ES2352333T3

ES2352333T3 - Resistencia a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo peronospora.

Info

Publication number: ES2352333T3
Application number: ES04078320T
Authority: ES
Inventors: Jan Leendert Harrewijn; Joannes Petrus Hubertus Hoogenboom
Original assignee: Nickerson Zwaan BV
Current assignee: Hazera Seeds BV
Priority date: 2004-12-08
Filing date: 2004-12-08
Publication date: 2011-02-17
Anticipated expiration: 2024-12-08
Also published as: ZA200704505B; ATE480141T1; EP1668979B1; AU2005313442B2; EP1819217B1; EP1668979A1; PL1819217T3; US20120017331A1; IL183759A0; PL1668979T3; NZ555724A; DE602004029063D1; EP1819217A1; JP5065905B2; US8119856B2; ES2572393T3; JP2012205591A; JP5628866B2; JP2008522602A; WO2006061256A1

Abstract

Planta de la especie Allium cepa que es resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) debido a un locus de resistencia a Pd presente de manera homocigota en el brazo largo del cromosoma 3 en el genoma de dicha planta, en la que el locus de resistencia a Pd es el fragmento de introgresión de Allium roylei en el genoma de una planta de la línea 3591-1, número de registro NCIMB 41249, y en la que, se lleva a cabo el siguiente procedimiento: a) realizar la restricción del ADN genómico de dicha planta con las enzimas de restricción PstI y MseI; b) realizar un ligamiento con los siguientes adaptadores de oligonucleótido: alfa 5'-CTCGTAGACTGCGTACATGCA CATCTGACGCATGT-5', y beta 5'-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5'; c) amplificar selectivamente conjuntos de fragmentos de restricción, caracterizándose la presencia del locus de resistencia a Pd por &8226; un producto de amplificación de 61 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c): (A) 5'-GACTGCGTACATGCAGAAC y 5'-GATGAGTCCTGAGTAACTT, &8226; un producto de amplificación de 151 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c): (B) 5'-GACTGCGTACATGCAGAAG y 5'-GATGAGTCCTGAGTAAAAC y &8226; un producto de amplificación de 330 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c): (C) 5'-GACTGCGTACATGCAGACA y 5'-GATGAGTCCTGAGTAACCA.

Description

[0001] La presente invención se refiere a plantas del género Allium que son resistentes al mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) (Berk.) Cas., específicamente plantas de la especie Allium cepa. Según la invención, la resistencia se proporciona mediante un locus de resistencia, que puede estar presente de manera homocigota

o heterocigota en el genoma de la planta, y que es suficiente para proporcionar resistencia a plantas que llevan este locus. Se dan a conocer procedimientos para obtener dichas plantas resistentes a mildiú velloso de cebolla, siendo adecuados dichos procedimientos para obtener cebollas y chalotes cultivados.

Antecedentes de la invención [0002] El mildiú velloso provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) tiene una distribución prácticamente mundial. El patógeno ataca diversos tipos de cebollas, pero es especialmente destructivo para la cebolla común Allium cepa. El daño provocado por el hongo se describe en Mukerji (ref. 5). Pueden producirse epidemias espontáneas en el campo, si las condiciones son favorables para la enfermedad. Los síntomas son amarilleo de las hojas y esporulación gris. [0003] Desde un punto de vista económico, el mildiú velloso es una de las principales enfermedades fúngicas que amenazan el cultivo de cebollas y chalotes (Allium cepa L.), en casi todas las regiones de cultivo de cebollas en el mundo. [0004] Se supone que no está presente una resistencia natural completa a mildiú velloso en Allium cepa y Allium fistulosum. Sin embargo, se encontró una resistencia completa a mildiú velloso en el Allium roylei Stearn de tipo natural. Basándose en una determinada semejanza morfológica entre A. roylei y A. cepa se ha propuesto, por tanto, usar A. roylei como una pareja de introgresión para A. cepa. En la publicación de van der Meer y de Vries (ref. 1) se notificaron resultados preliminares referentes a un híbrido de este tipo entre A. roylei y A. cepa, así como resultados referentes al retrocruzamiento del híbrido interespecífico para A. cepa. Se ha observado que dicho híbrido interespecífico es fértil para machos y hembras (Kofoet et al., ref. 2). También se ha notificado que puede heredarse de manera dominante una resistencia a mildiú velloso en la progenie BC1 (primer retrocruzamiento) de este híbrido para cebolla. [0005] El locus en el genoma de la especie cepa, en el que se encuentran las secuencias de introgresión responsables de la resistencia, se ha denominado “locus de resistencia a Pd”. Por extensión, el “locus de resistencia a Pd” también designa las propias secuencias. [0006] Sin embargo, se observa segregación para la resistencia a mildiú velloso entre las progenies BC1 y F2 procedentes de F1 entre A. roylei y A. cepa (de Vries et al., ref. 3) y nunca se ha obtenido ninguna variedad de cebollas para reproducción resistentes a mildiú velloso, más de 10 años después de que se obtuvo el primer híbrido resistente. [0007] Existe así un gran interés desde un punto de vista agronómico y económico por plantas de la especie Allium cepa, que sean resistentes a mildiú velloso y que aún sean 100% resistentes tras la autopolinización, es decir no haya segregación de la característica de resistencia. Estas plantas son particularmente valiosas ya que de hecho pueden cruzarse con una línea sensible, produciendo híbridos que también son resistentes a mildiú velloso de cebolla. [0008] La invención reside en primer lugar en la observación de que todo material resistente disponible de las especies de Allium cepa y Allium fistulosum era de hecho heterocigoto para las secuencias de resistencia a Pd y que hasta ahora no se ha obtenido ni se ha dado a conocer ninguna planta resistente homocigota de manera reproducible. [0009] Los presentes inventores elucidaron la razón por la que no podía obtenerse ninguna planta resistente de manera homocigota y entonces tuvieron éxito en obtener tales plantas de Allium, que da origen a una progenie tras autopolinización que también es 100% resistente (es decir, una planta resistente de manera homocigota). [0010] Varias hipótesis podrían haber explicado el notable hallazgo de que no estaba disponible ninguna planta homocigota: translocación, recombinación, selección preferente de híbridos, silenciamiento génico y efectos pleiotrópicos, arrastre genético (linkage drag), etcétera... [0011] Los presentes inventores han determinado que el fragmento de introgresión de Allium roylei que está presente en el hibrido de la especie cepa y que confiere resistencia a mildiú velloso comprende también una secuencia designada “factor letal”, cuya presencia en ambos homólogos de cromosoma en la especie cepa es letal para la planta. Para que exista y crezca una planta de cepa resistente, el fragmento de introgresión, que confiere resistencia y que contiene el factor letal, está por tanto necesariamente presente en un único homólogo de cromosoma, explicando la ausencia de plantas resistentes obtenidas de manera homocigota por los predecesores. Esta secuencia responsable de letalidad está presente en las proximidades del locus de resistencia a Pd. [0012] Habiendo identificado que la secuencia que confiere resistencia está ligada a la secuencia letal, los presentes inventores han tenido éxito, por primera vez, en la separación física de la secuencia que confiere resistencia de la secuencia responsable de letalidad cuando están presentes en ambos cromosomas. [0013] Esta etapa de separación, que puede producirse mediante un acontecimiento de recombinación, es el punto clave de la presente invención. En efecto, no podría preverse que las secuencias que confieren resistencia pudieran separarse del factor letal. En primer lugar, no se sabía si dicho factor era una secuencia que en sí misma era letal o si la letalidad surgía como resultado de la sustitución, por secuencias presentes en un fragmento de introgresión, de secuencias endógenas esenciales. En efecto, es posible que la letalidad sea de hecho una inactivación del/de los gen(es) esencial(es) en el fragmento de la especie cepa correspondiente que no se compensan con el fragmento introducido de A. roylei. Por tanto, eran posibles diferentes escenarios para explicar la letalidad:

-las secuencias de resistencia podrían haber constituido

de hecho el factor letal, porque sustituyen secuencias

endógenas: críticas. Por tanto, podrían no estar

presentes: nunca en ambos cromosomas sin provocar

letalidad.

-las secuencias de resistencia y las secuencias letales podrían haber estado extremadamente cerca entre sí en el cromosoma, o incluso solaparse. En esta situación, la probabilidad de obtener un acontecimiento de recombinación que separe a ambas es insignificante.

-las secuencias que constituyen el factor letal podrían haber sido necesarias para el funcionamiento de la resistencia. En esta condición, separar ambas conduciría a la pérdida de la capacidad de resistencia.

[0014] En este contexto, los presentes inventores han tenido éxito inesperadamente en la separación de las secuencias que confieren el fenotipo de resistencia de la secuencia cuya presencia en ambos homólogos es letal. [0015] Los inventores también han encontrado que la A. cepa resistente ya liberada presenta tanto el locus de resistencia a Pd (que es dominante) como el factor letal (que se hereda de manera recesiva) en el mismo fragmento de introgresión. Como el locus de resistencia a Pd es dominante, el fenotipo de la planta es “resistente” y no se observa el factor letal recesivo. Sin embargo, la progenie de tales plantas cuando se cruzan con plantas sensibles se segregará y por tanto no puede usarse comercialmente. En efecto, las cebollas y los chalotes comerciales son generalmente variedades, por tanto material vegetal, ya sean líneas o híbridos, con un fenotipo que tiene que ser uniforme; no pueden concebirse rasgos de interés con segregación para plantas comerciales. [0016] Por tanto, la presente invención proporciona plantas de la especie Allium cepa que son resistentes a mildiú velloso de cebolla provocado por Peronospora destructor (Pd) debido a la presencia en su genoma de un locus de resistencia a Pd, y dichas plantas son plantas resistentes de manera homocigota, es decir plantas que proporcionan una progenie tras autofecundación que también es 100% resistente. [0017] La presente invención también proporciona plantas resistentes que pueden obtenerse cruzando las plantas resistentes mencionadas anteriormente de la especie Allium cepa con una planta también de la especie Allium cepa que es sensible al mildiú velloso. [0018] También se dan a conocer procedimientos para obtener dichas plantas.

