ES2351876T3

ES2351876T3 - Sitio de enlazamiento del ligando de rage y usos del mismo.

Info

Publication number: ES2351876T3
Application number: ES98952204T
Authority: ES
Inventors: Shi Du Yan; Ira Lamster; David Stern; Ann Marie Schmidt
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1997-10-09
Filing date: 1998-10-09
Publication date: 2011-02-11
Anticipated expiration: 2018-10-09
Also published as: JP2010143932A; AU9795898A; US6555651B2; ATE476192T1; EP1023080B1; HK1031100A1; EP1023080A1; PT1023080E; EP2343316A1; DE69841806D1; CY1110884T1; EP1023080A4; WO1999018987A1; US20010053357A1; JP2001519401A; DK1023080T3

Abstract

Un péptido enlazado a un anticuerpo o a una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que comprende los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab o un fragmento Fc.

Description

SITIO DE ENLAZAMIENTO DEL LIGANDO DE RAGE Y USOS DEL MISMO

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud estadounidense con serial No. 08/948.131.

La invención divulgada aquí contó con el apoyo del gobierno a través de las Subvenciones del USPHS No. AG00690, AG00603, HL56881 del Department of Health and Human Services. Por lo tanto, el Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención. Antecedentes de la Invención

A través de esta solicitud, se referencian diferentes publicaciones por medio del autor y la fecha. Las citaciones completas de estas publicaciones pueden encontrarse enlistadas alfabéticamente al final de las especificaciones inmediatamente después de la sección de Procedimientos Experimentales y antes de la sección de las reivindicaciones. La divulgación de estas publicaciones representa el estado del arte tal como lo conocen aquellas personas calificadas en ella a partir de la fecha de la invención descrita y reivindicada allí.

La cardiopatía isquémica es la principal causa de morbilidad y de mortalidad en la población en general, pero especialmente en pacientes con diabetes. La prevalencia de la enfermedad de las arterias coronarias es tan alta como del 55% en pacientes adultos con diabetes (Robertson y Strong, 1968). En realidad, los datos del Estudio Framingham del Corazón demuestran que la mortalidad de la enfermedad cardiovascular en diabetes no dependiente de insulina (NIDDM) es más del doble en hombres diabéticos y más el cuádruple en mujeres diabéticas cuando se compara con individuos de control no diabéticos (Kannel y McGee, 1979). Además de una mayor prevalencia, los estudios han mostrado que la aterosclerosis en pacientes diabéticos es claramente más acelerada y extendida. En una serie de autopsias, por ejemplo, se encontró que los pacientes con diabetes se enfermaron más severamente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (Waller y colaboradores, 1980), una incidencia mayor de enfermedad en dos y tres vasos (Crall y Roberts, 1978), y un mayor carácter difuso de la distribución de las lesiones ateroscleróticas (Hamby y colaboradores, 1976). Estos hallazgos fueron confirmados por angiografía coronaria en pacientes sintomáticos (Pyorala y colaboradores, 1978).

Las razones para la aterosclerosis acelerada en el ámbito de la diabetes son numerosas. Sin embargo, incluso después de la corrección por dislipidemia, hipertensión y obesidad, los estudios de análisis de múltiples variables han indicado que los pacientes diabéticos tienen un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular con relación a individuos no diabéticos (Kannel y McGee, 1979). Por ejemplo, en el Nurses’ Health Study de 1.500 individuos diabéticos entre un total de 115.000 mujeres, la incidencia de enfermedad cardiovascular fue 5 veces mayor en los individuos diabéticos independientemente de sus niveles de colesterol (Manson y colaboradores, 1991). Estos datos sugieren que los factores específicos para la población diabética juegan un papel importante.

Las características patológicas de la enfermedad de Alzheimer (AD) son acumulaciones intracelulares y extracelulares de proteínas, cuyo progreso está estrechamente relacionado con una eventual disfunción neuronal y demencia clínica (para comentarios ver Goedert, 1993; Haass y colaboradores, 1994; Kosik, 1994; Trojanowski y colaboradores, 1994; Wischik, 1989). El péptido β amiloide (Aβ), que es un componente principal de depósitos extracelulares en AD, tanto en placas seniles/difusas como en la vasculatura cerebral, influye activamente sobre las funciones cerebrales como lo indican varias líneas de evidencia: El Aβ ha demostrado que promueve el crecimiento de las neuritas, genera intermediaros reactivos de oxígeno (ROI), induce estrés oxidativo celular, conduce a citotoxicidad neuronal, y promueve activación microglial (Behl y colaboradores, 1994; Davis y colaboradores, 1992; Hensley, y colaboradores, 1994; Koh, y colaboradores, 1990; Koo y colaboradores, 1993; Loo y colaboradores, 1993; Meda y colaboradores, 1995; Pike y colaboradores, 1993; Yankner y colaboradores, 1990). Para que el Aβ induzca estos efectos celulares múltiples, las superficies de las células pueden contener una(s) proteína(s) de enlazamiento que acoplan al Aβ. En este contexto, diferentes proteínas asociadas a la célula, así como proteoglicanos sulfatados, pueden interactuar con Aβ. Estos incluyen: al receptor de la sustancia P, al receptor del complejo serpina enzima (SEC), apolipoproteína E, apolipoproteína J (clusterina), transtiretina, antiquimotripsina, proteína precursora β amiloide, y sulfonatos/sulfatos de heparina (Abraham y colaboradores. 1985; Fraser y colaboradores, 1992; Fraser y colaboradores, 1993; Ghisc y colaboradores, 1993; Joslin y colaboradores, 1991; Kimura y colaboradores, 1993; Kisilevsky y colaboradores, 1995; Strittmatter y colaboradores, 1993a; Strittmatter y colaboradores, 1993b; Schwarzman y colaboradores, 1994; Snow y colaboradores, 1994 ; Yankner y colaboradores, 1990). De estos, el receptor de la sustancia P y el receptor de SEC pueden actuar como receptores superficiales de células neuronales para el Aβ, aunque se carece de evidencia directa de esto (Fraser y colaboradores, 1993; Joslin y colaboradores, 1991; Kimura y colaboradores, 1993; Yankner y colaboradores, 1990). En realidad, el papel de los receptores de sustancia es controversial, y no se sabe si Aβ interactúa únicamente con el receptor, o si se requieren también coestimuladores (Calligaro y colaboradores, 1993; Kimura y colaboradores, 1993; Mitsuhashi y colaboradores, 1991) y el receptor de SEC no ha sido caracterizado completamente aún. El péptido β amiloide (Aβ) es central para la patología de la enfermedad de Alzheimer (AD), especialmente debido a sus efectos neurotóxicos que involucran la inducción de estrés oxidativo celular.

Resumen de la Invención

La presente invención proporciona un péptido enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que contiene 1 -30 aminoácidos del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en done la porción del anticuerpo es un fragmento Fab

o un fragmento Fc. La invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene dicho péptido. La invención también está dirigida a dicho péptido para inhibir una interacción entre péptido β amiloide y un receptor para los productos finales de glicación avanzada sobre la superficie de una célula en un individuo, y también para inhibir (a) la degeneración de una neuronal; (b) la formación de una fibrilla de péptido β amiloide sobre una célula; (c) la formación extracelular de un péptido amiloide en una fibrilla; (d) para inhibir la reunión de péptido β amiloide sobre la superficie de una célula; (e) la infiltración de una célula microglial en placas seniles; (f) la activación de una célula microglial por un péptido β amiloide; o (g) activación de un gen NF-κB en una célula, en un individuo. La invención también prevé dicho péptido para el tratamiento de un individuo con una condición enfermiza asociada con una interacción entre péptido β amiloide y un receptor para un producto final de glicación avanzada sobre la superficie de una célula en un individuo, en donde la condición enfermiza es diabetes, enfermedad de Alzheimer, senilidad, falla renal, aterosclerosis hiperlipidémica, citotoxicidad neuronal, síndrome de Down, demencia asociada con un traumatismo craneal, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, amiloidosis, una enfermedad autoinmune, inflamación, un tumor, cáncer, impotencia masculina, cicatrización de heridas, enfermedad periodontal, neuropatía, retinopatía, nefropatía o degeneración neuronal.

La presente descripción divulga un péptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de un dominio V de un receptor para un producto final de glicación avanzada (RAGE). La presente descripción también divulga un péptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos A-Q-N-I-TA-R-I-G-E-P-L-V-L-K-C-K-G-A-P-K-K-P-P-Q-R-L-E-WK (Seq. I.D. No. 1). La presente descripción divulga una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de un dominio V del RAGE y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente descripción también divulga un método para inhibir la interacción de un péptido β amiloide con un receptor para un producto final de glicación avanzada que está sobre la superficie de una célula, que comprende poner en contacto la célula con el péptido o un agente funcionalmente equivalente, en donde el péptido o agente es capaz de inhibir la interacción del péptido β amiloide con el receptor para el producto final de glicación avanzada, y el péptido o agente está presente en una cantidad efectiva para inhibir la interacción del péptido β amiloide con el receptor para el producto final de glicación avanzada.

La presente invención también provee un péptido enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab

o un fragmento Fc para tratamiento de un individuo con una condición asociada con la interacción del péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre una célula, por medio de la administración al individuo del péptido o un agente funcionalmente equivalente capaz de inhibir la interacción del péptido β amiloide con el receptor para el producto final de glicación avanzada, estando el péptido o el agente presente en una cantidad efectiva para inhibir la interacción del péptido β amiloide con el receptor, para tratar así el individuo.

Breve Descripción de las Figuras

Figura 1. Mediciones de pérdida ósea alveolar en ratones tratados con sRAGE. Ver el

Ejemplo 2 en los Procedimientos Experimentales. Análisis estadístico = Grupo I vs. Grupo II -p =

0.002; Grupo I vs. Grupo III -p = 0.005; Grupo III vs. Grupo IV: p = 0.009. Descripción Detallada de la Invención

La presente invención proporciona un péptido aislado enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab o un fragmento Fc.

La presente invención también proporciona dicho péptido para el tratamiento o el mejoramiento de los síntomas en un individuo que están asociados con una enfermedad, en donde la enfermedad es aterosclerosis, hipertensión, incapacidad para cicatrización de heridas, enfermedad periodontal, impotencia masculina, retinopatía y diabetes y complicaciones de la diabetes, por medio de la administración al individuo de una cantidad del péptido aislado de la presente invención o un agente capaz de inhibir la interacción entre péptido β amiloide y RAGE, efectiva para inhibir la interacción con el fin de tratar o mejorar la enfermedad o condición en el individuo. El péptido puede también evitar que se presenten tales condiciones en el individuo.

En diferentes modalidades de la presente descripción, se presentan ejemplos de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de un dominio V de un RAGE o RAGE soluble por medio de las siguientes secuencias de aminoácidos:

A-Q-N-I-T-A-R-I-G-E-P-L-V-L-K-C-K-G-A-P-K-K-P-P-Q-R-L-E-W-K (Seq. I.D. No. 1);

G-Q-N-I-T-A-R-I-G-E-P-L-V-L-S-C-K-G-A-P-K-K-P-P-Q-Q-L-E-W-K (Seq. I.D. No. 2);

G-Q-N-I-T-A-R-I-G-E-P-L-M-L-S-C-K-A-A-P-K-K-P-T-Q-K-L-E-W-K (Seq. I.D. No. 3);

D-Q-N-I-T-A-R-I-G-K-P-L-V-L-N-C-K-G-A-P-K-K-P-P-Q-Q-L-E-W-K (Seq. I.D. No. 4).

4 La presente descripción divulga un péptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de los primeros 1 -112 aminoácidos de RAGE humana (que es el dominio V de RAGE humana), o que corresponde a los aminoácidos 5 -35 del dominio V de RAGE humana, o cualquier otra porción más pequeña del dominio V de RAGE humana. Los péptidos representativos de la presente descripción incluyen pero no se limitan a péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que corresponde a los aminoácidos números (2 30), (5 -35), (10 -40), (15 -45), (20 -50), (25 -55), (30 -60), (30 -65), (10 -60), (8 -100), 14 -75), (24 -80), (33 -75), (45 -110) de proteína sRAGE humana. Las abreviaturas utilizadas aquí para los aminoácidos son aquellas abreviaturas convencionalmente utilizadas: A = Ala = Alanina; R = Arg = Arginina; N = Asn = Asparagina; D = Asp = Ácido Aspártico; C = Cys = Cisteína; Q = Gln = Glutamina; E = Glu = Ácido glutámico; G = Gly = Glicina; H = His = Histidina; I = Ile = Isoleucina; L = Leu = Leucina; K = Lys = Lisina; M = Met = Metionina; F = Phe = Fenilalanina; = Pro = Prolina; S = Ser = Serina; T = Thr = Treonina; W = Trp = Triptófano; Y = Tyr = Tirosina; V = Val = Valina. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos L

o D. Se puede reemplazar un aminoácido por un aminoácido sintético que sea alterado con el fin de incrementar la vida media del péptido o para incrementar la potencia del péptido, o para incrementar la biodisponibilidad del péptido.

La presente descripción también divulga una composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva del péptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de un dominio V de un receptor para el producto final de glicación avanzada (RAGE) y un portador farmacéuticamente aceptable. El portador puede ser un diluyente, un aerosol, un portador tópico, una solución acuosa, una solución no acuosa o un portador sólido. El portador puede ser un polímero o una pasta dentífrica. La composición farmacéutica puede incluir al péptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de un dominio V de un RAGE enlazado a un segundo péptido, en donde el segundo péptido puede ser albúmina, una globulina o un péptido escogido de un grupo de péptidos, en donde cada péptido del grupo incluye un péptido de diferente longitud, y en donde la secuencia de cada péptido corresponde a cualquier secuencia de aminoácidos tomada dentro del aminoácido número 31 hasta el aminoácido número 281 de la proteína sRAGE humana.

La presente invención también abarca una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva del péptido que es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural enlazado a un anticuerpo o una porción del mismo. En una modalidad, el anticuerpo puede ser capaz de enlazarse específicamente con el receptor para el producto final de glicación avanzada. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal. La porción o fragmento del anticuerpo es un fragmento Fah o un fragmento Fc. La porción o fragmento del anticuerpo puede incluir una región determinante de complementariedad o una región variable.

La presente invención también prevé la inhibición de una interacción de péptidos β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada cuando el receptor está sobre la superficie de una célula, por medio de una cantidad de un inhibidor de dicha interacción efectiva para inhibir la interacción del péptido β amiloide con el receptor para el producto final de glicación avanzada, en donde dicho inhibidor es un péptido enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab

o un fragmento Fc.

5 La célula puede ser una célula eucariota. La célula puede ser una célula de un individuo. El individuo puede ser un humano. La célula puede ser una célula neuronal, una célula endotelial, una célula glial, una célula microglial, una célula de músculo liso, una célula somática, una célula de médula ósea, una célula de hígado, una célula intestinal, una célula germinal, un miocito, un fagocito mononuclear, una célula endotelial, una célula tumoral, un linfocito, una célula mesangial, una célula epitelial de la retina, una célula vascular de la retina, una célula ganglionar o una célula madre. La célula puede ser también de otros tipos de células no enlistadas explícitamente aquí. La célula puede ser cualquier célula humana. La célula puede ser una célula normal, una célula activada, una célula neoplásica, una célula enferma o una célula infectada. En una divulgación adicional, el inhibidor incluye un péptido, un compuesto peptidomimético, una molécula de ácido nucleico, una molécula pequeña, un compuesto orgánico, un compuesto inorgánico, o un anticuerpo o un fragmento del mismo. El inhibidor puede ser el péptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de un dominio V de un receptor para el producto final de glicación avanzada. El inhibidor puede ser cualquiera de los compuestos o composiciones descritas aquí. El inhibidor puede ser un dominio V soluble de un receptor para el producto final de glicación avanzada. El inhibidor puede incluir un anticuerpo o un fragmento del mismo. El anticuerpo puede ser capaz de enlazarse específicamente con el receptor para el producto final de glicación avanzada. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal o un fragmento de un anticuerpo. El fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento Fab o Fc. El fragmento del anticuerpo puede incluir una región determinante de la complementariedad. En una modalidad, el inhibidor es capaz de enlazarse específicamente con el péptido β amiloide. La presente invención también prevé un inhibidor de la interacción de un péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada, en donde dicho inhibidor es a péptido enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab o un Fc fragmento, para inhibir la degeneración de una célula neuronal. En otra modalidad, la presente invención prevé un inhibidor de la interacción de un péptido β amiloide con a receptor para el producto final de glicación avanzada, en donde dicho inhibidor es a péptido enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es a fragmento Fab o a fragmento Fc, para inhibir la formación de una fibrilla de péptido β amiloide sobre una célula. En otra modalidad, la presente invención prevé un inhibidor de la interacción de un péptido β amiloide con otro péptido β amiloide, en donde dicho inhibidor es un péptido enlazado a un anticuerpo o a una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab o un fragmento Fc, para inhibir la formación extracelular de un péptido β amiloide en una fibrilla. En otra modalidad, la presente invención prevé un inhibidor de la interacción del péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada, en donde dicho inhibidor es un péptido enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en

donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab o a fragmento Fc, para inhibir la agregación de péptido β amiloide sobre la superficie de una célula.

