ES2378411T3 - Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo intermedio de detector de fluorescencia - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de sondar múltiples dianas en una muestra biológica, que comprende: (a) proporcionar una muestra que contiene múltiples dianas; (b) unir al menos una sonda, que comprende un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas presentes en la muestra; (c) hacer reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente; (d) observar una señal procedente del generador de señal fluorescente de la etapa (c); (e) aplicar a la muestra en la etapa (c) una solución, que comprende un agente oxidante que inactiva sustancialmente tanto al generador de señal fluorescente, como a la enzima;(f) unir al menos una sonda, que comprende un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas presentes en la muestra de la etapa (e); (g) hacer reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente; (h) observar una señal procedente del generador de señal fluorescente de la etapa (g).

Description

Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo intermedio de detector de fluorescencia

Antecedentes

En el presente documento se divulgan procedimientos para analizar secuencialmente una muestra biológica para discernir, entre otros, la presencia, ausencia, concentración y/o distribución espacial de múltiples dianas biológicas en una muestra biológica.

Se han usado varios procedimientos en biología y en medicina para observar dianas diferentes en una muestra biológica. Por ejemplo, se puede realizar análisis de proteínas en secciones histológicas y otras preparaciones citológicas usando las técnicas de histoquímica, inmunohistoquímica (IHC) o inmunofluorescencia. El análisis de proteínas en muestras biológicas también se puede realizar usando inmunoensayos en estado sólido usando, por ejemplo, las técnicas de transferencias de tipo western.

Muchas de las técnicas actuales pueden detectar únicamente unas pocas dianas a la vez (tal como, IHC o transferencias de tipo western basadas en fluorescencia, en las que el número de dianas detectables está limitado por el sistema de detección basado en fluorescencia) en una única muestra. Análisis adicionales de dianas pueden requerir el uso de muestras biológicas adicionales de la fuente, lo que limita la capacidad para determinar las características relativas de las dianas, tales como la presencia, ausencia, concentración y/o distribución espacial de múltiples dianas biológicas en la muestra biológica. Además, en ciertos casos, se dispone de una cantidad limitada de la muestra para el análisis o la muestra individual puede requerir más análisis. Por tanto se necesitan procedimientos, agentes y dispositivos capaces de analizar repetidamente una muestra individual.

Breve descripción

En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos de sondeo de múltiples dianas en una muestra biológica. Los procedimientos incluyen las etapas de proporcionar una muestra que contiene múltiples dianas, unir al menos una sonda, que tiene un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas presentes en la muestra, y reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente. Los procedimientos incluyen las etapas de observar una señal procedente del generador de señal fluorescente y aplicar a la muestra una solución, que contiene un agente oxidante que inactiva sustancialmente tanto al generador de señal fluorescente, como a la enzima. Los procedimientos incluyen además las etapas de unir al menos una sonda, que tiene un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas presentes en la muestra de la etapa, reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente; y observar una señal procedente del generador de señal fluorescente. El procedimiento de unir, observar y oxidar se puede repetir de forma iterativa.

En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen las etapas de proporcionar una muestra que contiene múltiples dianas, unir al menos una sonda, que tiene un aglutinante acoplado a una peroxidasa, a una o más dianas presentes en la muestra, y reaccionar la sonda unida con un sustrato de peroxidasa acoplado a un generador de señal fluorescente. Los procedimientos incluyen las etapas de observar una señal procedente del generador de señal fluorescente y aplicar a la muestra una solución, que contiene un agente oxidante que inactiva sustancialmente tanto al generador de señal fluorescente, como a la peroxidasa. Los procedimientos incluyen además las etapas de unir al menos una sonda, que tiene un aglutinante acoplado a una peroxidasa, a una o más dianas presentes en la muestra de la etapa, reaccionar la sonda unida con un sustrato de peroxidasa acoplado a un generador de señal fluorescente; y observar una señal procedente del generador de señal fluorescente. El procedimiento de unir, observar y oxidar se puede repetir de forma iterativa.

En algunas realizaciones se proporcionan kits para la detección de múltiples dianas en una muestra biológica. Los kits incluyen múltiples sondas que tienen un aglutinante acoplado a una enzima, y un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente. Cuando se aplica a la muestra, un agente oxidante inactiva sustancialmente tanto al generador de señal fluorescente, como a la enzima.

Descripción de las figuras

La FIG.1 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 1 como función de la longitud de onda, tras 10 minutos y 15 minutos.

La FIG.2 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 1, 2 y 3 como función de la longitud de onda.

La FIG.3 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 4 como función de la longitud de onda, tras 30 minutos y 140 minutos.

La FIG.4 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 5 como función de la longitud de onda, tras 20 minutos, 2

60 minutos y 210 minutos.

La FIG.5 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 6 como función de la longitud de onda, tras 12 minutos y 16 minutos. La FIG.6 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 8 como función de la longitud de onda, tras 22 minutos,

70 minutos y 210 minutos. La FIG.7 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 9a, 10a y 11a como función de la longitud de onda. La FIG.8 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 9b y 10b como función de la longitud de onda. La FIG.9 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 12a y 12b como función de la longitud de onda. La FIG. 10 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 13, 14 y 15 como función de la longitud de onda. La FIG. 11 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 16 y 17 como función de la longitud de onda. La FIG. 12 muestra las micrografías (con un aumento 10x) de la Muestra 18A (antes de la modificación de la señal)

y la Muestra 18B (tras la modificación de la señal).

La FIG. 13 muestra las micrografías (con un aumento 10x) de la Muestra 19A (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 19B (tras la modificación de la señal). La FIG. 14 muestra las micrografías de la Muestra 20A (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 20B (tras

la modificación de la señal).

La FIG. 15 muestra las micrografías de las Muestras 21A y 21B (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 21C (tras la modificación de la señal). La FIG. 16 muestra las micrografías de las Muestras 22A y 22B (antes de la modificación de la señal) y la Muestra

22C (tras la modificación de la señal). La FIG. 17 muestra las micrografías de las Muestras 23A-E. La FIG. 18 muestra las micrografías de la Muestra 24A (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 24b (tras

la modificación de la señal).

La FIG. 19 muestra las micrografías de la Muestra 25A (canales Cy3 y Cy5), la Muestra 25B (canales Cy3 y Cy5) y las Muestras 25C-25J. La FIG. 20 muestra las micrografías de las Muestras 26A-H. La FIG. 21 muestra las micrografías de las Muestras 27A-C. La FIG. 22 muestra el gráfico de intensidad media de píxeles del fondo para cada ciclo en las imágenes del Ejemplo

20. La FIG. 23 muestra la comparación entre las micrografías de las Muestras 28A-C y 29A-C. La FIG. 24 muestra las micrografías de las Muestras 30A-D. La FIG. 25 muestra las micrografías de las Muestras 30C-F. La FIG. 26 muestra el gráfico de intensidad media de píxeles del fondo para cada ciclo en las Muestras 30C y 30D. La FIG. 27 muestra las micrografías de las Muestras 31A, 31B y 31C. La FIG. 28 muestra las micrografías de las Muestras 32A, 32B y 32C. La FIG. 29 muestra las micrografías de las Muestras 33, 34, 35 y 36. La FIG. 30 muestra las transferencias puntuales de las Muestras 37, 38, 39 y 40. La FIG. 31 muestra el gráfico de barras de las intensidades de señal relativas de las transferencias para las

Muestras 37, 38, 39 y 40. La FIG. 32 muestra el perfil de tiempo de los espectros Cy3 y Cy5.

La FIG. 33 muestra los valores de absorbancia de Cy3 como función del tiempo para diferentes concentraciones de H2O2.

La FIG. 34 muestra los valores de absorbancia como función del tiempo para diferentes fluoróforos.

La FIG. 35 muestra los valores de absorbancia de QD 655 como función del tiempo para H2O2.

La FIG. 36 muestra los espectros de absorbancia para fluoresceína usando H2O2.

Descripción detallada

Para describir y subrayar con más claridad y concisamente la materia objeto de la invención reivindicada se proporcionan las definiciones siguientes para términos específicos que se usan en la descripción siguiente y en las reivindicaciones adjuntas.

Las formas del singular “un”, “uno” y “el/la” incluyen las referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La expresión aproximadamente, como se usa en el presente documento a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se puede aplicar para modificar cualquier representación cuantitativa que podría variarse permisivamente sin que de cómo resultado un cambio en la función básica a la que se refiere. En consecuencia con esto, un valor modificado por un término tal como “aproximadamente” no se tiene que limitar al valor preciso especificado. A menos que se indique otra cosa, debe entenderse que todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades, tales como el peso molecular, las condiciones de reacción, usadas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, están modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. De acuerdo con esto, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la memoria descriptiva siguiente y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar en función de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la presente invención. Como mínimo, cada parámetro numérico debería interpretarse, al menos, a la luz del número de dígitos significativos indicados y aplicando técnicas de redondeo habituales.

Definiciones

Para describir y subrayar con más claridad y concisamente la materia objeto de la invención reivindicada se proporcionan las definiciones siguientes para términos específicos que se usan en la descripción siguiente y en las reivindicaciones adjuntas.

Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina que se une específicamente, y se define como complementaria, a una organización polar y espacial concreta de otra molécula. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede prepararse mediante técnicas bien conocidas en la material, tales como la inmunización de un huésped y la recolección de sueros (policlonal) o preparando líneas celulares híbridas continuas y recogiendo la proteína secretada (monoclonal), o clonando y expresando secuencias nucleotídicas o versiones mutageneizadas de las mismas, codificando al menos las secuencias de aminoácidos requeridas para la unión específica de anticuerpos naturales. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o fragmento de la misma, en las que las inmunoglobulinas incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM Fragmentos de anticuerpo funcionales pueden incluir porciones de un anticuerpo capaz de conservar la unión a una afinidad similar a un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, Fab, Fv y F(ab’)2, o Fab’). Además, se pueden usar agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando sea adecuado, siempre que se mantenga sustancialmente la afinidad de unión por una molécula concreta.

Como se usa en el presente documento, el término “aglutinante” se refiere a una molécula que se puede unir a una

o más dianas en la muestra biológica. Un aglutinante se puede unir específicamente a una diana. Aglutinantes adecuados pueden incluir uno o más de péptidos naturales o modificados, proteínas (p. ej., anticuerpos, aficuerpos

o aptámeros), ácidos nucleicos (p. ej., polinucleótidos, ADN, ARN o aptámeros), polisacáridos (p. ej., lectinas, azúcares), lípidos, enzimas, sustratos o inhibidores enzimáticos, ligandos, receptores, antígenos o haptenos. Se puede seleccionar un aglutinante adecuado en función de la muestra que se va a analizar y las dianas disponibles para detección. Por ejemplo, una diana en la muestra puede incluir un ligando y el aglutinante puede incluir un receptor o una diana puede incluir un receptor y el aglutinante puede incluir un ligando. De forma similar, una diana puede incluir un antígeno y el aglutinante puede incluir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o viceversa. En algunas realizaciones, una diana puede incluir un ácido nucleico y el aglutinante puede incluir un ácido nucleico complementario. En algunas realizaciones, tanto la diana como el aglutinante pueden incluir proteínas capaces de unirse entre sí.

Como se usa en el presente documento, la expresión “muestra biológica” se refiere a una muestra obtenida de un sujeto biológico, incluida una muestra de tejido o fluido biológico obtenido in vivo o in vitro. Dichas muestras pueden ser, entre otros, fluido corporal (p. ej., sangre, plasma sanguíneo, suero u orina), órganos, tejidos, fracciones y

células aisladas de mamíferos, incluidos seres humanos. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de la muestra biológica, incluidos tejidos (p. ej., porciones en secciones de un órgano o tejido). Las muestras biológicas también pueden incluir extractos de una muestra biológica, por ejemplo, un antígeno de un fluido biológico (p. ej., sangre u orina).

Una muestra biológica puede ser de origen procariota o eucariota (p. ej., insectos, protozoos, aves, peces, reptiles). En algunas realizaciones, la muestra biológica es de mamífero (p. ej., rata, ratón, vaca, perro, mono, cobaya o conejo). En ciertas realizaciones, la muestra biológica es de origen de primate (p. ej., chimpancé o ser humano).

Como se usa en el presente documento, la expresión “sonda control” se refiere a un agente que tiene un aglutinante acoplado a un generador de señal o a un generador de señal capaz de teñirse directamente, de modo que el generador de señal conserva al menos el 80 por ciento tras el contacto con una solución de un agente oxidante empleado para inactivar la sonda fluorescente. Un generador de señal adecuado en una sonda control no está sustancialmente oxidado o sustancialmente inactivado cuando se pone en contacto con el agente oxidante. Ejemplos adecuados de generadores de señal pueden incluir un marcador radioactivo o un fluoróforo no oxidable

(p. ej., DAPI).

Como se usa en el presente documento, el término “enzima” se refiere a una molécula proteica que puede catalizar una reacción química de un sustrato. En algunas realizaciones, una enzima adecuada cataliza una reacción química del sustrato para formar un producto de reacción que se puede unir a un receptor (p. ej., grupos fenólicos) presente en la muestra o un soporte sólido al que la muestra está unida. Un receptor puede ser exógeno (es decir, un receptor extrínsecamente adherido a la muestra o al soporte sólido) o endógeno (receptores presentes intrínsecamente en la muestra o el soporte sólido). Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasas, oxidasas, fosfatasas, esterasas y glicosidasas. Ejemplos específicos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, �-D-galactosidasa, lipasa y glucosa oxidasa.

Como se usa en el presente documento, la expresión “sustrato enzimático” se refiere a un compuesto químico que es químicamente catalizado por una enzima para formar un producto de reacción. En algunas realizaciones, el producto de reacción puede unirse a un receptor presente en la muestra o a un soporte sólido al que la muestra está unida. En algunas realizaciones, los sustratos enzimáticos usados en los procedimientos del presente documento pueden incluir sustratos no cromogénicos o no quimioluminiscentes. Un generador de señal puede unirse al sustrato enzimático como un marcador.

Como se usa en el presente documento, el término “fluoróforo” o la expresión “generador de señal fluorescente” se refiere a un compuesto químico que, cuando se excita por la exposición a una longitud de onda concreta de luz, emite luz a una longitud de onda diferente. Los fluoróforos pueden describirse en términos de su perfil de emisión o “color”. Los fluoróforos verdes (por ejemplo Cy3, FITC, y verde Oregón) pueden caracterizarse por su emisión a longitudes de onda generalmente en el intervalo de 515-540 nanómetros. Los fluoróforos rojos (por ejemplo Rojo Texas, Cy5 y tetrametilrodamina) pueden caracterizarse por su emisión a longitudes de onda generalmente en el intervalo de 590-690 nanómetros. Ejemplos de fluoróforos incluyen, entre otros, ácido 4-acetamido-4’isotiocianatoestilben-2,2’-disulfónico, derivados de acridina e isotiocianato de acridina, ácido 5-(2’aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS), 3,5-disulfonato de 4-amino-N-[3-vinilsulfonil]fenol]naftalimida (Amarillo Lucifer VS), N-(4.anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, Amarillo Brillante, coumarina, derivados de coumarina, 7-amino-4-metilcoumarina (AMC, Coumarina 120), 7-amino-trifluorometilcouluarina (Coumaran 151), cianosina; 4’-6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5,5’’-dibromopirogalol-sulfoneftaleína (romo bromopirogalol), 7dietilamino-3-(4’-isotiocianatofenol)—metilcoumarina, ácido 4,4’-diisotiocianatodihidro-estilben-2,2’-disulfónico, ácido 4,4’-diisotiocianatoestilben-2,2’-disulfónico, cloruro de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo), eosina, derivados de eosina tales como isotiocianato de eosina, eritrosina, derivados de eritrosina tales como eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etidio; fluoresceína y derivados tales como 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2’,7’-dimetoxi-4’,5’-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), QFITC (XRITC); derivado de fluorescamina (fluorescente tras la reacción con aminas); IR144; IR1446; isotiocianato de verde malaquita; 4-metilumbeliferona; orto-cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; rojo fenol, ficoeritrina B; derivado de o-ftaldialdehído (fluorescente tras la reacción con aminas); pireno y derivados, tales como pireno, butirato de pireno y butirato de succinidimidil-1-pireno; rojo reactivo 4 (Cibacron, RTM. Rojo brillante 3B-A), rodamina y derivados tales como 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6carboxirodamina (R6G), rodamina lisamina B, cloruro de sulfonilo, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, sulforodamina B, sulforodamina 101 y derivado de cloruro de sulfonilo de sulforodamina 101 (rojo Texas); N,N,N’N’-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA); tetrametilrodamina, isocianato de tetrametilrodamina (TRITC); riboflavina; ácido rosólico y derivados de quelato de latanida, puntos cuánticos, cianinas, pigmentos de pirelio y escuaraínas.

Como se usa en el presente documento, “in situ” se refiere, en general, a un acontecimiento que se produce en la ubicación original, por ejemplo, en órgano o tejido intacto o en un segmento representativo de un órgano o tejido. En algunas realizaciones, el análisis in situ de las dianas describe análisis de sondas unidas a las dianas

localizadas en una muestra de células enteras o de tejido, esté la membrana celular. El análisis in situ proporciona información contextual que puede perderse cuando la diana se elimina de su sitio de origen. De acuerdo con esto, el análisis in situ de las dianas describe el análisis de la sonda unida a la diana localizada dentro de una muestra de célula entera o de tejido, esté la membrana celular completamente intacta o parcialmente intacta cuando la sonda unida a la diana permanece dentro de la célula. Además, los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden usar para analizar las dianas in situ en muestras de células o tejidos que están fijadas o no fijadas.

Como se usa en el presente documento, el término “peroxidasa” se refiere a una clase de enzima que cataliza una reacción de oxidación de un sustrato enzimático junto con un donante de electrones. Ejemplos de enzimas peroxidasa incluyen peroxidasa de rábano, citocromo C peroxidasa, glutation peroxidasa, microperoxidasa, mieloperoxidasa, lactoperoxidasa o peroxidasa de soja.

Como se usa en el presente documento, la expresión “sustrato de la peroxidasa” se refiere a un compuesto químico que es químicamente catalizado por una peroxidasa para formar un producto de reacción. En algunas realizaciones, los sustratos de la peroxidasa usados en los procedimientos del presente documento pueden incluir sustratos no cromogénicos o no quimioluminiscentes. Un generador de señal fluorescente puede unirse al sustrato de la peroxidasa como marcador.

Como se usa en el presente documento, el término “sonda” se refiere “sonda” se refiere a un agente que tiene un aglutinante o un marcador, tal como un generador de señal o una enzima. En algunas realizaciones, el aglutinante y el marcador (generador se señal o enzima) están reunidos en una única entidad. El aglutinante y el marcador pueden estar unidos directamente (p. ej., a través de una molécula fluorescente incorporada en el aglutinante) o indirectamente (p. ej., a través de un ligador, que puede incluir un sitio de escisión) y aplicarse a la muestra biológica en una única etapa. En realizaciones alternativas, el aglutinante y el marcador están reunidos en entidades pequeñas (p. ej., un anticuerpo primario capaz de unirse a una diana u una enzima o un anticuerpo secundario marcado con un generador de señal capaz de unirse al anticuerpo primario). Cuando el aglutinante y el marcador (generador de señal o la enzima) son entidades distintas, se pueden aplicar a una muestra biológica en una única etapa o en múltiples etapas. Como se usa en el presente documento, la expresión “sonda fluorescente” se refiere a un agente que tiene un aglutinante acoplado a un generador de señal fluorescente.

Como se usa en el presente documento, la expresión “generador de señal” se refiere a una molécula capaz de proporcionar una señal detectable usando una o más técnicas de detección (p. ej., espectrometría, calorimetría, espectroscopia o inspección visual). Ejemplos adecuados de una señal detectable pueden incluir una señal óptica, una señal eléctrica o una señal radioactiva. Ejemplos de generadores de señal incluyen uno o más de un cromóforo, un fluoróforo, una marca activa de Raman o un marcador radioactivo. Como se ha indicado anteriormente, con respecto a la sonda, el generador de señal y el aglutinante pueden estar presentes en una única entidad (p. ej., una proteína de unión a la diana con un marcador fluorescente) en algunas realizaciones. Como alternativa, el aglutinante y el generador de señal pueden ser entidades pequeñas (p. ej., una proteína receptora y un anticuerpo marcado contra la proteína receptora concreto) que se asocian entre sí antes o tras la introducción en la muestra.

Como se usa en el presente documento, la expresión “soporte sólido” se refiere a un artículo sobre el cual las dianas presentes en la muestra biológica pueden estar inmovilizados y detectarse después mediante los procedimientos divulgados en el presente documento. Las dianas pueden quedar inmovilizadas sobre el soporte sólido mediante adsorción física, mediante formación de enlaces covalentes o mediante combinaciones de ambos. Un soporte sólido puede incluir un material polimérico, de vidrio o metálico. Ejemplos de soportes sólidos incluyen una membrana, una placa de microtitulación, una perla, un filtro, una tira de análisis, un portaobjetos, un cubreobjetos y un tubo de análisis.

Como se usa en el presente documento, la expresión “unión específica” se refiere al reconocimiento específico de una de dos moléculas diferentes por la otra en comparación con un reconocimiento sustancialmente menor de otras moléculas. Las moléculas pueden tener áreas sobre sus superficies o en cavidades que dan lugar a un reconocimiento específico entre las dos moléculas que se producen a partir de una o más interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno o interacciones hidrófobas. Ejemplos de unión específica incluyen, entre otros, interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones enzima-sustrato, interacciones polinucleotídicas y similares. En algunas realizaciones, una molécula aglutinante puede tener una constante de asociación de equilibrio intrínseco (KA) por la diana no inferior a aproximadamente 105 M-1 en condiciones ambiente, tales como un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, y una temperatura que varía de aproximadamente 0º C a aproximadamente 37 ºC.

Como se usa en el presente documento, el término “diana” se refiere al componente de una muestra biológica que se puede detectar cuando está presente en la muestra biológica. La diana puede ser cualquier sustancia para la cual existe un aglutinante específico natural (p. ej., un anticuerpo) o para la cual se puede preparar un aglutinante específico (p. ej., un aglutinante de molécula pequeña o un aptámero). En general, un aglutinante se puede unir a

una diana a través uno o más restos químicos pequeños de la diana o un componente estructural tridimensional de la diana (p. ej., estructuras 3D que resultan del plegamiento de los péptidos). La diana puede incluir uno o más péptidos naturales o modificados, proteínas (p. ej., anticuerpos, aficuerpos o aptámeros), ácidos nucleicos (p. ej., polinucleótidos, ADN, ARN o aptámeros), polisacáridos (p. ej., lectinas, azúcares), lípidos, enzimas, sustratos enzimáticos, ligandos, receptores, antígenos o haptenos. En algunas realizaciones, las dianas pueden incluir proteínas o ácidos nucleicos.

