CN1957266A - 用于测量血流速度的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及采用光扫描显微镜测量颗粒在流体中移动的速度的方法，颗粒例如是红细胞，流体例如是血流。本发明方法包括如下步骤：通过在含有所述物体的平面上进行x和y光扫描而捕获图像；在平面(x，y)上检测平面(x，y)上的标记；由如此确定的斜率估计物体的速度v_x。

Description

用于测量血流速度的方法和系统

本发明涉及用光扫描显微镜测量微观物体在流体例如血流中移动的速度的方法。

该方法特别地、但是不惟一地被应用于微循环研究，在该研究中，困难在于检测颗粒如移动的红细胞或者白细胞，估计这些颗粒的移动方向及其速度。

然而，本发明可被应用于其他领域，如显微流体学。

通常使用反映移动中的物体的顺序图像，采用成像系统来估计该物体的移动速度。基本的假设是，检测系统的捕获速度(acquisitionrate)使得物体从一张图像缓慢移动到下一张图像。物体在图像序列的在不同位置上的出现，使得可能借助于对探测系统的校正来确定后者的速度。

在J.Appl.Physiol.22(2)：333-337，1967中出版的文章H.Wayland和RC.Johnson，“Red blood cell velocity measurement in microvessels bya two-slit photometric method”中描述了一种双狭缝光度法，是已知的。通过双狭缝光度法进行测量可能是用于自动测量血流速度的最古老方法。该方法测量红细胞的速度，并优选应用于毛细血管和小静脉中，血细胞在小静脉中以单列纵队、分离的或者小聚集体形式循环。使用两个放置在显示顺序的屏幕上的裂缝，在视频序列(videosequence)上进行测量。这两个裂缝是平行的，并且垂直于进行测量的血管。发光二极管与两个裂缝中的每一个相对放置。所用的设备提供了两种测量方法。在第一种方法中，两个裂缝相隔45-70μm(在组织上处于相等的距离)。通过计算源自发光二极管的两个信号的相关度来测量速度。在第二种测量方法中，两个裂缝十分靠近：7.4μm的相等的组织距离，即稍微小于红细胞平均直径的距离。结果，分别由上、下游二极管发出的两个连续信号是由同一个血细胞产生的，因此可能计算该血细胞的速度。然而，该方法的局限在于需要在极细的血管中进行测量，以便将观察限制在一个红细胞上，所测量的速度是每秒30张图像的图像频率的结果，它不能超过2mm/s。

时空投影方法(“线移图”)也是已知的。该方法是前一种方法的延伸。不必在两个点上对信号采样，使用者可以选择一个感兴趣的区域，即标记在血管中的矩形。在每张图像中，根据血管轴线的各个点上的血管宽度，计算灰度的平均值，将感兴趣的区域的信号线性投射到血管的轴线的一个方向上。然后，垂直排列所捕获的每张图像的一维信号，以生成一个显示血细胞轨迹的时空图像。将相邻的信号关联来估计速度。这种方法被用于CapImage和Capiscop软件程序中，以及Cytoscan捕获设备中。这种方法特别地被描述在出版在NatureMedictine，5：1209-1213，1999的文章W.Groner，I.W.Winkelaman，A.G.Harris，G..Inde，G.I.Bouma，K.Kessmer和R.G.Nadeau，“Orthogonal Polarization Spectral Imagine：A new method for study ofmicrocirculation.”。主要的局限在于由于图像频率(如果可选择地在两个视频流的交错视野中进行测量，图像频率为25张图像/秒或者50张图像/秒)，所测量的速度范围不能超过2mm/s。

