ES2357853T3

ES2357853T3 - Uso de clasificadores de actividad génica para la clasificación in vitro de perfiles de expresión génica de pacientes con fallo multiorgánico infeccioso/no infeccioso.

Info

Publication number: ES2357853T3
Application number: ES06725094T
Authority: ES
Inventors: Stefan Russwurm; Konrad Reinhart
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: SIRS Lab GmbH
Priority date: 2005-03-21
Filing date: 2006-03-16
Publication date: 2011-05-03
Anticipated expiration: 2026-03-16
Also published as: EP1863928A2; CA2602543C; US8236496B2; ATE498694T1; CN101146914A; DE502006008908D1; CA2602543A1; WO2006100203A3; US20090325152A1; BRPI0609705A2; DE102005013013A1; WO2006100203A2; EP1863928B1

Abstract

Uso de polinucleótidos que se seleccionan del grupo constituido por: SEQ ID I.1, SEQ ID I.2, SEQ ID I.3, SEQ ID I.4, SEQ ID I.5, SEQ ID I.6, SEQ ID I.7, SEQ ID I.8 y SEQ ID I.9 o secuencias parciales de los mismos con una longitud de 20 a 200 nucleótidos como marcadores de actividad génica para la clasificación de pacientes como "no infectados sin fallo multiorgánico" o como "no enfermos de fallo multiorgánico infeccioso" o como "enfermos de fallo multiorgánico infeccioso".

Description

La presente invención se refiere al uso de marcadores de actividad génica para la clasificación de pacientes que están enfermos de un fallo multiorgánico infeccioso o no infeccioso.

La invención se refiere además al uso de estos clasificadores de actividad génica como valiosos parámetros guardados en dispositivos que se usan para el diagnóstico in vitro de pacientes con fallo multiorgánico infeccioso o no infeccioso. Además, la invención se refiere a un dispositivo para el diagnóstico in vitro de pacientes que están enfermos de un fallo multiorgánico infeccioso o no infeccioso.

Además, la invención se refiere al uso de los marcadores/clasificadores de actividad génica para la clasificación de perfiles de expresión génica de pacientes para evaluar el efecto terapéutico de principios activos contra fallo multiorgánico infeccioso o no infeccioso.

A pesar de los avances en el entendimiento patofisiológico y el tratamiento de apoyo, el síndrome del fallo multiorgánico (SFMO) o el fallo multiorgánico (FMO) representa en pacientes que requieren cuidados intensivos la causa más frecuente de muerte y mundialmente sigue aumentando. Las consecuencias de este desarrollo no sólo son considerables para los pacientes individuales, sino que tienen enormes repercusiones sobre los costes de la sanidad y el avance médico en muchos campos de la medicina.

Como fallo multiorgánico se designa el fallo que se produce al mismo tiempo o en un corto periodo de tiempo de dos o más sistemas de órganos vitales. El síndrome del fallo multiorgánico (SFMO) precede al FMO como fallo orgánico inicial [1]. Actualmente se habla de fallo multiorgánico cuando dos o más órganos presentan al mismo tiempo o sucesivamente fallos, descartándose un fallo orgánico crónicamente persistente [2]. El pronóstico del FMO depende estrechamente del número de sistemas orgánicos implicados. La mortalidad asciende en el fallo de un órgano dentro de las primeras 24 horas al 22%, después de 7 días al 41%. En el caso de fallo de tres sistemas de órganos la mortalidad asciende en el primer día al 80% y después de 4 días al 100% [3].

Para la puntuación clínica del grado de gravedad de SFMO e FMO se usa regularmente la puntuación de fallo multiorgánico (Multiple-Organ-Failure-Score) (puntuación de FMO, de MOF-Score) de GORIS y col. [4] o alternativamente también la puntuación de la evaluación de fallo multiorgánico relacionada con sepsis (EIMRS) (Sepsisrelated Organ Failure Assessment (SOFA) Score) [5]. La puntuación de FMO permite una clasificación rápida y clínicamente sencilla de la función de los órganos en tres grados. Una puntuación de FMO > 4 designa regularmente en la bibliografía clínica FMO [6]. La puntuación de IMRS es un sistema de puntos que valora la rápida evaluación clínica de la función respectivamente en cuatro grados de gravedad, los siguientes sistemas de órganos: respiración (pulmones), coagulación, hígado, aparato circulatorio, sistema nervioso central y riñón.

El FMO transcurre clínicamente en tres fases [7]

1.: Órgano de choque: El mecanismo patofisiológico desencadenante es un déficit de perfusión de distinta génesis. Este acontecimiento se produce en el plazo de horas y todavía no deja daños permanentes.

2.: Disfunción orgánica: Un déficit de perfusión persistente en el plazo de los siguientes días conduce a la formación de un SRIS (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, de Systemic Inflammatory Response Syndrome, clasificado según [8]) con edemas locales y lesiones celulares. Esta fase se designa síndrome de fallo multiorgánico (SFMO).

3.: Fallo orgánico: El déficit de perfusión persistente conduce a estasis en el área visceral, por lo que se produce superinfección y translocación de las endotoxinas del intestino. Esto conduce a una potenciación de los síntomas clínicos y al cuadro completo de sepsis. De la disfunción orgánica resulta un fallo orgánico.

El SFMO y el FMO son cuadros clínicos con una complicada patofisiología. Hasta hoy en día sólo se han entendido insuficientemente las exactas causas moleculares de la aparición y la complejidad de la respuesta huésped inmunológica-inflamatoria en infección grave y traumatismo que puede conducir al desencadenamiento de un SRIS y a las correspondientes repercusiones cardiocirculatorias [9].

