ES2385712T3 - Oligonucleótidos que inhiben la expresión de la proteína OB-RGRP y procedimiento de detección de compuestos que modifican la interacción entre las proteínas de la familia de OB-RGRP y el receptor de la leptina - Google Patents

Oligonucleótidos que inhiben la expresión de la proteína OB-RGRP y procedimiento de detección de compuestos que modifican la interacción entre las proteínas de la familia de OB-RGRP y el receptor de la leptina Download PDF

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Abstract

Oligonucleótido opcionalmente modificado que comprende de 8 a 50 nucleótidos que hibrida de manera específica con la secuencia SEQ ID N° 1 e inhibe la expresión de OB-RGRP, caracterizado porque comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos 90% con la secuencia SEQ ID NO:2.

Description

Oligonucleótidos que inhiben la expresión de la proteína OB-RGRP y procedimiento de detección de compuestos que modifican la interacción entre las proteínas de la familia de OB-RGRP y el receptor de la leptina
La presente solicitud tiene por objeto oligonucleótidos que inhiben la expresión de la proteína OB-RGRP
La invención se define por las reivindicaciones.
La leptina es una proteína de 16 kDa secretada principalmente por el tejido adiposo y se une a un receptor (OB-R) que pertenece a la familia de los receptores de las citoquinas. Se han identificado cinco isofermas de membrana de este receptor y derivan del corte y empalme alternativo de un mismo gen. Estas isofermas que poseen el mismo dominio extracelular y transmembrana, se caracterizan por dominios intracelulares de tamaños variables (Tartaglia et al. (1995) Ce1l83, 1263-1271). También se ha identificado una forma soluble del receptor y proviene de un corte y empalme alternativo o de una escisión proteo lítica del dominio extracelular de las formas de membrana. La forma corta del receptor (OB-Rs) que parece implicada en el transporte de la leptina a través de la barrera hematoencefálica es la isoforma más expresada. La forma larga (OB-RI) sólo se expresa en algunos tejidos como el hipotálamo y parece responsable de la mayor parte de los efectos biológicos de la leptina (Sweeney, G. (2002) Cell Signal14, 655-663). La leptina y su receptor han sido objeto de una atención particular a causa de su implicación en la regulación del equilibrio energético, del metabolismo y en la respuesta neuroendocrina a la ingesta alimentaria. Recientemente, se ha mostrado que la leptina también está implicada en funciones adicionales importantes como la regulación de la masa ósea, angiogénesis, cicatrización, formación de trombos, maduración sexual, hematopoyesis, regulación de la inmunidad y de la inflamación, desarrollo fetal y cáncer. La administración de leptina en organismos deficientes en leptina como los ratones (ob/ob) y determinados individuos humanos provoca una disminución de la masa de lipido en diversos tejidos como el higado y el tejido adiposo (Halaas et al. (1995) Science 269, 543546, Pelleymounter et al. (1995) Science 269, 540-543, Campfield et al. (1995) Science 269, 546-549, Farooqi et al. (1999) N Engl J Med 341, 879-884). Este tratamiento con leptina también mejora la sensibilidad a la insulina y disminuye la masa grasa en el ratón y el ser humano que presentan una lipodistrofia (Shimomura et al. (1999) Nature 401, 73-76, Oral et al. (2002) New England Journal of Medicine 346, 570-578, Petersen et al. (2002) J Clin Invest 109, 1345-1350. Las personas obesas son generalmente resistentes a la leptina. Las razones de esta resistencia todavía se comprenden mal pero se han sugerido varios mecanismos: un defecto en el transporte de la leptina a través de la barrera hemato-encefálica, un defecto en la activación de los OB-R o de la señalización de estos receptores, y la sobreexpresión de reguladores negativos como SOCS3 y PTP-1 B Bjorbaek et al. (2000) J Biol Chem 275, 40649-40657, Cheng et al. (2002) Developmental Cell 2, 497-503, Cook y Unger (2002) Developmental Cell 2, 385-387. La comprensión de los mecanismos de la resistencia a la leptina requiere una caracterización más detallada de los mecanismos implicados en la activación de los OB-R.
El OB-R está asociado constitutivamente a la quinasa janus 2 (JAK2). La unión de JAK2 al receptor es crítica para la señalización por los OB-R y se ha propuesto que está implicada en la estabilización de los dímeros de los receptores OB-R. La activación por agonistas provocará un cambio de conformación en la región yuxtamembrana de la cola citoplásmica de los OB-R. JAK2, que está constitutivamente unido al resto box1 en esta región se activa por autofosforilación y fosforila el receptor OB-RI pero no OB-Rs. La fosforilación de OB-RI permite el anclaje de proteínas STAT que se unen al receptor y se activan por fosforilación en tirosina. Las proteínas STAT activadas se dimerizan y translocan en el núcleo para estimular la transcripción de genes mediante el elemento de respuesta de STAT (Tartaglia (1997) J Biol Chem 272,6093-6096).
Recientemente, se ha descubierto un segundo promotor para el receptor de la leptina. De forma interesante, un segundo transcrito se co-expresa con los mensajeros de los OB-R a partir de este promotor. Este transcrito se ha observado en varias especies como el ratón, la rata, el ser humano, la levadura y C. elegans (Bailleul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25, 2752-2758). Los experimentos de hibridación in situ confirman la co-expresión de los OB-R y del gen asociado en el cerebro de los ratones incluidas las regiones hipotalámicas implicadas en la regulación del peso corporal (Mercer et al., J Neuroendocrinol2000 Jul;12(7):649-55). La proteina correspondiente está compuesta por 131 aminoácidos y se denomina proteína relacionada con el gen OB-R (OB-RGRP). Esta proteína ha sido objeto de la solicitud de patente W098/05792.
Por otra parte, la solicitud de patente EP0969091 A2 enseña un polipéptido denominado LEPRGRP. Esta solicitud sugiere que la expresión del gen que codifica el polipéptido LEPRGRP endógeno podría ser inhibida por el sesgo de técnicas que bloquean la expresión.
El hecho de que OB-RGRP se exprese en la levadura y nematodo, organismos desprovistos de receptores de la leptina, indica un papel más general para OB-RGRP, apoyado por la deleción de esta proteína en la levadura que provoca un defecto en el transporte de proteinas del golgi hacia las vacuolas (Belgareh-Touze et al. (2002) Molecular Biology OfThe Ce1l13, 1694-1708).
En 2001, un ADNc denominado MY047, se clonó a partir de una biblioteca de ADNc de cerebro humano (Huang et al. (2001) Blochimica et Biophysica acta. Gene structure and expression 327-331). Esta proteina ha sido objeto además de la solicitud EP O 969 091. La función de la proteína correspondiente es todavía desconocida. MY047
tiene una homología del 68 % con OB-RGRP lo que sugiere que estas dos proteínas pertenecen a la misma familia. El análisis de las secuencias disponibles del proyecto de secuenciación del genoma humano muestra que no existe ningún otro homólogo.
Los solicitantes están vinculados a determinar el papel de la OB-RGRP y sus relaciones con los receptores de la leptina.
Así, han mostrado la especificidad de las interacciones entre la OB-RGRP y el receptor OBRs.
Además han mostrado que era posible modificar específicamente la expresión de los receptores de la leptina en la superficie celular mediante oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la proteína asociada al gen de los receptores de la leptina (OB-RGRP).
La presente tiene por lo tanto por objeto oligonucleótidos opcionalmente modificados que comprenden de 8 a 50 nucleótidos que hibridan de manera específica con la secuencia SEO ID N° 1 e inhiben la expresión de OB-RGRP, caracterizados porque comprenden una secuencia que presenta una identidad de al menos 90% con la secuencia SEO ID NO:2. Ventajosamente, estos oligonucleótidos favorecen la expresión de los receptores de la leptina en la superficie celular.
Preferentemente, estos oligonucleótidos son antisentido.
Según un modo de aplicación ventajoso estos oligonucleótidos se caracterizan porque los nucleótidos están tioesterificados.
Según otro modo de aplicación ventajoso estos oligonucleótidos se caracterizan porque los nucleótidos están 2' 0metilados.
Según otro modo de aplicación ventajoso estos oligonucleótidos se caracterizan porque presentan un residuo trietilenglicol en sus extremos 3'.
Aunque la forma más usada de los compuestos antisentido se presenta en la forma de oligonucleétidos antisentido, la presente invención incluye los derivados de oligonucleótidos y los compuestos que mimetizan su estructura tales como los descritos más adelante, sin que esta lista sea limitativa. Los compuestos antisentido según esta invención comprenden preferentemente, de 8 a 50 nucleobases (es decir, son oligómeros formados por 8 a 50 unidades nucleotídicas). Los compuestos antisentido particularmente considerados son los oligonucleótidos antisentido, más especialmente los que están formados por aproximadamente 12 a 30 nucleobases. Los compuestos antisentido comprenden ribozimas, oligozimas y otros ARN catalíticos cortos u oligonucleótidos catalíticos que hibridan con el ácido nucleico diana y modulan su expresión. Un nucleósido es una combinación de una base nitrogenada y un azúcar. La base de un nucleósido es generalmente una base nitrogenada heterocíclica. Los dos tipos de base heterocíclica más comunes son las bases púricas y pirimidínicas. Los nucleétidos son nucleósidos que portan un grupo fosfato unido de manera covalente al azúcar del nucleósido. Para los nucleósidos que contienen una pentanofuranosa, el fosfato puede unirse al hidroxilo en posición 2', 3' ó 5' del azúcar. La formación de nucleótidos proviene de la unión covalente del grupo fosfato de dos nucleósidos adyacentes lo que permite poco a poco la obtención de un oligómero lineal. Los dos extremos de dicho polímero lineal pueden a su vez unirse para formar una estructura circular, pero la estructura abierta se prefiere generalmente. En la estructura nucleotídica, los grupos fosfato se considera que forman el esqueleto internucleosídico del oligonucleótido. La unión normal en el esqueleto de ARN o de AON es una unión fosfodiéster 3'-5'. Los ejemplos específicos de compuestos antisentido utilizables en esta invención incluyen los oligonucleótidos que contienen un armazón modificado o uniones internucleosídicas no naturales. Así, los oligonucleótidos con armazón modificado comprenden los que conservan un átomo de fosfato en su esqueleto y los que están desprovistos de él. Para las necesidades de la presente invención, los oligonucleótidos modificados que no poseen átomo de fosfato en su unión internucleosídica pueden a pesar de todo considerarse como oligonucleótidos. El armazón de estos oligonucleótidos modificados puede comprender por ejemplo grupos fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquil fosfonatos incluidos los 3'-alquilen fosfonatos, 5'-alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, grupos fosfinatos, fosforamidatos incluidos 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y borofosfatos que forman uniones normales, 3'-5', y sus análogos que forman uniones 2'-5', así como los que presentan una polaridad invertida, es decir que comprenden al menos una unión internucleosídica de tipo 3'-3', 5'-5' ó 2'-2'. La forma de oligonucleótidos que poseen una polaridad invertida utilizada preferentemente es la que posee la primera unión internucleosídica en 3' es de tipo 3'-3'. Ésta corresponde a un único residuo nucleosídico invertido, que por otra parte puede ser abásico, es decir en el que la base nitrogenada heterocíclica está ausente o se ha reemplazado por un grupo hidroxilo. Las diversas formas (salinas o ácido libre) se incluyen en el campo de esta invención.
El armazón de los oligonucleótidos modificados desprovistos de átomo de fósforo está formado preferentemente por cadenas cortas alquilos o cicloalquilos, incluidos sus derivados que contienen uno o varios heteroátomos, que sirven de unión internucleosídica. Este tipo de armazón puede ser a base de unión morfolino (constituida en parte por el azúcar del nucleósido), de siloxano, de formacetilo y tioformacetilo, de metilen formacetilo y metilen tioformacetilo,
de riboacetilo, de alquenos, de sulfamatos, de sulfonato y sulfonamida, de metilen ¡mina y metilen hidrazina, de amida, y de cualquier otro grupo que contiene diversos átomos de nitrógeno, de azufre y de oxígeno o grupos metilo.
Para otros análogos de oligonucleótidos, el azúcar y la unión internucleosídica (es decir, el armazón) se reemplazan a la vez en la estructura nucleotídica por nuevos grupos. La base nitrogenada heterocíclica se conserva para asegurar la hibridación con el ácido nucleico diana. Dichos compuestos oligómeros, los PNA (por Peptide Nucleic Acid, Ácido Nucleico Peptídico), han mostrado una excelente capacidad de hibridación. En estos compuestos, el esqueleto del oligonucleótido se reemplaza por un armazón a base de amida, en particular por aminoetil glicina, injertada directamente o indirectamente sobre las bases nitrogenadas. Además una amplia información sobre estos
PNA pueden encontrarse en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497.
La invención incorpora más particularmente oligonucleótidos con armazón fosforotioato, amida y morfolina, y oligonucleótidos con esqueleto con heteroátomos, más precisamente:
-
CH2-NH-0-CH2-CH2-N(CH3)-0-CH2-(denominado esqueleto metilen-(metilimino) o MMI) -CH2-0-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-0-N(CH3)-CH2-CH2-(en el que el puente fosfodiéster es: 0-P-0-CH2).
La modificación de los oligonucleótidos puede afectar igualmente a los azúcares: las sustituciones preferidas son en
posición 2' (F; derivados 0-, N-o S-alcanos, 0-, N-o S-alquenos o 0-, N-o S-alquinos de longitud C1 a C11,
sustituidos o no) en particular, los derivados preferidos son:
0-[(CH2)nO]m-CH3 0-(CH2)n-0-CH3 0-(CH2)n-NH2 0-(CH2)n-CH3 0-(CH2)n-0-NH2 0-(CH2)n-0-N[(CH2)n-CH3]2
en los que n y m varían de 1 a 10. Otras modificaciones de la posición 2' incluyen los grupos siguientes: cadenas alifáticas sustituidas o no de longitud
C1 a C1 O, arilos, arilos-alquilos y alquilos-arilos; -SH, -SCH3, -OCN, -CI, -Br, -CN, -CF3, -OCF3, -S02CH3, -ON02,
-
N02, -N3, -NH2; sililos sustituidos; grupo "informador"; grupo intercalante; grupos de escisión del ARN; grupo para mejorar las capacidades farmacodinámicas de un oligonucleótido. Las modificaciones preferidas incluyen los grupos:
2-metoxietoxi (2'-0-CH2CH20CH3, igualmente llamado 2-0-(2-metoxietilo) ó 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78f 486-504) 2'-dimetilaminooxietoxi (0(CH2)20N(CH3)2, igualmente llamado 2'-DMAOE
2 -dimetilaminoetoxietoxi (2'-0-CH20CH2-N(CH2)2, igualmente llamado 2'-dimetilaminoetoxietilo ó 2'-DMAEOE).
Otra modificación interesante da lugar a la formación de LNA (Locked Nucleic Acids, Ácidos Nucleicos Bloqueados) en los que el hidroxilo en posición 2' está unido al carbono en posición 3' ó 4' del azúcar, formando un azúcar con estructura bicíclica. El puente preferido se hace por un enlace metilo o etilo entre el oxígeno 2' y el carbono en 4'.
Otras sustituciones preferidas en posición 2' incluyen:
-0-CH3 (2'-metoxi) -0-(CH2)3-NH2 (2'-aminopropoxi) -CH2-CH=CH2 (2-alilo) -0-CH2-CH=CH2 (2'-0-alilo) -F (2' flúor).
Estas modificaciones en 2' pueden presentarse en posición ribo (abajo) o arabino (arriba). El sustituyente 2' flúor es el preferido en posición arabino.
Pueden hacerse modificaciones similares sobre otras posiciones, en particular en posición 3' del azúcar del nucleótido en el extremo 3'-terminal o en los oligonucleótidos con armazón 2'-5', yen posición 5' del azúcar en el extremo 5'-terminal. Los azúcares de los oligonucleótidos pueden ser reemplazados igualmente por análogos (por ejemplo un ciclobutilo puede sustituirse por un pentofuranilo).
Los oligonucleótidos también pueden contener modificaciones o sustituciones a nivel de las nucleobases (bases heterocíclicas nitrogenadas llamadas "bases" por el experto en la técnica). Las bases naturales (no modificadas) son las purinas (adenina A y guanina G) y las pirimidinas (citosina e, timina T y uracilo U). Entre las bases modificadas se incluyen moléculas naturales o sintéticas tales como 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina; 6-metilo, 2-metilo y otros derivados alquilados de las bases púricas (A y G); derivado 2-tio (e, T y U); derivado 5-halo (U, C); derivado 5-propinil (U y C) citosina; derivado 6-azo (U, T Y C); 5-uracilo; 4-tiouracilo; 8halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo otras adeninas y guaninas sustituidas en posición 8; 5-halo (en particular 5-bromo), 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidas en posición 5; 7-metilguanina y 7metiladenina; 2-fluoroadenina; 2-amino-adenina; 8-azaguanina y 8-azaadenina; 7-deazaguanina y 7-deazaadenina; 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. En las demás bases modificadas, se encuentran las pirimidinas tricíclicas tales como lenoxazina citidina(IH-pirimido[5,4-b][ 1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), lenotiazina citidina (1 H-pirimido[5,4b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), lenoxazina citidina sustituidas (como la 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4b][1 ,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido[4,5-b]-indol-'2-ona).