En otra modalidad, la presente invención prevé un inhibidor de la interacción de un péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de la célula microglial, en donde dicho inhibidor es un péptido enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab

: o un fragmento Fc, para inhibir la infiltración de una célula microglial en placas seniles.

En otra modalidad, la presente invención prevé un inhibidor de la interacción del péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de la célula microglial, en donde dicho inhibidor es un péptido enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab

: o un fragmento Fc, para inhibir la activación de una célula microglial por un péptido β amiloide.

En otra modalidad, la presente invención prevé un inhibidor capaz de inhibir la interacción del péptido β amiloide con el receptor para el producto final de glicación avanzada, estando el inhibidor presente en una cantidad efectiva para inhibir la interacción del péptido β amiloide con el receptor, en donde dicho inhibidor es un péptido enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab

: o un fragmento Fc, para ser administrado para tratamiento de un individuo con una condición asociada con una interacción de un péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre una célula.

En otra modalidad, la condición es diabetes, Enfermedad de Alzheimer, senilidad, falla renal, aterosclerosis hiperlipidémica, citotoxicidad neuronal, síndrome de Down, demencia asociada con trauma craneano, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, amiloidosis, una inflamación por enfermedad autoinmune, un tumor, cáncer, impotencia masculina, cicatrización de heridas, enfermedad periodontal, neuropatía, retinopatía, nefropatía o degeneración neuronal. El individuo puede ser un mamífero. El mamífero puede ser un humano.

La administración puede incluir una inyección dentro de la lesión, intraperitoneal, intramuscular o intravenosa; infusión: suministro mediado por un liposoma; suministro tópico, nasal, oral, anal, subcutáneo, vaginal, sublingual, uretral, transdérmico, intratecal, ocular u ótico. La condición puede estar asociada con degeneración de una célula neuronal en el individuo. La condición puede estar asociada con la formación de una fibrilla de péptido β amiloide. La condición puede estar asociada con agregación de péptido β amiloide, con infiltración de una célula microglial en una placa senil, o con la activación de una célula microglial por medio de un péptido β amiloide.

El inhibidor puede consistir esencialmente de una porción del péptido que tiene una secuencia de aminoácido correspondiente a la secuencia de aminoácidos de un dominio V de un receptor para el producto final de glicación avanzada.

El inhibidor puede incluir la composición farmacéutica que incluye un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de un dominio V de un receptor para el producto final de glicación avanzada y un portador.

La presente descripción divulga un método para evaluar la habilidad de un agente para inhibir el enlazamiento de un péptido β amiloide con un dominio V de un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de una célula que comprende: (a) poner en contacto la célula con el agente y el péptido β amiloide; (b) determinar la cantidad de péptido β amiloide enlazado a la célula, y (c) comparar la cantidad de péptido β amiloide enlazado determinada en la etapa (b) con la cantidad determinada en ausencia del agente, evaluando así la habilidad del agente para inhibir el enlazamiento de péptido β amiloide con el dominio V del receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de la célula.

En una modalidad, se pone en contacto la célula con el agente y el péptido β amiloide simultáneamente. En otra modalidad, se pone en contacto la célula con el péptido β amiloide y el agente. La célula puede ser una célula neuronal, una célula endotelial, una célula glial, una célula microglial, una célula de músculo liso, una célula somática, una célula de médula ósea, una célula de hígado, una célula intestinal, una célula germinal, un miocito, un fagocito mononuclear, una célula endotelial, una célula tumoral, un linfocito, una célula mesangial, una célula epitelial de la retina, una célula vascular de la retina, una célula ganglionar o una célula madre.

El agente puede incluir un péptido, un compuesto peptidomimético, una molécula de ácido nucleico, una molécula pequeña, un compuesto orgánico, un compuesto inorgánico, o un anticuerpo o un fragmento del mismo. El agente puede ser un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de un dominio V de un receptor para el producto final de glicación avanzada.

En una modalidad, el agente es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos A-Q-N-I-TA-R-I-G-E-P-L-V-L-K-C-K-G-A-P-K-K-P-P-Q-R-L-E-W-K (Seq. I.D. No. 1).

En otra modalidad, el agente es a péptido que tiene la secuencia de aminoácidos A-Q-N-I-TA-R-I-G-E (Seq. I.D. No. 5). En otra modalidad, el agente es un dominio V soluble de un receptor para el producto final de glicación avanzada. El agente puede ser también una porción extracelular soluble de un receptor para el producto final de glicación avanzada. El agente puede ser un anticuerpo

o un fragmento del mismo o está enlazado a un anticuerpo o a un fragmento del mismo. El anticuerpo puede ser capaz de enlazarse específicamente con un receptor para el producto final de glicación avanzada. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal. El fragmento del anticuerpo puede incluir un fragmento Fab o un fragmento Fc. El fragmento del anticuerpo puede incluir una región determinante de complementariedad.

En una modalidad, el agente es capaz de enlazarse específicamente con el péptido β amiloide. En otra modalidad, el agente está enlazado a un soporte sólido. En otra modalidad, el agente se expresa sobre la superficie de una célula.

La presente invención prevé un inhibidor de la interacción del péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la célula, en donde dicho inhibidor es un péptido enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab o un fragmento Fc, para inhibir la activación de un gen NF-κB en una célula.

La presente descripción también prové un método para inhibir una enfermedad periodontal en un individuo que incluye la administración en forma tópica al individuo de una composición farmacéutica que incluye sRAGE en una cantidad efectiva para acelerar la cicatrización de heridas y por lo tanto inhibir una enfermedad periodontal. La composición farmacéutica puede incluir sRAGE en una pasta dentífrica.

La presente descripción también divulga un método para inhibir una interacción de un producto final de glicación avanzada con un receptor para el producto final de glicación avanzada cuando el receptor está sobre la superficie de una célula, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad de un inhibidor de dicha interacción efectiva para inhibir la interacción del producto final de glicación avanzada con el receptor para el producto final de glicación avanzada. La célula puede ser una célula endotelial, una célula de músculo vascular liso, una célula neuronal, un macrófago, un linfocito, una célula vascular de la retina, una célula neuronal de la retina, una célula asociada con una célula gingival asociada con la piel, una célula mesangial o una célula de tejido conectivo. El producto final de glicación avanzada (AGE) puede ser una pentosidina, una carboximetillisina, una carboxietillisina, una piralina, una imidizalona, un metilglioxal, un etilglioxal.

La presente descripción también describe un método para tratar un individuo con una condición asociada con una interacción de un producto final de glicación avanzada con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre una célula, que comprende la administración al individuo de un inhibidor capaz de inhibir la interacción del producto final de glicación avanzada con el receptor para el producto final de glicación avanzada, estando el inhibidor presente en una cantidad efectiva para inhibir la interacción del producto final de glicación avanzada con el receptor, tratando así al individuo.

La condición puede estar asociada con diabetes. La condición puede ser diabetes, falla renal, aterosclerosis hiperlipidémica, asociada con diabetes, citotoxicidad neuronal, síndrome de Down, demencia asociada con un trauma craneal, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, amiloidosis, una enfermedad autoinmune, inflamación, un tumor, cáncer, impotencia masculina, cicatrización de heridas, enfermedad periodontal, neuropatía, retinopatía, nefropatía o degeneración neuronal. El producto final de glicación avanzada (AGE) puede ser una pentosidina, una carboximetillisina, una carboxietillisina, una piralina, una imidizalona, un metilglioxal, un etilglioxal.

El agente o inhibidor de la presente invención incluye un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos números 1 -30 del dominio V de sRAGE (receptor soluble para el producto final de glicación avanzadas). El sRAGE puede ser humano, de ratón, de rata

o sRAGE de bovino. El agente de la presente invención puede ser un inhibidor. El agente puede consistir de los aminoácidos números 1 -30 del dominio V de sRAGE. El agente puede consistir de los aminoácidos números 1 -112, que incluyen al dominio V de una proteína RAGE. El agente puede incluir un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de un dominio V de un sRAGE enlazado a un segundo péptido, en donde el segundo péptido puede ser una albúmina, una globulina o un péptido escogido de un grupo de péptidos, en donde cada péptido del grupo incluye un péptido de diferente longitud, y en donde la secuencia de cada péptido corresponda a cualquier secuencia de aminoácidos tomada entre el aminoácido número 31 hasta el aminoácido número 281 de la proteína sRAGE humana, de bovino, ratón o rata.

En la presente invención la célula puede ser una célula neuronal, una célula endotelial, una célula glial, una célula microglial, una célula de músculo liso, una célula somática, una célula de médula ósea, una célula de hígado, una célula intestinal, una célula germinal, un miocito, un fagocito mononuclear, una célula endotelial, una célula tumor, o una célula madre. La presente invención puede incluir también células de otros tipos no enlistadas explícitamente aquí. La célula puede ser cualquier célula en un individuo. La célula puede estar bajo estrés oxidante.

El agente puede ser un péptido, un peptidomimético, un ácido nucleico o una molécula pequeña. Los términos "péptido" y "polipéptido" se utilizan en forma intercambiable en toda la memoria. El péptido incluye al menos la secuencia del aminoácido 1 hasta el aminoácido 30 de sRAGE. El péptido puede ser un péptido que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de la Secuencia I.D. No. 1, 2, 3, 4 ó 5. El péptido puede incluir los aminoácidos 1 -112 de una proteína RAGE. El péptido puede consistir esencialmente del dominio V de una proteína RAGE.

9 El agente puede estar conjugado con un portador. El péptido o agente está enlazado a un anticuerpo, tal como un fragmento Fab o un fragmento Fc para un suministro específicamente dirigido. El agente puede ser un dominio V soluble del receptor para el producto final de glicación avanzada. El agente puede ser capaz de enlazarse específicamente con el péptido β amiloide. El agente puede enlazarse con el péptido β amiloide en el sitio donde interactúa el receptor para el producto final de glicación avanzada. El agente puede ser una porción extracelular soluble de un receptor para el producto final de glicación avanzada. En una modalidad de la invención, el péptido puede incluir al menos una porción de receptor soluble de ocurrencia natural para el producto final de glicación avanzada. El péptido puede incluir un dominio "V" del receptor soluble de ocurrencia natural para el producto final de glicación avanzada. El péptido incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V. El péptido puede ser el dominio V soluble de sRAGE. El péptido puede ser un dominio V soluble de RAGE. El polipéptido puede ser un peptidomimético, un polipéptido sintético o un análogo de polipéptido. El polipéptido puede ser un polipéptido no natural que tenga quiralidad no encontrada en la naturaleza, es decir D-aminoácidos o L-aminoácidos. El polipéptido puede ser un derivado de un polipéptido natural, un polipéptido modificado, un polipéptido marcado, o un polipéptido que incluya péptidos no naturales. El peptidomimético puede ser identificado a partir de la búsqueda en bibliotecas grandes de diferentes compuestos que sean peptidomiméticos para determinar un compuesto que sea capaz de inhibir la interacción de un péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada. El péptido o polipéptido de la presente descripción puede incluir alteraciones a las secuencias suministradas en la Secuencias I.D. Nos 1 -5. El péptido de la presente invención puede incluir alteraciones en la secuencia que no afectan la funcionalidad del péptido en una forma negativa, sino que pueden incrementar la funcionalidad del péptido de tal forma, por ejemplo que se incremente la potencia del péptido. Algunos ejemplos de tales alteraciones a la secuencia humana de los primeros 30 aminoácidos (1 -30) del dominio V de sRAGE (Secuencia I.D. No 1) están enlistados aquí a continuación como ejemplos:

(a): Sustitución de D-alanina por L-alanina en la posición 6;

(b): Sustitución de D-lisina por L-lisina en la posición 15;

(c): Sustitución de D-alanina por L-alanina en la posición 6 y D-lisina por L-lisina en la posición 15;

(d): Omisión de los aminoácidos 1 -5 del dominio V, dejando como grupo terminal N-amino a la L-alanina;

(e): Omisión de los aminoácidos 1 -5 del dominio V dejando a la D-alanina como el Naminoácido;

(f): Sustitución de D-lisina por la L-lisina en la posición del aminoácido número "30" del dominio V de la Secuencia I.D. No. 1;

(g): Sustitución de L-arginina por L-lisina en la posición 30 del dominio V;

(h): Sustitución de L-arginina por L-lisina en la posición 30 del dominio V y añadir glicina como el grupo terminal carboxilo para producir un péptido de 31 aminoácidos;

(i): Sustitución de L-arginina por L-lisina en la posición 30 de los aminoácidos del péptido que contiene la secuencia de aminoácidos de 6 -30 descrita para el dominio V de sRAGE;

(j): Sustitución de L-arginina por L-lisina en la en la posición 30 de los aminoácidos del péptido que contiene la secuencia de aminoácidos de 6 -30 descrita para el dominio V de sRAGE y añadir

10 glicina como el grupo terminal carboxilo para producir un péptido con una secuencia de 25 aminoácidos;

(k): Sustitución de D-lisina por L-lisina en la posición 30 de la secuencia de aminoácidos 6 -30 designada para el dominio V;

(l): Sustitución de D-lisina por L-lisina en la posición 30 de la secuencia de aminoácidos 6 -30 designada para el dominio V y añadir L-alanina en la posición C-terminal del nuevo péptido de 26 aminoácidos;

(m): Sustitución de D-valina por L-valina en la posición 13 del dominio V del péptido de 30 aminoácidos designado 6 -30 del dominio V de sRAGE;

(n): Sustitución de D-valina por L-valina en la posición 13 del péptido de 25 aminoácidos designado 6 -30 del dominio V de sRAGE;

(o): Sustitución de D-alanina por L-alanina en la posición 6 del péptido de 30 aminoácidos y Dvalina por L-valina en la posición 13 del péptido de 30 aminoácidos del dominio V;

(p): Sustitución de D-alanina por L-alanina en la posición 6 y D-valina por L-valina en la posición 13 dl péptido de 25 aminoácidos designado 6 -30 del dominio V de sRAGE;

(q): los péptidos enlistados anteriormente (a) -(p) se convierten en derivados a través del ácido carboxílico de la posición 30 con albúmina, globulinas o péptidos de diferentes longitudes compuestos de los aminoácidos contenidos en las posiciones 31 a 281 de la proteína sRAGE humana, de ratón, rata o bovino.