El SFMO y el FMO pueden ser de génesis tanto infecciosa como no infecciosa. El SFMO y el FMO aparecen regularmente como complicación clínicamente importante en pacientes con sepsis, después de choque traumático, en pacientes después de operaciones utilizando el sistema de circulación extracorporal, después de trasplantes de órganos, y otros (Figura 1). Un importante patomecanismo para la aparición del SFMO y el FMO es el desarrollo de un síndrome inflamatorio sistémico (SRIS, [8]). Los procesos patofisiológicos iniciados en el marco de un SRIS no implican sólo todos los componentes del sistema inmunitario, sino que perjudican al aparato cardiocirculatorio en todos los niveles y no sólo se limitan a depresión miocárdica y vasodilatación. Los cambios cardiocirculatorios, sobre todo en el plano de la microcirculación, forman la distancia final común y producen una hipoxia de tejidos que se considera un cofactor importante en la patogénesis del fallo multiorgánico.

La Figura 1 describe a modo de ejemplo los mecanismos más importantes desde el punto de vista actual de la aparición del SFMO y el FMO [10]: un sistema inmunitario hiperactivo parece que desempeña una función central en la aparición del fallo multiorgánico. A este respecto, el endotelio asume una función clave central mediante la secreción de citocinas mediante la mediación de la adhesión de leucocitos. En las células endoteliales se activan cascadas de transducción de señales que por último lugar conducen a la expresión y a la activación de factores de transcripción.

El conocimiento todavía incompleto de los procesos en la fase temprana del SFMO y el FMO es el motivo por el que hasta hoy en día no existe ningún diagnóstico sensible/específico que pueda discriminar entre causas infecciosas y no infecciosas. Los novedosos biomarcadores y diagnósticos, a partir de ahora también en el plano de la expresión génica, pueden proporcionar informaciones diagnósticas esenciales para el reconocimiento temprano de fallo multiorgánico, así como para diferenciar entre causas infecciosas y no infecciosas, de un SFMO y un FMO, y además representan una contribución importante para la aclaración de los mecanismos patofisiológicos de inflamaciones sistémicas.

Los síntomas tempranos frecuentemente usados clínicamente como fiebre, leucocitosis, taquicardia y taquipnea son completamente inespecíficos en el diagnóstico de un SFMO o un FMO, así como en la diferenciación entre causas infecciosas y no infecciosas de un SFMO y un FMO. Los parámetros que registran precozmente los trastornos de la microcirculación como cambios de pH de la mucosa intestinal [11] y el nivel de lactato en el lecho capilar [12,13], la aparición de un fallo respiratorio cuya causa no se encuentra en los pulmones [2], la subida de leucocitoselastasa [14,15], la altura del nivel de neopterina [16], la activación de leucocitos polimorfonucleares y la altura del nivel de IL-6 [17] son adecuados con limitaciones como parámetros tempranos para la aparición tardía de SFMO e FMO, pero pueden no contribuir a la diferenciación entre causas infecciosas y no infecciosas de un SFMO y un FMO. Por tanto, existe una necesidad urgente de un nuevo procedimiento diagnóstico que mejore la capacidad del experto para diferenciar precozmente SFMO o FMO no infeccioso de infeccioso y para obtener información de la respuesta a tratamientos específicos.

Pero precisamente la diferenciación entre causas infecciosas y no infecciosas de un SFMO y una FMO es de suma importancia médica ya que mediante una diferenciación tal pueden utilizarse más específicamente, por ejemplo, antibióticos, lo que, además de evitar efectos secundarios debido a la utilización inespecífica de antibióticos, también contribuye a un considerable ahorro de costes. Igualmente, en el caso de presencia de un SFMO o un FMO no infeccioso pueden evitarse medidas diagnósticas muy estresantes para los pacientes, así como que requieren mucho tiempo y personal (por ejemplo, transporte al CT/MRI), para la identificación del sitio de infección respectivo, la realización de amplios procedimientos microbiológicos (por ejemplo, la investigación de cultivos de sangre que también está asociada a la extracción de grandes cantidades de sangre), pero también el intercambio muy arriesgado de todos los materiales de plástico conectados al paciente como catéter venoso, etc. Por el contrario, la rápida identificación de causas infecciosas de un SFMO o un FMO puede garantizar el comienzo inmediato de tales medidas y, por tanto, la reducción de la mortalidad.

Los avances tecnológicos, especialmente el desarrollo de la tecnología de micromatrices, ponen al experto ahora en situación de comparar al mismo tiempo 10000 o más genes y sus productos génicos. La aplicación de tales tecnologías de micromatrices puede facilitar información sobre el estado de la salud, los mecanismos de regulación, interacciones bioquímicas y redes de transmisión de señales. La mejora del conocimiento sobre cómo reacciona un organismo a infecciones facilitará el desarrollo de modalidades de reconocimiento, diagnóstico y tratamiento para enfermedades infecciosas.

Las micromatrices proceden de “transferencia Southern” [19] que representa la primera manera de proceder para inmovilizar moléculas de ADN de un modo y manera espacialmente accesible sobre una matriz fija. Las primeras micromatrices estaban constituidas por fragmentos de ADN, frecuentemente con secuencia desconocida, y se aplicaron en forma de puntos sobre una matriz porosa (normalmente nailon). Rutinariamente se usaron ADNc, ADN genómico o bibliotecas de plásmidos, y el material hibridado se marcó con un grupo radiactivo [20-22].

Hoy en día, el uso de vidrio como sustrato y la fluorescencia para la detección, junto con el desarrollo de nuevas tecnologías para la síntesis y para la aplicación de ácidos nucleicos en densidades muy altas, permite miniaturizar matrices de ácidos nucleicos con al mismo tiempo aumento del rendimiento experimental y del contenido de información [23-25].

Una razón para la aplicabilidad de la tecnología de micromatrices fue obtenida inicialmente por investigaciones clínicas en el campo de la investigación del cáncer. Aquí, los perfiles de expresión han mostrado su utilidad en la identificación de actividades de genes individuales o grupos de genes que guardan relación con determinados fenotipos clínicos [26]. Mediante el análisis de muchas muestras que procedían de individuos con o sin leucemia agua o linfomas de linfocitos B difusos se encontraron marcadores de expresión génica (ARN) y a continuación se aplicaron para la clasificación clínicamente relevante de estos tipos de cáncer [26,27]. Golub y col. han descubierto que no pueden hacerse pronósticos fiables por un gen individual cualquiera, pero que los pronósticos que se basan en el cambio de la transcripción de 53 genes (seleccionados de más de 6000 genes que estaban presentes en las matrices) son muy exactos [26].