Las bases modificadas comprenden los compuestos cuyo heterociclo púrico o pirimidínico se ha reemplazado por otro heterociclo por ejemplo 7 -deazaadenina, 7 -deazaguanosina, 2-aminopiridina ó 2-piridona (The eoncise Encyclopedia 01 Polymer Science And Engineering, páginas 858-859" Kroschwilz, J.I., ed. John Wley & Sons, 1990; Englisch et al., Angewandte Chemie, Edición Internacional, 1991, 30, 613; Sanghvi, Y.S., Capitulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993). Algunas de estas bases modificadas pueden tener un gran interés para aumentar la afinidad de los compuestos oligoméricos de la invención, como las pirimidinas sustituidas en posición 5, las azapirimidinas, las purinas N-y 0-sustituidas (tales como la 2-aminopropiladenina, el 5-propinil uracilo, la 5-propinil citosina). Las 5-metilcitosinas sustituidas tienen un efecto positivo en la estabilidad de los dúplex oligómeros-ácidos nucleicos (Sanghvif Y.S.f erookef S.T, y Lebleu, B.,r eds.f Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, p. 276-278) Y son la sustitución preferida, en particular en combinación con las modificaciones 2'-metoxietilo de los azúcares.
Preferentemente, estos oligonucleótidos están en la forma monocatenaria.
Según un modo de aplicación particularmente ventajoso estos oligonucleótidos comprenden una secuencia que presenta una identidad de al menos 90 %, con la secuencia SEO ID N°2, en la que los nucleótidos en posiciones 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 Y20, en el sentido 5' hacia 3', están tioesterilicados.
Según un modo de aplicación particularmente ventajoso estos oligonucleótidos comprenden una secuencia que presenta una identidad de al menos 90 %, con la secuencia SEO ID N°2, en la que los nucleótidos en posiciones 1, 2,3,4,5,16,17,18,19 y/o 20, en el sentido 5' hacia 3', están 2' O-metilados.
Preferentemente, los oligonucleótidos según la presente invención son AON.
La presente invención tiene también por objeto los oligonucleótidos de tipo ARNi (Ácido Ribonucleico de Interferencia) que comprenden de 15 a 60 nucleótidos, caracterizados porque hibridan de manera específica con la secuencia SEO ID N° 21 e inhiben la expresión de OB-RGRP, y caracterizados porque son ARN bicatenarios en los que al menos una de las dos cadenas comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos 90 %, con una de las secuencias SEO ID N"37 o SEO ID N"38.
La presente invención tiene igualmente por objeto los oligonucleótidos de tipo ARNi que comprenden de 15 a 60 nucleótidos que hibridan de manera específica con la secuencia SEO ID NO: 21 e inhiben la expresión de OBRGRP, caracterizados porque están en forma monocatenaria y porque comprenden una secuencia que presenta una identidad de al menos 90%, con la secuencia SEO ID N°42.
Preferentemente, dichos ARNi comprenden 17 ó 19 nucleótidos tomados en continuo en la secuencia SEO ID NO: 21, o en su secuencia complementaria.
Los nucleótidos A(NG) y (CfT)T pueden añadirse respectivamente en 5' y en 3' de esta secuencia de 17 ó 19 nucleótidos. Otros tipos de residuos o grupos químicos pueden añadirse si embargo a estos dos extremos, sin que disminuyan la actividad de los antisentido.
Las modificaciones de nucleótidos descritas para los antisentidos son también posibles para los que forman parte de la composición de los sARNi.
La presente invención incluye igualmente todas las modificaciones de los antisentidos o de los ARNi, que pretendan aumentar la resistencia de estos compuestos a las nucleasas celulares, o su penetración en las células y/o su eficacia en el direccionamiento hacia la secuencia de OB-RGRP.
Cuando son ADN, los oligonucleótidos según la presente invención pueden realizarse cómodamente y rutinariamente por la técnica muy conocida de la síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis se comercializa por diferentes empresas especializadas tales como Applied Biosystems (Foster City, CA). La síntesis de los antisentido en la presente invención recurre a una síntesis química sobre un soporte adaptado según los métodos conocidos por el experto en la técnica, en particular descritos por E. Uhlmann, A. Peyman, A. Ryte, A. Sehmidt y E. Buddeeke (1999, Methods in Enzymology 313: 268-284) y por E. Uhlmann (Reeent advanees in the medicinal chemistry of antisense oligonucleotides,Current Opinion of Drug Discovery and Develepment 3: 203-213, 2000). También puede emplearse cualquier otro procedimiento de síntesis conocido por el experto en la técnica.
Cuando son ARNi los oligonucleótidos según la presente invención pueden sintetizarse por síntesis química, cuando se trata de de ARNi sintéticos, expresados in situ mediante vectores que permiten la síntesis de dichos oligonucleótidos u obtenidos por escisión de un ARN bicatenario por la RNAse 111 o la enzima DICER.
Los ARNis (ARNi small o ARNi pequeños) pueden obtenerse a través de diferentes suministradores como Proligo (Proligo Franee SAS 1 rue Robert et Sonia Delaunay 75011 Paris) Dharmaeon (Dharmaeon, Ine. 1376 Miners Drive #101 Lafayette, CO 80026) y Ambion (Ambion (Europe) Ud. Ermine Business Park Spitfire Close Huntingdon, Cambridgeshire PE29 6XY Reino Unido), o pueden sintetizarse a partir de kits comercializados por diferentes empresas como Dharmacon y Ambion.
Preferentemente, los ARNi según la presente invención están en forma bicatenaria.
Después de la síntesis los ARNi se recogen en primer lugar en agua desprovista de ARNasas. El emparejamiento de las dos moléculas monocatenarias puede realizarse como sigue: 20 I-lmoles.L-1 de cada cadena se mezcla en el tampón de emparejamiento (100 mmoles.L-1 de aeetato de potasio, 30 mmoles.L-1 de HEPES-KOH pH 7,4, 2 mmoles.L-1 de acetato de magnesio) y se calienta a 90°C durante 1 min seguido de una incubación de 1 ha 3rC.
La transfección de los ARNis puede hacerse por el mismo protocolo que para la transfección de los antisentido.
Una alternativa para el ARNi es la utilización de vectores que permiten la síntesis de ARN antisentido específicos del gen a inactivar y que se va a emparejar en las células transfectadas para proporcionar un ARNis. Un primer sistema de vector permite la expresión de una secuencia antisentido por dos promotores en sentido inverso, a cada lado de esta secuencia, proporcionando la aparición de dos ARN complementarios que van a emparejar en las células transfectadas y proporcionar un ARNis. Otro sistema de vector emplea la síntesis de un ARN que presenta la secuencia del antisentido seguida de la secuencia con sentido, espaciada por algunos nucleótidos, que va a crear una estructura de ARN en horquilla, que va a escindirse en las células transfectadas para proporcionar un ARNis. Otro sistema más de vector emplea la expresión de un ARN bicatenario, con una longitud de hasta 600 pares de bases que no puede salir del núcleo por falta de las secuencias necesarias: sin caperuza en 3' (sitio ribozima), ni cola poli-A en 5' (sitio de fijación de la proteína con dedo de cinc MAl). Este ARN largo se escinde en el núcleo para proporcionar ARNis funcionales que van a salir al citoplasma y provocar la degradación del ARN diana.
La transfección de estos vectores se efectúa de manera clásica como se ha descrito anteriormente para los diferentes ADN. La obtención de líneas estables que presentan una extinción del gen diana se puede realizar por una selección con antibiótico utilizada clásicamente para la obtención de líneas.
De manera general, el experto en la técnica puede referirse para los ARNI a las publicaciones siguientes: Elbashir
S.M. et al. (2001, Nature 411: 494-498), Elbashir S.M. Lendeekel W y Tusehl T. (2001, Genes & Dev. 15:188-200) et Masters J.R., et al. (2001, Proe. Natl. Aead. Sei. USA 98: 8012-8017).
Los vectores que permiten la expresión de los ARNi pueden obtenerse como describen Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. (2002. Seienee 296: 550-553), Yu J.Y., DeRuiter S.L., y Turner D. (2002, Proe. Natl. Aead. Se;' USA 99: 6047-6052) y Shinagavva T. y Ishii S. (2003, Genes & Dev. 17:1340-1345).
Dichos vectores, así como las células que contienen dichos vectores son objetos de la presente solicitud.
Por otra parte, la presente invención divulga medicamentos que contienen dichos oligonucleótidos, vectores y células y composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad farmacológicamente activa de dichos oligonucleótidos, vectores y células y excipientes farmacéuticamente aceptables.
La presente invención divulga igualmente la utilización de dichos oligonucleótidos, vectores y células para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de patologías ligadas a la leptina.
Divulga además un procedimiento de tratamiento curativo o preventivo de enfermedades ligadas a la leptina que consiste en administrar dichos oligonucleótidos, vectores y células a un paciente que padece dicha enfermedad.
La invención divulga igualmente un procedimiento de determinación de la modificación de la interacción entre la OBRGRP o la proteína MY047, o una proteína que presenta una identidad de al menos 65 % con esta proteína o con la proteína MY047, y el receptor de la leptina por un compuesto.
Divulga además proteínas de fusión para la aplicación de este procedimiento, así como ácidos nucleicos que codifican estas proteínas.
Divulga además un procedimiento de tratamiento curativo o preventivo de enfermedades ligadas a la leptina que consiste en administrar un ligando seleccionado por el procedimiento definido anteriormente a un paciente que padece dicha enfermedad.
Se divulga igualmente una proteína de fusión caracterizada porque está compuesta por una secuencia que presenta una identidad de al menos 65 % con la secuencia SEO ID N°4, o la secuencia SEO ID N°16, o una parte sustancial de la secuencia SEQ ID N°4 o de la secuencia SEO ID N°16, Y por una proteína donadora de energía o aceptora de energía, o por una parte sustancial y activa de una proteína donadora de energía o aceptora de energía.
Dichas proteínas de fusión están compuestas en sustancia por una parte correspondiente a una parte o la totalidad de una secuencia que presenta una identidad de al menos 65% preferentemente de al menos 75% y aún más preferentemente de al menos 85% ó 95%, con secuencia SEO ID N°4, o la secuencia SEO ID N°16, o una parte sustancial de la secuencia SEO ID N°4 o de la secuencia SEO ID N°16, Y por una parte correspondiente a una proteína donadora o aceptora de energía. Pueden sin embargo comprender otras secuencias de aminoácidos, obtenidas de otras proteínas, tales como secuencias señal.
De manera ventajosa, la proteína donadora de energía es la luciferasa de Renilla (Rluc). Puede sin embargo ser cualquier otra proteína donadora de energía tal que el espectro de emisión del donador se solape suficientemente con el espectro de excitación del aceptor para permitir una transferencia de energía eficaz entre los dos compañeros. Puede ser así la GFP, si la transferencia de energía es el FRET, o también la aequorina si la transferencia de energía es el CRET. La aequorina puede obtenerse y utilizarse como se describe en la solicitud de patente EPO 187 519, o en el articulo de Inouye et al. (PNAS USA 82: 3154-3158 (1985)).
La proteína fluorescente aceptora de energía es en cuanto a ella preferentemente la OsRed, la GFP o un mutante de esta proteina, tal como YFP, EYFP, GFP salvaje, GFPS65T, Topaz, o GFP1Q.
Puede sin embargo ser cualquier otra proteína fluorescente aceptora de energía tal que el espectro de excitación del aceptor y el espectro de emisión del donador se solapen suficientemente para permitir una transferencia de energía eficaz entre los dos compañeros.
Estas proteínas son conocidas por el experto en la técnica que puede encontrar sus secuencias en la bibliografía, principalmente en la revisión de Blinks et al. (Pharmacol. Rev. 28: 1-93 (1976)). En particular la GFP se describe por Tsien (Annu. Rev. Biochem. 67 : 509-544 (1998)) Ysu clonación por Prasher et al. (Gene 111 : 229-233 (1992) ). La clonación de la DsRed se describe en cuanto a ella por Malz et al. (Nat Biotechnol. 17: 969-973 (1999)). Para Rluc, el experto en la técnica puede referirse a Blinks et al. (Pharmacol. Rev. 28: 1-93 (1976)) o también a Lorenz et al. (PNAS 88 4438-4442 (1991) ).
De manera particularmente ventajosa, las proteínas de fusión donadora y aceptora presentan una de las secuencias SEOID N°6, SEOID N°8, SEOID N°12, SEO ID N°14, SEOID N°18 o SEOID N°20 o una variante de esta secuencia que presenta una identidad de al menos 65%.
La presente invención divulga también ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Dichos ácidos nucleicos pueden ser AON complementarios o genómicos, o ARN. Estos ácidos nucleicos o polinucleótidos pueden estar en forma monocatenaria o en la forma de dúplex.
Son de manera particularmente ventajosa AON complementarios. De manera preferente, dicho ácido nucleico tiene una identidad de al menos 65 %, preferentemente de al menos 75 %, Y aún más preferentemente de al menos 85 % ó 95 'lo, de identidad de nucleótidos con un ácido nucleico de secuencia SEO ID N°5, SEO ID N°7, SEO ID N°11, SEO ID N°13, SEO ID N°17 o SEO ID N°19.
La invención también divulga un ácido nucleico que hibrida, en condiciones de hibridación de alta astringencia, con un ácido nucleico tal como se ha definido anteriormente, y más particularmente un ácido nucleico de secuencias nucleotidicas SEO ID N°5, SEO ID N°7, SEO ID N°11, SEO ID N°13, SEO ID N°17 o SEO ID N°19, o un ácido nucleico de secuencia complementaria.
El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos, en el sentido de la presente invención, se puede determinar comparando dos secuencias alineadas de forma óptima a través de una ventana de comparación.
La parte de la secuencia nucleotídica o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender por lo tanto adiciones o deleciones (por ejemplo "huecos") respecto a la secuencia de referencia (que no comprende estas adiciones ni estas deleciones) de forma que se obtenga un alineamiento óptimo de las dos secuencias.
El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que una base nucleica o un residuo de aminoácido idéntico se observa para las dos secuencias (nucleica o peptídica) comparadas, dividiendo después el
número de posiciones en las que hay identidad entre las dos bases o residuos de aminoácidos por el número total de posiciones en la ventana de comparación y a continuación multiplicando el resultado por 100 con el fin de obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación se puede realizar de forma informática mediante
algoritmos conocidos contenidos en el paquete informático de la Empresa WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, VV1SCONSIN. A titulo de
ilustración, el porcentaje de identidad de secuencia podrá efectuarse mediante el programa informático BLAST
(versiones BLAST 1.4.9 de marzo 1996, BLAST 2.0.4 de febrero 1998 y BLAST 2.0.6 de septiembre 1998), utilizando exclusivamente los parámetros por defecto (S. F Altschul et al, J. Mol. Biol. 1990215 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25 : 3389-3402). Blast busca las secuencias similares/homólogas a una
secuencia {{ requerida}} de referencia, mediante el algoritmo de Altschul et al. La secuencia requerida y las bases de datos utilizadas pueden ser peptídicas o nucleicas, siendo posible cualquier combinación.
Por "condiciones de hibridación de alta astringencia" en el sentido de la presente invención, se entenderán las condiciones siguientes:
1-Competición de membranas y PRE HIBRIDACiÓN: Mezclar: 40 ~I de ADN de esperma de salmón (10mg/ml) + 40 ~I de ADN de placenta humana (10mg/ml)
Desnaturalizar 5 min a 96°C y sumergir la mezcla en hielo.
Extraer el SSC 2X y verter 4 mi de mezcla de formamida en el tubo de hibridación que contiene las membranas.
Añadir la mezcla de los dos ADNs desnaturalizados.
Incubación a 42°C durante 5 a 6 horas, con rotación.
2-Competición de la sonda marcada:
Añadir a la sonda marcada y purificada de 10 a 50 1-11 de ADN Cot 1, según la cantidad de repeticiones.
Desnaturalizar 7 a 10 mn a 95°C.
Incubar a 65°C durante 2 a 5 horas.
3-Hibridación:
Extraer la mezcla de pre-hibridación.
Mezclar 40 ~I de ADN de esperma de salmón + 40 ~I de ADN de placenta humana; desnaturalizar 5 mn a 96'C
y sumergir en hielo.
Añadir en el tubo de hibridación 4 mi de mezcla de formamida, la mezcla de los dos ADN y la sonda
marcada/ADN Cot I desnaturalizado.
Incubar de 15 a 20 horas a 42°C, con rotación.
4-Lavados:
Un lavado a temperatura ambiente en SSC 2X, para aclarar.
2 veces 5 minutos a temperatura ambiente SSC 2X y SDS 0,1 % a 65°C.
2 veces 15 minutos a 65°C SSC 1X y SDS 0,1% a 65°C.
Cubrir las membranas con Saran y exponer.