La invención incluye realizaciones que se refieren, en general, a procedimientos aplicables en aplicaciones analíticas, diagnósticas o pronosticas, tales como detección de analitos, histoquímica, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden ser particularmente aplicables en histoquímica, inmunotinción, inmunohistoquímica, inmunoensayos o inmunofluorescencia. En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden ser particularmente aplicables en técnicas de inmunotransferencia, por ejemplo, transferencias de tipo western, o inmunoensayos, tales como ensayos de inmunosorción ligada a enzimas (ELISA).

Los procedimientos divulgados se refieren, en general, a la detección de múltiples dianas en una única muestra biológica. En algunas realizaciones se divulgan procedimientos de detección de múltiples dianas en una única muestra biológica usando el mismo canal de detección. Las dianas pueden estar presentes sobre la superficie de células en suspensión, sobre la superficie de frotis de citología, sobre la superficie de secciones histológicas. Sobre la superficie de micromatrices de ADN, sobre la superficie de micromatrices de proteínas o sobre la superficie de soportes sólidos (tales como geles, transferencias, portaobjetos de vidrio, perlas o placas de ELISA).

Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden permitir la detección de una pluralidad de dianas en la misma muestra biológica con poco o ningún efecto sobre la integridad de la muestra biológica. La detección de las dianas en la misma muestra biológica puede proporcionar además información espacial sobre las dianas en la muestra biológica. Los procedimientos divulgados en el presente documento también pueden ser aplicables a aplicaciones analíticas, en las que puede estar disponible una cantidad limitada de muestra biológica para el análisis y puede que la misma muestra tenga que procesarse para múltiples análisis, Los procedimientos divulgados en el presente documento también pueden facilitar múltiples análisis de muestras en estado sólido (p. ej., secciones de tejido) o muestras adheridas a un soporte sólido (p. ej., transferencias) sin extraer sustancialmente las sondas y las dianas. Adicionalmente, se puede usar el mismo canal de detección para la detección de diferentes dianas en la muestra, lo que permite menos requisitos químicos para el análisis de múltiples dianas. Los procedimientos pueden además facilitar análisis basados en los procedimientos de detección, que pueden estar limitados en el número de dianas detectables de forma simultánea por las limitaciones de las señales resolubles. Por ejemplo, usando detección basada en fluorescencia, el número de dianas que se pueden detectar de forma simultánea puede estar limitada a aproximadamente cuatro, ya que sólo se pueden resolver aproximadamente cuatro señales fluorescentes en base a sus propiedades de longitud de onda de excitación y de emisión. En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden permitir la detección de más de cuatro dianas usando un sistema de detección basado en fluorescencia.

En algunas realizaciones, el procedimiento de detección de múltiples dianas en una muestra biológica incluye la detección secuencia de dianas en la muestra biológica. En general, el procedimiento incluye las etapas de detectar una primera diana en la muestra biológica, modificando la señal de la primera diana usando un agente químico y detectando una segunda diana en la muestra biológica. El procedimiento puede además incluir repetir la etapa de modificación de la señal de la segunda diana, seguido de detección de una tercera diana en la muestra biológica, etc.

En algunas realizaciones, el procedimiento incluye las etapas de poner en contacto una muestra biológica con una primera sonda y la unión física de una primera sonda con su primera diana. El procedimiento incluye además observar una primera señal procedente de la primera sonda. Para modificar la primera señal se aplica un agente químico a la sonda. El procedimiento incluye además poner en contacto la muestra biológica con una segunda sonda y la unión física de la segunda sonda con una segunda diana en la muestra biológica, seguido de la observación de una segunda señal procedente de la segunda sonda.

En otras realizaciones, el procedimiento incluye las etapas de proporcionar una muestra que contiene múltiples dianas y unir al menos una sonda que tiene un aglutinante acoplado a una enzima con una o más dianas presentes en la muestra. El procedimiento incluye además hacer reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente y observar una señal desde el generador de señal fluorescente. A la muestra se aplica una solución que incluye un agente oxidante que inactiva sustancialmente el generador de señal fluorescente y la enzima. El procedimiento incluye además la unión de al menos otra sonda que tenga un aglutinante acoplado a una enzima con una o más dianas presentes en la muestra. El procedimiento incluye además hacer reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente y observar una señal desde el generador de señal fluorescente.

En otras realizaciones más, el procedimiento incluye las etapas de proporcionar una muestra que contiene múltiples dianas adheridas a un soporte sólido y unir al menos una sonda fluorescente con una o más dianas presentes en la muestra. El procedimiento incluye además observar una señal procedente de la sonda fluorescente unida. La sonda fluorescente unida se oxida con un agente oxidante que inactiva sustancialmente la sonda fluorescente. El procedimiento incluye además unir al menos otra sonda fluorescente a una o más dianas presentes en la muestra, seguido de observar una señal procedente de la otra sonda fluorescente unida.

En otras realizaciones más, el procedimiento incluye las etapas de proporcionar una muestra que contiene múltiples dianas adheridas a un soporte sólido y unir al menos una sonda fluorescente con una o más dianas presentes en la muestra. El procedimiento incluye además la unión de al menos una sonda control a una o más dianas en la muestra. El procedimiento incluye además observar una señal procedente de la sonda fluorescente unida y una señal control procedente de la sonda control. La sonda fluorescente unida se oxida con un agente oxidante que inactiva sustancialmente la sonda fluorescente y no la sonda control. El procedimiento incluye además unir al menos otra sonda fluorescente a una o más dianas presentes en la muestra, seguido de observar una señal procedente de la otra sonda fluorescente unida.

Muestras biológicas

Una muestra biológica de acuerdo con una realización de la invención puede ser sólida o fluida. Ejemplos adecuadas de muestras biológicas pueden incluir, entre otros, cultivos, sangre, plasma, suero, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, leche, linfa, esputo, semen, orina, heces, lágrimas, saliva, aspirados con aguja, secciones externas de la piel tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, tumores, órganos, cultivos celulares o constituyentes de cultivos celulares, o secciones de tejido sólido. En algunas realizaciones, la muestra biológica puede analizarse como tal, es decir sin recoger y/o aislar la diana de interés. En una realización alternativa, puede realizarse la recolección y aislamiento de las dianas antes del análisis. En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden ser particularmente adecuados para el análisis in vitro de las muestras biológicas.

Una muestra biológica puede incluir cualquiera de las muestras mencionadas anteriormente con independencia de su estado físico, tales como, entre otras, tratadas mediante congelación o tinción o de otro modo. En algunas realizaciones, una muestra biológica puede incluir compuestos que no están entremezclados de forma natural con la muestra en la naturaleza, tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos

o similares.

En algunas realizaciones, una muestra biológica puede incluir una muestra de tejido, una célula entera, un constituyente celular, un citoespín o un frotis celular. En algunas realizaciones, una muestra biológica incluye esencialmente una muestra de tejido. Una muestra de tejido incluye una colección de células similares obtenidas de un tejido de un sujeto biológico que puede tener una función similar. En algunas realizaciones, una muestra de tejido puede incluir una colección de células similares obtenidas de un tejido de un ser humano. Ejemplos adecuados de tejidos humanos incluyen, entre otros, (1) epitelio; (2) tejidos conjuntivos, incluidos vasos sanguíneos, hueso y cartílago, (3) tejido muscular y (4) tejido nervioso. La fuente de la muestra de tejido puede ser tejido sólido obtenido de una muestra de tejido u órgano fresco, congelado y/o conservado o biopsia o aspirado, sangre o cualquier constituyente de la sangre, fluidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial, o células de cualquier tiempo de gestación o desarrollo del sujeto. En algunas realizaciones, la muestra de tejido puede incluir células primarias o cultivadas o líneas celulares.

En algunas realizaciones, una muestra biológica incluye secciones de tejido de muestras de tejido sanas o enfermas (p. ej., sección de tejido de colon, tejido de mama, próstata). Una sección de tejido puede incluir una sola parte o pieza de una muestra de tejido, por ejemplo una lámina fina de tejido o células cortadas de una muestra de tejido. En algunas realizaciones, se pueden obtener múltiples secciones de muestras de tejido y someter a análisis, siempre que los procedimientos divulgados en el presente documento se puedan usar para análisis de la misma sección de la muestra de tejido con respecto a al menos dos dianas diferentes (a nivel morfológico o molecular). En algunas realizaciones, la misma sección de muestra de tejido se puede analizar con respecto a al menos cuatro dianas diferentes (a nivel morfológico o molecular). En algunas realizaciones, la misma sección de muestra de tejido se puede analizar con respecto a más de cuatro dianas diferentes (a nivel morfológico o molecular). En algunas realizaciones, la misma sección de muestra de tejido se puede analizar a los niveles tanto morfológico como molecular.

Una sección de tejido, si se usa como muestra biológica, puede tener un espesor en el intervalo que es inferior a aproximadamente 100 micrómetros, en un intervalo que es inferior a aproximadamente 50 micrómetros, en un intervalo que es inferior a aproximadamente 25 micrómetros, o en un intervalo que es inferior a aproximadamente 10 micrómetros.

En algunas realizaciones, una muestra biológica o las dianas en la muestra biológica se pueden adherir a un

soporte sólido. Un soporte sólido puede incluir micromatrices (p. ej., micromatrices de ADN o de ARN), geles, transferencias, portaobjetos de vidrio, perlas o placas de ELISA. En algunas realizaciones, una muestra biológica o las dianas en la muestra biológica se pueden adherir a una membrana seleccionada de nylon, nitrocelulosa y difluoruro de polivinilideno. En algunas realizaciones, el soporte sólido puede incluir una superficie de plástico seleccionada de poliestireno, policarbonato y polipropileno.

Dianas

Una diana puede estar presente sobre la superficie de una muestra biológica (por ejemplo, un antígeno sobre una superficie de una sección de tejido) o presente en el grueso de la muestra (por ejemplo, un anticuerpo en una solución tampón). En algunas realizaciones, una diana puede no estar presente de forma inherente sobre la superficie de una muestra biológica y la muestra biológica puede tener que procesarse para hacer que la diana esté disponible sobre la superficie (p. ej., recuperación del antígeno, digestión enzimática, recuperación del epítopo o bloqueo). En algunas realizaciones, la diana puede estar presente en un fluido corporal, tal como sangre, plasma sanguíneo, suero u orina. En algunas otras realizaciones, la diana puede estar fijada en un tejido, bien sobre la superficie celular o bien dentro de una célula.

Adecuadamente, las dianas que se van a analizar pueden estar determinadas por el tipo y la naturaleza del análisis requerido para la muestra biológica. En algunas realizaciones, una diana puede proporcionar información sobre la presencia o ausencia de un analito en la muestra biológica. En otra realización, una diana puede proporcionar información sobre el estado de una muestra biológica. Por ejemplo, si la muestra biológica incluye una muestra de tejido, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden usarse para detectar dianas que pueden ayudar en la comparación de diferentes tipos de células o tejidos, en la comparación de diferentes estadios de desarrollo, en la detección de la presencia de una enfermedad o anomalía o en la determinación del tipo de enfermedad o anomalía

Las dianas pueden incluir uno o más péptidos, proteínas (p. ej., anticuerpos, aficuerpos o aptámeros), ácidos nucleicos (p. ej., polinucleótidos, ADN, ARN o aptámeros), polisacáridos (p. ej., lectinas, azúcares), lípidos, enzimas, sustratos enzimáticos, ligandos, receptores, antígenos o haptenos. En algunas realizaciones, las dianas pueden incluir esencialmente proteínas o ácidos nucleicos. Una o más de las dianas mencionadas anteriormente pueden ser características de células concretas, mientras que otras dianas pueden asociarse con una enfermedad

o afección concretas. En algunas realizaciones, las dianas que se pueden detectar y analizar usando los procedimientos divulgados en el presente documento pueden incluir, entre otros, dianas pronósticas, hormonas o dianas receptores de hormonas, dianas linfoides, dianas tumorales, dianas asociadas al ciclo celular, tejido neural y dianas tumorales o dianas de diferenciación en grupo.

Ejemplos adecuados de dianas pronósticas pueden incluir dianas enzimáticas tales como galactosil transferasa II, enolasa específica de neuronas, protón ATPasa-2 o fosfatasa ácida.

Ejemplos adecuados de dianas hormonales o receptoras de hormonas pueden incluir gonadotropina coriónica humana (HCG), hormona adrenocorticotropa, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno específico de la próstata (PSA), receptor de estrógenos, receptor de progesterona, receptor de andrógenos, receptor del complemento gC1q-R/p33, receptor de IL-2, receptor de la neurotrofina p75, receptor de PTH, receptor de la hormona tiroides o receptor de insulina.

Ejemplos adecuados de dianas linfoides pueden incluir alfa-antiquimotripsina, alfa-1-antitripsina, diana de células B, bcl-2, bcl-6, antígeno de linfocitos B de 36 kD, BM1 (diana mieloide), BM2 (diana mieloide), galectina-3, granzima B, antígeno de HLA clase I, antígeno de HLA clase II (DP), antígeno HLA de clase II (DQ), antígeno HLA de clase II (DR), defensinas de neutrófilo humano, inmunoglobulina A, inmunoglobulina D, inmunoglobulina G, inmunoglobulina M, cadena ligera kappa, cadena ligera kappa, cadena ligera lambda, antígeno de linfocitos/histocitos, diana de macrófagos, muramidasa (lisozima), p80 cinasa de linfomas anaplásicos, diana de células plasmáticas, inhibidor de la proteasa leucocitaria secretora, receptor de antígenos de linfocitos T (JOVI 1), receptor de antígenos de linfocitos T (JOVI 3), desoxinucleotidil transferasa terminal o diana de linfocitos B sin agrupar.

Ejemplos adecuados de dianas tumorales pueden incluir alfa fetoproteína, apolipoproteína D, BAG-1 (proteína RAP46), CA19-9 (sialil lewisa), CA50 (antígeno mucínico asociado al carcinoma), CA125 (antígeno del cáncer d de ovarios), CA242 (antígeno mucínico asociado al tumor), cromogranina A, clusterina (apolipoproteína J), antígeno epitelial de membrana, antígeno relacionado con el tejido epitelial, antígeno específico epitelial, proteína 15 de líquidos de la enfermedad quística macroscópica, antígeno específico de hepatocitos, heregulina, mucina gástrica humana, glóbulo graso de leche humana, MAGE-1, metaloproteinasas de matriz, melan A, diana del melanoma (HMB45), mesotelina, metalotioneína, factor de transcripción de microftalmia (MITF), glicoproteína del núcleo Muc

1. Glicoproteína Muc-1, glicoproteína Muc2, glicoproteína Muc-5AC, glicoproteína Muc-6, mieloperoxidasa, Myf-3 (diana del rabdomiosarcoma), Myf4 (diana del rabdomiosarcoma), MyoD1 (diana del rabdomiosarcoma), mioglobina, proteína nm23, fosfatasa alcalina placentaria, prealbúmina, antígeno específico de próstata, fosfatasa

ácida prostática, péptido inhibina prostática, PTEN, diana del carcinoma de células renales, antígeno mucinoso del intestino delgado, tetranectina, factor 1 de transcripción tiroideo 1,inhibidor tisular de la matriz metaloproteinasa 1, inhibidor tisular de la matriz metaloproteinasa 2, tirosinasa, proteína 1 relacionada con la tirosinasa o factor de von Willebrand.

Ejemplos adecuados de las dianas asociadas con el ciclo celular pueden incluir factor 1 de activación de la proteasa de la apoptosis, bcl-w , bcl-x, bromodesoxiuridina, CAK (quinasa activadora de cdk), proteína de susceptibilidad a la apoptosis celular (CAS), caspasa 2, caspasa 8, CPP32 (caspasa-3), CPP32 (caspasa-3), quinasas dependientes de ciclina, ciclina A, ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2, ciclina D3, ciclina E, ciclina G, factor de fragmentación de ADN (extremo N), Fas (CD95), proteína del dominio de muerte asociado con Fas, ligando de Fas, Fen-1, IPO-38, Mcl-1, proteínas de mantenimiento de minicromosoma, proteína de reparación de errores de apareamiento (MSH2), poli (ADPRibosa) polimerasa, antígeno nuclear de células en proliferación, proteína p16, proteína p27, p34cdc2, proteína p57 (Kip2), proteína p105, Stat 1 alfa, topoisomerasa I, topoisomerasa II alfa, topoisomerasa III alfa o topoisomerasa II beta.

Ejemplos adecuados de dianas de tejido neural y tumoral pueden incluir alfa B cristalina, alfa-internexina, alfa sinnucleína, proteína precursora amiloide, amiloide beta, calbindina, colina acetiltransferasa, transportador 1 de aminoácidos excitadores, GAP43, proteína ácida de las fibrillas de las células gliales, receptor 2 de glutamato, proteína básica de la mielina, receptor del factor de crecimiento neural (gp75), diana del neuroblastoma, neurofilamento de 68 kD, neurofilamento de 160 kD, neurofilamento de 200 kD, enolasa específica de neuronas, receptor nicotínico alfa 4 de acetilcolina, receptor nicotínico beta 2 de acetilcolina, periferina, producto 9 del gen de proteínas, proteína S-100, serotonina, SNAP-25, sinapsina I, sinaptofisina, tau, triptófano hidroxilasa, tirosina hidroxilasa o ubiquitina.

Ejemplos adecuados de dianas de clúster diferenciación pueden incluir CD1a, CD1b, CD1 c, CD1d, CD1e, CD2, CD3delta, CD3epsilon, CD3gamma, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8alpha, CD8beta, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16a, CD16b, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CDw93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDw108, CD109, CD114, CD115, CD116, CD117, CDw119, CD120a, CD120b, CD121a, CDw121b, CD122, CD123, CD124, CDw125, CD126, CD127, CDw128a, CDw128b, CD130, CDw131, CD132, CD134, CD135, CDw136, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw149, CDw150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD 164, CD165, CD166 y TCR-zeta.

Otras dianas pronóstico adecuadas incluyen la proteína F del centrómero (CENP-F), giantina, involucrina, lamina A&C (XB 10), LAP-70, mucina, proteínas del complejo del poro nuclear, proteína del cuerpo lamelar p180, ran, r, catepsina D, proteína Ps2, Her2-neu, P53, S100, antígeno diana del tejido epitelial (EMA), TdT, MB2, MB3, PCNA, o Ki67

Sondas

En algunas realizaciones, un aglutinante y un marcador (generador de señal o una enzima) se pueden acoplar entre sí directamente (es decir, sin ligadores). En otras realizaciones, un aglutinante y un marcador (generador de señal o una enzima) se pueden acoplar entre sí a través de un ligador. Como se usa en el presente documento, “acoplado” se refiere, en general, a dos entidades (por ejemplo, un aglutinante y un generador de señal) unidas de forma estable entre sí por medios fisicoquímicos. La naturaleza del acoplamiento puede ser tal que no altere sustancialmente la eficacia de cualquiera de las entidades. Un aglutinante y un marcador pueden acoplarse entre sí a través de interacciones covalentes o no covalentes. Las interacciones no covalentes pueden incluir, entre otras, interacciones hidrófobas, interacciones iónicas, interacciones por puentes d hidrógeno, interacciones de alta afinidad (tales como, complejos de biotina-avidina o biotina-estreptavidina) u otras interacciones de afinidad.

Un ligador puede incluir una forma de estructura o secuencia de unión formada debido a la formación de enlaces no covalentes o covalentes. En algunas realizaciones, el ligador puede ser químicamente estable, es decir puede mantener su integridad en presencia de un agente químico. En algunas realizaciones, el ligador puede ser susceptible a agentes químicos, es decir puede ser capaz de disociarse, escindirse o hidrolizarse en presencia de un agente químico. Ejemplos adecuados de ligadores pueden incluir puentes disulfuro (p. ej., SPDP o SMPT), estructuras/secuencias sensibles al pH, estructuras/secuencias que pueden reducirse en presencia de un agente reductor, estructuras/secuencias que se pueden oxidar en presencia de un agente oxidante, o cualquier otro enlace

químico o físico que se puede manipular fácilmente (disociar, escindir o hidrolizar) en presencia de un agente químico.

En algunas realizaciones, un aglutinante y un marcador (generador de señal o una enzima) pueden estar unidos químicamente entre sí a través de grupos funcionales capaces de reaccionar y formar un enlace en las condiciones adecuadas. Ejemplos adecuados de combinaciones de grupos funcionales pueden incluir, entre otros, éster de amina y aminas o anilinas; acida de acilo y aminas o anilinas; haluros de acilo y aminas, anilinas, alcoholes o fenoles; nitrilo de acilo y alcoholes o fenoles; aldehído y aminas o anilinas; haluro de alquilo y aminas, anilinas, alcoholes, fenoles o tioles; sulfonato de alquilo y tioles, alcoholes o fenoles; anhídrido y alcoholes, fenoles, aminas o anilinas; haluro de arilo y tioles; aziridina y tioles o tioléteres; ácido carboxílico y aminas, anilinas, alcoholes o haluros de alquilo; diazoalcano y ácidos carboxílicos; epóxido y tioles; haloacetamida y tioles; haloacetamida y tioles; halotriazina y aminas, anilinas o fenoles; hidrazina y aldehídos o cetonas; hidroxiamina y aldehídos o cetonas; imido éster y aminas o anilinas; isocianato y aminas o anilinas; e isotiocianato y aminas o anilinas. Un grupo funcional en uno de los pares de grupos funcionales mencionados anteriormente puede estar presente en un aglutinante y en el generador de señal o la enzima puede estar presente un correspondiente grupo funcional. Por ejemplo, un aglutinante puede incluir un ácido carboxílico y el generador de señal o la enzima pueden incluir una amina, anilina, alcohol o haluro de acilo, o viceversa. La conjugación entre el aglutinante y el generador de señal o la enzima puede efectuarse, en este caso, mediante formación de una amida o un enlace éster.

En algunas realizaciones, el aglutinante puede estar marcado intrínsecamente con un generador de señal (por ejemplo, su el aglutinante es una proteína, durante la síntesis usando un aminoácido marcador de forma que se pueda detectar) o una enzima (por ejemplo, si el aglutinante es una enzima). Un aglutinante que está marcado de forma intrínseca puede no requerir además un generador de señal o una enzima para su detección. En su lugar, el marcador intrínseco puede ser suficiente para hacer que se pueda detectar la sonda. En realizaciones alternativas, el aglutinante puede marcarse a través de su unión a un generador de señal o una enzima específicos (es decir, se marca de forma extrínseca).

En algunas realizaciones, el aglutinante y el marcador (generador se señal o enzima) están reunidos en una única entidad. En realizaciones alternativas, el aglutinante y el marcador (generador de señal o enzima) están reunidos en pequeñas entidades (p. ej., un anticuerpo primario capaz de unirse a una diana y un anticuerpo secundario marcado con una enzima o con un generador de señal capaz de unirse al anticuerpo primario o un anticuerpo primario marcado con hapteno capaz de unirse a una diana y un anticuerpo anti-hapteno marcado con una enzima o con un generador de señal capaz de unirse al anticuerpo primario marcado con hapteno). Cuando el aglutinante y el generador de señal o la enzima son entidades distintas, se pueden aplicar a una muestra biológica en una única etapa o en múltiples etapas. En algunas realizaciones, el aglutinante y el marcador (generador de señal o la enzima) son entidades distintas que están pre-fijadas antes de la aplicación a la muestra biológica y se aplican a la muestra biológica en una única etapa. En otras realizaciones más, el aglutinante y el marcador (generador de señal

o la enzima) son entidades distintas que se aplican a la muestra biológica de forma independiente y se combinan tras la aplicación.