Por el documento WO 03/002763 se sabe que la medición de la expresión génica mediante micromatrices puede usarse en principio para el diagnóstico de sepsis y estados similares a sepsis.

La aplicabilidad fundamental de perfiles de expresión génica que pueden obtenerse, por ejemplo, mediante la técnica de micromatrices para el diagnóstico de SRIS, inflamaciones inflamatorias generalizadas, sepsis y sepsis más grave se describe en las solicitudes de patente alemanas de los solicitantes de la presente invención DE 103 40 395.7, DE 103 36 511.7, DE 103 150 31.5, así como DE 10 2004 009 952.9.

De Feezor y col. [28] se sabe que las actividades génicas de pacientes que desarrollaron un SRIS con síndrome de fallo multiorgánico (SFMO) (“Multiorgan Dysfunction Syndrome”) debido a su tratamiento quirúrgico se diferencian en comparación con pacientes que bajo las mismas condiciones quirúrgicas desarrollaron un SRIS sin SFMO. Sin embargo, estas investigaciones no facilitan información sobre la diferenciación de FMO no infecciosa en comparación con FMO infeccioso, ya que en los pacientes no se detectó ninguna infección.

Para la clasificación de perfiles de expresión génica ya se han descrito varios procedimientos y su aplicación para datos de expresión génica como, por ejemplo, análisis de discriminación lineal y cuadrática, predictores de covariante compuesta (“Compound Covariant Predictor”), clasificación del vecino más cercano (“Nearest Neighbor Classification”), árboles de clasificación (“Classification trees”) o máquinas de vectores de soporte (“Support Vector Machines”) [26, 29, 30, 31, 32]. Una visión general sobre la aplicación de procedimientos de clasificación para el análisis de datos de expresión génica se muestra en [33].

El objetivo de los procedimientos de clasificación es el desarrollo de clasificadores multivariantes que hagan posible una predicción sobre la pertenencia de un nuevo conjunto de datos a una clase. Así pueden clasificarse pacientes en pacientes que responden o que no responden, por ejemplo, mediante clasificadores referentes a su reacción a un tratamiento especial.

El desarrollo de clasificadores transcurre fundamentalmente en tres etapas: 1. La selección de características estadísticamente relevantes de un gran conjunto de datos. Para análisis de la expresión génica se eligen inicialmente mediante pruebas monofactoriales entre varias clases los genes estadísticamente relevantes basándose en su patrón de expresión como características. 2. La determinación de los clasificadores con ayuda de distintos procedimientos para la clasificación pone a disposición en su final un conjunto de entrenamiento de clasificadores. 3. La validación de este conjunto de entrenamiento mediante nuevos conjuntos de pruebas no clasificados de perfiles de expresión génica y la optimización del conjunto de entrenamiento.

En el documento WO 2004/108957 se describen en general la clasificación de biomarcadores (ácidos nucleicos) y su uso para el diagnóstico de SRIS o sepsis. No se describe una clasificación y/o uso de los biomarcadores para el diagnóstico de fallo multiorgánico infeccioso o no infeccioso.

En la solicitud de patente alemana no publicada DE 102004 049897 se muestra por primera vez marcadores de actividad génica para la diferenciación entre fallo multiorgánico infeccioso y no infeccioso. Allí se describe el uso de 1297 genes distintos para el diagnóstico in vitro de pacientes que están enfermos de un fallo multiorgánico infeccioso o no infeccioso.

La presente invención parte del estado de la técnica mostrado en el documento DE 102004049897.041 en el que mediante investigaciones específicas se determinó el perfil de expresión génica de muestras de pacientes cuyas actividades génicas son adecuadas como clasificadores para el diagnóstico in vitro para la diferenciación de fallo multiorgánico infeccioso y no infeccioso.

El punto de partida para la invención dada a conocer en la presente solicitud de patente es el conocimiento de que mediante clasificadores de actividad génica pueden agruparse los perfiles de expresión génica de pacientes con FMO no infeccioso o con FMO infeccioso. El uso de estos clasificadores no es posible con los parámetros clínicos usados hasta la fecha para el diagnóstico, pero son muy importantes para el inicio de una terapia especializada que requiere cuidados intensivos.

Por tanto, el objetivo de la presente invención se basa en diferenciar entre pacientes no infectados sin fallo multiorgánico, un fallo multiorgánico no infeccioso y un fallo multiorgánico infeccioso mediante el uso de clasificadores de actividad génica.

El objetivo de la invención se alcanza mediante marcadores de actividad génica según la reivindicación 1, un procedimiento para la clasificación de pacientes según la reivindicación 6, una micromatriz según la reivindicación 9 y un dispositivo según la reivindicación 10.

A continuación, el término “control por ITS” se usa para los pacientes que se trataron con cuidados intensivos en los que sin embargo no pudo detectarse infección y no se diagnosticó fallo multiorgánico.

La presente invención se refiere especialmente al uso de clasificadores de actividad génica mediante los cuales los perfiles de expresión génica obtenidos in vitro de una muestra de paciente se clasifican en fallo multiorgánico no infeccioso e infeccioso.

Además, usando los clasificadores, la presente invención sirve para la evaluación del curso durante la terapia de pacientes que están enfermos de causas no infecciosas e infecciosas de un fallo multiorgánico.

Los clasificadores de actividad génica según la invención son además útiles como criterios de inclusión o exclusión de pacientes que están enfermos de causas no infecciosas o infecciosas de un fallo multiorgánico en estudios clínicos de las fases 2-4.

