ES2352559T3

ES2352559T3 - Procedimiento y sistema de medida de velocidad del flujo sanguíneo.

Info

Publication number: ES2352559T3
Application number: ES05744612T
Authority: ES
Inventors: Georges Le Goualher; Nicholas Ayache; Aymeric Perchant; Francois Lacombe
Original assignee: Mauna Kea Technologies SA
Current assignee: Mauna Kea Technologies SA
Priority date: 2004-04-02
Filing date: 2005-03-25
Publication date: 2011-02-21
Anticipated expiration: 2025-03-25
Also published as: EP1740974A1; JP4758418B2; EP1740974B1; FR2868279B1; IL178347A0; CN1957266A; IL178347A; WO2005098474A1; AU2005230544A1; ATE479909T1; DE602005023292D1; CA2561770C; US7911590B2; US20080045848A1; FR2868279A1; JP2007530197A; CA2561770A1; CN100592107C; AU2005230544B2

Abstract

Procedimiento para medir la velocidad de un objeto microscópico en movimiento en el seno de un flujo, como un flujo sanguíneo, a partir de un microscopio de barrido luminoso, este procedimiento comprende las etapas siguientes: - adquisición de una imagen por barrido luminoso x e y de un plano que contiene dicho objeto; - detección en el plano (x, y) de una estría engendrada por el desplazamiento de dicho objeto en el momento de la adquisición de dicha imagen; el procedimiento está caracterizado por que comprende las etapas que consisten en - la determinación de la pendiente de dicha estría en el plano (x, y); y - la estimación de la velocidad Vg de dicho objeto a partir de la pendiente así determinada.

Description

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Procedimiento y sistema de medida de velocidad del flujo sanguíneo.

La presente invención se refiere a un procedimiento para medir la velocidad de un objeto microscópico en movimiento en un flujo, como un flujo sanguíneo, utilizando un microscopio de barrido luminoso.

Se aplica particularmente pero no exclusivamente al estudio de la microcirculación en el cual la problemática es detectar partículas tales como glóbulos rojos o leucocitos en desplazamiento, estimar la dirección de desplazamiento de estas partículas así como sus velocidades.

La invención presente puede no obstante aplicarse a otros campos tales como por ejemplo los microfluidos.

La estimación de la velocidad de desplazamiento de un objeto utilizando un sistema de formación de imágenes se hace convencionalmente a partir de una secuencia de imágenes representando este objeto en movimiento. La hipótesis de base es que la velocidad de adquisición del sistema de formación de imágenes es tal que el objeto efectúa pequeños desplazamientos de una imagen a otra. La presencia del objeto, en diferentes posiciones, sobre la serie temporal de imágenes permite entonces determinar, mediante un calibrado del sistema de adquisición, la velocidad de este último.

Se conoce el documento "Erythrocite velocity measurement in microvessels by a two-slit photometric method" de H. Wayland y RC. Johnson, publicado en J. Appl. Physiol. 22 (2): 333-337, 1967, y que describe un método fotométrico de dos hendiduras. La medida por método fotométrico de dos hendiduras es probablemente la técnica más antigua de medida automatizada de velocidad del flujo sanguíneo. Este método mide la velocidad de los glóbulos rojos y se aplica preferentemente a los capilares y a las pequeñas venillas por las cuales circulan en fila los glóbulos, aislados o por pequeños agregados. La medida se hace sobre una vídeo secuencia, con la ayuda de dos hendiduras colocadas sobre la pantalla mostrando la secuencia. Ambas hendiduras son paralelas y están orientadas perpendicularmente al vaso sobre el cual se realiza la medida. Un fotodiodo está presente frente a cada una de las hendiduras. El aparato utilizado propone dos modos de medidas. En un primer modo, las dos hendiduras están espaciadas (en distancia equivalente sobre el tejido) de 45 \mum a 70 \mum. La medida de velocidad se realiza por un cálculo de la intercorrelación de las dos señales provenientes de los fotodiodos. En el segundo modo de medida, las dos hendiduras están muy próximas 7,4 \mum en distancia equivalente tejido, es decir una distancia ligeramente inferior al diámetro medio de un glóbulo rojo. En consecuencia, dos señales consecutivas generadas respectivamente por el diodo de entrada y el diodo de salida son causadas por el mismo glóbulo, y es posible pues calcular la velocidad de este glóbulo. Sin embargo, las limitaciones del método son la necesidad de hacer la medida sobre vasos muy finos con el fin de limitar la observación a un glóbulo rojo, y las velocidades medidas, que debido a la frecuencia de imágenes de 30 imágenes por segundo, no pueden sobrepasar los 2 mm/s.