Aglutinantes

Los procedimientos divulgados en el presente documento implican el uso de aglutinantes que se unen físicamente a la diana de un modo específico. En algunas realizaciones, un aglutinante se puede unir a una diana con suficiente especificidad, es decir un aglutinante se puede unir a una diana con mayor afinidad de lo que lo hace a cualquier otra molécula. En algunas realizaciones, un aglutinante se puede unir a otras moléculas, pero la unión puede ser tal que la unión inespecífica puede estar a niveles basales o casi basales. En algunas realizaciones, la afinidad del aglutinante por la diana de interés puede estar en un intervalo que sea al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o más que su afinidad por otras moléculas. En algunas realizaciones se pueden emplear aglutinantes con la mayor afinidad diferencial, aunque pueden no ser aquéllos con mayor afinidad por la diana.

En algunas realizaciones, la unión entre la diana y el aglutinante puede efectuarse mediante unión física. La unión física puede incluir la unión efectuada usando interacciones no covalentes. Las interacciones no covalentes pueden incluir, entre otras, interacciones hidrófobas, interacciones iónicas, interacciones por puentes de hidrógeno o interacciones de afinidad (tales como, complejos de biotina-avidina o biotina-estreptavidina). En algunas realizaciones, la diana y el aglutinante pueden tener áreas sobre sus superficies o en cavidades que dan lugar a un reconocimiento específico entre los dos, lo que tiene como resultado unión física. En algunas realizaciones, un aglutinante puede unirse a una diana biológica en base al ajuste recíproco de una porción de sus formas moleculares.

Los aglutinantes y sus correspondientes dianas pueden considerarse como pares de unión, de los cuales ejemplos no limitantes incluyen pares de unión de tipo inmunitario, tales como antígeno/anticuerpo, fragmento de antígeno/anticuerpo o hapteno/anti-hapteno; pares de unión de tipo no inmunitario, tales como proteína de unión biotina/avidina, biotina/estreptavidina, ácido fólico/folato, hormona/receptor de hormona, lectina/hidrato de carbono

específico, enzima/enzima, enzima/sustrato, encima/análogo de sustrato, enzima/seudosustrato (análogos de sustrato que no se pueden catalizar mediante la actividad enzimática), enzima/cofactor, enzima/modulador, enzima/inhibidor o vitamina B18/Factor intrínseco. Otros ejemplos adecuados de pares de unión pueden incluir fragmentos de ácido nucleico complementarios (incluidas, secuencias de ADN, secuencias de ARN, secuencias de LNA y secuencias de PNA); Proteína A/anticuerpo; Proteína G/anticuerpo; ácido nucleico/proteína de unión a ácido nucleico; o polinucleótido/proteína de unión a polinucleótido.

En algunas realizaciones, el aglutinante puede ser un aglutinante específico de secuencia o de estructura, en el que la secuencia o la estructura de una diana reconocida y unida por el aglutinante pueden ser suficientemente únicas para dicha diana.

En algunas realizaciones, el aglutinante puede ser específico de estructura y puede reconocer una estructura primaria, secundaria o terciaria de una diana. Una estructura primaria de una diana puede incluir la especificación de su composición atómica y los enlaces químicos que conectan dichos átomos (incluida la estereoquímica), por ejemplo el tipo y la naturaleza de la disposición lineal de los aminoácidos en una proteína. Una estructura secundaria de una diana puede hacer referencia a la forma tridimensional general de los segmentos de biomoléculas, por ejemplo una proteína de una estructura secundaria puede hacer referencia al plegamiento de la cadena “armazón” peptídico en varias conformaciones que pueden tener como resultado el acercamiento de aminoácidos distantes. Ejemplos adecuados de estructuras secundarias pueden incluir, entre otros, alfa hélices, láminas plegadas en beta o hélices aleatorias. Una estructura terciaria de una diana puede ser su estructura tridimensional global. Una estructura cuaternaria de una diana puede ser la estructura formada por su interacción no covalente con una o más dianas o macromoléculas distintas (tales como interacciones proteicas). Un ejemplo de una estructura cuaternaria puede ser la estructura formada por las cuatro subunidades de la proteína globina para fabricar la hemoglobina. Un aglutinante de acuerdo con las realizaciones de la invención puede ser específico de cualquiera de las estructuras mencionadas anteriormente.

Un ejemplo de un aglutinante específico de estructura puede incluir una molécula específica de proteína que se puede unir a una diana proteica. Ejemplos de moléculas específicas de proteínas adecuadas pueden incluir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos (por ejemplo, aptámeros que reconocen las dianas proteicas) o sustratos de proteínas (no catalizables).

En algunas realizaciones, una diana puede incluir un antígeno y un aglutinante puede incluir un anticuerpo. Un anticuerpo adecuado puede incluir anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) o fragmentos de anticuerpos, siempre que se unan específicamente a un antígeno diana.

En algunas realizaciones, una muestra biológica puede incluir una muestra de célula o de tejido, y los procedimientos divulgados en el presente documento pueden usarse en inmunohistoquímica (IHC). La inmunoquímica puede implicar la unión de un antígeno diana a un aglutinante a base de anticuerpos, para proporcionar información sobre los tejidos o las células (por ejemplo células enfermas frente a normales). Ejemplos de anticuerpos (y las correspondientes enfermedades/células enfermas) adecuados como aglutinantes para los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen, entre otros, anticuerpo del receptor anti-estrógeno (cáncer de mama), anticuerpo del receptor anti-progesterona (cáncer de mama), anticuerpo anti-p53 (múltiples tipos de cáncer), anticuerpo anti-Her-2/neu (múltiples tipos de cáncer), anticuerpo anti-EGFR (factor de crecimiento epidérmico, múltiples tipos de cáncer), anticuerpo anti-catepsina D (cánceres de mana y otros tipos de cáncer), anticuerpo anti-Bcl-2 (células apoptóticas), anticuerpo anti-cadherina E, anticuerpo anti-CA125 (cáncer de ovario y de otro tipo), anticuerpo anti-CA15-3 (cáncer de mama), anticuerpo anti-CA19-9 (cáncer de colon), anticuerpo antic-erbB-2, anticuerpo anti-P-glicoproteína (MDR, resistencia a múltiples fármacos), anticuerpo anti-CEA (antígeno carcinoembrionario), anticuerpo anti-proteína de retinoblastoma (Rb), anticuerpo anti-oncoproteína ras (p21), anticuerpo anti-cuerpos de Lewis X (también denominado CD15), anticuerpo anti-Ki-67 (proliferación celular), anticuerpo anti-PCNA (múltiples tipos de cáncer), anticuerpo anti-CD3 (linfocitos T), anticuerpo anti-CD4 (linfocitos T colaboradores), anticuerpo anti-CD5 (linfocitos T), anticuerpo anti-CD (timocitos, linfocitos T inmaduros, células NK asesinas naturales), anticuerpo anti-CD8 (linfocitos T supresores), anticuerpo anti-CD9/p24 (ALL), anticuerpo anti-CD10 (también denominados CALLA) (leucemia linfoblástica aguda común), anticuerpo anti-CD11c (monocitos, granulocitos, AML), anticuerpo anti-CD13 (células mielomonocíticas, AML), anticuerpo anti-CD14 (monocitos, granulocitos maduros), anticuerpo anti-CD 15 (enfermedad de Hodgkin), anticuerpo anti-CD19 (linfocitos B), anticuerpo anti-CD20 (linfocitos B), anticuerpo anti-CD22 (linfocitos B), anticuerpo anti-CD23 (linfocitos B humanos, CLL), anticuerpo anti-CD30 (linfocitos T y B activados, enfermedad de Hodgkin), anticuerpo anti-CD31 (marcador de la angiogénesis), anticuerpo anti-CD33 (células mieloides, AML), anticuerpo anti-CD34 (células madre endoteliales, tumores estromales), anticuerpo anti-CD35 (células dendríticas), anticuerpo anti-CD38 (células plasmáticas, células mieloides y T y B activadas, anticuerpo anti-CD41 (plaquetas, megacariocitos), anticuerpo anti-LCA/CD45 (antígeno común de leucocitos), anticuerpo anti-CD45RO (linfocitos T inductores, colaboradores), anticuerpo anti-CD45RA (linfocitos B), anticuerpo anti-CD39, anticuerpo CD100, anticuerpo anti-CD95/Fas (apoptosis), anticuerpo 10

anti-CD99 (marcador del sarcoma de Ewings, producto del gen MIC2), anticuerpo anti-CD106 (VCAM-1; células endoteliales activadas), anticuerpo anti-ubiquitina (enfermedad de Alzheimer), anticuerpo anti-CD71 (receptor de transferrina), anticuerpo anti-c-myc (oncoproteína y un hapteno), anticuerpo anti-citoqueratinas (receptor de transferrina), anticuerpo anti-vimentinas (células endoteliales) (linfocitos B y T), anticuerpo anti-proteínas del HPV (papilomavirus humano), anticuerpo anti-cadenas ligeras kappa (linfocitos B), anticuerpo anti-cadenas ligeras lambda (linfocitos B), anticuerpo anti-melanosomas (HMB45) (melanoma), anticuerpo anti-antígeno específico de próstata (PSA) (cáncer de próstata), anticuerpo anti-S-100 (células de melanoma, salivales, gliales), anticuerpo antiantígeno tau (enfermedad de Alzheimer), anticuerpo antifibrina (células epiteliales), anticuerpo anti-queratinas, anticuerpo anti-citoqueratina (tumor), anticuerpo anti-alfa-catenina (membrana celular) o anticuerpo anti-antígeno-Tn (carcinoma de colon, adenocarcinomas y cáncer pancreático).

Otros ejemplos específicos de anticuerpos adecuados pueden incluir, entre otros, antígeno nuclear celular antiproliferación, clon pc10 (Sigma Aldrich, P8825); anti-actina alfa del músculo liso (SmA), clon 1A4 (Sigma, A2547); anti-beta catenina de conejo (Sigma, C 2206); anti-pancitoqueratina de ratón, clon PCK-26 (Sigma, C1801); anti-receptor alfa de estrógenos de ratón, clon 1D5 (DAKO, M 7047); anticuerpo de beta catenina, clon 15B8 (Sigma, C 7738); anti-vimentina de cabra (Sigma, V4630); clon AR441 del receptor de andrógenos del ciclo (DAKO, M3562); factor 7 de Von Willebrand, queratina 5, queratina 8/18, e-cadherina, Her2/neu, receptor de estrógenos, p53, receptor de progesterona, beta catenina; anti-ratón de burro (Jackson Immunoresearch, 715-166-150); o anticonejo de burro (Jackson Immunoresearch, 711-166-152).

En algunas realizaciones, un aglutinante puede ser específico de secuencia. Un aglutinante específico de secuencia puede incluir un ácido nucleico y el aglutinante puede ser capaz de reconocer una disposición lineal concreta de nucleótidos o derivados de los mismos en la diana. En algunas realizaciones, la disposición lineal puede incluir nucleótidos contiguos o derivados de los mismos que pueden cada uno unirse a un correspondiente nucleótido complementario en el aglutinante. En una realización alternativa, la secuencia puede no ser contigua, ya que puede haber uno, dos o más nucleótidos que pueden no tener los correspondientes residuos complementarios en la sonda. Ejemplos adecuados de aglutinantes a base de ácidos nucleicos pueden incluir, entre otros, oligonucleótidos o polinucleótidos de ADN o de ARN. En algunas realizaciones, ácidos nucleicos adecuados pueden incluir análogos de ácido nucleico, tales como dCTP de dioxigenina, biotina dcTP 7-azaguanosina, azidotimidina, inosina o uridina.

En ciertas realizaciones, tanto el aglutinante como la diana pueden incluir ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, un aglutinante a base de ácido nucleico puede formar un enlace de Watson-Crick con la diana de ácido nucleico. En otra realización, el aglutinante de ácido nucleico puede formar un enlace de Hoogsteen con el ácido nucleico diana, formando de este modo un triplex. Un aglutinante de ácido nucleico que se une mediante enlace de Hoogsteen puede penetrar en la ranura principal de un el ácido nucleico diana e hibridar con las bases ahí localizadas. Ejemplos adecuados de los aglutinantes anteriores pueden incluir moléculas que reconocen y se unen a las ranuras minoritarias y mayoritarias de los ácidos nucleicos (por ejemplo, algunas formas de antibióticos). En ciertas realizaciones, los aglutinantes de ácido nucleico pueden formar enlaces de Watson-Crick y Hoogsteen con el ácido nucleico diana (por ejemplo, las sondas de bisPNA son capaces de formar enlaces de Watson-Crick y Hoogsteen con un ácido nucleico).

La longitud del aglutinante de ácido nucleico puede también determinar la especificidad de la unión. El coste energético de un único error de apareamiento entre el aglutinante y el ácido nucleico diana puede ser relativamente mayor para las secuencias más cortas que para las más largas. En algunas realizaciones, la hibridación de aglutinantes de ácido nucleico más pequeños puede ser más específica que la hibridación de sondas de ácido nucleico más largas, ya que las sondas más largas pueden ser más susceptibles a sufrir errores de apareamiento y pueden seguir uniéndose al ácido nucleico según las condiciones. En ciertas realizaciones, los aglutinantes más cortos pueden exhibir una estabilidad de unión menor a una temperatura y una concentración de sales dadas. En este caso se pueden usar los aglutinantes que pueden exhibir mayor estabilidad para unir secuencias cortas (p. ej., bisPNA). En algunas realizaciones, el aglutinante de ácido nucleico puede tener una longitud en el intervalo de aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 12 nucleótidos, de aproximadamente 12 nucleótidos a aproximadamente 25 nucleótidos, de aproximadamente 25 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos, de aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 250 nucleótidos, de aproximadamente 250 nucleótidos a aproximadamente 500 nucleótidos o de aproximadamente 500 nucleótidos a aproximadamente 1000 nucleótidos. En algunas realizaciones, el aglutinante de ácido nucleico puede tener una longitud en el intervalo que es superior a aproximadamente 1000 nucleótidos. Con independencia de la longitud del aglutinante de ácido nucleico, no todos los residuos de nucleótido del aglutinante se hibridan con nucleótidos complementarios en el ácido nucleico diana. Por ejemplo, el aglutinante puede incluir 50 residuos de nucleótidos de longitud y sólo 25 de dichos residuos de nucleótidos pueden hibridar pueden hibridar con el ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, los residuos de nucleótidos que pueden hibridar pueden ser contiguos entre sí. Los aglutinantes de ácido nucleico pueden ser monocatenarios o pueden incluir una estructura secundaria. En algunas realizaciones, una muestra biológica puede incluir una muestra de

célula o de tejido y la muestra biológica puede someterse a hibridación in situ (ISH) usando un aglutinante de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una muestra de tejido puede someterse a hibridación in situ además de inmunohistoquímica (IHC) para obtener la información deseada de la muestra.

Con independencia del tipo de aglutinante y la diana, la especificidad de la unión entre el aglutinante y la diana puede también verse afectada en función de las condiciones de unión (p. ej., condiciones de hibridación en el caso de los ácidos nucleicos complementarios). Las condiciones de unión adecuadas pueden obtenerse mediante modulación de uno o más de pH, temperatura o concentración de sales.

Un aglutinante puede estar marcado de forma intrínseca (generador de señal o enzima unidos durante la síntesis del aglutinante) o marcado de forma extrínseca (generador de señal o enzima unidos durante una etapa posterior). Por ejemplo, para un aglutinante a base de proteínas, se puede preparar un aglutinante marcado de forma intrínseca usando aminoácidos marcados. De forma similar, un ácido nucleico marcado de forma intrínseca se puede sintetizar usando procedimientos que incorporan nucleótidos marcados con generador de señal directamente en el ácido nucleico en crecimiento. En algunas realizaciones, un aglutinante se puede sintetizar de un modo tal que los generadores de señal o las enzimas se pueden incorporar en una etapa posterior. Por ejemplo, este último marcaje puede conseguirse por medios químicos mediante la introducción de grupos amino o tiol activos en ácidos nucleicos de cadenas peptídicas. En algunas realizaciones, un aglutinante, tal como una proteína (p. ej., un anticuerpo) o un ácido nucleico (p. ej., un ADN) puede variar mediante marcaje químico directo usando técnicas químicas adecuados.

En algunas realizaciones se pueden usar combinaciones de aglutinantes que pueden proporcionar mayor especificidad o, en ciertas realizaciones, amplificación de la señal. Por tanto, en algunas realizaciones se puede usar un sándwich de aglutinantes, en el que el primer aglutinante puede unirse a la diana y servir para proporcionar unión secundaria, en el que el aglutinante secundario puede o no incluir un marcador, que puede además proporcionar unión terciaria (en caso necesario) en la que el miembro de unión terciaria puede incluir un marcador.

Ejemplos adecuados de combinaciones de aglutinantes pueden incluir anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios, ácidos nucleicos complementarios u otros pares ligando-receptor (tales como biotina-estreptavidina). Algunos ejemplos específicos de pares de aglutinantes adecuados pueden incluir anti-myc de ratón para proteínas expresadas de forma recombinante con epítopo c-myc, anti-HisG de ratón para proteína recombinante con epítopo His-Tag, anti-xpress de ratón para proteína recombinante con epítopo-cola, anti-cabra de conejo para moléculas primarias de IgG de cabra, secuencia de ácido nucleico complementario para un ácido nucleico, anti-tiol de ratón para proteínas de fusión de tioredoxina, anti-GFP de conejo para proteína de fusión, jacalina para α-D-galactosa y melibiosa para proteínas de unión a hidratos de carbono, azúcares, matriz acoplada a níquel o heparina.

En algunas realizaciones se puede usar una combinación de un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario como aglutinante. Un anticuerpo primario puede ser capaz de unirse a una región específica de la diana y el anticuerpo secundario puede ser capaz de unirse al anticuerpo primario. Un anticuerpo secundario puede estar fijado a un generador de señal o a una enzima antes de unirse al anticuerpo primario o puede ser capaz de unirse a un generador de señal o a una enzima en una etapa posterior. En una realización alternativa se pueden usar un anticuerpo primario y pares de ligando-receptor de unión específica (tales como biotina-estreptavidina). El anticuerpo primario puede estar fijado a un miembro del par (p. ej., biotina) y el otro miembro (p. ej., estreptavidina) puede estar marcado con un generador de señal o una enzima. El anticuerpo secundario, avidina, estreptavidina o biotina, pueden estar cada uno marcados de forma independiente con un generador de señal o una enzima.

En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden usar en un procedimiento de inmunotinción y un anticuerpo primario se puede usar para unirse específicamente a la proteína diana. Un anticuerpo secundario se puede usar para unirse específicamente al anticuerpo primario, formando de este modo un puente entre el anticuerpo primario y un reactivo posterior (p. ej., un generador de señal o enzima), en su caso. Por ejemplo, un anticuerpo primario puede ser IgG de ratón (un anticuerpo creado en ratón) y el correspondiente anticuerpo secundario puede ser anti-ratón de cabra (anticuerpo creado en cabras) que tiene regiones capaces de unirse a una región en una IgG de ratón.

En algunas realizaciones se puede obtener amplificación de señal cuando varios anticuerpos secundarios se pueden unir a epítopos sobre el anticuerpo primario. En un procedimiento de inmunotinción, un anticuerpo primario puede ser el primer anticuerpo usado en el procedimiento y el anticuerpo secundario puede ser el segundo anticuerpo usado en el procedimiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo primario puede ser el único anticuerpo usado en el procedimiento de inmunotinción.

Generadores de señal

El tipo de generador de señal adecuado para los procedimientos divulgados en el presente documento pude depender de diversos factores, incluidas la naturaleza del análisis que se está realizando, el tipo de fuente de

energía y el detector usado, el tipo de agente oxidante empleado, el tipo de aglutinante, el tipo de diana o el modo de fijación entre el aglutinante y el generador de señal (p. ej., escindible o no escindible).

Un generador de señal adecuado puede incluir una molécula o un compuesto capaz de proporcionar una señal detectable. Un generador de señal puede proporcionar una señal característica tras la interacción con una fuente de energía o una corriente. Una fuente de energía puede incluir una fuente de radiación electromagnética y una fuente de excitación de fluorescencia. La fuente de radiación electromagnética puede ser capaz de proporcionar energía electromagnética de cualquier longitud de onda, incluida luz visible, infrarrojos y ultravioleta. La radiación electromagnética puede estar en forma de una fuente de luz directa o puede ser emitida por un compuesto de emisión de luz, tal como un fluoróforo donante. Una fuente de excitación de fluorescencia puede ser capaz de fabricar una fuente de fluorescencia o puede dar lugar a emisiones de fotones (es decir, radiación electromagnética, campo eléctrico dirigido, temperatura, contacto físico o alteración mecánica). Generadores de señal adecuados pueden proporcionar una señal capaz de ser detectada por varios procedimientos, incluidas mediciones ópticas (p. ej., fluorescencia), conductividad eléctrica o radioactividad. Generadores de señal adecuadas pueden ser, por ejemplo, emisión de luz, aceptación de energía, fluorescencia, radioactivos o de inactivación.

Un generador de señal adecuado puede ser estérica y químicamente compatible con los constituyentes a los que está unido, por ejemplo un aglutinante. Adicionalmente, un generador de señal adecuado puede no interferir con la unión del aglutinante a la diana ni tampoco puede afectar a la especificidad de unión del aglutinante. Un generador de señal adecuado puede ser de naturaleza orgánica o inorgánica. En algunas realizaciones, un generador de señal puede ser de naturaleza química, peptídica o de ácido nucleico.

Un generador de señal adecuado puede ser detectable directamente. Un resto detectable directamente puede ser uno que se pueda detectar directamente por su capacidad para emitir una señal, tal como, por ejemplo, un marcador fluorescente que emite luz de una longitud de onda concreta tras la excitación por la luz de otra longitud de onda característica menor y/o absorber luz de una longitud de onda concreta.

Un generador de señal, adecuado de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento, puede ser susceptible a la manipulación mediante aplicación de un agente químico. En algunas realizaciones, un generador de señal puede ser capaz de ser destruido químicamente tras la exposición a un agente oxidante. La destrucción química puede incluir la disgregación completa del generador de señal o la modificación del componente de generación de señal del generador de señal. La modificación del componente de generación de señal puede incluir cualquier modificación química (tal como adición, sustitución o eliminación) que puede tener como resultado la modificación de las propiedades de generación de señal. Por ejemplo, la desconjugación de un generador de señal conjugado puede tener como resultado la destrucción de las propiedades cromogénicas del generador de señal. De forma similar, la sustitución de un grupo funcional de inhibición de la fluorescencia en un generador de señal fluorescente puede tener como resultado la modificación de sus propiedades fluorescentes. En algunas realizaciones, uno o más generadores de señal sustancialmente resistentes a la inactivación mediante un agente químico específico se pueden usar como sonda control en los procedimientos proporcionados.

