ES2372004T3 - Usos de derivados de metilfenidato. - Google Patents

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Abstract

Un compuesto de fórmula I, o una sal del mismo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección que comprende inhibir una respuesta inmune, en el que fórmula I es: en la que n es 1; R 1 es arilo C6 a C14, o ariloxi C6 a C14; y R 2 es metilo.

Description

Usos de derivados de metilfenidato
Campo de la invención
La invencion se refiere a usos de derivados de metilfenidato. Estos usos incluyen inhibir las respuestas inmunes e 5 inhibir la inflamacion.
Antecedentes
Metilfenidato es el tratamiento de eleccion para ninos y adultos a los que se les diagnostica deficit de atencion/trastorno de hiperactividad (ADHD), incluyendo su subtipo sin atencion (anteriormente conocido como trastorno por deficit de atencion o ADD). Tambien se han propuesto ciertos derivados de metilfenidato para el
10 tratamiento de ADD (vease la Patente Estadounidense Num. 6.025.502) y para el tratamiento de otros trastornos y afecciones neurologicas (vease las Patentes Estadounidenses Num. 5.859.249, 6.025.502 y 6.486.177 y solicitud PCT WO 99/36403).
Se han realizado experimentos para examinar los efectos del metilfenidato en el sistema inmune, y se han informado resultados contradictorios. Vease Auci et al., J. Am. Acad Child Ado/esc. Psychiatry, 36, 1015-1016 (agosto de 1997)
15 y la Publicacion de Solicitud de Patente Estadounidense Num. 2005/0192290.
Resumen de la invención
La invencion proporciona un compuesto de formula I, o una sal del mismo, para el uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion segun lo detallado en las reivindicaciones, en el que la formula I es:
20 en la que n es 1 R1 es arilo C6 a C14 o ariloxi C6 a C14 y R2 es metilo.
Especificamente, en una primera realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en la inhibicion de una respuesta inmune en un animal. En una segunda realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en la inhibicion de la
activacion de celulas T en un animal.
25 En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion mediada por celulas T en un animal. En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en la inhibicion de la activacion
de monocitos en un animal. En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en la inhibicion de la produccion 30 y/o liberacion de una citocina proinflamatoria en un animal.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en la inhibicion de la produccion y/o liberacion de IL-8 en un animal. En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en la inhibicion de la produccion
y/o liberacion de IL-13 en un animal.
35 En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en la inhibicion de la produccion y/o liberacion de interferon gamma (IFNy) en un animal. En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en la inhibicion de la produccion
y/o liberacion de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) en un animal. Aun en otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en la inhibicion de
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inflamacion en un animal.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion inflamatoria en un animal.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en la inhibicion de la proliferacion no deseada de linfocitos en un animal.
En otra realizacion, la invencion proporciona un compuesto de formula I para su uso en la inhibicion de la adhesion no deseada de linfocitos en un animal.
Se cree que los compuestos de formula I son estimulantes del sistema nervioso central e inhibidores de la captacion de dopamina. Por consiguiente, en otra realizacion que no esta en conformidad con la invencion, la invencion proporciona un procedimiento para tratar un animal que sufre de enfermedades o afecciones comorbidas, en el que
(1) una de las enfermedades o afecciones es una enfermedad o afeccion neurologica que es tratable con un estimulante del sistema nervioso central o un inhibidor de captacion de dopamina y (2) una segunda enfermedad o afeccion es una enfermedad o afeccion inflamatoria o inmune.
"Inhibir" se utiliza en la presente memoria para significar reducir (totalmente o parcialmente) o prevenir.
"Mediada" se utiliza en la presente memoria para significar que involucra, causada por o exacerbada por.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A-C son graficos de DO a 530 nm para diversos aditivos para cultivos de linfocitos de sangre periferica (PBL) estimulados con2 !g/ml, 5 !g/ml y20 !g/mlde fitohemaglutinina (PHA), respectivamente.
La Figura 2 es un grafico de DO a 530 nm para diversos aditivos para cultivos de PBL estimulados con 2 !g/ml de PHA.
La Figura 3 es un grafico de concentracion de IL-13 para diversos aditivos para cultivos de PBL estimulados con 2 !g/ml de PHA.
La Figura 4 es un grafico de concentracion de IFNy para diversos aditivos para cultivos de PBL estimulados con 2 !g/ml PHA.
Las Figuras 5A-B son graficos de DO a 530 nm para diversos aditivos para cultivos de PBL estimulados con 2 !g/ml y 5 !g/ml de PHA, respectivamente.
La Figura 6 es un grafico de concentracion de IL- 13 para diversos aditivos para cultivos de PBL estimulados con 5 !g/ml de PHA.
La Figura 7 es un grafico de concentracion de TNFa para diversos aditivos para cultivos de PBL estimulados con 2 !g/ml de PHA.
La Figura 8 es un grafico de concentracion de IL-8 para diversos aditivos para cultivos de PBL estimulados con 2 !g/ml de PHA.
Las Figuras 9A-B son graficos de DO para diversos aditivos para cultivos de monocitos THP-1 estimulados con lipopolisacarido (LPS). En la Figura 9B, la barra gris oscuro superior en cada caso es c-Jun y la barra gris claro inferior es NFKB.
Descripción detallada de la invención
Los compuestos de formula I se utilizan en la practica de la presente invencion.
En la Formula I, n es 1. R1 es arilo C6 a C14, o ariloxi C6 a C14, Mucho mas preferentemente R1 es fenilo. En la formula I, R2 es -CH3. En una realizacion especifica, el compuesto de formula II es particularmente util en la presente invencion:
"Acilo" significa un resto de la formula -C(O)-R3, en el que R3 es H, alquilo, cicloalquilo o arilo.
10 "Amino" significa un resto de la formula -NR4R5, en el que cada uno de R4 y R5 es independientemente H o alquilo, preferentemente alquilo inferior. "Alcoxi" significa un resto de la formula -OR6, en el que R6 es un alquilo. Un ejemplo de un grupo alcoxi es metoxi
(-O-CH3). "Alquilo" significa un hidrocarburo ramificado o de cadena lineal saturado monovalente que contiene 1-8 atomos de 15 carbono. Cada alquilo puede, opcionalmente, sustituirse con uno o mas grupos amino, hidroxilo o sulfhidrilo.
"Arilo" significa un resto de hidrocarburo aromatico mono, bi o triciclico monovalente de 6 a 14 atomos de carbono anulares. Fenilo es preferente. "Ariloxi" significa un resto de la formula -OR7, en el que R7 es un arilo. Un ejemplo de un grupo ariloxi es fenoxi. "Carboxilo" significa un resto de la formula -C(O)-O- R3, en el que R3 es H, un alquilo, cicloalquilo o arilo.
20 "Cicloalquilo" significa un resto de hidrocarburo mono o biciclico, monovalente, saturado de tres a diez atomos de carbono anulares. Preferentemente el cicloalquilo contiene 4-8 atomos de carbono anulares. El cicloalquilo mucho mas preferente es ciclohexilo.
"Halogeno" significa cloro, fluor, bromo o yodo. Cloro o bromo es preferente. "Heteroarilo" significa un resto aromatico monociclico o biciclico, monovalente de 5 a 12 atomos anulares que 25 contiene uno, dos, o tres heteroatomos anulares cada uno de los que independientemente se selecciona de N, O y S, en el que los atomos anulares restantes son C.
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"Hidroxilo" significa -OH.
"Alquilo inferior" significa un hidrocarburo ramificado o de cadena lineal saturado que contiene 1-4 atomos de carbono.
"Nitro" significa -NO2.
"Sulfhidrilo" significa -SH.
"Sulfo" significa -SO3H.
"Profarmaco" significa cualquier compuesto que libera un farmaco padre activo de acuerdo a la formula I in vivo cuando dicho profarmaco se administra a un individuo mamifero. Los profarmacos de un compuesto de formula I que no son de acuerdo a la invencion se preparan mediante la modificacion de uno o mas grupos funcionales presentes en el compuesto de formula I de tal manera que la/s modificacion/es puede/n escindirse in vivo para liberar el compuesto padre. Los profarmacos incluyen los compuestos de formula I en los que un grupo hidroxi, amino, o sulfhidrilo en un compuesto de formula I esta unido a cualquier grupo que puede ser escindido in vivo para generar el grupo hidroxilo, amino, o sulfhidrilo libre, respectivamente. Los ejemplos de profarmacos incluyen, pero no se limitan a, esteres (por ejemplo, derivados de acetato, formiato, y benzoato), carbumatos (por ejemplo, N,Ndimetilaminocarbonilo) de grupos funcionales hidroxi en compuestos de formula I, y similares.
"Tratar" o "tratamiento" de una enfermedad o afeccion incluye: (1) prevenir la enfermedad o afeccion, es decir, hacer que los sintomas clinicos de la enfermedad o afeccion no se desarrollen en un mamifero que puede estar expuesto a o predispuesto a la enfermedad o afeccion, pero aun no experimenta o muestra los sintomas de la enfermedad o afeccion; (2) inhibir la enfermedad o afeccion, es decir, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o afeccion o sus sintomas clinicos; o (3) aliviar la enfermedad o afeccion, es decir, causar la regresion de la enfermedad o afeccion o sus sintomas clinicos, incluyendo curar la enfermedad o afeccion.
Una "cantidad efectiva" significa la cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un animal para tratar una enfermedad o afeccion o hacer que un efecto sea suficiente para hacerlo. La "cantidad efectiva" puede y muy posiblemente variara dependiendo del compuesto, la enfermedad o afeccion y su severidad, o el efecto que se busca causar, y la edad, peso, etc., del animal que debe ser tratado.