SLO(扫描激光检眼镜)是一种原理基于非光纤共焦显微镜的设备。以每秒50张交错图像的速度捕获图像。该设备所用的测量速度的方法基于细胞监测。同一张图像是由对应于两个间隔20秒的瞬时的交错场构成，因此移动中的血细胞出现在图像上的两个不同位置上，一次位于偶数行，而另一次位于奇数行。一旦定位了该血细胞的两种图像，可立即测量速度.该设备的宽视野(最高达到1200μm)，使得可能测量几cm/s的速度。这种设备的局限主要是由于对血细胞的监测；要求所标记的血细胞尺寸大(白细胞为12μm)并且数量少。这种方法似乎不能被应用于测量红细胞的速度，红细胞的尺寸较小(7-8μm)处于远远地高的浓度下(比白细胞浓度高1000倍)，并且更难标记。

另一种通常与Cytoscan或者SLO结合使用的测量方法是通过多普勒效应测量红细胞的速度。多普勒效应描述相对于观察者移动的物体所反射的光波所经历的频移。对于血流来说，移动的物体是红细胞。给定波长的单频波(例如激光)沿着血管被发送。通过多普勒效应测量速度具有快速和精确的优点。根据所用的材料和分析软件，最大可测量速度在1mm/s到数mm/s之间变化。多普勒效应的缺点在于难以精确地确定要测量速度的区域，特别是深度方面。被反射的光可来源于不同的血管，血细胞在这些血管中以不同速度循环。

时空分析方法也是已知的。这种用于测量白细胞速度的方法在Yoshinobu Sato等人，“Measuring microcirculation usingspatiotemporal image analysis”，CVRMed，302-308，1995中被描述。这种分析方法包括三个主要步骤：i)首先，通过在序列框架的像素的时间变量的柱形图上进行区段化，来从图像中提取血管。ii)然后，由连续的血管图像构建时空图像。如果每张顺序图像被沿着血管的轴线或者轮廓投射，该图像可以是三维的或者平面的。iii)然后，通过在所选方向上应用滤波器组(例如Gabor滤波器组)加强由白细胞移动留在时空图像中的轨迹。通过设立最佳响应的阈值，来提取轨迹。最后步骤包括将轨迹连接在一起，来重新构建白细胞的完整轨迹。捕获这些轨迹使得可能通过计算出其正切值，以达到估计白细胞在其轨迹上的速度的目的。

在时空分析领域还已知的有文章：

-“Two-photon imaging of neocortical microcirculation.”D.Kleinfeld和W.Denk；In Imaging Neurons：A Laboratory Manual(R.Yuste，F.Lanni和A.Konnerth编辑)，1999，Cold Spring HarborLaboratary Press，NY，23.1-23.15；可以从如下网址获得：

http：//physics.ucsd.edu/neurophysies/publieations/kleinfeld_denk_c shl_2003.pdf；和

“Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulbglomeruli”E.Chaigneau等人，PNAS，2003年10月28日；100(22)：13081-13086；可以从如下网址获得：

http：//www.pnas.org/cgi/content/full/100/22/13081。

这些文章描述了一种测量速度的方法，通过使用非光纤显微镜，沿着血管的轴线进行几个连续的扫描。从而在不同的连续瞬间，从相同区段中捕获几张“一维”图像。将这些图像首尾连接放置，形成全面显像，其纵座标是时间轴。颗粒在血管中的移动以斜线(obliqueband)形式显示。通过计算全面显像上各条线的斜率，来确定各点的速度。但是，该方法的缺陷在于，事实上将捕获装置与血管轴线平行放置是必要的。而且，为了构建全面显像，有必要从相同区段捕获数张图像。

在大部分刚介绍的技术中，速度测量基于对至少两张连续的捕获图像的分析；这额外地造成图像混乱和进行图像对应的问题。结果，通过这些方法测量的速度范围取决于视野以及图像频率。对于具有小视野，如166μm×118μm量级的视野和低的捕获速度，例如每秒12张图像量级的速度的扫描成像系统，以超过1.8mm/s的速度移动的颗粒将会穿过两张连续图像之间的观察视野，这使得不可能使用大部分前面提及的方法。