En algunas realizaciones, se puede seleccionar un generador de señal de una molécula de emisión de luz, un radioisótopo (p. ej., P32 o H3, 14C, 125I y 131I), un marcador de densidad óptica y electrónica, una marca activa de Raman, una molécula de resonancia de espín de electrones (tal como, por ejemplo, radicales de nitroxilo), una molécula de transferencia de carga eléctrica (es decir, una molécula de transducción de carga eléctrica), un nanocristal semiconductor, una nanopartícula semiconductora, un nanocristal de oro coloidal, una microesfera, una perla magnética, una partícula paramagnética o un punto cuántico.

En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir una molécula de emisión de luz. Una molécula de emisión de luz puede emitir luz en respuesta al la irradiación con luz de una longitud de onda concreta. Las moléculas de emisión de luz pueden ser capaces de absorber y emitir luz a través de luminiscencia (emisión no térmica de radiación electromagnética por un material tras su excitación), fosforescencia (luminiscencia retardada como resultado de la absorción de radiación), quimioluminiscencia (luminiscencia debido a una reacción química), fluorescencia o fluorescencia polarizada.

En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente un fluoróforo. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente un fluoróforo fijado a un anticuerpo, por ejemplo en un análisis de inmunohistoquímica. Fluoróforos adecuados que se pueden conjugar con un anticuerpo primario incluyen, entre otros, fluoresceína, rodamina, rojo Texas, rojo VECTOR, ELF (fluorescencia marcada con enzima), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7, FluorX, calceína, calcecina-AM, CRYPTOFLUOR, naranja (42 kDa), mandarina (35 kDa), oro (31 kDa), rojo (42 kDa), crimson (40 kDa), BHMP, BHDMAP, Br-Oregón, amarillo Lucifer, familia de pigmentos Alexa, N-[6-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-il)amino]caproilo] (NBD), BODIPY, difluoruro de dipirrometeno de boro, verde Oregón, rojo MITOTRACKER, ficoeritrina, ficobiliproteínas BPE (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa), espectro azul, espectro agua, espectro verde, espectro oro, espectro naranja, espectro rojo, pigmentos Infrarrojos (IR), GDP-Ribosa cíclica (cGDPR), blanco calcoflúor, lisamina, umbeliferona,

tirosina o triptófano. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente un pigmento de cianina. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente uno o más de un pigmento de Cy3, un pigmento de Cy5 o un pigmento de Cy7.

En algunas realizaciones, el generador de señal puede ser parte de un par de FRET. El par de FRET incluye dos fluoróforos que son capaces de sufrir FRET para producir o eliminar una señal detectable cuando están colocados cerca uno de otro. Algunos ejemplos de donantes pueden incluir Alexa 488, Alexa 546, BODIPY 493, Oyster 556, Flúor (FAM), Cy3 o TTR (Tamra). Algunos ejemplos de aceptores pueden incluir Cy5, Alexa 594, Alexa 647 u Oyster

656.

Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, una o más de las moléculas mencionadas con anterioridad se pueden usar como generador de señal. En algunas realizaciones, uno o más de los generadores de señal pueden no ser susceptibles a destrucción química y se puede usar un ligador escindible para asociar el generador de señal y el aglutinante. En algunas realizaciones, uno o más de los generadores de señal pueden no ser susceptibles a destrucción de la señal y el generador de señal puede incluir esencialmente una molécula capaz de ser destruida químicamente. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir un fluoróforo capaz de ser destruido químicamente por un agente oxidante. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente cianina, coumarina, BODIPY, ATTO 658, o ATTO 634, capaces de ser destruidos químicamente por un agente oxidante. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir uno o más de un pigmento de Cy3, un pigmento de Cy5 o un pigmento de Cy7 capaces de ser destruidos o inactivados.

Enzima y sustratos enzimáticos

En algunas realizaciones, una sonda puede incluir un aglutinante acoplado a una enzima. En algunas realizaciones, una enzima adecuada cataliza una reacción química del sustrato para formar un producto de reacción que se puede unir a un receptor (p. ej., grupos fenólicos) presente en la muestra o un soporte sólido al que la muestra está unida. Un receptor puede ser exógeno (es decir, un receptor extrínsecamente adherido a la muestra o al soporte sólido) o endógeno (receptores presentes intrínsecamente en la muestra o el soporte sólido). La amplificación de señal puede efectuarse cuando una única enzima puede catalizar una reacción química del sustrato para unir covalentemente múltiples generadores de señal cerca de la diana.

En algunas realizaciones, una enzima adecuada también puede ser capaz de ser inactivado por un agente oxidante. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasas, oxidasas, fosfatasas, esterasas y glicosidasas. Ejemplos específicos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, -D-galactosidasa, lipasa y glucosa oxidasa. En algunas realizaciones, la enzima es una peroxidasa seleccionada de peroxidasa de rábano, peroxidasa de citocromo C, peroxidasa de glutatión, microperoxidasa, mieloperoxidasa, lactoperoxidasa y peroxidasa de soja.

En algunas realizaciones, un aglutinante y una enzima pueden estar reunidos en una única entidad, por ejemplo una molécula proteica capaz de unirse a una diana y también de catalizar una reacción química del sustrato. En otras realizaciones, un aglutinante y una enzima pueden estar reunidos en entidades separadas y se pueden acoplar mediante formación de enlaces o usando pares conjugados de ligando-receptor (p. ej., biotinaestreptavidina).

Se puede seleccionar un sustrato enzimático en función de la enzima empleada y la diana disponible para unirse en la muestra o sobre el soporte sólido. Por ejemplo, en realizaciones que incluyen HRP como enzima, un sustrato puede incluir un fenol sustituido (p. ej., tiramina). La reacción de HRP con la tiramina puede producir un sustrato fenólico activado que se puede unir a receptores endógenos, como restos ricos en electrones (tales como tirosina o triptófano) o grupos fenólicos presentes en las proteínas de superficie de una muestra biológica. En realizaciones alternativas, en las que se puede usar 3-metil-2-benzotiazolinona clorhidrato (MBTH) como sustrato junto con una enzima HRP, los receptores exógenos como p-dimetilaminobenzaldehído (DMAB) pueden adherirse al soporte sólido o a la muestra biológica antes de reaccionar con el sustrato.

En algunas realizaciones, un sustrato enzimático se puede desfosforilar tras la reacción con la enzima. El producto de la reacción de desfosforilación puede ser capaz de unirse a receptores endógenos o exógenos (p. ej., anticuerpos) en la muestra o en el soporte sólido. Por ejemplo, una enzima puede incluir fosfatasa alcalina (AP) y un sustrato puede incluir NADP, fosfatos sustituidos (p. ej., fosfato de nitrofenilo) o biotina fosforilada. Los receptores pueden incluir proteínas de unión a NAD, anticuerpos frente al producto de reacción desfosforilado (p. ej., anti-nitro-fenol), avidina o estreptavidina, según sea necesario.

En algunas realizaciones, una enzima puede incluir -galactosidasa y un sustrato puede incluir -galactopiranosilglicósido de fluoresceína o coumarina. Los receptores pueden incluir anticuerpos frente a restos desglicosilados (p. ej., anti-fluoresceína o anti-coumarina). En algunas realizaciones, se pueden usar como enzima combinaciones de múltiples enzimas, como HRP/AP. Un sustrato puede incluir fenol sustituido fosforilado, por ejemplo tirosina fosfato,

que puede ser desfosforilada por la AP antes de reaccionar con la HRP, para formar un producto de reacción capaz de unirse a receptores basados en restos ricos en electrones o grupos fenólicos.

Un producto de reacción del sustrato enzimático puede además ser capaz de proporcionar una señal detectable. En algunas realizaciones, los sustratos enzimáticos usados en los procedimientos divulgados en el presente documento pueden incluir sustratos no cromogénicos o no quimioluminiscentes, es decir una reacción de la enzima y el sustrato enzimático puede no producir por sí mismo una señal detectable. Los sustratos enzimáticos usados en los procedimientos divulgados en el presente documento pueden incluir un generador de señal extrínseco (p. ej., un fluoróforo) como marcador. El generador de señal y el sustratos enzimático se pueden fijar directamente (p. ej., un sustrato enzimático con un marcador fluorescente) o indirectamente (p. ej., mediante par conjugado de ligandoreceptor). En algunas realizaciones, un sustrato puede incluir grupos funcionales protegidos (p. ej., grupos sulfhidrilo). Tras la unión del sustrato activado a los receptores, el grupo funcional puede quedar desprotegido y efectuarse la conjugación con un generador de señal usando un generador de señal que tenga un grupo reactivo tiol (p. ej., maleimida o yodoacetilo).

En algunas realizaciones, una sonda puede incluir peroxidasa de rábano y el sustrato se selecciona de fenoles sustituidos (p. ej., tiramina). En algunas realizaciones, la peroxidasa de rábano hace que el sustrato fenólico activado se una covalentemente a los grupos fenólicos presentes en la muestra o a un soporte sólido al que la muestra está unida. En algunas realizaciones, una sonda puede incluir un aglutinante acoplado a HRP y un sustrato puede incluir tiramina acoplada a un fluoróforo

Agentes químicos

Un agente químico puede incluir uno o más sustancias químicas capaces de modificar el generador de señal, la enzima o el ligador escindible (si está presente) entre el generador de señal y el aglutinante o el sustrato enzimático. Se puede poner en contacto un agente químico con la muestra en forma de un sólido, una solución, un gel o una suspensión.

En algunas realizaciones, un agente químico puede incluir agentes oxidantes, por ejemplo especies de oxígeno activo, radicales hidroxilo, oxígeno singlete, peróxido de hidrógeno u ozono. En algunas realizaciones, un agente químico puede incluir peróxido de hidrógeno, permanganato potásico, dicromato sódico, bromo acuoso, yoduro de yodo-potasio o hidroperóxido de t-butilo.

Uno o más de los agentes químicos mencionados anteriormente se pueden usar en los procedimientos divulgados en el presente documento, en función de la susceptibilidad del generador de señal, de la enzima, del aglutinante, de la diana o de la muestra biológica al agente químico. En algunas realizaciones, se puede usar un agente químico que esencialmente no afecta a la integridad del aglutinante, la diana y la muestra biológica. En algunas realizaciones, se puede usar un agente químico que no afecta a la especificidad de unión entre el aglutinante y la diana.

En algunas realizaciones, en las que se pueden usar dos o más (hasta cuatro) generadores de señal de forma simultánea, un agente químico puede ser capaz de modificar de forma selectiva uno o más generadores de señal. La susceptibilidad de diferentes generadores de señal a un agente químico puede depender, en parte, de la concentración del generador de señal, la temperatura o el pH. Por ejemplo, dos fluoróforos diferentes pueden tener diferente susceptibilidad a un agente oxidante en función de la concentración del agente oxidante.

En algunas realizaciones, un agente químico puede incluir esencialmente un agente oxidante. En otras realizaciones, un agente químico puede incluir esencialmente una solución básica de un agente oxidante. En algunas realizaciones específicas, una solución básica puede tener un pH en un intervalo de aproximadamente 8 a aproximadamente 10. En algunas realizaciones, una solución básica (p. ej., bicarbonato sódico) puede tener un pH de aproximadamente 10.

Un agente oxidante adecuado se puede seleccionar de peróxido, peryodato sódico u ozono. En algunas realizaciones, un agente oxidante adecuado puede incluir peróxido o una fuente de peróxido y la solución básica puede incluir peróxido de hidrógeno. La concentración de peróxido de hidrógeno en la solución básica puede seleccionarse para oxidar sustancialmente el generador de señal fluorescente en un periodo de tiempo predeterminado. En algunas realizaciones, la concentración de peróxido de hidrógeno en la solución básica puede seleccionarse para inactivar sustancialmente tanto el generador de señal fluorescente como la enzima en un periodo de tiempo dado. La concentración de peróxido de hidrógeno en la solución básica puede seleccionarse de modo que se pueda mantener la integridad de la muestra, las dianas, el aglutinante o la especificidad dianaaglutinante.

En algunas realizaciones, una solución básica puede incluir peróxido de hidrógeno en una cantidad que está en un intervalo de aproximadamente 0,5 por ciento en volumen a aproximadamente 5 por ciento en volumen en un intervalo de aproximadamente 1 por ciento en volumen a aproximadamente 4 por ciento en volumen o en un

intervalo de aproximadamente 1,5 por ciento en volumen a aproximadamente 3,5 por ciento en volumen. En algunas realizaciones específicas, una solución básica puede incluir peróxido de hidrógeno en una cantidad que está en un intervalo de aproximadamente 3 por ciento en volumen.

En algunas realizaciones, la solución básica puede no incluir reactivos que extraen los aglutinantes, las dianas o tanto los aglutinantes como las dianas de la muestra, tal como agentes reductores o tensioactivos.

Análisis secuencial de una muestra biológica, contacto y unión a la sonda

Se puede poner en contacto una muestra biológica con una sonda para unir la sonda a una diana en la muestra biológica. En algunas realizaciones, una diana puede no ser fácilmente accesible para unión con la sonda y una muestra biológica puede procesarse después para facilitar la unión entre la diana y el aglutinante en la sonda, por ejemplo mediante recuperación del antígeno, digestión enzimática, recuperación del epítopo o bloqueo.

En algunas realizaciones se puede poner en contacto una sonda con la muestra biológica en forma de una solución. En algunas realizaciones, una sonda puede incluir un aglutinante acoplado a un marcador (generador de señal fluorescente o una enzima). El aglutinante y el marcador (generador de señal o enzima) pueden estar reunidos en una única molécula y la solución de la sonda se puede aplicar en una única etapa. Como alternativa, el aglutinante y el marcador (generador de señal o enzima) pueden ser entidades distintas y la solución de la sonda se puede aplicar en una única etapa o en múltiples etapas. En todas las realizaciones, una sonda control puede unirse además a una o más dianas en la muestra.

En función de la naturaleza del aglutinante, la diana y la unión entre los dos se puede dejar suficiente tiempo de contacto. En algunas realizaciones, se puede usar un exceso de moléculas sonda (y, en consecuencia, de moléculas aglutinantes) para garantizar que todas las dianas en la muestra biológica están unidas. Tras un tiempo suficiente para la acción de unión, la muestra se puede poner en contacto con una solución de lavado (p. ej., una solución tampón adecuada) para eliminar mediante lavado todas las sondas no unidas. Dependiendo de la concentración y del tipo de sondas usadas, una muestra biológica se puede someter a una serie de etapas de lavado usando las mismas o diferentes soluciones de lavado en cada etapa.

En algunas realizaciones, la muestra biológica se puede poner en contacto con más de una sonda en la primera etapa de unión. La pluralidad de las sondas puede ser capaz de unirse a diferentes dianas en la muestra biológica. Por ejemplo, una muestra biológica puede incluir dos dianas: diana 1 y diana 2, y en este caso se pueden usar dos grupos de sondas: sonda 1 (que tiene el aglutinante 1 capaz de unirse a la diana 1) y sonda 2 (que tiene el aglutinante 2 capaz de unirse a la diana 2). Se puede poner en contacto una pluralidad de sondas con la muestra biológica de forma simultánea (p. ej., como mezcla única) o secuencialmente (p. ej., una sonda 1 se puede poner en contacto con la muestra biológica, seguido de la etapa de lavado para eliminar toda la sonda 1 no unida, seguida del contacto de una sonda 2 con la muestra biológica, y así sucesivamente.

El número de sondas que se pueden unir de forma simultánea a la diana puede depender del tipo de detección usada, es decir, la resolución del espectro que se puede conseguir. Por ejemplo, para generadores de señal basados en fluorescencia se pueden usar cuatro sondas diferentes (proporcionando cuatro señales fluorescentes de resolución espectral) de acuerdo con los procedimientos divulgados. De resolución espectral, en referencia a una pluralidad de generadores de señal fluorescentes, indica que las bandas de emisión de fluorescencia de los generadores de señal son lo suficientemente distintos, es decir suficientemente no solapantes, de modo que los aglutinantes a los que están fijados los respectivos generadores de señal se pueden distinguir sobre la base de la señal fluorescente generada por los respectivos generadores de señal usando sistemas de fotodetección convencionales.

En algunas realizaciones, una muestra biológica se puede poner en contacto esencialmente con cuatro o menos de cuatro sondas en la primera etapa de unión. En las realizaciones que usan sondas a base de enzimas, el número de sondas que se pueden unir de forma simultánea a la diana puede también depender del número de enzimas diferentes y de sus correspondientes sustratos disponibles.

En algunas realizaciones, una muestra biológica puede incluir una muestra de células enteras, una muestra de tejido o la muestra biológica puede estar adherida a una micromatriz, un gel o una membrana. En algunas realizaciones, una muestra biológica incluye una muestra de tejido. La muestra de tejido puede obtenerse mediante diversos procedimientos, incluidos, entre otros, escisión quirúrgica, aspiración o biopsia. El tejido puede estar fresco

o congelado. En algunas realizaciones, la muestra de tejido puede estar fijada e incluida en parafina. La muestra de tejido puede estar fijada o conservada de otro modo mediante metodología convencional; la elección de un fijante puede venir determinada por el objetivo para el cual el tejido se va a teñir histológicamente o analizarse de otro modo. La longitud de la fijación puede depender del tamaño de la muestra de tejido y del fijante usado. Por ejemplo, para fijar o conservar una muestra de tejido se puede usar formalina tamponada neutra, Bouin o paraformaldehído.

En algunas realizaciones, en primer lugar se puede fijar la muestra de tejido y, después, deshidratar mediante una

serie creciente de alcoholes, infiltrar e incluir en parafina o en otros medios para secciones de modo que se pueda partir la muestra de tejido. En una realización alternativa, una muestra de tejido se puede partir y después fijar. En algunas realizaciones, la muestra de tejido puede incluirse y procesarse en parafina. Ejemplos de parafina que se pueden usar incluyen, entre otros, Paraplast, Broloid y Tissuemay. Una vez que la muestra de tejido se ha incluido, la muestra se puede partir con un microtomo en secciones que pueden tener un espesor en el intervalo de aproximadamente tres micrómetros a aproximadamente cinco micrómetros. Una vez partidas, las secciones se pueden fijar a portaobjetos usando adhesivos. Ejemplos de adhesivos para portaobjetos pueden incluir, entre otros, silano, gelatina, poli-L-lisina. En realizaciones, su se usa parafina como material de inclusión, las secciones de tejido se pueden desparafinar y rehidratar en agua. Las secciones de tejido se pueden desparafinar usando, por ejemplo, agentes orgánicos (tales como, xilenos o series gradualmente descendentes de alcoholes).

En algunas realizaciones, además de los procedimientos de preparación de muestras tratados anteriormente, la sección de tejido se puede someter a tratamiento adicional antes de, durante o después de inmunohistoquímica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la sección de tejido puede someterse a procedimientos de recuperación de epítopo, tales como calentamiento de la muestra de tejido en tampón citrato. En algunas realizaciones, una sección de tejido pueden someterse opcionalmente a una etapa de bloqueo para minimizar cualquier unión inespecífica.

En algunas realizaciones, la muestra biológica o una porción de la muestra biológica, o las dianas presentes en la muestra biológica pueden adherirse a la superficie de micromatrices de ADN, a superficie de micromatrices de proteínas o a la superficie de soportes sólidos (tales como geles, transferencias, portaobjetos de vidrio, perlas o placas de ELISA). En algunas realizaciones, las dianas presentes en la muestra biológica pueden adherirse a la superficie de soportes sólidos. Las dianas en la muestra biológica pueden adherirse a un soporte sólido mediante formación de uniones físicas, mediante formación de enlaces covalentes o mediante ambos.

En algunas realizaciones, las dianas en la muestra biológica pueden adherirse a membranas y a sondas secuencialmente usando los procedimientos divulgados en el presente documento. En algunas realizaciones, las dianas en la muestra biológica pueden procesarse antes de poner en contacto la muestra con la membrana. Por ejemplo, realizaciones que implican procedimientos para el sondaje de dianas proteicas en una muestra de tejido pueden incluir la etapa de extraer las proteínas diana en una muestra biológica de homogeneizado de tejido o un extracto. Primero, los tejidos sólidos o las células enteras se pueden descomponer mecánicamente usando una batidora (para volúmenes grandes de muestra) usando un homogeneizador (volúmenes más pequeños) o mediante ultrasonidos. Los diferentes compartimentos celulares y orgánulos se pueden separar usando técnicas de filtración y centrifugación. También se pueden usar detergentes, sales y tampones para estimular la lisis de las células y solubilizar las proteínas. De forma similar, las realizaciones que implican procedimientos para sondar ácidos nucleicos pueden incluir la etapa de preparar fragmentos de ADN o ARN usando, por ejemplo, endonucleasas de restricción (para ADN).

En algunas realizaciones, las dianas extraídas de la muestra biológica pueden separarse adicionalmente mediante electroforesis. La separación de las dianas se puede realizar mediante el punto isoeléctrico (pI), el peso molecular, la carga eléctrica o una combinación de estos factores. La naturaleza de la separación puede depender del tratamiento de la muestra y la naturaleza del gel. Se puede seleccionar un gel adecuado de un gel de poliacrilamida, un SDS-gel de poliacrilamida o un gel de agarosa.

Se puede seleccionar una membrana adecuada de modo que la membrana tenga propiedades de unión inespecífica a la diana. En algunas realizaciones se puede seleccionar una membrana adecuada de una membrana de fluoruro de polivinilideno, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nylon. En alguna realización se puede seleccionar una membrana adecuada de modo que la membrana pueda ser sustancialmente estable al sondaje múltiple. En las realizaciones que implican sondaje de dianas usando sondas proteicas, las membranas se pueden bloquear usando una solución de bloqueo para impedir la unión inespecífica de las sondas proteicas a las membranas. En las realizaciones que implican sondaje de fragmentos de ADN, el gel de ADN se puede tratar con una solución de HCl diluido o una solución alcalina para facilitar la transferencia más eficiente de ADN desde el gel a la membrana.

En algunas realizaciones, la membrana puede someterse a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 60 ºC a aproximadamente 100 ºC para unir covalentemente las dianas a la membrana, por ejemplo dianas de ADN a una membrana de nitrocelulosa. En algunas realizaciones, la membrana puede exponerse a radiación ultravioleta para unir covalentemente las dianas a la membrana, por ejemplo dianas de ADN a una membrana de nylon. En algunas realizaciones, las dianas en la muestra biológica pueden no separarse mediante electroforesis antes de la transferencia sobre una membrana y pueden sondarse directamente sobre una membrana en, por ejemplo, técnicas de transferencia puntual.