Una forma de realización preferida de la invención se refiere a poner a disposición clasificadores de actividad génica para el procesamiento electrónico, así como para la preparación de software para la descripción del pronóstico individual de un paciente, para fines de diagnóstico y/o sistemas de gestión de datos de pacientes. Los clasificadores de actividad génica se usan in vitro para esto como base para la evaluación automática de los perfiles de expresión génica que van a investigarse en dispositivos diagnósticos. Los clasificadores de expresión génica se guardan a este respecto como valiosos parámetros en un software, en un circuito de conmutación integrado, una EPROM u otras posibilidades técnicas conocidas para el experto para el almacenamiento de parámetros valiosos.

Otra forma de realización preferida de la invención consiste en un dispositivo que usa los clasificadores de actividad génica guardados como parámetros valiosos para hacer posible un diagnóstico in vitro de pacientes con fallo multiorgánico no infeccioso e infeccioso. Además de los clasificadores de actividad génica guardados como parámetros valiosos, un dispositivo tal contiene la posibilidad de comparar perfiles de expresión génica no clasificados de muestras de pacientes con los clasificadores de actividad génica guardados y especificar el resultado resultante como visualización técnica. La comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el procesamiento electrónico de los parámetros valiosos de los clasificadores de actividad génica transformados en señales electrónicas con las señales electrónicas que se obtuvieron de los perfiles de expresión génica que iban a investigarse. El resultado resultante de esta comparación consiste en la clasificación del perfil de expresión génica que va a investigarse en una de las clases fallo multiorgánico no infeccioso o fallo multiorgánico infeccioso. Como visualización técnica se utilizan visualizaciones analógicas y/o digitales como, por ejemplo, sistemas de puntuación (similares a la puntuación APACHE o EIMRS ya usada en el diagnóstico in vitro) o en geles de sílice, señales acústicas u otros procedimientos conocidos para el experto.

En una forma de realización preferida este dispositivo también hace posible además la creación de perfiles de expresión génica para la comparación con los clasificadores de actividad génica guardados. Para esto, estos dispositivo están constituidos por un módulo para la preparación de muestras de la muestra de paciente obtenida in vitro, un módulo para la hibridación de la muestra de paciente con sondas de actividad génica que se derivan de los clasificadores de actividad génica, un módulo para la lectura de las señales de hibridación, otro módulo para el análisis de imágenes de las señales de hibridación leídas, un módulo que hace posible la comparación automática con el clasificador de actividad génica guardado, así como un módulo que hace posible la visualización de la comparación resultante. Para el experto es evidente que dependiendo del grado de automatización del dispositivo no todos los módulos deben combinarse en el dispositivo. Ejemplos de dispositivos que hoy en día ya hacen posible una creación automática/semiautomática de perfiles de expresión génica son el Light Cycler de la empresa Roche, el Smart Cycler de la empresa Cepheid o el AP-System de la empresa Clondiag Chip Technologies.

Además, para el experto es evidente que, además del procedimiento descrito en esta solicitud de patente para la creación de perfiles de expresión génica mediante tecnología de micromatrices, también pueden usarse todos los otros procedimientos para análisis de expresión génica diferencial.

Los clasificadores de actividad génica según la invención también pueden usarse para la preparación de sistemas expertos informáticos y/o para la modelización informática de rutas celulares de transmisión de señales.

Como clasificadores de actividad génica según la presente invención se usan genes y/o fragmentos génicos que se seleccionan del grupo constituido por SEQ ID I.1 a SEQ ID I.9, así como fragmentos génicos de los mismos con por lo menos 5-2000, preferiblemente 20-200, más preferiblemente 20-80 nucleótidos.

Estas secuencias con SEQ ID I.1 a SEQ ID I.9 están comprendidas por el alcance de la presente invención y se dan a conocer en particular en el protocolo de secuencias que comprende 9 secuencias que, por tanto, es constituyente de la descripción de la presente invención. Por tanto, el protocolo de secuencias también es constituyente de la revelación de la invención. Este protocolo de secuencias contiene además una asignación de las secuencias individuales con SEQ ID I.1 a SEQ ID I.9 a su nº de registro de GenBank (acceso a Internet por http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Para esto también pueden usarse análogos sintéticos hibridables de las sondas enumeradas.

También es posible el uso de mutantes de inserción, deleción o de intercambio de nucleótidos de las secuencias con SEQ ID I.1 a SEQ ID I.9 para los fines de la presente invención, siempre y cuando estos mutantes no modifiquen esencialmente el comportamiento de hibridación de las secuencias para los fines de la presente invención. Si en la presente invención se hace referencia a marcadores de actividad génica, entonces están comprendidas tales mutaciones.

En otra forma de realización, los clasificadores de actividad génica con SEQ ID I.1 a SEQ ID I.9 para la clasificación de perfiles de expresión génica de muestras de paciente con fallo multiorgánico no infeccioso o infeccioso según la Tabla 1 se asocian a reglas de selección lógicas.

Tabla 1: Reglas de selección para la clasificación de control de ITS, FMO no infeccioso o infeccioso

Clase: Control de ITS Fallo multiorgánico no infeccioso Fallo multiorgánico infeccioso

(SEQ ID I.1) : (SEQ ID I.3)  (SEQ ID I.5) 

y
y
y

Clasificadores: (SEQ ID I.3)  o (SEQ ID I.6)  o (SEQ ID I.7)  o

(SEQ ID I.2) : (SEQ ID I.4)  (SEQ ID I.8) 

y
y
y

(SEQ ID I.4) : (SEQ ID I.5)  (SEQ ID I.9) 

5  actividad génica expresada en exceso,  actividad génica expresada en defecto

Otra forma de realización de la invención se caracteriza porque los genes o fragmentos génicos enumerados

en la reivindicación 1 y/o de sus secuencias derivadas de ARN se sustituyen por análogos sintéticos, aptámeros, así

como ácidos nucleicos de péptidos.