Además de las formas de ocurrencia natural de los polipéptidos derivados de sRAGE, la presente invención también abarca otros polipéptidos tales como los análogos del polipéptido de sRAGE que tiene la funcionalidad equivalente del péptido de la Secuencia I.D. No. 1 o una funcionalidad más positiva o más potente. Tales análogos incluyen fragmentos de sRAGE. Siguiendo los procedimientos de la solicitud publicada por Alton et aloe (WO 83/04053; se puede diseñar y fabricar fácilmente genes que codifiquen la expresión microbiana de polipéptidos que tengan conformaciones primarias que difieran de aquellas especificadas aquí en términos de la identidad o ubicación de uno o más residuos (por ejemplo, sustituciones, adiciones y supresiones terminales e intermedias). Alternativamente, se pueden lograr fácilmente modificaciones de ADNc y de genes genómicos por medio de técnicas conocidas de mutagénesis dirigida al sitio y empleadas para generar análogos y derivados del polipéptido sRAGE. Tales productos comparten al menos una de las propiedades biológicas de sRAGE pero pueden diferir en otras. Como ejemplos, productos de la invención incluyen aquellos que son escorzados por ejemplo por medio de supresiones; o aquellos que son más estables a la hidrólisis (y, por lo tanto, pueden tener efectos más pronunciados o efectos más duraderos que los de ocurrencia natural); o que han sido alterados para suprimir o para añadir uno o más sitios potenciales para O-glicosilación y/o N-glicosilación o que tienen uno o más residuos de cisteína suprimidos o reemplazados por ejemplo por residuos de alanina o serina y son potencialmente más fácilmente aislados en forma activa a partir de sistemas microbianos; o que tienen uno o más residuos de tirosina reemplazados por fenilalanina y enlazados más o menos fácilmente a proteínas objetivo o a receptores sobre células objetivo. También están comprendidos fragmentos de polipéptido que duplican únicamente una parte de la secuencia continua de aminoácidos o conformaciones secundarias dentro de sRAGE, cuyos fragmentos pueden poseer una propiedad de sRAGE y no otras. Es notable que no sea necesaria actividad para uno cualquiera o más de los polipéptidos de la invención para que tengan utilidad terapéutica en otros contextos, tal como en ensayos de antagonismo de sRAGE. Los antagonistas competitivos pueden ser bastante útiles por ejemplo en los casos de sobreproducción de sRAGE.

11 De aplicabilidad para los análogos de polipéptido de la invención son los reportes de la propiedad inmunológica de los péptidos sintéticos que sustancialmente duplican la secuencia de aminoácidos en proteínas, glicoproteínas y nucleoproteínas de ocurrencia natural. Más específicamente, se ha demostrado que polipéptidos de peso molecular relativamente bajo participan en reacciones inmunológicas que son similares en duración y extensión a las reacciones inmunológicas de proteínas fisiológicamente significativas tal como antígenos virales, hormonas polipeptídicas, y similares. Incluidas entre las reacciones inmunes de tales polipéptidos están la provocación de la formación de anticuerpos específicos en animales inmunológicamente activos [Lerner y colaboradores, 1981; Ross y colaboradores, 1981; Walter y colaboradores, 1981; Wong y colaboradores, 1982; Baron y colaboradores, 1982; Dressman y colaboradores, 1982; y Lerner, Scientific American, 1983. Ver también, Kaiser y colaboradores, 1984] relacionados con propiedades biológicas e inmunológicas de péptidos sintéticos que comparten aproximadamente estructuras secundarias de hormonas peptídicas pero no pueden compartir su conformación estructural primaria. El polipéptido de la presente invención puede ser un compuesto peptidomimético que puede ser al menos parcialmente no natural. El compuesto peptidomimético puede ser una imitación de una molécula pequeña de una porción de la secuencia de aminoácidos de sRAGE. El compuesto puede tener mayor estabilidad, eficacia, potencia y biodisponibilidad en virtud de la imitación. Además, el compuesto puede tener menor toxicidad. El compuesto peptidomimético puede tener mejor permeabilidad de la mucosa intestinal. El compuesto puede ser preparado en forma sintética. El compuesto de la presente invención puede incluir aminoácidos L, D, DL o no naturales, aminoácidos alfa o alfa disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico (un análogo isoelectrónico de alanina). La columna vertebral del péptido del compuesto puede tener al menos un enlace reemplazado con PSI-[CH=CH] (Kempf y colaboradores. 1991). El compuesto pude incluir además trifluorotirosina, pCl-fenilalanina, p-Br-fenilalanina, poli-L-propargilglicina, poli-D,L-alil glicina, o poli-L-alil glicina. Una modalidad de la presente invención es un compuesto peptidomimético que tiene la actividad biológica de prevenir una aterosclerosis acelerada en un individuo en donde el compuesto tiene un enlace, una columna vertebral de péptido o un componente aminoácido reemplazado con una imitación adecuada. Los ejemplos de aminoácidos no naturales que pueden ser imitaciones adecuadas de aminoácidos incluyen β-alanina, ácido L-α-amino butírico, ácido L-γ-amino butírico, ácido L-αamino isobutírico, ácido L-ε-amino capróico, ácido 7-amino heptanóico, ácido L-aspártico, ácido Lglutámico, cisteína (acetamindimetilo), N-ε-Boc-N-α-CBZ-L-lisina, N-ε-Boc-N-α-Fmoc-L-lisina, Lmetionina sulfona, L-norleucina, L-norvalina, N-α-Boc-N-SCBZ-L-ornitina, N-δ-Boc-N-α-CBZ-Lornitina, Boc-p-nitro-L-fenilalanina, Boc-hidroxiprolina, Boc-L-tioprolina. (Blondelle, y colaboradores. 1994; Pinilla, y colaboradores. 1995). De acuerdo con el método de esta especificación, el agente puede incluir un péptido, un peptidomimético, una molécula orgánica, un carbohidrato, un lípido, un anticuerpo o un ácido nucleico. El péptido de esta invención puede incluir un péptido producto final de glicación avanzada o una porción del mismo, un receptor para el péptido producto final de glicación avanzada o una porción del mismo, un receptor soluble para el péptido producto final de glicación avanzada o una porción del mismo. El péptido de la presente invención puede incluir cualquier parte de los primeros 112 aminoácidos de la proteína sRAGE. El péptido de la presente invención puede incluir al dominio V de una proteína RAGE. El péptido de la presente invención puede ser una porción más pequeña del dominio V de una proteína RAGE soluble. El péptido de la presente invención puede ser un péptido que corresponda con el dominio V de RAGE humano, RAGE de ratón, RAGE de rata, RAGE de bovino o RAGE de pez.

12 De acuerdo con el método de esta invención, el agente puede ser un péptido (polipéptido), un peptidomimético, una molécula orgánica, un carbohidrato, un lípido, un anticuerpo o un ácido nucleico. En el caso de polipéptidos, el polipéptido puede ser un polipéptido producto final de glicación avanzada (AGE) o una porción del mismo, un receptor para el polipéptido producto final de glicación avanzada o una porción del mismo, un receptor soluble para el polipéptido producto final de glicación avanzada o una porción del mismo, por ejemplo, RAGE soluble, o un polipéptido recombinante. El polipéptido puede ser el dominio V de sRAGE, o los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE. El polipéptido de esta invención puede incluir un polipéptido producto final de glicación avanzada o una porción del mismo, un receptor para el polipéptido producto final de glicación avanzada o una porción del mismo, un receptor soluble para el polipéptido producto final de glicación avanzada o una porción del mismo. El polipéptido de la presente invención puede incluir cualquier parte de los primeros 112 aminoácidos de la proteína sRAGE. El polipéptido de la presente invención puede incluir al dominio V de una proteína RAGE soluble. El polipéptido de la presente invención puede ser una porción más pequeña del dominio V de una proteína RAGE soluble. El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido que corresponda al dominio V de RAGE humano, RAGE de ratón, RAGE de rata, RAGE de bovino o RAGE de pez. El polipéptido puede ser sintetizado químicamente o producido por medio de métodos estándar de ADN recombinante. En el caso de anticuerpos, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-RAGE o un fragmento F(ab’)2 anti-RAGE. Una modalidad de esta invención es un agente que es capaz de inhibir la interacción de un péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de una célula neuronal, en donde dicho agente es un péptido enlazado a un anticuerpo o a una porción de un anticuerpo, siendo el péptido un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab

o un fragmento Fc para inhibir la degeneración de la célula neuronal.

Otra modalidad de esta invención es un agente capaz de inhibir la interacción de un péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de la célula, en donde el agente incluye los aminoácidos números 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural y está enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, siendo la porción del anticuerpo un fragmento Fab o un fragmento Fc, para inhibir la formación de una fibrilla de péptido β amiloide sobre una célula.

Otra divulgación de esta descripción es un método para inhibir la formación extracelular de un péptido β amiloide en una fibrilla que incluye poner en contacto al péptido β amiloide con un agente capaz de inhibir la interacción de un péptido β amiloide con otros péptidos β amiloide.

Otra divulgación de esta descripción es a método para inhibir la agregación del péptido β amiloide sobre la superficie de una célula que incluye poner en contacto al péptido β amiloide con un agente capaz de inhibir la interacción del péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada.

Otra divulgación de esta descripción es un método para inhibir la agregación del péptido β amiloide sobre la superficie de una célula que incluye poner en contacto al receptor para el producto final de glicación avanzada con un agente capaz de inhibir la interacción del péptido β amiloide con el receptor para el producto final de glicación avanzada.

Otra divulgación de esta descripción es un método para inhibir la infiltración de una célula microglial en placas seniles que incluye poner en contacto la célula microglial con un agente capaz de inhibir la interacción de un péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de la célula microglial.

Otra divulgación de esta descripción es un método para inhibir la activación de una célula microglial por medio de un péptido β amiloide que incluye poner en contacto la célula microglial con un agente capaz de inhibir la interacción del péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de la célula microglial. La inhibición de la activación puede incluir una menor producción de citoquinas por parte de la célula microglial. La interacción puede ser por medio del enlazamiento del péptido β amiloide con el receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de la célula.

Una divulgación de esta descripción es un método para crear un individuo con una condición asociada con la interacción de un péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre una célula, que incluye la administración al individuo de un agente capaz de inhibir la interacción del péptido β amiloide con el receptor para el producto final de glicación avanzada, estando el agente presente en una cantidad efectiva para inhibir la interacción del péptido β amiloide con el receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la célula para tratar de este modo al individuo. La condición puede ser diabetes, Enfermedad de Alzheimer, senilidad, falla renal, aterosclerosis hiperlipidémica, citotoxicidad neuronal, síndrome de Down, demencia asociada con trauma craneal, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, amiloidosis, enfermedad autoinmune, inflamación, cáncer o degeneración neuronal.

El individuo puede ser un mamífero o no. El individuo puede ser un mamífero o un humano. El individuo puede ser un ratón, una vaca, un mono, un caballo, un cerdo, o un perro. El individuo puede ser un individuo diabético. El individuo puede sufrir de una deficiencia de apolipoproteína, o de hiperlipidemia. La hiperlipidemia puede ser hipercolesterolemia o hipertrigliceridemia. El individuo puede tener un trastorno en el metabolismo de la glucosa. El individuo puede ser un individuo obeso.

El individuo puede tener hiperlipidemia inducida por dieta o mediada genéticamente. Los AGE se forman en ambientes enriquecidos en lípidos incluso en euglicemia. El individuo puede estar sufriendo de estrés oxidante. El individuo puede estar sufriendo d degeneración neuronal o neurotoxicidad.

En otra divulgación de la presente descripción, el método puede incluir además la administración al individuo de un portador farmacéuticamente aceptable durante la administración del agente. La administración puede incluir una inyección al interior de la lesión, intraperitoneal, intramuscular o intravenosa; infusión; suministro mediado por liposoma; o suministro tópico, nasal, oral, ocular u ótico. El agente puede estar enlazado a un portador farmacéuticamente aceptable.

El agente puede ser suministrado a cada hora, en forma diaria, semanal, mensual, anual (por ejemplo en una forma de liberación prolongada) o como un suministro una sola vez. El suministro puede ser continuo durante un período de tiempo, por ejemplo un suministro intravenoso. El agente o una composición farmacéutica de la presente invención pueden ser suministrados en el interior del cráneo o en el fluido espinal.

La cantidad efectiva del agente puede incluir aproximadamente desde 0.000001 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En una modalidad, la cantidad efectiva puede incluir aproximadamente desde 0.001 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. En otra modalidad, la cantidad efectiva puede estar en el rango aproximadamente desde 0.01 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. La cantidad real efectiva se basará en el tamaño del agente, la biodegradabilidad del agente, la bioactividad del agente y la biodisponibilidad del agente. El agente puede ser suministrado en forma tópica en un portador tipo crema o ungüento. Puede ser aplicado repetidamente según se requiera con base en la absorción del portador a través de la piel o mucosa o lesión. Si el agente no se degrada rápidamente, está biodisponible y es altamente activo, se requerirá una cantidad menor para ser efectivo. La cantidad efectiva será conocida por la persona capacitada en el arte; también dependerá de la forma del agente, del tamaño del agente y de la bioactividad del agente. Alguien capacitado en el arte podría llevar a cabo rutinariamente ensayos empíricos de actividad para un agente para determinar la bioactividad en bioensayos y determinar así la cantidad efectiva.

En esta modalidad, la condición puede estar asociada con degeneración de una célula neuronal en el individuo, con formación de una fibrilla de péptido β amiloide, con agregación de péptido β amiloide, con infiltración de una célula microglial en una placa senil, o con activación de una célula microglial por un péptido β amiloide, en donde la activación incluye la producción de citoquinas por parte de la célula microglial.

Otra modalidad de esta descripción es un método para evaluar la habilidad de un agente para inhibir el enlazamiento de un péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de un célula que incluye: a) poner en contacto la célula con el agente y el péptido β amiloide; b) determinar la cantidad de péptido β amiloide enlazado a la célula y c) comparar la cantidad de péptido β amiloide enlazado determinada en la etapa b) con la cantidad determinada en ausencia del agente, evaluando así la habilidad del agente para inhibir el enlazamiento de péptido β amiloide con el receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de la célula.

En esta modalidad, se puede poner en contacto la célula con el agente y el péptido β amiloide simultáneamente o se puede poner en contacto la célula con el péptido β amiloide y el agente. El agente puede ser capaz de enlazarse específicamente con el péptido β amiloide. El agente puede enlazarse con el péptido β amiloide en el sitio donde interactúa el receptor para el producto final de glicación avanzada. El agente puede ser una porción extracelular soluble de un receptor para el producto final de glicación avanzada. El agente puede estar enlazado a un soporte sólido. El agente puede expresarse sobre la superficie de una célula.

Otra modalidad de esta descripción es un método para inhibir la activación de un gen NF-κB en una célula que comprende poner en contacto la célula con un agente que es capaz de inhibir la interacción del péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada sobre la célula, inhibiendo así la activación de NF-κB en la célula.

La presente invención prové una composición farmacéutica que incluye un agente capaz de inhibir la interacción del péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada, siendo dicho agente un péptido enlazado a un anticuerpo o una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que incluye los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab o a fragmento Fc, y un portador farmacéuticamente aceptable. El portador puede ser un diluyente, un aerosol, un portador tópico, una solución acuosa, una solución no acuosa o un portador sólido.

Como se lo utiliza aquí, el término "estrés oxidante " abarca la perturbación de la habilidad de una célula para mejorar los efectos tóxicos de oxidantes. Los oxidantes pueden incluir peróxido de hidrógeno o radicales oxígeno que sean capaces de reaccionar con bases en la célula incluido ADN. Una célula bajo "estrés oxidante" puede sufrir modificaciones bioquímicas, metabólicas, fisiológicas y/o químicas para contrarrestar la introducción de tales oxidantes. Tales modificaciones pueden incluir peroxidación lipídica, activación de NF-κB, inducción de hemo oxigenasa tipo I y mutagénesis de ADN. También, antioxidantes tales como glutationa son capaces de disminuir los efectos de oxidantes. La presente invención prové agentes y composiciones farmacéuticas que son capaces de inhibir los efectos del estrés oxidante en una célula. La invención también divulga métodos para mejorar los síntomas del estrés oxidante en un individuo que comprenden la administración al individuo de una cantidad del agente o composición farmacéutica efectivos para inhibir el estrés oxidante y mejorar por lo tanto los síntomas del estrés oxidante en el individuo.