Tras la preparación de la muestra de tejido o la membrana, se puede poner en contacto una solución con la sonda

(p. ej., solución de anticuerpo marcado) con la sección de tejido o la membrana durante un periodo de tiempo suficiente y en condiciones adecuadas para la unión del aglutinante a la diana (p. ej., antígeno). Como se ha

descrito anteriormente se pueden usar dos procedimientos de detección: directa o indirecta. En una detección directa, un anticuerpo primario marcado con generador de señal (p. ej., un anticuerpo primario marcado con un fluoróforo o un anticuerpo primario marcado con una enzima) se pueden incubar con un antígeno en la muestra de tejido o la membrana, que se puede visualizar sin posterior interacción con anticuerpos. En una detección indirecta, un anticuerpo primario sin conjugar se puede incubar con un antígeno y, después, un anticuerpo secundario marcado se puede unir al anticuerpo primario. Se puede producir amplificación de señal, ya que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopos sobre el anticuerpo primario. En algunas realizaciones, dos

o más (como máximo cuatro) anticuerpos primarios (marcados o sin marcar) se pueden poner en contacto con la muestra de tejido. Los anticuerpos sin marcar pueden ponerse en contacto después con los correspondientes anticuerpos secundarios marcados. En realizaciones alternativas se pueden usar un anticuerpo primario y pares de ligando-receptor de unión específica (tales como biotina-estreptavidina). El anticuerpo primario puede estar fijado a un miembro del par (p. ej., biotina) y el otro miembro (p. ej., estreptavidina) puede estar marcado con un generador de señal o una enzima. El anticuerpo secundario, avidina, estreptavidina o biotina, pueden estar cada uno marcados de forma independiente con un generador de señal o una enzima.

En las realizaciones en las que el anticuerpo primario o el anticuerpo secundario se pueden conjugar con un marcador enzimático se puede añadir un sustrato acoplado a un generador de señal fluorescente para proporcionar la visualización del antígeno. En algunas realizaciones, el sustrato y el generador de señal fluorescente pueden estar reunidos en una única molécula y se pueden aplicar en una única etapa. En otras realizaciones, el sustrato y el generador de señal fluorescente pueden ser entidades diferentes y se pueden aplicar en una única etapa o en múltiples etapas.

Una enzima acoplada al aglutinante puede reaccionar con el sustrato para catalizar una reacción química del sustrato para unir covalentemente el sustrato acoplado a un generador de señal fluorescente a la muestra biológica

o al soporte sólido al que la muestra está unida. En algunas realizaciones, una enzima puede incluir peroxidasa de rábano y el sustrato puede incluir tiramina. La reacción de la peroxidasa de rábano (HRP) con el sustrato de tiramina puede hacer que el sustrato de tiramina se una covalentemente a los grupos fenólicos presentes en la muestra o a un soporte sólido al que la muestra está unida. En realizaciones que emplean conjugados enzimasustrato, se puede producir amplificación de señal, ya que una enzima puede catalizar múltiples moléculas sustrato. En algunas realizaciones se pueden usar los procedimientos divulgados en el presente documento para detectar dianas con abundancia baja usando procedimientos de detección indirecta (p. ej., usando anticuerpos primariossecundarios), usando procedimientos de amplificación de señal de HRP-tiramina o combinaciones de ambos (p. ej., procedimientos de amplificación de señal indirecta de HRP-tiramina). La incorporación de las técnicas de amplificación de señal en los procedimientos divulgados en el presente documento y, de forma correspondiente, el tipo de técnicas de amplificación de señal incorporadas puede depender de la sensibilidad requerida para una diana concreta y el número de etapas implicadas en el protocolo.

Observación de una señal de la sonda

Se puede detectar una señal procedente del generador de señal usando un sistema de detección. La naturaleza del sistema de detección usado puede depender de la naturaleza de los generadores de señal usados. El sistema de detección puede incluir un sistema de detección de resonancia de espín de electrones (EDR), un sistema de detección de dispositivo acoplado a carga (CCD) (p. ej., para radioisótopos), un sistema de detección de fluorescencia, un sistema de detección eléctrica, un sistema de detección de película fotográfica, un sistema de detección quimioluminiscente, un sistema de detección enzimática, un sistema de detección por microscopia de fuerza atómica (AFM) (para la detección de microesferas), un sistema de detección por microscopia de tunelización de barrido (STM) (para la detección de microesferas), un sistema de detección óptica, un sistema de detección de campo cercano o un sistema de detección de reflejo interno total (TIR).

Una o más de las técnicas mencionadas anteriormente se pueden usar para observar una o más características de una señal procedente de un generador de señal (acoplada a un aglutinante o acoplada a un sustrato enzimático). En algunas realizaciones, la intensidad de la señal, la longitud de onda de la señal, la localización de la señal, la frecuencia de la señal o la desviación de la señal se pueden determinar usando una o más de las técnicas mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, una o más de las características de la señal mencionadas anteriormente se pueden observar, medir y registrar.

En algunas realizaciones, un generador de señal (acoplado con un aglutinante o acoplado con un sustrato enzimático) puede incluir un fluoróforo y se puede determinar la longitud de onda de la fluorescencia o la intensidad de la fluorescencia usando un sistema de detección de fluorescencia. En algunas realizaciones se puede observar una señal in situ, es decir, se puede observar una señal directamente a partir del generador de señal asociado a través del aglutinante a la diana en la muestra biológica. En algunas realizaciones se puede analizar una señal procedente del generador de señal en la muestra biológica, obviando la necesidad de distintos sistemas de detección basados en matrices.

En algunas realizaciones, la observación de una señal puede incluir capturar una imagen de la muestra biológica. En algunas realizaciones, como sistema de detección se puede usar un microscopio conectado a un dispositivo de imagen, de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento. En algunas realizaciones, un generador de señal (tal como un fluoróforo) puede excitarse y la señal (tal como una señal de fluorescencia) se puede obtener y registrar en forma de una señal digital (p. ej., una imagen digitalizada). El mismo procedimiento se puede repetir para diferentes generadores de señal (si hay) que están unidos en la muestra usando los filtros de fluorescencia adecuados.

Aplicación de un agente químico para modificar la señal

Para modificar la señal se puede aplicar un agente químico a la muestra. En algunas realizaciones, la modificación de la señal puede incluir uno o más de un cambio en la característica de la señal, por ejemplo una disminución de la intensidad de la señal, una desviación en el pico de la señal, un cambio en la frecuencia resonante o escisión (eliminación) del generador de señal que tiene como resultado la eliminación de la señal. En algunas realizaciones, se puede aplicar un agente químico para modificar la señal inactivando sustancialmente el generador de señal fluorescente y la enzima (si se usa). En algunas realizaciones, un agente químico puede incluir un agente oxidante, que puede oxidar sustancialmente el generador de señal fluorescente. En algunas realizaciones, se puede aplicar un agente químico para modificar la señal oxidando sustancialmente el enlace escindible para escindir el generador de señal.

En algunas realizaciones, un agente químico puede estar en forma de una solución y la muestra se puede poner en contacto con la solución del agente químico durante una cantidad de tiempo predeterminada. En algunas realizaciones, un agente químico puede ser una solución básica que tiene un agente oxidante. La concentración de la solución básica y el tiempo de contacto pueden depender del tipo de modificación de señal deseada. En algunas realizaciones, una solución del agente químico se puede poner en contacto con la muestra y la etapa de oxidación puede efectuarse durante menos de 30 minutos. En algunas realizaciones, la etapa de oxidación puede realizarse durante menos de 15 minutos. En algunas realizaciones, la etapa de oxidación puede realizarse durante de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 15 minutos. En algunas realizaciones, la etapa de oxidación puede realizarse durante aproximadamente 5 minutos. En algunas realizaciones, la etapa de oxidación puede realizarse a temperatura ambiente.

En algunas realizaciones, las condiciones de contacto para la solución básica se pueden seleccionar de modo que el aglutinante, la diana, la muestra biológica y la unión entre el aglutinante y la diana no se vean afectados. En algunas realizaciones, un agente oxidante puede afectar sólo al generador de señal y a la enzima (si se usa) y el agente oxidante puede no afectar a la unión diana/aglutinante o a la integridad del aglutinante. Por tanto, a modo de ejemplo, un aglutinante puede incluir un anticuerpo primario o una combinación de anticuerpo primario/secundario. Un agente oxidante de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento puede afectar sólo al generador de señal, y el anticuerpo primario o la combinación de anticuerpo primario/secundario pueden esencialmente seguir sin verse afectados. En algunas realizaciones, un aglutinante (tales como un anticuerpo primario o la combinación de anticuerpo primario/anticuerpo secundario) puede permanecer unido a la diana en la muestra biológica después de poner en contacto la muestra con el agente oxidante.

En algunas realizaciones, un aglutinante puede permanecer unido a la diana en la muestra biológica después de poner en contacto la muestra con el agente oxidante y la integridad del aglutinante puede permanecer esencialmente sin afectar (p. ej., un anticuerpo no se desnaturaliza sustancialmente ni eluye en presencia de un agente químico). En algunas realizaciones, tras la aplicación del agente oxidante a la muestra, menos del 25 por ciento de los aglutinantes puede extraerse de las dianas en la muestra biológica. En algunas realizaciones, tras la aplicación del agente oxidante a la muestra, menos del 20 por ciento, menos del 15 por ciento, menos del 10 por ciento o menos del 5 por ciento de los aglutinantes puede extraerse de las dianas en la muestra biológica.

En algunas realizaciones, se puede observar una característica de la señal tras poner en contacto la muestra con el agente oxidante, para determinar la eficacia de la modificación de la señal. Por ejemplo, se puede observar un color antes de la aplicación del agente oxidante y el color puede estar ausente tras la aplicación del agente oxidante. En otro ejemplo se puede observar la intensidad de la fluorescencia de un generador de señal fluorescente antes de poner en contacto con el agente oxidante y después de poner en contacto con el agente oxidante. En algunas realizaciones, una disminución de la intensidad de la señal en una cantidad predeterminada se puede denominar modificación de la señal. En algunas realizaciones, la modificación de la señal puede hacer referencia a una disminución de la intensidad de la señal en una cantidad en un intervalo de más de aproximadamente 50 por ciento. En algunas realizaciones, la modificación de la señal puede hacer referencia a una disminución de la intensidad de la señal en una cantidad en un intervalo de más de aproximadamente 60 por ciento. En algunas realizaciones, la modificación de la señal puede hacer referencia a una disminución de la intensidad de la señal en una cantidad en un intervalo de más de aproximadamente 80 por ciento.

Contacto de la muestra con una sonda posterior y unión a una diana posterior

La muestra biológica o la muestra unida a un soporte sólido se puede poner en contacto con una sonda posterior usando uno o más procedimientos descritos en el presente documento anteriormente para la primera sonda. La sonda posterior puede ser capaz de unirse a una diana diferente de la diana unida en las etapas anteriores. En las realizaciones en las que una pluralidad de sondas se puede poner en contacto con la muestra biológica en las etapas de contacto con la sonda anterior, la sonda posterior puede ser capaz de unirse a una diana diferente de las dianas unidas por el conjunto de sondas anteriores. En algunas realizaciones, una muestra biológica se puede poner en contacto con una pluralidad de sondas en la etapa de contacto de la sonda posterior. En las realizaciones en las que los aglutinantes acoplados a enzimas se pueden usar como sondas, las etapas de unión pueden incluir además etapas de reacción que implican la reacción de la enzima con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente.

En algunas realizaciones, el generador de señal (p. ej., un generador de señal fluorescente) usado en las diferentes etapas de unión puede ser el mismo, es decir detectable en el mismo canal de detección. Los procedimientos que usan el mismo generador de señal en diferentes etapas de unión puede permitir la detección de múltiples dianas cuando se dispone de un número limitado de canales de detección. En algunas realizaciones, cuando se puede usar un conjunto de sondas (de 2 a 4 sondas) en la primera etapa de unión, las sondas posteriores pueden incluir los mismos generadores de señal que en las etapas de unión anteriores. Por ejemplo, una primera etapa de unión puede incluir diferentes aglutinantes unidos a Cy3, Cy5 y Cy7. En algunas realizaciones, las etapas de unión posteriores pueden también incluir el mismo conjunto de pigmentos, es decir Cy3, Cy5 y Cy7.

En algunas realizaciones, el generador de señal (p. ej., un generador de señal fluorescente) usado en las diferentes etapas de unión puede ser diferente, es decir detectable de forma independiente en diferentes canales de detección. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una primera sonda puede incluir un pigmento Cy3, que tiene una longitud de onda de emisión de fluorescencia en la región del verde y una sonda posterior puede incluir un pigmento Cy7 que tiene una longitud de onda de emisión de fluorescencia en la región del rojo.

En las realizaciones en las que se usan enzimas acopladas al aglutinante como sondas, las enzimas y los sustratos usados en las diferentes etapas de unión y de reacción pueden ser los mismos. Un agente oxidante puede inactivar la enzima anterior antes de unir la muestra a una enzima posterior para evitar la reacción cruzada de la enzima anterior con el sustrato posterior. Por ejemplo, una primera etapa de unión y de reacción puede incluir aglutinante acoplado a HRP y tiramina acoplada a un primer fluoróforo. La etapa de oxidación puede implicar las etapas de oxidar sustancialmente el fluoróforo e inactivar sustancialmente la HRP. En algunas realizaciones, las etapas de oxidación e inactivación se pueden producir de forma simultánea. En algunas realizaciones, las etapas de oxidación e inactivación se pueden producir de forma secuencial. Tras las etapas de oxidación e inactivación, la muestra se puede poner en contacto con un aglutinante posterior acoplado a HRP, que además puede hacerse reaccionar con la tiramina acoplada a un segundo fluoróforo. De forma similar, las posteriores etapas de unión y de reacción pueden verse afectadas usando múltiples repeticiones de HRP-tiramina como conjugados de sustrato enzimático, cada etapa de unión y de reacción seguida de la etapa de oxidación e inactivación. El primer fluoróforo y los fluoróforos posteriores pueden ser iguales o diferentes en función del número de canales de detección disponibles para detección.

En algunas realizaciones, la primera etapa de unión puede incluir un conjunto de sondas (p. ej., de 2 a 4 sondas), en el que cada sonda incluye un aglutinante capaz de unirse a una diana diferente y cada enzima capaz de catalizar una reacción química de un sustrato diferente. Por ejemplo, en una realización, el primer conjunto de sondas puede incluir aglutinante 1 acoplado a HRP y un aglutinante 2 acoplado a AP. La etapa de reacción puede incluir poner en contacto el mismo con tiramina acoplada a Cy3 y NADP acoplado a Cy7. Tras la reacción de las enzimas con sus correspondientes sustratos y la observación de las señales, los pigmentos de cianina se pueden oxidar y se pueden inactivar las enzimas mediante la adición de un agente oxidante adecuado. Las etapas de sondaje posteriores pueden incluir el mismo conjunto de aglutinante-enzima y pares de sustrato-fluoróforo o un conjunto diferente de aglutinante-enzima y pares de –fluoróforo. Se puede poner en contacto la pluralidad de sondas y el generador de señal del sustrato con la muestra biológica de forma simultánea (p. ej., como mezcla única) o secuencialmente (p. ej., una sonda 1 se puede poner en contacto con la muestra biológica, seguido de la etapa de lavado para eliminar toda la sonda 1 no unida, seguida del contacto de una sonda 2 con la muestra biológica, y así sucesivamente.

Observación de una señal posterior de una sonda posterior

Se pueden usar uno o más procedimientos de detección descritos anteriormente en el presente documento para observar una o más características de una señal posterior (p. ej., segunda, tercera etc.) procedente de un generador de señal posterior (presente en la sonda posterior). En algunas realizaciones, la intensidad de la señal, la longitud de onda de la señal, la localización de la señal, la frecuencia de la señal o la desviación de la señal se pueden determinar usando una o más de las técnicas mencionadas anteriormente. Similar a la primera señal, una señal posterior (p. ej., una señal de fluorescencia) obtenida se puede registrar en forma de una señal digital (p. ej., una imagen digitalizada). En algunas realizaciones, la observación de una señal posterior puede incluir también capturar una imagen óptica de la muestra biológica.

Repetición de las etapas de contacto, unión y observación

En algunas realizaciones, después de poner en contacto la muestra con una sonda posterior (p. ej., segunda, tercera etc.), la oxidación del generador de señal y la administración de la sonda posterior se pueden repetir múltiples veces. En algunas realizaciones, después de observar una segunda señal de la segunda sonda, la muestra biológica se puede poner en contacto con un agente oxidante para modificar la señal de la segunda sonda. Además, se puede poner en contacto una tercera sonda con la muestra biológica, en la que la tercera sonda puede ser capaz de unirse a una diana diferente de la primera y de la segunda sonda. Asimismo, se puede observar una señal de la tercera sonda, seguida por la aplicación del agente oxidante para modificar la señal. Las etapas de unión, observación y oxidación se pueden repetir retiradamente múltiples veces usando una nª sonda capaz de unirse a etapas adicionales, para proporcionar al usuario información sobre diversas dianas usando diversas sondas y/o generadores de señal. En las realizaciones en las que los aglutinantes acoplados a enzimas se pueden usar como sondas, las etapas de unión pueden incluir además etapas de reacción que implican la reacción de la enzima con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente. En algunas realizaciones, las etapas de oxidación, unión, reacción (si procede) y observación se pueden repetir una o más veces. En algunas realizaciones, las etapas de oxidación, unión, reacción (si procede) y observación se pueden repetir al menos 5, al menos 10 o al menos 20 veces.

En algunas realizaciones se puede poner en contacto una serie de sondas con la muestra biológica de forma secuencial para obtener un análisis multiplexado de la muestra biológica. En algunas realizaciones se puede poner en contacto una serie de sondas (incluido, como máximo, 4 sondas en un conjunto) con la muestra biológica de forma secuencial para obtener una análisis multiplexado de la muestra biológica. En general, el análisis multiplexado se refiere al análisis de múltiples dianas en una muestra biológica usando el mismo mecanismo de detección.

Contacto de la muestra con una o más tinciones morfológicas

En algunas realizaciones, una muestra biológica puede incluir una célula o un tejido y la muestra se puede poner en contacto con una tinción morfológica antes, durante o después de la etapa de contacto con la primera sonda o la sonda posterior. Una tinción morfológica puede incluir un pigmento que puede teñir diferentes componentes celulares, con el fin de facilitar la identificación del tipo de célula o el estado de enfermedad. En algunas realizaciones, la tinción morfológica puede distinguirse fácilmente de los generadores de señal en las sondas, es decir la tinción puede no emitir la señal que puede solapar con la señal de la sonda. Por ejemplo, para una tinción morfológica fluorescente, la señal de la tinción morfológica puede no ser autofluorescente en la misma longitud de onda que los fluoróforos usados en las sondas.

Una tinción morfológica puede ponerse en contacto con la muestra biológica antes, durante o después de una cualquiera de las etapas mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, una tinción morfológica se puede poner en contacto con la muestra biológica junto con la etapa de contacto con la primera sonda. En algunas realizaciones, una tinción morfológica se puede poner en contacto con la muestra biológica antes del contacto de la muestra con el agente químico y tras la unión de la primera sonda con la diana. En algunas realizaciones, una tinción morfológica se puede poner en contacto con una muestra biológica después del contacto de la muestra con el agente químico y de la modificación de la señal. En algunas realizaciones, una tinción morfológica se puede poner en contacto con una muestra biológica junto con la etapa de contacto con la segunda sonda. En algunas realizaciones, una muestra biológica se puede poner en contacto con la tinción morfológica después de la unión de la segunda sonda a la diana. En algunas realizaciones, en las que las tinciones morfológicas pueden dar como resultado rudo de fondo para la señal fluorescente del generador de señal, las tinciones morfológicas se pueden poner en contacto con la muestra biológica después de las etapas de sondaje, oxidación y repetición del sondaje. Por ejemplo, se pueden obtener imágenes secuenciales de las tinciones morfológicas como H y E, y se pueden registrar después de los procedimientos divulgados en el presente documento.

En algunas realizaciones, se pueden usar como tinciones morfológicas cromóforos, fluoróforos o enzima/sustratos enzimáticos. Ejemplos adecuados de cromóforos que se pueden usar como tinciones morfológicas (y sus células diana, compartimentos subcelulares o componentes celulares) pueden incluir, entre otros, eosina (componentes celulares alcalinos, citoplasma), hematoxilina (ácidos nucleicos), naranja G (sangre, páncreas y células de la hipófisis), verde claro LF (colágeno), tinción de Romanowsky-Giemsa (morfología celular global), May-Grunwald (células sanguíneas), contratinción con azul (Trevigen), verde de etilo (CAS) (amiloide), amarillo S de Feulgen-Naphthol (ADN), Giemsa (tiñe de forma diferencial varios compartimentos celulares), verde de metilo (amiloide), pironina (ácidos nucleicos), amarillo naftol (células sanguíneas rojas), rojo neutro (núcleos), tinción de Papanicolaou (una mezcla de hematoxilina, eosina Y, naranja G y mezcla de marrón de Bismarck (morfología celular global)), contratinción con rojo B (Trevigen), contratinción con rojo C (Trevigen), rojo sirio (amiloide), reactivo de Feulgen (pararosanilina) (ADN), galocianina cromo-alúmina (ADN), galocianina cromo-alúmina y Amarillo naftol S (ADN),

verde de metilo-pironina Y (ADN), tionina-reactivo de Feulgen (ADN), naranja acridina (ADN), azul de metileno (ARN y ADN), azul toluidina (ARN y ADN), azul alciano (hidratos de carbono), rojo rutenio (hidratos de carbono), negro sudán (lípidos), Sudán IV (lípidos), rojo O al aceite (lípidos), tinción tricrómica de Van Gieson (fuccsina ácida y mezcla de ácido pícrico) (células musculares), tinción tricrómica de Masson (mezcla de hematoxilina, fucsina ácida y verde claro) (tiñe colágeno, citoplasma, nucleolos de forma diferente), aldehído fucsina (fibras de elastina) o tinción de Weigert (diferencia las fibras reticulares y colagenosas).

Ejemplos de tinciones morfológicas fluorescentes adecuadas (y sus células diana, compartimentos subcelulares o componentes celulares si procede) pueden incluir, entre otros: 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (ácidos nucleicos), eosina (componentes celulares alcalinos, citoplasma), Hoechst 33258 y Hoechst 33342 (dos bisbenzimidas) (ácidos nucleicos), yoduro de propidio (ácidos nucleicos), naranja espectral (ácidos nucleicos), verde espectral (ácidos nucleicos), quinacrina (ácidos nucleicos), fluoresceína-faloidina (fibras de actina), cromomicina A 3 (ácidos nucleicos), reacción de acriflavina-Feulgen (ácido nucleico), reacción de auramina O-Feulgen (ácidos nucleicos), bromuro de etidio (ácidos nucleicos). Tinciones de Nissl (neuronas, fluoróforos de ADN de alta afinidad tales como POPO, BOBO, YOYO y TOTO y otros, y proteína verde fluorescente condensada con proteína de unión a ADN, tales como histonas, ACMA, quinacrina y naranja acridina.