También se conoce el método de la proyección espacio-temporal ("Line shift Diagram"). Este método es una extensión de la precedente. En lugar de muestrear la señal en dos puntos, el usuario selecciona una zona de interés, es decir un rectángulo marcado en un vaso. En cada imagen, una media de los niveles de gris es calculada sobre la anchura del vaso en cada punto del eje del vaso, la señal de la zona de interés es proyectada en una dimensión sobre el eje del vaso. Luego las señales unidimensionales obtenidas para cada imagen son alineadas verticalmente para dar una imagen espacio-temporal que deja aparecer las huellas de los glóbulos. La velocidad es estimada correlacionando las señales adyacentes. Este método es utilizado por el software CapImage® y Capiscope®, acompañado con el aparato de adquisición Cytoscan®. Dicho método se describe particularmente en el documento "Ortogonal Polarisation Spectral Imagina: A new method for study of microcirculation." de W. Groner, I.W. Winkelman, A.G. Harris, G. Inde, G.I. Bouma, K. Messmer, y R.G. Nadeau, publicado en Nature Medecine, 5 :1209-1213, 1999. La principal limitación es la gama de velocidad medida, que no puede sobrepasar los 2 mm/s debido a la frecuencia de las imágenes (25 imágenes/segundo ó 50 imágenes/segundo si las medidas son realizadas alternativamente sobre ambos campos entrelazados del flujo vídeo).

El SLO para "Scanning Laser Ophtalmoscope" en lengua inglesa, es un aparato cuyo principio se basa en la microscopía confocal no fibrada. Las imágenes son capturadas a una velocidad de 50 imágenes entrelazadas por segundo. El método de medida de velocidad utilizado por este aparato se basa en el control de célula. Una misma imagen está constituida por campos entrelazados correspondientes a dos instantes espaciados por 20 ms, un glóbulo en movimiento aparece pues en dos lugares diferentes sobre la imagen, una vez sobre las líneas pares y otra vez sobre las líneas impares. Una vez localizadas las dos imágenes del glóbulo, la medida de la velocidad es inmediata. El gran campo del aparato (hasta 1200 \mum permite medir velocidades de varios cm/s). Las limitaciones de este aparato son debidas principalmente al control de los glóbulos: hacen falta glóbulos señalados de gran tamaño (12 \mum para los leucocitos) y en pequeño número. Dicho método parece inaplicable a la medida de velocidad de glóbulos rojos, cuyas dimensiones son más pequeñas (7 - 8 \mum), de concentración mucho más fuerte (1.000 veces más importante que la de los glóbulos blancos) y más difíciles de señalar.

Otro método de medida que está asociado corrientemente con el Cytoscan ® o el SLO es la medida de velocidad de glóbulos rojos por efecto Doppler. El efecto Doppler describe la diferencia frecuencial que experimenta una onda reflejada por un objeto en movimiento con relación al observador. En el caso del flujo sanguíneo, los objetos en movimiento son los glóbulos rojos. Una onda monofrecuencial (por ejemplo un láser) de longitud de onda determinada es enviada sobre un vaso sanguíneo. La medida de la velocidad por efecto Doppler tiene la ventaja de ser muy rápida y precisa. Según el material y los programas de análisis utilizados las velocidades máximas mensurables varían de 1 mm/s a varios cm/s. Un inconveniente del Doppler viene dado por la dificultad en identificar precisamente la zona sobre la cual la velocidad es medida, sobre todo en profundidad. La luz reflejada puede provenir de diferentes vasos dónde la sangre circula a velocidades diferentes.

Todavía conocemos el método por Análisis Espacio-temporal. Dicho método para la medida de la velocidad de leucocitos se describe en el documento "Measuring microcirculation using spatiotemporal llena de image analysis". Por Yoshinobu Sato et al., CVRMed, páginas 302-308, 1995. Este análisis contiene tres etapas principales: i) en un primer paso, el vaso es extraído de la imagen por una segmentación hecha sobre el histograma de las varianzas temporales de los píxeles de las tramas de la secuencia. ii) Una imagen espacio-temporal es entonces construida a partir de las imágenes sucesivas del vaso. Esta imagen puede ser tridimensional, o bidimensional si cada imagen de la secuencia es proyectada sobre el eje o los contornos del vaso. iii) Las huellas dejadas en la imagen espacio-temporal por el movimiento de los leucocitos son luego reforzadas por la aplicación de un banco de filtros de orientación selectiva (por ejemplo un banco de filtros de Gabor). Las huellas son extraídas por el método del valor umbral de las mejores respuestas. La última etapa consiste en conectar entre ellas las huellas para reconstituir las trayectorias enteras de los leucocitos. La obtención de estas huellas permite luego por un cálculo de sus tangentes tener una estimación de la velocidad de los leucocitos sobre sus trayectorias.