本发明的目的在于通过提供一种方法克服了前面提及的缺陷，该方法特别可用于测量红细胞的速度。

本发明的目标在于借助于扫描成像系统来测量快速移动的颗粒的速度。快速移动是指速度超过约2mm/s。

用一种方法实现期望的目标，该方法使用光扫描显微镜测量微观物体的速度，如红细胞和白细胞在流体如血流中移动的速度。按照本发明，该方法包括如下步骤：

-通过在含有所述物体的平面的x轴和y轴方向进行光扫描来捕获图像，该平面也被称作为位于深入样本或者生物组织几μm处的表面下的图像场；

-在捕获所述图像的过程中，在平面(x，y)中检测由所述物体移动产生的脊线(ridge)；

-确定平面(x，y)中的所述脊线的斜率；

-从如此确定的斜率估计所述物体的速度V_g。

可以以光纤或者非光纤的模式，使用共焦或者非共焦的光扫描显微镜，特别是激光扫描。为了实施非光纤的实施方案，通过适应处理电子学，可以使用SLO型设备或者任何其他(x，y)扫描图像捕获设备，该设备的扫描速度适合于实施按照本发明的方法。

除了上述内容外，可能以非限制性方式将光纤，特别是单光纤的、激光的、共焦的或者非共焦的显微镜与远端扫描一起使用。可以通过微镜(micromirror)，通过移动透镜或者光学仪器，通过光谱扫描，来实现这种远端扫描。还有可能使用可近端扫描的单光纤系统，其中通过偏移靠近所观察的物体的光学头中的光纤的一端来进行光扫描。

在Kleinfeld和Chaigneau的时空分析方法中，一系列“一维”图像是从血管轴线的相同区域中捕获的，与此相反，在本发明中，可能使用通过二维平面扫描捕获的单一图像。

在现有技术中，在时空图像上计算脊线(t＝f(x))，与此相反，本发明中的脊线是完全不同的，因为其从平面图像捕获(y＝f(x))，时间概念通过“Z”方向上的点扫描系统而在该点引起的。有利地使用形态学图像。例如，在现有技术的Yoshinobu Sato文献中，为了捕获脊线，生成数张图像，从各张图像中提取单一的一条线，从而产生最终图像t＝f(x)。

扫描成像系统是一种其中在图像的产生时间过程中(渡越时间的框架)观察移动中的物体的系统，使用该系统会导致脊线出现，使得可能从单一图像估计移动物体的速度。因而，这些脊线来源于移动物体与扫描系统之间的相互作用。本发明是特别显著的，因为这些脊线通常被本领域技术人员认为是从扫描成像系统中估计的干涉。因此，在激光扫描显微镜中，特别是在光纤模型中，使用被认为是偏差(aberration)的元件。为了该目的，本发明包括检测脊线的步骤，其中实施如下步骤：

-应用滤波器来增强一组图像的脊线；

-应用一种阈值以保留最显著的脊线；

-将一条直线或者椭圆拟合到这些脊线的每一条上；和

-鉴定所述脊线。

按照本发明，给出扫描速度和所观察的物体的数量级，可能简化光点轨迹的模型。第一种简化包括将光点轨迹视为水平位于捕获窗口上。光点的水平速度与垂直速度之间的1000倍的比例证实这种简化，计算结果验证了光点的垂直位置在捕获窗口上的改变少于0.1μm。

第二个近似在于将光点水平覆盖捕获窗口所需的时间看作是可忽略的，即物体在扫描线的路径上被视为是固定不动的。所观察的物体的速度(在所考虑的血管中，红细胞的速度小于20nm/s)相对于光点的水平速度(＞1m/s)证实了这种近似。

最后，采用空间上相隔一定距离V_y/f_x的瞬时水平扫描线将扫描模型化，f_x是“x”扫描的频率。

一旦模型化了扫描，必须模型化移动物体，如红细胞。观察数个模型来描述红细胞；从简单的棒状(rod)到理想的三维模型。

能够考虑到所观察的变形的最简单模型包括用垂直棒表示的红细胞。在使用这种模型的情形下，将所观察到的脊线的角度α(相对于“x”轴)与扫描的垂直速度V_y以及血细胞的水平移动速度V_gcos(θ)相联系，捕获简单的方程：