Otra forma de realización de la invención se caracteriza porque la muestra se selecciona de: fluidos corporales, 10 especialmente sangre, líquido cefalorraquídeo, orina, líquido ascítico, líquido seminal, saliva, líquido de punción; contenido celular o una mezcla de los mismos.

Otra forma de realización de la invención se caracteriza porque las muestras celulares se someten dado el caso a un tratamiento lítico para liberar sus contenidos celulares.

Para el experto es evidente que las características individuales de la invención expuestas en las 15 reivindicaciones pueden combinarse discrecionalmente entre sí sin limitación.

Como clasificadores de actividad génica en el sentido de la invención se entiende todas las secuencias de ADN derivadas, secuencias parciales y análogos sintéticos (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptidos, PNA). La descripción de la invención referente a la determinación de la expresión génica en el nivel del ARN no representa ninguna limitación, sino sólo una aplicación a modo de ejemplo.

20 La descripción de la invención referente a sangre sólo representa una aplicación a modo de ejemplo de la invención. Como líquidos biológicos en el sentido de la invención se entiende todos los fluidos corporales del ser humano.

Otras ventajas y características de la presente invención resultan de la descripción de un ejemplo de realización, así como mediante el dibujo.

25 La Figura 1 muestra el desarrollo patológico de fallo multiorgánico a partir de diferentes estados médicos.

Ejemplo de realización

Investigación para la creación y la validación de clasificadores de actividad génica para la clasificación de

perfiles de expresión génica de muestras de pacientes en una de las clases: control de ITS, fallo multiorgánico no

infeccioso o fallo multiorgánico infeccioso.

30 Medición de la expresión génica diferencial como base para el conjunto de entrenamiento:

Para la medición de la expresión génica diferencial para la diferenciación entre causas no infecciosas e infecciosas de un fallo multiorgánico se realizaron investigaciones de muestras de sangre completa de 57 pacientes en total que se trataron en unidades de cuidados intensivos. Los datos de expresión génica totales formaron la base para la creación del conjunto de entrenamiento de los clasificadores de actividad génica.

35 Se extrajeron muestras de sangre completa de 31 pacientes que en el marco de su cuidado intensivo desarrollaron un FMO infeccioso [clasificada según 8].

5

10

15

20

25

30

35

Además, se extrajeron muestras de sangre completa de 26 pacientes que en el marco de su cuidado intensivo desarrollaron un FMO no infeccioso [clasificada según 8].

Además, se extrajeron muestras de sangre completa de 18 pacientes que en el transcurso se trataron con cuidados intensivos (a continuación controles de ITS).

Como muestras de referencia sirvieron los ARN totales de líneas celulares SIG-M5.

En la Tabla 2 se representan características seleccionadas de tres grupos de pacientes. A este respecto se facilitan datos sobre la edad, el sexo y la puntuación de EIMRS como medida de la función del sistema orgánico. Igualmente se especifican los niveles de proteína en plasma de procalcitonina (PCT) y CRP, así como el número de leucocitos de los pacientes.

Todas las muestras de pacientes se cohibridaron en una micromatriz con la muestra de referencia, respectivamente.

Tabla 2: Datos de los grupos de pacientes

Controles de ITS: FMO no infeccioso FMO infeccioso

Número de pacientes: 18 26 31

Sexo M/F: 16/2 15/11 17/14

Edad [años]: 65 (15) 69 (10) 60 (17)

Puntuación APACHE II [puntos]: 10* (2,8) 14,9 (3,4) 14 (10)

Puntuación de EIMRS [puntos]: 3,4* (1,7) 8* (3) 10* (3)

Número de disfunciones orgánicas: - 3 (1) 3 (1)

PCT [ng/ml]: 0,56* (0,8) 3,8 (6,7) 3,1 (7,7)

CRP [g/l]: 68,5* (27,5) 80,2* (90,2) 188* (168)

WBC [no/l]: 8.088* (3.554,2) 12.300 (6.925) 13.200 (8.150)

*p < 0,05

Descripción experimental:

Después de extraer la sangre completa, el ARN total de las muestras se aisló aplicando el kit PAXGene Blood RNA según las especificaciones del fabricante (Qiagen).

Cultivo de células.

Para el cultivo de células (muestras de control) se utilizaron 19 criocultivos celulares (SIGM5) (congelados en nitrógeno líquido). Las células se inocularon respectivamente con 2 ml de medio Iscove (Biochrom AG) complementado con suero bovino fetal al 20% (SBF). Los cultivos celulares se incubaron a continuación durante 24 horas a 37ºC con 5% de CO2 en placas de 12 pocillos. Después se dividió el contenido de 18 pocillos en 2 partes con respectivamente el mismo volumen de manera que finalmente estuvieran a disposición 3 placas de la misma forma (en total 36 pocillos). El cultivo continuó a continuación durante 24 horas bajo las mismas condiciones. A continuación se reunieron los cultivos resultantes de 11 pocillos de cada placa y se centrifugaron (1000 x g, 5 min, temperatura ambiente). El sobrenadante se desechó y el sedimento celular se disolvió en 40 ml del medio anteriormente mencionado. Estas células disueltas en 40 ml se repartieron a partes iguales en dos matraces de 250 ml y se incubaron de nuevo después de 48 horas de incubación y adición de 5 ml del medio anteriormente mencionado. 80 l de los 2 ml restantes de las dos placas restantes se añadieron a pocillos vacíos de las mismas placas que ya se habían preparado previamente con 1 ml del medio anteriormente mencionado. Después de 48 horas de incubación sólo se procesó una de las placas de 12 pocillos del siguiente modo: de cada pocillo se extrajeron 500 l y se reunieron. Los 6 ml resultantes de esto se añadieron a un matraz de 250 ml que contenía aproximadamente 10 ml de medio fresco. Esta mezcla se centrifugó 5 minutos a 1000 x g a temperatura ambiente y se disolvió en 10 ml del medio anteriormente mencionado. El posterior recuento de células produjo el siguiente resultado: 1,5 x 107 células por ml, 10 ml de volumen total, número total de células: 1,5 x 108. Como el número de células no era todavía suficiente se añadieron 2,5 ml de la suspensión de células anteriormente mencionada en 30 ml del medio anteriormente mencionado en un matraz de 250 ml (75 cm2) (en total 4 matraces). Después de 72 horas de tiempo de incubación, a los matraces se les añadieron respectivamente 20 ml de medio fresco. Después de la siguiente incubación de 24 horas se realizó el recuento de células como se ha descrito anteriormente, que dio un número de células total de 3,8 x 108 células. Para alcanzar el número de células deseado de 2 x 106 células, las células se resuspendieron en 47,5 ml del medio anteriormente mencionado en 4 matraces. Después de un tiempo de incubación de 24 horas, las células se centrifugaron y se lavaron dos veces con tampón fosfato sin Ca2+ ni Mg2+ (Biochrom AG).