Las condiciones de hibridación descritas anteriormente están adaptadas a la hibridación en condiciones de alta astringencia de una molécula de ácido nucleico de una longitud variable de 20 nucleótidos a varios cientos de nucleótidos.
No hace falta decir que las condiciones de hibridación descritas anteriormente pueden adaptarse en función de la longitud del ácido nucleico cuya hibridación se pretende realizar o del tipo de marcaje elegido, según las técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Las condiciones convenientes de hibridación pueden adaptarse por ejemplo según la enseñanza contenida en el
trabajo de HAMES y HIGGINS (1985, "Nucleic acid hybridiation ; a practical approach", Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) o también en el trabajo de F.AUSUBEL et al (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green
Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y).
Las proteínas divulgadas en la presente invención pueden obtenerse por cualquier medio conocido por el experto en la técnica. Sin embargo, se obtienen ventajosamente por expresión de los ácidos nucleicos tales como los descritos anteriormente, que codifican estas proteínas, opcionalmente insertados en vectores de expresión, en células elegidas ventajosamente, seguido opcionalmente de una extracción y una purificación que puede ser total o parcial.
La invención divulga igualmente un vector recombinante que comprende un ácido nucleico descrito anteriormente.
Ventajosamente, dicho vector recombinante comprenderá un ácido nucleico elegido entre los ácidos nucleicos siguientes:
a) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene al menos 65 % de identidad en aminoácidos con una
secuencia SEO ID W6, SEO ID W8, SEO ID W18 o SEO ID N°20 o un fragmento peptidico o una variante de esta
última;
b) un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia SEO ID N°5, SEO ID N°7, SEO ID
N°17 o SEO ID N°19, o un fragmento o una variante de esta última;
e) un ácido que tiene al menos 65 % de identidad en nucleótidos con un ácido nucleico que tiene una secuencia
SEO ID N°5, SEO ID N°7, SEO ID N°17 o SEO ID N°19 o un fragmento o una variante de este último;
d) un ácido nucleico que hibrida, en condiciones de hibridación de alta astringencia, con un ácido nucleico de
secuencias SEO ID N°5, SEO ID N°7, SEO ID N°17 o SEO ID N°19 o un fragmento o una variante de este último.
Por {{ vector }} en el sentido de la presente invención se entenderá una molécula de ADN o de ARN circular o lineal que está indistintamente en forma monocatenaria o bicatenaria.
El vector de expresión puede comprender además de un ácido nucleico según la invención, secuencias reguladoras que permiten dirigir la transcripción y/o la traducción.
Dicho vector recombinante comprenderá principalmente los elementos siguientes:
(1)
elementos de regulación de la expresión del ácido nucleico a insertar, tales como promotores y amplificadores;
(2)
la secuencia codificadora comprendida en el ácido nucleico según la invención a insertar en dicho vector, estando situada dicha secuencia codificadora en fase con las señales de regulación descritas en (1) ; Y
(3)
secuencias de inicio y de parada de la transcripción apropiadas.
Además, los vectores recombinantes podrán incluir uno o varios orígenes de replicación en los huéspedes celulares en los que se busca su amplificación o su expresión, marcadores o marcadores de selección.
A título de ejemplos, los promotores para células eucariotas comprenderán el promotor de la timidina quinasa del virus HSV o también el promotor de la metalotioneína-L de ratón.
De manera general, para la elección de un promotor adaptado, el experto en la técnica podrá referirse
ventajosamente al trabajo de SAMBROOK et al. (1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) o también a las técnicas descritas por FULLER et al. (1996, Immunology in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel etal).
Los vectores preferidos son los plásmidos, tales como por ejemplo los vectores pcDNA3 (Invitrogen), pOE70,
pOE60, pOE9 (Oiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(Stragene).
Puede tratarse igualmente de vectores de tipo bacu/ovirus tal como el vector pVL 1392/1393 (Pharmingen) utilizado
para transfectar las células de la linea Sf9 (ATCC N°CRL 1711) derivadas de Spodoplera frugiperda.
También puede tratarse de vectores adenovirales tales como el adenovirus humano de tipo 2 ó 5.
Un vector recombinante puede ser también un vector retroviral o también un vector adeno-asociado (AAV). Dichos
vectores adeno-asociados se describen por ejemplo por FLOTTE et al. (1992, Am. J, Respir. Ce/l Mol. Biol., 7: 349
356.
La presente invención divulga además células que comprenden una proteína, un ácido nucleico o un vector tales como se han descrito anteriormente o fragmentos de estas células, lisados de estas células o también membranas de estas células.
Dichas células pueden ser células aisladas de un organismo y cultivadas en un medio de crecimiento adecuado. Sin embargo, son preferentemente líneas celulares. Así, dichas líneas son de manera particularmente ventajosa las líneas celulares HEK 293, COS (ATCC N°CRL 1650), COS-M6 y HeLa (ATCC N°CCL2), o también Cv 1 (ATCC N°CCL70), Sf-9 (ATCC N°CRL 1711), CHO (ATCC WCCL-61) o 3T3 (ATCC N°CRL-6361).
Las membranas de estas células pueden prepararse por cualquier método conocido por el experto en la técnica.
Preferentemente, se prepararán por trituración mecánica de las células y centrifugación de las suspensiones obtenidas, como se ilustra en los ejemplos siguientes.
La presente invención divulga además composiciones que comprenden células tales como las descritas anteriormente y saponina.
La presente invención divulga además un procedimiento de determinación de la modificación de la interacción entre la OB-RGRP, la proteína MY047, o una proteína que presenta una identidad de al menos 65 % con la secuencia SEO ID W4 o la secuencia SEO ID N°16, Y el receptor de la leptina por un compuesto que comprende las etapas que consisten en:
poner en contacto dicho compuesto con una proteína que presenta una identidad de al menos 65 % con la secuencia SEO ID N°4 o la secuencia SEO ID N°16, Y el receptor de la leptina, o células, o fragmentos, o lisados, o membranas de células que comprenden dichas proteínas, y opcionalmente un sustrato enzimático adecuado, y
medir la interacción entre una proteína que presenta una identidad de al menos 65% con la secuencia SEO ID N°4 o la secuencia SEO ID W16, y el receptor de la leptina.
De manera preferente, dicho compuesto se pone en contacto con una proteína de fusión donadora de energía, y una proteína de fusión aceptora de energía, o células, o fragmentos, o lisados, o membranas de células que comprenden dicha proteína, y opcionalmente un sustrato enzimático adecuado
Preferentemente, dicho procedimiento se aplica con células tratadas con un agente que permeabiliza las células tal como la saponina.
Las proteínas de fusión donadoras de energía y las proteínas de fusión aceptoras de energía se eligen de manera que la energía resultante de la activación del donador pueda transferirse de manera eficaz al aceptor.
En un modo de aplicación ventajoso de dicho procedimiento, la proteína de fusión donadora de energía es una proteína de fusión con la luciferasa o una parte sustancial de la luciferasa, en cuyo caso el sustrato es ventajosamente la coelenterazina.
En un modo de aplicación preferente de dicho procedimiento, la proteína de fusión aceptora de energía es una proteína de fusión con la YFP o una parte sustancial de la YFP.
En un modo de aplicación ventajoso de dicho procedimiento, la transferencia de energía medida en presencia del compuesto a ensayar se compara con la medida en ausencia del compuesto a ensayar.
En otro modo de aplicación ventajoso de dicho procedimiento, la transferencia de energía medida en presencia del compuesto a ensayar y de la leptina (o un ligando del receptor), se compara con la medida en presencia del compuesto en ausencia de leptina (o un ligando del receptor).
Preferentemente, el procedimiento se aplica sobre membranas de células, tales como las descritas anteriormente.
De manera preferente, las proteínas donadora y aceptora descritas anteriormente se eligen con el fin de que la transferencia de energía se haga por BRET (para Bioluminescence Résonance Energy Transfer o transferencia de energía de bioluminiscencia por resonancia) de primera o segunda generación, o LRET (para Luminescence Resonance Energy Transfer o transferencia de energía de luminiscencia por resonancia). Sin embargo, dicha transferencia de energía puede efectuarse por FRET (para Fluorescence Résonance Energy Transfer o transferencia de energía de fluorescencia por resonancia) o también por CRET (para Chemioluminescence Resonance Energy Transfer o transferencia de energía de quimioluminiscencia por resonancia).
Cualquiera que sea el tipo de transferencia de energía las parejas de proteína de fusión donadora/proteína de fusión aceptora de energía se eligen con el fin de permitir dicha transferencia.
El BRET2 (2a generación) consiste en una transferencia de energía entre la luciferasa de Rénilla, y una GFP
Tw
mutante, la GFP1Q, utilizando un sustrato adecuado, la coelanterazina OeepblueC (Biosignal Packard).
El CRET consiste en una transferencia de energía entre la aequorina, que es una luciferasa, y la GFP.
El FRET consiste en una transferencia de energía entre dos proteínas de la familia de las GFP que tienen espectros diferentes.
Para la aplicación de estas transferencias el experto en la técnica puede referirse a Ramsay O et al. (Biochem J 365: 429-40 (2002)) Ya Yoshioka K et al. (FEBS Letl 523: 147-151 (2002)) para BRET2, a Baubet et al. (PNAS USA 97: 7260-7265 (2000)) para CRET, a Matyus (J Photochem Photobiol B 12: 323-337 (1992)) Y Pollok y Heim (Trends Cell BioI9:57-60 (1999)) para FRET.
La presente invención también divulga un procedimiento de cribado o de detección de compuestos destinados a la prevención y/o al tratamiento de patologías ligadas a la leptina que comprende las etapas que consisten en:
poner en contacto dicho compuesto con una proteína que presenta una identidad de al menos 65 % con la secuencia SEO ID N°4 o la secuencia SEO ID N°16, Y el receptor de la leptina, o células, o fragmentos, o lisados, o membranas de células que comprenden dichas proteínas, y opcionalmente un sustrato enzimático adecuado, y
medir la interacción entre una proteína que presenta una identidad de al menos 65% con la secuencia SEO ID N°4 o la secuencia SEO ID W16, y el receptor de la leptina.
Preferentemente, la proteína que presenta una identidad de al menos 65 con la secuencia SEO ID N°4 o la secuencia SEO ID N°16 es la OB-RGRP o MY047.
Este procedimiento es compatible con las placas de 96 ó 384 pocillos utilizadas generalmente. No necesita la utilización de moléculas radiactivas, es sensible, reproducible, rápido y el resultado se lee fácilmente. Esta característica es particularmente interesante para la aplicación de cribado a gran escala.
La presente invención divulga además la utilización de compuestos seleccionados por un procedimiento que consiste en:
poner en contacto dicho compuesto con una proteína que presenta una identidad de al menos 65 % con la secuencia SEO ID N°4 o la secuencia SEO ID N°16, Y el receptor de la leptina, o células, o fragmentos, o lisados, o membranas de células que comprenden dichas proteínas, y opcionalmente un sustrato enzimático adecuado, y
medir la interacción entre una proteína que presenta una identidad de al menos 65% con la secuencia SEO ID N°4 o la secuencia SEO ID W16, y el receptor de la leptina.
Divulga finalmente un procedimiento de tratamiento curativo o preventivo de enfermedades ligadas a la leptina o a su receptor que comprende las etapas de :
selección de dicho compuesto por un procedimiento que consiste en:
+poner en contacto dicho compuesto con una proteína que presenta una identidad de al menos 65 % con la secuencia SEO ID N°4 o la secuencia SEO ID N°16, Y el receptor de la leptina, o células, o fragmentos, o lisados, o membranas de células que comprenden dichas proteínas, y opcionalmente un sustrato enzimático adecuado, y
+medir la interacción entre una proteína que presenta una identidad de al menos 65% con la secuencia SEO ID N°4
o la secuencia SEO ID N°16, y el receptor de la leptina.
administración de dicho compuesto a un paciente que padece dicha enfermedad.
Las patologías ligadas a la leptina pueden ser enfermedades ligadas a una disminución de la densidad ósea como por ejemplo la osteoporosis o a la inversa las ligadas a una calcificación importante.
También pueden ser enfermedades que tienen un efecto sobre el peso, tales como obesidad, diabetes o anorexia.
También pueden ser enfermedades que tienen un efecto sobre la maduración sexual, hematopoyesis, angiogénesis, formación de trombos, regulación de la inmunidad y de la inflamación, desarrollo fetal, cicatrización y cáncer.
Los compuestos de la invención, oligonucleótidos y ARNi, se pueden formular en las composiciones farmacéuticas con vistas a una administración por vía tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular etc. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos farmacéuticamente aceptables para una formulación inyectable. Puede tratarse en particular de disoluciones salinas (fosfato monosódico, disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, etc, o mezclas de dichas sales), estériles, isotónicas o composiciones secas, principalmente liofilizadas, que, por adición según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de solutos inyectables.
La formulación de composiciones terapéuticas y su administración está en las competencias del experto en la técnica.
La formulación de los compuestos puede incluir diferentes productos conocidos por el experto en la técnica. Preferentemente, a los compuestos se pueden añadir por ejemplo sales, como sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas, ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico o nítrico. Otras sales son igualmente utilizables, como las que provienen del ácido acético, oxálico, tartárico, succínico, maleico, fumárico, glucónico, cítrico, málico,
ascórbico, benzoico, tánico, palmítico, algínico, poliglutámico, naftalenosulfónico, metanosulfónico, ptoluenosulfónico, naftalenodisulfónico, poligalacturónico. Finalmente, también se pueden utilizar preferentemente sales de cloro, bromo y yodo.
La composición y la formulación para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizadores, líquidos y polvos.
La composición y la formulación para la administración oral pueden incluir polvos, gránulos, micropartículas, nano partículas, suspensiones, disoluciones acuosas o no, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o mini comprimidos. Pueden añadirse espesantes, aromas, diluyentes, emulsionantes, agentes de dispersión o ligantes.
La composición y la formulación para la administración parenteral, intratecal o intra ventricular, pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos como, pero no limitado a, agentes que aumentan la penetración, productos transportadores y excipientes.
La composición puede formularse y utilizarse como una espuma, emulsión, microemulsión, liposomas catiónicos, sensibles al pH o cargados negativamente y transferomas.
De una forma general, las diferentes formulaciones pueden contener una mezcla de uno o varios agentes, como pero no limitado a, agentes que aumentan la penetración del compuesto (tensioactivos, sales biliares, agentes quelantes, tensioactivos no quelantes), excipientes (ligantes, rellenos, lubricantes, disgregantes, agentes humectantes), transportadores (agua, disoluciones salinas, alcoholes, polietilen glicol, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silicílico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona). Pueden añadirse otros componentes, como colorantes, aromas, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes.
La dosificación depende de la gravedad y de la sensibilidad del estado de la enfermedad a tratar, con una duración de tratamiento que puede ir de algunos días a algunos meses, o hasta que la cura sea eficaz o se observe una disminución de la enfermedad. La dosificación óptima puede calcularse a partir de medidas de acumulación del agente terapéutico en el cuerpo del paciente. El experto en la técnica puede determinar fácilmente las dosificaciones óptimas, los métodos de dosificación y las tasas de repeticiones de estas dosificaciones. Las dosificaciones óptimas pueden variar en función de la eficacia relativa de cada oligonucleótido o ARNi, y pueden estimarse en general por la medida de las CE50 de las dosis utilizadas in vitro e in vivo en modelos animales. En general, la dosificación está comprendida entre 0,011-1g y 100 g por kilo de peso corporal y puede administrarse una vez o más, de forma diaria, quincenal, mensual o anual, o incluso una vez cada 2 a 20 años.
Las personas competentes pueden determinar fácilmente la tasa de repetición de las dosificaciones tomando como base el tiempo de presencia del compuesto en los fluidos corporales o los tejidos. Después de que un tratamiento ha salido bien, puede ser deseable que el paciente continúe una terapia de mantenimiento para prevenir la reaparición de la enfermedad, para hacer esto el oligonucleótido o ARNi se administran a dosis de mantenimiento que van de 0,01 I-Ig 100 g por kilo de peso corporal, una vez o más al día hasta una vez cada 20 años.
La administración del antisentido in vivo se ha realizado con éxito por diversos autores, utilizando protocolos de inyección simple del antisentido por via intravenosa (He et al. (1998) lhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue la lhi 12:1-4) o intracerebral (Yoburn et al. (2003) Synapse 47: 109-116, Tischkau et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 718-723). Estos dos últimos años, se han desarrollado sistemas más complejos que permiten el direccionamiento de antisentido en el organismo y se han utilizado con éxito (Morishita et al. (2002) J. Endocrinol. 175: 475-485, Barlsch et al. (2002) Pharm. Res. 19: 676-680), lo que permite en el ratón y la rata, tratar diversos cánceres (Rait et al. (2002) Mol. Med. 8: 475-486, Ochietli et al. (2002) J. Drug. Target 10: 113-121, Eder et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9:117-125). La transfección de los antisentido utiliza los mismos procedimientos que para la transfección de los ARNi, dejando prever las mismas aplicaciones in vivo para los ARNi. En esta óptica, podemos imaginar un direccionamiento del antisentido o de los ARNi a nivel del sistema nervioso central, para tratar trastornos cuyo origen es central (obesidad), pero también los obtenidos por una acción periférica de los receptores de la leptina. Más particularmente, puede preverse una acción de los antisentido o de los ARNi a nivel del transporte de la leptina a través de la barrera hemato-encefálica y que implica los OB-R. Por otra parte, las células endoteliales ya se han tomado como diana con éxito con una estrategia antisentido in vivo (Bartsch et al. (2002) Pharm. Res. 19: 676-680).