Definiciones [0019] En el contexto de la presente solicitud, se definen los siguientes términos de la siguiente manera:

Introgresión: introducción natural de genes de una especie en otra mediante el procedimiento de hibridación interespecífica seguido de retrocruzamientos sucesivos con los progenitores recurrentes. Cada especie puede volverse de ese modo más variable y mostrar determinados caracteres de la otra especie. Locus de resistencia a Pd: lugar en el cromosoma ocupado por las secuencias responsables de la resistencia a Peronospora destructor, siendo dichas secuencias suficientes para conferir resistencia a una planta. Un locus de resistencia a Pd puede contener un gen o varios genes, posiblemente separados por secuencias o genes no relacionados. Por extensión, en el contexto de la presente invención, las mismas secuencias también se denominan locus de resistencia a Pd. El locus de resistencia a Pd es el fragmento introgresión de A. roylei en el genoma de una planta de la línea 3591-1, número de acceso NCIMB 41249.

[0020] Puede caracterizarse la presencia del locus de resistencia a Pd mediante

• un producto de amplificación de 61 nucleótidos cuando se lleva a cabo el siguiente procedimiento: a) realizar la restricción del ADN genómico de dicha planta con las enzimas de restricción PstI y MseI; b) realizar un ligamiento con los siguientes adaptadores de oligonucleótido:

alfa 5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA CATCTGACGCATGT-5’, y beta 5’-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5’;

c) amplificar selectivamente conjuntos de fragmentos de restricción, con los cebadores

(A) 5’-GACTGCGTACATGCAGAAC y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT y

• producto de amplificación de 151 nucleótidos cuando se lleva a cabo el siguiente procedimiento: realizar la restricción del ADN genómico de dicha planta con enzimas de restricción PstI y MseI; b) realizar un ligamiento con los siguientes adaptadores de oligonucleótido:

(B) 5’-GACTGCGTACATGCAGAAG y 5’-GATGAGTCCTGAGTAAAAC y

• producto de amplificación de 330 nucleótidos cuando se lleva a cabo el siguiente procedimiento: a) realizar la restricción del ADN genómico de dicha planta con enzimas de restricción PstI y MseI; b) realizar un ligamiento con los siguientes adaptadores de oligonucleótido:

(C)5’-GACTGCGTACATGCAGACA y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACCA. [0021] Sensible/sensibilidad: según la Federación Internacional de Semillas, sección Plantas, documento de posición de mayo de 2004, en “Definition of the Terms Describing the Reaction of Plants to Pests o Pathogens for the Vegetable Seed Industry”, la sensibilidad es la incapacidad de una variedad de planta para limitar el crecimiento de una plaga o patógeno específico. Sin embargo, debe observarse que el término “susceptible” también se ha usado ampliamente en las últimas décadas para describir la misma propiedad. [0022] Por el contrario, una planta que puede, en cierto grado y en comparación con variedades de plantas sensibles en condiciones ambientales y presión de plagas o patógenos similares, limitar el crecimiento y el desarrollo de una plaga o un patógeno se califica como resistente a dicha plaga o patógeno específico. Las plantas resistentes incluyen plantas que son tolerantes, es decir permanecen infectadas pero sobreviven, y plantas que son totalmente resistentes. A pesar de ser resistente a una plaga o un patógeno, una planta resistente atacada por dicha plaga o patógeno puede presentar síntomas característicos de las infecciones, como crecimiento reducido, muerte precoz, pérdida de las hojas...

[0023] Línea endogámica: línea casi homocigota (para todos los caracteres) producida mediante cruzamiento endogámico y selección continuados.

[0024] Planta resistente de manera homocigota a un patógeno:

planta que produce una progenie tras autofecundación (autopolinización) que también es 100% resistente a dicho patógeno. Cuando la resistencia de debe a la presencia de una secuencia de ADN en un cromosoma de la planta, dicha secuencia está presente en todos los homólogos de cromosoma. [0025] Factor letal: factor, por ejemplo un factor genético, que impide la supervivencia de una planta expuesta a este factor. La presencia de un factor letal puede evitar que la planta exista ab initio o puede provocar su muerte en un estadio tardío. [0026] Allium cepa: especie del género Allium, que comprende plantas bulbosas que tienen hojas huecas cultivadas en todo el mundo por su bulbo comestible redondeado. Los cultívares de cebollas y los chalotes son de la especie Allium cepa. [0027] Recombinación: sobrecruzamiento que se produce durante la meiosis. [0028] Se proporciona un primer tipo de planta, es decir una planta de la especie Allium cepa que es resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd). La resistencia a mildiú velloso se debe a un locus de resistencia a Pd en el genoma de la planta, caracterizado porque el locus de resistencia está presente de manera homocigota en el genoma, es decir las secuencias responsables de la resistencia están presentes en dos copias en el genoma de una planta según la invención, es decir presentes en ambos homólogos cromosómicos. [0029] En efecto, los presentes inventores han tenido éxito en la separación de las secuencias responsables de la resistencia a mildiú velloso de las secuencias letales ligadas, que los inventores identificaron que eran letales si están presentes en ambos homólogos de cromosoma. Al separar estos dos tipos de secuencias, los inventores han podido obtener así una planta homocigota para la secuencia de interés (locus de resistencia a Pd), sin ser homocigota para las secuencias perjudiciales (factor letal). La invención se refiere a estas plantas viables homocigotas para las secuencias que confieren resistencia. Estas plantas no son necesariamente homocigotas para las secuencias letales, que sin embargo pueden estar presentes, pero sólo en una única copia. [0030] Dado que estas plantas según la invención son homocigotas para las secuencias de interés que confieren resistencia, cualquier progenie de una planta de la invención conducirá a una planta también resistente a mildiú velloso, sin segregación de esta característica. En efecto, cualquier planta en la progenie tendrá en su genoma el locus de resistencia a Pd, que se sabe que es dominante sobre el fenotipo sensible. [0031] Se considera que una planta es resistente si puede limitar el crecimiento y el desarrollo de Peronospora destructor, impidiendo la infección o combatiendo el crecimiento del hongo tras la infección. Por el contrario, una planta que no puede limitar el crecimiento y el desarrollo de Peronospora destructor se dice que es sensible a Peronospora destructor.

[0032] Dicha resistencia según la invención comprende la resistencia a la infección natural por Peronospora destructor y también la resistencia a la inoculación artificial de Peronospora destructor. Pueden llevarse a cabo pruebas artificiales en invernaderos y salas climatizadas con entornos más controlados. Pueden someterse a prueba tanto plantas jóvenes como bulbos germinados. [0033] Se notifican protocolos para someter a prueba si una planta es resistente o sensible a Peronospora destructor en el artículo de de Vries et al. (ref. 3). [0034] También puede someterse a prueba genéticamente la resistencia con marcadores moleculares, sometiendo a ensayo la presencia del locus de resistencia a Pd en el genoma de una planta. El experto en el campo conoce bien las técnicas que pueden usarse y generalmente se basan en amplificación génica. [0035] Las técnicas que pueden usarse para la tipificación molecular incluyen polimorfismos en longitud de fragmentos de restricción (RFLP), electroforesis de enzimas multilocus y ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD). Otra técnica que es particularmente adecuada para someter a prueba la presencia del locus de resistencia a Pd en el genoma de una planta, es el AFLP™ (polimorfismos en longitud de fragmentos amplificados, “Amplified Fragment Length Polymorphism”); una técnica de este tipo se describe por ejemplo en Vos et al. (ref. 4). Esta técnica consiste en una primera etapa de digestión del ADN genómico con enzimas de restricción adecuadas, simultáneamente con ligamiento con adaptadores de oligonucleótido diseñados específicamente. Estos adaptadores tienen secuencias que corresponden al sitio de restricción, ligadas a una secuencia adicional definida. En una segunda etapa, entonces se lleva a cabo la amplificación por PCR de los fragmentos de restricción marcados obtenidos con cebadores, cuya secuencia comprende una secuencia complementaria a los adaptadores y 1, 2 ó 3 nucleótidos adicionales que permiten la diferenciación entre los fragmentos de restricción marcados. Esta amplificación por PCR permite la detección de polimorfismos en longitud de fragmentos de restricción. [0036] En el ejemplo 4 a continuación se proporcionan cuatro pares de cebadores específicos que proporcionan fragmentos amplificados de longitud definida, sólo cuando esta presente el locus de resistencia a Pd. Si una planta genera uno o más de los fragmentos amplificados esperados, puede deducirse que esta planta presenta el locus de resistencia a Pd completo y es por tanto resistente a mildiú velloso. El uso de marcadores moleculares es particularmente muy adecuado en el contexto de la presente invención.

[0037] Preferiblemente, las plantas resistentes según la invención son resistentes a la infección por Peronospora destructor. [0038] Las plantas según este primer tipo según la invención son, por ejemplo, plantas de la línea 3591-1 que se ha depositado en el NCIMB con el número de acceso 41249. En el ejemplo 1 se notifica el procedimiento mediante el cual los inventores han obtenido esta planta. [0039] La presente invención también se refiere a un segundo tipo de plantas, que son plantas híbridas que presentan dicho locus de resistencia a Pd de manera heterocigota, es decir sólo en uno de los homólogos de cromosoma. Según la invención, pueden obtenerse dichas plantas cruzando la planta homocigota mencionada anteriormente con una segunda línea parental de la especie Allium cepa, siendo la línea parental sensible al mildiú velloso de cebolla. [0040] Por tanto, la invención se refiere a plantas de la especie Allium cepa. [0041] Debido al hecho de que el locus de resistencia a Pd está presente de manera heterocigota en el segundo tipo de plantas de la invención, el rasgo de resistencia se segrega cuando se realizan autopolinizaciones adicionales o cuando se cruzan con otras plantas. [0042] Una planta según esta realización de la invención puede obtenerse cruzando una planta de la línea 3591-1 que se ha depositado en el NCIMB con el número de acceso 41249, con una línea parental de Allium cepa sensible a mildiú velloso. Preferiblemente esta línea parental es una línea endogámica de Allium cepa macho citoplasmática. [0043] El segundo tipo de planta según la invención puede obtenerse naturalmente mediante otros procedimientos. Por ejemplo, también pueden obtenerse mediante plantas autopolinizantes ya de este tipo, aunque, tal como se explicó anteriormente, la progenie de una autopolinización de este tipo no es 100% resistente a mildiú velloso.