$\tan \mathrm{\α}=\frac{V_y}{V_g\cos \left(\mathrm{\θ}\right)}-----\left(1\right)$

V_y是用于扫描的光点的垂直速度，V_g是被搜索的血细胞的速度，θ是矢量V_g与快速扫描的x轴之间的夹角。Tan(α)是脊线的斜率。

如果血细胞的轨迹被认为是与运载该物体的血管边缘成线性的，有可能通过检测血管边缘来计算θ，从而得到血细胞的速度V_g。

在一般情形下，其中θ是未知的，但是脊线的长度L是已知的，可以设想两种可能：

1)已知血细胞的大小D。

在这种情形下，t_v被视为血细胞的可见时间，它被定义为从轨迹的第一个交叉点到最后一个交叉点之间经过的时间。血细胞具有垂直速度V_gcos(θ)和垂直伸展D。从而，将物体比作为垂直于流动方向的棒，以足够大的最终长度伸展在数条水平扫描线上。光点是点状的，具有垂直速度V_y，因而t_v仅依赖于光点和血细胞的垂直速度方面的差异，以及具有根据以下方程的D：

$t_v=\frac{D}{|V_y-V_g\sin \mathrm{\θ}|}-------\left(2\right)$

观察到的脊线的垂直伸展L|sin(α)|和水平伸展L|cos(α)|通过如下方程直接与t_v和光点的垂直速度以及血细胞的水平速度相联系：

L|sin(α)|＝t_v|V_y|                            (3)

L|cos(α)|＝t_v V_g|cos(θ)|

方程2和3使得可以得出如下方程：

$L=\frac{D}{|V_y-V_g\sin \mathrm{\θ}|}\sqrt{{V_y}^2+{V_g}^2{\cos }^2\mathrm{\θ}}------\left(4\right)$

与方程(1)结合，生成具有两个未知数θ和V_y的两个方程的体系。必须根据V_y-V_gsin(θ)来求解，即依据光点垂直移动是否比血细胞快或慢。

在两个速度相等的情况下，可见时间变得无限长，而脊线也变得无限长。就有V_gsin(θ)＝V_y，替换到方程(1)中，这意味着tan(α)＝tan(θ)。结果，脊线恰好就是血细胞的轨迹，速度V_g由下列给出：

$V_g=\left|\frac{V_y}{\sin a}\right|----------\left(5\right)$

如果光点垂直移动快于血细胞(V_y＞V_gsin(θ))，求解系统(3)给出如下：

$\tan \mathrm{\θ}=\tan \mathrm{\α}-\frac{D}{L\cos \mathrm{\α}}---------\left(6\right)$

$V_g=\left|V_y\right|\sqrt{{(1-\frac{D}{L\sin \mathrm{\α}})}^2+\frac{1}{{\tan }^2\mathrm{\α}}}$

如果光点垂直移动慢于血细胞(V_y＜V_gsin(θ))，求解系统(3)给出如下：

$\tan \mathrm{\θ}=\tan \mathrm{\α}+\frac{D}{L\cos \mathrm{\α}}--------\left(7\right)$

$V_g=\left|V_y\right|\sqrt{{(1+\frac{D}{L\sin \mathrm{\α}})}^2+\frac{1}{{\tan }^2\mathrm{\α}}}$

2)当可以利用反向扫描时：

如果有另一种扫描方法可以利用，其相对于前一种扫描方法是反方向的，即具有垂直速度为-V_y，观察到具有角度-α和长度L’的脊线。L’由下列给出：

$L^{\′}=\frac{D}{|-V_y-V_g\sin \mathrm{\θ}|}\sqrt{{V_y}^2+{V_g}^2{\cos }^2\mathrm{\θ}}---------\left(8\right)$