Figuras:
Figura 1
Secuencias de los diferentes ODN antisentido utilizados AS 01 a AS 16.
Figura 2
Alineamiento de las secuencias proteicas de OB-RGRP de diferentes especies y de la secuencia proteica humana de MY047. Los dominios transmembrana potenciales se determinaron por diferentes métodos (HMMTOP, TMHMM, TopPred2, TMpred) y se escriben en negrita.
Figura 3
Topologia de OB-RGRP estudiada por BRET, por la utilización de la doble proteina de fusión YFP-OB-RGRP-Luc. Figura 3a: representación esquemática de la topologia de OB-RGRP para los modelos 3 y 4TM. Figura 3b Resultados de los experimentos de BRET utilizando las proteínas indicadas. Los datos se expresan en mBU.
Figura 4
Estudio de la oligomerización de OB-RGRP por experimentos de SDS-PAGE e inmunoprecipitaciones. Figura 4a: Las células que expresan las proteínas de fusión indicadas se trataron o no con Ditiobis(succinimidil propionato) (DSP) 2 mmoles.L-1 en PBS (1X pH7,4) para entrecruzar los complejos proteicos. Las proteinas se separaron por SDS-PAGE y las proteínas de fusión con YFP se detectaron por la utilización de un anticuerpo específico anti-YFP. Figura 4b: Las células que expresan la construcción 6Myc-OB-RGRP se solubilizaron con 1 % de digitonina ó 5 % de SOS y el solubilizado se inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-myc. Los precipitados se sometieron a una separación por SOS-PAGE y las proteínas etiquetadas con myc se detectaron con un anticuerpo anti-myc.
Figura 5
Identificación de los determinantes moleculares implicados en la oligomerización de OB-RGRP. Las proteínas de fusión con los truncamientos de OB-RGRP se trataron como se ha descrito Fig. 4b. TM, dominio transmembrana.
Figura 6
Estudio de la oligomerización de OB-RGRP en las células HEK vivas por la tecnología de BRET. Figura 6a: Las proteínas de fusión indicadas se co-expresaron en una relación equimolar y se realizaron experimentos de medidas de BRET. Figura 6b: Cantidades constantes del plásmido OB-RGRP-Luc se co-expresaron con cantidades crecientes del plásmido OB-RGRP-YFP y se realizaron medidas de BRET. MT2R-Luc, proteina de fusión del receptor MT2 de la melatonina con la luciferasa.
Figura 7
Interacción de OB-Ro Y de OB-RGRP y MY047 estudiadas por BRET. Las proteinas de fusión indicadas se coexpresaron en una relación equimolar y se realizaron medidas de BRET. IR-YFP, proteína de fusión del receptor de la insulina con YFP.
Figura 8
Activación dependiente de la dosis de los genes informadores para STAT3 (Figura 8a) y STAT5 (Figura 8b) en las células HeLa, por OB-RI en presencia de una sobreexpresión de las construcciones de la proteína OB-RGRP como se indica.
Figura 9
Efecto de la sobreexpresión de OB-RGRP sobre la expresión de OB-R en la superficie de las células. Las células HEK 293 transfectadas o no con el vector de expresión de OB-RGRP, y las células COS transfectadas con los vectores de expresión de OB-R¡ o OB-Rs y +/-los vectores de OB-RGRP, se utilizaron para determinar la cantidad de receptores expresada en la superficie y el total expresado en las células por experimentos de unión de 125 1_ leptina.
Figura 10
Efecto de diferentes oligodesoxinucleótidos (OON) antisentido sobre el nivel de mensajeros de OB-RGRP observados por RT -PCR semi-cuantitativa. Figura 10a: determinación de la zona lineal de amplificación de transcritos de OB-RGRP y de la GAPOH, en función del número de ciclos de PCR. Figura 10b: cuantificación de los resultados mostrados en el panel a. Figura 10c: Determinación de los niveles de expresión relativos de los ARNm de OB-RGRP a 26 ciclos de PCR, en las células incubadas con los diferentes OON antisentido.
Figuras 11
Efecto de diferentes ARN de interferencia sobre el nivel de los mensajeros de OB-RGRP observados por RT -PCR semi-cuantitativa. Figura 11a: secuencia SEO ID N°37/SEO ID N°38 del ARNi sintético utilizado (homólogo para el ser humano y el ratón). Figura 11 b: determinación de los niveles de expresión relativos de los ARNm de OB-RGRP a 26 ciclos de PCR, en las células HELA transfectadas o no con el ARNi sintético. Figura 11c: secuencia SEO ID N°42 del ARNi en horquilla sintetizado a partir del vector PCR3.1-RNAi 14. Figura 11 d: determinación de los niveles de expresión relativos de los ARNm de OB-RGRP a 26 ciclos de PCR, en las células Ltk transfectadas o no con el vector PCR3.1-RNAi 14.
Figura 12
Efecto de los OON antisentido específicos de OB-RGRP sobre la activación de un gen informador STAT3. Las células HeLa se co-transfectaron, en primer lugar con el vector de expresión OB-RI y las construcciones de los genes informadores para STAT3 Ó 5, y después con los OON antisentido indicados. Después 48 horas de estimulación o no con 10 nmoles.L-1 de leptina.
Figura 13
Efecto de los OON antisentido específicos de OB-RGRP sobre la expresión en superficie de OB-R. Las células HeLa se transfectaron o no con los plásmidos de expresión de OB-Ro de OB-Rs antes de una segunda transfección o no
con los OON antisentido indicados. 48 h post-transfecciónse determinó la cantidad de OB-R total y la fracción
s
expuesta en la superficie en experimentos de unión con la 12 I-Ieptina.
Materiales y Métodos utilizados en los ejem plos
Construcción de los plásm idos.
Leas proteínas de fusión de los OB-R con la YFP y la luciferasa se construyeron por ligación de la YFP y de la luciferasa a la parte C-terminal de los receptores OB-R, por técnicas estándar de biología molecular. La región
codificadora de la YFP se obtuvo a partir del vector Cytogem®-Topaze (pGFPtpz-N1) (Packard. Meriden. CT) y se
insertó en el sitio EcoRV del vector pcONA3/CMV (lnvitrogen, Groningen, Países bajos) que contiene un policonector modificado. La región codificadora de la luciferasa de Renilla se obtuvo a partir del vector pRL-CMV (Promega, Madison, WI) y se insertó en el sitio EcoRV del vector pcONA3 modificado. Las regiones codificadoras de OB-Ry de
OB-Rs (regalo del Or. Gainsford, Royal Melbourne Hospital, Victoria, Australia) se insertaron en los dos vectores descritos anteriormente, respectivamente en los sitios EcoR1/BamH1 y Nhe1. Los codones de parada se suprimieron por mutagénesis dirigida y la fase de las proteínas de fusión se ajustó al mismo tiempo.
El vector pcDNA3-0B-RGRP se obtuvo por inserción de la región codificadora de OB-RGRP. obtenida a partir del vector pCDNA3-Di1. en los sitios EcoR1 y Xba1 del vector pcDNA3/CMV (Invitrogen. Groningen. Países bajos). El codón de parada de OB-RGRP se suprimió por mutagénesis dirigida. El vector pcDNA3-0B-RGRP-Luc se obtuvo por digestión del vector pRL-CMV N3 (Promega. Madison. WI) con Sma1 y Hpa1 y por inserción del fragmento.
correspondiente a la región codificadora de la luciferasa de Renilla, después de la región codificadora de OB-RGRP
en el sitio BspE1 lleno del vector pcDNA3-0B-RG RP.
El vector pcDNA3-YFP se obtuvo por sub-clonación de la región codificadora de la YFP a partir del vector pGFPtpzN1 (Packard. Meriden. CT) insertado en el sitio EcoRV del vector pcDNA3/CMV. El vector pcDNA3-0B-RGRP-YFP se obtuvo por inserción del fragmento BamH1/BspE1 del vector pCDNA3-0B-RGRP no parada en el vector pcDNA3-YFP digerido con las enzimas BamH1 y Age1.
La construcción pcDNA3-GFP-OB-RGRP-Luc se obtuvo por inserción del fragmento OB-RGRP-Luc del vector pcDNA3-0B-RGRP-Rluc cortado con EcoR1. en el sitio EcoR1 del vector pcDNA3-YFP. El codón de parada de la
YFP se eliminó por mutagénesis dirigida.
El vector 6Myc-OBR-GRP (4TM) se obtuvo por inserción del fragmento 6myc del vector pCDNA3-RSV-6Myc. en los sitios BamH1 y EcoR1 del vector pCDNA3-0BRGRP. Las diferentes deleciones de OB-RGRP (2 Y 3 TM) se
obtuvieron por PCR e inserción en el vector pcONA3 en los sitios EcoR1 y Xba1. La región codificadora de MY047 se obtuvo por RT-PCR sobre los ARNm de origen humano. El fragmento de PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoR1/Xba1 y se insertó en el vector pcONA3-Topaze cortado con las mismas enzimas. El codón de
parada de la YFP se eliminó por mutagénesis dirigida para obtener el vector pcDNA3-YFP-MY047. El vector pcDNA3-MY047-YFP se obtuvo por inserción del fragmento de ADN obtenido por PCR sobre el vector pcDNA3
YFP-MY047 y cortado con BamH1, e insertado en el vector pcONA3-YFP cortado con la misma enzima. La inserción
del mismo fragmento en el vector pcDNA3-Rluc cortado con BamH1 ha permitido obtener el vector pcDNA3-MY047
Rluc. Se realizaron dos reacciones de PCR consecutivas para obtener una amplificación del promotor U6 de ratón seguido de la secuencia ARNi en horquilla de secuencia SEO ID N°42. En la primera reacción, una primera pareja de cebadores: U6 sentido. 5'-CCATCTAGGCCAAGCTTATCCGACGCCGCCATCTC-3' SEQ ID N°41 y la correspondiente a la secuencia sentido de la diana seguido de una secuencia que forma el bucle (SEO ID N°39). Este producto de PCR se utilizó en una segunda reacción con el mismo cebador con sentido (U6 sentido) y con un segundo cebador correspondiente a la secuencia anti-sentido de la diana precedido de la misma secuencia que
forma el bucle (SEQ ID N°40). Los diferentes productos de PCR correspondientes a los diferentes ARNi en horquilla se insertaron en el vector PCR3.1 mediante el kit TA-cloning (INVITROGEN Groningen, Países bajos), para
proporcionar los plásmidos PCR3.1-RNAi 14. Todas las construcciones se verificaron por secuenciación.
Cultivo celular y transfección.
Las células HEK 293, COS-7-y HeLa se cultivaron en DMEM suplementado con 10 % (vlv) de SVF, 4,5 g/litro de glucosa, 100 U/mi de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 1 mmol.L-1 de glutamina (todos de Life Technologies,
Gaithersburg, MO). Las transfecciones transitorias se realizaron con el reactivo FuGene 6 (Roche, Basilea, Suiza)
según las instrucciones del suministrador, salvo para las células Ltk. Estas últimas se transfectaron por la técnica de DEAE Dextrano : las células se lavan dos veces con PBS y se añade sobre las células 1 mi de una mezcla de 21-19 de ADN, DMEM, Hepes 20 mM, 4,5 g/litro de glucosa y 200~g de DEAE-dextrano. Después de una incubación de 8 horas, el medio se retira y las células se incuban durante 1'30" con 1 mi de DMEM, 4,5 g/litro de glucosa y 10 % DMSO. Las células se lavan finalmente y se incuban con el medio de cultivo.
Preparación de las mem branas y solubilización.
Las membranas se prepararon como se ha descrito anteriormente (19), y se resuspendieron en Tris 75 mmoles.L-1 (pH 7,4), MgC1 2 12,5 mmoles.L-1, y EDTA 5 mmoles.L-1 y se utilizaron inmediatamente en los experimentos de BRET.
SDS PAGE y transferencia Western.
Los lisados totales se prepararon por lavado de las células una vez con PBS frío (pH 7,4) Y se desnaturalizaron por adición de tampón de depósito (30mmoles.L-1 Tris HCI pH 6,8,1 % glicerol 5 % SDS, 50 mmoles.L-1 DTT y 0,05 % azul de bromofenol). Los lisados totales o los inmunoprecipitados se incubaron durante 10 minutos a 90°C y se depositaron sobre gel de acrilamida 10 % para una separación por electroforesis (SDS-PAGE). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se revelaron con anticuerpos primarios específicos: anti-YFP (83671 Living Colors) a 1/200, anti-myc A14 (sc-789 TEBU Peprotech Santa Cruz Biotechnology) a 1/500, y un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa (lgG de cabra anti-conejo; Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Baltimore Pike) a 1/10.000. Las bandas inmuno-reactivas se revelaron con un kit ECL (Pharmacia Biotech).
Inm u noprecipitación.
Dos días después de la transfección, las células se lavaron una vez con PBS frío y las proteínas se extrajeron por una incubación durante 15 minutos en tampón de lisis (PBS 1X, Nonidet P40 1 %, Desoxicolato de Sodio 0,5 %, SDS 0,1 %, NaN3 0,02 %, benzamidina 10 mg.L-1 e inhibidores de tripsina 5 mg.L-1). El lisado se centrifugó a
18.000 9 durante 15 min y el sobrenadante se incubó durante 3 horas a 4°C con un anticuerpo anti-myc acoplado a bolas de agarosa (sc-40ACTEBU preprotech, Santa CRUZ Biotechnology). Los precipitados se lavaron tres veces con tampón de lisis frío y se desnaturalizaron con tampón de depósito para SDS-PAGE.
Experimentos de radiounión.
Los experimentos de radiounión se realizaron como se ha descrito anteriormente (Barr et al. (1999) J Biol Chem, 274, 21416-21424), con ligeras modificaciones. Para determinar la unión de la leptina en superficie, las células cultivadas en placas de 6 pocillos se lavaron dos veces con PBS frío y se incubaron en el tampón de unión (DMEM, 25 mmoles.L-1 Hepes pH 7,4, 1 % BSA) que contiene 100.000 cpm/pocillo de 1251-leptina (PerkinElmer life sciences, Paris, Francia) en presencia o no de 200 nmoles.L-1 de leptina (PeproTech Inc, EEUU) durante 4 h a 4°C. Las células se lavaron dos veces con PBS frío, se lisaron en NaOH 1 N, Yla radiactividad se determinó en un contador y. Para determinar la unión total de la leptina, las células cultivadas en los botes de 10 cm de diámetro se solubilizaron en 1,5 mi de tampón de unión que contiene 0,15% de digitonina durante 2 h a 4°C. Los extractos se centrifugaron 30 min a velocidad máxima ya 4°C. Los sobrenadantes (0,2ml) se incubaron con 100.000 cpm de 1251_leptina en presencia o no de 200 nmoles.L-1 de leptina, en un volumen total de 0,25 mi en rotación constante a 4°C durante una noche. Se añadieron 0,5 mi de y-globulina (1,25 mg/ml) y 0,5 mi de polietilen glicol 6000 (25 % plv) para precipitar los complejos receptores-ligandos, que se centrifugaron a 17.000 9 durante 3 mino El sedimento se lavó una vez con 1 mi de polietilen glicol 6000 (12 % p/v) y la radiactividad se determinó en un contador y.
Ensayo de activación de los genes informadores.
Las células HeLa cultivadas en los pocillos de placas de 6 pocillos se co-transfectaron con 500 ng de un plásmido informador que expresa la luciferasa de luciérnaga bajo el control de elementos de respuesta para los factores STAT3 o STAT5, (regalo del Dc. Levy, Universidad de Nueva York, Nueva York, EEUU), 250 pg del vector de expresión pcDNA3-luciferasa de Renilla (utilizado como estándar interno entre las muestras) y con 500 ng de los diferentes vectores de expresión de OB-R o el vector solo. 48 h después de la transfección, las células se pusieron sin suero durante una noche en medio Otpimem (lnvitrogen, Groningen, Países bajos) que contiene 1 % de BSA, antes de la estimulación o no con 10 nmoles.L-1 de leptina durante 48 h. Las células se lavaron una vez con PBS y se lisaron en tampón de lisis pasiva (Promega Corporation, Madison, WI) durante 15 min a temperatura ambiente. Los lisados totales se centrifugaron durante 2 min a 15.000 9 Y los sobrenadantes se utilizaron en un ensayo de medida de luciferasa (Dual Luciferase Assay System de Promega Corporation, Madison, \/\/1) utilizando un luminómetro Berthold (Lumat LB 9507). Los resultados se expresan respecto a las actividades de la luciferasa de luciérnaga sobre la luciferasa de Renilla.
Medidas de BRET en microplacas.