El documento US 6 473 698 describe un método según el preámbulo de la reivindicación 1.

También en el área del análisis espaciotemporal, se conocen los documentos:

- "Two-photon imaging of neocortical microcirculation". D. Kleinfeld and W. Denk; In Imaging Neurons: A Laboratory Manual (R. Yuste, F. Lanni, y A. Konnerth, editors), 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, pp. 23.1-23.15; accesible en Internet en la dirección siguiente: http://physics.ucsd.edu/neurophysics/publications/kleinfeld_
denk_cshl_2003.pdf; y

- "Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli" E. Chaigneau et al., PNAS, 28 de octubre, 2003; 100 (22): 13081 - 13086; accesible en Internet en la dirección siguiente: http://www.pnas.org/cgi/content/
full/100/22/13081.

Estos documentos describen un método de medida de velocidad realizando, con ayuda de un microscopio no fibrado, varios barridos sucesivos sobre el eje del vaso sanguíneo. Se obtienen pues varias imágenes "unidimensionales" de un mismo segmento a instantes diferentes sucesivos. Estas imágenes son puestas una tras otra para formar una visualización global cuyo orden es una indicación temporal. El movimiento de las partículas en el vaso sanguíneo se muestra en forma de bandas oblicuas. Se determina la velocidad instantánea calculando la pendiente de cada banda sobre la visualización global. No obstante, el inconveniente de este método reside en el hecho de que es indispensable situar el dispositivo de adquisición paralelamente al eje del vaso sanguíneo. Por otro lado, la constitución de la visualización global necesita la adquisición de varias imágenes del mismo segmento.

En la inmensa mayoría de las técnicas que han sido presentadas, la medida de la velocidad se basa en un análisis entre por lo menos dos imágenes sucesivas de una adquisición; lo que por otro lado causa problemas de pérdida de definición y de correspondencia entre imágenes. Consecuentemente, la gama de velocidad mensurable por estas técnicas depende del campo de vista así como de la frecuencia de imágenes. O, para sistemas de formación de imágenes por barrido que presentan un pequeño campo de vista, por ejemplo del orden de 166 \mum x 118 \mum, y velocidades de adquisición, por ejemplo del orden de 12 imágenes por segundo, una partícula desplazándose a una velocidad superior a 1,8 mm/s atravesará el campo de observación entre dos imágenes sucesivas, lo que hace imposible la utilización de la inmensa mayoría de las técnicas citadas anteriormente.

La presente invención pretende remediar los citados inconvenientes proponiendo un procedimiento apto para medir la velocidad de los glóbulos rojos particularmente.

La presente invención tiene por objeto la medida de velocidad de partículas en movimiento rápido por medio de un sistema de formación de imágenes por barrido. Por movimiento rápido, se entiende una velocidad superior a aproximadamente 2 mm/s.

Se logra el fin deseado con un procedimiento para medir la velocidad de un objeto microscópico, como por ejemplo los glóbulos rojos y los leucocitos en movimiento en un flujo, como el flujo sanguíneo, utilizando un microscopio de barrido luminoso. Según la invención, este procedimiento comprende las siguientes etapas:

- Adquisición de una imagen por barrido luminoso en las direcciones x e y de un plano que contiene dicho objeto, este plano es también llamado campo explorado subsuperficial situado a algunos \mum en una muestra o un tejido biológico;

- Detección en el plano (x, y) de una estría engendrada por el desplazamiento de objeto dicho en el momento de la adquisición de dicha imagen;

- Determinación de la pendiente de dicha estría en el plano (x, y);

- Estimación de la velocidad Vg de objeto dicho a partir de la pendiente así determinada.

Podemos utilizar un microscopio, confocal o no, de barrido luminoso, particularmente láser, en modo fibrado o no fibrado. Para ejecutar el modo de realización no fibrado, podemos utilizar, adaptando la electrónica de tratamiento, un aparato de tipo SLO u cualquier otro aparato de adquisición de imagen por barrido (x, y) para el cual las velocidades de barrido están adaptadas a la implementación del procedimiento según la invención.