方程(4)和(8)之间的比例使得可以得出如下方程：

$\frac{L}{L^{\′}}=\frac{|V_y+V_g\sin \mathrm{\θ}|}{|V_y-V_g\sin \mathrm{\θ}|}---------\left(9\right)$

然后必须区别两种情况：|V_y|＞|V_gsin(θ)|和|V_y|＜|V_gsin(θ)|，(如果|V_y|＝|V_gsin(θ)|，则使用方程(5))。

如果|V_y|＞|V_gsin(θ)|，则得出解：

$\tan \mathrm{\θ}=\tan a\frac{L-L^{\′}}{L+L^{\′}}--------\left(10\right)$

$V_g=\left|V_y\right|\sqrt{{\left(\frac{L-L^{\′}}{L+L^{\′}}\right)}^2+\frac{1}{{\tan }^2\mathrm{\α}}}$

如果|V_y|＜|V_gsin(θ)|，则得出解：

$\tan \mathrm{\θ}=\tan a\frac{L+L^{\′}}{L-L^{\′}}--------\left(11\right)$

$V_g=\left|V_y\right|\sqrt{{\left(\frac{L+L^{\′}}{L-L^{\′}}\right)}^2+\frac{1}{{\tan }^2\mathrm{\α}}}$

在上面的所有方程中，物体如红细胞被比作为具有长度D的垂直棒。本领域技术人员容易理解，可以用更加理想的球形(或者圆盘形)或者椭圆形或者甚至更加复杂的结构来替换这种假设，评价在这种情形下观察到的状态与在简单情形下观察到的状态间的差异。这种差异是否应当被考虑将取决于要求的精确度。

作为例子，可将红细胞表示为固体球体或者具有轴向对称的双面凹状的形式。在这两种情形下，在观察平面上的正交投影被比作为具有半径R的圆盘。在捕获的图像中，该移动圆盘显示为一个椭圆，脊线与“x”轴之间的图像的夹角α为：

$\tan \left(2\mathrm{\α}\right)=\frac{2\cos \left(\mathrm{\θ}\right)}{\frac{V_g}{V_y}-2\sin \left(\mathrm{\θ}\right)}-------\left(12\right)$

主轴的长度为：

$L=\frac{2R\sqrt{2}}{\sqrt{{V_r}^2-2V_r\sin \left(\mathrm{\θ}\right)+2-\left|V_r\right|\sqrt{{V_r}^2-4V_r\sin \left(\mathrm{\θ}\right)+4}}}-------\left(13\right)$

考虑到 $V_r=\frac{V_g}{V_y}$ 和圆盘半径R。

用更为复杂的描绘红细胞的模型(圆环形表面)进行数字模拟，显示圆盘模型足以代表红细胞。

如果红细胞轨迹的方向θ是未知的，但是可以捕获脊线的长度L，有可能部分地计算速度信息。方程(12)和(13)形成了联系对(α，L)的系统，对(α，L)是在捕获被求解的参数对(θ，V_g)的过程中观察到的参数。