48 h después de la transfección, las células COS-7, HeLa o HEK 293 que expresan las proteínas de fusión de OB-R se despegaron y se lavaron en PBS. 1-2x105células se distribuyeron en pocillos de placas optiplate (96 pocillos, Packard Instrument Company, Meriden, CT) en presencia o no de los ligandos y se incubaron a 25°C. De forma
alternativa, hemos procedido de la misma forma con membranas preparadas a partir de las células que expresan las diferentes construcciones. El sustrato, la Coelenterazina h (Molecular Probes, Eugene, OR) se añadió a una concentración final de 5 fJmoles.L-1 y las lecturas se realizaron con un lumino/fluorímetro Fusion T" (Packard Instrument Company, Meriden, CT) que permite la medida de la luminiscencia a través de dos filtros (filtro Luciferasa: 485 ± 10 nm; filtro YFP: 530 ± 12,5 nm). La relación de BRET se definió como la diferencia de emisión a 530 nm/485 nm de las células co-transfectadas con las proteínas de fusión Luc y YFP Y la emisión a 530 nm/485 nm de la proteína de fusión Luc transfectada sola en las células. Los resultados se expresan en unidades de miliBRET (mBU), 1 mBRET corresponde a los valores de las diferencias de las relaciones multiplicados por 1.000.
RT-PCR.
Los ARN totales se extrajeron por el método de Chomczynski y Sacchi (Chomcynzki P .. y Sacchi N. (1987) Anal. Biochem. 162. 156-159). 1 ~g de ARN se desnaturaliza durante 5 minutos a 68°C y se enfria brutalmente durante 5 min a 4°C. La muestra desnaturalizada se transcribe de forma inversa durante 1 h a 3rC en 20 1-11 de medio de reacción RT (5~moles.L-1 PdN6. 10~moles.L-1 DTT. 50mmoles.L-1 Tris-HCI pH=8.3. 75mmoles.L-1 KCI. 5mmoles.L-1 MgCI2. 500 ~moles.L-1 dNTP. 200U RT-MMLV). Una alicuota de 2.5 ~I de esta reacción se utiliza para una reacción de PCR en un volumen final de 25~1 (40mmoles.L-1 Tris-HCI pH 8.4; 100 mmoles.L-1 KCI; 1.5 mmoles.L-1 MgCI2; 0.2mmoles.L-1 de cada dNTP; 0.141 mmoles. L-1 de cebadores especificos de OB-RGRP (con sentido humano: CCGTGGCAGGAAGC SEQ ID W43, con sentido murino: GCAGCGACAGCCCCAGCTCC SEQ ID W44 antisentido: CAGCCACACGAGCAAG SEQ ID W45), y 0,035mmoles.L-1 de cebadores especificos de la gliceraldehido fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (con sentido: GGAGAAGGCTGGGGC SEQ ID W46, antisentido: GATGGCATGGACTGTGG SEQ ID W47) y 2,5U de TAQ ADN polimerasa). El protocolo siguiente se utilizó para la reacción de PCR : Desnaturalización inicial de 3 min a 94°C, y 22 a 30 ciclos de desnaturalización (20 seg a 94°C), hibridación (20 seg a 59°C), elongación (20 seg a 72°C) seguido de una elongación final de 7 min a 72°C.
Una alicuota de la reacción de PCR se depositó en un gel de agarosa al 2% para separar los productos de la reacción por electroforesis. Los tamaños esperados de los fragmentos de la GAPDH y de OBR-GRP son respectivamente 229 pb Y334 pb.
Síntesis de oligonucleótidos
Los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador automático de ADN (modelo 8909 "Expedite MOSS" de Applied Biosystems) por química estándar de fosforamiditas y oxidación con yodo. La desmetilación se efectuó con una disolución de 0,2 moles.L-1 de 3H-1 ,2-benzoditiol-3-ona 1, 1-dióxido en acetonitrilo durante 120 s. La liberación del soporte y la desprotección se realizaron en amoniaco concentrado (18 h a 55°C), y los oligonucleótidos se purificaron por precipitación. El producto de desprotección se precipitó con 10 volúmenes de 1-butanol; el sedimento recogido en un volumen de NaCI a 0,3 moles.L-1 se precipitó por la adición de 4 volúmenes de etanol.
El análisis por gel de poliacrilamida al 20 % (en tampón urea 8 moles.L-1 y Tris-borato 454 mmoles.L-1 a pH 7,0) mostró una proporción superior al 80 % de producto de la longitud esperada.
Transfección de los OligoDesoxiNucleótidos antisentido y del dúplex de ARN de interferencia sintéticos.
Para la transfección de 300.000 células cultivadas en un pocillo de placa de 6 pocillos, se diluyeron 10 ~L de ODN antisentido a 20 ~moles.L-1 ó 10 ~L del dúplex de ARN de interferencia a 20 ~M en 175 ~L de DMEM. Se incubaron 3 ~L de oligofectamina (Invitrogen, Groningen, Paises bajos) y 12 ~L de DMEM en un segundo tubo durante 10 min a temperatura ambiente. La mezcla oligofectamina I DMEM se añade al ODN antisentido diluido, se agita y se incuba 20 min a temperatura ambiente. Durante este tiempo, las células se lavan una vez con PBS, una vez con DMEM, y se recubren con 800 ~I de DMEM. La mezcla ODN I oligofectamina se añade gota a gota sobre las células y se incuba 4h a 3rC antes de añadir 500 ~I de DMEM suplementado con 30 % de suero.
Ejemplo 1: Topología y localización celular de OB-RGRP.
Para estudiar la topología y localización subcelular de OB-RGRP, hemos etiquetado la proteína con la variante amarilla de la Proteína Verde Fluorescente (YFP) en el extremo de su cola C-terminal. La proteína de fusión se expresó en las células HeLa y su localización se determinó por microscopía de fluorescencia.
Los resultados muestran que la proteína de fusión se dirige preferentemente a nivel de las membranas perinucleares yen las vesículas intracelulares. Se observaron resultados similares en las células HEK. No se observó ninguna colocalización con proteínas citoplásmicas y nucleares, lo que confirma la localización de OB-RGRP a nivel de las membranas (no mostrado). La naturaleza exacta del compartimento de membrana se determinó por estudios de colocalización con marcadores específicos de compartimentos subcelulares. Se observó una fuerte co-Iocalización con la cadena invariable de las proteínas de clase II de CMH, un marcador del compartimento endocítico.
El análisis inicial de la topología de OB-RGRP sugirió una organización en 3 dominios transmembrana (TM) Bailleul et al (1997) Nucleic Acids Research 25, 2752-2758). Una organización similar se ha propuesto para MY047 (Huang et al. 2001) Biochimica et Biophysica acta. Gene structure and expression 327-331). Sin embargo, un nuevo análisis del perfil de hidrofobicidad de diferentes secuencias proteicas disponibles para OB-RGRP y MY047 es también
compatible con un modelo de 4 TM (Fig. 2). La topología difiere profundamente entre estos dos modelos. En el modelo de 3 TM, los extremos N-y e-terminales están localizados en cada lado de la membrana, mientras que en el modelo de 4 TM, las dos colas están orientadas al mismo lado de la membrana (Fig. 3a). Para determinar el modelo correcto, hemos utilizado el método de transferencia de energía por resonancia (BRET), que se ha desarrollado recientemente para seguir las interacciones proteína-proteína en las células vivas (Xu et al. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A 96,151-156). En el caso de proximidad fisica « 100 A) entre las dos proteinas que interaccionan, puede tener lugar una transferencia de energía entre la donadora de energía (Luc) y la aceptora de energía (YFP), fusionadas a las dos proteínas de interés. Hemos etiquetado la cola N-terminal de OB-RGRP con YFP, la cola Cterminal con la luciferasa y hemos observado la transferencia de energía por medidas de BRET con esta doble proteína de fusión. El modelo de 3 TM no permite la transferencia porque los dos compañeros de BRET están separados por la bicapa lipídica. El modelo de 4 TM al contrario prevé una fuerte transferencia de energía porque los dos compañeros están localizados en el mismo lado de la membrana. Como se muestra en la figura 3b, se detectó una transferencia de energía muy fuerte para la doble proteína de fusión en las células intactas, lo que indica que OB-RGRP posee 4 TM.
El conjunto de estos resultados sugiere que OB-RGRP es una proteína de membrana con 4 dominios transmembrana, que posee 3 bucles cortos y extremos N-y C-terminales cortos orientados al mismo lado de la membrana. OB-RGRP está localizada mayoritariamente en compartimentos intracelulares.
Ejem plo 2: Oligomerización de OB-RGRP.
La oligomerización es una propiedad común a diferentes proteínas incluidas las proteínas de membrana como los receptores tirosina quinasa, los receptores de las citoquinas y las fosfotirosinas fosfatasa. Se ha mostrado que esta oligomerización juega un papel importante en la función de estas proteínas. Para obtener los elementos en la función de OB-RGRP, hemos querido saber si esta proteína oligomeriza.
OB-RGRP se etiquetó con YFP en su cola C-terminal y se expresó en las células HeLa. Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida en condición desnaturalizante (PAGE-SOS) y se realizaron experimentos de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-YFP. La figura. 4a revela varias bandas específicas de OB-RGRPYFP, correspondientes a las formas monoméricas, diméricas y complejos oligoméricos. Se obtuvieron resultados similares con OB-RGRP etiquetada en N-terminal bien con YFP o un epítopo myc (Fig. 4 a,b). La formación de los oligómeros de OB-RGRP se observó en los extractos celulares totales después de la inmunoprecipitación. La utilización de un agente de entrecruzamiento sobre las células enteras, estabiliza los complejos diméricos, lo que indica que la forma dimérica es la forma predominante de OB-RGRP en las células intactas (Fig. 4a).
De forma sorprendente, OB-RGRP tiene propiedades inesperadas porque los oligómeros son estables en presencia de diferentes agentes desnaturalizantes y/o disociantes como SOS 5 %, Tritón X-100 1 %, Nonidet P40 1 %, digitonina 1 %, OTT 50 mmoles.L-1 y ~-mercaptoetanol 2 %. Sin embargo, se obtuvieron observaciones similares para otras proteínas de membrana como la glicoforina A y los receptores ~2-adrenérgicos acoplados a proteínas G. Los estudios sobre estas proteínas muestran respectivamente que los restos LlXXGVXXG y LXXXGXXXGXXXL en los dominios transmembrana son esenciales para la formación de los oligómeros. Se han identificado restos similares en las regiones de membrana de OB-RGRP.
Para identificar los determinantes moleculares implicados en la dimerización, hemos realizado construcciones de OB-RGRP que presentan deleciones progresivas de la cola C-terminal (Fig. 5). Una construcción que contiene los dos primeros TM potenciales pierde la capacidad de formar oligómeros. La adición del 3er TM restaura la posibilidad de formar dímeros. Sin embargo, el perfil completo de oligomerización sólo se ha observado en presencia de los 4 TM potenciales.
Los oligómeros de proteínas de membrana pueden ser artefactos inducidos durante la preparación de las muestras (solubilización, desnaturalización etc.). Por esto es importante verificar la oligomerización de las proteínas en células vivas. Las técnicas de transferencia de energía desarrolladas recientemente como BRET permiten seguir dichas interacciones proteínas-proteínas en células vivas. Las proteínas de fusión de OB-RGRP con la luciferasa y YFP se han utilizado para seguir la oligomerización de OB-RGRP en células vivas. La co-expresión de las construcciones OB-RGRP-YFP o YFP-OB-RGRP con la construcción OB-RGRP-Luc induce una transferencia de energia (Fig. 6a). La especificidad de esta interacción se ha mostrado por la ausencia de transferencia de energía durante la coexpresión con dos proteinas de fusión diferentes: la ~arrestina2-YFP (Angers et al. (2000) Proc Natl Acad Sei U S A 97, 3684-3689), o el receptor MT2 de la melatonina-Luc (Ayoub et al. (2002) J Biol Chem 277, 21522-21528) Hemos expresado diferentes relaciones de los compañeros de BRET (Fig. 6b). La señal de BRET aumenta de forma hiperbólica en función de la relación OB-RGRP-YFP / OB-RGRP-Luc, alcanzando una asíntota que corresponde a la saturación de las moléculas donadoras de energia (OB-RGRP-Luc) por las moléculas aceptaras (OB-RGRP-YFP), lo que se espera en el caso de una interacción específica.
Colectivamente, estos resultados muestran que OB-RGRP es una proteína de membrana dimérica que también puede estar implicada en complejos oligoméricos de muy alto peso molecular. El 3er y 40 dominios transmembrana potenciales parecen ser importantes para la formación de los oligómeros.
Ejem plo 3: Interacción entre los OB-R y OB-RGRP Y MY047.
Hemos utilizado la tecnología BRET para estudiar una posible interacción entre los OB-R y OB-RGRP en células vivas. Se observó una transferencia de energía de forma constitutiva en las células que cQ-expresan la construcción OB-Rs-Luc Y la construcción OB-RGRP-YFP lo que indica una proximidad de los compañeros de interacción (Fig. 7). Los mismos resultados se obtuvieron en las células que cQ-expresan OB-Rs-Luc y la construcción MY047-YFP, así como en la orientación inversa: en las células que cQ-expresan OB-RGRP-Luc y OB-Rs-YFP, o en las células que cQ-expresan MY047-Luc y OB-Rs-YFP. La especificidad de estas interacciones se confirmó por la ausencia de transferencia de energía entre OB-Rs-Luc, OB-RGRP-Luc, MY047-Luc y una construcción del receptor de la insulina etiquetado con YFP (Boute et al. (2001) Mol Pharmacol 60. 640-645). así como en la orientación inversa: por la ausencia de transferencia de energía entre una construcción del receptor de la insulina etiquetado con Luc y las construcciones OB-Ro-YFP. OB-RGRP-YFP Y MY047-YFP. La ca-expresión de OB-R,-Luc y una construcción de OB-RGRP o de MY047 que presenta la etiqueta YFP en N-terminal no provoca señal significativa, lo que confirma la especificidad de la interacción con OB-RGRP-YFP y MY047 e indica que el extremo N-terminal de OB-RGRP y MY047 debe estar implicado en la interacción con OB-R.
No se observó ninguna transferencia de energía significativa en las células que co-expresan las construcciones OBR,-Luc y OB-RGRP-YFP o YFP-OB-RGRP.
Esto no es debido a una ausencia de expresión funcional OB-R1-Luc porque se observó una señal de BRET específica en las células que co-expresan OB-R1_YFP para seguir la dimerización de los OB-R. La ausencia de BRET entre las proteínas de fusión OB-R1-Luc y OB-RGRP-YFP no excluye una interacción directa entre estas dos proteínas porque ésta puede explicarse por el hecho de que la distancia entre los dos compañeros de BRET (Luc y YFP) sea más grande que 100 A, la distancia máxima que permite obtener una transferencia. Éste debe ser el caso porque los extremos N-y C-terminales de OB-RGRP deben estar localizados cerca de la región transmembrana de los OB-R, mientras que el extremo C-terminal de OB-RI debe apuntar lo más probablemente hacia el citoplasma a causa de su larga cola intracelular de aproximadamente 300 aminoácidos. Habida cuenta que las isoformas corta y larga de los OB-R comparten las mismas regiones trans-y yuxta-membrana y que la interacción de OB-RGRP con OB-Rs está localizada a este nivel, es probable que OB-RGRP interaccione con OB-RI de de la misma manera que con OB-Rs.
Ejem plo 4: Efecto de la sobreexpresión de OB-RGRP sobre la señalización de los OB-R.
Se co-expresaron construcciones que contienen elementos de respuesta para STAT3-o STAT5-en 5' respecto a un gen informador luciferasa con OB-R1en ausencia o en presencia de diferentes construcciones de OB-RGRP (Fig. 8). Las dos construcciones se activaron con la leptina de forma dependiente de la dosis con una CE50 de aproximadamente 50 pM. Se obtuvieron resultados similares en las células HEK 293 que expresan de forma estable un gen informador para STAT3. La sobreexpresión de diferentes construcciones de OB-RGRP no tuvo efecto reproducible sobre esta activación lo que indica que OB-RGRP no es un factor limitante.
Ejemplo 5: Efecto de la sobreexpresión de OB-RGRP sobre la expresión de los OB-R en la superficie.
En las levaduras knock-out para OB-RGRP (Vps55). el transporte de proteínas está alterado entre el golgi y las vacuo las (Belgareh-Touze et al. (2002) Molecular Biology Of The Cell 13. 1694-1708). Aunque los OB-R se activen únicamente cuando se expresan en la membrana plásmica, una cantidad importante de receptores se acumula en los compartimentos intracelulares (Barr. et al. (1999) J Biol Chem. 274. 21416-21424)(Lundin et al. (2000) Biochimica et Biophysica Acta 1499. 130-138). Es por esto por lo que hemos ensayado los efectos de la sobreexpresión de OB-RGRP sobre la expresión de los OB-R en la superficie de las células.