Complementariamente a lo anterior, se puede utilizar de modo no limitativo un microscopio, confocal o no, láser fibrado, particularmente monofibra, de barrido distal. Este barrido distal puede ser realizado por un microespejo, por un desplazamiento de lentes o de ópticas, por barrido espectral... Se puede también utilizar un sistema mono-fibrado de barrido proximal donde el barrido luminoso es obtenido por desviación de un extremo de la fibra óptica en el seno de una cabeza óptica próxima del objeto observado.

Contrariamente a los métodos de análisis espacio-temporal de Kleinfeld y de Chaigneau donde se adquiere una sucesión de imágenes "unidimensionales" de un mismo segmento en el eje del vaso sanguíneo, en la presente invención, podemos utilizar una sola imagen adquirida por un barrido de plano bidimensional.

Contrariamente a la técnica anterior donde se miden estrías sobre una imagen espacio-temporal (t=f (x)), aquí las estrías son completamente diferentes ya que provienen de una imagen plano (y=f (x)), la noción temporal inducida en el sistema de barrido punto a punto en "Z". Nos servimos ventajosamente de una imagen morfológica. Por ejemplo, en el documento de Yoshinobu Sato según la técnica anterior, para conseguir estrías, se realizan varias imágenes en las cuales se extrae una sola línea en cada imagen, y se elabora así la imagen final t=f (x).

La utilización de un sistema de formación de imágenes por barrido, sistema en el cual el objeto en desplazamiento va a ser observado durante el tiempo de generación de una imagen (el tiempo de recorrido de trama), conduce a la aparición de estrías que permiten llegar a una estimación de la velocidad de objetos en desplazamiento a partir de una sola imagen. Estas estrías provienen pues de la interacción entre el objeto en movimiento y el sistema de barrido. La invención es particularmente notable por el hecho de que estas estrías son generalmente consideradas por el experto en la materia como parásitos que hay que eliminar en un sistema de formación de imágenes por barrido. Pues se saca provecho de elementos considerados como aberraciones en los microscopios de barrido láser, particularmente en modo fibrado. Para hacerlo,

\hbox{la invención contiene una etapa de
detección  de estrías en la cual se realizan las etapas
siguientes:}

- acentuación de un conjunto de estrías de la imagen por aplicación de un filtro;

- aplicación de un umbral para conservar las estrías más importantes;

- ajuste de una recta o de una elipse sobre cada una de estas estrías; e

- identificación de dicha estría.

Según la invención, teniendo en cuenta los órdenes de magnitudes de las velocidades de barrido y de las de objetos observados, es posible simplificar el modelo de la trayectoria del punto luminoso. Una primera simplificación consiste en considerar la trayectoria del punto luminoso como horizontal sobre la ventana de adquisición. Esta simplificación está justificada por el coeficiente mil existente entre la velocidad horizontal y la velocidad vertical del punto luminoso, el cálculo confirma que la posición vertical del punto luminoso varía menos de 0,1 \mum sobre la ventana de adquisición.

Una segunda aproximación es la de considerar el tiempo necesario para el punto luminoso para cubrir horizontalmente la ventana de adquisición como despreciable, es decir de considerar los objetos como inmóviles durante el trayecto de una línea de barrido. La velocidad de los objetos observados (en los vasos considerados, los glóbulos rojos tienen una velocidad inferior a 20 mm/seg.) con relación a la velocidad horizontal del punto luminoso (> 1 m/s) justifica esta aproximación.

Al final el barrido está modelizado por líneas de barrido horizontal instantáneo espaciadas espacialmente por una distancia V_{y}/f_{x}, con frecuencia f_{x} del barrido "x".

Una vez establecido el modelo del barrido, queda establecer el modelo de los objetos en movimiento, por ejemplo a continuación de los glóbulos rojos. Varios modelos han sido contemplados para describir los glóbulos rojos: del simple palito a un modelo tridimensional realista.

El modelo más simple que puede tener en cuenta las deformaciones observadas consiste en representar un glóbulo rojo por un palito vertical. En el caso de la utilización de este modelo, se obtiene una relación simple que vincula el ángulo \alpha de las estrías observadas (con relación al eje "x") a la velocidad vertical del barrido V_{y} y a la velocidad de desplazamiento horizontal V_{g}cos (\theta) del glóbulo:

1

con V_{y} la velocidad vertical del punto luminoso utilizado para el barrido, V_{g} la velocidad del glóbulo buscado, \theta el ángulo entre el vector V_{g} y el eje x de barrido rápido. Tan (\alpha) es la pendiente de las estrías.

\newpage

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Si la trayectoria de los glóbulos es supuestamente colineal a los bordes del vaso que transporta el objeto entonces es posible conocer \theta detectando los bordes del vaso y entonces acceder a la velocidad V_{g} del glóbulo.