按照本发明的另一个特征，提供具有光纤模式的光扫描的共焦显微镜，用于测量在流体如血流中移动的微观物体的速度，该系统包括：

-用于通过对含有所述物体的平面进行x和y光扫描而捕获图像的装置；

-用于在捕获所述图像的过程中检测由所述物体移动产生的脊线的装置；

-用于确定所述脊线的斜率的装置；和

-用于从如此确定的斜率中估计所述物体的速度V_g的装置。

在考察无论如何不具有限制性的具体实施方式和如下附图的详细描述后，本发明的其他优点和特征将是显然的：

-图1是实施按照本发明的方法的一个光纤共焦成像系统例子的总略图；

-图2是举例说明图1的成像系统的扫描方法的简化图；

-图3是描绘脊线的概略图，该图像来源于一次同时捕获；和

-图4是选择脊线的步骤的概略图。

尽管本发明不限于此，但是现在将描述在具有光纤模式的激光扫描的共焦显微镜中实施按照本发明的方法，该方法被应用于微循环领域，其数量级如下：

-细动脉的直径在50-100μm之间变化；毛细血管更细，直径为3-8μm；最后，小静脉的直径为30-50μm；

-这些血管中的红细胞的速度被包括在一定范围内，从最细的血管的速度为低于1mm/s到细动脉的几十mm/s；

-红细胞是平均直径约7μm的细胞，而白细胞的直径为10-15μm。

在一般情况下，为了实施本发明，在文献WO2004/008952A1“Method and equipment for fibre optic high-resolution，in particularconfocal，fluorescence imaging”，Mauna Kea Technologies中描述的系统被用作基础，在该文献中，使用图像向导，图像向导由数千条光纤组成，激发信号依次被光源发射、被偏转和投射到所述向导的光纤之一中，在光纤出口处的组织的各个激发点反过来发射荧光信号，由所述光纤收集，然后被检测并数字化而形成图像元素。根据第一个方面，在文献WO2004/008952A1中描述的方法在光纤出口处聚焦的光束而激发表面下的平面，产生共焦图像。按照第二个方面，该方法在光纤输出口处产生发散光束，该发散光束能够激发表面上的微小体积的组织。该激发信号以对应于每秒捕获许多图像的足以用于实时应用的速度发生偏转，并且对应于用于逐一对光纤取样的最小频率的检测频率检测荧光信号。

图1显示构成图像向导1的挠性光纤的相干光束，在该向导的近端具有光源2和光纤注入系统，使得光纤逐一被照亮，在其远距端具有光学头3，使得离开被照亮的光纤的光束被聚焦到位于所观察物体4的一定深度的点上。注入系统包括多个光学元件5，其前面是光纤扫描系统6，例如偏转单元，使得可以以非常高的速度逐一扫描光纤。各条光纤依次被用于传递光束以及来源于观察物体的相应返回光束。通过将激光束聚焦到一个点上以及通过由用于照明的相同光纤观察的物体的空间滤波器的内在共焦特性，捕获空间分辨率。这使得可能使用光电探测器9来专一性地接收来源于所观察物体的信号，从而逐点产生图像。

图像向导1由大量的挠性光纤构成，例如由30000根直径为2μm并且间隔3.3μm的光纤构成。在实践中，可能使用图像向导中的所有光纤，或者选择这些光纤的一小组，例如位于中心的光纤。

电子计算装置7用于控制、分析和数字化处理所检测的信号，特别用于显示包括如下的插件：

-同步插件8，其功能为：

-以同步化方式控制扫描；

-用于在任何时候及时探知激光点的位置，从而扫描；和

-用于借助本身可被控制的微控制器管理其他插件；

-探测器插件9，其包括特别实施阻抗匹配的模拟电路、模拟-数字化变换器、使信号定形的程序化逻辑元件(例如FPGA电路)。

-数字化捕获插件10，其以可变频率处理数字化数据流，并显示在屏幕11上；

-制图插件12。

作为一种变化形式，可以使用组合了这些不同插件的功能的单个插件。

这些电子和计算机装置7能够实施按照本发明的方法的步骤，可以以装配了计算红细胞速度所需的处理装置的微型计算机形式呈现。

图2是举例说明图1的成像系统的扫描方法的简化图。扫描激光点用虚线13表示，该虚线描述了长方形扫描窗口14中的传统扫描轨迹。激光点13的轨迹是一个从上到下的“Z”形。与沿着轴A_y的垂直速度V_y相比，沿着水平轴A_x的水平速度V_x非常大。该假设包括忽略两次水平扫描之间的时间，在这期间，光点开始赶上血细胞。它也是在偶数行上观察到的结果与在奇数行上观察到的结果的组合。作为例子，速度V_y可以为3mm/s，而速度V_x可以为5mm/s。

在图2中，在扫描窗口14内，还以横剖面表示了图像向导1。光纤被以相干圆圈的形式表示。图像化区域15仅对应于位于长方形中的有限量的光纤。激光束被连续注入到各个光纤中。图3中表示的图像模拟一次捕获，即各条光纤仅被注入一次。这些图像显示对应于扫描系统与移动颗粒之间的相互作用的倾斜的脊线。