El aislamiento del ARN total se realiza mediante el kit NucleoSpin RNA L (Machery&Nagel) correspondientemente a las indicaciones del fabricante. El procedimiento anteriormente descrito se repitió hasta que se alcanzó el número de células necesario. Esto fue necesario para alcanzar la cantidad necesaria de 6 mg de ARN total, lo que se corresponde con aproximadamente una eficiencia de 600 g de ARN por 108 células.

Transcripción inversa/marcado/hibridación

Después de extraer la sangre completa, el ARN total de las muestras se aisló usando el kit PAXGene Blood RNA (PreAnalytiX) según las especificaciones del fabricante y se comprobó para su calidad. De cada muestra se tomaron alícuotas de 10 g de ARN total y junto con 10 g de ARN total de células SIGM5 como ARN de referencia se transcribieron en ADN complementario (ADNc) con la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen) y el ARN se eliminó a continuación de la mezcla mediante hidrólisis alcalina. En la mezcla de reacción se sustituyó una parte del dTTP por aminoalil-dUTP (AA-dUTP) para hacer posible posteriormente el acoplamiento del colorante de fluorescencia al ADNc.

Después de la purificación de la mezcla de reacción, los ADNc de las muestras y los controles se marcaron covalentemente con el colorante de fluorescencia Alexa 647 y Alexa 555 y se hibridaron sobre una micromatriz de la empresa SRIS-Lab. Sobre la micromatriz usada se encuentran 5308 polinucleótidos inmovilizados con una longitud de 55 - 70 pares de bases que representan respectivamente un gen humano y puntos de control para el aseguramiento de la calidad. Una micromatriz está dividida en 28 submatrices con una rejilla de 15x15 puntos.

La hibridación y el posterior lavado o secado se realizó en la estación de hibridación HS 400 (Tecan) según las indicaciones del fabricante durante 10,5 horas a 42ºC. La disolución de hibridación usada está constituida por las muestras de ADNc marcadas respectivas, 3,5x SSC (1x SSC contiene cloruro sódico 150 mM y citrato sódico 15 mM), dodecilsulfato de sodio al 0,3% (v/v), formamida al 25% (v/v) y 0,8 g l-1 de cada uno de cot-1 DNA, ARNt de levadura y ARN de poli-A. El posterior lavado de las micromatrices se realizó con el siguiente programa a temperatura ambiente: cada 90 segundos lavado con tampón de lavado 1 (2x SSC, dodecilsulfato de sodio al 0,03%), con tampón de lavado 2 (1x SSC) y por último con tampón de lavado 3 (0,2x SSC). Después, las micromatrices se secaron bajo una corriente de nitrógeno con una presión de 2,5 bar (0,25 MPa) a 30ºC durante 150 segundos.

Después de la hibridación, las señales de hibridación de las micromatrices se leyeron con un escáner GenePix 4000B (Axon) y las relaciones de expresión de los genes diferencialmente expresados se determinaron con el software GenePix Pro 4.0 (Axon).

Evaluación:

Para la evaluación, la intensidad media de un punto se determinó como la mediana del valor de los píxeles de puntos correspondientes.

Corrección de fallos sistemáticos:

La corrección de fallos sistemáticos se realizó según el planteamiento de Huber y col. [34]. A este respecto, el sesgo aditivo y multiplicativo dentro de una micromatriz se estimó a partir del 70% de las muestras de genes presentes. Para todos los otros cálculos las señales se transformaron mediante arco seno hiperbólico.

Para los análisis se calcularon las relaciones relativas normalizadas y transformadas de las señales de las muestras de pacientes frente a los controles generales. Es decir, para el gen j del paciente n el cálculo dio el valor Gj,n = arcsenh(Scy5(j,n)) -arcsenh(Scy3(j,n)) en la que [SCy3(j,n), SCy5(j,n)] designa el par de señales correspondiente. Si para un pacientes no pudo valorarse un punto (por ejemplo, mancha sobre la imagen escaneada), entonces el valor correspondiente se designó como inexistente (‘missing value’).

Comparación estadística:

Para la comparación se usó la prueba de Student de muestras al azar para datos emparejados por gen. Ambas muestras al azar contuvieron los valores de los grupos de pacientes FMO no infeccioso o FMO infeccioso. Para la selección de genes diferencialmente expresados se valoró el valor de p correspondiente. Para el grupo de los genes seleccionados el valor de p correspondiente fue inferior a 0,05.