En el caso general donde 9 es desconocido pero donde la longitud L de la estría es conocida, son factibles dos posibilidades:

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1) La medida D del glóbulo es conocida

En este caso, se considera t_{v} el tiempo de visibilidad del glóbulo, definido como el tiempo transcurrido entre la primera intersección y la última intersección de las trayectorias. El glóbulo tiene una velocidad vertical V_{g}sen (\theta) y una extensión vertical D. Se compara entonces el objeto con una barra perpendicular a la dirección de flujo, de longitud terminada lo suficientemente grande para extenderse sobre varias líneas de barrido horizontal. El punto luminoso es puntual y tiene una velocidad vertical V_{y}, pues t_{v} únicamente depende de la diferencia de velocidad vertical del punto luminoso y del glóbulo, y de D según la relación:

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2

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Las extensiones vertical L|sen (\alpha) y horizontal L|cos (\alpha) | de la estría observada están directamente conectadas a t_{v} y a las velocidades verticales del punto luminoso y horizontal del glóbulo por:

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3

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Las relaciones 2 y 3 permiten escribir:

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4

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Lo que, combinado a la relación (1), da un sistema de dos ecuaciones a dos desconocidos \theta y V_{y}. La resolución debe hacerse según el signo de V_{y}-V_{g}sen (\theta), es decir según si el punto luminoso se desplaza más o menos rápido verticalmente que el glóbulo.

En el caso de que ambas velocidades son iguales, el tiempo de visibilidad se vuelve infinito y la estría se vuelve infinitamente larga. Se tiene entonces V_{g}sen (\theta) = V_{y}, reemplazando en la relación (1), que es tan (\alpha) = tan (\theta). Por consiguiente, la estría es exactamente la trayectoria del glóbulo y la velocidad V_{g} es determinada por:

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5

\newpage

Si el punto luminoso se desplaza verticalmente más rápido que el glóbulo (V_{y}> V_{g}sen (\theta)), entonces la resolución del sistema (3) determina:

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6

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Si el punto luminoso se desplaza verticalmente menos rápido que el glóbulo (V_{y} <V_{g} sen (\theta)), entonces la resolución del sistema (3) determina

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7

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2) Cuando un barrido inverso está disponible

Si se dispone de otro barrido, inverso con relación al precedente, es decir de velocidad vertical-V_{y}, una estría de ángulo - \alpha y de longitud L' será observada. Se determina por:

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8

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El informe de las relaciones (4 y 8) permite escribir:

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9

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Dos casos entonces tienen que distinguirse: |V_{y}|> |V_{g}sen (\theta)| y |V_{y}| < |V_{g}sen (\theta) \splitvert (Si |V_{y}| = |V_{g}sen (\theta), entonces la relación (5) se aplica).

\newpage

Si |V_{y}|> |V_{g}sen (\theta)| Entonces se da la resolución:

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10

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Si |V_{y}| <|V_{g}sen (\theta)| Entonces se da la resolución:

11

En todo lo que precede, el objeto, como el glóbulo rojo, es asimilado a un palito vertical de longitud D. El experto en la materia comprenderá fácilmente que se puede reemplazar esta hipótesis por la de una esfera (o disco), más realista, incluso de una elipse o de una estructura más complicada todavía y estimar la diferencia entre el estado observado en este caso y el observado en el caso simple. Según la precisión buscada, convendrá tener en cuenta o no ésta diferencia.

En calidad de ejemplo, el glóbulo rojo puede ser representado en forma de una esfera sólida o de una forma bicóncava que posee una simetría de revolución. En ambos casos, se compara la proyección ortogonal en el plano de observación con un disco de radio R. Sobre la imagen adquirida, este disco en movimiento aparece como una elipse la que el ángulo \alpha entre la estría y el eje "x" se determina por:

12

La longitud del eje principal se determina por:

13

Con 14 y R el radio del disco considerado.

Simulaciones numéricas efectuadas con modelos más complejos de representación de los glóbulos rojos (superficies toroidales) muestran que el modelo del disco es suficiente para representar los glóbulos rojos.

Si la orientación \theta de la trayectoria del glóbulo es desconocida, pero la longitud L de las estrías está disponible, es posible calcular parcialmente la información de velocidad. Las relaciones (12 y 13) forman un sistema que vincula la pareja (\alpha, L) que son los parámetros observables en el momento de las adquisiciones a la pareja (\theta, V_{g}) que son los parámetros buscados.