Los procedimientos para sintetizar los compuestos de formula I utiles en la presente invencion son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Num. 5.859.249 y 6.025.502, solicitud PCT WO 99/36403, Pan et al., Eur. J Pharmacol., 264, 177-182 (1994), Gatley et al., Life Sci., 58, 231-239 (1996), Deutsch et al. J. Med. Chem., 39, 1201-1209 (1996), Thai et al., J. Med. Chem., 41, 591-601 (1998), y Wayment et al., J. Neurochem., 72:1266-1274 (1999), Krim, Lori, Thesis (Ph.D. in Chemistry) (2001), University Of Pennsylvania, Chemistry Library Reading Room (Call No. QD001 2001.K92), University Microfilms Order No. 3031684, ISBN 0-49344179-4.
Si el compuesto de la presente invencion contiene uno o mas centros quirales, el compuesto puede sintetizarse enantioselectivamente o puede prepararse y separarse una mezcla de enantiomeros y/o diastereomeros. La resolucion de los compuestos de la presente invencion, sus materiales de etapas y/o los intermedio puede llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, segun lo que se describe en el compendio volumen cuatro Optical Resolution Procedures for Chemical Compounds: Optical Resolution Information Center, Manhattan College, Riverdale, N.Y., y en Enantiomers, Racemates and Resolutions, Jean Jacques, Andre Collet y Samuel H. Wilen; John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1981, que se incorporan en la presente memoria en su totalidad. Basicamente, la resolucion de los compuestos se basa en las diferencias en las propiedades fisicas de diastereomeros mediante union, ya sea quimicamente o enzimaticamente, de un resto enantiomericamente puro, dando como resultado formas que son separables mediante cristalizacion fraccionaria, destilacion o cromatografia.
Las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos de formula I tambien pueden utilizarse en la practica de la invencion. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen sales convencionales no toxicas, tales como sales obtenidas de acidos inorganicos (tales como clorhidrico, bromhidrico, sulfurico, fosforico, nitrico, y similares), acidos organicos (tales como acido acetico, propionico, succinico, glicolico, estearico, lactico, malico, tartarico, citrico, glutamico, aspartico, benzoico, salicilico, oxalico, ascorbico, y similares) o bases (tales como el hidroxido, carbonato
o bicarbonato de un cation metalico farmaceuticamente aceptable o cationes organicos obtenidos de N,Ndibenciletilendiamina, D-glucosanaina, o etilendiamina). Las sales se preparan en una forma convencional, por ejemplo, mediante la reaccion de la forma de base libre del compuesto con un acido.
Se debe entender que el ambito de la presente invencion abarca no solo el uso de los mismos compuestos de formula I, sino tambien las sales de los mismos. Ademas, la presente invencion contempla el uso de los isomeros de los compuestos de formula I, y de las sales de los mismos, incluyendo isomeros puros y diversas mezclas de isomeros.
Los compuestos de formula I, o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, pueden utilizarse como inmunosupresores. Estos compuestos inhiben una amplia variedad de respuestas inmune.
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Por ejemplo, un compuesto de formula I puede utilizarse para inhibir la activacion de celulas T y para tratar enfermedades mediadas por celulas T. Las enfermedades mediadas por celulas T tratables de acuerdo a la invencion incluyen rechazo de injerto, enfermedad de injerto versus huesped, reacciones por hipersensibilidad de tipo retardadas no deseadas (tales como reacciones alergicas de tipo retardadas), enfermedades pulmonares mediadas por celulas T, enfermedades autoinmunes e inflamacion mediada por celulas T. Las enfermedades pulmonares mediadas por celulas T incluyen sarcoidosis, neumonitis por hipersensibilidad, neumonitis intersticial aguda, alveolitis, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopatica y otras enfermedades caracterizadas por dano pulmonar inflamatorio. La enfermedades autoinmunes incluyen esclerosis multiple, neuritis, polimiositis, psoriasis, vitiligo, sindrome de Sjogren, artritis reumatoidea, diabetes tipo 1, pancreatitis autoinmune, enfermedades inflamatorias de intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), enfermedad celiaca, glomerulonefritis, escleroderma, sarcoidosis, enfermedades autoinmunes tiroideas (por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Graves), miastenia grave, enfermedad de Addison, uveoretinitis autoinmune, penfigo vulgar, cirrosis biliar primaria, anemia perniciosa, y lupus eritematoso sistemico.
Un compuesto de formula I tambien puede utilizarse para inhibir la produccion, liberacion, o ambos, de las citocinas, incluyendo interleucina-8 (IL-8), IL-13, interferon gamma (IFNy) y factor alfa de necrosis tumoral (TNFa). IL- 8 es una citocina proinflamatoria y un potente quimioatrayente y activador de neutrofilos. Tambien se ha informado que es un quimioatrayente y activador de linfocitos T y eosinofilos. IL-8 se produce mediante celulas inmunes (incluyendo linfocitos, neutrofilos, monocitos y macrofagos), fibroblastos y celulas epiteliales. IL-13 se produce mediante las celulas TH2 activadas, y las dianas primarias de IL-13 son las celulas B y los monocitos. IL-13 estimula las respuestas inmunes humorales, y ha estado implicada en la patogenesis de asma. IFNy y TNFa son ambas citocinas proinflamatorias producidas por celulas T activadas y otras celulas. TNFa rapidamente activa los factores de transcripcion NFxB y AP-1, hace que las celulas endoteliales expresen moleculas de adhesion, y puede tener un papel en el reclutamiento de celulas inmunes a los sitios de inflamacion. IFNy puede activar neutrofilos, celulas endoteliales y macrofagos, asi como causar un incremento en la expresion de moleculas MHC. IFNy impulsa la respuesta inmune mediada por celulas.
Un compuesto de formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, puede utilizarse para inhibir la inflamacion y para tratar enfermedades y afecciones inflamatorias. Una enfermedad o afeccion inflamatoria es una enfermedad o afeccion que incluye, o es causada o exacerbada por, inflamacion. Las enfermedades y afecciones inflamatorias especificas tratables con un compuesto de la presente invencion incluyen sindrome de dificultad respiratoria aguda, alergias, artritis, asma, autismo, enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis multiple y lupus eritematoso sistemico), bronquitis, cancer, enfermedad de Crohn, fibrosis quistica, enfisema, endocarditis, gastritis, infecciones (bacteriana, viral, por levaduras, micotica y parasitaria), enfermedad inflamatoria del intestino, trastornos inflamatorios de piel, isquemia, reperfusion, sindrome de disfuncion organica multiple, falla organica multiple, nefritis, enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson y demencia), pancreatitis, psoriasis, infecciones respiratorias virales, sepsis, conmocion cerebral, sindrome de respuesta inflamatoria sistemica, trauma, colitis ulcerativa y otras enfermedades, afecciones y trastornos inflamatorios. Los compuestos de la presente invencion, incluyendo sus sales farmaceuticamente aceptables, seran especialmente utiles para tratar enfermedades y afecciones neurologicas inflamatorias, tales como autismo, enfermedad de Alzheimer, esclerosis multiple, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, demencia senil y demencia asociada a infecciones por HTV.
Un compuesto de formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, puede utilizarse para inhibir la proliferacion no deseada de linfocitos. La proliferacion no deseada de linfocitos se produce en, por ejemplo, ciertos tipos de cancer (por ejemplo, timomas, linfomas y leucemias) e inflamacion.
Un compuesto de formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, puede utilizarse para inhibir la adhesion no deseada de linfocitos. La adhesion no deseada de linfocitos esta incluida en, por ejemplo, inflamacion, enfermedades y afecciones inflamatorias, y respuestas inmunes.
Ademas de las actividades descritas mas arriba, se cree que los compuestos de la presente invencion son estimulantes del sistema nervioso central e inhibidores de la captacion de dopaminas. Por consiguiente, los mismos seran especialmente utiles para tratar un animal que sufre de enfermedades o afecciones comorbidas que no estan en conformidad con la invencion en el que (1) una de las enfermedades o afecciones es una enfermedad o afeccion neurologica tratable con un estimulante del sistema nervioso central o un inhibidor de captacion de dopamina y (2) una segunda enfermedad o afeccion es una enfermedad o afeccion inmune o inflamatoria. Las enfermedades y afecciones neurologicas tratables con un estimulante del sistema nervioso central incluyen ADHD, depresion, disforia, narcolepsia, fatiga (por ejemplo, debido a la quimioterapia o tratamiento con analgesicos narcoticos), hipersomnia, trastornos cognitivos, trastorno de compra compulsiva. Las enfermedades y afecciones neurologicas tratables con un inhibidor de captacion de dopamina incluyen abuso o adiccion de cocaina y enfermedad de Parkinson (solo o en combinacion con dopa, levodopa u otro precursor de dopamina). Las enfermedades y afecciones inflamatorias e inmunes incluyen aquellas descritas mas arriba. En una realizacion particularmente preferente, los compuestos de la presente invencion y sus sales farmaceuticamente aceptables se utilizaran para tratar ADHD comorbido y alergias.
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Para tratar un animal que necesita tratamiento, un compuesto de formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, se administra al animal. Preferentemente, el animal es un mamifero, tal como un conejo, cabra, perro, gato, caballo o ser humano. Mucho mas preferentemente, el animal es un ser humano.
Las formas de dosificacion efectivas, modos de administracion y cantidades de dosificacion para los compuestos de la invencion pueden determinarse empiricamente, y tomar dichas determinaciones esta dentro de la destreza de la tecnica. Aquellos expertos en la tecnica entienden que la cantidad de dosificacion variara con el compuesto particular empleado, la enfermedad o afeccion que debe ser tratada, la severidad de la enfermedad o afeccion, la/s via/s de administracion, la tasa de excrecion del compuesto, la duracion del tratamiento, la identificacion de cualquier otro ingrediente activo que este siendo administrado al animal, la edad, tamano y especie del animal, y factores similares conocidos en la tecnica medica y veterinaria. En general, una dosis diaria apropiada de un compuesto de la presente invencion sera esa cantidad del compuesto que sea la menor dosis efectiva para producir un efecto terapeutico. Sin embargo, la dosificacion diaria sera determinada por el medico o veterinario tratante dentro del ambito del juicio medico sensato. Si se desea, la dosis diaria efectiva puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas sub-dosis, administradas en forma separada en intervalos apropiados en todo el dia. La administracion del compuesto debe ser continua hasta que se logre una respuesta aceptable.