El reparto de los receptores se estudió por experimentos de unión de 1251_leptina. De acuerdo con otros autores (Barr et al. 1999), hemos mostrado que solamente 10 -20 % de los receptores OB-R1y OB-Rs se expresan en la superficie de las células COS transfectadas (Fig. 9) Y las células HeLa. Esto no es un artefacto debido a la expresión de receptores exógenos porque se obtienen valores similares en las células HEK 293 que expresan receptores endógenos OB-R (Fig. 9). La sobreexpresión de OB-RGRP no ha mostrado modificación de la cantidad total en las células ni el % de receptores expresados en la superficie (Fig. 9).
Ejemplo 6: Caracterización de desoxinucleótidos antisentido específicos de OB-RGRP
OB-RGRP parece tener una expresión ubicua, es por esto por lo que la disminución de la expresión de esta proteína se eligió como estrategia alternativa para estudiar su papel en la función de los OB-R. Catorce antisentido específicos para OB-RGRP (AS 1 a 14 ; SEQ ID W22 a SEQ ID W34 y SEQ ID W2) y dos antisentido aleatorios (AS 15 Y 16 ;SEQ ID W35 y SEQ ID W36) se eligieron (véase la Figura 1). se sintetizaron y se ensayaron para su capacidad de inhibir la expresión de OB-RGRP por experimentos de RT-PCR semi-cuantitativa en las células HeLa que expresan OB-RGRP de forma endógena (Fig. 10). Sólo uno de estos antisentido (AS-14). derivado de la región 3' no traducida del ARNm de OB-RGRP interfiere con la expresión de OB-RGRP. El marcaje de este antisentido con el fluoróforo Cy3 ha permitido mostrar que el conjunto de las células se transfectaba con nuestras condiciones experimentales, durante nuestros diferentes experimentos.
Ejemplo 7: Efecto de los diferentes ARN de interferencia sobre el nivel de los mensajeros de OB-RGRP observados por RT-PCR semi-cuantitativa.
Con el fin de disminuir la expresión de OB-RGRP, una estrategia alternativa ha sido utilizar ARN de interferencia. Para esto, hemos utilizado por una parte una secuencia candidata ARN de interferencia sintética dirigida a la vez contra la secuencia humana y murina (figura 11 a) ; y por otra parte, un vector (PCR3.1-RNAi 14) que expresa un ARN de interferencia en horquilla dirigido contra una secuencia murina de OB-RGRP (figura 11 e).
La capacidad de los ARNi para disminuir la expresión de OB-RGRP endógena se ensayó por RT-PCR.
El ARNi sintético transfectado en las células HELA (de origen humano) provoca una disminución de la expresión de OB-RGRP humana.
La transfección del vector PCR3.1-RNAi-14 provoca el mismo efecto en las células L (de origen murino).
Ejem plo 8: Efecto del antisentido específico de OB-RGRP sobre la señalización y la expresión en superficie de los OB-R.
Las células HeLa se co-transfectaron en primer lugar con los vectores de expresión de OB-Ry el gen informador
para STAT3 y después con los antisentido. La leptina provoca un aumento de la activación basal del gen informador para STAT 3 de aproximadamente 1,5 veces en las células control sin antisentido, o con un antisentido control (AS16) (Fig. 12). En las células transfectadas con el antisentido especifico para OB-RGRP (AS-14). la señalización basal y estimulada por la leptina aumenta relativamente respecto a las condiciones control. Esto muestra que la activación de la vía JAKlSTAT aumenta en las células que presentan una disminución de la expresión de OB-RGRP. Estas observaciones pueden explicarse por un efecto inhibidor de OB-RGRP sobre la actividad basal y estimulada de los OB-R, yen este caso, OB-RGRP puede considerarse como un regulador de la señalización de los OB-R. Otra alternativa es que OB-RGRP podría regular la expresión de los receptores en superficie limitando el número de OBR que alcanzan la superficie de las células. Esto está de acuerdo con el hecho de que solamente 10 a 20 % de los receptores expresados alcanzan la superficie celular. En esta hipótesis, la disminución de la expresión de OB-RGRP debería aumentar el número de receptores en la superficie de las células, lo que debería aumentar la señalización por estos receptores. Para ensayar esta hipótesis, hemos cuantificado el número de receptores OB-Ry OB-Rs
expresados en la superficie de las células en presencia (control) yen ausencia (AS-14) de OB-RGRP (Fig. 13). La transfección del antisentido aleatorio no mostró efecto sobre el número de receptores expresados en la superficie de las células, mientras que la del antisentido específico (AS-14) provocó un aumento de 3 veces en el número de los OB-R expresados en la membrana plásmica. Se obtuvieron resultados similares en las células HeLa no transfectadas que expresan receptores endógenos. En estas condiciones experimentales, el número total de receptores, medido por experimentos de unión de 1251_leptina, no mostró variaciones significativas.
El conjunto de nuestros resultados es consistente con el papel de OB-RGRP en la levadura, en el transporte de proteínas. El aumento de la expresión en superficie de los OB-R parece implicado en el aumento de la señalización observado. Sin embargo, no podemos excluir totalmente la hipótesis de que OB-RGRP regula directamente la actividad de los OB-R. La aplicación de antisentido específicos dirigidos contra OB-RGRP debería ser útil para aumentar la señalización de los OB-R en los trastornos asociados con la leptina, como la obesidad humana en la que se observa una resistencia a la leptina, caracterizada por una respuesta inadaptada a esta hormona. El aumento de la expresión de los receptores en la superficie de las células y de su señalización debe ser importante para aumentar la respuesta a la leptina en el caso de la obesidad humana, en primer lugar por aumento del transporte de la leptina hacia el cerebro a través de la barrera hemato-encefálica y en segundo lugar por un aumento de la señalización de los OB-R a nivel del hipotálamo. La interacción entre OB-RGRP y OB-Rs permite suponer que la acción de OB-RGRP se hace por esta interacción directa con los receptores y que impedir ésta puede dar lugar a reproducir los efectos del OON antisentido específico. Proponemos utilizar el ensayo de BRET de las interacciones entre OB-RGRP y OB-Rs, Y MY047 YOB-Rs descrito más arriba, como ensayo de cribado de moléculas que pueden modular esta interacción. Este ensayo podrá realizarse bien sobre células enteras o permeabilizadas, que coexpresan las proteínas de fusión de los compañeros de BRET OB-RGRP Y OB-Ro o MY047 y OB-Ro. bien sobre fracciones de membrana obtenidas de estas células.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> AVENTIS PHARMA S.A. CNRS INSERM
5
<120> 08 RGRP
<130> FRAV2003/0005
<160> 47
<170> Patentln versión 3.1
10
<210> 1 <211>648 <212> ADN <213> Horno sapiens
<400> 1 cactttattc tgattacagt
gcacatgcgg
cattttacta
catgttcact ttaagaaaga
cctgtcaaat ttagattatg
acggtgctct cagaaaatat
catcgaaacc ttttgcttgg
tcatgaccca ggaaggccgg
tgtggcccac agaccaagag
gaagccccac tctggaccca
aagtttgaga agcatcatca
gtggctaaac cacttaacct
15
<210> 2 <211>20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
20
<220> <223> AS14 <220> <221> característica_mise <223>antisentido AS14
25
<400> 2 20 aatgccgcat gtgcacatgt
<210> 3 <211>396 <212> ADN <213> Horno sapiens
30
<220> <221> CDS <222> (1 )..(396) <223>
<400> 3
gcattgaatt tcttagaact catactatct
gtatacatgt 60.
tgaaatttaa tatgctgggt tttttaatac
ctttatatat 120
cttcataagt aggagatgag
ttttattctc agcaaataga 180
ttactcaaat tatgttactt gtttggctgt
tcatgtagtc 240
attaacgcag tcttgtaggc agctgccacc
ttatgcagtg 300
ggatgtgctt ggagaggcag ataacgctga
agcaggcctc 360
ggtggatccc tctttgtgtt gtagtccatg
ctattaaaag 420
cctcaacatt tcctagagcc ttattagaaa
tgcagaatct 480
ggacattttg atgagatcca aaggagttgt
atgcacatga 540
tagagaagta aacatcacac
ccaacttcct tatctttcca 600
ctctgggtgt tacctgctca tttgttta
648
atg geg g~e gtt aaa get etc gt~ gea tta tee tte agt g~g get att 48
Met Ala G y val Lys Ala Leu Va Ala Leu Ser phe Ser G y Ala Ile
1 5 10
g~a etg aet ttt ett atg etg g~a tgt gee tta gag gat tat
G y Leu Thr phe Leu Met Leu G y Cys Ala Leu Glu ASp Tyr 20 25 30
tae tgg cee tta tte gte etg att tte cae gee ate tee cee
Tyr Trp pro Leu phe val Leu Ile Phe His Ala Ile Ser Pro 35 40 45
eat tte att gee aaa aga gte aee tat gae tea gat gea aee
His Phe Ile Ala Lys Arg val Thr Tyr ASp Ser ASp Ala Thr SO 55 60
gee tgt egg gaa etg gea tat tte tte aet aet g~a att gtt
Ala Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Phe Phe Thr Thr G y Ile val 65 70 75
gee ttt g~a ttt eet gtt att ett get egt gt~ get gtate Ala phe G y phe Pro val Ile Leu Ala Arg Va Ala VaT Ile 85 90
g~a gee tge gTe ctt gt~ ttg gea grC aat gea gte att tte
G y Ala cys G y Leu va Leu Ala G y Asn Ala val Ile phe 100 105 110
att caa g19 ttt ttc ctt ata ttt 9Ta aga gTa gat gat
Ile Gln G y phe Phe Leu Ile phe G y Arg G y ASp ASp115 120 125
gag cag tgg tag Glu Gln Trp 130
<210> 4 5 <211> 131
<212> PRT
<213> Horno sapiens
<400> 4
g~e gtt
G y val
ate cee
Ile Pro
agt agt
Ser ser
gtt tet val ser
aaa tggLys Trp95
ett aea
Leu Thr
ttt a9c Phe Ser
96 144
192 240 288
336
tggTrp
384 396
Met Ala Gly val Lys Ala Leu val Ala Leu ser Phe Ser Gly Ala rle 1 5 10 15
Gly Leu Thr phe Leu Met Leu Gly Cys Ala Leu Glu ASp Tyr Gly val 20 2S 30
Tyr Trp Pro Leu phe val Leu Ile phe His Ala Ile Ser Pro Ile pro 35 40 4S
His Phe rle Ala Lys Arg val Thr Tyr ASp Ser ASp Ala Thr Ser Ser 50 55 60
Ala cys Arg Glu Leu Ala Tyr Phe Phe Thr Thr Gly Ile val val Ser 65 70 75 80
Ala phe Gly phe pro val rle Leu Ala Arg val Ala val rle Lys Trp85 90 95
Gly Ala cys Gly Leu val Leu Ala Gly Asn Ala val rle Phe Leu Thr 100 105 110
Ile Gln Gly phe phe Leu rle Phe Gly Arg Gly ASp ASp Phe Ser Trp 115 120 125
Glu Gln Trp 130
<210> 5
<211> 1359
<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> 08 RGRP LUC
<220>
<221> característica_mise 10 <223> 08 RGRP LUC
<220>
<221> CDS
<222> (1 ).. (1359)
<223>
15 <400> 5
atg geg g~e gtt aaa get etc Met Ala G y val Lys Ala Leu
1 5 etg aet ttt ett atg etg
g~a
G Y Leu Thr phe Leu Met Leu
tae tgg cee tta tte gte etgTyr Trp pro Leu Phe val Leu
35 eat 't'te att gee aaa aga gte
His Phe Ile Ala Lys Arg val
50 55 gee 'tg't egg gaa etg gea tat
Ala cys Arg Glu Leu Ala Tyr65 70
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Ala Phe G y phe pro val Ile
g~a gee tge g~e ett gtttg G Y Ala cys G y Leu va1 Leu 100 att eaa g1g ttt tte ett ata
Ile Gln G y phe phe Leu Ile 115
gag eag tgg att eeg g1g gat
Glu Gln Trp Ile pro G y ASp130 135
aag gt tae gae cee gag eag
Lys VaT Tyr ASp pro Glu Gln 145 150
tgg 'tgg gee agg tge aag eag
Trp Trp Ala Arg cys Lys Gln
165 tae tae gae age gag aag cae
gtgea tta tee tte agt
VaT Ala Leu Ser Phe Ser
10 tgt gee tta gag gat
g~a
G y Cys Ala Leu Glu ASp
2S att tte cae gee ate tee
Ile Phe His Ala Ile Ser 40 45
aee tat gae tea gat gea
Thr Tyr ASp Ser ASp Ala 60
tte tte aet aet gTa att
Phe Phe Thr Thr G y Ile
75 ett get egt gt~ get gt~
Leu Ala Arg va Ala Va 90
gea g1e aat gea gte att
Ala G y Asn Ala val Ile 105
ttt gTa aga g1a gat gat
Phe G y Arg G y ASp ASp 120 125
cea eeg get aga gee aee
Pro Pro Ala Arg Ala Thr
140 agg aag agg atg ate aee
Arg Lys Arg Met Ile Thr 155
atg aae gtetg gae age
Met Asn VaT Leu ASp Ser
170 gee gag aae gee gtg ate
get att
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G y Ala Ile
ta't g~e gtt
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Pro Ile pro
aee agt agt
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gt't g'tt tet
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Ile Lys Trp
95 'tte ett aea
Phe Leu Thr
110 tt't age tgg
Phe Ser Trp
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Me't Thr Ser
gTe cee eag
G y pro Gln 160
'tte ate aae phe Ile Asn 175
'tte etg cae
96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576
Tyr Tyr ASp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val rle Phe Leu His
180 185 190 aae gee get age age tae etg tgg agg cae gt~ gt~ cee cae ate
g~e
G Y Asn Ala Ala ser Ser Tyr Leu Trp Arg His va Va Pro Hi s Ile 195 200 205
gag cee gtgee agg tge ate ate cee gat etg ate gTe atg g~e aag -672 Glu Pro VaT Ala Arg Cys Ile rle Pro ASp Leu rle G y Met G y Lys
210 215 220 age g~e aag age gTe aae gTe age tae agg etg ctg gae cae tae aag 720
Ser G y Lys Ser G y Asn G y Ser Tyr Arg Leu Leu ASp Hi s Tyr Lys
225 230 235 240 tae etg acc gee tgg ttc gag etc etg aac etg cee aag aag ate ate 768
Tyr Leu Thr Ala Trp phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys Lys rle Ile 245 250 255
tte gt gTe cae gae tgg gTe gee tge etg gee tte cae tae age tae 816
Phe vaT G y H; s ASp Trp G y Ala cys Leu Ala phe H;S Tyr Ser Tyr
260 265 270 gag cae eag gae aag ate aag gee ate gt? cae gee gag age gt~ gtT 864
Glu His Gln ASp Lys Ile Lys Ala Ile va Hi s Ala Glu Ser Va va
275 280 285 gae gtate gag age tgg gae gag tgg cea gae ate gag gag gae ate 912
ASp vaT Ile Glu ser Trp ASP Glu Trp pro ASp rle Gl u Gl u ASp Ile 290 295 300
gee etg ate aag age gag gag gle gag aag atg gtetg gag aae aac 960
Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu G y Glu Lys Met vaT Leu Glu Asn Asn 305 310 315 320
tte tte gt~ gag aee atg etg cee age aag ate atg aga aag ctg gag 1008
Phe Phe va Glu Thr Met Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg Lys Leu Glu
325 330 335 cee gag gag tte gee gee tac etg gag cee tte aag gag aag gle gag 1056
Pro Glu Glu phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro phe Lys Glu Lys G y Glu 340 345 350
gtTaga aga cee aee etg age tgg cee aga gag ate cee etg QtTaag 1104
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100 105 110
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210 215 220
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245 250 255 Phe val Gly His ASp Trp Gly Ala Cys Leu Ala Phe His Tyr Ser Tyr260 265 270 Glu H;S Gln ASp Lys Ile lys Ala Ile val H;S Ala Glu Ser val val
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385 390 395 400 Gly Phe Phe ser Asn Ala rle val Glu Gly Ala Lys Lys Phe Pro Asn
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~O ~5 ~O
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Trp ser ser pro pro Leu val pro Phe pro Leu Gln Tyr Gln val Lys 260 265 270
Tyr Ser Glu Asn Ser Thr Thr val rle Arg Glu Ala ASp Lys Ile val 275 280 285
Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val ASp Ser Ile Leu pro Gly Ser Ser Tyr 290 295 300
Glu val Gln val Arg Gly Lys Arg Leu ASp Gly pro Gly Ile Trp ser 305 310 315 320
ASp Trp Ser Thr Pro Arg val Phe Thr Thr Gln ASp val rle Tyr phe 325 330 335
Pro pro Lys rle Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn val Ser Phe His cys 340 345 350
Ile Tyr Lys Lys Glu Asn Lys Ile val pro Ser Lys Glu Ile val Trp 355 360 365
Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys Ile Pro Gln ser Gln Tyr ASp val val 370 375 380
Ser ASp His val Ser Lys val Thr Phe Phe Asn Leu Asn Glu Thr Lys 385 390 395 400
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465 470 475 480 pro Ile ser Glu Pro Lys ASp Cys Tyr Leu Gln Ser ASp Gly Phe Tyr 485 490 495 Glu Cys rle Phe Gln Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp
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530 535 540 Ala Glu Ile Thr Ile Asn Ile Gly Leu Leu Lys rle Ser Trp Glu Lys
545 550 555 560 Pro val Phe pro Glu Asn Asn Leu Gln Phe Gln rle Arg Tyr Gly Leu 565 570 575 Ser Gly Lys Glu val Gln Trp Lys Met Tyr Glu val Tyr ASp Ala Lys -580 585 590 Ser Lys Ser val Ser Leu Pro val pro ASp Leu cys Ala val Tyr Ala 595 600 605 val Gln val Arg cys Lys Arg Leu ASp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn
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705 710 715 720 Gly Ala Ser val Ala Asn Phe Asn Leu Thr phe Ser Trp Pro Met Ser 725 730 735 Lys val Asn rle val Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Asn Ser Ser
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1824
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2352
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2496
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Phe Thr Phe leu Trp Thr Glu Gln Ala His Thr val Thr val Leu Ala 725 730 735
rle Asn Ser rle Gly Ala Ser Val Ala Asn phe Asn Leu Thr Phe Ser
740 745 750 Trp Pro Met Ser Lys val Asn Ile val Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro 755 760 765 Leu Asn Ser Ser cys val rle val Ser Trp rle Leu Ser Pro Ser ASp
770 775 780
Tyr Lys Leu Met Tyr Phe rle rle Glu Trp Lys Asn Leu Asn Glu ASp
785 790 795 800
Gly Glu rle Lys Trp Leu Arg rle Ser ser Ser val Lys Lys Tyr Tyr
805 810 815 Ile His ASp His phe rle pro rle Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr820 825 830 pro rle Phe Met Glu Gly val Gly Lys pro Lys rle rle Asn Ser Phe 835 840 845 Thr Gln ASp ASp Ile Glu Lys His Gln ser ASp Ala Gly Leu Tyr val 850 855 860 Ile Val pro val rle rle Ser Ser Ser Ile Leu Leu Leu Gly Thr Leu
865 870 875 880 Leu rle Ser His Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp.Glu ASp val Pro 885 890 895 Asn Pro Lys Asn cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn phe Gln Lys Arg900 905 910 Thr Asp rle Leu ASp Pro Pro Ala Arg Ala Thr Met Thr Ser Lys val 915 920 925 Tyr ASp pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr Gly Pro Gln Trp Trp 930 935 940
Ala Arg cys Lys Gln Met Asn val Leu ASP Ser phe rle Asn Tyr Tyr
945 950 955 960
ASp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala val Ile phe Leu His Gly Asn
965 970 975
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His val val pro His Ile Glu Pro 980 985 990
val Ala Arg cys Ile Ile Pro ASp Leu Ile Gly Met Gly Lys ser Gly995 1000 1005
Lys ser
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1025 Phe val
1040 Tyr Glu
1055 Val val
1070 Glu ASp
1085 Leu Glu
1100 Met Arg
1115 Phe lys1130 Arg Glu
1145 Ile val
1160 Pro Lys1175 Ile val
1190 val Lys1205. Gly Lys1220 Gln
<210> 13
<211> 3486
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1150 Arg Asn Tyr Asn Ala 1165 Met Phe Ile Glu Ser
1180 Glu Gly Ala Lys Lys 1195 Gly Leu Hi s phe Ser 1210 Tyr rle Lys Ser Phe
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1140 Gly Gly Lys Pro ASp
1155 Tyr Leu Arg Ala ser
1170 ASp Pro Gly Phe phe
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1215 val Glu Arg val Leu
Tyr lys Tyr lys Ile Ile His Tyr ser Ala Glu ser ASp Ile Glu Lys Met val Ser Lys Ile leu Glu Pro Ser Trp Pro Val val Gln ASp ASp Leu ser Asn Ala phe val Lys ASp Glu Met Lys Asn Glu
<212> ADN
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<220>
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5 <220>
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<223> OBR YFP
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1 5 10
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2160
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2208
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2256
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2304
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2640
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2688
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2736
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tee gee atg eee gaa gTe tae gte eag gag ege aee ate tte tte 3069
Ser Ala Met pro Glu G y Tyr val Gln Glu Arg Thr Ile Phe phe
1010 1015 1020
aag gae gae gfe aae tae aag aee ege gee gag gtaag tte gag 3114
Lys ASp ASp G y Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu VaT Lys Phe Glu
1025 1030 1035 e gae aee etg gt aae ege ate gag etg aag e ate gae tte 3159
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Lys Glu Asp G y Asn Ile Leu G y His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr
1055 1060 1065 aae age eae aac gtc tat ate atg gee gae aag eag aag aae 3249
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1070 1075 1080 ate aag gt aae tte aag ate ege cae aae ate gag gae e age 3294
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1085 1090 1095 gtreag ete gee gae eae tae eag eag aae aee eee ate gre gae 3339
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Leu Tyr Lys
1160 o
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485 490 495
Pro Ser Ile His Pro Ile ser Glu Pro Lys ASp Cys Tyr Leu Gln Ser 500 505 510
ASp Gly Phe Tyr Glu cys rle Phe Gln Pro rle Phe Leu Leu Ser Gly
515 520 525 Tyr Thr Met Trp rle Arg rle Asn Hi s Ser Leu Gly Ser Leu ASp Ser
530 535 540 Pro Pro Thr cys val leu Pro ASp Ser val val lys Pro Leu Pro pro
545 550 555 560
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Tyr ASp Ala Lys Ser Lys Ser val ser Leu pro val pro ASp Leu cys610 615 620
Ala val Tyr Ala val Grn val Arg cys Lys Arg Leu ASp Gly Leu Gly625 630 635 640
Tyr Trp ser Asn Trp Ser Asn Pro Ala Tyr Thr val val Met ASP rle
645 650 655 Lys val pro Met Arg Gly pro Glu Phe Trp Arg Ile rle Asn Gly ASp660 665 670 Thr Met lys lys Glu Lys Asn val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met 675 680 685 Lys Asn ASp Ser Leu cys Ser Val Gln Arg Tyr val rle Asn His His 690 695 700 Thr Ser cys Asn Gly Thr Trp Ser Glu ASp val Gly Asn His Thr Lys
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805 810 815
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rle val Pro val rle rle ser ser Ser rle Leu Leu Leu Gly Thr Leu 865 870 875 880
Leu Ile Ser His Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu ASp val Pro 885 890 895
Asn Pro Lys Asn Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn phe Gln Lys Arg900 905 910
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Glu Leu Phe Thr Gly val val Pro Ile Leu val Glu Leu ASp Gly ASp930 935 940
val Asn Gly His Lys Phe ser val Ser Gly Glu Gly Glu Gly ASp Ala
945 950 955 960 Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile cys Thr Thr Gly Lys Leu 965 970 975 Pro val Pro Trp Pro Thr Leu val Thr Thr phe Gly Tyr Gly val Gln 980 985 990 Cys phe Ala Arg Tyr Pro ASp His Met Arg Gln His ASp Phe phe Lys995 1000 1005 Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr val Gln Glu Arg Thr rle Phe phe1010 1015 1020 Lys ASp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu val Lys Phe Glu
1025 1030 1035
Gly Asp Thr Leu val Asn Arg rle Glu Leu Lys Gly rle ASp phe1040 1045 1050
Lys
Glu 1055 Asp Gly ASn rle Leu 1060 Gly H;S Lys Leu Glu 1065 Tyr Asn Tyr
Asn
Ser 1070 H;s Asn val Tyr Ile 1075 Met Ala ASp Lys Gln 1080 Lys Asn Gly
Ile Lys1085
val Asn Phe Lys Ile 1090 Arg H;s Asn Ile Glu 1095 Asp Gly Ser
val
Gln 1100 Leu Ala ASp H;S Tyr1105 Gln Gln Asn Thr Pro 1110 Ile Gly ASp
Gly
Pro 1115 val Leu Leu Pro Asp 1120 Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser 1125 .
Ala Leu 1130
Ser Lys ASp pro Asn 1135 Glu Lys Arg Asp H;s 1140 Met val Leu
Leu Glu 1145
phe val Thr Ala Ala 1150 Gly Ile Thr Leu Gly1155 Met ASp Glu
Leu Tyr1160
Lys
5
<210> 15 <211> 396 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (396) <223>
10
<400> 15 atg gea gle ate Met Ala G y Ile 1 gTa etg atg ttt G y Leu Met phe 20 tae tgg eee ete Tyr Trp pro Leu 35 tac tge ata gea aaa getLys Ala 5 ttg atgLeu Met ttt gttphe val aga aga ttg att agt ttg tee ttt gla gla gea ateLeu Ile Ser Leu ser phe G y G Y Ala Ile 10 15 ett gTa tgt gee ett cea ata tae aae aaa Leu G y Cys Ala Leu pro Ile Tyr Asn Lys 25 30 eta ttt ttt tae ate ett tea eet att eea Leu Phe Phe Tyr Ile Leu Ser Pro Ile pro 40 45 tta gtg gat gat aca gat get atg agt aae 48 96 144 192
. Tyr Cys rle Ala Arg Arg Leu val Asp ASp Thr ASp Ala Met Ser 50 55 60 get tgt aag gaa ett gee ate ttt eLt aea aeg g!r att gte gt1Ala Cys Lys Glu Leu Ala Ile phe Leu Thr Thr G y Ile val Va 65 70 75 Asn tea Ser 80
240
get ttt gla Ala Phe G y
etc eet att gta ttt gee aga gea eat etg att gagLeu Pro Ile val Phe Ala Arg Ala His Leu Ile Glu 85 90 95 tggTrp 288
g~a get tgt gea ett gtt etc aea gla aae aea gte ate ttt gca G Y Ala cys Ala Leu val Leu Thr G y Asn Thr val Ile phe Ala 100 105 110
aet Thr 336
ata cta gTe ttt tte ttg gte ttt gTa agc aat gae gae tte ageIle Leu G y phe phe Leu val phe G y Ser Asn ASp ASp phe Ser 115 120 125
tggTrp 384
eag eag tgg tgaGln Gln Trp 130
396
5
<210> 16 <211> 131 <212> PRT <213> Hamo sapiens <400> 16
Met Ala .Gly Ile Lys Ala Leu Ile Ser Leu Ser phe Gly Gly Ala Ile 1 5 10 15
Gly Leu Met
phe Leu Met 20 Leu Gly Cys Ala Leu 2S pro Ile Tyr Asn 30 Lys
Tyr Trp pro leu phe val 3S
Leu Phe Phe Tyr Ile Leu Ser Pro Ile Pro 40 45
Tyr Cys50
Ile Ala Arg Arg Leu Val 55 ASp ASp Thr ASp Ala Met Ser Asn 60
Ala cys65
Lys Glu Leu Ala Ile Phe Leu Thr Thr Gly Ile val 70 75 val Ser 80
Ala Phe Gly Leu
pro Ile val 85 Phe Ala Arg Ala His Leu Ile Glu Trp90 9S
Gly Ala cys Ala Leu val 100
Leu Thr Gly Asn Thr val 105 Ile phe Ala Thr 110
Ile Leu Gly115
phe phe Leu val Phe Gly Ser Asn ASp ASp Phe Ser Trp120 125
Gln Gln Trp 130
10 15
<210> 17 <211> 1359 <212> ADN <213> Hamo sapiens <220> <221> característica_mise <223> MY47 LUC
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (1359)
<223>
5 <400> 17
atg gea g~e ate aaa get ttg att agt ttg tee ttt g~a g~a gea ate
Met Ala G y Ile Lys Ala Leu Ile ser Leu Ser phe G y G Y Ala Ile
1 5 10 15
g1a etg atg ttt ttg atg ett g1a tgt gee ett eea ata tae aae aaa G Y Leu Met phe Leu Met Leu G y cys Ala Leu pro Ile Tyr Asn Lys
20 25 30
tae tgg eee ete ttt gtt eta ttt ttt tae ate ett tea eet att eea
Tyr Trp pro Leu Phe val Leu Phe phe Tyr Ile Leu Ser Pro Ile pro 35 40 45
tae tge ata gea aga aga tta gtgat gat aea gat get atg agt aae
Tyr cys Ile Ala Arg Arg Leu Va1 ASp ASp Thr ASp Ala Met ser Asn 50 55 60
get tgt aag gaa ett gee ate ttt ett aea aeg g1e att gte gttea Ala Cys Lys Glu Leu Ala Ile Phe Leu Thr Thr G y !le Val Va1 Ser 65 70 75 80
get ttt g1a ete eet att gta ttt gee aga gea eat etg att gag tgg
Ala phe G y Leu Pro Ile val Phe Ala Arg Ala Hi s Leu Ile Glu Trp 85 90 95
g~a get tgt gea ett gtt ete aea g1a aae aea gte ate ttt gea aet
G Y Ala cys Ala Leu val Leu Thr G y Asn Thr val Ile Phe Ala Thr 100 105 110
ata eta g~e ttt tte ttg gte ttt g1a age aat gae gae tte age tggIle Leu G y phe phe Leu val Phe G y ser Asn ASp ASp Phe Ser Trp 115 120 125
eag eag tgg ega eeg gt~ gat cea eeg get aga gee aee atg aec ageGln Gln Trp Arg pro Va ASp Pro Pro Ala Arg Ala Thr Met Thr ser 130 135 140
96 144 192 240 288 336 384 432
aag gt tae gae cee gag eag agg aag agg atg ate aee g~e cee eag 480
Lys va1 Tyr ASp pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr G y Pro Gln 145 150 155 160
tgg tgg gee agg tge aag eag atg aae gtetg gae age tte ate aae 528
Trp Trp Ala Arg cys Lys Gln Met Asn Va1 Leu ASp Ser Phe Il e Asn
165 170 175
tae tae gae age gag aag cae gee gag aae gee gtate tte ctg cae 576 Tyr Tyr ASp ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Va1 Ile Phe Leu Hi s
180 185 190 g~e aae gee get agc age tae etg tgg agg cae gt1gt cee cae ate 624
G Y Asn Ala Ala Ser ser Tyr Leu Trp Arg His va Var Pro His Ile
195 200 205 gag cee gtgee agg tge ate ate cee gat etg atc g1e atg g1e aag 672
Glu Pro va1 Ala Arg cys Ile Ile Pro ASp Leu Ile G y Met G y Lys
210 215 220 age e aag age gre aae g1e age tae agg etg etg gae cae tae aag 720
gr
Ser G y Lys Ser G y Asn G y Ser Tyr Arg Leu Leu ASp His Tyr Lys225 230 235 240
tae ctg aec gce tgg tte gag etc ctg aac etg cee aag aag ate ate 768
Tyr Leu Thr Ala Trp phe Glu Leu Leu Asn Leu pro Lys Lys Ile Ile
245 250 255 tte gt1gqe e~e gae tgg gre gee tge etg gee tte cae tae age tae 816
phe Va G y H1S Asp Trp G y Ala cys Leu Ala Phe His Tyr Ser Tyr
260 265 270 gag cae eag gae aag ate aag gee ate gtcae gee gag age gtq gt864
Glu His Gln ASp Lys Ile Lys Ala Ile Va1 His Ala Glu Ser Va va1 275 280 285
gae gt1ate gag age tgg gae gag tgg eea gae ate gag gag gae ate 912
ASp Va Ile Glu Ser Trp ASp Glu Trp Pro ASp Ile Glu Glu ASp Ile 290 295 300
gee etg ate aag age gag gag g1e gag aag atg gtetg gag aae aae 960
Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu G y Glu Lys Met va1 Leu Glu Asn Asn
305 310 315 320 tte tte gtq gag aee atg etg cee agc aag ate atg aga aag etg gag 1008
phe Phe va Glu Thr Met Leu pro Ser Lys Ile Met Arg Lys Leu Glu 325 330 335
cee gag gag tte gee gee tae ctg gag cee ttc aag gag aag g1e gag 1056
Pro Glu Glu phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu Lys G y Glu 340 345 350
gt aga aga eee aee etg age tgg eee aga gag ate cce etg gtq aag 1104
Var Arg Arg pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile pro Leu Va Lys
355 360 365 gqe gqe aag cee gae 9t 9t1 eag ate gtaga aae tae aae gee tae 1152
G Y G Y Lys pro ASp va1 Va Gln Ile va1 Arg Asn Tyr Asn Ala Tyr 370 375 380
et9 aga gee age gae gae etg cee aag atg tte ate gag age gae cee 1200
Leu Arg Ala Ser ASp ASp Leu Pro Lys Met phe Ile Glu Ser Asp pro
385 390 395 400 gqe tte tte age aae gee ate gtgag g1e gec aag aag tte eee aae 1248
G Y Phe phe Ser Asn Ala Ile Va1 Glu G y Ala Lys Lys Phe Pro Asn 405 410 415
aee gag tte gt~ aag gt~ aag g~e ctg cae ttc agc eag gag gac gee 1296 Thr Glu phe va Lys Va Lys G y Leu His Phe Ser Gln Glu Asp Ala 420 425 430
cce gac gag atg glc aag tac atc aag age ttc gt1gag aga gt1ctg 1344 pro Asp Glu Met G y Lys Tyr Ile Lys Ser phe va Glu Arg Va Leu 435 440 445
aag aac gag eag taa 1359 Lys Asn Glu Gln 450
<210> 18
<211> 452
<212> PRT
<213> Homo sapiens
5 <220>
<221> característica_mise
<223> MY47 LUC
<400> 18
Met Ala Gly Ile Lys Ala Leu Ile Ser Leu Ser phe Gly Gly Ala Ile 1 5 10 15
Gly Leu Met Phe Leu Met Leu Gly cys Ala Leu pro Ile Tyr Asn Lys20 25 30
Tyr Trp pro Leu phe val Leu Phe Phe Tyr Ile Leu Ser Pro Ile Pro 35 40 45