Como se lo utiliza aquí, el término "neurotoxicidad" abarca los efectos metabólico, bioquímico y fisiológico negativos sobre una célula neuronal que pueden resultar en una debilitación de las funciones celulares neuronales. Tales funciones pueden incluir la memoria, el aprendizaje, la percepción, la electrofisiología neuronal (es decir, potenciales de acción, polarizaciones y sinapsis), formación de sinapsis, tanto químicas como eléctricas, funciones de canal, liberación y detección de neurotransmisores y funciones neuromotoras. La neurotoxicidad puede incluir citotoxicidad neuronal.

Como se lo utiliza aquí, el término "degeneración neuronal" abarca una declinación en el funcionamiento normal de una célula neuronal. Tal declinación puede incluir una declinación en la memoria, el aprendizaje, la percepción, electrofisiología neuronal (es decir, potenciales de acción, polarizaciones y sinapsis), formación de sinapsis, tanto químicas como eléctricas, funciones de canal, liberación y detección de neurotransmisores y funciones neuromotoras.

En la práctica de cualquiera de las modalidades de la invención o preparación de cualquiera de las composiciones farmacéuticas una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad que es capaz de inhibir el enlazamiento de un péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada. Por lo tanto, la cantidad efectiva variará con el individuo que está siendo tratado, así como con la condición que está siendo tratada.

Como se lo utiliza aquí, el término "portador adecuado farmacéuticamente aceptable" abarca cualquiera de los portadores estándar farmacéuticamente aceptados, tales como solución salina amortiguada con fosfato, solución salina amortiguada con acetato (un vehículo probable para administración parenteral), agua, emulsiones tales como una emulsión aceite/agua o una emulsión de triglicérido, diferentes tipos de agentes humectantes, tabletas, tabletas recubiertas y cápsulas. Un ejemplo de una emulsión aceptable de triglicéridos útil en administración intravenosa e intraperitoneal de los compuestos es la emulsión de triglicéridos comercialmente conocida como Intralipid®.

Cuando se administra oral o tópicamente, tales agentes y composiciones farmacéuticas serían suministradas utilizando diferentes portadores. Típicamente tales portadores contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles, u otros excipientes conocidos. Tales portadores pueden incluir también aditivos saborizantes y colorantes u otros ingredientes. El portador específico necesitaría ser seleccionado con base en el método deseado de suministro, por ejemplo, se podría utilizar PBS para suministro intravenoso o sistémico y se pueden utilizar grasas vegetales, cremas, ungüentos, pomadas

o geles para suministro tópico.

Esta invención también prové composiciones farmacéuticas incluidas cantidades terapéuticamente efectivas de composiciones de proteína y/o agentes capaces de inhibir el enlazamiento de un péptido β amiloide con un receptor para el producto final de glicación avanzada en el individuo de la invención junto con diluyentes adecuados, preservantes, solubilizantes, emulgentes, adyuvantes y/o portadores útiles en el tratamiento de la degradación neuronal debida al envejecimiento, una discapacidad de aprendizaje, o un trastorno neurológico. Tales composiciones son líquidas o liofilizadas o bien formulaciones secas e incluyen diluyentes con diferente contenido de amortiguador (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para evitar la absorción a superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácido biliares), agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol, polietilén glicerol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), preservantes (por ejemplo, Timerosal, alcohol bencílico, parabenos), sustancia de relleno o modificadores de tonicidad (por ejemplo, lactosa, manitol), unión covalente de polímeros tales como polietilén glicol con el agente, complejación con iones metálicos, o incorporación del agente en o sobre preparaciones en partículas de agentes poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o sobre liposomas, micro emulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos, o esferoplastos. Tales composiciones influirán sobre el estado físico, solubilidad, estabilidad, tasa de liberación in vivo, y tasa de aclaramiento in vivo del agente o composición. La escogencia de composiciones dependerá de las propiedades físicas y químicas del agente capaz de aliviar los síntomas del trastorno cognitivo de memoria o la incapacidad e aprendizaje en el individuo.

El agente de la presente invención puede ser suministrado en forma local a través de una cápsula que permite la liberación sostenida del agente o del péptido durante un período de tiempo. La liberación sostenida o controlada de composiciones incluye la formulación en depósitos lipofílicos (por ejemplo, ácidos grasos, ceras, aceites). También están comprendidas en la invención composiciones en partículas recubiertas con polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas) y el agente acoplado con anticuerpos dirigidos contra receptores específicos del tejido, ligandos o antígenos o acoplados con ligandos de receptores específicos del tejido. Otras modalidades de las composiciones de la invención incorporan formas e partículas con recubrimientos protectores, inhibidores de proteasa o reforzadores de permeación para diferentes rutas de administración, incluidas parenteral, pulmonar, nasal y oral.

Las porciones del agente de la invención pueden ser "marcadas" por medio de asociación con

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una sustancia marcadora detectable (por ejemplo, marcadas en forma radioactiva con o biotiniladas) para suministrar reactivos útiles en la detección y cuantificación del compuesto o sus células que soportan al receptor o sus derivados en muestras sólidas y fluidas de tejido tales como sangre, fluido cerebroespinal u orina.

Cuando se administran, los agentes (tales como un péptido que contiene al dominio V de sRAGE) son a menudo aclarados muy rápidamente de la circulación y pueden por lo tanto provocar una actividad farmacológica de duración relativamente corta. En consecuencia, se pueden requerir inyecciones frecuentes de dosis relativamente grandes de agentes bioactivos para mantener la eficacia terapéutica. Se sabe que agentes modificados por la unión covalente de polímeros solubles en agua tales como polietilén glicol, copolímeros de polietilén glicol y polipropilén glicol, carboximetil celulosa, dextrano, polivinil alcohol, polivinilpirrolidona o poliprolina exhiben una vida media sustancialmente más larga en sangre después de la inyección intravenosa que aquellos correspondientes a agentes no modificados (Abuchowski y colaboradores, 1981; Newmark y colaboradores, 1982; y Katre y colaboradores, 1987). Tales modificaciones pueden incrementar también la solubilidad del agente en solución acuosa, eliminar la agregación, mejorar la estabilidad física y química del agente, y reducir grandemente la inmunogenicidad y reactividad del agente. Como resultado, se puede conseguir la actividad biológica in vivo por medio de la administración de tales aductos de agente polimérico menos frecuentemente o en dosis menores que con el agente no modificado.

La unión de polietilén glicol (PEG) a agentes es particularmente útil ya que PEG tiene muy baja toxicidad en mamíferos (Carpenter y colaboradores, 1971). Por ejemplo, un aducto de PEG de adenosina desaminasa fue aprobado en los Estados Unidos para uso en humanos para el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia combinado severo. Una segunda ventaja que ofrece la conjugación de PEG es que efectivamente reduce la inmunogenicidad y antigenicidad de compuestos heterólogos.

Por ejemplo, un aducto de PEG de una proteína humana podría ser útil para el tratamiento de enfermedades en otras especies de mamíferos sin el riesgo de activar una severa respuesta inmune. El compuesto de la presente invención capaz de aliviar los síntomas de un trastorno cognitivo de la memoria o aprendizaje se puede suministrar en un dispositivo de microencapsulación para reducir o prevenir una respuesta inmune en el huésped contra el agente o contra células que pueda producir el compuesto. El agente de la presente invención puede ser suministrado también microencapsulado en una membrana, tal como un liposoma.

Polímeros tales como PEG pueden ser convenientemente unidos a uno o más residuos aminoácidos reactivos en una proteína tal como el grupo alfa-amino del aminoácido amino terminal, los grupos épsilon amino de cadenas laterales de lisina, los grupos sulfhidrilo de cadenas laterales de cisteína, los grupos carboxilo de aspartilo y cadenas laterales de glutamilo, el grupo alfa-carboxilo del aminoácido carboxi terminal, cadenas laterales de tirosina, o a derivados activados de cadenas de glicosilo unidos a ciertos residuos de asparagina, serina o treonina.

Se han descrito numerosas formas activadas de PEG adecuadas para reacción directa con proteínas. Los reactivos de PEG útiles para reacción con grupos amina de proteína incluyen ésteres activos de ácido carboxílico o derivados carbonato, particularmente aquellos en los cuales los grupos salientes son N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenol, imidazol o 1-hidroxi-2-nitrobenceno-4-sulfonato. Los derivados de PEG que contienen grupos maleimida o haloacetilo son reactivos útiles para la modificación de proteína libre de grupos sulfhidrilo. Igualmente, los reactivos de PEG que contienen grupos amino hidrazina o hidrazida son útiles para reacción con aldehídos generados por oxidación con peryodato de grupos carbohidrato en proteínas. Cicatrización de Heridas

Los péptidos y agentes de la presente invención pueden ser utilizados para tratar la cicatrización de heridas en individuos. La cicatrización de heridas puede estar asociada con diferentes enfermedades o condiciones. Las enfermedades o condiciones pueden perjudicar la cicatrización normal de una herida o contribuir a la existencia de heridas que requieren cicatrización. Los individuos pueden ser tratados con los péptidos o agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención con el propósito de tratar una cicatrización lenta, una enfermedad periodontal recalcitrante, la incapacidad de cicatrización de una herida debido a diabetes y la incapacidad de cicatrización de una herida debido a una enfermedad autoinmune. La presente invención proporciona compuestos y composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de la incapacidad para cicatrización de una herida como resultado del envejecimiento. El efecto de la administración tópica del agente puede ser reforzada por medio de administración parenteral del ingrediente activo en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable. Enfermedad Neurológica

Las características patológicas de la enfermedad de Alzheimer (AD) son la deposición intracelular y extracelular de proteínas filamentosas que están estrechamente correlacionadas con una eventual disfunción neuronal y con demencia clínica (para revisión ver Goedert, 1993; Haass y colaboradores, 1994; Kosik, 1994; Trojanowski y colaboradores, 1994; Wischik, 1989). El péptido β amiloide (Aβ) es el principal componente de los depósitos extracelulares en AD, tanto en placas seniles/difusas como en la vasculatura cerebral. Se ha demostrado que el Aβ promueve el crecimiento de neuritas, genera intermediarios reactivos de oxígeno (ROI), induce estrés celular oxidante, conduce a citotoxicidad neuronal, y promueve activación microglial (Behl y colaboradores, 1994; Davis y colaboradores, 1992; Hensley, y colaboradores, 1994; Koh, y colaboradores, 1990; Koo y colaboradores, 1993; Loo y colaboradores, 1993; Meda y colaboradores, 1995; Pike y colaboradores, 1993; Yankner y colaboradores, 1990). Para que Aβ induzca estos efectos celulares múltiples, es probable que las membranas plasmáticas presenten una(s) proteína(s) de enlazamiento que enganche(n) Aβ. En este contexto, varias proteínas asociadas con la célula, así como proteoglicanos sulfatados, pueden interactuar con Aβ. Estas incluyen: a la receptora de sustancia P, a la receptora del complejo serpina-enzima (SEC), apolipoproteína E, apolipoproteína J (clusterina), transtiberina, antiquimotripsina alfa-1, proteína precursora β amiloide, y sulfonatos/sulfatos de heparina (Abraham y colaboradores, 1988; Fraser y colaboradores, 1992; Fraser y colaboradores, 1993; Ghiso y colaboradores, 1993; Joslin y colaboradores, 1991; Kimura y colaboradores, 1993; Kisilevsky y colaboradores, 1995; Strittmatter y colaboradores, 1993a; Strittmatter y colaboradores, 1993b; Schwarzman y colaboradores, 1994; Snow y colaboradores, 1994; Yankner y colaboradores, 1990). De estos, el receptor de sustancia P y el receptor de SEC pueden funcionar como receptores de la superficie de la célula neuronal para Aβ, aunque se carece de evidencia directa para esto (Fraser y colaboradores, 1993; Joslin y colaboradores, 1991; Kimura y colaboradores, 1993; Yankner y colaboradores, 1990). En realidad, el papel de los receptores de la sustancia P es controversial, y no se sabe si Aβ interactúa solo con el receptor, o si se requieren coestimuladores (Calligaro y colaboradores, 1993; Kimura y colaboradores, 1993; Mitsuhashi y colaboradores, 1991) y el receptor de SEC no ha sido aún completamente caracterizado.

ASPECTOS CLÍNICOS

En ciertas modalidades de la presente invención, el individuo puede sufrir de aspectos clínicos como de describe aquí más adelante y como se describe adicionalmente en Harper’s Biochemistry, R. K. Murray, y colaboradores. (Editors) 21st Edition, (1988) Appelton & Lange, East Norwalk, CT. Tales aspectos clínicos pueden predisponer al individuo a la aterosclerosis o a aterosclerosis acelerada. Por lo tanto, tales individuos se beneficiarían de la administración de un polipéptido derivado de sRAGE en una cantidad efectiva durante un tiempo efectivo.

El individuo de la presente invención puede mostrar señales clínicas de aterosclerosis, hipercolesterolemia u otros trastornos como se discute aquí más adelante.

Clínicamente, la hipercolesterolemia puede ser tratada por medio de la interrupción de la circulación enterohepática de ácidos biliares. Se reporta que pueden efectuarse reducciones significativas de colesterol en plasma por medio de este procedimiento, que puede lograrse por medio del uso de resina de colestiramina o quirúrgicamente por medio de las operaciones de exclusión ileal. Ambos procedimientos causan un bloqueo en la reabsorción de ácidos biliares. Entonces, debido a la liberación de la regulación de realimentación normalmente ejercida por ácidos biliares, se refuerza mucho la conversión de colesterol en ácidos biliares en un esfuerzo por mantener la fuente de ácidos biliares. Se favorece la expresión de los receptores de LDL (lipoproteína de baja densidad) en el hígado, provocando un mayor consumo de LDL con la consecuente disminución de colesterol en plasma. Aterosclerosis por Colesterol y Enfermedad Coronaria

Los péptidos, agentes y composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser utilizados como agentes terapéuticos para inhibir los síntomas de enfermedades en un individuo asociadas con el metabolismo de colesterol, aterosclerosis o enfermedad coronaria. Se discuten aquí más adelante algunos síntomas de tales enfermedades que pueden ser inhibidos o mejorados o prevenidos a través de la administración de los agentes y composiciones farmacéuticas de la presente invención. Por ejemplo, se pueden administrar los agentes y composiciones farmacéuticas de la presente invención a un individuo que padece los síntomas de enfermedad coronaria con el propósito de proteger la integridad de las células endoteliales del individuo y por lo tanto inhibir los síntomas de la enfermedad coronaria.

Muchos investigadores han demostrado una correlación entre los elevados niveles de lípido en suero y la incidencia de enfermedad coronaria y aterosclerosis en humanos. De los lípidos en suero, el colesterol ha sido señalado como el que más se destaca por estar principalmente comprometido en esta relación. Sin embargo, otros parámetros tales como la concentración de triacilglicerol en suero muestran correlaciones similares. Los pacientes con enfermedad arterial pueden tener una cualquiera de las siguientes anomalías: (1) elevadas concentraciones de VLDL (lipoproteínas de muy baja densidad) con concentraciones normales de LDL; (2) LDL elevado con VLDL Normal; (3) elevación de ambas fracciones de lipoproteína. Existe también una relación inversa entre las concentraciones de HDL (lipoproteínas de alta densidad) (HDL3) y la enfermedad coronaria, y algunos consideran que la relación más predictiva es la proporción entre colesterol LDL:HDL. Esta relación es explicable en términos de los papeles propuestos de LDL en el transporte de colesterol a los tejidos y de HDL que actúa como la depuración del colesterol.

La aterosclerosis se caracteriza por la deposición de colesterol y éster de colesterol de lipoproteínas que contienen apo-B-100 en el tejido conectivo de las paredes arteriales. Las enfermedades en las cuales se presentan niveles elevados prolongados de VLDL, IDL, o LDL en la sangre (por ejemplo, diabetes, mellitus, nefrosis lipídica, hipotiroidismo, y otras condiciones de hiperlipidemia) están a menudo acompañadas por aterosclerosis más severa o prematura.