Ejemplos de enzimas adecuadas (y sus principales localizaciones o actividades celulares) pueden incluir, entre otros, ATPasas (fibras musculares), succinato deshidrogenasas (mitocondria), citocromo c oxidasas (mitocondria), fosforilasas (mitocondria), fosfofructoquinasas (mitocondria), acetil colinesterasa (células nerviosas), lactasas (intestino delgado), fosfastasas ácidas (lisosomas), leucina aminopeptidasas (células hepáticas), deshidrogenasas (mitocondria), miodenilato desaminasas (células musculares), NADH diaforasas (eritrocitos) y sacarasas (intestino delgado).

En algunas realizaciones, una tinción morfológica puede ser estable frente a un agente oxidante, es decir las propiedades de generación de señal de la tinción morfológica puede no verse sustancialmente afectada por el agente oxidante. En algunas realizaciones, cuando una muestra biológica puede teñirse con una sonda y una tinción morfológica al mismo tiempo, la aplicación del agente oxidante para modificar la señal de la sonda puede no modificar la señal de la tinción morfológica. En algunas realizaciones, se puede usar una tinción morfológica como control para co-registrar la información molecular (obtenida mediante las repetidas etapas de sondaje) y la información morfológica (obtenida mediante las tinciones morfológicas).

Contacto de la muestra con una o más sondas control

En algunas realizaciones, una sonda control se puede unir a una o más dianas en la muestra biológica. En algunas realizaciones, una sonda control se puede unir a las dianas junto con la etapa de contacto con la primera sonda. En algunas realizaciones se puede aplicar una sonda control a la muestra biológica de forma simultánea con la primera sonda. En algunas realizaciones se puede aplicar una sonda control a la muestra biológica secuencialmente, es decir antes o después de la aplicación de la primera sonda pero antes de la aplicación del agente oxidante.

Una sonda control puede incluir un generador de señal que es estable frente a un agente oxidante o las propiedades de generación de señal del generador de señal no se ven sustancialmente afectadas cuando se ponen en contacto con el agente oxidante. Un generador de señal puede incluir un radioisótopo que es estable frente al agente oxidante o un fluoróforo que es estable frente al agente oxidante. Un radioisótopo adecuado puede incluir P32 o H3, 14C, 125I o 131I. Un fluoróforo adecuado puede incluir DAPI.

En algunas realizaciones un generador de señal adecuado se puede acoplar a un aglutinante para formar una sonda control. Por ejemplo, un marcador radioactivo puede acoplarse a un anticuerpo para formar una sonda control y el anticuerpo puede unirse a uno o más antígenos diana presentes en la muestra biológica. En otras realizaciones, un generador de señal adecuado puede ser capaz de unirse a una o más dianas en la muestra y, también, proporcionar una señal detectable que es estable en presencia del agente oxidante. Por ejemplo, una sonda control adecuada puede ser DAPI, que es capaz de unirse a ácidos nucleicos en la muestra y también es capaz de proporcionar una señal fluorescente que es estable frente al agente oxidante.

En algunas realizaciones, en los procedimientos divulgados en el presente documento se puede usar una sonda control para proporcionar una indicación de la estabilidad de las dianas frente a las repetidas etapas de tinción. Por ejemplo, una sonda control se puede unir a una diana conocida en la muestra y se puede observar y cuantificar una señal del control. A continuación la señal del control se puede monitorizar durante las repetidas etapas de tinción para proporcionar una indicación de la estabilidad de las dianas o aglutinantes frente a los agentes oxidantes. En algunas realizaciones, una medida cuantitativa (p. ej., intensidad de señal) de la señal control puede controlarse para cuantificar la cantidad de dianas presentes en la muestra tras las repetidas etapas de sondaje,

En algunas realizaciones, se puede usar una sonda control para obtener información cuantitativa de la muestra de interés, por ejemplo la concentración de las dianas en la muestra o el peso molecular de las dianas en la muestra.

Por ejemplo, se puede cargar una sonda control (que tenga una concentración conocida o un peso molecular conocido) junto con la muestra de interés en una técnica de transferencia. Una sonda control se puede unir a la diana control y se puede observar una señal control. A continuación, la señal control se puede correlacionar con la señal observada procedente de la muestra de interés usando los procedimientos descritos más adelante en el presente documento.

En algunas realizaciones, se puede usar una sonda control en los procedimientos descritos en el presente documento para proporcionar el registro conjunto de múltiple información molecular (obtenida mediante las repetidas etapas de sondaje) y la información morfológica (obtenida, p. ej., usando DAPI). En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden incluir el registro conjunto de múltiples imágenes fluorescentes con las imágenes morfológicas de campo brillante obtenidas usando, por ejemplo, H y E. En algunas realizaciones, las sondas usadas en las repetidas etapas de sondaje pueden no tener ninguna información compartimental común que se pueda usar para registrar con las imágenes de H y E. Una sonda control, como una tinción nuclear DAPI, se puede usar para el registro conjunto del núcleo teñido con hematoxilina en las imágenes de campo brillante con las imágenes fluorescentes. Las imágenes fluorescentes y las imágenes de campo brillante se pueden registrar de forma conjunta usando algoritmos de registro de imágenes que se pueden agrupar en dos categorías: técnicas basadas en intensidad y técnicas basadas en características.

Correlación de la primera señal y las señales posteriores

En algunas realizaciones se puede analizar una primera señal, una señal posterior o la primera señal y las señales posteriores se pueden analizar para obtener información con respecto a la muestra biológica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presencia o ausencia de una primera señal puede indicar la presencia o ausencia de la primera diana (capaz de unirse al primer aglutinante) en la muestra biológica. De forma similar, la presencia o ausencia de una segunda señal puede indicar la presencia o ausencia de la segunda diana (capaz de unirse al segundo aglutinante en la muestra biológica). En las realizaciones en las que se pueden analizar múltiples dianas usando una pluralidad de sondas, la presencia o ausencia de una señal concreta puede indicar la presencia o ausencia de la diana correspondiente en la muestra biológica.

En algunas realizaciones, las etapas de observación pueden incluir una medición cuantitativa de al menos una diana en la muestra. En algunas realizaciones se puede medir un valor de intensidad de una señal (p. ej., intensidad de fluorescencia) y puede correlacionarse con la cantidad de diana en la muestra biológica. Una correlación entre la cantidad de diana y la intensidad de señal puede determinarse usando patrones de calibrado. En alguna realización, los valores de intensidad de la primera y la segunda señal se pueden medir y correlacionar con las respectivas cantidades de las dianas. En algunas realizaciones, comparando las dos intensidades de señal se pueden determinar las cantidades relativas de la primera diana y de la segunda diana (entre sí o con respecto a un control). De forma similar, cuando se pueden analizar múltiples dianas usando múltiples sondas, se pueden determinar las cantidades relativas de las diferentes dianas en la muestra biológica a través de la medición de diferentes intensidades de señal. En algunas realizaciones se pueden usar una o más muestras control tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Observando una presencia o ausencia de una señal en las muestras (muestra biológica de interés frente a un control) se puede obtener información sobre la muestra biológica. Por ejemplo, comparando una muestra de tejido enfermo frente a una muestra de tejido normal se puede obtener información sobre las dianas presentes en la una muestra de tejido enfermo. De forma similar, comparando las intensidades de señal entre las muestras (es decir, la muestra biológica de interés y uno o más controles) se puede obtener información sobre la expresión de dianas en la muestra.

En algunas realizaciones, las etapas de observación incluyen la co-localización de al menos dos señales en la muestra.

En algunas realizaciones, se puede observar una localización de la señal en la señal biológica usando tinciones morfológicas. En algunas realizaciones, se pueden observar localizaciones relativas de dos o más señales. Una localización de la señal se puede correlacionar con una localización de la diana en la muestra biológica, lo que proporciona información sobre la localización de diferentes dianas en la muestra biológica. En algunas realizaciones se puede correlacionar un valor de intensidad de la señal y una localización de la señal para obtener información sobre la localización de diferentes dianas en la muestra biológica. Por ejemplo, puede que ciertas dianas se expresen más en el citoplasma que en el núcleo y al contrario. En algunas realizaciones se puede obtener información sobre la localización relativa de las dianas comparando los valores de localización y de intensidad de dos o más señales.

En algunas realizaciones que usan técnicas de transferencia, las etapas de observación pueden incluir observar una localización de la señal en la transferencia. La localización de la señal en la transferencia puede correlacionarse después con patrones de calibrado cargados junto con la muestra en el gel, para obtener información sobre el peso molecular de las dianas en las diferentes bandas. En algunas realizaciones, una localización de la señal en la transferencia se puede correlacionar con un peso molecular de la diana y el punto

isoeléctrico de la diana, por ejemplo en 2D-PAGE. En algunas realizaciones se pueden sondar proteínas estructurales, tales como actina o tubulina, usando sondas control en transferencias de tipo western, para cuantificar la cantidad de dianas en la muestra.

En algunas realizaciones, una o más de las etapas de observación o correlación se pueden realizar usando medios informáticos. En las realizaciones en las que la(s) señal(es) procedentes del generador de señal se pueden almacenar en forma de imagen(es) digitales se puede llevar a cabo análisis informático de las imagen(es). En algunas realizaciones, las imágenes (p. ej., señales procedentes de la(s) sonda(s) y las tinciones morfológicas) se pueden solapar usando superposición informática para obtener información completa de la muestra biológica, por ejemplo información topológica y de correlación.

En algunas realizaciones, una o más de los anteriores se pueden automatizar y realizar usando sistemas automáticos. En algunas realizaciones, todas las etapas pueden realizarse a usando sistemas automáticos.

Los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden aplicar en aplicaciones analíticas, diagnósticas y terapéuticas en biología y en medicina. En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden ser particularmente aplicables en histoquímica, particularmente inmunohistoquímica. El análisis de las muestras celulares o de tejido de un paciente de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento se puede emplear en diagnóstico (p. ej., para identificar pacientes que tengan una enfermedad concreta, hayan estado expuestos a una toxina concreta o estén respondiendo bien a una terapéutica concreta o a un transplante de órgano) y en términos pronósticos (p. ej., para identificar pacientes con probabilidad de desarrollar una enfermedad concreta, de responder bien a una terapéutica concreta o de aceptar un transplante de órgano concreto). Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden facilitar un análisis preciso y fiable de una pluralidad (p. ej., un número infinito) de dianas (p. ej., marcadores de enfermedad) de la misma muestra biológica.

Ejemplo 1 Oxidación selectiva de pigmentos de cianina usando peróxido de hidrógeno sin afectar a la DAPI

Mezclando 1 volumen de bicarbonato sódico 1M, 3 volúmenes de agua y 1 volumen del 30 por ciento (v/v) de peróxido de hidrógeno se preparó una solución de peróxido de hidrógeno (H2O2) en un tampón de bicarbonato sódico. El pH del bicarbonato sódico se ajustó a un pH de 10 usando hidróxido sódico antes de mezclar con peróxido de hidrógeno.

Se prepararon tres soluciones distintas de pigmentos de cianina: Cy3, Cy5 y Cy7 en agua a una concentración de aproximadamente 2μM. Un alícuota de una solución de pigmento de cianina se mezcló con un alícuota de la solución de H2O2 para preparar una solución de muestra con una concentración final de aproximadamente 3 por ciento en volumen de H2O2 y pigmento de cianina uno micromolar 10M (Muestras 1 ((Cy3), 2 (Cy5) y 3 (Cy7)). Como control se usó una solución de pigmento de cianina 10M en agua (sin H2O2).

La reacción de oxidación del pigmento de cianina se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia del pigmento en un espectrofotómetro de luz ultravioleta/visible (UV/vis) como una función del tiempo. La FIG.1 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 1 como función de la longitud de onda, tras una duración de 10 minutos y 15 minutos. El valor de la absorbancia disminuyó considerablemente cuando se comparó con el control. La FIG.2 muestra los valores de las Muestras 1, 2 y 3 como función de la longitud de onda. La absorbancia de las Muestras 1, 2 y 3 se redujo a cero tras una duración de tiempo exhibiendo destrucción química del pigmento por H2O2. La duración del tiempo para las Muestras 1, 2 y 3 fue diferente para cada pigmento distinto: 19 minutos para la Muestra 1,15, minutos para la Muestra 2 y 3 minutos para la Muestra 3.

Una solución de 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se preparó en agua a una concentración de aproximadamente 57 μM. Un alícuota de solución DAPI se mezcló con un alícuota de la solución de H2O2 para preparar una solución con una concentración final de aproximadamente 3 por ciento en volumen de H2O2 y 10 μg/ml de DAPI (Muestra 4). Como control se usó una solución de DAPI 10 μg/ml en agua (sin H2O2).

La reacción de oxidación del DAPI se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de la Muestra 4 como una función del tiempo. La FIG. 3 muestra espectro de absorbancia de la Muestra 4 como una función de la longitud de onda tras una duración de 30 minutos y de 140 minutos. El valor de la absorbancia de la Muestra 4 no varió mucho, incluso después de un periodo de 140 minutos y estaba en el mismo intervalo que el control, sin exhibir ningún efecto significativo del H2O2 sobre el DAPI.

Ejemplo 2 Oxidación selectiva de pigmentos de cianina usando peryodato sódico sin afectar al DAPI

Se preparó una solución de peryodato (NaIO4) mezclando una solución 0,2M de NaIO4 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 X. Se prepararon tres soluciones distintas de pigmentos de cianina (Cy3, Cy5 y Cy7) en agua a una concentración de aproximadamente 2 μM. Un alícuota de una solución de pigmento de cianina se mezcló con un alícuota de la solución de NaIO4 para preparar una solución con una concentración final de

aproximadamente 1μM de NaIO4 y de pigmento de cianina 1 μM (Muestras 5 (Cy3), 6 (Cy5) y 7 (Cy7)). Como control se usó una solución de pigmento de cianina 1 μM en agua (sin NaIO4).

La reacción de oxidación del pigmento de cianina se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia del pigmento en un espectrofotómetro de luz ultravioleta/visible (UV/vis) como una función del tiempo. La FIG. 4 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 5 como una función de la longitud de onda tras una duración de 20 minutos, 60 minutos y 210 minutos. El valor de absorbancia disminuyó como una función del tiempo en comparación con el control. Se observó pérdida de la absorbancia completa tras 210 minutos para la Muestra 5. La FIG.5 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 6 como función de la longitud de onda, tras una duración de 12 minutos y 16 minutos. El valor de absorbancia disminuyó como una función del tiempo en comparación con el control. Se observó pérdida de la absorbancia completa rápidamente tras 16 minutos.

Una solución de 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se prepare en agua a una concentración de aproximadamente 57 μM. Un alícuota de solución DAPI se mezcló con un alícuota de la solución de NaIO4 para preparar una solución con una concentración final de aproximadamente 0,1 M de NaIO4 y 10 μg/ml de DAPI (Muestra 8). Como control se usó una solución de DAPI 10 μg/ml en agua (sin NalO4).

La reacción de oxidación del DAPI se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de la Muestra 8 como una función del tiempo. La FIG. 6 muestra espectro de absorbancia de la Muestra 8 como una función de la longitud de onda tras una duración de 22 minutos, 70 minutos y 210 minutos. El valor de la absorbancia de la Muestra 8 no varió mucho, incluso después de un periodo de 210 minutos y una cantidad significativa de DAPI permaneció intacta cuando se comparó con el control.

Ejemplo 3 Destrucción selectiva de pigmentos de cianina usando base de hidróxido sódico sin afectar al DAPI

Se preparó una solución de NaOH a una concentración de 0,1M y 1M. Se prepararon tres soluciones distintas de pigmentos de cianina, Cy3, Cy5 y Cy7 en agua a una concentración de 2 μM. Un alícuota de una solución de pigmento de cianina se mezcló con un alícuota de la solución de NaOH de dos concentraciones diferentes de NaOH: NaOH 0,1M (MUESTRAS 9a, 10a y 11a) y NaOH 1M (Muestras 9b, 10b y 11b). Como control se usó una solución de pigmento de cianina 1 μM en agua (sin NaOH).

La destrucción básica del pigmento se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de las muestras como una función del tiempo. La FIG. 7 muestra espectro de absorbancia de las Muestras 4 9a, 10a y 11a como una función de la longitud de onda tras una duración inferior a 5 minutos. El valor de la absorbancia de la Muestra 9A no varió mucho y una cantidad significativa de Cy3 permaneció intacta cuando se comparó con el control. La muestra 10a mostró una descomposición del 20 por ciento del pigmento Cy5, mientras que la Muestra 11A mostró una descomposición del 70 por ciento del pigmento Cy7 usando NaOH 0,1M. La FIG. 8 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 9B y 10B como una función de la longitud de onda tras una duración inferior a 5 minutos. La muestra 9B mostró una descomposición del 50 por ciento del pigmento Cy3, mientras que la muestra 10B mostró una descomposición del 80 por ciento del pigmento Cy5 usando NaOH 1M.

Una solución de 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se preparó en agua a una concentración de aproximadamente 57 μM. Un alícuota de solución DAPI se mezcló con un alícuota de la solución de NaOH de dos concentraciones diferentes de NaOH 0,1M (Muestras 12A) y NaOH 1M (Muestras 12B). Como control se usó una solución de DAPI 10 μg/ml en agua (sin NaOH). La destrucción básica del DAPI se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de las Muestras 12A y 12B como una función del tiempo. La FIG. 9 muestra espectro de absorbancia de las Muestras 12A y 12B como una función de la longitud de onda. El valor de la absorbancia de las muestras no varió mucho y una cantidad significativa de DAPI permaneció intacta cuando se comparó con el control.

Ejemplo 4 Destrucción selectiva de los pigmentos Cy5 y Cy7 sin afectar a Cy3

Se preparó una solución del 5 por ciento (peso/volumen) de un nucleófilo mezclando clorhidrato de tris[2carboxietil]-fosfina (TCEP.HCl) en tampón de bicarbonato sódico 1M (pH final 7,7). Se prepararon tres soluciones distintas de pigmentos de cianina, Cy3, Cy5 y Cy7, en agua a una concentración de aproximadamente 2 μM. Un alícuota de una solución de pigmento de cianina se mezcló con un alícuota de la solución de TCEP.HCl para preparar las Muestras 13 (Cy3), 14 (Cy5) y 15 (Cy7). Como control se usó una solución de pigmento de cianina 1 μM en agua (sin TCEP.HCl).

La destrucción del pigmento se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de las muestras como una función del tiempo. La FIG. 10 muestra espectro de absorbancia de las Muestras 13, 14 y 15 como una función de la longitud de onda. El valor de la absorbancia de la Muestra 13 no varió mucho y una cantidad significativa de Cy3 permaneció intacta cuando se comparó con el control tras una duración de 60 minutos. Las muestras 14 y 15 mostraron una descomposición significativa de los pigmentos Cy5 y Cy7 tras una duración de 0,5 minutos.

Ejemplo 5 Destrucción selectiva del pigmento Cy7 sin afectar a Cy3

Se preparó una solución de peróxido de hidrógeno (H2O2) en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) mezclando una solución del 6 % (v/v) de H2O2 en 0,8 X de BS (pH final de 6,6). Se prepararon dos soluciones distintas de pigmentos de cianina, Cy3 y Cy7 en agua a una concentración de aproximadamente 2 μM. Un alícuota de una solución de pigmento de cianina se mezcló con un alícuota de la solución de H2O2 para preparar las Muestras 16 (Cy3) y 17 (Cy7). Como control se usó una solución de pigmento de cianina 1 μM en agua (sin H2O2).

La destrucción del pigmento se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de las muestras como una función del tiempo. La FIG. 11 muestra espectro de absorbancia de las Muestras 16 y 17 como una función de la longitud de onda. El valor de la absorbancia de la Muestra 16 no varió mucho y una cantidad significativa de Cy3 permaneció intacta cuando se comparó con el control tras una duración de 60 minutos. La muestra 17 mostró una descomposición significativa del pigmento Cy7 tras una duración de 60 minutos.

Los ejemplos 6-21 siguientes ilustran realizaciones de la invención de acuerdo con qué imagen múltiple de las muestras de tejido se lleva a cabo. La tinción múltiple se obtiene mediante tinción, obtención de imágenes, destrucción química del fluoróforo, retención, obtención de imágenes y repetición de las etapas.

Ejemplo 6 Preparación de muestras de tejido para tinción

Se obtuvieron muestras de tejido humano adulto como portaobjetos de tejido incluido en parafina. Las muestras de tejido incluyeron portaobjetos de colon (Biochain, T2234090), tejido de mama normal (Biochain, T2234086), cáncer de próstata (Biochain, T2235201-1), adenocarcinoma de colon (Biochain, T2235090-1), micromatriz del tejido de mama (Imgenex, IMH 367, p61), TMA de mama (Imgenex IMH 367, p32) y próstata normal (Biochain, T2234201). Los portaobjetos incluidos en parafina de tejido humano adulto se sometieron a un protocolo de inmunohistoquímica para prepararlos para la tinción. El protocolo incluyó desparafinización, rehidratación, incubación y lavado. La desparafinización se llevó a cabo lavando los portaobjetos con Histochoice (o tolueno) durante un periodo de 10 minutos con agitación frecuente. Tras la desparafinización, la muestra de tejido se rehidrató lavando el portaobjetos con solución de etanol. El lavado se realizó con tres soluciones diferentes de etanol con concentraciones decrecientes. Las concentraciones de etanol usadas fueron 90 % en volumen, 70 % en volumen y 50 % en volumen. El portaobjetos se lavó después con una solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4). La permeabilización de la membrana del tejido se llevó a cabo lavando el portaobjetos con una solución de 0,1 por ciento en peso de Triton TX-100. Se usó tampón citrato a pH 6,0 (solución Vector Unmasking) para la recuperación del antígeno. Los portaobjetos se expusieron al tampón en una olla a presión durante un periodo de 15 minutos, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, el portaobjetos se bloqueó contra la unión inespecífica lavando con PBS y 900 μl de 3 por ciento en volumen de seroalbúmina bovina (BSA) durante 45 minutos a 37 ºC. Para la tinción con anticuerpos secundarios (opcional), el portaobjetos también se bloqueó con 100 μl de suero de especies de huéspedes con anticuerpos secundarios.

Ejemplo 7 Conjugación de los anticuerpos con un pigmento

Los anticuerpos conjugados con pigmento se prepararon de acuerdo con el procedimiento siguiente. Los anticuerpos usados para conjugación y tinción incluyeron antígeno nuclear celular antiproliferación, clon pc10 (Sigma Aldrich, P8825); anti-actina alfa del músculo liso (SmA), clon 1A4 (Sigma, A2547); anti-beta catenina de conejo (Sigma, C 2206); anti-pancitoqueratina de ratón, clon PCK-26 (Sigma, C1801); anti-receptor alfa de estrógenos de ratón, clon 1D5 (DAKO, M 7047); anticuerpo de beta catenina, clon 15B8 (Sigma, C 7738); antivimentina de cabra (Sigma, V4630); clon AR441 del receptor de andrógenos del ciclo (DAKO, M3562); factor 7 de Von Willebrand, queratina 5, queratina 8/18, e-cadherina, Her2/neu, receptor de estrógenos, p53, receptor de progesterona, beta catenina; anti-ratón de burro (Jackson Immunoresearch, 715-166-150); o anti-conejo de burro (Jackson Immunoresearch, 711-166-152).