[0044] Según la presente invención, el locus de resistencia a Pd está presente en el brazo largo del cromosoma 3, de manera homocigota o heterocigota, en el genoma de plantas según el primer o segundo tipo de la presente invención. Las plantas de la especie Allium cepa tienen de hecho 2n=16 cromosomas que se consideran que son cromosomas homólogos (véase en particular la referencia 8). [0045] La descripción también da a conocer plantas de la especie Allium cepa o Allium fistulosum, que son resistentes a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) debido al locus de resistencia a Pd, en las que cualquier fragmento del cromosoma que comprende el locus de resistencia a Pd, puede estar presente de manera homocigota en la progenie sin provocar letalidad. [0046] Tal como se mencionó anteriormente, las secuencias que provocan la letalidad pueden encontrarse generalmente en las proximidades de las secuencias o locus de resistencia a Pd. La parte del cromosoma que comprende el locus de resistencia a Pd y dichas secuencias letales pueden generalmente no estar presentes en ambos homólogos de cromosoma, porque impide que la planta exista. Al disociar el locus de resistencia a Pd de las secuencias letales, los inventores han podido obtener plantas que contienen el locus de resistencia a Pd y en las que cualquier parte del cromosoma que comprende el locus de resistencia a Pd está o puede estar presente en ambos homólogos de cromosoma, porque no están presentes las secuencias letales. [0047] La descripción también da a conocer una planta de la especie Allium cepa o Allium fistulosum, que es resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd), en la que al menos uno de los homólogos del cromosoma 3 comprende un locus de resistencia a Pd y cualquier fragmento de dicho cromosoma, que comprende el locus de resistencia a Pd, puede estar presente de manera homocigota en la progenie sin provocar letalidad.

[0048] Debe observarse que también es parte de la presente invención, una planta que es homocigota para el locus de resistencia a Pd y heterocigota para las secuencias letales, es decir las secuencias letales están presentes sólo en un homólogo del cromosoma 3. En efecto, cualquier fragmento de al menos uno del homólogo del cromosoma 3, el homólogo que comprende el locus de resistencia a Pd sin las secuencias letales, puede estar presente de manera homocigota en la progenie sin provocar letalidad. [0049] Una planta de este tipo es, por ejemplo, las plantas 3591-3, 3591-4, 3591-5, 3591-6 ó 3591-8 que se muestran a modo de ejemplo en el ejemplo 3 de la sección experimental de la presente solicitud. [0050] Mediante la autopolinización de una planta resistente, puede deducirse mediante el análisis de la progenie si la planta corresponde a la definición facilitada anteriormente. El ejemplo 5 proporciona detalles acerca del análisis que ha de llevarse a cabo para una determinación de este tipo. El principal criterio que ha de evaluarse es el porcentaje de la progenie que es resistente. Cualquier planta resistente es una planta según la invención si al menos el 75% (+/- el 5% debido a la variabilidad de las mediciones) de la progenie también es resistente. La figura 1 muestra a modo de ejemplo las diferentes situaciones a nivel genómico, que conducen a este porcentaje. [0051] Debe observarse que una planta que tiene una resistencia a Pd ligada a las secuencias letales sólo en un homólogo de cromosoma no es parte de la presente invención. Una planta de este tipo, tras la autopolinización, proporcionará una progenie que es, según la ley genética, 66,7% resistente, es decir menos del 75%. Una planta de este tipo puede diferenciarse así de las plantas según la presente invención. Una planta de este tipo es, por ejemplo, una planta de la línea 2348 que se muestra a modo de ejemplo en el ejemplo 2 de la sección experimental de la presente solicitud.

[0052] Preferiblemente, el locus de resistencia a Pd está presente de manera homocigota en una planta según la invención. [0053] El locus de resistencia a Pd, que confiere resistencia a la infección por Peronospora destructor, está presente en un fragmento de introgresión; éste se origina a partir de una planta que es resistente de manera natural a mildiú velloso de cebolla, de Allium roylei. La presencia de un fragmento de introgresión en el genoma de una planta de la especie Allium cepa puede obtenerse cruzando dichas plantas con una pareja de introgresión, obteniéndose así un híbrido. Dicho híbrido preferiblemente se somete a retrocruzamiento con una planta de la especie Allium cepa con el fin de minimizar los fragmentos de introgresión, y entonces se selecciona con respecto a la capacidad de mostrar resistencia a mildiú velloso. [0054] En efecto, preferiblemente se limitan los fragmentos de introgresión en una planta de la especie Allium cepa según la invención con el fin de tener plantas que compartan todas las características de interés de la planta parental excepto el rasgo de resistencia. [0055] Los fragmentos de introgresión en el genoma de una planta según la presente invención están presentes en uno o ambos homólogos del cromosoma 3 en el brazo largo del cromosoma 3. Se prefiere que el fragmento de introgresión que comprende el locus de resistencia a Pd sea inferior al 50% de la longitud del brazo largo del cromosoma 3, preferiblemente inferior al 44%, más preferiblemente inferior al 35, 30, 25 ó 20% de la longitud del brazo largo del cromosoma 3. Tal como se mencionó anteriormente, el fragmento de introgresión se origina a partir del genoma de Allium roylei. [0056] Las plantas según este tipo son plantas de la línea 3591-1 que se ha depositado en el NCIMB con el número de acceso 41249. [0057] Debe observarse que pueden estar presentes uno, dos o más fragmentos de introgresión, por ejemplo en el brazo largo del cromosoma 3, siendo, sin embargo, cada fragmento distinto y disociándose de los otros. Preferiblemente sólo hay un fragmento de introgresión. [0058] Según la situación más favorable, el fragmento de introgresión presente en una planta según la invención es sólo las secuencias estrictamente necesarias para la resistencia al mildiú velloso. [0059] Las plantas según la invención pueden usarse para transferir la resistencia a Pd a otras plantas de valor agronómico, siempre que las plantas puedan cruzarse entre sí. Esto puede realizarse obteniendo un híbrido y entonces sometiendo a retrocruzamiento el híbrido con las segundas plantas, seguido de autopolinizaciones de las plantas obtenidas; en cada etapa, se selecciona la progenie resistente. [0060] Preferiblemente, las plantas según la invención son estables para la característica de interés, es decir resistencia a mildiú velloso de cebolla, sin embargo no necesariamente para otros rasgos. [0061] Puede obtenerse una planta según la presente invención a partir de un cruzamiento interespecífico inicial entre un genitor de Allium de tipo natural resistente a mildiú velloso de cebolla y Allium cepa. Según esta situación, el fragmento de introgresión se origina a partir del genitor de Allium de tipo natural. [0062] Con el fin de obtener una planta según la invención, es decir de la especie Allium, debe ser necesario seleccionar plantas híbridas resultantes del cruzamiento que comparten la mayor similitud genotípica con el progenitor de la especie Allium cepa que, sin embargo, es resistente a mildiú velloso. Preferiblemente, puede obtenerse una planta según la invención tras el cruzamiento interespecífico inicial anteriormente mencionado seguido de varios retrocruzamientos con una planta de la especie parental y opcionalmente una o varias autopolinizaciones. Las etapas de retrocruzamientos y autopolinizaciones permiten reducir la proporción de fragmentos de introgresión en la planta resultante. El número de retrocruzamientos que se recomienda es de al menos 2, preferiblemente 3, 4, 5 o también puede concebirse 6, 7, 8 a 10 retrocruzamientos sucesivos. El número de autopolinizaciones que pueden realizarse es de entre 1 y 8, preferiblemente 2, 3, 4 ó 5. [0063] El cruzamiento interespecífico inicial es entre el genitor de Allium de tipo natural resistente a mildiú velloso de cebolla y Allium cepa y los retrocruzamientos mencionados se llevan a cabo con plantas de la especie Allium cepa. El genitor de Allium de tipo natural es una planta de la especie Allium roylei. [0064] Tal como se mencionó anteriormente, puede someterse a prueba la presencia del locus de resistencia a Pd, según protocolos bien conocidos, para detectar la resistencia a infecciones por Peronospora destructor. Sin embargo, estos protocolos requieren mucho tiempo. Por tanto, también puede someterse a prueba la presencia del locus de resistencia a Pd mediante otras técnicas genéticas, basadas en amplificación génica, que las conoce bien el experto en el campo. [0065] Las técnicas que pueden usarse para la tipificación molecular incluyen polimorfismos en longitud de fragmentos de restricción (RFLP), electroforesis de enzimas multilocus y ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD). Otra técnica que es particularmente adecuada para someter a prueba la presencia del locus de resistencia a Pd en el genoma de una planta, es el AFLP™ (polimorfismos en longitud de fragmentos amplificados); por ejemplo una técnica de este tipo se describe en la referencia 4. Esta técnica es particularmente adecuada para la presente invención. [0066] Según la presente invención, esta técnica denominada AFLP™ se usa para someter a ensayo para determinar la presencia del locus de resistencia a Pd en el genoma de una planta del género Allium. La restricción del ADN genómico de la planta preferiblemente se realiza con las enzimas de restricción PstI y MseI; y el ligamiento se realiza con los siguientes adaptadores:

alfa 5’ – CTCGTAGACTGCGTACATGCA CATCTGACGCATGT-5’, y beta 5’ – GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5’. [0067] Entonces se lleva a cabo la amplificación por PCR con los fragmentos de restricción ligados a los adaptadores con los siguientes cebadores:

(A): 5’-GACTGCGTACATGCAGAAC y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT. [0068] Según este procedimiento, la presencia de un locus de resistencia a Pd en la planta sometida a prueba puede deducirse a partir de la presencia de un fragmento amplificado de 61 nucleótidos. En efecto, si resulta un fragmento de este tipo de las etapas anteriores, es indicativo de la presencia de un locus de resistencia a Pd según la invención, tal como puede deducirse a partir de los resultados notificados en el ejemplo 4. [0069] Alternativamente, el método puede llevarse a cabo según el siguiente protocolo alternativo:

-: Se realiza la restricción del ADN genómico de la planta con las enzimas de restricción PstI y MseI; y

-: Se realiza el ligamiento con los siguientes adaptadores: alfa 5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA CATCTGACGCATGT-5’, y

beta 5’-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5’;

- entonces se lleva a cabo la amplificación por PCR con los fragmentos de restricción ligados a los adaptadores con los siguientes cebadores:

(B): 5’-GACTGCGTACATGCAGAAG y 5’-GATGAGTCCTGAGTAAAAC. [0070] Cuando se lleva a cabo un protocolo de este tipo, un fragmento específico de 151 nucleótidos es representativo de

la presencia de un locus de resistencia a Pd en el genoma de la planta sometida a prueba, tal como puede deducirse a partir de los resultados notificados en el ejemplo 4. [0071] Según una tercera alternativa, el método puede llevarse a cabo según el siguiente protocolo:

beta 5’-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5’;

(C) 5’-GACTGCGTACATGCAGACA y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACCA. [0072] Cuando se lleva a cabo un protocolo de este tipo, un fragmento específico de 330 nucleótidos es indicativo de la presencia de un locus de resistencia a Pd en el genoma de la planta sometida a prueba, tal como puede deducirse a partir de los resultados notificados en el ejemplo 4. [0073] El ejemplo 4 de la presente invención describe el uso de un método de este tipo. [0074] La presente invención también da a conocer una planta de la especie Allium cepa, resistente de manera homocigota a mildiú velloso de cebolla, es decir la progenie de dicha planta tras autopolinización es 100% resistente a mildiú velloso, que puede obtenerse llevando a cabo el siguiente procedimiento:

a) realizar un cruzamiento interespecífico entre Allium roylei y Allium cepa; b) seleccionar un híbrido interespecífico, resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd); c) realizar el retrocruzamiento de dicho híbrido con

plantas de Allium cepa;

d) seleccionar plantas resistentes a mildiú velloso de

cebolla;

e) realizar la autopolinización de las plantas así

obtenidas;

f) seleccionar plantas resistentes de manera homocigota

a mildiú velloso de cebolla. [0075] Se ha probado que la etapa a) proporciona híbridos interespecíficos viables que son fértiles para machos y hembras. Puede realizarse el cruzamiento interespecífico entre Allium roylei como el progenitor macho y Allium cepa como el progenitor hembra o por el contrario con Allium roylei como el progenitor hembra y Allium cepa como el progenitor macho. [0076] La etapa b) es una etapa de selección de plantas resistentes a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor. Tal como se mencionó en los párrafos anteriores, puede someterse a prueba la resistencia mediante inoculaciones naturales o artificiales con protocolos conocidos descritos en la bibliografía o en la sección experimental de la presente solicitud. La selección también puede realizarse aprovechándose del método de AFLP™ descrito anteriormente. Las enzimas, adaptadores y cebadores de PCR útiles se describieron anteriormente, junto con la longitud del fragmento amplificado esperado indicativo de la presencia del locus de resistencia a Pd. [0077] Según la presente descripción, las plantas seleccionadas en la etapa b) no sólo son resistentes a mildiú velloso de cebolla, sino que también comparten de manera ventajosa el mayor número posible de características morfológicas con el progenitor de Allium cepa. [0078] La etapa c) se refiere al retrocruzamiento del híbrido interespecífico seleccionado en la etapa b) por su resistencia a mildiú velloso de cebolla con plantas de la especie Allium cepa. Estas plantas de Allium cepa usadas para la etapa de retrocruzamiento pueden ser de la misma subespecie, variedad o forma que la planta usada en la etapa a) como progenitor para el híbrido interespecífico, pero no necesariamente. [0079] Tras obtenerse las plantas resultantes del retrocruzamiento, se seleccionan las plantas que son resistentes a mildiú velloso de cebolla. Tal como se mencionó para la etapa b), esta selección puede realizarse sometiendo a prueba la capacidad para resistir una infección por Peronospora destructor, o logrando una tipificación molecular, por ejemplo mediante la técnica de AFLP™. [0080] En una realización preferida de la presente descripción, esta etapa c) seguida de la etapa d) se repiten de manera ventajosa al menos una vez, es decir, hay al menos dos retrocruzamientos sucesivos. El número de retrocruzamientos puede variar entre 2 y 10, preferiblemente 3, 4, 5 ó 6. [0081] La etapa e) es una etapa de autopolinización o autofecundación, que conoce bien un experto en la técnica. [0082] Esta etapa de autopolinización va seguida de la selección de plantas resistentes a mildiú velloso de cebolla, que comparten todos los rasgos característicos de una planta de la especie Allium cepa. Preferiblemente, estas etapas de autopolinización y selección se repiten al menos una vez, es decir se logran al menos dos series de autopolinización y selección. Estas etapas preferiblemente se llevan a cabo 2, 3, 4, 5 u 8 veces, es decir se repiten 1, 2, 3, 4 ó 7 veces. [0083] La última etapa del procedimiento se refiere a la selección de una planta que es resistente de manera homocigota a mildiú velloso de cebolla provocado por Peronospora destructor. Esta homocigosidad puede someterse a prueba realizando la etapa e) y comprobando que el 100% de la progenie es resistente a mildiú velloso. [0084] Según la presente descripción, esta última etapa de selección puede realizarse preferiblemente usando una técnica de tipificación molecular, por ejemplo la técnica de AFLP™ tal como se describió en las secciones anteriores y preferiblemente con las enzimas de restricción, los adaptadores y los cebadores citados anteriormente. [0085] La presente descripción también da a conocer un método para la producción de una planta de la especie Allium cepa que es resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) que comprende las siguientes etapas:

a) obtener un Allium roylei resistente a mildiú velloso

de cebolla;

b) realizar un cruzamiento interespecífico entre dicho

Allium roylei y un Allium cepa;

c) seleccionar un híbrido interespecífico resistente a

mildiú velloso de cebolla;

d) realizar el retrocruzamiento de dicho híbrido con una

planta de Allium cepa;

e) seleccionar las plantas resistentes a mildiú velloso

de cebolla;

f) autopolinizar la planta resistente obtenida en la

etapa e);

g) seleccionar las plantas resistentes de manera

homocigota a mildiú velloso de cebolla. [0086] Según la presente descripción, se usan marcadores moleculares en las etapas c), e) y/o g) para seleccionar plantas resistentes a mildiú velloso de cebolla. [0087] Las diferentes etapas del método son tal como se explicaron en los párrafos anteriores. Las realizaciones preferidas del procedimiento también se mencionaron previamente, en particular, la repetición de las etapas d) y e) y de las etapas f) y g). Las etapas de selección también pueden realizarse tal como se explicó previamente. Preferiblemente se logran usando un método de tipificación molecular haciendo uso de marcadores moleculares. Un método particularmente preferido es AFLP™ que se describe en las secciones anteriores. Según la descripción, pueden usarse marcadores moleculares sólo en la etapa de selección c), o sólo en la etapa e), o sólo en la etapa g), o en cada una de estas etapas, o en dos de las tres. [0088] En cada etapa de selección, las plantas seleccionadas preferiblemente son plantas que comparten el mayor número de rasgos característicos para Allium cepa. Según este procedimiento, en cada etapa se minimizan los fragmentos de introgresión que se originan a partir del primer genitor de Allium roylei. Los rasgos característicos para Allium cepa son tal como se dan a conocer en las Guidelines for the Conducts of Tests for Distinctness, Uniformity and Stability

(Directrices para llevar a cabo pruebas para determinar la distinción, uniformidad y estabilidad) (ref. TG/46/6), en relación con el tratado de la UPOV. [0089] Según la descripción, el método también puede comprender una etapa adicional de cruzamiento de la planta obtenida al final de la etapa g) con una planta de la especie Allium cepa que es sensible a mildiú velloso de cebolla. La planta resultante es resistente a mildiú velloso, ya que la planta obtenida al final de la etapa g) es resistente de manera homocigota a mildiú velloso. [0090] Tal como ya se mencionó, la etapa de selección c), e) y/o g) puede llevarse a cabo usando la técnica de AFLP™. Tal como se muestra a modo de ejemplo en la presente solicitud, las enzimas de restricción usadas en esta técnica son preferiblemente las enzimas PstI y MseI. El par de adaptadores adecuado para la etapa de ligamiento es:

alfa 5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA

CATCTGACGCATGT-5’, y

beta 5’-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5’. [0091] Para la etapa de amplificación por PCR, los pares adecuados de cebadores que pueden usarse son:

(A): 5’-GACTGCGTACATGCAGAAC y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT;

(B): 5’-GACTGCGTACATGCAGAAG y 5’-GATGAGTCCTGAGTAAAAC; y

(C) 5’-GACTGCGTACATGCAGACA y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACCA. [0092] Se amplifican varios fragmentos y pueden detectarse en un gel de agar tras esta amplificación por PCR. Sin embargo, la presencia de un fragmento que tiene 61 nucleótidos cuando se usa el par de cebadores (A), es indicativo de la presencia de un locus de resistencia a Pd en el genoma de la planta sometida a prueba. Alternativamente, cuando se usa el par de cebadores (B), la longitud del fragmento amplificado indicativo es de 151 nucleótidos, y de 330 cuando se usa el par de cebadores (C). [0093] En una realización preferida de la invención, cuando se usa la técnica de AFLP™, también pueden llevarse a cabo amplificaciones por PCR adicionales, con el fin de detectar falsos positivos. Según este procedimiento, las amplificaciones se llevan a cabo con al menos un par de cebadores elegidos entre los siguientes pares de cebadores:

(A’) 5’-GACTGCGTACATGCAGAAG y 5’-GATGAGTCCTGAGTAAAAC; (B’) 5’-GACTGCGTACATGCAGAAC y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT; y (C’) 5’-GACTGCGTACATGCAGAAA y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACAC.