Los compuestos utiles en la presente invencion (es decir, los compuestos de formula I y las sales farmaceuticamente aceptables) pueden administrarse a un paciente animal para terapia mediante una via de administracion apropiada, incluyendo por via oral, nasal, rectal, vaginal, parenteral (por ejemplo, por via intravenosa, intraespinal, intraperitoneal, subcutanea, o intramuscular), intracisternal, transdemica, intracranial, intracerebral, y topica (incluyendo por via bucal y sublingual). La via de administracion preferente es por via oral.
Si bien es posible que un compuesto util en la presente invencion sea administrado solo, es preferente administrar el compuesto como una formulacion farmaceutica (composicion). Las composiciones farmaceuticas utiles en la invencion comprenden uno o mas compuestos de formula I, sales farmaceuticamente aceptables como ingrediente/s activo/s en mezcla con uno o mas vehiculos farmaceuticamente aceptables y, opcionalmente, con uno o mas otros compuestos, ingrediente/s activo/s u otros materiales. Cada vehiculo debe ser "aceptable" en el sentido de que sea compatible con los otros ingredientes de la formulacion y no danino para el animal. Los vehiculos farmaceuticamente aceptables son bien conocidos en la tecnica. Sin importar la via de administracion seleccionada, los compuestos de la presente invencion son formulados para generar formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables mediante procedimientos convencionales conocidos por aquellos con experiencia en la tecnica. Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences.
Las formulaciones de la invencion apropiadas para la administracion oral pueden estar en forma de capsulas, sellos, pildoras, comprimidos, polvos, granulos o como una solucion o una suspension en un liquido acuoso o no acuoso, o una emulsion de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (mediante la utilizacion de una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia), y similares, en los que cada uno contiene una cantidad predeterminada de un compuesto o compuestos utiles en la presente invencion como ingrediente activo. Un compuesto o compuestos utiles en la presente invencion tambien pueden administrarse como bolo, electuario o pasta.
En las formas de dosificacion solidas para la administracion oral (capsulas, comprimidos, pildoras, grageas, polvos, granulos y similares), el/los ingrediente/s activo/s se mezcla/n con uno o mas vehiculos farmaceuticamente aceptables, tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera de los siguientes: (1) agentes de carga o extendedores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o acido silicico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidon de patata o tapioca, acido alginico, ciertos silicatos, y carbonato de sodio; (5) agentes retardadores de solucion, tales como parafina; (6) aceleradores de absorcion, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetilico y monosterato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolin y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, lauril sulfato sodico, y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de capsulas, comprimidos y pildoras, las composiciones farmaceuticas tambien pueden comprender agentes tampones. Las composiciones solidas de un tipo similar pueden emplearse como agentes de carga en capsulas de gelatina con relleno blandas o duras mediante la utilizacion de dichos excipientes como lactosa o azucares de leche, asi como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Un comprimido puede fabricarse mediante compresion o moldeo opcionalmente con uno o mas ingredientes accesorios. Los comprimidos obtenidos por compresion pueden prepararse mediante la utilizacion de agente aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por ejemplo, glicolato de almidon sodico o carboximetilcelulosa sodica reticulada), tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse mediante el moldeo en una maquina apropiada de una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente liquido inerte.
Los comprimidos, y otras formas de dosificacion solidas de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, tales como grageas, capsulas, pildoras y granulos, opcionalmente pueden lograrse o prepararse con
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revestimientos y envolturas, tales como revestimientos entericos y otros revestimientos bien conocidos en la tecnica de formulacion farmaceutica. Tambien pueden formularse para proporcionar la liberacion lenta o controlada del ingrediente activo en el mismo mediante la utilizacion de, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberacion deseado, otras matrices polimericas, liposomas y/o microesferas. Los mismos pueden esterilizarse mediante, por ejemplo, filtracion a traves de un filtro de retencion bacteriana. Estas composiciones tambien pueden opcionalmente contener agentes opacificantes y pueden tener una composicion de manera que liberen solamente el ingrediente activo, o preferencialmente, en una cierta porcion del tracto gastrointestinal, opcionalmente, en una forma retardada. Los ejemplos de composiciones incorporadas que pueden utilizarse incluyen sustancias polimericas y ceras. El ingrediente activo tambien puede estar en forma microencapsulada.
Las formas de dosificacion liquidas para la administracion oral de los compuestos de la invencion incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables. Ademas de el/los ingrediente/s activo/s, las formas de dosificacion liquidas pueden contener diluyentes inertes comunmente utilizados en la tecnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etilico, alcohol siopropilico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencilico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, semilla de algodon, mani, maiz, germen, oliva, aceites de castor y sesamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurilico, polietilenglicoles y esteres de acidos grasos de sorbitan, y mezclas de los mismos.
Ademas de los diluyentes inertes, las composiciones orales tambien pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, emulsionantes y agentes de suspension, agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, aromatizantes y conservantes.
Las suspensiones, ademas de el/los compuesto/s activo/s (s), pueden contener agentes de suspension como, por ejemplo, alcoholes isostearilicos etoxilados, esteres de polioxietilen sorbitol y sorbitano, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.
Las formulaciones de las composiciones farmaceuticas para la administracion rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que puede prepararse mediante la mezcla de uno o mas compuestos de la invencion con uno o mas excipientes o vehiculos no irritantes apropiados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera para supositorio o salicilato, y que es solida a temperatura ambiente, pero liquida a temperatura corporal y, por ello, se derretira en el recto o cavidad vaginal y liberara el compuesto activo. Las formulaciones de la presente invencion que son apropiadas para la administracion vaginal tambien incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de sprays que contienen dichos vehiculos que son conocidos en la tecnica por ser apropiados.
Las formas de dosificacion para la administracion topica o transdermica de los compuestos utiles en la presente invencion incluyen polvos, sprays, unguentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches, gotas e inhalantes. El/los ingrediente/s activo/s puede/n mezclarse en condiciones esteriles con un vehiculo farmaceuticamente aceptable, y con cualquier tampon, o propulsor que pueda requerirse.
Los unguentos, pastas, cremas y geles pueden contener, ademas de el/los ingrediente/s activo/s, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidon, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, acido silicico, talco y oxido de zinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y sprays pueden contener, ademas de el/los ingrediente/s activo/s, excipientes tales como lactosa, talco, acido silicico, hidroxido de aluminio, silicatos de calcio y poliamida en polvo o mezclas de estas sustancias. Los sprays adicionalmente pueden contener propulsores usuales tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volatiles no sustituidos, tales como butano y propano.
Los parches transdermicos tienen la ventaja anadida de proporcionar la administracion controlada de los compuestos de la invencion al cuerpo. Dichas formas de dosificacion pueden fabricarse mediante la disolucion, dispersion o de otra manera la incorporacion de uno o mas compuestos de la invencion en un medio adecuado, para incrementar el flujo del compuesto en toda la piel. La velocidad de dicho flujo puede controlarse mediante la provision de una membrana controladora de velocidad o la dispersion del compuesto en una matriz polimerica o gel.
Las formulaciones farmaceuticas incluyen aquellas apropiadas para la administracion mediante inhalacion o insuflacion o para la administracion nasal o intraocular. Para la administracion al tracto respiratorio inferior o superior (nasal) mediante inhalacion, los compuestos de la invencion convenientemente se administran desde un insuflador, nebulizador o un pack presurizado u otro medio conveniente para administrar spray en aerosol. Los packs presurizados pueden comprender un propulsor apropiado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclolotetrafluoroetano, dioxido de carbono, u otro gas apropiado. In En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificacion puede determinarse mediante la provision de una valvula para administrar una cantidad medida.
Alternativamente, para la administracion mediante inhalacion o insuflacion, la composicion puede tomar la forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla en polvo de uno o mas compuestos de la invencion y una base en polvo apropiada, tal como lactosa o almidon. La composicion en polvo puede presentarse en forma de dosificacion unitaria
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en, por ejemplo, capsulas o cartuchos, o, por ejemplo, gelatina o packs de blister de los que el polvo puede administrarse con la ayuda de un inhalador, insuflador o un inhalador de dosis medida.
Para la administracion intranasal, los compuestos utiles en la invencion pueden administrarse mediante gotas nasales o un spray liquido, tal como mediante un atomizador de botella de plastico o inhalador de dosis medida. Los atomizadores tipicos son Mistometer (Wintrop) y Medihaler (Riker).
Las gotas, tales como gotas de ojos y gotas nasales, pueden formularse con una base acuosa o no acuosa que tambien comprende uno o mas agentes dispersantes, agentes solubilizantes o agentes de suspension. Los sprays liquidaos convenientemente se administran a partir de packs presurizados. Las gotas pueden administrarse mediante una simple botella tapada con gotero para ojos o mediante una botella de plastico para administrar contenidos liquidos en gotas y mediante un cierre con forma especial.
Las composiciones farmaceuticas apropiadas para las administraciones parenterales comprenden uno o mas compuestos utiles en la invencion en combinacion con una o mas soluciones acuosas o no acuosas isotonicas esteriles, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos esteriles farmaceuticamente aceptables que pueden ser reconstituidos en soluciones inyectables esteriles o dispersiones justo antes del uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, solutos que hacen que la formulacion sea isotonica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspension o espesantes.
Los ejemplos de vehiculos acuoso y no acuosos apropiados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas apropiadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de particula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede lograrse mediante la inclusion de agentes que retardan la absorcion tales como monosterato de aluminio y gelatina.
En algunos casos, para prolongar el efecto de el/los ingrediente/s activo/s, es deseable disminuir la velocidad de la absorcion de el/los ingrediente/s activo/s de la inyeccion subcutanea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspension liquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua. La velocidad de absorcion de el/los ingrediente/s activo/s despues depende de su velocidad de disolucion que, a su vez, puede depender del tamano de cristal y forma cristalina. Alternativamente, la absorcion retardada de un ingrediente activo administrado por via parenteral se logra mediante la disolucion o suspension de el/los ingrediente/s activo/s en un vehiculo aceitoso.