这些脊线的外观可用红细胞的图像与图像形成机制之间的相互作用来解释。激光点执行按照Z形轨迹的扫描，在一组激光位置上，例如在640条线上进行测量，每条线进行896次测量。移动的红细胞将在确定位置上与一条扫描线相交。在后面的线上，该血细胞还会相交，但是其已经相对于先前那条线发生移动。只要存在扫描线与血细胞相交，这种现象将持续。然后，这种现象产生一条脊线，该脊线的斜率为红细胞的速度的函数。

在图4中，在捕获一张图像后，显示出脊线。设立一个阈值使得可能仅保留最显著的脊线。然后，用一个椭圆拟合(frame)各条脊线，以便确定一个斜率。然后，电子计算装置7确定各条脊线的斜率，以计算各个红细胞的速度。

因此，本发明使得可能从单一图像中确定速度。这使得可能特别能够避免在图像坐标化过程中的图像混乱的问题。这有利于挑选出相对于视野的高速度，以及提高捕获频率。作为例子，一个11Hz的图像捕获系统使得可能挑选出5-25mm/s量级的速度，即采用绝大多数现有技术不可能估计的速度。

优选地，测量血细胞的速度，该血细胞的垂直移动未到达光点。通常，轨迹的角度必须位于水平角和垂直角之间，在该垂直角上，血细胞的垂直速度变得与光点的速度相等。

当然，本发明不限于刚刚描述的实施例，可以对这些实施例进行许多调整而不超出本发明的保护范围。特别地，可设想在多条脊线或者数张图像上进行测量来提高精确度。

Claims (20)

1.用光扫描显微镜测量微观物体在流体如血流中移动的速度的方法，该方法包括如下步骤：

-通过对含有所述物体的平面进行x轴和y轴方向光扫描而捕获图像；

-在捕获所述图像的过程中，在平面(x，y)中检测由所述物体的移动产生的脊线；

-确定平面(x，y)中的所述脊线的斜率；和

-从如此确定的斜率估计所述物体的速度V_g。

2.按照权利要求1的方法，其特征在于检测所述脊线的步骤包括如下步骤：

-应用滤波器来增强一组图像的脊线；

-应用一种阈值以保留最显著的脊线；

-将一条直线或者椭圆拟合到这些脊线的每一条上；和

-鉴定所述脊线。

3.按照权利要求1或2的方法，其特征在于所述物体的速度V_g通过如下方程给出：

V_g ^*cos(θ)＝V_y/tan(α)，V_y是用于扫描的光点的垂直速度，而“α”是水平轴“x”与脊线之间的夹角。

4.按照权利要求3的方法，其特征在于通过检测运载该物体的血管的边缘来捕获角度θ。

5.按照权利要求3的方法，其特征在于为了捕获角度θ，所述物体被比作为具有最终高度D的垂直棒，而角度θ是从如下方程中计算得到的：

$L=\frac{D}{|V_y-V_g\sin \mathrm{\θ}|}\sqrt{{V_y}^2+{V_g}^2{\cos }^2\mathrm{\θ}}$

其中L是脊线的长度。

6.按照权利要求5的方法，其特征在于在V_g ^*sin(θ)＜V_y的情形下：

$\tan \mathrm{\θ}=\tan \mathrm{\α}-\frac{D}{L\cos \mathrm{\α}}$

$V_g=\left|V_y\right|\sqrt{{(1-\frac{D}{L\sin \mathrm{\α}})}^2+\frac{1}{{\tan }^2\mathrm{\α}}}.$

7.按照权利要求5的方法，其特征在于在V_g ^*sin(θ)＞V_y的情形下：

$\tan \mathrm{\θ}=\tan \mathrm{\α}+\frac{D}{L\cos \mathrm{\α}}$

$V_g=\left|V_y\right|\sqrt{{(1+\frac{D}{L\sin \mathrm{\α}})}^2+\frac{1}{{\tan }^2\mathrm{\α}}}.$