Los experimentos sobre la inducción de aterosclerosis en animales indican una amplia variación de susceptibilidad entre especies. Los conejos, cerdos, monos, y humanos son especies en las cuales se puede inducir aterosclerosis por medio de colesterol en la alimentación. Las ratas, perros, ratones y gatos son resistentes. La tiroidectomía o tratamiento con fármacos de tiouracilo permitirá la inducción de aterosclerosis en perros y ratas. Colesterol bajo en sangre es una característica de hipertiroidismo.

Los factores hereditarios juegan el papel más importante en la determinación de las concentraciones individuales de colesterol en sangre, pero de los factores ambientales y de la dieta que disminuyen el colesterol en sangre, la sustitución en la dieta de los ácidos grasos poliinsaturados por algunos de los ácidos grasos saturados ha sido el más intensamente estudiado.

Los aceites de ocurrencia natural que contienen una alta proporción de ácido linoléico son benéficos en la disminución de colesterol en plasma e incluyen aceite de aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de maíz, y aceite de soja mientas que la grasa de la leche, la grasa de vacuno, y el aceite de coco, que contienen una alta proporción de ácidos grasos saturados, aumentan el nivel. La sacarosa y la fructosa tienen un mayor efecto en la elevación de lípidos en sangre, particularmente de triacilgliceroles, que otros carbohidratos.

La razón para el efecto de disminución del colesterol de los ácidos grasos poliinsaturados no es aún clara. Sin embargo, se han adelantado varias hipótesis para explicar el efecto, incluida la estimulación de la excreción de colesterol en el intestino y la estimulación de la oxidación de colesterol hasta ácidos biliares. Es posible que los ésteres de colesterol de ácidos grasos poliinsaturados sean metabolizados más rápidamente por el hígado y otros tejidos, que podría mejorar su tasa de rotación y excreción. Existe otra evidencia de que el efecto en gran medida debido a un cambio en la distribución de colesterol del plasma dentro de los tejidos debido a la mayor tasa catabólica de LDL. Los ácidos grasos saturados causan la formación de partículas más pequeñas de VLDL que contienen relativamente más colesterol, y son utilizadas por los tejidos extrahepáticos a una velocidad más lenta de lo que lo hacen las partículas mayores. Todas estas tendencias pueden ser consideradas como aterogénicas.

Los factores adicionales que se considera que juegan un papel en la enfermedad coronaria incluyen presión sanguínea alta, tabaquismo, obesidad, falta de ejercicio, y beber agua desmineralizada en vez de agua con minerales. La elevación de ácidos grasos libres en plasma conducirá también a incrementar la secreción de VLDL por parte del hígado, lo que involucra una salida extra de triacilglicerol y colesterol al torrente sanguíneo. Los factores que conducen a niveles mayores o fluctuantes de ácidos grasos libres incluyen estrés emocional, la nicotina proveniente de fumar cigarrillo, beber café, y participar de una pocas grandes comidas en vez de alimentarse en forma más continua. Las mujeres pre menopáusicas parecen estar protegidas contra muchos de estos factores nocivos, posiblemente debido a que ellas tienen concentraciones mayores de HDL que los hombres y las mujeres posmenopáusicas. Fármacos Hipolipidémicos

Cuando las medidas dietéticas no logran reducir los niveles de lípido en suero, puede recurrirse al uso de fármacos hipolipidémicos. Tales fármacos pueden ser utilizados junto con los agentes y composiciones farmacéuticas de la presente invención, es decir, se pueden administrar tales fármacos a un individuo junto con los agentes de la presente invención. Se sabe que diferentes fármacos bloquean la formación de colesterol en diferentes etapas en la ruta de la biosíntesis. Muchos de estos fármacos tienen efectos nocivos, pero los inhibidores de hongos de HMG-CoA reductasa, compactina y mevinolina, reducen los niveles de colesterol LDL con pocos efectos adversos. El sitosterol es un agente hipocolesterolémico que actúa bloqueando la absorción de colesterol en el tracto gastrointestinal. Resinas tales como colestipol y colestiramina (Questran) previenen la reabsorción de sales biliares combinándose con ellas, incrementando por lo tanto su pérdida través de la materia fecal. La neomicina también inhibe la reabsorción de sales biliares. El clofibrato y el gemfibrozilo ejercen al menos parte de su efecto hipolipidémico al desviar el flujo hepático de los ácidos grasos libres de las rutas de esterificación en aquellas de oxidación, disminuyendo así la secreción de triacilglicerol y colesterol que contienen VLDL por parte del hígado. Además, facilitan la hidrólisis de triacilgliceroles VLDL por medio de la lipoproteína lipasa. Probucol parece incrementar el catabolismo de LDL a través de rutas independientes del receptor. El ácido nicotínico reduce el flujo de FFA por medio de la inhibición de la lipólisis del tejido adiposo, inhibiendo por lo tanto la producción de VLDL por parte del hígado. Trastornos de las Lipoproteínas en Plasma (Dislipoproteinemias)

Unos pocos individuos en la población exhiben defectos heredados en sus lipoproteínas, que conduce a la condición primaria de si hipo o hiperlipoproteinemia. Muchos otros tienen defectos tales como diabetes mellitus, hipotiroidismo, y aterosclerosis muestran patrones anormales de lipoproteína que son muy similares a una u otra de las condiciones heredadas primarias. Virtualmente todas estas condiciones primarias son debidas a un defecto en una u otra etapa en el transcurso de la formación, transporte o destrucción de lipoproteína. No todas las anormalidades son nocivas. Hipolipoproteinemia:

1.: Abetalipoproteinemia -Esta es una rara enfermedad heredada caracterizada por la ausencia de β-lipoproteína (LDL) en plasma. Los lípidos en sangre están presentes en concentraciones bajas especialmente de acilgliceroles, que están virtualmente ausentes, ya que no se forman quilomicrones o VLDL. Tanto el intestino como el hígado acumulan acilgliceroles. La abetalipoproteinemia es debida a un defecto en la síntesis de apoproteína B.

2.: Hipobetalipoproteinemia Familiar -En la hipobetalipoproteinemia, la concentración de LDL está entre 10 y 50% del valor normal, pero se presenta formación de quilomicrones. Debe concluirse que apo-B es esencial para el transporte de triacilglicerol. La mayoría de los individuos son sanos y longevos.

3.: Deficiencia Familiar de lipoproteína alfa (enfermedad de Tánger) -En los individuos homocigotos, hay casi ausencia de HDL en plasma y acumulación de ésteres de colesterol en los tejidos. No existe un deterioro de la formación de quilomicrones o secreción de VLDL por parte del hígado. Sin embargo, en electroforesis, no existe pre-β-lipoproteína, sino que se encuentra una banda β ancha que contiene al triacilglicerol endógeno.

Esto es debido a que la banda pre-β normal contiene otras apoproteínas normalmente suministradas por HDL. Los pacientes tienden a desarrollar hipertriacilglicerolemia como resultado de la ausencia de apc-C-II, que normalmente activa lipoproteína lipasa. Hiperlipoproteinemia:

1.: Deficiencia familiar de lipoproteína lipasa (tipo I) -Esta condición se caracteriza por un aclaramiento muy lento de quilomicrones de la circulación, lo que conduce a niveles anormalmente elevados de quilomicrones. La VLDL puede elevarse, pero existe una disminución de LDL y HDL. Por lo tanto, la condición es inducida por grasa. Puede ser corregida por medio de la reducción de la cantidad de grasa e incrementando la proporción de carbohidratos complejos en la dieta. Una variación de esta enfermedad es causada por una deficiencia en apo-CII, requerida como un cofactor para la lipoproteína lipasa.

2.: Hipercolesterolemia familiar (tipo II)-Los pacientes se caracterizan por hiperbetalipoproteinemia (LDL), que está asociada con mayor colesterol total en plasma. También puede haber una tendencia para que se eleve VLDL en el tipo IIb. Por lo tanto, el paciente puede tener algo elevados los niveles de triacilglicerol pero el plasma -ya que no es cierto en otros tipos de hiperlipoproteinemia -permanece claro. La deposición de lípidos en el tejido (por ejemplo, xantomas, ateromas) es común. Puede surgir también un patrón tipo II como resultado secundario de hipotiroidismo. La enfermedad parece estar asociada con tasas reducidas de aclaración de LDL de la circulación debido a receptores defectuosos de LDL y está asociada con una mayor incidencia de aterosclerosis. La reducción de colesterol en la dieta y de grasas saturadas puede ser usada en el tratamiento. Una enfermedad que produce hipercolesterolemia pero debido a una causa diferente es la enfermedad de Wolman (enfermedad por almacenamiento de éster de colesterol). Esto es debido a una deficiencia de éster de colesterol hidrolasa en lisosomas de células tales como fibroblastos que normalmente metabolizan LDL.

3.: Hiperlipoproteinemia familiar tipo III (enfermedad general beta, enfermedad de eliminación de residuos, disbetalipoproteinemia familiar) -Esta condición se caracteriza por un incremento tanto en quilomicrones como en VLDL residual; estas son lipoproteínas de densidad menor a 1,019 pero aparecen como una banda p ancha en la electroforesis (β-VLDL). Causan hipercolesterolemia e hipertriacilglicerolemia. Están presentes xantomas y aterosclerosis tanto de arterias coronarias como periféricas. Se recomienda un tratamiento por medio de reducción de peso y de dietas que contengan carbohidratos complejos, grasas insaturadas, y poco colesterol. La enfermedad es debida a una deficiencia en el metabolismo de residuos por parte del hígado causado por una anormalidad en apo-E, que está normalmente presente en 3 isoformas, E2, E3, y E4. Los pacientes con hiperlipoproteinemia tipo III poseen únicamente E2, que no reacciona con el receptor E.

4.: Hipertriacilglicerolemia familiar (tipo IV) -Esta condición se caracteriza por niveles altos de triacilglicerol (VLDL) producido en forma endógena. Los niveles de colesterol se elevan en forma

proporcional con la hipertriacilglicerolemia, y se presenta frecuentemente intolerancia a la glucosa. Tanto LDL como HDL están por debajo de lo normal en cantidad. Este patrón de lipoproteína está también comúnmente asociado con enfermedad coronaria, diabetes mellitus tipo II no dependiente de insulina, obesidad, y muchas otras condiciones, incluido alcoholismo y el consumo de hormonas progestágeno. El tratamiento de hiperlipoproteinemia primaria tipo IV es por reducción de peso; el reemplazo de carbohidratos solubles en la dieta con carbohidratos complejos, grasa insaturada, dietas bajas en colesterol; y también agentes hipolipidémicos.

5.: Hiperlipoproteinemia familiar tipo V -El patrón de lipoproteína es complejo, ya que tanto los quilomicrones como VLDL son elevados, provocando tanto triacilglicerolemia como colesterinemia. Las concentraciones de LDL y de HDL son bajas. Los xantomas están frecuentemente presentes, pero la incidencia de aterosclerosis aparentemente no es sorprendente. La tolerancia a la glucosa es anormal y está frecuentemente asociada con obesidad y diabetes. La razón para la condición, que es familiar, no es clara. El tratamiento ha consistido en reducción de peso seguido por una dieta no muy alta ya sea en carbohidratos o en grasa. Se ha sugerido que una causa adicional de hipolipoproteinemia es la sobreproducción de apo-B, que puede influir sobre las concentraciones en plasma de VLDL y LDL.

6.: Hiperalfalipoproteinemia familiar -Esta es una rara condición asociada con mayores concentraciones de HDL aparentemente benéficas para la salud.

Lecitina Familiar: Deficiencia de Colesterol Aciltransferasa (LCAT): En individuos afectados, la concentración en plasma de ésteres de colesterol y lisolecitina es baja, mientras que la concentración de colesterol y lecitina es elevada. El plasma tiende a ser turbio. Se encuentran también anormalidades en las lipoproteínas. Una fracción de HDL contiene estructuras en forma de disco en amontonamientos o agrupaciones de glóbulos rojos que son claramente HDL naciente incapaz de recoger el colesterol debido a la ausencia de LCAT. También está presente lipoproteína-X como una subfracción anormal de LDL, que únicamente se encuentra en pacientes con colestasis. Los VLDL son también anormales, migrando como β-lipoproteínas por electroforesis (β-VLDL). Los pacientes con enfermedad del parénquima hepático también presentan una disminución de la actividad de LCAT y anormalidades en los lípidos y lipoproteínas en suero.

Portadores farmacéuticos

En una modalidad preferida el portador farmacéutico puede ser un líquido y la composición farmacéutica estaría en la forma de una solución. En otra modalidad igualmente preferida, el portador farmacéuticamente aceptable es un sólido y la composición está en la forma de un polvo o una tableta. En una modalidad adicional, el portador farmacéutico es un gel y la composición está en la forma de un supositorio o una crema. En una modalidad adicional el ingrediente activo puede ser formulado como parte de un parche transdérmico farmacéuticamente aceptable.

Un portador sólido puede incluir una o más sustancias que pueden actuar también como agentes aromatizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, rellenos, deslizantes, auxiliares de compresión, aglomerantes o agentes para desintegración de la tableta; también puede ser un material de encapsulado. En polvos, el portador es un sólido finamente dividido que es una mezcla con el ingrediente activo finamente dividido. En tabletas, el ingrediente activo se mezcla con un portador que tiene las propiedades necesarias de compresión en proporciones adecuadas y compactadas en la forma y tamaño deseados. Los polvos y tabletas contienen preferiblemente hasta un 99% del ingrediente activo. Los portadores sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidona, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico.

23 Se utilizan portadores líquidos en la preparación de soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elíxires y composiciones presurizadas. Se puede disolver o suspender el ingrediente activo en un portador líquido farmacéuticamente aceptable tal como agua, un solvente orgánico, una mezcla tanto de aceites como de grasas farmacéuticamente aceptables. El portador líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados tales como solubilizantes, emulsificantes, amortiguadores, preservantes, edulcorantes, agentes saborizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, colorantes, reguladores de viscosidad, estabilizantes u osmoreguladores. Los ejemplos adecuados de portadores líquidos para administración oral y parenteral incluyen agua (que contienen parcialmente aditivos como anteriormente, por ejemplo derivados de celulosa, preferiblemente solución de carboximetil celulosa sódica), alcoholes (incluidos alcoholes monohídricos y polihídricos, por ejemplo glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo aceite de coco fraccionado y aceite de cacahuete). Para administración parenteral, el portador puede ser también un éster aceitoso tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los portadores líquidos estériles son útiles en composiciones estériles en forma líquida para administración parenteral. El portador líquido para composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propelente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas líquidas que son soluciones estériles o suspensiones pueden ser utilizadas, por ejemplo, para inyección intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal o subcutánea. Las soluciones estériles también se pueden administrar en forma intravenosa. El ingrediente activo se puede preparar como una composición sólida estéril que puede ser suelta o suspendida al momento de administrarla utilizando agua estéril, solución salina, u otro medio inyectable estéril apropiado. Los portadores deben incluir aglomerantes necesarios e inertes, agentes de suspensión, lubricantes, saborizantes, edulcorantes, preservantes, colorantes, y recubrimientos. El ingrediente activo de la presente invención (por ejemplo, el polipéptido del dominio V derivado de sRAGE, o una composición del mismo) se puede administrar en forma oral en la forma de una solución o suspensión estéril que contenga otros solutos o agentes de suspensión, por ejemplo, suficiente solución salina o glucosa para hacer isotónica la solución, sales biliares, acacia, gelatina, sorbitan monooleato, polisorbato 80 (ésteres de oleato de sorbitol y sus anhídridos copolimerizados con óxido de etileno) y similares. El ingrediente activo se puede administrar también en forma oral ya sea en forma líquida o de una composición sólida. Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen formas sólidas, tales como píldoras, cápsulas, gránulos, tabletas, y polvos, y formas líquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires, y suspensiones. Las formas útiles para administración parenteral incluyen soluciones estériles, emulsiones, y suspensiones.