Las formas de deposito inyectables se fabrican mediante la formacion de matrices de microcapsula de el/los ingrediente/s activo/s en polimeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relacion de ingrediente/s activo/s y polimero, y la naturaleza del polimero particular empleado, la velocidad de liberacion de el/los ingrediente/s activo/s puede controlarse. Los ejemplos de otros polimeros biodegradables incluyen poli(ortoesteres) y poli(anhidridos). Las formulaciones de deposito inyectables tambien se preparan atrapando el/los ingrediente/s activo/s en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido del cuerpo. Los materiales inyectables pueden esterilizarse por ejemplo, mediante filtracion a traves de un filtro de retencion bacteriana.
Las formulaciones pueden presentarse en recipientes sellados de multiples dosis o dosis unitarias, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden almacenarse en una condicion liofilizada que requiere solamente la adicion del vehiculo liquido esteril, por ejemplo agua para inyeccion, inmediatamente previo al uso. Las soluciones y suspensiones de inyeccion extemporaneas pueden prepararse a partir de polvos, granulos y comprimidos esteriles del tipo descrito mas arriba.
Los objetos, ventajas y nuevas caracteristicas de la presente invencion seran evidentes para aquellos con experiencia en la tecnica con el examen de los siguientes ejemplos de los mismos, que no tienen como objeto ser restrictivos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se extrajo sangre completa de GR283, un voluntario humano con alergias conocidas, en un tubo de vacutainer de vidrio que no contenia ningun anticoagulante. Se dejo que esta sangre coagule, y se elimino el suero mediante centrifugacion y despues se inactivo con calor mediante la colocacion de la misma en un bano de agua a 56'C durante 30 minutos. Tambien se extrajo sangre completa de GR283 en un tubo de vacutainer de vidrio que contenia heparina y se utilizo para el aislamiento de linfocitos de sangre periferica (PBL) de la siguiente manera. La sangre
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completa se coloco en capas sobre solucion Histopaque 1077 a temperatura ambiente y se centrifugo a 2000 r.p.m. durante 15 minutos a temperatura ambiente. Despues se eliminaron las celulas en la interfaz de plasma-Histopaque y se lavaron con medio de cultivo (medio IMDM con suero de GR283 inactivado con calor al 10% mas penicilina/estreptomicina al 1%) a 37 'C.
Se anadieron el compuesto de formula II (vease mas arriba) y metilfenidato (ambos obtenidos de Dr. Jeffrey D. Winkler, University of Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania) en medio de cultivo a pocillos de una placa de 96 pocillos para dar las concentraciones finales de 5 !g/ml, 15 !g/ml y 50 !g/ml del compuesto de formula II de metilfenidato. Se utilizaron agua de 18 MO esteril, el disolvente para el compuesto de formula II, y dexametasona (obtenida de Sigma) (concentracion final de 10 !g/ml en agua) como controles. Despues, Se anadieron los PBL de GR283 en medio de cultivo a los pocillos para dar una concentracion final de 150.000 celulas por pocillo, y se incubaron las placas a 37'C, CO2 al 5% durante 24 horas. Despues de esta incubacion, se anadio fitohemaglutinina (PHA) en medio de cultivo para dar concentraciones finales de 2 !g/ml, 5 !g/ml o 20 !g/ml, volumen final total de 200 !l/pocillo, y se incubaron las celulas durante 72 horas adicionales a 37'C, CO2 al 5%. Todos los cultivos se realizaron por triplicado.
Al final de esta incubacion, se examino la agregacion celular mediante el fotografiado de pocillos representativos con una camara digital montada a un microscopio invertido. El compuesto de formula II redujo la cantidad de agregacion celular inducida por 5 !g/ml de PHA en forma dependiente de la dosis. El compuesto de formula II atenuo la agregacion celular, presumiblemente, como resultado de una disminucion en la expresion de moleculas de adhesion celular en las superficies de las celulas.
Se ensayo la proliferacion celular mediante la adicion de 20 !l de solucion de titulacion celular Promega a cada pocillo y mediante la incubacion de la placa durante 4 horas adicionales. La solucion de titulacion celular Promega es una solucion que contiene una tintura de tetrazolio que es reducida por las celulas vivientes a una tintura de formazano, y esta reduccion es proporcional al numero de celulas vivientes presentes en el pocillo. Despues de la incubacion de 4 horas, se midio la densidad optica (DO) a 530 nm de cada pocillo. La DO a 530 nm para los pocillos para el blanco que no contenian ninguna celula se sustrajo de la DO de los pocillos experimentales. Los resultados de los ensayos de proliferacion se presentan en las Figuras 1A-C. Tal como puede observarse a partir de las Figuras 1A-C, el compuesto de formula II (Comp. II) y dexametasona (Dex) inhibieron significativamente la proliferacion de PBL estimulados con PHA en una forma dependiente de la dosis. El metilfenidato (MP) mostro un efecto significativo en su dosis mas alta y la dosis mas baja de PHA. Por el contrario, el metilfenidato no redujo significativamente la proliferacion de PBL estimulados con PHA.
Ejemplo 2
Se extrajo sangre completa de GR467, un voluntario humano con alergias conocidas, y se procedio segun lo que se describe en el Ejemplo 1 para dar suero inacitvado con calor y PBL. El compuesto de formula II y el metilfenidato en medio de cultivo (fabricado mediante la utilizacion de suero de GR467 inactivado con calor) se anadieron a los pocillos de una placa de 96 pocillos para dar concentraciones finales de 5 !g/ml, 15 !g/ml y 25 !g/ml del compuesto de formula II y 15 !g/ml de metilfenidato. Se utilizaron agua y dexametasona (concentracion final de 10 !M) como controles. Despues, se anadieron los PBL de GR467 en medio de cultivo a los pocillos para dar una concentracion final de 150.000 celulas por pocillo, y se incubaron las placas a 37'C, CO2 al 5% durante 24 horas. Despues de esta incubacion, se anadio PHA para dar una concentracion final de 2 !g/ml, volumen final total de 200 !l/pocillo, y se incubaron las celulas durante 72 horas adicionales a 37'C, CO2 al 5%. Todos los cultivos se realizaron por triplicado.
Al final de esta incubacion, se determino la proliferacion celular segun lo que se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Figura 2. Tal como puede observarse a partir de la Figura 2, el compuesto de formula II (Comp. II) y dexametasona (Dex) inhibieron significativamente la proliferacion de PBL, ambos no estimulados y estimulados con PHA, mientras que el metilfenidato no lo hizo.
La liberacion de citocinas mediante los PBL tambien se midio mediante el cultivo de PBL en tubos de 1 ml, a 1,3 x 106 celulas por ml, con 15 !g/ml del compuesto de formula II, 15 !g/ml de metilfenidato o 10 !M de dexametasona a 37'C, CO2 al 5% durante 24 horas. Despues de esta incubacion, se anadio PHA para dar una concentracion final de 2 !g/ml, y se incubaron las celulas durante 96 horas adicionales a 37'C, CO2 al 5%. Todos los cultivos se realizaron por triplicado. Despues se eliminaron las celulas mediante centrifugacion a 1000 r.p.m. durante 10 minutos, y se recolecto el medio de cultivo.
Se midio la liberacion de IL-13 e interferon gamma (IFNy) en el medio de cultivo mediante ELISA. Para llevar a cabo ELISA, se compraron pares apareados de anticuerpos contra IL-13 e IFNy humana en Pierce Biotechnology y Biosource, respectivamente. Las placas de pocillos con tira para ELISA se revistieron con 10 !g/ml de anticuerpo (en solucion salina tamponada con fosfato (PBS)) contra IL-13 y 4 !g/ml de anticuerpo contra IFNy (en PBS) durante toda la noche a temperatura ambiente. Despues se bloquearon las placas mediante la utilizacion de una solucion de BSA al 4% en PBS durante una hora, seguido por la adicion de 50 !l de medio de cultivo experimental por pocillo por duplicado. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante una hora y despues se lavaron mediante la utilizacion de 50 mM de Tris pH 8,0 con Tween 20 al 0,1%. Despues, soluciones de 400 ng/ml del segundo anticuerpo biotinilado contra IL-13 y 500 ng/ml segundo anticuerpo biotinilado contra IFNy se convirtieron en tampon
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de bloqueo, y se anadieron 100 !l por pocillo. Se incubaron las placas durante 1 hora y se lavaron nuevamente. Un conjugado de dilucion 1:8000 de estrepavidina HRP (Pierce Biotechnology) se convirtio en tampon de bloqueo, y se anadieron 100 !l a los pocillos y la incubacion continuo durante 30 minutos. Se llevo a cabo una etapa de lavado final, despues del que se anadieron 100!l de sustrato TMB de Pierce Biotechnology a cada pocillo. Se desarrollo el color durante 30 minutos y se interrumpio mediante la adicion de 100 !l de H2SO4 0,18 N. Se determino la DO mediante la utilizacion de lector de microplaca con filtro a 450 nM.
Los resultados para IL-13 se muestran en la Figura 3. Tal como puede observarse, el compuesto de formula II (Comp. II) y la dexametasona (Dex) inhibieron significativamente la liberacion de IL-13 inducida por PHA. El metilfenidato (MP) no inhibio la liberacion de IL-13. En efecto, el metilfenidato incremento la liberacion de IL-13 mediante celulas estimuladas con PHA.
Los resultados para IFNy se muestran en la Figura 4. Tal como puede observarse, el compuesto de formula II (Comp. II) y la dexametasona (Dex) inhibieron significativamente la liberacion de IFNy tanto en celulas no estimuladas como en celulas estimuladas con PHA. El metilfenidato (MP) tuvo algun efecto en la liberacion de IFNy mediante las celulas no estimuladas, pero no suprimio significativamente la liberacion de IFNy de las celulas estimuladas con PHA. En efecto, el metilfenidato incremento la liberacion de IFNy mediante las celulas estimuladas con PHA.