Una columna de espín micron YM-10 se humidificó con 250 ml de PBS y la columna se centrifugó durante 15 minutos. Se pipetearon 500 ml del anticuerpo (200 μg/ml) en la columna húmeda. La columna se centrifugó durante 30 minutos a 11.000 rpm a 4 ºC. Después, el anticuerpo/proteína concentrado se transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó durante 30 segundos para eliminar la proteína concentrada. Después, una solución tampón de acoplamiento se mezcló con la solución de anticuerpo concentrado. La solución tampón de acoplamiento incluyó carbonato sódico 1M (pH entre 8-9) y se usaron 5 μl del tampón por 100 μl de la solución de anticuerpo. El anticuerpo y la solución tampón se añadieron a 0,01-0,1 miligramos del pigmento de cianina. El pigmento se reconstituyó en DMSO hasta una concentración de 10-20 mg/ml antes de la incubación con el anticuerpo. La solución resultante se mezcló exhaustivamente pipeteando y todas las burbujas formadas se eliminaron mediante agotación del tubo. La solución se cubrió con papel de aluminio y se incubó a temperatura ambiente durante un periodo de aproximadamente 30-45 minutos. Tras la incubación, la solución se añadió a una columna YM-10 spin y se centrifugó durante 30 minutos a 4 ºC a 11.000 rpm. La solución se lavó con PBS y se centrifugó para eliminar todo el pigmento o el anticuerpo no conjugados. La solución de anticuerpo conjugado con pigmento se diluyó

después con 50 por ciento de glicerol y se almacenó en un congelador a -20ºC.

Ejemplo 8 Tinción y obtención de imágenes de tejido con pigmentos

Un portaobjetos preparado en el ejemplo 6 se incubó con un anticuerpo conjugado con pigmento preparado en el Ejemplo 7. La incubación se realizó en 3 por ciento de BSA durante 45 minutos a 37 ºC. Tras la incubación, el portaobjetos se sometió a una amplia serie de lavados con PBS. Cuando se usaron anticuerpos secundarios, el portaobjetos se incubó con un anticuerpo secundario en BSA durante 45 minutos a 37 ºC. Tras la incubación, el portaobjetos se sometió a una amplia serie de lavados con PBS. Un portaobjetos teñido con anticuerpo primario o anticuerpo secundario se sometió a contratinción con la tinción morfológica, DAPI y se cubrió con un cubreobjetos.

Se tomaron imágenes del portaobjetos cubierto usando una cámara. La cámara usada fue una cámara monocromática Leica DFC 350FX de alta resolución montada en un microscopio de fluorescencia Leica DMRA2. El aumento usado fue 20x a menos que se indique lo contrario. Después de la adquisición de imágenes, se retiró el cubreobjetos y el portaobjetos se lavó con PBS para preparar la destrucción de la señal.

Ejemplo 9 Destrucción de pigmento, tinción y obtención de imágenes

Para la destrucción de la señal se usaron una solución de NaOH y una solución de H2O2. Se preparó una solución de NaOH usando 500 μl de 50 por ciento en volumen de NaOH y 49,5 ml de PBS. El pH final de la solución de NaOH fue de aproximadamente 11,9-12,5. Se preparó una solución de H2O2 mezclando 10 ml de carbonato sódico 0,5M (pH 10), 5 ml de 30 por ciento en volumen de H2O2 y 35 ml de agua. Se introdujo un portaobjetos en la solución de NaOH o de H2O2 durante 15 minutos con agitación suave. Tras 15 minutos, el portaobjetos se lavó de nuevo con PBS, se cubrió con cubreobjetos y se obtuvieron imágenes de nuevo (opcional) para comprobar la eficacia de la destrucción del pigmento o se volvió a teñir y a obtener imágenes. Las etapas de repetición de la tinción o de repetición de la obtención de imágenes se llevaron a cabo usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 8. Tras la obtención de imágenes, un portaobjetos se sometió a ciclos de destrucción de señal, tinción y obtención de imágenes, y el procedimiento se repitió un número múltiple de veces. Se obtuvieron imágenes de las muestras de tejido usando 1-9 anticuerpos diferentes. Después de obtener imágenes con la serie de cianina, el portaobjetos se tiñó opcionalmente y se obtuvieron imágenes con tinciones morfológicas de H y E.

Ejemplo 10 Tinción de un solo canal y obtención de imágenes de un tejido de colon normal seguido de la destrucción de la señal usando NaOH

Un portaobjetos con colon normal se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon pc10 de antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) y se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 18A. Se obtuvieron imágenes de la muestra 18A y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 18B, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y 9. La FG. 12 muestra microfotografías (con un aumento de 10X) de la Muestra 18A (antes de la destrucción del pigmento) y la Muestra 18B (tras la destrucción del pigmento). Después del tratamiento con NaOH quedó poco o ninguna señal del Cy3.

Ejemplo 11 Tinción de un solo canal y obtención de imágenes de un tejido de colon normal seguido de la destrucción de la señal usando NaOH

Un portaobjetos con colon normal se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon 1A4 de alfa-actina de músculo liso de ratón (SmA) y se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 19A. Se obtuvieron imágenes de la muestra 19A y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 19B, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y

9. La FG. 13 muestra microfotografías (con un aumento de 10X) de la Muestra 19A (antes de la destrucción del pigmento) y la Muestra 19b (tras la destrucción del pigmento). Después del tratamiento con NaOH quedó una pequeña cantidad de señal del Cy3.

Ejemplo 12 Tinción de dos canales y obtención de imágenes de un tejido de mama normal usando NaOH

Un tejido de mama normal se tiñó con un anticuerpo primario SmA, se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 y se realizó contratinción con DAPI para formar la Muestra 20A. Se obtuvieron imágenes de la muestra 20a y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 20B, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y 9. La Muestra 20B se volvió a teñir con un anticuerpo primario frente a beta-catenina de conejo y se detectó con anti-conejo conjugado con Cy3 de la Muestra

20C. Se obtuvieron imágenes de la muestra 20C y, después, se realizó contratinción con H y E para formar la Muestra 20D, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo.

La FIG. 14 muestra las micrografías de la muestra 20A (antes de la destrucción del pigmento) y la Muestra 20B (tras la destrucción del pigmento). Después del tratamiento con NaOH quedó poca o ninguna señal del Cy3 y sólo se observó DAPI. La micrografía de la Muestra 20c mostró que era posible la obtención de imágenes el mismo canal de Cy3 mediante tinción con un anticuerpo distinto. La información morfológica sobre el tejido se obtuvo mediante tinción adicional con H y E (Muestra 20D).

Ejemplo 13 Tinción de dos canales y obtención de imágenes de un tejido de cáncer de próstata usando NaOH

Un tejido de cáncer de próstata se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon PCK-26 de anti-pancitoqueratina de ratón y se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 21A. Se obtuvieron imágenes de la muestra 21A y, después, se realizó contratinción con DAPI para formar la Muestra 21B. Se obtuvieron imágenes de la muestra 21B y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 21C, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y

9. La Muestra 21C se volvió a teñir con un anticuerpo primario SmA y se detectó con anti-conejo conjugado con Cy3 para formar la Muestra 21D y se obtuvieron imágenes de nuevo.

La FIG. 15 muestra las micrografías de la muestra 21A (canal de Cye) y la Muestra 21B (canal DAPI) antes de la destrucción del pigmento y la Muestra 21C (canal de Cye) tras la destrucción del pigmento. Después del tratamiento con NaOH quedó poca o ninguna señal del Cy3 (21C) y sólo se observó DAPI (no mostrado). La micrografía de la Muestra 21D mostró que era posible la obtención de imágenes en el mismo canal Cy3 mediante tinción con un anticuerpo diferente.

Ejemplo 14 Tinción de dos canales y obtención de imágenes de un adenocarcinoma de colon usando NaOH

Un portaobjetos con adenocarcinoma de colon se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon PCK26 de antipancitoqueratina de ratón y se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 22A. Se obtuvieron imágenes de la muestra 22A y, después, se realizó contratinción con DAPI para formar la Muestra 22B. Se obtuvieron imágenes de la muestra 22B y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 22C, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y 9. La Muestra 22C se volvió a teñir con un anticuerpo primario SmA y se detectó con anti-conejo conjugado con Cy3 para formar la Muestra 22d y se obtuvieron imágenes de nuevo.

La FIG. 16 muestra las micrografías de las muestras 22A (Canal Cye) y 22B (canal de DAPI) antes de la destrucción del pigmento y la Muestra 22c tras la destrucción del pigmento. Después del tratamiento con NaOH quedó poca o ninguna señal del Cy3 (22D) y sólo se observó DAPI (no mostrado). La micrografía de la Muestra 22D mostró que era posible la obtención de imágenes en el mismo canal Cy3 mediante tinción con un anticuerpo diferente. La información nuclear sobre el tejido se obtuvo mediante tinción con DAPI (Muestra 22B).

Ejemplo 15 Tinción de dos canales y obtención de imágenes de una micromatriz de tejido de mama con medición basal usando NaOH

Se obtuvieron imágenes de micromatriz de tejido de mama (Muestra 23A) en el canal de DAPI y Cy3 para medir la autofluorescencia del tejido. Después, la muestra 23A se tiñó con DAPI para formar la Muestra 23B, se obtuvieron imágenes y después se trató con NaOH para formar la Muestra 23C, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. La Muestra 23A también se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon 1D5 del receptor alfa de estrógenos y se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 23D. Se obtuvieron imágenes de la muestra 23D y después se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 23E, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los Ejemplos 8 y 9.

La FIG. 17 muestra microfotografías de las Muestras 23A-E. Las microfotografías de las Muestras 23C y 23E se compararon con la autofluorescencia (basal) observada en la Muestra 23A. Ambas muestras mostraron reducción de señal. La muestra teñida con DAPI mostró reducción de señal posiblemente a causa de la destrucción de los ácidos nucleicos a los que se une el DAPI.

Ejemplo 16 Tinción de tres canales y obtención de imágenes de TMA de mama usando NaOH

Una muestra de mama se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon PCK-26 de anti-pancitoqueratina de ratón, se detectó y visualizó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 24A y se realizó

contratinción con DAPI (no mostrado) y se obtuvieron imágenes. La muestra 24A se trató después con una solución de NaOH para eliminar la señal de Cy3 (no mostrado) conservando la señal DAPI para formar la Muestra 24B y se obtuvieron imágenes como se muestra en la FIG. 18 en la muestra 24B. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción del pigmento se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los Ejemplos 8 y 9. La muestra 24B se volvió a teñir con anticuerpo anti-beta catenina conjugado directamente con Cy3 para formar la muestra 24C y se obtuvieron imágenes de nuevo. La muestra se trató de nuevo con NaOH y se marcó con anticuerpo SmA conjugado directamente con Cy3 para formar la Muestra 24D y se obtuvieron imágenes de nuevo. Las imágenes obtenidas se registraron, seudocolorearon y superpusieron (Muestra 24E) para dar información espacial para expresar el antígeno. La muestra 24D se tiñó adicionalmente con H y E para formar la Muestra 24F.

La FIG. 18 muestra las micrografías de la muestra 24A (canal e Cy3 antes de la destrucción del pigmento) y la Muestra 24B (canal de DAPI tras la destrucción del pigmento). Después del tratamiento con NaOH quedó poca o ninguna señal del Cy3 y sólo se observó DAPI. Las micrografías de la Muestra 24C y 24D mostraron que era posible la obtención de imágenes en el mismo canal de Cy3 mediante tinción con anticuerpos diferentes. La información morfológica sobre el tejido se obtuvo mediante tinción con H y E (Muestra 24F).

Ejemplo 17 Tinción de doce canales y obtención de imágenes de próstata normal usando NaOH

Se obtuvieron imágenes antes de la tinción hasta el nivel basal de la autofluorescencia procedente de cada canal. Un portaobjetos de próstata normal se tiñó con un cóctel de dos anticuerpos primarios: anti-vimentina de cabra y anti-pancitoqueratina de ratón. Los dos anticuerpos primarios se detectaron con un segundo cóctel de anticuerpos secundarios: anti-cabra de burro conjugado con Cy3 y anti-ratón de burro conjugado con Cy5, para formar la Muestra 25A Cy3 y Cy5, respectivamente. Se obtuvieron imágenes de la muestra 25A y después, se trató con una solución de NaOH. Después, el tejido se tiñó secuencialmente con uno de dos anticuerpos primarios: anti-alfacatenina de conejo, que se detectó después con un anticuerpo secundario conjugado con cy3 y, después, con antireceptor de andrógenos conjugado con Cy5, para formar las Muestras 25B (25b-Cy3 y 25b-Cy5, respectivamente). Tras la obtención de imágenes, la muestra se trató con una solución de NaOH, seguido de las etapas de tinciónobtención de imágenes-tratamiento con NaOH-tinción usando siete anticuerpos conjugados directamente con Cy (Muestras 25C-251). Los anticuerpos usados fueron: alfa-actina de músculo liso, beta-catenina, pan-cadherina, factor VII de Von Willebrand, queratina 5, queratina 8/18 y e-cadherina. Cada etapa de tinción incluyó contratinción con DAPI (Muestra 25J).

La FIG. 19 muestra micrografías de las muestras 25A y 25A (canales Cy3 y Cy5), la Muestra 25B (canales Cy3 y Cy5) y las Muestras 25C-25J. La FIG. 19 muestra que era posible la obtención de múltiples imágenes en el mismo canal de Cy3 mediante tinción con anticuerpos diferentes. La obtención de múltiples imágenes en 12 canales fue posible siendo 9 de los canales canales de Cy3.

Ejemplo 18 Tinción en cuatro canales y obtención de imágenes de próstata normal usando H2O2

Se obtuvieron imágenes antes de la tinción hasta el nivel basal de la autofluorescencia procedente de cada canal. Un portaobjetos de próstata normal se tiñó con un anticuerpo anti-pancadherina conjugada directamente con cy3 para formar la Muestra 26A. Se obtuvieron imágenes del portaobjetos y se trató con H2O2 (Muestra 26B), se volvió a teñir con anti-vimentina conjugado con Cy3 (Muestra 26c), se trató con H2O2 (Muestra 26D), se volvió a teñir con anti-pancitoqueratina conjugado con Cy3 (Muestra 26E), se trató con H2O2 (Muestra 26F), se volvió a teñir con anti-SmA conjugado con Cy3 (Muestra 26g) y se trató con H2O2 (Muestra 26H).

La FIG. 20 muestra micrografías de las Muestras 26A-G. La FIG. 20 muestra que era posible la obtención de múltiples imágenes en el mismo canal de Cy3 mediante tinción con anticuerpos diferentes y destrucción de la señal usando H2O2.

Ejemplo 19 Tinción residual tras tinción para abundantes proteínas usando NaOH

Se obtuvieron imágenes de una próstata normal (Muestra 27A) en el canal de Cy3 para medir la autofluorescencia del tejido. Después, la muestra 27A se tiñó con anti-SmA conjugado con Cy3 para formar la Muestra 27B, se obtuvieron imágenes y después se trató con NaOH para formar la Muestra 27C, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y 9. La FG. 21 muestra las microfotografías de las Muestras 27A-C. La tinción residual se observó después del tratamiento con NaOH mostrado en la Muestra 27C.

Los valores de tinción residual también se monitorizaron durante la obtención de múltiples imágenes en doce canales descrita en el Ejemplo 17. Usando tinción de Gimp 2.2 se recogieron las intensidades medias de píxel para cada imagen basal y tratada con NaOH y se tabularon. La FIG. 22 muestra un gráfico de la intensidad media del píxel de la basal para cada ciclo en la obtención de imágenes, así como una imagen pequeña de cómo aparecía el

basal antes de la tinción. Se observó un pico grande en la intensidad de la tinción residual en el ciclo 4 como SmA, una proteína de expresión abundante se tiñó en el ciclo 3.

Ejemplo 20 Tinción residual tras tinción para abundantes proteínas usando tratamiento con NaOH y con H2O2

Dos portaobjetos de próstata se tiñeron con SmA conjugado directamente con Cy3 (Muestras 28A y 28B en los paneles de la izquierda). En ambos portaobjetos se usaron etapas de pretratamiento, concentraciones y recuperación de antígeno idénticas y la única diferencia fue el procedimiento de destrucción de señal: siendo el procedimiento uno con NaOH (Muestra 28C) y el otro con H2O2 (Muestra 28D). Otros dos portaobjetos de próstata se tiñeron con pancadherina conjugada directamente con Cy3 (Muestras 29A y 29B en los paneles de la derecha). En ambos portaobjetos se usaron etapas de pretratamiento, concentraciones y recuperación de antígeno idénticas y la única diferencia fue el procedimiento de destrucción de señal; siendo el procedimiento uno con NaOH (Muestra 29C) y el otro con H2O2 (Muestra 29D).

La FIG. 23 muestra microfotografías de comparación directa de tinción con SmA y pancadherina y eliminación de la señal. El H2O2 mostró una eliminación de pigmento más eficaz para SmA y para pancadherina cuando se comparó con NaOH.

Ejemplo 21 Tinción residual tras tinción de múltiples ciclos para abundantes proteínas usando tratamiento con NaOH y con H2O2

Dos portaobjetos de próstata se tiñeron con pancadherina conjugada directamente con Cy3 (Muestras 30A y 30B). En ambos portaobjetos se usaron etapas de pretratamiento idénticas, incluida la recuperación de antígeno, y la única diferencia fue el procedimiento de destrucción de señal; siendo el procedimiento uno con NaOH y el otro con H2O2. Los portaobjetos fueron sometidos a ciclos de tinción simulada y destrucción de señal antes de teñir con pancitoqueratina conjugada con Cy3 para producir la Muestra 30C y la Muestra 30D en la FIG. 24.

La FIG. 24 compara la tinción del primer ciclo con pancadherina con la del 9º ciclo de pancitoqueratina usando NaOH o H2O2 para destruir la señal tras cada tinción. La FIG. 25 compara el nivel de fondo de después de de la eliminación del pigmento (Muestras 30E y 30F) en el primer ciclo y tras 9 ciclos de tratamiento con NaOH o H2O2 (Muestras 30C y 30D). H2O2 (Muestra 30D, FIG. 25) mostró una eliminación del pigmento más eficaz de panqueratina cuando se comparó con NaOH (Muestra 30C, FIG, 25) tras la 9ª etapa. La FIG. 26 es un gráfico de las intensidades medidas de píxel para el fondo de cada ciclo para los portaobjetos de NaOH o H2O2. Como muestra el gráfico de la Fig. 26, el fondo para el portaobjetos de H2O2 fue significativamente menor para cada ciclo tras el basal inicial.

Ejemplo 22 Estabilidad del anticuerpo frente a agentes químicos

Un portaobjetos de tejido de colon se tiñó con un anticuerpo primario anti-cadherina de conejo y se detectó con un anticuerpo secundario anti-conejo de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 31A. Se obtuvieron imágenes de la muestra 31A y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 31B, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y 9. La Muestra 31B se volvió a teñir con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Cy3 para formar la Muestra 31C y se obtuvieron imágenes de nuevo. La FIG, 27 muestra microfotografías de las Muestras 31A-C. La FIG. 27 muestra que el anticuerpo primario permanece unido a la muestra tras el tratamiento con NaOH.

Un portaobjetos de tejido de colon se tiñó con un anticuerpo primario anti-PCNA de ratón y se detectó con un anticuerpo secundario anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 32A. Se obtuvieron imágenes de la muestra 32A y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 32C, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y 9. La Muestra 32B se volvió a teñir con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Cy3 para formar la Muestra 32C y se obtuvieron imágenes de nuevo. La FIG. 28 muestra microfotografías de las Muestras 31A-C. La FIG. 27 muestra que el anticuerpo primario sigue unido a la muestra tras el tratamiento con NaOH.

Los ejemplos 23-26 siguientes ilustran realizaciones de la invención de acuerdo con qué imagen múltiple de las muestras de tejido se lleva a cabo usando conjugados de enzima-sustrato-fluoróforo. La tinción múltiple se obtiene mediante tinción, obtención de imágenes, destrucción química del fluoróforo, retención, obtención de imágenes y repetición de las etapas.

Ejemplo 23 Conjugación de los anticuerpos con una enzima

Los anticuerpos usados fueron anti-β-catenina de conejo conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (HRP), anti-queratina 5 de ratón y anticuerpo anti-ratón de burro conjugado con HRP. El sustrato para la enzima HRP fue sustrato de tiramida conjugada con Cy5.

Ejemplo 24 Tinción y obtención de imágenes de tejido con HRP

Un portaobjetos preparado como en el ejemplo 6 se incubó con un anticuerpo anti-β-catenina conjugado con HRP preparado en el Ejemplo 23. La incubación del anticuerpo primario se realizó en 3 por ciento de BSA durante 45 minutos a 37 ºC. Tras la incubación, el portaobjetos se sometió a una amplia serie de lavados con PBS. El portaobjetos teñido con HRP se incubó con sustrato de tiramida conjugada con Cy5 en PBS/0,1 % de Triton X-100 durante 10 minutos. Tras la incubación, el portaobjetos se sometió a una extensa serie de lavados con PBS. Después, se obtuvieron imágenes del sustrato de tiramida con Cy5 con un Zeiss Axio Imager. El aumento usado fue 20x a menos que se indique lo contrario. L FIG. 29 muestra una microfotografía de la Muestra 33 tras la tinción para β-catenina. Después de la adquisición de imágenes, el portaobjetos se lavó con PBS para preparar para la destrucción de la señal.

Ejemplo 25 Modificación de la señal, tinción y obtención de imágenes

Para la destrucción de la señal se usó una solución de H2O2. Se preparó una solución de H2O2 mezclando 10 ml de carbonato sódico 0,5 M (pH 10), 5 ml de 30 por ciento en volumen de H2O2 y 35 ml de agua. Se introdujo un portaobjetos en la solución de H2O2 durante 15 minutos con agitación suave. Tras 15 minutos, el portaobjetos se lavó de nuevo con PBS (Muestra 34), se cubrió con cubreobjetos y se obtuvieron imágenes de nuevo para comprobar la eficacia de la destrucción del pigmento. La etapa de repetición de imágenes se llevó a cabo usando el procedimiento descrito con anterioridad en el Ejemplo 24. La FIG. 29 muestra una microfotografía de la Muestra 34 tras la modificación de señal, mostrando una sustancial eliminación de la señal tras la destrucción de la señal. Después, la Muestra 34 se volvió a incubar con tiramida-Cy5 y para determinar la actividad residual de la enzima HRP y se obtuvieron imágenes como se ha indicado anteriormente. La FIG. 29 muestra una microfotografía de la Muestra 35 y la solución de H2O2 no inactivó químicamente más Cy5 ni enzima HRP de modo que no se produce reacción enzima-sustrato adicional.