[0094] Los fragmentos amplificados resultantes de estas amplificaciones adicionales se usan como controles negativos. Cuando se usa el par de cebadores (A’), (B’) o (C’), no debe detectarse ningún fragmento de la longitud esperada cuando se usa el par de cebadores (A), (B) o (C). [0095] La presente descripción también da a conocer plantas del género Allium que pueden obtenerse mediante los métodos descritos, en particular mediante el método según las realizaciones preferidas. [0096] La invención también se refiere a una planta de Allium cepa híbrida que puede obtenerse cruzando una línea parental de Allium cepa sensible a mildiú velloso con una planta resistente de manera homocigota a mildiú velloso de cebolla según la invención. Dicha planta, por ejemplo, puede obtenerse llevando a cabo el método de la invención tal como se dio a conocer anteriormente.

[0097] La línea parental de Allium cepa puede ser cualquier línea de la especie Allium cepa, preferiblemente es una línea bien descrita y conocida por sus características de interés. Por ejemplo, es una línea de cultivar conocida por su sabor, crecimiento rápido u otro rasgo agronómico importante. [0098] Según una realización preferida, la línea parental es una línea endogámica de Allium cepa estéril macho citoplasmática. [0099] Cualquier planta de la invención que se ha descrito es, según una realización preferida de la invención, una cebolla o chalote cultivado.

Leyenda de las figuras [0100]

Figura 1: esta figura ilustra de manera esquemática una posible vía de transmisión del locus de resistencia a Pd y secuencias letales a la progenie de autopolinización para 4 especies Allium resistentes diferentes. La columna de la derecha proporciona el porcentaje de resistencia en la progenie y es indicativo de si la planta parental tiene al menos un homólogo del cromosoma 3 que lleva el locus de resistencia sin las secuencias letales. Figura 2: esta figura representa los cariotipos de GISH para 14 plantas resistentes a mildiú velloso de la población 2348, que se han analizado según el protocolo descrito en el ejemplo 2. 2348-1, 2348-3, 2348-4, 23485, 2348-6, 2348-7, 2348-8, 2348-11, 2348-13, 2348-14, 2348-15, 2348-16, 2348-18 y 2348-19 son diferentes plantas de la misma línea parental 2348. Figura 3: esta figura representa los cariotipos de GISH para 6 plantas resistentes a mildiú velloso de la población 3591, que se han analizado según el protocolo descrito en el ejemplo 2. 3591-1 (figura 3A), 3591-3 (figura 3B), 3591-4 (figura 3C), 3591-5 (figura 3D), 3591-6 (figura 3E) y 3591-8 (figura 3F) son plantas diferentes de la misma línea parental 3591.

Ejemplos: [0101] Ejemplo 1: Obtención de una línea resistente de manera homocigota de Allium cepa. Introducción:

[0102] El mildiú velloso en la cebolla está causado por el hongo Peronospora destructor (Berk.) Casp. (Mukerji, ref. 5). Es un patógeno estricto que sólo puede mantenerse sobre tejido vegetal, no sobre agar ni medios líquidos in vitro. [0103] Pueden llevarse a cabo pruebas sobre la resistencia a la enfermedad de diversas maneras, véase por ejemplo de Vries et al. (ref. 3). Pueden producirse epidemias espontáneas en el campo, si las condiciones son favorables para la enfermedad. Pueden llevarse a cabo pruebas artificiales en invernaderos o salas climatizadas con entornos más controlados. Pueden someterse a prueba tanto plantas jóvenes como bulbos

germinados.: Los síntomas son amarilleo de las hojas y

esporulación gris.

[0104] En: el programa de reproducción seguido por los

inventores, se han aplicado diversos métodos durante el procedimiento de retrocruzamiento y durante el procedimiento de autofecundación con el fin de obtener líneas homocigotas. [0105] Este informe describe que los ensayos que dieron como resultado la conclusión de que la resistencia no se heredó de manera tan sencilla como se esperaba: monogénica dominante, y que dio como resultado la producción de la línea 3591 de la invención, con resistencia completa a mildiú velloso.

Materiales y métodos.

[0106] EL punto de partida de este estudio es la planta denominada F1BC2 dada a conocer en de Vries et al. (ref. 3). Esta planta se ha obtenido mediante un primer cruzamiento interespecífico entre Allium cepa y Allium roylei (F1), seguido de dos retrocruzamientos sucesivos con Allium cepa (BC2). Los presentes inventores continuaron llevando a cabo retrocruzamientos de dicho material vegetal con sus líneas de reproducción y llevaron a cabo autofecundaciones de la generación BC5 con el fin de obtener líneas homocigotas. S1, S2 y S3 indican respectivamente que se llevaron a cabo 1, 2 ó 3 etapas de autofecundación (autopolinización) sucesivas. [0107] Se llevó a cabo una primera prueba de campo con las líneas F3 (F1BC5S2), derivadas de plantas resistentes de autofecundación de diferentes poblaciones F2 (F1BC5S1). Se sembraron las plantas en el principal campo de reproducción de los inventores. [0108] Se pusieron en el campo los bulbos propagadores que se inocularon previamente en el invernadero (Hildebrand et al., ref. 7). [0109] Se preparó el inoculo suspendiendo conidiosporas en agua desmineralizada. Se lavaron las hojas con esporas en agua desmineralizada sobre dos capas de estopilla. Se diluyó la suspensión hasta 5,0 x 104 esporas/ml. Se inocularon las esporas en bulbos, desde el ecuador del bulbo hasta la placa basal, con una jeringa con aguja. Se pusieron los bulbos en bolsas de plástico con cierta cantidad de papel húmedo durante 24 h a 10°C. Después de eso, se elevó la temperatura hasta 15°C con el fin de estimular el crecimiento del micelio. Entonces, se plantaron los bulbos en el campo. [0110] Se inició una epidemia y se contaron las plantas infectadas durante la segunda mitad de agosto. Durante la estación de crecimiento y hasta el estadio de la caída de las hojas y la maduración de los bulbos, se realizaron recuentos de bulbos no infectados con el fin de estimar la puntuación de resistencia y la razón de segregación de las diferentes líneas. Las plantas resistentes no muestran síntomas en absoluto. Si pudo puntuarse alguna lesión, se consideró la planta sensible.

[0111] En la segunda prueba de campo, se perforaron 353 parcelas en el campo de reproducción, la primera semana de abril. [0112] Se rodeó el campo con bulbos, con el fin de estimular el desarrollo de la epidemia de mildiú velloso. Se inició una fuerte infección que dio como resultado una infección del 100% de las parcelas de control de la variedad Staccato sensible. Se realizaron recuentos de las plantas infectadas y no infectadas. Se recogieron los bulbos de las líneas relevantes y se usaron para investigación adicional y la producción de semillas para el año siguiente.

Resultados.

[0113] La primera prueba de campo dio como resultado una fuerte infección de las plantas de cebolla. Siempre que los síntomas pudieron puntuarse de manera fiable, se realizaron recuentos de las plantas sensibles. Algunas líneas precoces tuvieron caída en un estadio temprano y no pudo realizarse ninguna distinción entre la muerte de las hojas y los síntomas de mildiú velloso. Para estas líneas, sólo se puntuaron las plantas sensibles y no las resistentes, porque la clase resistente en estas líneas precoces contendría muchos escapes. En total había 20 líneas. Se contaron 34 líneas tanto para plantas sensibles como para resistentes y estas líneas tuvieron la caída mucho más tarde y pudo realizarse de manera fiable la puntuación de resistencia. Los datos se proporcionan en la tabla 1. [0114] La segunda prueba de campo de nuevo proporcionó una alta infección de mildiú velloso. Las parcelas de control especiales de la variedad Staccato sensible se infectaron al 100%. En esta prueba de campo de 353 líneas de reproducción diferentes, sólo se encontró un número que no proporcionó ninguna planta infectada. Esta línea de reproducción 4018282 sembrada en la parcela número 3591 proporcionó 140 plantas no infectadas. Otras 21 líneas F4 (F1BC5S3), derivadas mediante autofecundación de la misma línea F3, 3997284, mostraron segregación para la resistencia, tabla 2.

29

Tabla 1: Prueba de campo a mildiú velloso n.º 1:Tabla 2: Prueba de campo de mildiú velloso n.°2:

Línea dereproducciónF3 S2: Porcentajederesistencia Plantassensibles Plantasresistentes

397730439773053977307397731139773133977319397732239773263977328397733339773343977336397733739773383977343397734439773503977351: 72,667,590,752,957,755,651,750,959,157,162,566,756,270,374,068,458,353,1 6312426177224248357825627548253123320244338 167258254199305311382858136680504017857526043

3977357397735839773673977375397737739773783977379397738039773813977382397738539773873977392397739439773953977396Total: 73,292,568,360,971,057,456,061,766,558,966,360,255,972,155,047,660,7 56733885410380755630431371523945663401 1538671137132139102121111436615619310155605243

Línea dereproducciónF4 S3: Porcentajederesistencia Plantassensibles Plantasresistentes Línea dereproducciónF4 S3 Porcentajederesistencia Plantassensibles Plantasresistentes

40182684018269401827040182724018273401827440182754018276401827840182794018280: 58,361,569,261,764,575,17168,563,756,966,9 6382665760466778859746 881311489210913916417014912893 40182814018282401828340182844018287401828840182894018290401829140182924018293 60,510062,266,754,871,471,553,867,865,272,2 900564784465555386480 13814092941021151386480120208

Discusión.