Ejemplo 3
Se extrajo sangre completa de GR191, un voluntario humano normal, y se procedio segun lo que se describe en el Ejemplo 1 para dar suero inacitvado con calor y PBL. Se anadieron el compuesto de formula II y metilfenidato en medio de cultivo (fabricado mediante la utilizacion de suero de GR191 inactivado con calor) a pocillos de una placa de 96 pocillos para dar concentraciones finales de 5 !g/ml, 15 !g/ml, 25 !g/ml y 50 !g/ml del compuesto de formula II y 50 !g/ml de metilfenidato. Se utilizaron agua, factor de crecimiento nervioso de raton (Upstate Biotechnology, Inc) (NGF) (concentracion final de 250 ng/ml) y dexametasona (concentracion final de 10 !M) como controles. Despues, se anadieron PBL de GR191 en medio de cultivo a los pocillos para dar una concentracion final de 150.000 celulas por pocillo, y se incubaron las placas a 37'C, CO2 al 5% durante 24 horas. Despues de esta incubacion, se anadio PHA para dar concentraciones finales de 2 !g/ml y 5 !g/ml, volumen final total de 200 !l/pocillo, y se incubaron las celulas durante 72 horas adicionales a 37'C, CO2 al 5%. Todos los cultivos se realizaron por triplicado.
Al final de esta incubacion, se determino la proliferacion celular segun lo que se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en las Figuras 5A-B. Tal como puede observarse a partir de las Figuras 5A-B, el compuesto de formula II (Comp. II) y dexametasona (Dex) inhibieron significativamente la proliferacion de PBL, tanto no estimulados como estimulados con PHA, mientras que el metilfenidato (MP) no lo hizo.
Tambien se midio la liberacion de citocinas mediante los PBL mediante el cultivo de PBL en tubos de 1 ml, a 1 x 106 celulas por ml, con 15 !g/ml y 50 !g/ml del compuesto de formula II o 10 !M de dexametasona a 37'C, CO2 al 5% durante 24 horas. Despues de esta incubacion, se anadio PHA para dar una concentracion final de 5 !g/ml, y se incubaron las celulas durante 72 horas adicionales a 37'C, CO2 al 5%. Todos los cultivos se realizaron por triplicado. Despues se eliminaron las celulas mediante centrifugacion a 1000 r.p.m. durante 10 minutos.
Se recolectaron los sobrenadantes, y se midieron las concentraciones de IL-13 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) en los sobrenadantes mediante ELISA. ELISA de IL-13 se llevo a cabo segun lo que se describe en el Ejemplo 2. Los resultados se presentan en la Figura 6. Tal como puede observarse en la Figura 6, el compuesto de formula II (Comp. II) y dexametasona (Dex) inhibieron significativamente la liberacion de IL-13 de los PBL estimulados con PHA.
ELISA para TNFa se llevo a cabo segun lo que se describe en el Ejemplo 2 mediante la utilizacion de anticuerpos de pares apareados de Pierce Endogen (2 !g/ml para el anticuerpo de revestimiento y 250 ng/ml para el segundo anticuerpo). Los resultados se presentan en la Figura 7. Tal como puede observarse en la Figura 7, el compuesto de formula II (Comp. II) y dexametasona (Dex) inhibieron significativamente la liberacion de TNFa de los PBL estimulados con PHA.
Las celulas ademas se analizaron mediante citometria de flujo. Se utilizo anexina para determinar las poblaciones de celulas muertas o que esten muriendo. Se utilizo anticuerpo anti-CD69 para establecer el nivel de activacion celular. Tambien se utilizo el anticuerpo contra el receptor a� de celulas T (TCR). Se compraron anexina 5 recombinantes (conjugados de PE y FITC) y los anticuerpos en Caltag (Burlingham, CA) y se utilizaron siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se observaron los siguientes resultados.
Muerte celular:
El tenido con anexina de las celulas TCR positivas aumento de 7,3% (fondo) a 45% y 23% con 50 !g/ml y 15 !g/ml del compuesto de formula II, respectivamente, significando un incremento en la muerte celular en la poblacion de celulas T. La estimulacion con PHA en 5 !g/ml incremento el tenido con anexina de las celulas TCR positivas a 67%. Esto indica que PHA tambien puede inducir la muerte celular en la poblacion de celulas T. La muerte celular disminuyo levemente como resultado del tratamiento con PHA mas 15 !g/ml del compuesto de formula II (62% de
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las celulas TCR positivas tenidas para anexina con PHA y IMM 0001 versus 67% con PHA solo). PHA mas 50 !g/ml del compuesto de formula II causo 87% de muerte celular en el subconjunto TCR positivo de celulas segun lo observado por el tenido con anexina. Estos resultados muestran que la mayor concentracion de 50 !g/ml del compuesto de formula II causo la muerte significativa de las celulas T, mientras que la concentracion inferior de 15 !g/ml no lo hizo. La dexametasona rescato el incremento inducido por PHA en el tenido con anexina de las celulas TCR positivas (disminuyo de 84% a 48%), demostrando que el compuesto de control esta funcionando adecuadamente.
Activación de células T:
El tenido con CD69 � TCR (celulas T activadas) no se detecto en ninguno de los controles (nil, el compuesto de formula II solo y dexametasona sola). PHA incremento el tenido con CD69 � TCR al 84%. Solamente PHA causo la activacion de celulas T segun lo detectable por el incremento en el tenido de CD69. El tenido con CD69 � TCR de las celulas estimuladas con PHA cayo de 84% a 54% con 50 !g/ml del compuesto de formula II y a 64% con 15 !g/ml del compuesto de formula II. La dexametasona fue menos efectiva que el compuesto de formula II en la reduccion del tenido con CD69 � TCR de las celulas estimuladas con PHA. De ese modo, el compuesto de formula II es mas efectivo en la disminucion de la activacion de celulas T que la dexametasona, un potente antiinflamatorio.
Ejemplo 4
Se extrajo sangre completa de GR-192, un voluntario humano normal, y se proceso segun lo que se describe en el Ejemplo 1 para dar suero inactivado con calor y PBL. Despues, los PBL de GR-192 se cultivaron en tubos de 1 ml, a 1,3 x 106 celulas por ml, con 15 !g/ml del compuesto de formula II (en medio de cultivo fabricado mediante la utilizacion de suero de GR-192 inactivado con calor al 10%) o 10 !M de dexametasona, a 37'C, CO2 al 5% durante 24 horas. Despues de esta incubacion, se anadio PHA para dar una concentracion final de 2 !g/ml, y se incubaron las celulas durante 96 horas adicionales a 37'C, CO2 al 5%. Todos los cultivos se realizaron por triplicado. Despues se eliminaron las celulas mediante centrifugacion a 1000 r.p.m. durante 10 minutos, y se recolecto el medio de cultivo.
La liberacion de IL-8 en el medio de cultivo se midio mediante ELISA. Para llevar a cabo ELISA, se compraron pares apareados de anticuerpo contra IL-8 humana en Pierce Biotechnology y Biosource, respectivamente. Las placas de pocillos con tira de ELISA se revistieron con 2 !g/ml de anticuerpo contra IL-8 (en solucion salina tamponada con fosfato (PBS)) durante toda la noche a temperatura ambiente. Las placas despues se bloquearon mediante la utilizacion de una solucion de BSA al 4% en PBS durante una hora, seguido por la adicion de 50 !l de medio de cultivo experimental por pocillo por duplicado. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante una hora y despues se lavaron mediante la utilizacion de 50 mM de Tris pH 8,0 con Tween 20 al 0,1 %. Despues, se fabricaron soluciones de 100 ng/ml del segundo anticuerpo biotinilado contra IL-8 en tampon de bloqueo, y se anadieron 100 !l por pocillo. Se incubaron las placas durante 1 hora y se lavaron nuevamente. Se hizo una dilucion de 1:8000 de conjugado de estrepavidina HRP (Pierce Biotechnology) en tampon de bloqueo, y se anadieron 100 !l a los pocillos y la incubacion continuo durante 30 minutos. Se llevo a cabo una etapa de lavado final, despues de la que se anadieron 100 !l de sustrato TMB de Pierce Biotechnology a cada pocillo. Se desarrollo el color durante 30 minutos y se interrumpio mediante la adicion de 100 !l de H2SO4 0,18 N. Se determino la DO mediante la utilizacion de lector de microplaca con un filtro 450 nm.
Los resultados se muestran en la Figura 8. Tal como puede observarse, el compuesto de formula II (Comp. II) y dexametasona (Dex) inhibieron significativamente la liberacion de IL-8 inducida por PHA.
Una linea celular de linfocitos T humanos CD4 positivos (TRiPS), que se aislo de un dador inmunizado contra la influenza y es especifica para el peptido de hemaglutinina 307-319, se estimulo para el pasaje mediante la utilizacion de aproximadamente 4x105 celulas el dia 18-20 despues de una estimulacion previa. Se lavaron las celulas una vez en Medio Esencial Minimo modificado por Dulbecco de Iscove frio (IMDM, Sigma) mas suero fetal bovino al 10% (FCS; American Type Culture Collection (ATCC)) y se resuspendieron en 1,0 ml de medio IMDM frio que contenia una dilucion de 1:500 de anticuerpo monoclonal anti-CD3 OKT3 (preparado de liquido ascitico de raton). Se incubaron las celulas con anticuerpo durante 30 minutos en hielo, despues se lavaron con medio frio sin FCS y se combinaron con aproximadamente 2x106 leucocitos de sangre periferica (PBL) de dador humano normal irradiado con 4000R, como celulas nutrientes, en medio mas 50 U/ml de IL-2 humana (�enometrix). Los cultivos se expandieron mediante la adicion de medio IMDM fresco con FCS mas IL-2 el dia 3. Se midio el dia de cultivo desde el dia de estimulacion con OKT3. Pueden utilizarse celulas para los experimentos que comienzan el dia 7 (en maxima proliferacion), tipicamente el dia 14 (mucho mas sensible a la reestimulacion) y hasta el dia 21 (celulas en reposo alcanzando la senectud).