Ejemplo 26 Repetición de la tinción y repetición de obtención de imágenes de tejido con pigmentos

El portaobjetos (Muestra 35) del Ejemplo 25 se incubó con anticuerpo anti-queratina 5 de ratón. La incubación se realizó en 3 por ciento de BSA durante 45 minutos a 37 ºC. Tras la incubación, el portaobjetos se sometió a una extensa serie de lavados con PBS. El anticuerpo frente a queratina 5 se detectó después con un anticuerpo antiratón de burro conjugado con HRP en BSA durante 45 minutos a 37 ºC. El portaobjetos teñido con HRP se incubó con sustrato de tiramida conjugada con Cy5 como en el ejemplo 25. Tras la incubación, el portaobjetos se sometió a una extensa serie de lavados con PBS. El portaobjetos que se volvió a teñir con Cy5 (Muestra 36) se sometió a contratinción con la tinción morfológica, DAPI, y se cubrió con un cubreobjetos. Se volvió a obtener imágenes del portaobjetos cubierto con el cubreobjetos usando el procedimiento descrito con anterioridad en el Ejemplo 24. La FIG. 29 muestra una microfotografía de la Muestra 36 tras la tinción para la proteína k5.

Los ejemplos 27-31 siguientes ilustran realizaciones de la invención de acuerdo con qué imagen múltiple de transferencias puntuales se lleva a cabo. La tinción múltiple se obtiene mediante tinción, obtención de imágenes, destrucción química del fluoróforo, retención, obtención de imágenes y repetición de las etapas.

Ejemplo 27 Inmovilización de las dianas sobre una transferencia

Las proteínas diana, el péptido β-catenina (Sigma 26561-1 lote R1078-005) y antígeno CEA se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) a tres concentraciones diferentes: 1 microgramo, 100 nanogramos y 10 nanogramos. La transferencia se bloqueó usando 5% de leche en 1xTBS-T (solución salina tamponada con Tris, tampón Tween 20) durante 1 hora a temperatura ambiente.

Ejemplo 28 Tinción de -catenina y obtención de imágenes de las transferencias

Una transferencia preparada en el Ejemplo 27 se incubó con un anticuerpo primario, anticuerpo anti-β-catenina de conejo (Sigma, C7738). La incubación se realizó a una dilución de 1:200 de anticuerpo usando 1 por ciento de leche en 1xTBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Tras la incubación, la transferencia se sometió a una extensa serie de lavados. Después, la transferencia se incubó con un anticuerpo secundario conjugado con pigmento Cy5 anti-conejo de burro (preparado como en el Ejemplo 6) a una dilución de 1:500 usando 1 por ciento de leche en 1xTBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Tras a incubación, la transferencia (Muestra 37) se lavó con 1xTBS-T. Las imágenes de la transferencia (Muestra 37) se capturaron en un Typhoon Imager (GE Healthcare) usando el canal de Cy5 y una tensión fijada a 450 V. La FIG. 30 muestra una imagen de la Muestra 30.

Como se muestra en la FIG. 30, las transferencias de las intensidades de señal variables se observaron para tres concentraciones diferentes de la proteína diana β-catenina.

Ejemplo 29 Destrucción de pigmento y obtención de imágenes

Para la destrucción de la señal se usó una solución de H2O2. Se preparó una solución de H2O2 mezclando 10 ml de carbonato sódico 0,5M (pH 10), 5 ml de 30 por ciento en volumen de H2O2 y 35 ml de agua. La transferencia preparada en el Ejemplo 28 se introdujo en la solución de H2O2 durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Tras 15 minutos, la transferencia se lavó tres veces usando 1xTBS-T durante 5 minutos para formar la Muestra 38. Se volvieron a obtener imágenes de la transferencia (Muestra 38) y las imágenes de la transferencia se capturaron en un Typhoon Imager (GE Healthcare) usando el canal de Cy5 y una tensión fijada a 450 V. La FIG. 30 muestra una imagen de la Muestra 38. Como se muestra en la FIG. 30, no se observaron puntos tras la etapa de destrucción de la señal, lo que indica una destrucción sustancialmente completa de Cy5.

Ejemplo 30 Tinción del antígeno CEA y obtención de imágenes de la transferencia

La transferencia del Ejemplo 29 se incubó con un anticuerpo primario anti-CEA de ratón. La incubación se realizó a una dilución de 1:200 usando 1 por ciento de leche en 1xTBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Tras la incubación, la transferencia se sometió a una extensa serie de lavados. Después, la transferencia se incubó con un anticuerpo secundario conjugado con pigmento Cy5 anti-conejo de burro (preparado como en el Ejemplo 6) a una dilución de 1:500 usando 1 por ciento de leche en 1xTBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Tras la incubación, la transferencia (Muestra 39) se sometió a una extensa serie de lavados. Las imágenes de la transferencia (Muestra 39) se capturaron en un Typhoon usando un canal de Cy5 y una tensión fijada a 450 V. La FIG. 30 muestra una imagen de la Muestra 39. Como se muestra en la FIG. 30, los puntos de intensidades de señal variables se observaron para las tres concentraciones diferentes del antígeno CEA. El Ejemplo ilustra que se pueden detectar dos dianas diferentes usando un único generador de señal.

Ejemplo 31 Cuantificación de la señal después de cada etapa

Las Muestras 37, 38, 39 y 40 se analizaron adicionalmente para cuantificar las señales en las tres manchas detectadas para cada péptido (un ejemplo representativo de las regiones escogidas para el análisis se muestra en la FIG. 30 con las regiones subrayadas con un cuadrado numerado de 4-9 en la FIG. 30). Las señales de cada muestra, cada una de las manchas de péptido se normalizaron a una media de tres manchas de fondo 1,2, 2 y 3, como se muestra en la FIG. 30. La FIG. 31 es un gráfico de las intensidades de señal relativas de las manchas par alas Muestras 37, 38, 39 y 40, que muestra que las intensidades de señal se dividen por 10 tras la etapa de destrucción del pigmento (Muestra 38).

Los ejemplos 32-34 siguientes ilustran realizaciones de la invención de acuerdo con qué fluoróforo es destruido por un agente oxidante sin extraer significativamente la sonda (anticuerpo primario) del soporte sólido.

Ejemplo 32 Preparación de cultivos celulares

Alexa 488, BODIPY FL C5 (D6184), hidroxicoumarina (H 1193) se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA); ATTO 495, ATTO 635 y ATTO 655 se obtuvieron de ATTO-TEC (Siegen, Alemania); DY-734-NHS se obtuvo de Dyomics (Jena, Alemania); la fluoresceína cadaverina se obtuvo de Biotium Inc. (Hayward, CA). La IgG anti-ratón de cabra-Cy3 y la IgG anti-ratón de cabra-Cy5 se obtuvieron de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA). DPBS y PBS se obtuvieron de Invitrogen; PFA al 16 % se obtuvo de Electron Microscopy Sciences(Hatfield, PA). El suero de cabra se obtuvo de Vector Laboratories (Burlingame, CA). Todos los demás reactivos se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO).

Las células LS174T (ATCC, CL-188) que expresan el antígeno carcinoembrionario (CEA) se cultivaron en medio EMEM (ATCC, nº cat. 30-2003) suplementado con FBS al 10 %. Las células se incubaron a 37 ºC y 5% de CO2. Al llegar a un 90 % confluencia se subcultivaron o sembraron en placas de 96 pocillos y continuaron creciendo durante dos días más.

Las células confluentes en placas de 96 pocillos se lavaron con DPBS (con calcio) dos veces y después se añadió PFA al 2 % (concentración final) para fijar las células durante 10 minutos, seguido de permeabilización usando 0,1 % de Triton X-100 en PBS durante 5 minutos. A continuación, las células se incubaron en un tampón de bloqueo (10 % de suero de cabra + 3 % de BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió anti-CEA de ratón (concentración final de 10 μg/ml en 3 % de BSA) inmediatamente después de la etapa de bloqueo y se incubó durante la noche.

Ejemplo 33 Contacto del anticuerpo primario con agentes oxidantes

Para investigar el efecto de los agentes oxidantes sobre el anticuerpo primario se añadieron varias soluciones con

agentes oxidantes (como se describe en la Tabla 1) a la mitad de la placa durante 30 minutos y después se lavaron extensamente con PBS. Los reactivos de oxidación usados fueron peróxido de hidrógeno, bromo acuoso, permanganato potásico, dicromato sódico, solución de I2/KI, peróxido de t-butilo y peróxido de hidrógeno de t-butilo. La otra mitad de la placa se usó como control con incubaciones paralelas de PBS y lavados, y no se aplicaron soluciones con agente oxidante. Para comprobar el efecto de una base sobre la sonda también se pusieron en contacto con la placa diferentes bases, tales como NaOH, DBU (diazobiciclo-undeceno) acuoso y butilamina acuosa. Como agente control se aplicó PBS.

Todos los pocillos se incubaron con 50 μl/pocillo de IgG anti-ratón de cabra-Cy3 O IgG anti-ratón de cabra-Cy5 (dilución de 1:200). Toda la placa se escaneó usando el espectrofotómetro Gemini M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Un total de cinco manchas se escanearon en cada pocillo y después se obtuvo la media para obtener una lectura para cada pocillo. Para el pigmento cy3, la fluorescencia se leyó a la longitud de onda de excitación a 544 nm, emisión a 580 nm y corte a 570 nm. Para Cy6, excitación a 640 nm, emisión 675 y corte 665.

La Tabla 1 muestra los valores de fluorescencia medidos tras la aplicación del agente oxidante al anticuerpo primario, como se muestra en las columnas 2 (Cy3) y 4 (Cy5). Los valores de la Tabla son la intensidad de fluorescencia normalizada, es decir una proporción entre la intensidad de la fluorescencia medida para los pocillos en contacto con al agente oxidante y la intensidad de la fluorescencia medida para los pocillos control (sin aplicar una solución oxidante) multiplicada por 100. Por tanto, un valor cercano a 100 % significa que la solución oxidante no tiene ningún efecto sobre el anticuerpo primario en comparación con su control (sin aplicar una solución oxidante).

La Tabla 1 muestra que algo de agente oxidante (p. ej., H2O2) no tiene casi ningún efecto sobre el anticuerpo primario (P>0,1), mientras que en otros casos, la concentración del agente oxidante se puede variar (p. ej., para I2/KI) de modo que no se afecta sustancialmente al anticuerpo primario. Las bases usadas (NaOH y butilamina) exhibieron una destrucción sustancial de los anticuerpos primarios en diversas concentraciones usadas. El PBS no mostró efecto alguno sobre el anticuerpo primario.

Ejemplo 34 Contacto de los fluoróforos con agentes oxidantes

Para comprobar el efecto del agente oxidante sobre las células marcadas con fluoróforo se añadieron varias soluciones con agentes oxidantes (como se describe en la Tabla 1) a diferentes filas (parte control de la placa) durante 30 minutos. La placa se leyó de nuevo tras un exhaustivo lavado como se describe en el Ejemplo 33.

La Tabla 1 muestra que algo de agente oxidante (p. ej., H2O2) no tiene casi efecto sobre el anticuerpo primario pero tiene como resultado la pérdida sustancial de las propiedades de fluorescencia para el pigmento de cianina. Los datos indicados en la Tabla 1 muestran además que la destrucción de la señal fluorescente funcionaba mejor a un pH alto para las soluciones de H2O2. Como se describe en el presente documento, en otros casos, la concentración del agente oxidante se puede variar (p. ej., para I2/K) de modo que el anticuerpo primario no se ve afectado sustancialmente, pero el pigmento de cianina sí. Las bases usadas (NaOH y butilamina) exhibieron una pérdida sustancial de señal procedente del pigmento de cianina, pero esto puede deberse a la destrucción (o extracción) de los anticuerpos primarios mediante la base. El PBS no mostró efecto alguno sobre el anticuerpo primario ni el pigmento de cianina.

Tabla 1. Intensidad de fluorescencia normalizada medida tras el contacto de la placa con diferentes agentes oxidantes. (continuación)

Solución de blanqueo

En Cy3 primaria (hasta grupos) Blanqueo en 6 Cy3 (hasta 4 grupos) En Cy primaria (2 grupos) Blanqueo en Cy5 (1 grupo)

Reactivos oxidantes

3 % de H2O2, pH 10

105% 11% 124% 0%

3 % de H2O2, pH 5

99% 73%

Bromo acuoso

100% 14%

4 % de permanganato de potasio

0% 0% 1% 0%

1% de permanganato de potasio

80% 4%

4 % de dicromato sódico.2H2O

111% 69% 88% 25%

Solución de blanqueo

En Cy3 primaria (hasta grupos) Blanqueo en 6 Cy3 (hasta 4 grupos) En Cy primaria (2 grupos) Blanqueo en Cy5 (1 grupo)

4 % de dicromato sódico. 2H2O en ácido acético

213% 10%

5% de I2, 10% de KI

9% 0% 7% 4%

0,5% de I2, 1% de KI

82% 10%

0,05% de I2, 0,1 % de KI

101% 72%

3,5 % de peróxido de t-butilo en acetonitrilo

45% 103% 49% 84%

3,5 % de hidroperóxido de tbutilo

166% 65% 107% 44%

Bases

NaOH 0,35 N

17% 11% 14%

NaOH 0,1 N

37% 13% 34%

5 % de DBU

40% 12% 40%

1% de DBU

38% 41%

5 % de butilaminina

20% 13% 38%

Control

PBS

108% 79% 91% 96%

Ejemplo 35 Medición del espectro de blanqueo con pigmentos

Se usó la densidad óptica (DO) para monitorizar la destrucción del pigmento. Se mezclaron 10 μl del pigmento con

5 un volumen igual de la solución oxidante y, después, 2 μl de la solución mezclada se cargaron en un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc. Wilmington, DE). La densidad óptica (DO) se leyó a un espectro completo que varía de 200 nm a 750 nm. Para el estudio cinético se realizaron mediciones a los tiempos 0, 5 minutos, 15 minutos y 30 minutos.

Ejemplo 36 Estudio cinético de la destrucción de Cy3 y Cy5 con H2O2

10 Para estudiar la cinética de la destrucción del pigmento se usó peróxido de hidrógeno (1,5 % de H2O2 a pH 10) como agente oxidante y Cy3 y Cy5 como pigmentos representativos usando el procedimiento descrito en el Ejemplo

36. El espectro de fluorescencia de la mezcla de pigmento-solución oxidante se monitorizó durante un periodo de 30 minutos. La FIG. 32 muestra el perfil de tiempo de los espectros de Cy3 y Cy5. Se observó una rápida disminución de la DO, lo que indica destrucción del pigmento. En ambos casos, la incubación de 15 minutos en 1,5

15 % de H2O2 podría prácticamente destruir los pigmentos. Los valores de DO a la excitación máxima se redujeron al 2 % ara Cy3 y Cy5 tras 15 minutos.

Ejemplo 37 Efecto de las concentraciones de H2O2 en el blanqueo de Cy3

Se analizó una serie de concentraciones de H2O2 de 0 a 1,5 % y el espectro de absorbancia se monitorizó en 30 minutos usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 35. El pH de la solución de H2O2 se mantuvo en 10. Se usó

20 Cy3 como pigmento y la absorbancia se registró en su longitud de onda máxima a 550 nm. A excepción de la concentración de 0,1% de H2O2, todas las demás concentraciones de H2O2 mostraron resultados muy similares y casi se redujo la absorbancia del pigmento a 5% en 15 minutos, como se muestra en la FIG. 33. No hay una diferencia estadística entre los tratamientos con concentraciones de 0,5 %, 1% y 1,5 % (P>0,1).

Ejemplo 38 Efecto de H2O2 sobre varios fluoróforos

Se analizó un panel de pigmentos fluorescentes para determinar el efecto del H2O2 (3 % de H2O2 a pH de 10) sobre diferentes fluoróforos usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 35. El espectro de la absorbancia se monitorizó en 30 minutos y los valores de absorbancia se muestran en la FIG. 34. Los datos mostrados en el presente documento son valores de DO a la longitud de onda de a absorbancia máxima del pigmento normalizada a la DO a tiempo 0. La fluoresceína, que es muy sensible al fotoblanqueo, fue relativamente estable a este procedimiento de oxidación. ATTO 496 y Alexa 488 fueron también menos sensibles al agente oxidante en comparación con otros pigmentos. La FIG. 34 muestra que los pigmentos podían destruirse usando H2O2.

Ejemplo 39 Efecto de H2O2 sobre los puntos cuánticos (QD 655).

Se analizó una serie de concentraciones de H2O2 (a una dilución de 20x a 2000x) y el espectro de absorbancia se monitorizó en 30 minutos usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 36. El pH de la solución de H2O2 se mantuvo en 10. Los valores de la absorbancia se compararon con una muestra control de una solución de QD 655 a concentraciones diferentes (a una dilución de 20x a 2000x).

La solución de conjugado de punto cuántico 655 con F(ab’)2 de IgG anti-ratón de cabra (1 uM) se diluyó a 10x, 100x

o 1000x con una solución de bicarbonato sódico 0,775M (ajustada a un pH de 10). A cada solución se añadió un volumen igual de 6 %de peróxido de hidrógeno. Se introdujeron alícuotas de 100 μl en cada uno de los triplicados de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Las muestras sin peróxido pero diluidas a la misma concentración final con agua se usaron como controles. Como control de fondo se usó una solución diluida 2x con bicarbonato sódico. La fluorescencia se midió en el tiempo en un lector de placas spectromax M2 usando los parámetros siguientes: Excitación 350 nm, Emisión 655 nm y autocorte 630 nm. Para la concentración menor se alcanzó una reducción del 99 % de la fluorescencia tras 5 minutos. En 30 minutos, la fluorescencia de todas las muestras con peróxido se redujo en > 99,5 %. La fluorescencia de las muestras control permaneció en su mayoría intacta (> 93 % para la muestra de la concentración menor y ~99 % la muestra de la concentración más alta).

Para destruir la señal se usó peróxido de hidrógeno al tres por ciento en tampón de bicarbonato (pH 10). Los valores de la absorbancia se compararon con una muestra control de una solución de Qd 655 a concentraciones diferentes (a una dilución de 20x a 2000x). A todas las concentraciones de QD, la fluorescencia se redujo a menos del 6 % del valor control en 5 minutos, como se muestra en la FIG. 35.

Ejemplo 40 Efecto de los radicales hidroxilo sobre la fluoresceína

Los espectros de absorbancia del pigmento fluoresceína-cadaverina FAM (“FAM-CAD”) se midieron usando diferentes condiciones de oxidación para las muestras 41 (FAM-CAD, H2O2 y H2O (1:1:1), 42 (FAM-CAD, H2O2 y FeCl3 (1:1:1)), 43 (FAM-CAD, H2O y FeCl3 (1:1:1)), 44 (FAM-CAD y H2O (1:2)). Una solución de fluoresceínacadaverina se mezcló con 9 % de peróxido de hidrógeno y una solución al 2 % de FeCl3 en agua en la proporción de 1:1:1 en volumen. La mezcla se dejó reposar durante 5 minutos. Dado que la adición de FeCl3 cambia el pH a muy ácido y se sabe que el espectro de la fluoresceína es diferente en condiciones ácidas, antes de la medición del espectro UV/VIS la solución se convirtió en básica mediante la adición de NaOH 1M, se filtró y se registró su espectro. Como controles se usaron las soluciones tratadas de forma similar a excepción de que se sustituyó el peróxido de hidrógeno por agua o la solución de FeCl3 por agua. Una solución en la que tanto el FeCl3 como el peróxido de hidrógeno se sustituyeron por agua también se usó como otro control. Aunque en presencia de peróxido los espectros son un poco ruidosos y se eleva el basal debido a la formación de burbujas, los espectros mostraron claramente que aunque las muestras control no estaban afectadas, prácticamente toda la fluoresceína se había destruido en la muestra de análisis. La absorbancia se redujo considerablemente tras 5 minutos para la Muestra 42, como se muestra en la FIG. 36, lo que indica que la fluoresceína se puede destruir usando un agente oxidante para crear radicales hidroxilo.

Por tanto, las realizaciones anteriores se deben considerar en todos los aspectos como ilustrativas y no como limitantes de la invención descrita en el presente documento. El alcance de la invención está indicado en las reivindicaciones adjuntas y no en la descripción anterior y, por consiguiente, se pretende que todos los cambios que entren dentro del significado y del alcance de equivalencia de las reivindicaciones estén incluidos en ellas.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de sondar múltiples dianas en una muestra biológica, que comprende:

   (a) proporcionar una muestra que contiene múltiples dianas;

   (b)

   unir al menos una sonda, que comprende un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas 5 presentes en la muestra;

   (c)

   hacer reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente;

   (d)

   observar una señal procedente del generador de señal fluorescente de la etapa (c);

   (e)

   aplicar a la muestra en la etapa (c) una solución, que comprende un agente oxidante que inactiva 10 sustancialmente tanto al generador de señal fluorescente, como a la enzima;

   (f)

   unir al menos una sonda, que comprende un aglutinante acoplado a una enzima, a una o más dianas presentes en la muestra de la etapa (e);

   (g)

   hacer reaccionar la sonda unida con un sustrato enzimático acoplado a un generador de señal fluorescente;

   15 (h) observar una señal procedente del generador de señal fluorescente de la etapa (g).

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución de la etapa (e) es una solución básica.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la enzima se selecciona de peroxidasa, fosfatasa alcalina, -D-galactosidasa y glucosa oxidasa.

4. 4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el generador de señal fluorescente comprende un 20 pigmento de cianina.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las etapas (e)-(h) se repiten una o más veces.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de observación (d), la etapa (h) o las etapas (d) y

   (h) comprenden co-localizar al menos dos dianas en la muestra.
7. 7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de observación (d), la etapa (h) o las etapas (d) y 25 (h) comprenden una medición cuantitativa de al menos una diana en la muestra.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende medir uno o más valores de intensidad de la señal observada al observar la etapa (d), la etapa (h) o las etapas (d) y (h).

9. 9.

   El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende correlacionar el valor de la intensidad con una cantidad de la diana presente en la muestra.

   30 10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el generador de señal fluorescente en la etapa (c) es el mismo que el generador de señal fluorescente en la etapa (g).
10. 11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el generador de señal fluorescente en la etapa (c) es diferente del generador de señal fluorescente en la etapa (g).
11. 12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las señales observadas en la etapa (d) y la etapa (h) son 35 ambas detectables en la misma longitud de onda de la detección.

12. 13.

    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la enzima es una peroxidasa y el sustrato enzimático es un sustrato de peroxidasa.

13. 14.

    El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la peroxidasa provoca el sustrato de peroxidasa en

    enlaces covalentes, en grupos fenólicos presentes en la muestra, o un soporte solido al que está unida la 40 muestra.