8.按照权利要求3的方法，其特征在于第二张图像是从同一平面但是沿反向扫描捕获的，并使用如下方程：

$L^{\′}=\frac{D}{|-V_y-V_g\sin \mathrm{\θ}|}\sqrt{{V_y}^2+{V_g}^2{\cos }^2\mathrm{\θ}}$

其中L’是在反向扫描过程中的脊线的长度。

9.按照权利要求8和5的方法，其特征在于当|V_g ^*sin(θ)|＜|V_y|时：

$\tan \mathrm{\θ}=\tan a\frac{L-L^{\′}}{L+L^{\′}}$

$V_g=\left|V_y\right|\sqrt{{\left(\frac{L-L^{\′}}{L+L^{\′}}\right)}^2+\frac{1}{{\tan }^2\mathrm{\α}}}$

其中L是沿第一扫描方向的脊线的长度，而L’是在反向扫描过程中的脊线的长度。

10.按照权利要求5和8的方法，其特征在于当|V_g ^*sin(θ)|＞|V_y|时：

$\tan \mathrm{\θ}=\tan a\frac{L+L^{\′}}{L-L^{\′}}$

$V_g=\left|V_y\right|\sqrt{{\left(\frac{L+L^{\′}}{L-L^{\′}}\right)}^2+\frac{1}{{\tan }^2\mathrm{\α}}}.$

11.按照权利要求3的方法，其特征在于当V_g ^*sin(θ)＝V_y时，为了确定V_g和θ，还使用如下方程：

$V_g=\left|\frac{V_y}{\sin \mathrm{\α}}\right|.$

12按照权利要求3的方法，其特征在于当所述物体是红细胞时，它在所捕获的图像上的形式被比作为具有半径R的椭圆，脊线与“x”轴之间的图像的角度α由如下给出：

$\tan \left(2\mathrm{\α}\right)=\frac{2\cos \left(\mathrm{\θ}\right)}{\frac{V_g}{V_y}-2\sin \left(\mathrm{\θ}\right)}$

而主轴的长度由如下给出：

$L=\frac{2R\sqrt{2}}{\sqrt{{V_r}^2-2V_r\sin \left(\mathrm{\θ}\right)+2-\left|V_r\right|\sqrt{{V_r}^2-4V_r\sin \left(\mathrm{\θ}\right)+4}}}$

和 $V_r=\frac{V_g}{V_y}.$

13.按照先前权利要求中的任何一项的方法，其特征在于使用共焦显微镜。

14.按照先前权利要求中的任何一项的方法，其特征在于使用光纤模式的光扫描显微镜。

15.按照权利要求1-13中的任何一项的方法，其特征在于使用非光纤的光扫描显微镜。

16.用于微观物体在测量流体如血流中的移动速度的光扫描显微镜系统，该系统实施按照先前的权利要求中的任何一项的方法；该系统包括：

-用于通过对含有所述物体的平面进行x和y光扫描而捕获图像的装置；

-用于在捕获所述图像的过程中检测平面(x，y)中由所述物体移动产生的脊线的装置；

-用于确定平面(x，y)中所述脊线的斜率的装置；和

-用于从如此确定的斜率中估计所述物体的速度V_g的装置。

17.按照权利要求16的系统，其特征在于在检测脊线的过程中，该系统包括：

-用于通过应用滤波器来增强一组图像的脊线的装置；

-用于通过应用一种阈值以保留最显著的脊线的装置；

-用于将椭圆拟合到这些脊线中的每一条上的装置；和

-用于鉴定所述脊线的装置。

18.按照权利要求16或17的系统，其特征在于使用共焦显微镜。

19.按照权利要求16-18的任何一项的系统，其特征在于使用光纤模式的光扫描显微镜。

20.按照权利要求16-18的任何一项的系统，特征在于使用非光纤的光扫描显微镜。

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