Tabla 3: Actividades génicas significativamente aumentadas en muestras de pacientes con FMO infeccioso en comparación con las actividades génicas de pacientes con FMO no infeccioso

Número de: Valor de expresión medio normalizado y transformado Desviación estándar ID de secuencia

registro de GenBank: Valor de p Grupo de pacientes con FMO no infeccioso Grupo de pacientes con FMO infeccioso Grupo de pacientes con FMO no infeccioso Grupo de pacientes con FMO infeccioso

N32857: 0,00 -2,99 0,20 1,42 2,78 1

N32853: 0,00 -0,85 1,60 2,15 2,89 2

N32495: 0,00 -2,38 -0,56 1,37 0,40 3

AI701077: 0,01 -0,33 1,46 0,17 3,08 4

M87790: 0,00 1,18 2,93 1,13 1,24 5

AI559317: 0,01 0,20 1,83 0,54 2,60 6

N34897: 0,00 -2,60 -1,05 1,61 0,54 7

AA907084: 0,02 0,53 1,94 0,49 2,58 8

N45223: 0,00 -2,88 -1,54 1,24 0,57 9

Los números de registro de GenBank citados en la Tabla 3 (acceso a Internet por http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) de las secuencias individuales están asignados en el protocolo de secuencias adjunto a esta solicitud en particular respectivamente a una ID de secuencia (SEQ ID 1 a SEQ ID 91).

5 Además, las secuencias se dan a conocer en su interior en particular.

Este protocolo de secuencias es constituyente de la descripción de la presente invención.

Adicionalmente, estas secuencias se dan a conocer en la solicitud de patente alemana nº DE 102004049897.0.

Creación de clasificadores de actividad génica (conjunto de entrenamiento)

A partir de todas las actividades génicas medidas se crearon mediante el software MediPred (empresa

10 Biocontrol Jena GmbH) clasificadores de actividad génica y reguladores de selección que hacían posible una clasificación del patrón de expresión génica en las clases FMO infeccioso e FMO no infeccioso (Figura 2). A este respecto se determinaron gen por gen valores umbral para expresión alta y baja (en la Figura 3 se designa Cmín y Cmáx) y se extrajeron genes con comportamiento de expresión génica típico y robusto por clase de pacientes.

Prueba de clasificadores de actividad génica en perfiles de expresión génica todavía no clasificados (conjunto de 15 prueba)

Los clasificadores de actividad génica fijados se probaron mediante las reglas de selección definidas en un conjunto de prueba de en total 190 patrones de expresión génica todavía no clasificados de controles de ITS (56), pacientes con FMO no infeccioso (75) o pacientes con FMO infeccioso (59) y se validaron mediante datos clínicos.

Para esto se seleccionaron perfiles de expresión génica de pacientes que fueron clínicamente diagnosticados

20 como controles de ITS o FMO no infeccioso o FMO infeccioso. Si en la posterior comparación con el conjunto de entrenamiento pudo establecerse que los patrones de expresión que iban a clasificarse eran el conjunto de entrenamiento dentro de los límites de expresión fijados mediante las reglas de selección de los clasificadores de actividad génica correspondientes (habiéndose aplicado al mismo tiempo las reglas de selección), entonces el patrón de expresión que iba a clasificarse se asignó a la clase correspondiente.

25 De la Tabla 4 es evidente la pertenencia del conjunto de prueba a las clases correspondientes. Por lo tanto, el 86% de los controles de ITS, el 80% de los pacientes con i fallo multiorgánico no infeccioso, así como el 63% de los pacientes con fallo multiorgánico infeccioso pudieron clasificarse correctamente en la clase correspondiente.

Tabla 4: Proporción en porcentaje de 190 perfiles de expresión génica a clasificar en las clases control de ITS, FMO no infeccioso e FMO infeccioso

Grupos de pacientes: Controles de ITS Fallo multiorgánico no infeccioso Fallo multiorgánico infeccioso

Número de perfiles de expresión génica a clasificar: 56 75 (varios días de 16 pacientes) 59 (varios días de 35 pacientes)

Pertenencia a las clases [%]: Controles de ITS 86 4 14

Fallo multiorgánico no infeccioso: 13 80 16

Fallo multiorgánico infeccioso: 2 16 63

5

10

15

20

25

30

35

Por tanto, los clasificadores de actividad génica pueden aplicarse junto con las reglas de selección para la invención.

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Protocolo de secuencias

<110> SRIS-Lab GmbH

<120> Procedimiento para la diferenciación entre causas no infecciosas e infecciosas de un fallo multiorgánico

<130> 85/SL0528/PC

<140> Número de la presente solicitud

<141> 16 de marzo de 2006.

<160> 1297

<170>: Patent Prepare 0.3.5

<210>: 1

<211>: 670

<212>: ADN

5: <213> Homo sapiens

<220>

<221>: misc_feature

<222>: (503)..(503)

<223>: n es a, c, g o t.

10: <220>

<221>: misc_feature

<222>: (530)..(530)

<223>: n es a, c, g o t.

<220>

15: <221> misc_feature

<222>: (564)..(564)

<223>: n es a, c, g o t.

<220>

<221>: misc_feature

20: <222> (669)..(669)

<223>: n es a, c, g o t.

<400>: 1

imagen1

<210>: 2

<211>: 609

5: <212> ADN

<213>: Homo sapiens

<220>

<221>: misc_feature

<222>: (490)..(490)

10: <223> n es a, c, g o t.

<220>

<221>: misc_feature

<222>: (495)..(495)

<223>: n es a, c, g o t.

<220>

<221>: misc_feature

<222>: (516)..(516)

5: <223> n es a, c, g o t.

<220>

<221>: misc_feature

<222>: (552) .. (552)

<223>: n es a, c, g o t.

10: <220>

<221>: misc_feature

<222>: (564)..(564)

<223>: n es a, c, g o t.

<220>

15: <221> misc_feature

<222>: (589)..(589)

<223>: n es a, c, g o t.

<400>: 2

imagen1

<210>: 3

<211>: 599

5: <212> ADN

<213>: Homo sapiens

<220>

<221>: misc_feature

<222>: (495)..(495)

10: <223> n es a, c, g o t.

<220>

<221>: misc_feature

<222>: (527)..(527)

<223>: n es a, c, g o t.

15: <220>

<221>: misc_feature

<222>: (539)..(539)

<223>: n es a, c, g o t.