[0115] El ensayo de campo n.º 1 proporcionó la primera indicación clara de que la reproducción de cebollas resistentes a mildiú velloso no era tan sencilla como se esperaba anteriormente. En caso de una resistencia heredada de manera dominante, monogénica, normalmente se esperaría encontrar al menos 1/3 de las líneas que son completamente resistentes, tras autofecundar plantas F2 resistentes. Sólo las plantas RR proporcionan una progenie completamente resistente, las plantas Rr se segregarán, y en una F2 tras selección por la resistencia, las plantas RR comprenden 1/3 de la población (en la que “R” representa el alelo que lleva el gen de resistencia dominante, “r” para el gen sensible recesivo). Se sometieron a prueba 54 líneas y pudieron puntuarse de manera fiable 34 tanto para resistencia como para sensibilidad, pero todas de las 54 líneas se segregaron. Esto significa una razón significativamente diferente de 1/3. [0116] La razón total de plantas resistentes con respecto a todas las líneas era inferior a la esperada (60,65%). Si se autofecundaba una planta heterocigota, se esperaba una razón resistente del 75% en el caso de un único gen dominante. [0117] Las líneas individuales, como 3977307 y 3977358 proporcionaron un razón diferente. Esto puede estar causado por escapes. Se han sometido a prueba líneas endogámicas derivadas de 3977303, y todas se segregaron, con razones que variaban entre el 52% y el 73% (datos no mostrados). Las plantas que no pudieron infectarse se clasificaron como resistentes, pero se escaparon en mostrar síntomas, quizá debido a la pudrición temprana del follaje, baja población, lo que conduce a un microclima menos húmedo u otra enfermedad o infecciones por trips. [0118] La prueba de campo n.º 2 dio como resultado el descubrimiento de la parcela 3591-1, que contiene la línea 4018282. Esta línea no mostró plantas sensibles en un campo fuertemente infectado. El campo contenía 353 líneas que confirmaron la complejidad de la herencia. Por otra parte, se encontró una frecuencia mucho mayor de líneas homocigotas y no sólo de la línea 4018282/3591. [0119] De la parcela 3591 se llevaron las plantas al invernadero para la investigación que va a llevarse a cabo sobre el fragmento de introgresión de A. roylei (véase el ejemplo 3) y para fines de producción de semillas. Los resultados presentados en el ejemplo 3 mostraron que 3591 contenía un fragmento de introgresión más pequeño. Algunas de las plantas son heterocigotas para los fragmentos de introgresión pequeños y grandes y la planta 3591-1 era homocigota para el fragmento de introgresión pequeño. [0120] Se ilustra la singularidad de esta línea mediante los resultados de las líneas hermanas proporcionados en la tabla

2. Todas estas líneas se han derivado de la misma línea F3 mediante autofecundación y ninguna de ellas muestra homocigosidad. [0121] Ejemplo 2: Hibridación genómica in situ (GISH) con la línea de reproducción 2348, generación F1BC5S3 (la línea de reproducción 2348 de número de muestra 4008191 de la parcela 2348 proporcionó una resistencia del 66% en el campo). [0122] Se ha desarrollado la técnica de hibridación genómica in situ (GISH) en cebolla por Khrustaleva y Kik (ref. 9 y 10) y se ha usado en la presente invención con el fin de distinguir los insertos/segmentos genómicos de Allium roylei de los cromosomas de Allium cepa. Por tanto, esta técnica permite la visualización de los fragmentos de introgresión de Allium roylei en el genoma de una planta de Allium cepa. [0123] Se llevaron a cabo un primer conjunto de experimentos por Plant Research International BV, Wageningen (NL), con plantas de cebolla resistentes, sin embargo plantas con segregación que corresponden a 14 plantas F1BC5S3, en las que F, es el híbrido interespecífico entre Allium roylei y Allium cepa, BC5 indica 5 retrocruzamientos sucesivos y S3 3 autopolinizaciones sucesivas.

Introducción:

[0124] La GISH es una técnica poderosa para la detección de la introgresión de material de cromatina de una especie en otras especies. La ventaja de GISH es que el procedimiento de introgresión se visualiza por medio de “imágenes del genoma con introgresión”. Con esta técnica, también es posible establecer si una región particular del genoma es homocigota o heterocigota, gracias al uso de marcadores citogenéticos moleculares que son codominantes. Mediante esta técnica, también es posible determinar en qué cromosoma está presente un gen de introgresión de interés.

Material de planta:

[0125] El material de partida es la línea de reproducción 2348, generación F1BC5S3. Se recogen puntas de raíces jóvenes y se preparan hasta 100 portaobjetos para el análisis de propagación de metafase (para la descripción del método, véase Khrustaleva y Kik, (ref. 9 y 10)). Los portaobjetos con metafases bien propagadas y que contienen un conjunto completo de cromosomas (2n=2x=16) se seleccionan para experimentos de GISH.

Método: [0126] Se extrae el ADN genómico de hojas jóvenes de A. cepa y

A. roylei usando el método CTAB de Rogers y Bendich (ref. 13). [0127] Se marca el ADN genómico de A. roylei con Dig-11-dUTP (digoxigenin-11-2’-desoxi-uridina-5’-trifosfato) mediante un protocolo de corte-traducción convencional (Boehringer, Manheim, Alemania). Se usa el ADN genómico de A. cepa como ADN de bloqueo. La hibridación in situ, la detección inmunológica y el procedimiento de microscopía son tal como se describieron anteriormente por Khrustaleva y Kik, (ref. 9 y 10). Se llevan a cabo análisis de cariotipo según el sistema de nomenclatura para la cebolla convencional propuesto por Kalkman (ref. 12) y confirmado por el cuarto Simposio de Eucarpia Allium por de Vries (ref. 8). Las mediciones cromosómicas de 3-5 metafases por cada registro se realizan con un programa de software libre para Windows de la Universidad del Estado de Colorado: (http://www.colostate.edu/Depts/biolog/MicroMeasure)

Resultados:

[0128] El análisis de GISH de 14 plantas resistentes de la línea de reproducción 2348, generación F1BC5S3 mostró que todas las plantas presentan el segmento de A. roylei que alberga el/los gen(es) para la resistencia a mildiú velloso (figuras 2A, 2B y 2C). El análisis de cariotipo reveló que el cromosoma recombinante que transportaba el segmento de A. roylei es el cromosoma 3 (índice de centrómero: 41,7; longitud cromosómica relativa: 13,8). Sólo trece plantas presentaban un segmento de

A. roylei en el cromosoma 3, los demás cromosomas homólogos demostraron estar compuestos sólo por cromatina de A. cepa. Sin lugar a dudas, estos resultados demostraron que todas de las 13 plantas de la línea de reproducción 2348 son heterocigotas para el segmento que contiene el/los gen(es) de resistencia a mildiú velloso. El registro 2348-5 presenta dos segmentos de A. roylei: uno en el brazo largo del cromosoma 3 que portaba el/los gen(es) de resistencia a mildiú velloso y uno adicional en el brazo largo del cromosoma 4 (índice centromérico: 39,3; longitud cromosómica relativa: 12,6). Ambos segmentos están presentes de manera heterocigota en el genoma. [0129] El análisis de GISH también permite la determinación del tamaño del segmento de introgresión en el brazo largo del cromosoma 3 de A. roylei dentro del cromosoma de A. cepa. El segmento en promedio es el 25,2% de la longitud del cromosoma completo y el 43,9% de la longitud del brazo largo.

Discusión:

[0130] Mediante este método, se ha detectado con éxito la introgresión de material de cromatina de A. roylei que porta genes de resistencia a mildiú velloso dentro del genoma de la cebolla. Los presentes datos demuestran la naturaleza heterocigota de el/los gen(es) de resistencia a mildiú velloso en la línea de reproducción 2348, generación F1BC5S3. En todos de los 14 individuos seleccionados como resistentes en el campo, se encontró un segmento de A. roylei sólo en un homólogo del cromosoma 3. Podrían explicarse los resultados mencionados anteriormente planteando la hipótesis de que un gen (o factor de letalidad) que es necesario para el desarrollo de A. cepa, por ejemplo para el desarrollo de las semillas, y ubicado cerca del/de los gen(es) de resistencia a mildiú velloso, es responsable de la ausencia de plantas homocigotas. En efecto, puede suponerse que la sustitución de un gen de A. cepa esencial por el gen de A. roylei correspondiente durante la introgresión conduce a una grave alteración del desarrollo de la planta, por ejemplo el desarrollo de las semillas, cuando se coloca en un fondo citoplasmático de A. cepa. Puede obtenerse una cebolla resistente homocigota viable sólo si se produce la recombinación entre el/los gen(es) de resistencia a mildiú velloso y el factor de letalidad, si esto es posible. [0131] Durante el retrocruzamiento a A. cepa y la selección por la resistencia a mildiú velloso, se mantendrán sólo aquellas plantas que contienen el segmento de A. roylei que alberga el/los gen(es) de resistencia a mildiú velloso. Eventualmente, esto conduce a plantas, que consisten sólo en cromatina de A. cepa y un segmento de A. roylei. Sin embargo, según la hipótesis mencionada anteriormente, este segmento ha sustituido al gen de A. cepa necesario para el desarrollo. En una condición heterocigota, se desarrollan semillas y se obtendrán plantas, pero en la condición homocigota no se forman plantas.

Ejemplo 3: Hibridación genómica in situ (GISH) con la línea de reproducción 3591, generación F1BC5S3

Introducción:

[0132] Tras el análisis de 14 plantas resistentes a mildiú velloso de la línea de reproducción 2348, generación F1BC5S3, se mostró que todas las plantas eran heterocigotas para el locus de resistencia a Pd. Se detectó el segmento de A. roylei que alberga el/los gen(es) para resistencia a mildiú velloso sólo en uno de los homólogos del cromosoma 3, consistiendo el otro homólogo en su totalidad en cromatina de A. cepa. Este análisis adicional se refiere a la línea de reproducción 3591 en la que no tiene lugar segregación para la resistencia a mildiú velloso en los campos. En vista de esto, se espera encontrar en esta población, a través de GISH, plantas que son homocigotas para la zona del cromosoma 3 que alberga el locus de resistencia a mildiú velloso.

Material de planta:

[0133] Se recogen puntas de raíces jóvenes de 6 plantas individuales, línea de reproducción 3591, generación F1BC5S3, y se preparan hasta 50 portaobjetos para análisis de propagación de metafase (para la descripción del método, véase Khrustaleva y Kik, ref. 9). Se seleccionan los portaobjetos con metafases bien propagadas y que contienen un conjunto completo de cromosomas (2n=2x=16) para experimentos de GISH.

Métodos:

[0134] Se facilitan detalles en la sección “método” del ejemplo anterior.