Aterosclerosis

En una modalidad de la presente invención, el individuo puede estar predispuesto a aterosclerosis. Esta predisposición puede incluir predisposición genética, predisposición ambiental, predisposición metabólica, o predisposición física. Se han hecho revisiones recientes de aterosclerosis y enfermedad cardiovascular. Por ejemplo: Keating y Sanguinetti, (Mayo 1996) Molecular Genetic Insights into Cardiovascular Disease, Science 272: 681 -685 se incorpora como referencia en su totalidad en la presente solicitud. Los autores revisan la solicitud de herramientas moleculares para formas heredadas de enfermedad cardiovascular tales como arritmias, cardiomiopatías, y enfermedad vascular. La Tabla 1 de esta referencia incluye enfermedades cardíacas y la proteína aberrante asociada con cada enfermedad. Las enfermedades enlistadas son: enfermedad LQT, cardiomiopatía hipertrófica familiar; distrofia muscular de Duchenne y Becker; síndrome de Barth por deficiencias de Acil-CoA deshidrogenasa; trastornos mitocondriales; hipercolesterolemia familiar; hipobetalipoproteinemia; homocistinuria; hiperlipoproteinemia tipo III; estenosis aórtica supravalvular; síndrome IV de Ehler-Danlos; síndrome de Marfa; telangiectasia hemorrágica hereditaria. Estas condiciones están incluidas como posibles predisposiciones de un individuo a la aterosclerosis.

Adicionalmente, se revisan los modelos de ratón de aterosclerosis en Breslow (1996) Mouse Models of Atherosclerosis, Science 272: 685. Esta referencia es también incorporada como referencia en su totalidad en la presente solicitud. Breslow también incluye una tabla (Tabla 1) que enumera diferentes modelos de ratón y los estímulos aterogénicos. Por ejemplo, los modelos de ratón incluyen C57BL/6; deficiencia de Apo E; lesión por ApoE; ApoE R142C; deficiencia del receptor de LDL; y HuBTg. Una modalidad de la presente invención es en donde un individuo tiene una predisposición a la aterosclerosis como lo muestran los modelos de ratón presentados en la publicación de Breslow.

Gibbons y Dzau revisan una enfermedad vascular en Molecular Therapies for Vascular Disease, Science Vol. 272, páginas 689 -693. En una modalidad de la presente invención, el individuo puede manifestar los eventos patológicos como se describe en la Tabla 1 de la publicación de Gibbons y Dzau. Por ejemplo, el individuo puede tener disfunción endotelial, lesión endotelial, activación celular y modulación fenotípica, crecimiento celular desregulado, apoptosis desregulada, trombosis, ruptura de placa, migración de células anormales o modificación de la matriz extracelular o intracelular.

En otra modalidad de la presente invención, el individuo puede tener diabetes. El individuo puede presentar complicaciones asociadas con diabetes. Algunos ejemplos de tales complicaciones incluyen la activación de receptores endoteliales y AGE de macrófagos, lipoproteínas alteradas, matriz, y proteínas de membrana basal; contractilidad alterada y sensibilidad hormonal de músculo vascular liso; permeabilidad celular endotelial alterada; acumulación de sorbitol; reducción de mioinositol neural o actividad alterada de Na-K ATPasa. Tales complicaciones son discutidas en una reciente publicación de Porte y Schwartz, Diabetes Complications: Why is Glucose potentially Toxic?, Science, Vol. 272, páginas 699 -700.

Esta invención es ilustrada en la sección de Detalles Experimentales que viene a continuación. Se exponen estas secciones para ayudar en la comprensión de la invención pero no pretenden, y no deben ser consideradas como limitantes de ninguna manera de la invención como se expone en las reivindicaciones que vienen más adelante. DETALLES EXPERIMENTALES Ejemplo 1; Los primeros 30 Aminoácidos del Dominio tipo V de (sRAGE) Extracelular Soluble Media sus Interacciones con Productos Finales de Glicación Avanzada (AGES) Y el Péptido β Amiloide

El dominio extracelular de RAGE (Receptor para Productos Finales de Glicación Avanzada) contiene un dominio tipo "V" seguido por dos dominios de inmunoglobulina tipo "C". Esta porción de la molécula, llamada soluble o RAGE, media la interacción de los Productos Finales de Glicación Avanzada (AGE) y el péptido β amiloide con el receptor de la superficie de la célula. Los RAGE ligan estrechamente los AGE o péptido β amiloide e interfieren con la habilidad de estos ligandos para interactuar con, y activar, RAGE celular sobre un rango de tipos de células. In vivo, la administración de sRAGE suprime la aterosclerosis acelerada en un modelo de múrido de enfermedad vascular diabética acelerada en ratones nulos en apolipoproteína E y mejora la reducida cicatrización de heridas en ratones db+/db+ genéticamente diabéticos. Con el fin de delinear qué porción de sRAGE media estas interacciones ya sea con los AGE o con el péptido β amiloide, se generaron una serie de construcciones de ADN (incluido ADN que codifica para el dominio V, el dominio C1 o el dominio C2) junto con una series de péptidos que representan secuencias a lo largo de los tres dominios. Los datos indican aquí que el dominio de enlazamiento del ligandos tanto para los AGE como para el péptido β amiloide en sRAGE cae dentro de los primeros 30 aminoácidos del dominio V. Además, los datos indican que el dominio C1 o el dominio C2 o las secuencias de péptidos dentro de esos dominios no median la interacción de esos ligandos con sRAGE. Estos datos indican que los primeros 30 aminoácidos de sRAGE pueden representar un objetivo importante para la identificación de medicamentos, selección y desarrollo para tratar enfermedades en las cuales se acumulan los AGE, tal como las complicaciones de diabetes, así como la enfermedad de Alzheimer.

Se identificó primero al RAGE (Receptor para el AGE) como un sitio de interacción celular de Productos Finales de Glicación Avanzada (los AGE), los productos de glicación y oxidación no enzimática irreversible de proteínas/lípidos, que se acumulan durante el envejecimiento normal, diabetes así como en falla renal y amiloidosis (Ruderman y colaboradores, 1992; Baynes, 1991; Sell y colaboradores, 1989; Brownlee y colaboradores, 1988; Hicks y colaboradores, 1988). RAGE (Schmidt y colaboradores, 1992; Neeper y colaboradores, 1992) es un miembro de la superfamilia de la inmunoglobulina de moléculas de la superficie de la célula cuya porción extracelular porción contiene un dominio tipo "V" seguido por dos dominios de inmunoglobulina tipo "C". El gráfico de hidropatía putativa predice además que esta porción extracelular está precedida por un péptido líder de aproximadamente 22 aminoácidos, y está seguido por un dominio putativo hidrófobo que se extiende a través de la membrana, y por último por un dominio citosólico altamente cargado (Neeper y colaboradores, 1992). RAGE se conserva notablemente entre las especies examinadas hasta el momento (bovino, humano, ratón y rata) (Neeper y colaboradores, 1992), con una homología observada superior al 90% tanto a niveles de aminoácido como de ácido nucleico.

RAGE como receptor para Productos Finales de Glicación Avanzada (los AGE). Estudios previos han demostrado que RAGE está presente en tipos de células que son objetivos específicos en la patogénesis de complicaciones en diabetes, específicamente células endoteliales, células de músculo liso vascular, macrófagos, células mesangiales, células vasculares y neurales de la retina, así como neuronas (en el sistema nervioso central y periférico) (Brett y colaboradores, 1993). En este contexto, la interacción de los AGE con RAGE resulta en una cantidad de alteraciones en el fenotipo celular vascular e inflamatorio, todas las cuales son probablemente importantes en la patogénesis de complicaciones diabéticas y por envejecimiento (Schmidt y colaboradores, 1993; Schmidt y colaboradores, 1994; Schmidt y colaboradores, 1995; Wautier y colaboradores, 1996; Yan y colaboradores, 1994; Miyata y colaboradores, 1996; Lander y colaboradores, 1997)). Por ejemplo, la interacción AGE-RAGE resulta en una migración mejorada y en activación de macrófagos (Schmidt y colaboradores, 1993), una mayor expresión de Interleuquina-6 en los hígados de ratones tratados con AGE (Schmidt y colaboradores, 1994), en una expresión mejorada de la Molécula 1 de Adhesión Celular Vascular por el endotelio vascular (Schmidt y colaboradores, 1995), híper permeabilidad vascular (Wautier y colaboradores, 1996) y estrés oxidante celular mejorado (Yan y colaboradores, 1994, Miyata y colaboradores, 1996). Un medio fundamental por medio del cual la interacción AGERAGE imparte estos efectos es a través de la activación de rutas sensibles a la oxidación incluidas las quinasas p21ras y MAP (Lander y colaboradores, 1997).

Los efectos de la interacción AGE-RAGE están en gran parte bloqueadas por el tratamiento previo de un sistema de cultivo de células o ratones vivos con un compuesto anti-RAGE compuesto del dominio "V" y dos dominios tipo "C" (Schmidt y colaboradores, 1993; Schmidt y colaboradores, 1994; Schmidt y colaboradores, 1995; Wautier y colaboradores, 1996; Yan y colaboradores, 1994; Miyata y colaboradores, 1996; Lander y colaboradores, 1997). Además, en recientes estudios, el tratamiento de ratones diabéticos con sRAGE mejoró la cicatrización desmejorada de las heridas en un modelo de escisión de espesor completo (Wu y colaboradores, 1997) y suprimió la aterosclerosis diabética acelerada en ratones nulos en apolipoproteína E vueltos diabéticos con estreptozotocina (Park y colaboradores, 1997).

RAGE como receptor para el péptido beta amiloide. El péptido beta amiloide es una importante especie patogénetica en el desarrollo de toxicidad neuronal en la enfermedad de Alzheimer (Yan y colaboradores, 1996). RAGE fue identificado como un sitio central de interacción para el péptido beta amiloide sobre neuronas; la interacción de la cual resulta un estrés oxidante mejorado, citotoxicidad neuronal y expresión del factor estimulador de colonias de macrófagos (Yan y colaboradores, 1996; Yan y colaboradores, 1997). Estos efectos, como en el caso de los AGE, son bloqueados en modelos de cultivo de células en presencia ya sea de IgG anti-RAGE o sRAGE (Yan y colaboradores, 1996; Yan y colaboradores, 1997).

Por lo tanto, el propósito de los estudios esbozados más adelante fue delinear el sitio preciso de interacción de los AGE y el péptido beta amiloide con sRAGE como medio para entender cómo imparte sRAGE sus efectos benéficos. Por último, los resultados de estos estudios son más útiles en el desarrollo de fármacos diseñados para tratar trastornos en los cuales se acumulan los AGE, tal como las complicaciones de diabetes, así como la enfermedad de Alzheimer.

Materiales. Se prepararon Productos Finales de Glicación Avanzada (los AGE) como se describió previamente (Schmidt y colaboradores, 1992; Neeper y colaboradores, 1992) utilizando los materiales obtenidos de SIGMA®. Se adquirió el péptido beta amiloide (1 -42) de Quality Control Biochemicals. Se prepararon todos los péptidos de acuerdo a la secuencia (Neeper y colaboradores, 1992) por medio de Quality Control Biochemicals.

Construcciones. El sistema de proteína de fusión de GST fue utilizado para preparar el dominio V soluble, y dominios C1 y C2 solubles de acuerdo con las instrucciones del fabricante (PHARMACIA®).

Ensayos de Enlazamiento. Se cargo albúmina de suero bovino de AGE (5 µg) sobre los pozos de una placa Maxisorp NUNC® en amortiguador bicarbonato de sodio/carbonato de sodio (pH 9.8) durante la noche a 4º C. La mañana siguiente, se aspiraron los pozos y se bloqueo con solución salina amortiguada con fosfato (con calcio/magnesio) que contenía albúmina de suero bovino (1%) por dos horas a 37° C. Se lavaron luego los pozos una vez con solución salina amortiguada con fosfato (sin calcio/magnesio) que contenía TWEEN® 20 (20%); 0.150 ml/pozo. Se llevó a cabo luego un ensayo radiológico de enlazamiento en solución salina amortiguada con fosfato que contenía albúmina de suero bovino al 0,2% durante 2 horas a 37° C. Utilizando RAGE soluble de longitud completa marcado en forma radioactiva (125I; utilizando Iodogen (PIERCE®)) (100 nM; actividad específica

7.000 -8.000 cpm/ng) en presencia o en ausencia de RAGE soluble no marcado (exceso molar 50X) o el exceso molar indicado de dominio o de péptido. Se eluyeron luego los pozos después de lavar como anteriormente con amortiguador que contenía NP -40 (1%) y NaCl (0.15 M). Se hizo un recuento luego del material recuperado en un contador gamma (LKB®). En experimentos con péptido beta amiloide, se cargó péptido beta amiloide 1 -42 (5 µg) sobre los pozos de una placa Maxisorp NUNC® en amortiguador de bicarbonato de sodio/carbonato de sodio (pH 9.8) durante la noche a 4°C. La mañana siguiente, se aspiraron los pozos y se bloqueo con solución salina amortiguada con fosfato (con calcio/magnesio) que contenía albúmina de suero bovino (1%) por dos horas a 37° C. Se llevó a cabo luego un ensayo de enlazamiento en solución salina amortiguada con fosfato que contenía albúmina de suero bovino al 0.2% durante 2 horas a 37° C utilizando RAGE soluble de longitud completa marcado en forma radioactiva (125I; utilizando Iodogen (PIERCE®)) 950 nM; actividad específica 7.000 -8.000 cpm/ng) en presencia o en ausencia de RAGE soluble no marcado (exceso molar indicado más abajo) o el exceso molar indicado de dominio o de péptido. Se eluyeron luego los pozos después de lavar como anteriormente con amortiguador que contenía NP -40 (1%) y NaCl

(0.15 M). Se hizo un recuento luego del material recuperado en un contador gamma como anteriormente.

RESULTADOS

Interacción de los AGE con sRAGE. Los primeros experimentos buscaron determinar cuál de los tres dominios extracelulares que contiene sRAGE interactuó con los AGE. Los ensayos de enlazamiento de ligandos radioactivos revelaron que aunque el RAGE soluble no marcado (de longitud completa) compitió por el enlazamiento de sRAGE marcado en forma radioactiva con AGE inmovilizado en un 83%, el dominio V no marcado compitió en un 89%, mientras que los dominios C1 y C2 se quedaron sin efecto (competición del 30% y 19%, respectivamente), cuando todos los competidores no marcados fueron utilizados en un exceso molar de 50 veces (Tabla 1). Estos datos indicaron que únicamente el dominio V pareció mediar la interacción con los AGE. Estos efectos del dominio V no marcado eran dependientes de la dosis; con un exceso molar de 100 veces se observó una competición del 80%. Esta se redujo hasta un 53% con un exceso molar de 12,5 veces y hasta no competición (0) con un exceso molar de 1,56 veces del dominio V no marcado (Tabla II). Se preparó luego una serie de péptidos que incluían porciones diferentes del dominio V de sRAGE. Estos datos indicaron que con un exceso molar de 50 veces, no se obtuvo esencialmente competición utilizando los siguientes péptidos (péptidos que consisten de los números de los aminoácidos de sRAGE: 1 -13, 18 -28, 31 -60, y 46 -60; Tabla III). Se utilizaron también péptidos de control de los dominios C1 y C2 (péptidos que consisten de los números de los aminoácidos de sRAGE: 157 -169 y 270 -281, respectivamente) que no tuvieron efecto (Tabla III). Sin embargo, los péptidos que consisten de los aminoácidos números 1 -30 y 16 -30 del dominio V no inhibieron el enlazamiento de sRAGE marcado en forma radioactiva con AGE inmovilizado. Con un exceso molar de 50 veces, el péptido que consiste de los aminoácidos números 1 -30 de sRAGE inhibió el enlazamiento en un 78%, con un exceso molar de 25 veces, el péptido que consiste de los aminoácidos números 1 -30 de sRAGE inhibió el enlazamiento en un 76% y con un exceso molar de 1 vez no hubo competición (0) (Tabla III). Con un exceso molar de 50 veces, un péptido que consiste de los aminoácidos números 16 -30 de sRAGE inhibió el enlazamiento de sRAGE marcado en forma radioactiva con AGE inmovilizado en un 73%, con un exceso molar de 25 veces, a péptido que consiste de los aminoácidos 16 -30 de sRAGE inhibió el enlazamiento en un 20% y con un exceso molar de 1 vez, no hubo competición (Tabla III). Se prepararon luego péptidos más pequeños (péptidos que consisten de los aminoácidos números 1 -25 y 10 -25 de sRAGE en un esfuerzo por delinear más el sitio preciso de enlazamiento. Incluso con un exceso molar de 50 veces, un péptido no marcado que consiste de los aminoácidos números 1 -25 de sRAGE únicamente inhibieron el enlazamiento de sRAGE marcado en forma radioactiva con AGE inmovilizado en un 31% y un péptido no marcado que consiste de los aminoácidos números 10 -25 de sRAGE únicamente tuvieron un efecto competitivo del 26% (Tabla III). Estos datos sugieren que el péptido que consiste de los aminoácidos números 1 -30 de sRAGE es un competidor efectivo del enlazamiento de sRAGE con AGE inmovilizado.