Se llevaron a cabo experimentos de activacion mediante el retiro de una alicuota de celulas y lavando dos veces con IMDM calentado (37'C). Para cada ensayo especifico, 2x105 celulas viables se preincubaron en un volumen total de 0,9 ml de medio IMDM calentado que contenia 15 !g/ml del compuesto de formula II o 10 !M de dexametasona durante 15 minutos a 37'C. Despues se anadio una alicuota de 2x105 de CD3/CD28 Dynabeads (Dynal), como estimulo activador, en 0,1 ml de IMDM calentado, y los cultivos se incubaron durante 24 horas a 37'C. Los sobrenadantes de los cultivos celulares se cosecharon despues de peletizar las celulas mediante centrifugacion.
Se ensayo el contenido de citocina mediante ELISA de IL-8 especifico segun lo que se describe mas arriba. Se descubrio que el compuesto de formula II no tuvo ningun efecto en la produccion de IL-8 mediante la linea celular TRiPS.
Ejemplo 5
5 THP-1 es una linea celular de monocitos obtenidos de American Type Culture Collection (ATCC) (catalogo Num. TIB-202). Las celulas THP-1 se colocaron en medio (RPMI que contenia suero fetal bovino al 10 % (FCS) (obtenido de ATCC) y 8 ng/ml de monotioglicerol (obtenido de Sigma)) en una concentracion de 250.000 celulas por ml y se incubaron con 15 !g/ml del compuesto de formula II o 10 !M de dexametasona durante una hora a 37'C y CO2 al 5%. Despues de 1 hora, se anadio lipopolisacarido (LPS) (obtenido de Sigma) a los cultivos para dar una
10 concentracion final de 200 ng/ml, y las celulas despues se incubaron durante 4 horas adicionales o durante 24 horas adicionales. Despues de la incubacion, las celulas se centrifugaron, y se recolectaron los sobrenadantes. Las concentraciones de IL- 8 y TNFa en los sobrenadantes se determinaron mediante ELISA.
Las concentraciones de IL-8 en los sobrenadantes se determinaron mediante ELISA llevado a cabo segun lo que se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se presentan en la Tabla 1 mas abajo. Tal como puede observarse en la
15 Tabla 1, el compuesto de formula II (Comp. II) y la dexametasona (Dex) inhibieron significativamente la liberacion de IL-8 de los monocitos estimulados con LPS.
ELISA de TNFa se llevo a cabo segun lo que se describe en el Ejemplo 2. Los resultados se presentan en la Tabla 2 mas abajo. Tal como puede observarse en la Tabla 2, el compuesto de formula II (Comp. II) y la dexametasona (Dex) inhibieron significativamente la liberacion de TNFa de los monocitos estimulados con LPS.
20 TABLA 1
Muestra
Tiempo de incubacion Concentracion media de IL-8 (pg/ml) % de inhibicion
Control (sin aditivos)
4 horas 75,96 � 12,73 N/A
LPS
4 horas 2844,60 � 180,55 N/A
LPS� Comp. II
4 horas 2185,00 � 78,30 23%
LPS � Dex
4 horas 2102,18 � 52,20 26%
Control (sin aditivos)
24 horas 46,09 � 22,42 N/A
LPS
24 horas 6653,20 � 193,18 N/A
LPS � Comp. II
24 horas 4490,20 � 264,46 33%
LPS � Dex
24 horas 2300,00 � 283,41 66%
TABLA 2
Muestra
Tiempo de incubacion Concentracion media de TNFa (pg/ml) % de inhibicion
Control (sin aditivos)
24 horas 1,415 � 1,464 N/A
LPS
24 horas 138,655 � 0,601 N/A
LPS � Comp. II
24 horas 65,370 � 0,891 53%
LPS � Dex
24 horas 94,759 � 8,755 32%
Ejemplo 6
25 Las celulas de la linea celular de fibroblatos murinos MC/9 (obtenida de ATCC, catalogo Num. CRL- 8305) se colocaron en los pocillos de una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos a 25.000 celulas /pocillo. El medio de cultivo era Medio de Eagle Modificado por Delbecco (DMEM) (obtenido de Cambrex) que contenia suero fetal bovino al 10% (FCS) (obtenido de ATCC). Los pocillos de control Nil no contenian aditivos. Los pocillos restantes contenian 25 ng/ml de factor de crecimiento nervioso murino (NGF) (obtenido de Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) o 25
30 ng/ml de NGF y TSTIM al 5% (un complemento de cultivo preparado a partir de ratas y que contenia concanavalina A que se obtuvo de BD Biosciences). Ademas, se anadieron los siguientes aditivos a las celulas: agua (control de vehiculo); 5 gg/mL del compuesto de formula II (Comp. II); 15 !g/ml de Comp. II; o 30 !g/ml de Comp. II. Despues de 72 horas de cultivo a 37 'C y CO2 al 5%, se evaluo la proliferacion celular mediante el ensayo de titulacion celular de Promega segun lo que se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 3 mas abajo.
TABLA 3
Aditivo
DO media 530 nm
Sin aditivos
0,058 � 0,008
NGF
0,116 � 0,029
NGF � agua
0,101 � 0,022
NGF � 1 !g/ml de Comp. II
0,117 � 0,015
NGF � 5 !g/ml de Comp. II
0,108 � 0,012
NGF � 15 !g/ml de Comp. II
0,049 � 0,016
NGF � TSTIM
0,490 � 0,047
NGF � TSTIM � agua
0,365 � 0,026
NGF � TSTIM � 1 !g/ml de Comp. II
0,428 � 0,027
NGF � TSTIM � 5 !g/ml de Comp. II
0,373 � 0,016
NGF � TSTIM � 15 !g/ml de Comp. II
0,326 � 0,024
Ejemplo 7
Las celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) de Pasaje 4 (es decir, cuatro duplicaciones de poblacion celular), lote numero 9713 de fuente humana (obtenido de ATCC), se colocaron en los pocillos de la placa
10 de cultivo de tejido de 48 pocillos a 20.000 celulas/pocillo en 500 !l de medio completo de medio de crecimiento endotelial 2 (EGM-2) (pero sin suero o ascorbato) (obtenido de Cambrex) complementado con ITSS (insulina, transferina y selenita de sodio) (obtenido de Sigma). Tambien, las HUVECs de pasaje 4, lote numero 7016 de fuente humana (obtenido de ATCC), se colocaron en los pocillos de la placa de cultivo de tejido de 48 pocillos a 20.000 celulas/pocillo en 500 !l de medio completo de EGM-2 (pero sin suero o ascorbato) complementado con ITSS. Los
15 siguientes aditivos se anadieron a las celulas: agua (control de vehiculo) y 15 !g/ml del compuesto de formula II (Comp. II). Despues de la incubacion durante 1 hora a 37 'C y CO2 al 5%, se anadio lipopolisacarido (LPS) (obtenido de Sigma) para dar una concentracion final de 200 ng/ml, y se incubaron las celulas durante toda la noche a 37'C y CO2 al 5%. Despues de esta incubacion, los sobrenadantes se recolectaron, y se determino la cantidad de IL-8 en los sobrenadantes mediante ELISA segun lo que se describe en el Ejemplo 4.
20 Los resultados se muestran en la Tabla 4 mas abajo. Tal como puede observarse en la Tabla 4, el Comp. II elimino por completo la liberacion de IL-8 mediante las HUVECs 7016 y disminuyo la liberacion de IL-8 en un 90% en las HUVECs 9713.
TABLA 4
Celulas
Tratamiento IL-8 (pg/ml)
HUVECs 7016
Control (LPS solamente) 53,3
HUVECs 7016
LPS � 15 !g/ml de Comp. II Por debajo de la deteccion
HUVECs 9713
Control (LPS solamente) 485,0
HUVECs 9713
LPS � 15 !g/ml de Comp. II 49,8
25 Ejemplo 8 Las HUVECs del pasaje 4, lote numero 8710 de fuente humana (obtenido de ATCC), se colocaron en los pocillos de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos a 5.000 celulas/pocillo en medio EGM-2 (obtenido de Cambrex) y se 14
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cultivaron durante 72 horas a 37'C y CO2 al 5%. Despues, el medio se reemplazo con medio fresco, y se anadieron los siguientes aditivos a las celulas: agua (control de vehiculo); 1 !g/ml, 5 !g/ml, 10 !g/ml, 15 !g/ml o 30 !g/ml del compuesto de formula II (Comp. II); 15 g/ml de metilfenidato (MP); 10 !M de LY 294002 (un inhibidor de quinasa PI3 obtenido de Sigma); o 10 !M de dexametasona (Dex). Despues de la incubacion durante 1 hora a 37'C y CO2 al 5%, se anadio TNFa (obtenido de Pierce) para dar una concentracion final de 10 ng/ml, y se incubaron las celulas durante 18 horas adicionales a 37'C y CO2 al 5%. Despues de esta incubacion, los sobrenadantes se recolectaron, y la cantidad de IL-8 en los sobrenadantes se determino mediante ELISA segun lo que se describe en el Ejemplo 4.
Los resultados se muestran en la Tabla 5 mas abajo. Tal como puede observarse en la Tabla 5, el Comp. II disminuyo la liberacion de IL-8 estimulada por TNFa en forma dosis dependiente, aunque parecio que hubo alguna muerte celular causada por la dosis mas alta (30 !g/ml). Dex y MP levemente disminuyeron la liberacion de IL-8 y LY 294002 redujo significativamente la liberacion de IL-8.