Resultados:

[0135] Plant Research International BV, Wageningen, NL llevó a cabo análisis de GISH de 6 plantas resistentes de la línea de reproducción 3591, generación F1BC5S3 que mostraron que todas las plantas son A. roylei homocigota para la zona que alberga el locus de resistencia a mildiú velloso (véanse las figuras 3A a 3F). El análisis de cariotipo revela la presencia de un segmento de A. roylei en ambos homólogos del cromosoma 3 (índice de centrómero: 41,7; longitud cromosómica relativa: 13,8). Entre 6 plantas analizadas, el registro 3591-1 presenta 2 segmentos pequeños en ambos homólogos del cromosoma 3 (figura 3A). El tamaño de los segmentos de introgresión de A.

roylei es el mismo en ambos homólogos y promedia: del 17,9 ± 0,78% de la longitud del brazo largo. Cinco plantas, concretamente los números de registro 3591-3, 3591-4, 3591-5, 3591-6 y 3591-8, presentan dos segmentos de introgresión de A. roylei que diferían en tamaño (figuras 3B, 3C, 3D, 3E y 3F). El tamaño del segmento más grande promedia del 42,8 ± 1,09% de la longitud del brazo largo y el tamaño del más pequeño promedia el 17,9 ± 0,78%.

Discusión:

[0136] Los presentes resultados confirman la hipótesis expuesta para explicar la naturaleza heterocigota del locus de resistencia a mildiú velloso en la línea de reproducción 2348. En efecto, puede plantearse la hipótesis de que un factor de letalidad, perjudicial para el desarrollo de la planta y que está ubicado cerca del/de los gen(es) de resistencia a mildiú velloso, es responsable de la ausencia de la planta resistente homocigota, o puede plantearse la hipótesis de que un gen de

A. cepa esencial, necesario para el desarrollo de la planta, se desactiva mediante la introgresión y es responsable de la ausencia de plantas resistentes homocigotas. [0137] Se supone que el segmento de introgresión de A. roylei también presenta el gen correspondiente que no funciona en un citoplasma de A. cepa exclusivo (es decir interacción núcleocitoplasmática). En una condición homocigota de A. roylei, el gen de A. cepa esencial se sustituirá completamente por el gen de A. roylei correspondiente, en consecuencia proporcionará semillas no viables. Sólo si se produce la recombinación entre el/los gen(es) de resistencia a mildiú velloso y el gen esencial (o factor de letalidad), se obtendrá una planta resistente homocigota viable. El análisis de GISH de la línea de reproducción 3591 demuestra que puede obtenerse una planta resistente homocigota (3591-1) debido a un acontecimiento de recombinación entre el gen de resistencia y el factor de letalidad. Los otros cinco registros presentan segmentos de introgresión de A. roylei tanto pequeños como grandes, lo que significa que estas plantas son homocigotas para el/los gen(es) de resistencia y heterocigotas para el factor de letalidad de A. roylei. [0138] Debe observarse que, tal como se esperaba a partir de la hipótesis mencionada anteriormente, no se han encontrado plantas que presenten dos segmentos de introgresión de A. roylei grandes, porque esta constitución genética da como resultado que no se desarrollen semillas.

Ejemplo 4: Identificación de marcadores ligados al locus de resistencia a Peronospora destructor (forma derivada de A. roylei).

Material de planta (número de individuos):

[0139]

1X Allium roylei (homocigota resistente) 4x (denominado AcA a AcD) y 24X (denominado Ac01 a Ac24) Allium cepa (homocigota sensible)

1X: 3591-1 (homocigota resistente; fragmentos de

introgresión: pequeños)

1X: 3591-3 (homocigota resistente, fragmentos de

introgresión pequeños y grandes) 14X 2348-* (heterocigota resistente; fragmento grande).

Introducción:

[0140] Para información complementaria sobre la técnica de AFLP™, se hace referencia a la publicación referenciada como n.º 4. {0141] El objetivo de este ejemplo es identificar marcadores de AFLP™ ligados al locus de resistencia a Peronospora destructor en cebolla. El locus de resistencia se deriva de Allium roylei. [0142] Tal como se muestra en el ejemplo 2, se ha identificado un fragmento de introgresión grande en algunos individuos (individuos 2348-*). Además de estos individuos, también se obtuvieron dos individuos que presentan un fragmento de introgresión más pequeño (3591-1; fragmento pequeño, y 3591-3; fragmentos pequeños y grandes). Para identificar los marcadores asociados con el locus de resistencia, y especialmente obtener marcadores que están ubicados en el fragmento de introgresión más pequeño, se llevó a cabo una estrategia de análisis de segregantes agrupados (BSA, véase Michelmore, ref. 11) adaptado con cuatro individuos/combinaciones:

I: individuo 2348-6; heterocigota resistente; fragmento de introgresión grande,

II: individuo 3591-1; homocigota resistente; fragmento de introgresión pequeño,

III: individuo Allium roylei; homocigota resistente,

IV: una combinación de cuatro individuos de A. cepa (AcA a AcD); homocigota sensible.

[0143] Se usaron los cuatro individuos separados de Allium cepa, 13 individuos “2348” restantes y el individuo 3591-3 para la verificación de los marcadores ligados. Finalmente, los marcadores que se encontró que estaban ligados al rasgo de interés se comprueban con un conjunto de 24 individuos de Allium cepa (Ac01 a Ac24) para identificar marcadores falsos positivos.

Resultados:

[0144] Material biológico: se extrajo ADN de material de hoja de 31 individuos (28X Allium cepa e individuos 3591-1, 3591-3 y Allium roylei) y ADN de los 14x individuos “2348” y se generaron para todos los individuos moldes de PstI/MseI. No pudieron generarse huellas dactilares de AFLP™ fiables para los individuos 2348-4, 2348-5, 2348-11 y 3591-3, por tanto se excluyeron estos individuos del análisis adicional.

Identificación y verificación de marcadores:

[0145] Se llevó a cabo un enfoque de BSA adaptado con cuatro individuos o combinaciones I, II, III, IV tal como se describió anteriormente. [0146] Se llevó a cabo el BSA usando 96 combinaciones de cebadores en la matriz de Pstl+3/Msel+3, se proporciona una visión general de las combinaciones de cebadores usadas en la tabla 3 y la tabla 6 facilita la nomenclatura de combinaciones de enzimas-cebadores de AFLP™. [0147] El BSA dio como resultado las identificaciones de 34 marcadores candidatos de los que ocho marcadores candidatos están posiblemente ligados al fragmento de introgresión pequeño. A partir de estos 34 marcadores candidatos, se realizó una selección de 13 marcadores incluyendo los ocho marcadores que están posiblemente ligados al fragmento de introgresión pequeño. Se usó esta selección de 13 marcadores para la verificación con más individuos. Se usaron para la verificación de cuatro individuos de Allium cepa, los 13 individuos “2348” restantes y el individuo 3591-3.

Tabla 3: Combinación de cebadores usada para el enfoque de BSA

M32: M34 M35 M37 M47 M48 M50 M51 M54 M59 M60 M62

P31: X X X X X X X X X X X X

P32: X X X X X X X X

P33: X X X X

P38: X X X X X X X X

P39: X X X X X X X X X X X X

P35: X X X X X X X X X X X X

P42: X X X X X X X X

P43: X X X X X X X X X X X X

P44: X X X X X X X X

P45: X X X X X X X X X X X X

[0148] Basándose en la verificación, tres marcadores candidatos (de los que dos están posiblemente ligados al 5 fragmento de introgresión pequeño) no mostraron un ligamiento claro con el rasgo de interés. Sin embargo un total de cuatro, respectivamente seis marcadores candidatos, mostraron un ligamiento claro con el fragmento de introgresión pequeño, respectivamente grande. Sin embargo, dos de estos marcadores

10 candidatos, unidos al fragmento de introgresión pequeño también están presentes en uno de los cuatro individuos de Allium cepa. Por tanto, se encuentra que estos marcadores no son útiles para el análisis adicional. Los resultados de la verificación se muestran en la tabla 4.

15 [0149] Se encontró que los marcadores P32/M62-061, P33/M32151, P35/M51-330 y P43/M35-190 están ligados al fragmento de introgresión pequeño.

Verificación extra en 24 individuos de Allium cepa:

20 [0150] Para superar los marcadores falsos positivos, se comprobaron los cuatro marcadores candidatos (P32/M62-061, P33/M32-151, P35/M51-330 y P43/M35-190) ligados al fragmento de introgresión pequeño en 24 individuos de Allium cepa extra (Ac01 a Ac24). Las puntuaciones obtenidas de los marcadores son de acuerdo a la puntuación esperada (véase la tabla 5).

Tabla 4: Visión general de puntuaciones de marcadores con plantas individuales

imagen1

+ = fragmento de AFLPTM presente, - = fragmento de AFLPTM ausente, X = producto generado que no es bueno, ? = no puede puntuarse

10

Discusión y conclusión: [0151] Para identificar los marcadores asociados con el locus de resistencia a Peronospora destructor en cebolla, y especialmente para obtener marcadores que están ubicados en el

15 fragmento de introgresión más pequeño, se llevó a cabo una estrategia de análisis de segregantes agrupados (BSA) adaptado con cuatro individuos/combinaciones. Se llevó a cabo el BSA usando un total de 96 combinaciones de cebadores de PstI/MseI (que se seleccionaron con cuatro individuos/combinaciones).

Tabla 5: Visión general de puntuaciones de marcadores en plantas individuales

imagen1

10

[0152] El BSA dio como resultado la identificación de 34 marcadores candidatos de los que 8 marcadores candidatos estaban posiblemente situados en el fragmento de introgresión pequeño. Tras la verificación, se identificaron un total de 15 cuatro marcadores que están ubicados en el fragmento de

introgresión pequeño (en el que también está ubicado el locus de resistencia a Peronospora destructor). [0153] Para superar marcadores falsos positivos, se comprobaron los cuatro marcadores candidatos (P32/M62-061, 5 P33/M32-151, P35/M51-330 y P43/M35-190) ligados al fragmento de introgresión pequeño en 24 individuos de Allium cepa extra. Las puntuaciones obtenidas de los marcadores son de acuerdo con la puntuación esperada. Por tanto, se encuentra que estos marcadores están ligados al fragmento de introgresión pequeño 10 de interés y pueden usarse para procedimientos de selección adicionales.