<220>

5: <221> misc_feature

<222>: (598)..(598)

<400>: 3

imagen1

<210>: 4

10: <211> 436

<212>: ADN

<213>: Homo sapiens

<400>: 4

imagen1

<210>: 5

<211>: 877

<212>: ADN

5: <213> Homo sapiens

<400>: 5

imagen1

<210>: 6

<211>: 371

<212>: ADN

5: <213> Homo sapiens

<400>: 6

imagen1

<210>: 7

<211>: 301

<212>: ADN

5: <213> Homo sapiens

<220>

<221>: misc_feature

<222>: (165)..(165)

<223>: n es a, c, g o t.

10: <400> 7

imagen1

<210>: 8

<211>: 587

15: <212> ADN

<213>: Homo sapiens

<400>: 8

imagen1

<210>: 9

<211>: 532

<212>: ADN

5: <213> Homo sapiens

<220>

<221>: misc_feature

<222>: (477)..(477)

<223>: n es a, c, g o t.

10: <400> 9

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de polinucleótidos que se seleccionan del grupo constituido por: SEQ ID I.1, SEQ ID I.2, SEQ ID I.3, SEQ ID I.4, SEQ ID I.5, SEQ ID I.6, SEQ ID I.7, SEQ ID I.8 y SEQ ID I.9 o secuencias parciales de los mismos con una longitud de 20 a 200 nucleótidos como marcadores de actividad génica para la clasificación de pacientes como “no infectados sin fallo multiorgánico” o como “no enfermos de fallo multiorgánico infeccioso” o como “enfermos de fallo multiorgánico infeccioso”.
2.

Uso según la reivindicación 1, en el que las secuencias parciales de los polinucleótidos tienen una longitud de 20-80 nucleótidos.
3.

Uso según la reivindicación 1-2, caracterizado porque una expresión en exceso de SEQ ID I.1 y una expresión en defecto de SEQ ID I.3 o una expresión en exceso de SEQ ID I.2 y una expresión en defecto de SEQ ID I.4 indica la clasificación “ninguna infección y sin fallo multiorgánico”;

una expresión en exceso de SEQ ID I.3 y una expresión en defecto de SEQ ID I.6 o una expresión en exceso de SEQ ID.I,4 y una expresión en defecto de SEQ ID I.5 indica la clasificación “fallo multiorgánico no infeccioso”;

una expresión en exceso de SEQ ID I.5 y una expresión en defecto de SEQ ID I.7 o una expresión en exceso de SEQ ID

I.8 y una expresión en defecto de SEQ ID I.9 indica la clasificación “fallo multiorgánico infeccioso”.
4.

Uso según la reivindicación 1-3, caracterizado porque las secuencias o las secuencias parciales de polinucleótidos se sustituyen al menos parcialmente por análogos sintéticos, aptámeros y/o ácidos nucleicos de péptidos.
5.

Uso según la reivindicación 1-4 en una micromatriz.
6.

Procedimiento para la clasificación de pacientes que están enfermos de un fallo multiorgánico infeccioso o no infeccioso que comprende las etapas:

aislar ARNm de una muestra de paciente;

marcar el ARNm con una unidad detectable;

poner en contacto el ARNm marcado con los marcadores de actividad génica según la reivindicación 1 de manera que los marcadores de actividad génica individuales también estén presentes separados entre sí después de la puesta en contacto;

lavar los marcadores de actividad génica hibridados;

estimular la unidad detectable de manera que ésta emita una señal;

leer las señales de hibridación para cada marcador de actividad génica individual y comparar con una muestra de referencia de un paciente sano,

indicando una expresión en exceso de SEQ ID I.1 y una expresión en defecto de SEQ ID I.3 o una expresión en exceso de SEQ ID I.2 y una expresión en defecto de SEQ ID I.4 la clasificación “ninguna infección y sin fallo multiorgánico”;

indicando una expresión en exceso de SEQ ID I.3 y una expresión en defecto de SEQ ID I.6 o una expresión en exceso de SEQ ID I.4 y una expresión en defecto de SEQ ID I.5 la clasificación “fallo orgánico no infeccioso”; y

indicando una expresión en exceso de SEQ ID I.5 y una expresión en defecto de SEQ ID I.7 o una expresión en exceso de SEQ ID I.8 y una expresión en defecto de SEQ ID I.9 la clasificación “fallo multiorgánico infeccioso”.
7.

Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la muestra de paciente comprende fluidos corporales, especialmente sangre, líquido cefalorraquídeo, orina, líquido ascítico, líquido seminal, saliva, líquido de punción, contenido celular o una mezcla de los mismos.
8.

Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7, en el que el procedimiento se realiza con una micromatriz.
9.

Micromatriz para la clasificación de pacientes con fallo multiorgánico infeccioso o no infeccioso constituida por polinucleótidos con las secuencias SEQ ID I.1, SEQ ID I.2. SEQ ID I.3, SEQ ID I.4, SEQ ID I.5. SEQ ID I.6, SEQ ID I.7, SEQ ID I.8 y SEQ ID I.9 o secuencias parciales de los mismos con una longitud de 20 a 200 nucleótidos.
10.

Dispositivo para la clasificación de pacientes con fallo multiorgánico infeccioso o no infeccioso que comprende;

un módulo para la preparación de muestras de la muestra de paciente obtenida in vitro, un módulo para la hibridación de la muestra de paciente con sondas de actividad génica que se derivan de los clasificadores de actividad génica constituido por clasificadores de actividad génica con las secuencias SEQ ID I.1, SEQ ID I.2, SEQ ID I.3, SEQ ID

I.4, SEQ ID I.5, SEQ ID I.6, SEQ ID I.7, SEQ ID I.8 y SEQ ID I.9 o secuencias parciales de las mismas con una longitud de 20 a 200 nucleótidos,

un módulo para la lectura de las señales de hibridación,

un módulo para el análisis de imágenes de las señales de hibridación leídas,

un módulo que hace posible la comparación automática con clasificadores de actividad génica guardados de pacientes sanos y

un módulo que hace posible la visualización de la comparación resultante.