Interacción del péptido beta amiloide con sRAGE. Se determinó primero cuál de los tres dominios extracelulares que contenía sRAGE interactuó con el péptido beta amiloide. Los ensayos de enlazamiento de un ligando marcado en forma radioactiva revelaron que mientras RAGE soluble no marcado en forma radioactiva (longitud completa) compitió por el enlazamiento de sRAGE marcado en forma radioactiva con péptido beta amiloide inmovilizado en un 80%, el domino V no marcado compitió en un 71,4%, mientras que los dominios C1 y C2 se quedaron sin efecto (competición del 15,2% y 21,4%, respectivamente), cuando todos los competidores no marcados fueron utilizados en un exceso molar de 100 veces (Tabla IV). Estos datos indicaron que únicamente el dominio V pareció mediar la interacción con el péptido beta amiloide. Estos efectos del dominio V no marcado eran dependientes de la dosis; con un exceso molar de 100 veces, se observó una competición del 72,5%. Con un exceso molar de 50 veces, se observó una competición del 41,4%. Esta se redujo a un 34% con un exceso molar de 25 veces y hasta una competición insignificante (3,9%) con un exceso molar de 10 veces del dominio V no marcado (Tabla V). Se prepararon luego una serie de péptidos que incluían diferentes porciones del dominio V de sRAGE. Estos datos indican que con un exceso molar de 100 veces, no se obtuvo esencialmente competición utilizando péptidos que consisten de los siguientes aminoácidos de sRAGE: 1 -13, 18 -28, 31 -60, y 46 -60 (Tabla VI). Se utilizaron también péptidos de control de los dominios C1 y C2 (péptidos que consisten de los aminoácidos números 157 -169 y 270 -281 de sRAGE, respectivamente) que no tuvieron efecto (Tabla VI).Sin embargo, los péptidos que contenían de 1 -30 del dominio V no inhibieron el enlazamiento de sRAGE marcado en forma radioactiva con AGE inmovilizado en un 29,7% (Tabla VI). Se prepararon luego péptidos más pequeños (aminoácidos números 1 -25 de sRAGE) y (aminoácidos números 10 25 de sRAGE) en un esfuerzo por delinear más el sitio preciso de enlazamiento. Incluso con un exceso molar de 100 veces, el péptido no marcado que consiste de los aminoácidos números 1 -25 de sRAGE únicamente inhibió el enlazamiento de sRAGE marcado en forma radioactiva con el péptido beta amiloide inmovilizado en un 5% y 10 -25 no marcados tuvieron únicamente un efecto competitivo del 18% (Tabla VI). Estos datos sugieren que un péptido que consiste de los aminoácidos números 1 -30 de sRAGE es un competidor efectivo del enlazamiento de sRAGE con el péptido beta amiloide inmovilizado (1 -42).

DISCUSIÓN

La interacción de los AGE o del péptido beta amiloide con RAGE sobre las superficies de las células probablemente son contribuyentes importantes para el desarrollo de complicaciones en trastornos en los cuales se acumulan los AGE, tales como diabetes, retinopatía, neuropatía vascular periférica, impotencia masculina, pérdida de la memoria por senilidad o enfermedad de Alzheimer, respectivamente. Soluble o sRAGE, dos terceras partes de RAGE extracelular, por medio del bloqueo de estos efectos en modelos in vitro e in vivo, incluyendo aquellos de complicaciones diabéticas crónicas, pueden tener implicaciones importantes como objetivo para el desarrollo de fármacos para estos trastornos.

El dominio V de sRAGE ha demostrado que media interacciones de sRAGE de longitud completa con los AGE o el péptido beta amiloide en una forma dependiente de la dosis. Además, los primeros 30 aminoácidos del dominio V contienen secuencias involucradas en la mediación de estas interacciones. Es probable, sin embargo, que no todos los aminoácidos presentes dentro de los aminoácidos 1 -30 de sRAGE sean necesarios para este enlazamiento. También es posible que un pequeño número de aminoácidos más allá de los primeros 30 aminoácidos de sRAGE (es decir, del dominio V) incluyan un sitio de interacción para AGE o ligandos beta amiloideos. La presente invención suministra compuestos y composiciones que incluirían polipéptidos que contienen tales aminoácidos como se discutió aquí anteriormente.

Una revisión de las secuencias obtenidas del GenBank de los primeros 30 aminoácidos del dominio V entre especie humana, ratón, rata y bovino revela una homología notable (Tabla VII). Por ejemplo, de los primeros 10 aminoácidos del dominio V, existe identidad completa entre las especies en los residuos aminoácidos 2 -9 (8 de los primeros 10 aminoácidos). De los siguientes 10

29 aminoácidos del dominio V (11 -20), existe identidad entre las especies en 7 de los 10 aminoácidos incluidos los aminoácidos 11, 12, 14, 16, 17, 19 y 20. De los aminoácidos 21 -30 del dominio V, existe identidad entre las cuatro especies en 8 de los 10 aminoácidos incluidos los aminoácidos 21, 22, 23, 25, 27, 28, 29 y 30. 5 En general, por lo tanto, existe una identidad de aminoácidos del 76% entre las cuatro especies analizadas hasta el momento. Estos datos son consistentes con el concepto de que las secuencias críticas para el enlazamiento de las AGE o el péptido beta amiloide con sRAGE pueden estar contenidas dentro de los primeros 30 aminoácidos del dominio V. Tomados en conjunto, estos datos indican que los primeros 30 aminoácidos del dominio V 10 son importantes en la medición de la interacción de sRAGE ya sea con los AGE o con el péptido beta amiloide. Esto sugiere que la región del dominio V es probablemente un objetivo importante para el desarrollo de fármacos diseñados para tratar trastornos en los cuales se acumulan los AGE, tal como en complicaciones diabéticas, envejecimiento, falla renal, amiloidosis, retinopatía, neuropatía vascular periférica, impotencia masculina, pérdida de la memoria por senilidad y enfermedad de Alzheimer. 15 Tabla I. El dominio V de sRAGE media la interacción con los AGE. Los ensayos de enlazamiento fueron realizados como se describió anteriormente; el sRAGE marcado en forma radioactiva se enlazó con AGE inmovilizado en la presencia o en ausencia del exceso molar indicado del competidor no marcado. En estos ensayos, por lo tanto, entre más cercano el valor a 100%, más efectivo es un competidor al enlazamiento de sRAGE marcado en forma radioactiva con AGE inmovilizado.

Competidor no marcado Veces de exceso molar % de competición/125I-sRAGE

longitud completa sRAGE 50 83% dominio V 50 89 C1 50 30 C2 50 19

20 Tabla II. El dominio V inhibe el enlazamiento de sRAGE marcado en forma radioactiva con AGE inmovilizado en una forma dependiente de la dosis. Se realizaron ensayos de enlazamiento como se describió anteriormente, sRAGE marcado en forma radioactiva se enlazó con AGE inmovilizado en presencia de los excesos molares indicados del dominio V. Competidor no marcado Veces de exceso molar % de competición/125I-sRAGE

Dominio V 100 80 Dominio V 50 86 Dominio V 25 76 Dominio V 12,5 53 Dominio V 6,25 28 Dominio V 3,12 16 Dominio V 1,56 0

Tabla III. Los primeros 30 aminoácidos del Dominio V de sRAGE median la interacción con los 25 AGE. Se realizaron ensayos de enlazamiento como se describió anteriormente; sRAGE marcado en forma radioactiva se enlazó con AGE inmovilizado en presencia de los excesos molares indicados de péptido no marcado.

Péptido/Dominio V[aminoácidos #s] Veces de exceso molar % de competición/125I-sRAGE

1 -30 100 77 50 78 25 76

1 0

1 -25 50 31 25 24 10

10 -25 50 26 25 17 10

16 -30 100 69 50 73 25 20 10

31 -60 100 25 50 11 25 0 10

46 -60 100 0 50 0 25 0 10

1 -13 100 0 50 0 25 0 10

18-28 100 0 50 0 25 0 10

157 -169 100 3 50 0 25 0 10

270 -281 100 0 50 0 25 0 10

Tabla IV. El Dominio V de sRAGE media la interacción con péptido beta amiloide. Se realizaron ensayos de enlazamiento como se describió anteriormente; sRAGE marcado en forma radioactiva se enlazó con péptido beta amiloide inmovilizado en presencia o en ausencia de los excesos molares indicados de competidor no marcado. En estos ensayos, por lo tanto, entre más cerca el valor a 100%, más efectivo un competidor del enlazamiento de sRAGE marcado en forma radiactiva con péptido beta amiloide inmovilizado.

Competidor no marcado Veces de exceso molar % de competición/125I-sRAGE

sRAGE de longitud completa 100 80% Dominio V 100 71,5

31 Dominio C1 100 15,2 Dominio C2 100 21,4

Tabla V. El dominio V inhibe el enlazamiento de sRAGE marcado en forma radioactiva con el péptido beta amiloide inmovilizado en una forma que depende de la dosis. Los ensayos de enlazamiento fueron realizados como se describió anteriormente; sRAGE marcado en forma radioactiva se enlazó con péptido beta amiloide inmovilizado en presencia del exceso molar indicado del dominio V no marcado.

Competidor no marcado Veces de exceso molar % de competición/125I-sRAGE

Dominio V: 100 72,5

Dominio V: 50 41,4

Dominio V: 25 34

Dominio V: 10 3,9

Tabla VI. Los primeros 30 aminoácidos del Dominio V de sRAGE median la interacción con el péptido beta amiloide. Los ensayos de enlazamiento fueron realizados como se describió anteriormente; sRAGE marcado en forma radioactiva se enlazó con péptido beta amiloide inmovilizado en presencia del exceso molar indicado del péptido no marcado.

Aminoácido competidor no Veces de exceso molar % de competición/125I-sRAGE marcado #

1-30 100 55 16 -30 100 29,7 1-25 100 5 10-25 100 18 31-60 100 2,6 46-60 100 0 1-13 100 0 18-28 100 27 157-167 100 0 270-281 100 0

10 Tabla VII. Comparación de los Primeros 30 Aminoácidos del dominio V de sRAGE entre las

especies humana, de múrido, rata y bovino. La secuencia de aminoácidos de los primeros 30 aminoácidos del dominio V están indicados para las cuatro especies indicadas. La letra indica los aminoácidos de la siguiente manera: A, ala; C, cys; D, asp; E, glu; F, phe, G, gly; H his; I, ile; K, lys; L, leu; M, met; N, asn; P, pro; Q, gln; R, arg; S, ser; T, thr; V, val; W, trp; y Y, tyr.

1 -10

Humano AQN I TAR I GE Ratón GQN I TAR I GE Rata GQNITARIGK Bovino DQN I TAR I GK

11 -20

Humano P LVLKCKGAP Ratón P LVL S CKGAP Rata PLMLSCKAAP

11 -20

vid PLVLNCKGAP

32

21 -30

Humano: K K P P Q R L E W K

Ratón: K K P P Q Q L E W K

Rata: K K P T Q K L E W K

Bovino: K K P P Q Q L E W K

Ejemplo 2 : sRAGE Suprime la Enfermedad Periodontal Acelerada en Ratones Diabéticos. Se estudiaron un modelo de enfermedad periodontal acelerada en ratones diabéticos y los efectos de sRAGE. Se muestra la eficacia de sRAGE en diabéticos (ratones C57BL6/J con estreptozotocina). La administración de RAGE soluble (forma extracelular de longitud completa de

5 aproximadamente 40 kDa) inhibe la pérdida acelerada de hueso alveolar, que es el sello distintivo de la enfermedad periodontal. La inyección intraperitoneal de RAGE soluble suprime la pérdida de hueso en ratones diabéticos (db+/db+).

La administración de (s) RAGE Soluble suprime la pérdida de hueso alveolar en un modelo de 10 múrido de la enfermedad periodontal acelerada en diabetes.

Se indujo diabetes en ratones C57BL6/J por medio de la administración de estreptozotocina. Se definió la diabetes como dos mediciones seriales de glucosa en suero ≥ 300 mg/dl. Alternativamente, se trató un número igual de ratones con vehículo para estreptozotocina, solución salina amortiguada con fosfato. Un mes después de la inducción de diabetes, se trataron los ratones

15 cada día durante cuatro días consecutivos con administración oral/anal del patógeno periodontal humano, Porphyromonas gingivalis (Pg) o vehículo, solución salina amortiguada con fosfato. Dos meses después, se sacrificaron y decapitaron los ratones. Se aislaron las mandíbulas y, bajo un microscopio de disección (Olympus), y utilizando pinzas curvas de microdisección (2 ¾ pulgadas, 0,6 mm de ancho) y un bisturí con una hoja No. 15C, se hizo disección del tejido gingival lingual del área

20 posterior de cada cuadrante. Comenzando con una incisión en surco horizontal en el margen gingival de los dientes posteriores, se reflejó la gingiva (espesor completo) con la hoja del bisturí. Se hicieron incisiones verticales de liberación y se removió el tejido (separando el tejido con una incisión horizontal justo por debajo de la unión mucogingival). Se colocó luego el tejido en formalina (10%) para análisis adicionales.

25 Después de los procedimientos anteriores, se expusieron las mandíbulas a KOH (2%) durante tres días y luego se las descarnó mecánicamente. Se embebieron luego las mandíbulas (exposición de las superficies linguales de cada 1/2 mandíbula) en masilla de laboratorio. Con el propósito de remover la angulación como una variable, se superpusieron las cúspides bucal y lingual de los dientes posteriores en 1/2 mandíbula durante la imbibición y visto desde la superficie lingual previo a la

30 fotografía. Las mandíbulas descarnadas fueron fotografiadas utilizando el microscopio amplificador de disección y película Ektachrome® 160T (diapositivas en color). Estas diapositivas, con un aumento de 40X, se ampliaron adicionalmente a continuación 4X. Las imágenes fueron luego calcadas sobre papel calcante estándar. Para cada ratón, se midió un área total de la distancia entre la unión cemento -esmalte (CEJ) y la cresta ósea alveolar (BC) para un total

35 de dientes 6 posteriores por medio del escaneo del calco en un ordenador/escáner Macintosh® y se analizaron las imágenes utilizando el programa NIH Image 157® (junto con el programa de fotografía de Adobe Photoshop®). Se reporta el área total (en unidades arbitrarias de pixel) para cada ratón (6 dientes) como se indica en la Figura 1. Se llevó a cabo un análisis estadístico utilizando un análisis de varianza en un solo sentido. A los dos meses, se observó un incremento significativo de 1,55 veces en

40 la pérdida de hueso alveolar en ratones diabéticos comparado con controles no diabéticos (ver los

33 datos específicos más adelante). Se observaron resultados similares en ratones db+/db+ (diabéticos genéticamente/resistentes a la insulina) un mes después de la infección con Pg comparable con controles no diabéticos (m+/db+). Con el propósito de analizar si la administración de sRAGE mejoraría la pérdida de hueso alveolar en ratones C57BL6/J tratados con Pg, ciertos ratones diabéticos fueron tratados con sRAGE (MSR; ya sea con 35 µg de IP/día durante dos meses o 3,5 µg IP/día durante dos meses). Los ratones diabéticos de control fueron tratados con concentraciones equimolares de albúmina de suero de ratón (70 µg IP/día durante dos meses). Todos los ratones fueron tratados con Pg. Al final de ese tiempo, se hicieron mediciones de la pérdida de hueso alveolar. Los resultados son los siguientes:

Condición Pérdida de hueso alveolar (CEJ con BC alveolar)

(I): Diabético / albúmina 6,222 ± 406 pixeles (SD)

(II): No diabético / albúmina 4,018 ± 501 pixeles (SD)

(III) Diabético / MSR (35 µg/día) 5,242 ± 463 pixeles (SD)

(IV) Diabético / MSR (3.5 µg/día) 6,198 ± 427 pixeles (SD)

10 Muchas complicaciones diabéticas pueden resultar de la interacción de los AGE con RAGE para provocar perturbación celular. AGE actúa como un ligando para el dominio V de RAGE para mediar tal perturbación celular. Esta invención proporciona un método para inhibir la perturbación celular en un individuo asociada con una condición diabética que comprende la administración al individuo de una cantidad de un inhibidor de la interacción de los AGE con RAGE sobre la superficie

15 de una célula efectiva para inhibir la interacción e inhibir por lo tanto la perturbación celular en el individuo y tratar la condición diabética. AGE (productos finales de glicación avanzada) son un grupo heterogéneo de compuestos. Un(os) compuesto(s) del AGE patógenos individuales o específicos están siendo identificados. Los ejemplos de los AGE incluyen pero no se limitan a: pentosidina (sola o una modificación enlazada a la

20 proteína); carboximetillisina (sola o una modificación enlazada a la proteína); carboxietillisina (sola o una modificación enlazada a la proteína); piralinas (sola o una modificación enlazada a la proteína); metilglioxal (sola o una modificación enlazada a la proteína) y etilglioxal (sola o una modificación enlazada a la proteína). Uno de estos AGE puede ser un ligando patógeno para una perturbación celular específica debida a una interacción del AGE con el dominio V de RAGE. Esta interacción

25 puede ser un factor contribuyente crítico en muchas complicaciones asociadas con diabetes. Esta invención proporciona inhibidores de tal interacción que pueden ser administrados a individuos con complicaciones diabéticas.