TABLA 5
Tratamiento
IL-8 media (pg/ml) Valor p % de inhibicion
Sin aditivos
207,15 � 66,17
30 !g/ml de Comp. II
0
15 !g/ml de Comp. II
400,35
10 ng/ml de TNFa
34695 � 301,9
10 ng/ml de TNFa � agua
35572 � 967,74
10 ng/ml de TNFa � 30 !g/ml de Comp. II
4829,8 � 214,13 86,93%
10 ng/ml de TNFa � 15 !g/ml de Comp. II
20817 � 674,63 0,002 41,72%
10 ng/ml de TNFa � 10 !g/ml de Comp. II
22050 � 727,27 0,003 38,24%
10 ng/ml de TNFa � 5 !g/ml de Comp. II
34482 � 2127,22 0,124 3,08%
10 ng/ml de TNFa � 1 !g/ml de Comp. II
53657 � 3935,18 0,011 (-51,1%)
10 ng/ml de TNFa � 15 !g/ml de MP
30183 � 3448,01 0,051 15,24%
10 ng/ml de TNF a � 10 !M LY 294002
9196,1 � 150,97 74,58%
10 ng/ml de TNFa � 10 !M de Dex
35952 � 2197,14 0,072 6,88%
Ejemplo 9
El factor de transcripcion NFxB (factor nuclear xB) esta implicado en la regulacion de la expresion de una amplia variedad de genes que codifican los mediadores de las respuestas inflamatoria, de fase aguda e inmune. Existen cinco subunidades de la familia de NF xB en mamiferos: p50, p65 (RelA), c-Rel, p52 y RelB. Los heterodimeros p50/p65 y los homodimeros p50 son los dimeros mas comunes encontrados en la via de senalizacion NF xB. NF xB puede ser activado mediante un numero de estimulos, incluyendo componentes de paredes celulares bacterianas, tales como lipopolisacarido, o citocinas inflamatorias, tales como TNFa o IL-1�.
La proteina 1 activadora (AP-1) es un factor de transcripcion que puede ser activado durante el ciclo celular para promover la supervivencia celular, diferenciacion y respuestas adaptativas. Las proteinas AP-1 desempenan un papel en la expresion de muchos genes involucrados en la proliferacion y progreso del ciclo celular. Por ejemplo, la transformacion celular mediante oncogenes que funcionan en la via de transduccion del factor de crecimiento, tales como ras, rasF y mek, da como resultado un alto incremento en la expresion proteica del componente AP-1. Por ello, los genes regulados con AP-1 soportan el proceso invasivo observado durante la malignidad y metastasis. AP-1 pertenece a una gran familia de factores de transcripcion estructuralmente relacionados que incluyen ATFI-4, c-Fos, c-Jun, c-Myc y C/EBP. AP-1 esta compuesto de una mezcla de complejos heterodimericos de proteinas obtenidos de las familias Fos y Jun, incluyendo c-Fos, FosB, Fra-1, Fra-2, c-Jun, JunB y JunD. Basicamente, los dimeros de AP1 se unen al ADN en un elemento de respuesta a TPA (TRE). La expresion de AP-1 esta inducida por multiples estimulos tales como suero, factores de crecimiento, esteres forbol, oncogenes, citocinas del TGF-�, familias de TNF e interferon, depolarizacion neuronal y estres celular.
HUVECs de pasaje 5, lote numero 8750 de fuente humana (obtenido de ATCC), se hicieron crecer a confluencia en frascos de 25 cm2 en medio EGM-2. Los siguientes aditivos se anadieron a los frascos (volumen total de 5 ml/frasco)
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en medio EGM-2 que contenia FCS al 2%, GA1000 (gentamicinan), heparina y acido ascorbico (todo de Cambrex): 1 !g/ml del compuesto de formula II (Comp. II); 5 !g/ml de Comp. II; 15 !g/ml de Comp. II; 15 !g/ml de metilfenidato (MP); o 10 !M de LY 294002. Los frascos se incubaron durante toda la noche a 37 'C, CO2 al 5%. Despues de esta incubacion, se anadio factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (obtenido de Sigma) para dar una concentracion final de 10 ng/ml, y los frascos se incubaron durante 30 minutos adicionales.
Despues, se determino la cantidad de NFKB mediante la utilizacion de un Kit de Ensayo de Transcripcion de NFKB p65/NFKB p50 TransAMT y un Kit de Extracto Nuclear de Active Motif North America, Carlsbad, CA, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En resumen, se preparo un extracto nuclear de las celulas mediante la utilizacion del Kit de Extracto Nuclear. Despues, el extracto nuclear se anadio a los pocillos de la placa de 96 pocillos del kit de TransAMT. Se inmovilizo el oligonucleotido que contenia un sitio de union al consenso NFKB en los pocillos, y el NFKB activado contenido en el extracto nuclear se unio al oligonucleotido. Despues, se anadio un anticuerpo dirigido contra la subunidad p65 o p50 de NFKB, y se detecto el complejo NFKB unido al oligonucleotido. Despues se anadio un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP) para proporcionar una lectura colorimetrica que se cuantifico mediante espectrofotometria (medicion a 450 nm).
La cantidad de c-Jun se determino mediante la utilizacion de un Kit de Ensayo de Transcripcion de la familia AP-1 m TransAMT y un Kit de Extracto Nuclear de Active Motif North America, Carlsbad, CA, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En resumen, se preparo un extracto nuclear de las celulas mediante la utilizacion del Kit de Extracto Nuclear. Despues, el extracto nuclear se anadio a los pocillos de una placa de 96 pocillos en la que se inmovilizo el oligonucleotido que contenia un elemento de sensible a TPA (TRE). Los dimeros de la proteina-1 activadora (AP-1) contenidos en el extracto nuclear se unieron a este oligonucleotido y se detectaron mediante la utilizacion de un anticuerpo especifico para c-Jun. Despues se anadio un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP) para proporcionar una lectura colorimetrica que se cuantifico mediante espectrofotometria (medicion a 450 nm).
Los resultados se muestran en las Tablas 6 y 7 mas abajo. Tal como puede observarse a partir de la Tabla 6, el tratamiento VEGF de HUVECs causo casi una duplicacion de NFKB activado segun lo detectado por el ensayo TransAM. El Comp. II en 15 !g/ml y 5 !g/ml redujo la cantidad de NFKB activado de nuevo a los niveles basales. Tal como puede observarse a partir de la Tabla 7, el tratamiento VEGF de HUVECs causo un incremento de c-Jun. El Comp. II en 15 !g/ml y 5 !g/ml elimino completamente el incremento en la cantidad de c-Jun.
TABLA 6
Muestra
DO media 450 nm ((NFKB)
Control (sin aditivos)
0,070 � 0,002
VEGF solamente
0,111 � 0,007
VEGF � 15 !g/ml de Comp. II
0,060 � 0,008
VEGF � 5 !g/ml de Comp. II
0,065 � 0,010
VEGF � 1 !g/ml de Comp. II
0,097 � 0,013
VEGF � 15 !g/ml de MP
0,093 � 0,011
VEGF � 10 !M de LY 294002
0,138 � 0,008
TABLA 7 10
Muestra
DO media 450 nm (c-Jun)
Control (sin aditivos)
0,204 � 0,016
VEGF solamente
0,261 � 0,013
VEGF � 15 !g/ml de Comp. II
0,204 � 0,010
VEGF � 5 !g/ml de Comp. II
0,185 � 0,025
VEGF � 1 !g/ml de Comp. II
0,221 � 0,008
VEGF � 15 !g/ml de MP
0,230 � 0,016
VEGF � 10 !M de LY 294002
0,340 � 0,020
35 E06719144 20-10-2011
Ejemplo 10
Las celulas endoteliales de arteria iliaca humana (HIAECs) de pasaje 8 (obtenidas de ATCC; catalogo Num. CC2545) se hicieron crecer a confluencia en frascos de 25 cm2 en medio EGM-2. Dieciocho horas previo al experimento, el medio se reemplazo con medio EGM-2 que contenia FCS al 0,1% mas heparina, GA1000 (gentamicina) y extracto pituitario bovino (todo de Cambrex) para colocar las celulas en un estado de reposo. Para llevar a cabo el experimento el medio se aspiro de los frascos, y se anadieron los siguientes aditivos a los frascos en medio fresco (volumen total de 5 ml/frasco): 15 !g/ml del compuesto de formula II (Comp. II) o 10 !M de LY 294002. Los frascos se incubaron 2 horas a 37'C CO2 al 5%. Despues de esta incubacion, se anadio VEGF o TNFa para dar una concentracion final de 10 ng/ml, y los frascos se incubaron durante 30 minutos adicionales. Despues, la cantidad de NFKB se determino mediante la utilizacion de un Kit de Ensayo de Transcripcion de NFKB p65/NFKB p50TransAMT y un Kit de Extracto Nuclear de Active Motif North America, Carlsbad, CA, segun lo que se describe en el Ejemplo 9.
Los resultados se muestran en la Tabla 8 mas abajo. Tal como puede observarse a partir de la Tabla 8, el tratamiento con TNFa de HUVECs causo un incremento extremadamente grande en la cantidad de NFKB activado segun lo detectado por el ensayo de TransAM. El Comp. II en 15 !g/ml redujo la cantidad de NFKB activado en aproximadamente un 82%. El tratamiento con VEGF no dio como resultado un incremento tan grande en el NFKB activado como lo que se logro con TNFa, pero la cantidad incrementada se redujo en un 70% por el Comp. II.
TABLA 8
Muestra
DO Media 450 nm (NFKB) Porcentaje de inhibicion
Control (sin aditivos)
0,174 � 0,004
TNFa solamente
0,881 � 0,021
TNFa � 15 !g/ml de Comp. II
0,302 � 0,003 81,89%
TNFa � 10 Mm de LY 294002
0,810 � 0,007 10,04%
VEGF solamente
0,220 � 0,007
VEGF � 15 !g/ml de Comp. II
0,066 � 0,005 70,00%
Ejemplo 11
Las celulas TRiPS del dia 18, 1x106, se incubaron durante 30 minutos a 37'C, con nada anadido ("Nil"), con 1 !l de Dynabeads CD3/CD28 (Dynal, Oslo, Norway) ("perlas CD3/CD28 ") por 100.000 celulas, o con perlas CD3/CD28 y 15 !g/ml del compuesto de formula II (Comp. II). Despues de la incubacion, las celulas se lisaron en Reactivo de Extraccion Celular de Mamifero Litico celular (Sigma). Despues de la centrifugacion hasta desechos celulares en pelets se obtuvieron los sobrenadantes (extractos celulares).