Según otro aspecto de la invención, se propone un sistema de microscopio confocal por barrido luminoso en modo fibrado, utilizado para medir la velocidad del objeto microscópico en movimiento en el seno de un flujo, como el flujo sanguíneo, al comprender este sistema:

- medios para adquirir una imagen por barrido luminoso en x e y de un plano que contiene dicho objeto;

- medios para detectar una estría engendrada por el desplazamiento de dicho objeto en el momento de la adquisición de dicha imagen;

- medios para determinar la pendiente de dicha estría; y

- medios para estimar la velocidad V_{g} de dicho objeto a partir de la pendiente así determinada.

Otras ventajas y características de la invención aparecerán en el examen de la descripción detallada de una realización de ninguna manera limitativo a, y dibujos adjuntados, sobre los cuales:

- La figura 1 es un esquema general de un ejemplo de sistema de formación de imágenes confocal fibrado en el cual se aplica el procedimiento según la invención;

- La figura 2 es un esquema muy simplificado ilustrando el modo de barrido del sistema de formación de imágenes de la figura 1;

- La figura 3 es una imagen esquemática que representa estrías, esta imagen se deriva de una adquisición simulada; y

- La figura 4 es una vista esquemática de una etapa de selección de estrías.

Aunque la invención no esté limitada a esto, se describirá ahora el procedimiento según la invención puesto en práctica en un microscopio confocal de barrido láser en modo fibrado, este procedimiento se aplica al campo de la microcirculación, cuyos órdenes de magnitudes son los siguientes:

- Las arteriolas tienen un diámetro que varía entre 50 \mum y 100 \mum; los capilares son mucho más finos con un diámetro de 3 \mum a 8 \mum; y finalmente las venillas tienen un diámetro de 30 \mum a 50 \mum;

- La velocidad de los glóbulos rojos en estos vasos está comprendida en una gama que va de menos de 1 mm/s para los vasos más pequeños a algunas decenas de mm/s para las arteriolas;

- Los glóbulos rojos son unas células cuyo diámetro medio es de cerca de 7 \mum, a comparar con diámetros de 10 \mum a 15 \mum de los glóbulos blancos.

De manera general, para ejecutar la presente invención, podemos basarnos en el sistema descrito en el documento WO 2004/008952A1, "Method and equipment for fibre optic high-resolution, in particular confocal, fluorescente imaging", Mauna Kea Technologies, en el cual se utiliza una guía de imagen hecha de varios millares de fibras ópticas, una señal de excitación que es emitida por una fuente, desviada e inyectada por turno en una de las dicha fibras de guía, cada punto de excitación del tejido en la salida de fibra que emite a cambio una señal de fluorescencia recogida por dicha fibra, luego detectada y digitalizada para formar un elemento de imagen. Según un primer aspecto, el procedimiento descrito en este documento WO2004/008952A1 prevé la focalización del haz en la salida de fibra para excitar un plano subsuperficial y realizar una imagen confocal. Según un segundo aspecto, el procedimiento prevé producir un haz divergente en la salida de fibra susceptible de excitar un microvolumen del tejido desde la superficie. La señal de excitación es desviada a una velocidad que corresponde a la adquisición de un número de imágenes por segundo suficiente para una utilización en tiempo real y se detecta la señal de fluorescencia a una frecuencia de detección correspondiente a una frecuencia mínima de preparación de muestreo de las fibras una por una.

Sobre la figura 1 se ve un haz ordenado de fibras ópticas flexibles que forman una guía de imagen 1 con, sobre su extremo próximo, una fuente de luz 2 y un sistema de inyección de fibras que permite iluminar las fibras una por una y, sobre su extremo distal, una cabeza óptica 3 que permite enfocar el haz saliente de la fibra iluminada en un punto situado en una profundidad determinada del objeto observado 4. El sistema de inyección comprende varios elementos ópticos 5 precedidos de un sistema de barrido de fibras 6, como un desviador, que permite barrer las fibras una por una a una muy gran velocidad. Cada fibra es utilizada por turno para transportar el haz de iluminación y también el haz de vuelta correspondiente que proviene del objeto observado. La resolución espacial es obtenida por focalización del haz láser en un punto y por el carácter confocal que reside en la filtración espacial del objeto observado por las mismas fibras que las que han servido para la iluminación. Esto permite recibir, por medio de un fotodetector 9, exclusivamente la señal que proviene del objeto observado y realizar una imagen punto por punto.

La guía de imagen 1 está constituida por un gran número de fibras ópticas flexibles, por ejemplo 30 000 fibras de 2 \mum de diámetro y espaciadas por 3,3 \mum. En la práctica, se puede utilizar o el conjunto de las fibras de la guía de imagen, o un subconjunto escogido de estas fibras, por ejemplo centrado.