Tyr Cys Ile Ala Arg Arg Leu val ASp ASP Thr ASp Ala Met Ser Asn 50 55 60
Ala Cys Lys Glu Leu Ala Ile Phe Leu Thr Thr Gly Ile val val Ser 65 70 75 80
Ala Phe Gly Leu pro Ile Val Phe Ala Arg Ala His Leu Ile Glu Trp 85 90 95
Gly Ala Cys Ala Leu val Leu Thr Gly Asn Thr val Ile Phe Ala Thr 100 105 110
Ile Leu Gly phe phe Leu val Phe Gly Ser Asn ASp ASp Phe Ser Trp 115 120 125
Gln Gln Trp Arg pro val ASp Pro Pro Ala Arg Ala Thr Met Thr Ser 130 135 140
Lys val Tyr ASp Pro Glu Gln Arg lys Arg Met Ile Thr Gly Pro Gln 145 150 155 160
Trp Trp Ala Arg cys lys Gln Met Asn val Leu ASp Ser phe Ile Asn 165 170 175
Tyr Tyr ASp Ser Glu lys His Ala Glu Asn Ala val Ile Phe leu H;S
180 185 190
Gly Asn Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Trp Arg H;S val val pro H;s Ile 195 200 205
Glu Pro val Ala Arg cys Ile Ile Pro ASp Leu Ile Gly Met Gly lys210 215 220
Ser Gly lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu ASp H;S Tyr lys 225 230 235 240
Tyr leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn leu pro lys Lys Ile Ile 245 250 255
phe val Gly His ASp Trp Gly Ala cys Leu Ala phe H;S Tyr Ser Tyr260 265 270
Glu H;S Gln ASp lys Ile lys Ala Ile val H;S Ala Glu Ser val val 275 280 285
ASp val Ile Glu Ser Trp ASp Glu Trp pro ASp Ile Glu Glu ASp Ile 290 295 300
Ala Leu Ile lys Ser Glu Glu Gly Glu lys Met val leu Glu Asn Asn 305 310 315 320
Phe Phe val Glu Thr Met Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg Lys Leu Glu 325 330 335
Pro Glu Glu phe Ala Ala Tyr Leu Glu pro Phe Lys Glu Lys Gly Glu 340 345 350
val Arg Arg pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile pro Leu val Lys 355 360 365
Gly Gly Lys Pro Asp val val Gln Ile val Arg Asn Tyr Asn Ala Tyr 370 375 380
Leu Arg Ala Ser ASp ASp Leu Pro Lys Met Phe Ile Glu Ser Asp Pro 385 390 395 400
Gly Phe phe Ser Asn Ala Ile val Glu Gly Ala Lys Lys Phe Pro Asn 405 410 415
Thr Glu Phe val lys val lys Gly leu His Phe ser Gln Glu ASp Ala 420 425 430
Pro ASp Glu Met Gly lys Tyr rle Lys Ser phe Val Glu Arg val Leu 435 440 445
Lys Asn Glu Gln 450
<210> 19 <211> 1140 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
5
<220> <223> MY047 YFP
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10
<220> <221> CDS <222> (1 ).. (1140) <223>
<400> 19
atg gea g~e ate aaa get ttg att agt ttg tee ttt g~a g~a gea ate Met Ala G y rle Lys Ala Leu Ile Ser Leu Ser Phe G y G Y Ala rle 1 5 10 15
48
g~a etg atg ttt ttg atg ett g~a tgt gee ett G Y Leu Met phe Leu Met Leu G y cys Ala Leu 20 2S
cea ata tae aae pro Ile Tyr Asn 30 aaa Lys 96
tae tgg eee ete ttt gtt eta ttt ttt tae ate ett tea eet att eea Tyr Trp pro Leu phe val Leu Phe Phe Tyr rle Leu Ser Pro rle pro 35 40 45
144
tae tge ata gea aga aga tta gt~ gat gat aea gat get atg agt aae Tyr cys rle Ala Arg Arg Leu Va ASp ASp Thr ASp Ala Met Ser Asn 50 55 60
192
get tgt aag gaa ett gee ate ttt ett aea aeg g~e att gte gt~ tea Ala cys Lys Glu Leu Ala rle Phe Leu Thr Thr G y Ile val Va ser 65 70 75 80
240
15
get ttt g~a ete eet att gta ttt gcc aga gca eat etg att gag tggAla phe G y Leu pro rl e val Phe Ala Arg Ala His Leu rle Glu Trp 85 90 95 288
g~a get tgt gea ett gtt ete aea gqa aae aea gte ate ttt gea aet G Y Ala Cys Ala Leu val Leu Thr G y Asn Thr val rle phe Ala Thr 100 105 110
336
ata eta g~e ttt tte ttg gte ttt gqa age aat gae gae tte age tggIle Leu G y phe Phe Leu val phe G y Ser Asn ASp ASp phe Ser Trp115 120 125
384
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cea eeg gte gee aee atg gt~ age aag pro Pro val Ala Thr Met va Ser Lys140 432
g~e gag gag etg tte aee g~g gt~ gt~ eee ate etg gte gag etg gae G Y Glu Glu Leu Phe Thr G y Va Va Pro Ile Leu val Glu Leu ASp145 150 155 160
480
g~e gae gta G Y Asp val
aae gqe eae Asn G y Hi s 165 aag tte age gt~ tee g~e gag g~e gag g~eLys phe Ser Va Ser G y Glu G y Glu G y 170 175 528
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576
aag etg eee Lys Leu Pro 195
gt~ eee tgg cee aee etc gt~ aee aee tte g~e tae g~eva Pro Trp Pro Thr Leu Va Thr Thr phe G y Tyr G y 200 205 624
gt~ eag tge tte gee ege tae eee gae eae atg ege eag cae gae tte Va Gln Cys phe Ala Arg Tyr Pro ASp His Met Arg Gln His Asp phe 210 215 220
672
tte aag tee gee atgPhe Lys Ser Ala Met 225
cee gaa g~e tae gte eag gag ege aee ate tte Pro Glu G y Tyr val Gln Glu Arg Thr Ile Phe 230 235 240 720
tte aag gae gae g~e aae tae aag aee ege gee gag gt~ aag tte gagPhe Lys ASp ASp G y Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu va Lys phe Glu 245 250 255
768
g~e gae aee etg gt~ aae ege ate gag etg aag g!r ate gae G Y Asp Thr Leu va Asn Arg Ile Glu Leu Lys G y Ile ASp260 265 270
tte aagPhe Lys 816
gag gae g~r aae ate etg g~g cae Glu ASp G y Asn Ile Leu G y Hi s 275 280
aag etg gag tae aae tae aae ageLys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser 285 864
cae aae gte tat ate atg gee gae aag eag aag aae g~e ate aag gt~His Asn val Tyr Ile Met Ala ASp Lys Gln Lys Asn G y Ile Lys Va 290 295 300
912
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tte aag ate ege cae aae ate gag gae g~e age gtT eag etc geePhe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu ASp G y Ser Va Gln leu Ala 310 315 320 960
gae cae tae eag eag aae aee cee ate gTe gae gqe cee gtí' etg etgAsp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile G y ASp G y Pro Va Leu Leu 325 330 335
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aae gag aag ege gat cae atg gte etg etg gag tte gtyaee gee geeAsn Glu Lys Arg ASp His Met val Leu Leu Glu Phe Va Thr Ala Ala 355 360 365
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1140
<210> 20
5
<211> 379
64
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> MY047 YFP
5 <220>
<221> característica_mise
<223> MY47 YFP
<400> 20
Met Ala Gly rle Lys Ala Leu rle Ser Leu Ser phe Gly Gly Ala rle 1 5 10 15
Gly Leu Met Phe Leu Met Leu Gly Cys Ala Leu pro rle Tyr Asn Lys20 25 30
Tyr Trp Pro Leu phe val leu Phe Phe Tyr rle leu Ser Pro rle Pro 35 40 45
Tyr Cys rle Ala Arg Arg leu val Asp ASp Thr ASp Ala Met Ser Asn 50 55 60
Ala Cys Lys Glu Leu Ala rle Phe Leu Thr Thr Gly rle val val Ser 65 70 75 80
Ala phe Gly leu pro rle val Phe Ala Arg Ala His Leu rle Glu Trp85 90 95
Gly Ala Cys Ala Leu val Leu Thr Gly Asn Thr val rle Phe Ala Thr 100 105 110
rle Leu Gly phe phe Leu val Phe Gly Ser Asn ASp ASp Phe Ser Trp 115 120 125
Gln Gln Trp Arg pro val ASp Pro Pro Val Ala Thr Met val Ser Lys 130 135 140
Gly Glu Glu leu phe Thr Gly val val Pro rle Leu val Glu Leu ASp 145 150 155 160
Gly ASp val Asn Gly His Lys Phe Ser val Ser Gly Glu Gly Glu Gly
165 170 175 ASp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe rle cys Thr Thr Gly 180 185 190 Lys Leu Pro val pro Trp Pro Thr Leu val Thr Thr phe Gly Tyr Gly
195 200 205 val Gln Cys phe Ala Arg Tyr pro ASp His Met Arg Gln His ASp Phe
210 215 220 Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr rle Phe
225 230 235 240 phe Lys Asp ASp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu val Lys Phe Glu 245 250 255 Gly ASp Thr Leu val Asn Arg rle Glu Leu Lys Gly rle ASp Phe Lys260 265 270 Glu ASp Gly Asn rle Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser
275 280 285 H;s Asn val Tyr Ile Met Ala ASp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys val
290 295 300 Asn Phe Lys rle Arg His Asn Ile Glu ASp Gly ser val Gln Leu Ala
305 310 315 320 ASp H;S Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly ASp Gly Pro val Leu Leu
325 330 335
Pro ASp Asn His Tyr Leu ser Tyr Gln ser Ala Leu ser Lys Asp pro340 345 350
Asn Glu Lys Arg ASp His Met val Leu Leu Glu phe val Thr Ala Ala 355 360 365
Gly rle Thr Leu Gly Met ASp Glu Leu Tyr Lys 370 375
<210> 21
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<212> ADN 5 <213> Hamo sapiens
<400> 21
gtctggcttg ggcaggctgc ccgggccgtg gcaggaagcc ggaagcagcc gcggccccag 60
ttcgggagac atggcgggcg ttaaagctct cgtggcatta tccttcagtg gggctattgg 120 actgactttt cttatgctgg gatgtgcctt agaggattat ggcgtttact ggcccttatt 180 cgtcctgatt ttccacgcca tctcccccat cccccatttc attgccaaaa gagtcaccta 240 tgactcagat gcaaccagta gtgcctgtcg ggaactggca tatttcttca ctactggaat 300 tgttgtttct gcctttggat ttcctgttat tcttgctcgt gtggctgtga tcaaatgggg 360 agcctgcggc cttgtgttgg caggcaatgc agtcattttc cttacaattc aagggttttt 420 ccttatattt ggaagaggag atgattttag ctgggagcag tggtagcact ttattctgat 480 tacagtgcat tgaatttctt agaactcata ctatctgtat acatgtgcac atgcggcatt 540 ttactatgaa atttaatatg ctgggttttt taataccttt atatatcatg ttcactttaa 600 gaaagacttc ataagtagga gatgagtttt attctcagca aatagacctg tcaaatttag 660 attatgttac tcaaattatg ttacttgttt ggctgttcat gtagtcacgg tgctctcaga 720 aaatatatta acgcagtctt gtaggcagct gccaccttat gcagtgcatc gaaacctttt 780 gcttggggat gtgcttggag aggcagataa cgctgaagca ggcc'tctcat gacccaggaa 840 ggcc9999t9 gatccctctt tgtgttgtag tccatgctat taaaagtgtg gcccacagac 900 caagagcctc aacatttcct agagccttat tagaaatgca gaatctgaag ccccactctg 960 gacccaggac attttgatga gatccaaagg agttgtatgc acatgaaagt ttgagaagca 1020 tcatcataga gaagtaaaca tcacacccaa cttccttatc tttccagtgg ctaaaccact 1080 taacctctct gggtgttacc tgctcatttg ttta 1114
<210> 22 5 <211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> AS01
10 <400> 22 gcttcctgcc acggcccggg 20
<210> 23
<211> 20
<212> ADN 15 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> AS02
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20 <210> 24
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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aacgcccgcc atgtctcccg
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
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agagctttaa cgcccgccat
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<212> ADN
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<220>
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aaggcacatc ccagcataag
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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ccataatcct ctaaggcaca
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cagtaaacgc cataatcctc
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<220>
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aataagggcc agtaaacgcc
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> AS10
<400> 31
atgccagttc ccgacaggca
<210> 32 <211>22
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> AS11
<400> 32
aaatatgcca gttcccgaca gg
<210> 33 <211>20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> AS12
<400> 33
aagaaatatg ccagttcccg
<210> 34 <211>20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> AS13
<400> 34
cattgcctgc caacacaagg
<210> 35 <211>20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> AS15
<400> 35
aaccgccgac ctgtcctccg
<210> 36 <211>22
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> AS16
<400> 36
aaatctgcac gttacagcca gg
<210> 37
<211> 21
<212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Artificial
<400> 37 gugccugucg ggaacuggct t
21
<210> 38 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Artificial
<400> 38 gccaguuccc gacaggcact t
21
<210> 39 <211>38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Artificial
<400> 39 tctcttgaat gaaacacatg tgcacacaca aacaaggc
38
<210> 40 <211>40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Artificial
<400> 40 gctctagaaa aatgtgtgca catgtgtttc atctct1gaa
40
<210>41 <211>35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Artificial
<400> 41 ccatctaggc caagcttatc cgacgccgcc atete
35
<210> 42 <211>47 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Artificial
<400> 42 tgtgtgcaca tgtgtttcat tcaagagatg aaacacatgt gcacaca
47
<210> 43 <211>14 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Artificial
<400> 43 ccgtggcagg aagc
14
<210> 44 <211>20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Artificial
<400> 44 gcagcgacag ccccagctcc
20
<210> 45 <211>16 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Artificial
<400> 45 cagccacacg agcaag
16
<210> 46 <211>15 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Artificial
<400> 46 ggagaaggct ggggc
15
<210> 47 <211>17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Artificial
<400> 47 gatggcatgg actgtgg
17

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Oligonucleótido opcionalmente modificado que comprende de 8 a 50 nucleótidos que hibrida de manera específica con la secuencia SEO ID N° 1 e inhibe la expresión de OB-RGRP, caracterizado porque comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos 90% con la secuencia SEO ID NO:2.
  2. 2.
    Oligonucleótido según la reivindicación 1 caracterizado porque favorece la expresión de los receptores de la leptina en la superficie celular.
  3. 3.
    Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque es un antisentido.
  4. 4.
    Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque los nucleótidos están tioesterificados.
  5. 5.0ligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque los nucleótidos están 2' 0metilados.
  6. 6.
    Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque presenta un residuo trietilenglicol en su extremo 3'.
  7. 7.
    Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque es monocatenario.
  8. 8.
    Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 7 en el que los nucleótidos en posiciones 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13,15,17,19 Y 20, en el sentido 5' hacia 3', están tioesterificados.
  9. 9.
    Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 7 en el que los nucleótidos en posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 16, 17, 18, 19 Y 20, en el sentido 5' hacia 3', están 2' O-metilados.
  10. 10.
    Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque es un AON.
  11. 11.
    Oligonucleótido de tipo Ácido Ribonucleico de Interferencia (ARNi) que comprende de 15 a 60 nucleótidos que hibrida de manera específica con la secuencia SEQ ID N° 21 e inhibe la expresión de OB-RGRP, caracterizado porque es un ARN bicatenario y porque al menos una de las dos cadenas comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos 90 'lo, con una de las secuencias SEO ID N° 37 o SEO IDo N 38.
  12. 12.
    Oligonucleótido de tipo Ácido Ribonucleico de Interferencia (ARNi) que comprende de 15 a 60 nucleótidos que hibrida de manera específica con la secuencia SEQ ID N° 21 e inhibe la expresión de OB-RGRP, caracterizado porque es un ARN monocatenario y porque comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos 90 %, con la secuencia SEQ ID N° 42.
  13. 13.
    Vector que expresa un oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3, 11 Y 12.
  14. 14.
    Célula que contiene un vector según la reivindicación 13.
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