Las células que pueden ser activadas por este enlazamiento de los AGE con RAGE sobre la superficie de la célula incluyen células endoteliales, células de músculo liso vascular, células 30 neuronales, macrófagos, linfocitos, células vasculares de la retina, células neuronales de la retina, células mesangiales y células de tejido conector y células asociadas con tejido conectivo tal como células asociadas con gingiva y piel. Las células que pueden ser activadas por este enlazamiento de los AGE con RAGE no se limitan a esta lista sino que pueden incluir otras células presentes en un cuerpo humano. La presente invención proporciona compuestos y composiciones que pueden ser útiles en la

35 inhibición de esta interacción, mejorando así la perturbación celular y en última instancia los síntomas asociados con diabetes. Las perturbaciones celulares en aquellas células que sRAGE, u otros péptidos o agentes suministrados por la presente invención incluyen pero no se limitan a: estrés oxidante, hiperpermeabilidad, expresión mejorada de moléculas de adhesión tales como la Molécula -1 de

40 Adhesión Celular Vascular; expresión mejorada del factor tisular; quimiotaxis y activación mejoradas

de macrófagos, tal como con una mayor producción de citoquinas y factores de crecimiento; mejor migración de células de músculo liso, activación de células de músculo liso, estrés oxidante neuronal y apoptosis. Los productos finales de glicación avanzada (AGE) son el resultado irreversible de glicación no enzimática y oxidación. Estos AGE se forman en la conexión con una cantidad de condiciones tales como: envejecimiento, diabetes, inflamación, falla renal, amiloidosis, e hiperlipidemia. Los AGE también se forman en conexión con otros estados de enfermedad y condiciones anormales que no están explícitamente enlistadas aquí pero que son abarcadas por la presente invención.

Ejemplo 3: Los agentes terapéuticos identificados a través de este medio in vitro, se demuestra que son efectivos in vivo para la inhibición de síntomas asociados con complicaciones diabéticas.

Se puede demostrar que el agente terapéutico identificado es efectivo en la cicatrización de heridas. En los experimentos de cicatrización de heridas, se utilizaría la segunda intención del modelo de heridas en ratones genéticamente diabéticos. El agente (o péptido o composición farmacéutica) se aplica en forma tópica al área lesionada, y se mide el cierre de heridas (cambio en el área lesionada), epitelialización y otros índices histológicos (tal como producción de colágeno, producción de matriz extracelular, fibrina, etc.). Cada una de estas mediciones son índices de la efectividad del agente sobre el aumento de cicatrización de las heridas.

En enfermedad periodontal, se utilizan ratones genéticamente diabéticos y tratados con estreptozotocina como sistemas de modelo animal para examinar la pérdida de hueso después de tratamiento con péptidos que tienen la secuencia de la Seq I.D. No. 1. La pérdida de hueso se mide cuantitativamente a través de métodos histológicos y determinación del área geométrica. Se administra localmente el péptido de la Seq. ID No. 1, el péptido del dominio V, el agente o la composición farmacéutica (por ejemplo "pintando" el agente) y/o sistémicamente. La reducción en pérdida de hueso es una indicación de un agente efectivo.

En aterosclerosis acelerada, se emplean ratones “genéticamente desactivados” apo E tratados con estreptozotocina sobre una dieta normal de comida como modelos animales de esta condición enfermiza. Se administra el agente (o el péptido o la composición farmacéutica) en forma sistémica, y se reúnen los datos cuantitativos midiendo el área de la lesión en los animales después del tratamiento. Estos datos dan una indicación de la efectividad de cada agente. Entre más pequeña el área de la lesión comparada con controles no tratados, más efectivo el agente.

En impotencia diabética, se emplea un modelo de rata con animales tratados con estreptozotocina en los cuales se monitorean las erecciones después de la administración de apomorfina. Se mide el número y frecuencia de las erecciones en presencia y en ausencia del agente se comparan esos datos para evaluar la efectividad del agente para inhibir los síntomas de la impotencia.

En retinopatía diabética, se utilizan modelos diabéticos de rata y de ratón como sistemas de modelo animal para medir los cambios en el flujo sanguíneo y patología de la retina. Nuevamente, se administra el agente (o el péptido o la composición farmacéutica) en forma sistémica, y se reúnen los datos cuantitativos por medio del flujo sanguíneo y se reúnen los datos cuantitativos examinando la patología de la retina en los animales después del tratamiento.

En nefropatía diabética, se emplean modelos de ratones diabéticos y de ratas como modelos animales de nefropatía diabética. Se miden los cambios en la tasa de filtración glomerular y flujo sanguíneo renal en animales que recibieron un agente terapéutico y se midió en animales que recibieron un placebo. Además, se determina la aparición de proteína en la orina y los cambios histológicos en los glomérulos en cada animal. Se evalúa la efectividad del agente con base en estas mediciones en la inhibición de la nefropatía diabética.

35 En neuropatía diabética, se utilizan ratones genéticamente diabéticos como modelo animal para la determinación de la efectividad del agente de la presente invención. Se tratan los ratones con el compuesto en forma sistémica. Se observan luego los ratones para determinar cambios en la velocidad de la conducción nerviosa y cambios en el número de fibras nerviosas periféricas con mielina. La comparación de esos datos con mediciones equivalentes determinadas en un animal no tratado darán una indicación de la efectividad del agente de la presente invención.

REFERENCIAS

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36 Koh, J -Y., y colaboradores. (1990) Brain Res. 533: 315 -320; Koo, E., y colaboradores. (1993) PNAS (USA) 90: 4748 -4752; Kosik, K. (1994) J. Cell. Biol. 127: 1501 -1504; Lander, H. L., Tauras, J. M., Ogiste, J. S., Moss, R. A., y A. M. Schmidt. Activation of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts triggers a MAP Kinase pathway regulated by oxidant stress. J. Biol. Chem. 272: 17810 -17814, 1997; Lerner y colaboradores, Cell, 23, 309 -310 (1981); Lerner, Scientific American, 248, 66 -74 (1983); Loo, D., y colaboradores. (1993) PNAS (USA) 90: 7951 -7955; Manson J. E. y colaboradores. A prospective study of maturity-onset diabetes mellitus and risk of coronary heart disease and stroke in women. Arch. Of. Int. Med. 151: 1141 -1137, 1991; Meda, L., y colaboradores. (1995) Nature 374, 647 -650; Mitsuhashi, M., y colaboradores. (1991) Mol. Brain. Rs. 11: 177 -180; Miyata, T., O. Hori, J. H. Zhang, S. D. Yan, L. Ferran, Y. Iida, y A. M. Schmidt. The Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE) mediates the interaction of AGE-β2-Microglobulin with human mononuclear phagocytes via an oxidant-sensitive pathway: implications for the pathogenesis of dialysis-related amyloidoses. J. Clin. Invest. 98: 1088 -1094, 1996; Neeper, M., Schmidt, A. M., Brett, J., Yan, S. D., Wang, F., Pan, Y.C., Elliston, K., Stern, D., y Shaw, A. Cloning and expression of RAGE: a célula surface receptor for advanced glycosylation end products of proteins. J. Biol. Chem. 267: 14998 -15004, 1992; Park, L., Raman, K. G., Lee, K. J., Lu, Y., Ginsberg, M. D., Ferran, L., Stern, D. y Schmidt, A. M. A murine model of accelerated diabetic atherosclerosis: suppression by soluble receptor for advanced glycation endproducts. Circulation Supplement, 1997; Pike, C., y colaboradores. (1993) Neurosci. 13: 1676 -1687; Porte y Schwartz. Diabetes Complications: Why is Glucose Potentially Toxic? Science 272: 699 700 (1996); Pyorala K M, M Laasko y M Uusitupa. Diabetes and atherosclerosis: an epidemiologic view. Diab. Metab. Rev. 3: 463 -524, 1987; Robertson W B y J B Strong. Atherosclerosis in persons with hypertension and diabetes mellitus. Lab. Invest. 18: 538 -551, 1968; Ross y colaboradores, Nature, 294, 654 -658 (1981); Ruderman, N., Williamson, J., y Brownlee, M. Glucose and diabetic vascular disease. FASEB J. 6: 2905 -2914, 1992; Schmidt, A. M., O. Hori, J. Chen, J. F. Li, J. Crandall, J. Zhang, R. Cao, S. D. Yan, J. Brett y D. Stern. Advanced glycation endproducts interacting with their endothelial receptor induce expression of vascular célula adhesion molecule-1 (VCAM-1): a potential mechanism for the accelerated vasculopathy of diabetes. J. Clin. Invest. 96: 1395 -1403, 1995; Schmidt, A. M., Yan, S. D., Brett, J., Mora, R., and Stern, D. Regulation of mononuclear phagocyte migration by célula surface binding proteins for advanced glycosylation endproducts. J. Clin. Invest. 92: 2155 -2168, 1993; Schmidt, A. M., Hasu, M., Popov, D., Zhang, J. H., Yan, S. D., Brett, J., Cao, R., Kuwabara, K., Costache, G., Simionescu, N., Simonescu, M., y Stern, D. The receptor for Advanced Glycation Endproducts (AGEs) has a central role in vessel wall interactions and gene activation in response to AGEs in the intravascular space. PNAS (USA) 91: 8807 -8811, 1994;

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

(i): SOLICITANTE: Los Síndicos de la Universidad de Columbia en la ciudad de Nueva York

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Sitio de Enlazamiento del Ligando de Rage y Usos del Mismo

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

(iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

(A): DESTINATARIO: Cooper & Dunham

(B): DIRECCIÓN: 1185 Avenue of the Americas

(C): CIUDAD: New York

(D): ESTADO: New York

(E): PAÍS: EUA

(F): ZIP: 10036 5 (v) FORMA QUE PUEDE SER LEIDA POR EL ORDENADOR:

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

(B): ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D): SOFTWARE: Lanzamiento de PatentIn #1.0, Versión #1.30 10 (vi) DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

(A): SOLICITUD INTERNACIONAL NÚMERO: NO SE CONOCE AÚN

(B): FECHA DE LA PRESENTACIÓN INTERNACIONAL: ADJUNTA

(C): CLASIFICACIÓN:

(viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE: 15 (A) NOMBRE: White, John P

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 28.678

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 53447

(ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

(A): TELÉFONO: 212-278-0400 20 (B) TELEFAX: 212-391-0526

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 30 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido 25 (C) CADENA: una sola

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

imagen1

30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C) CADENA: una sola 35 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

imagen1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): CADENA: una sola

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): CADENA: una sola

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

imagen2

imagen1

20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C) CADENA: una sola 25 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

imagen1

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

• US 08948131 B [0001] • WO 8304053 A, Alton et aloe [0054]

Literatura citada en la descripción que no es de patente

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Claims

1.: Un péptido enlazado a un anticuerpo o a una porción de un anticuerpo, en donde el péptido es un fragmento de sRAGE que comprende los aminoácidos 1 -30 del dominio V de sRAGE de ocurrencia natural, y en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab o un fragmento Fc.

2.: El péptido enlazado a un anticuerpo o a una porción de un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el péptido comprende un dominio “V” de sRAGE de ocurrencia natural.

3.: El péptido enlazado a un anticuerpo o a una porción de un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el sRAGE es un sRAGE humano, de ratón, de rata o de bovino.

4.: El péptido de la reivindicación 1, en donde el péptido está enlazado a un anticuerpo.

5.: El péptido de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

6.: El péptido de la reivindicación 1, en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fab.

7.: El péptido de la reivindicación 1, en donde la porción del anticuerpo es un fragmento Fc.

8.: Una composición farmacéutica que contiene el péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 y un portador farmacéuticamente aceptable.

9.: La composición farmacéutica de la reivindicación 8, en donde el portador es un diluyente, un aerosol, un portador tópico, una solución acuosa, una solución no acuosa, un polímero o un portador sólido.

10.: La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en donde el portador es una solución acuosa.

11.: El péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 para inhibir una interacción entre el péptido beta amiloide y un receptor el producto final de glicación avanzada sobre la superficie de una célula en un individuo.

12.: El péptido de la reivindicación 11 para inhibir dicha interacción, en donde la célula es una célula neuronal, una célula endotelial, una célula glial, una célula microglial, una célula de músculo liso, una célula somática, una célula de médula ósea, una célula de hígado, una célula intestinal, una célula germinal, un miocito, un fagocito mononuclear, una célula tumoral, una linfocito, una célula mesangial, una célula epitelial de la retina, una célula vascular de la retina, una célula ganglionar o una célula madre.

13.: El péptido de la reivindicación 11 para inhibir dicha interacción, en donde la célula es una célula normal, una célula activada, una célula neoplásica, una célula enferma, o una célula infectada.

14.: El péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 para inhibir:

(a): la degeneración de una célula neuronal;

(b): la formación de una fibrilla de péptido beta amiloide sobre una célula:

(c): la disposición extracelular de un péptido beta amiloide en una fibrilla;

(d): la agregación de péptido beta amiloide sobre la superficie de una célula;

(e): la infiltración de una célula microglial en placas seniles;

(f): la activación de una célula microglial por medio de un péptido beta amiloide; o

(g): la activación de u gen NF-κB en una célula en un individuo.

15.: El péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 para tratar un individuo con una condición enfermiza asociada con una interacción entre péptido beta amiloide y un receptor para un producto final de glicación avanzada sobre la superficie de una célula en un individuo, en donde la condición enfermiza es diabetes, enfermedad de Alzheimer, senilidad,

falla renal, aterosclerosis hiperlipidémica, citotoxicidad neuronal, síndrome de Down, demencia asociada con un traumatismo craneal, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, amiloidosis, una enfermedad autoinmune, inflamación, un tumor, cáncer, impotencia masculina, cicatrización de heridas, enfermedad periodontal, neuropatía, retinopatía, nefropatía o degeneración neuronal.

16.: El péptido de la reivindicación 15, en donde la condición enfermiza está asociada con degeneración de una célula neuronal.

17.: El péptido de la reivindicación 15, en donde la condición enfermiza está asociada con la activación de una célula microglial por medio de un péptido beta amiloide.