Tabla 6: Nomenclatura de combinación de enzimas-cebadores de AFLP™

Extensión: Códigode cebador Extensión Códigode cebador Extensión Códigode cebador

AAA: 31 CCC 52 GGG 73

AAC: 32 CCG 53 GGT 74

AAG: 33 CCT 54 GTA 75

AAT: 34 CGA 55 GTC 76

ACA: 35 CGC 56 GTG 77

ACC: 36 CGG 57 GTT 78

ACG: 37 CGT 58 TAA 79

ACT: 38 CTA 59 TAC 80

AGA: 39 CTC 60 TAG 81

AGC: 40 CTG 61 TAT 82

AGG: 41 CTT 62 TCA 83

AGT: 42 GAA 63 TCC 84

ATA: 43 GAC 64 TCG 85

ATC: 44 GAG 65 TCT 86

ATG: 45 GAT 66 TGA 87

ATT: 46 GCA 67 TGC 88

CAA: 47 GCC 68 TGG 89

CAC: 48 GCG 69 TGT 90

CAG: 49 GCT 70 TTA 91

CAT: 50 GGA 71 TTC 92

CCA: 51 GGC 72 TTG 93

GGG: 73 TTT 94

[0154] Ejemplo 5: determinación de la presencia, en una planta de género Allium, de un fragmento de introgresión de A. roylei que confiere resistencia a mildiú velloso de cebolla, que puede estar presente de manera homocigota sin causar letalidad. [0155] En una primera etapa, se evalúa la presencia del locus

5 de resistencia a Pd en mildiú velloso de cebolla en la planta en examen. Puede evaluarse la presencia de dicho locus usando la técnica de AFLP™, tal como se describió a modo de ejemplo en el ejemplo anterior o evaluando la resistencia de la planta a inoculaciones naturales o artificiales con Peronospora

10 destructor. [0156] Si la planta presenta en su genoma un locus de resistencia a Pd, los homólogos del cromosoma 3 de dicha planta corresponden necesariamente a una de las 4 posibilidades representadas en la figura 1 (con y sin

15 ligamiento a secuencias letales). [0157] Con el fin de distinguir los tres primeros genomas del cuarto, se lleva a cabo la autopolinización de la planta en examen. Entonces se examina la progenie de la autopolinización para determinar la presencia del locus de resistencia a Pd.

20 Tal como puede observarse a partir de la figura 1, sólo los tres primeros genomas proporcionan una progenie que es teóricamente al menos el 75% resistente, mientras que el cuarto genoma representado, que no es parte de la presente invención, proporciona una progenie que es inferior al 67%

25 resistente a mildiú velloso de cebolla. [0158] Conociendo el porcentaje de la progenie resistente tras la autopolinización, es posible por tanto deducir si la planta sometida a prueba está en una de las tres primeras categorías representadas o está en la cuarta, es decir si se encuentra o

30 no dentro del alcance de la presente descripción.

0Bibliografía

[0159]

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(A. roylei* A. cepa). Plant Breeding 105:144-149, 1990.

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11.: Michelmore, R.W. et al. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific

genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU. 88: 9828-9832, 1991.

12.: Kalkman, E.R. Analysis of the C-banded karyotype of Allium cepa L. Standard system of nomenclature and polymorphism. Genetica 65:141-148, 1984.

13.: Rogers y Bendich. In: Gelvin SB, Schilperoort RA (eds) Plant Molecular Biology manual A6, Kluwer Academic Publ., Dordrecht, Países Bajos; 1-10, 1998.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para la comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tomado especial cuidado en la compilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos no de patentes citados en la descripción

• Meer, Q.P. van der; Vries, J.N. De. An interspecific cross between Allium roylei Steam and Allium cepa L., and its backcross to A. cepa. Euphytica, 1990, vol. 47, 29-31

[0159]

•: Kofoet, A. et al. Inheritance of resistance to Downy Mildew (Peronospora destructor [Berk.] Casp.) from Allium roylei Steam in the Backcross Allium cepa L.* roylei* A. cepa). Plant Breeding, 1990, vol. 105, 144-149 [0159]

•: Vries, J.N. De et al. Linkage of downy mildew resistance genes Pd1 and Pd2 from Allium roylei Stearn in progeny of its interspecific hybrid with onion (A. cepa L.). Euphytica, 1992, vol. 64, 131-137 [0159]

•: Vos, P. et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 1995, vol. 21 (21), 4407-4414 [0159]

•: Mukerji, K.G. CMI Description of Pathogenic fungi and Bacteria No456. Peronospora destructor, 1975 [0159]

•: Downy Mildew of Onion. Viranyi, F. DM Spencer, The Downy Mildews. 1981, 461-471 [0159]

•: Hildebrand, P.D.; Sutton, J.C. Maintenance of Peronospora destructor in onions sets. Canadian Journal of Plant Pathology, 1980, vol. 2, 239-240 [0159]

•: Vries, J.N. De. Onion chromosome nomenclatura and homoeology relationships-workshop report. Euphytica, 1990, vol. 49, 1-3 [0159]

•: Khrustaleva, L.I. ; Kik, C. Cytogenetical studies in the

5 bridge cross Allium cepa * (A. fistulosum * A. roylei. Theor. Appl. Genet., 1998, vol. 96, 8-14 [0159]

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10 • Michelmore, R.W. et al. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 1991, vol. 88, 9828-9832 [0159]

15 • Kalkman, E.R. Analysis of the C-banded karyotype of Allium cepa L. Standard system of nomenclature and polymorphism. Genetica, 1984, vol. 65, 141-148 [0159]

• Rogers ; Bendich. Plant Molecular Biology manual A6. Kluwer Academic Publ, 1998, 1-10 [0159]

20

Claims

1. Planta de la especie Allium cepa que es resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) debido a un locus de resistencia a Pd presente de manera homocigota en el brazo largo del cromosoma 3 en el genoma de dicha planta, en la que el locus de resistencia a Pd es el fragmento de introgresión de Allium roylei en el genoma de una planta de la línea 3591-1, número de registro NCIMB 41249, y en la que, se lleva a cabo el siguiente procedimiento:

a) realizar la restricción del ADN genómico de dicha planta con las enzimas de restricción PstI y MseI; b) realizar un ligamiento con los siguientes adaptadores de oligonucleótido:

alfa 5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA CATCTGACGCATGT-5’, y beta 5’-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5’; c) amplificar selectivamente conjuntos de fragmentos de restricción, caracterizándose la presencia del locus de resistencia a Pd por

•: un producto de amplificación de 61 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(A) 5’-GACTGCGTACATGCAGAAC y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT,

•: un producto de amplificación de 151 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(B) 5’-GACTGCGTACATGCAGAAG y 5’-GATGAGTCCTGAGTAAAAC y

•: un producto de amplificación de 330 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(C) 5’-GACTGCGTACATGCAGACA y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACCA.

2.: Planta según la reivindicación 1, en la que no hay segmento de introgresión de Allium roylei excepto en el brazo largo de ambos homólogos del cromosoma 3.

3.: Planta según la reivindicación 1, en la que el fragmento de introgresión es inferior al 20% de la longitud del brazo largo del cromosoma 3.

4.: Planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que puede obtenerse a partir de un cruzamiento interespecífico entre Allium roylei resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) y Allium cepa tras varios retrocruzamientos con la planta de la especie Allium cepa y luego autopolinizaciones.

5.: Planta de la especie Allium cepa según la reivindicación 1 ó 4, que puede obtenerse mediante el siguiente procedimiento:

a) realizar un cruzamiento interespecífico entre Allium roylei y Allium cepa; b) seleccionar un híbrido interespecífico, resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd); c) realizar el retrocruzamiento de dicho híbrido con plantas de Allium cepa; d) seleccionar plantas resistentes a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd); e) autopolinizar las plantas así obtenidas; f) seleccionar plantas resistentes de manera homocigota a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd).

6.: Planta según la reivindicación 5, en la que las etapas c) y d) se repiten al menos una vez.

7.: Planta según la reivindicación 5 ó 6, en la que las etapas e) y f) se repiten al menos una vez.

8.: Planta según la reivindicación 5, en la que dicha selección en la etapa b), d) o f) se lleva a cabo usando la técnica de AFLP™ con el procedimiento y los cebadores dados a conocer en la reivindicación 1.

9.: Planta de Allium cepa híbrida que puede obtenerse cruzando una línea parental de Allium cepa, que es sensible a mildiú velloso provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd), con una planta según la reivindicación 1, en la que dicha planta híbrida es resistente a mildiú velloso de cebolla provocado por el hongo Peronospora destructor (Pd) debido a un locus de resistencia a Pd presente de manera heterocigota en el brazo largo del cromosoma 3 en el genoma de dicha planta, en la que el locus de resistencia a Pd es el fragmento de introgresión de Allium roylei en el genoma de una planta de la línea 3591-1 número de registro NCIMB 41249, y en la que, se lleva a cabo el siguiente procedimiento:

a) realizar la restricción del ADN genómico de dicha planta con enzimas de restricción PstI y MseI; b) realizar el ligamiento con los siguientes adaptadores de oligonucleótido:

c) amplificar selectivamente conjuntos de fragmentos de restricción, caracterizándose la presencia del locus de resistencia a Pd por

5 • un producto de amplificación de 61 nucleótidos cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(A) 5’-GACTGCGTACATGCAGAAC y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT,

• un producto de amplificación de 151 nucleótidos

10 cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(B) 5’-GACTGCGTACATGCAGAAG y 5’-GATGAGTCCTGAGTAAAAC y

• un producto de amplificación de 330 nucleótidos

15 cuando se usan los siguientes cebadores en la etapa c):

(C) 5’-GACTGCGTACATGCAGACA y 5’-GATGAGTCCTGAGTAACCA.

10. Planta de Allium cepa híbrida según la reivindicación 9,

20 en la que la línea parental es una línea endogámica de Allium cepa estéril macho citoplasmática.

11. Planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, siendo dicha planta una cebolla o chalote cultivado.