Los extractos celulares (supernadantes) despues se analizaron mediante la utilizacion de Custom AntibodyArray T fabricado por Hypromatrix Inc., Worcester, MA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Custom AntibodyArray T es una membrana de nylon con transferencia de anticuerpos contra las proteinas detalladas mas abajo. En resumen, los extractos celulares se incubaron con Custom AntibodyArrayT por duplicado durante 2 horas a temperatura ambiente con agitacion lenta, seguido por tres lavados con tampon Tris (NaCl 150 mM, Tris 25 mM, Tween-20 al 0,05%, pH 7,5). Se anadieron los anticuerpos etiquetados con HRP especificos de la tirosina fosforilada, serina fosforilada y treonina fosforilada en tampon Tris, y los arreglos se incubaron durante 2 horas. Despues de tres lavados mas con tampon Tris, se anadio un sustrato luminiscente reactivo a la peroxidasa. Los arreglos se visualizaron mediante la exposicion a pelicula radiografica.La densitometria de las peliculas radiograficas se midio mediante escaneado y analisis informatico. Los resultados se resumen en la Tabla 9 mas abajo.
TABLA 9
Proteína
Efecto del Comp. II en la proteína en células TriPS estimuladas con CD3/CD28
RAP 1
Activado
RAP2
Activado
E06719144 20-10-2011
(continuacion)
Proteína
Efecto del Comp. II en la proteína en células TriPS estimuladas con CD3/CD28
JAK2
Activado
STAT4
Activado
STAT5b
Activado
P13quinasaP85
Activado
MEK1
Disminuyo el nivel hasta debajo de los niveles basales (control Nil)
JNK1
Disminuyo el nivel de nuevo a los niveles basales (control Nil)
JNK2
Disminuyo el nivel de nuevo a los niveles basales (control Nil)
JNK3
Disminuyo el nivel de nuevo a los niveles basales (control Nil)
MEKK1
Disminuyo el nivel de nuevo a los niveles basales (control Nil)
IkB-
Disminuyo el nivel de nuevo a los niveles basales (control Nil)
IkB-r
Disminuyo el nivel de nuevo a los niveles basales (control Nil)
IL-2
Disminuyo el nivel de nuevo a los niveles basales (control Nil)
IL-4
Disminuyo el nivel de nuevo a los niveles basales (control Nil)
IL-7y
Disminuyo el nivel de nuevo a los niveles basales (control Nil)
14-3-3
Disminuyo levemente el nivel
STAT6
Disminuyo levemente el nivel
IkB-�
Disminuyo levemente el nivel
IkB-a
Disminuyo levemente el nivel
VAV
Ningun efecto
STAT2
Ningun efecto
Ejemplo 12
Las celulas THP-1 se colocaron en medio (RPMI que contenia FCS al 10 % y 8 ng/ml de monotioglicerol) en una
5 concentracion de 250.000 celulas por ml y se incubaron con 5 !g/ml del compuesto de formula II (Comp. II) o 15 !g/ml de Comp. II durante una hora a 37 'C y CO2 al 5%. Despues de 1 hora, se anadio lipopolisacarido (LPS) a los cultivos para dar una concentracion final de 200 ng/ml, y las celulas despues se incubaron durante 24 horas adicionales. Despues de la incubacion, se determino la cantidad de NFkB y c-Jun segun lo que se describe en el Ejemplo 9. Tambien, se determino la cantidad de c-Fos mediante la utilizacion de un Kit de Ensayo de Transcripcion
10 de la familia AP-1 m de TransAMT y un Kit de Extracto Nuclear de Active Motif North America, Carlsbad, CA, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En resumen, se preparo un extracto nuclear de las celulas mediante la utilizacion del Kit de Extracto Nuclear. Despues, el extracto nuclear se anadio a los pocillos de una placa de 96 pocillos en el que el oligonucleotido que contenia un elemento sensible a TPA (TRE) se inmovilizo. Los dimeros de la proteina-1 activadora (AP-1) contenidos en el extracto nuclear se unieron a este oligonucleotido y se detectaron
15 mediante la utilizacion de un anticuerpo especifico para c-Fos. Despues se anadio un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP) para proporcionar una lectura colorimetrica que se cuantifico mediante espectrofotometria (medicion a 450 nm). Los resultados se muestran en las Figuras 9A-B.
Ejemplo 13
Las celulas TRiPS del dia 10, 1x106, se incubaron con 15 !g/ml del compuesto de formula II (Comp. II) durante 1 hora a 37'C. Despues, se incubaron las celulas con perlas CD3/CD28 (1 !l por 100.000 celulas) (obtenido de Dynal) durante 10 minutos a 37'C. Las celulas despues se lisaron con un tampon suave (suministrado con kit de activacion
5 Pierce E�-Detect descrito mas abajo) para producir los extractos celulares. Las concentraciones de proteina de los extractos resultantes se determinaron mediante ensayo de acido bicinconinico (BCA) (Pierce) y se colocaron en hielo para uso inmediato.
Se llevaron a cabo ensayos de Pulldown mediante la utilizacion de kits de activacion de Pierce E�-Detect de acuerdo a las instrucciones del fabricante mediante la utilizacion de GST-RAF-1-RBD y GST-RalGDS-RBD para RAS y RAP10 1 respectivamente. En resumen, 400 !g de proteina total de cada extracto se combinaron con proteina recombinantes y resina de glutation y se incubaron a 4'C durante una hora con agitacion suave. La resina despues se lavo para eliminar la proteina no unida y las proteinas RAS y RAP activadas se eliminaron mediante ebullicion en presencia de tintura de carga de SDS-PAGE que contenia agente reductor. Las transferencias western de RAS y RAP-1 se llevaron a cabo para visualizar las proteinas mediante la utilizacion de anticuerpos suministrados con el kit
15 Se realizo la densitometria de las peliculas radiograficas mediante el escaneado y analisis informatico.
Los resultados se muestran en la Tabla 11. Tal como puede observarse a partir de la Tabla 11, la incubacion de las celulas TRiPS con el Comp. II dio como resultado una inhibicion muy fuerte de la proteina RAS. La estimulacion de las celulas con perlas CD3/CD28 no incremento la cantidad de proteina RAP-1 segun lo esperado, pero el Comp. II tambien parecio inhibir RAP-1.
20 TABLA 11
Tratamiento
Densidad optica integrada para el ensayo RAS Densidad optica integrada para el ensayo RAP-1
Ningun tratamiento
66,83 259,27
Perlas CD3/CD28 solamente
245,91 213,66
Perlas CD3/CD28 � 15 !g/ml de Comp. II
84,98 87,26

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion que comprende inhibir una respuesta inmune, en el que formula I es:
    5 en la que n es 1; R1 es arilo C6 a C14, o ariloxi C6 a C14; y R2 es metilo.
  2. 2. El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 1, en el que 10 inhibir una respuesta inmune comprende inhibir la activacion de celulas T.
  3. 3.
    El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la enfermedad o afeccion es una enfermedad o afeccion mediada por celulas T.
  4. 4.
    El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 3, en el que la enfermedad o afeccion mediada por celulas T es una enfermedad o afeccion autoinmune.
    15 5. El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 4, en el que la enfermedad o afeccion autoinmune es esclerosis multiple.
  5. 6. El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 4, en el que la enfermedad o afeccion autoinmune es lupus eritematoso sistemico.
  6. 7. El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 3, en el que la 20 enfermedad o afeccion mediada por celulas T es una enfermedad pulmonar mediada por celulas T.
  7. 8.
    El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 1, en el que inhibir una respuesta inmune comprende inhibir la activacion de monocitos.
  8. 9.
    Un compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion que comprende inhibir la produccion, liberacion o ambos de una citocina proinflamatoria, en el que la formula I es:
    en la que n es 1; R1 es arilo C6 a C14, o ariloxi C6 a C14; y R2 es metilo.
  9. 10.
    El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 9, en el que la citocina es interleucina 8 (IL- 8).
  10. 11.
    El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 9, en el que la citocina es interleucina 13 (IL-13).
    5 12. El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 9, en el que la citocina es interferon gamma (IFN-y).
  11. 13. El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 9, en el que la citocina es factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a).
  12. 14. Un compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion 10 que comprende inhibir la inflamacion, en el que la formula I es:
    en la que n es 1; R1 es arilo C6 a C14, o ariloxi C6 a C14; y
    15 R2 es metilo.
  13. 15.
    El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 14, en el que la enfermedad o afeccion es una enfermedad o afeccion inflamatoria.
  14. 16.
    El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 15, en el que la enfermedad o afeccion inflamatoria es asma.
    20 17. El compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en conformidad con la reivindicacion 15, en el que enfermedad o afeccion inflamatoria es una enfermedad o afeccion inflamatoria neurologica.
  15. 18. Un compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion que comprende inhibir la proliferacion no deseada de linfocitos, en el que la formula I es:
    25 en la que n es 1; R1 es arilo C6 a C14, o ariloxi C6 a C14; y R2 es metilo.
  16. 19. Un compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion que comprende inhibir la adhesion no deseada de linfocitos, en el que la formula I es:
    en la que n es 1; R1 es arilo C6 a C14, o ariloxi C6 a C14; y
    R2 es metilo.
  17. 20.
    Un compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que R1 es fenilo o fenoxi.
  18. 21.
    Un compuesto de formula I, o una sal del mismo, para su uso de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el compuesto es:
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