Los medios electrónicos e informáticos 7 de control, de análisis y de tratamiento numérico de la señal detectada y de la visualización comprenden particularmente las tarjetas siguientes:

- Una tarjeta de sincronización 8 que tiene como funciones:

- controlar de una manera sincronizada el barrido;

- conocer en cualquier momento la posición del punto luminoso láser así barrido; y

- administrar todas las demás tarjetas a través de un microcontrolador que él mismo puede ser pilotado;

- una carta detector 9 que comprende un circuito analógico que realiza particularmente una adaptación de impedancia, un convertidor analógico numérico luego un componente lógico programable (por ejemplo un circuito FPGA) que pone en marcha la señal;

- una tarjeta de adquisición numérica 10 que permite tratar un flujo de datos numéricos a frecuencia variable y fijarlo sobre una pantalla 11;

- una tarjeta gráfica 12.

Como variante, podemos utilizar una sola tarjeta que reagrupa los caracteres funcionales de estas diferentes tarjetas.

Estos medios electrónicos e informáticos 7, aptos para realizar las etapas del procedimiento según la invención, pueden presentarse en forma de un micro ordenador dotado de medio de tratamiento necesario para calcular la velocidad de los glóbulos rojos.

La figura 2 es un esquema muy simplificado que ilustra el modo de barrido del sistema de formación de imágenes de la figura 1. El punto luminoso láser de barrido está simbolizado por los punteados 13 que describen trayectoria de barrido clásico en una ventana cuadrada de barrido 14. La trayectoria del punto luminoso láser 13 es una "Z" de arriba abajo. La velocidad horizontal V_{x} según el eje horizontal A_{x} es supuesto muy superior ante la velocidad V_{y} según el eje A_{y}. Esta hipótesis vuelve a no hacer caso al tiempo de alcance del glóbulo por el punto luminoso entre dos barridos horizontales. Esto también confunde el efecto observado sobre las líneas pares con el observado sobre las líneas impares. En calidad de ejemplo, la velocidad V_{y} puede de 3 ser mm/s, mientras que la de V_{x} puede ser de 5 m/s.

Sobre la figura 2, dentro de la ventana de barrido 14, está también representada la guía de imagen 1 según una vista en corte transversal. Las fibras ópticas están representadas en forma de círculos ordenados. La zona 15 explorada corresponde sólo a un número limitado de fibras ópticas situadas dentro de un rectángulo. El haz láser está sucesivamente inyectado a cada una de las fibras ópticas. La imagen representada sobre la figura 3, simula una adquisición, es decir que cada fibra ha sido inyectada sólo una sola vez. Esta imagen pone de manifiesto estrías oblicuas correspondientes a la interacción entre el sistema de barrido y las partículas en movimiento.

La aparición de estas estrías se explica por la interacción entre la imagen de los glóbulos rojos y el mecanismo de formación de la imagen. El punto luminoso láser efectúa el barrido según una trayectoria en forma de Z, se efectúa una medida en un conjunto de posiciones del láser, por ejemplo 896 medidas por líneas sobre 640 líneas. Un glóbulo rojo en movimiento va a ser intersecado en una posición determinada sobre una línea del barrido. En la línea siguiente, este glóbulo está todavía intersecado, se ha desplazado sin embargo con relación a la línea precedente. Este fenómeno continúa mientras exista la intersección entre la línea de barrido y el glóbulo. Este fenómeno crea entonces una estría cuya inclinación depende de la velocidad del glóbulo rojo.

Sobre la figura 4, después de adquisición de una imagen, las estrías son puestas en evidencia. Una fijación de umbral permite conservar sólo las estrías más importantes. Cada estría es luego encuadrada por una elipse que permite definir una pendiente. Luego, los medios electrónicos e informáticos 7 determinan la pendiente de cada estría para calcular la velocidad de cada glóbulo rojo.

La presente invención permite pues determinar la velocidad a partir de una sola imagen. Esto permite evitar particularmente problemas de pérdida de definición de durante la coordinación de imágenes. Permite ventajosamente aprehender velocidades importantes comparadas en frente del campo de vista y de la frecuencia de adquisición. En calidad de ejemplo, un sistema de adquisición de imagen de 11 Hz permite aprehender velocidades del orden de 5 - 25 mm/seg., siendo velocidades imposibles a estimar con la mayoría de las técnicas de la práctica anterior.

Preferentemente, se mide la velocidad de glóbulo cuyo movimiento vertical no va en contra del punto luminoso. De manera general el ángulo de la trayectoria debe situarse entre el horizontal y el ángulo crítico al cual la velocidad vertical del glóbulo se vuelve igual a la del punto luminoso.

Por supuesto, la invención no está limitada a los ejemplos que han sido descritos y las numerosas estructuras pueden ser aportadas a estos ejemplos sin salir del marco de la invención. Podemos contemplar particularmente medidas hechas sobre varias estrías, incluso sobre varias imágenes con el fin de mejorar la precisión.

Claims

1. Procedimiento para medir la velocidad de un objeto microscópico en movimiento en el seno de un flujo, como un flujo sanguíneo, a partir de un microscopio de barrido luminoso, este procedimiento comprende las etapas siguientes:

- adquisición de una imagen por barrido luminoso x e y de un plano que contiene dicho objeto;

- detección en el plano (x, y) de una estría engendrada por el desplazamiento de dicho objeto en el momento de la adquisición de dicha imagen; el procedimiento está caracterizado por que comprende las etapas que consisten en

- la determinación de la pendiente de dicha estría en el plano (x, y); y

- la estimación de la velocidad V_{g} de dicho objeto a partir de la pendiente así determinada.

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2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que la etapa de la detección de la estría comprende las etapas siguientes

- aplicación de un umbral para conservar las estrías más importantes;

- ajuste de una recta o de una elipse sobre cada una de estas estrías; e

- identificación de dicha estría.

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3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que la velocidad V_{g} de dicho objeto está determinada por la relación siguiente

V_{g}*cos (\theta) = V_{y}/tan (\alpha) con V_{y} la velocidad vertical del punto luminoso utilizado para el barrido, y "\alpha" el ángulo entre el eje horizontal "x" y la estría.

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4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que el ángulo \theta se obtiene por detección de los bordes de vasos sanguíneos que transportan el objeto.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que para obtener el ángulo \theta, se asimila dicho objeto a un palito vertical de altura terminada D y se calcula el ángulo \theta a partir de la relación siguiente:

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en donde L es la longitud de la estría.

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6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que en caso en que V_{g}*sen (\theta) <Vy:

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7. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que en caso en que V_{g}*sen (\theta)> V_{y}:

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8. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que se adquiere una segunda imagen del mismo plano pero en un barrido inverso, y se utiliza la relación siguiente:

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en donde L' es la longitud de la estría en el momento del barrido inverso.

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9. Procedimiento según la reivindicación 8 y 5, caracterizado por que cuando |Vg* sen (\theta)| <|Vy|:

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en donde L es la longitud de la estría en el primer sentido de barrido, y L' la longitud de la estría en el momento del barrido inverso.

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10. Procedimiento según la reivindicación 5 y 8, caracterizado por que cuando |V_{g}*sen (\theta)| > |Vy|:

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11. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que cuando V_{g}*sen (\theta) = V_{y}, para determinar a V_{g} y \theta se utiliza además la relación siguiente:

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12. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que dicho objeto es un glóbulo rojo, se asimila su forma sobre la imagen adquirida a una elipse de radio R cuyo ángulo \alpha entre la estría y el eje "x" está determinado por:

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Y/y la longitud principal del eje está determinada por:

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Con 25

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que se utiliza un microscopio confocal.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que se utiliza un microscopio de barrido luminoso en modo fibrado.

15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que se utiliza un microscopio de barrido luminoso no fibrado.

16. Sistema de microscopio de barrido luminoso, utilizado para medir la velocidad de un objeto microscópico en movimiento en el seno de un flujo, tal como un flujo sanguíneo, este sistema que aplica un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes; este sistema comprende:

- medios para adquirir una imagen por barrido luminoso x e y de un plano que contiene dicho objeto;

- medios para detectar en el plano (x, y) una estría engendrada por el desplazamiento de dicho objeto en el momento de la adquisición de dicha imagen;

- medios para determinar en el plano (x, y) la pendiente de dicha estría; y

17. Sistema según la reivindicación 16, caracterizado por que en el curso de la detección de la estría, el sistema comprende:

- medios para acentuar un conjunto de estrías de la imagen por aplicación de un filtro;

- medios para aplicar un umbral para conservar las estrías más importantes;

- medios para ajustar una elipse sobre cada una de estas estrías; y

- medios para identificar dicha estría.

18. Sistema según reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado por que se utiliza un microscopio confocal.

19. Sistema según uno cualquiera reivindicaciones 16 a 18, caracterizado por que se utiliza un microscopio de barrido luminoso en modo fibrado.

20. Sistema según uno cualquiera reivindicaciones 16 a 18, caracterizado por que se utiliza un microscopio de barrido luminoso no fibrado.