KR101595630B1

KR101595630B1 - Rage 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제, 및 이를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101595630B1
Application number: KR1020130168662A
Authority: KR
Inventors: 최철용; 김선직; 김영호; 홍현석
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2016-02-18
Also published as: KR20140093596A

Abstract

본 발명은 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제, 및 이를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 RAGE 단백질 V-domain 유래 펩티드 및 이를 표적으로 하는 펩티드, 화합물 또는 항체는 RAGE 단백질에 길항작용을 함으로써, 베타아밀로이드 집적에 의해 유발되는 질환인 치매, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 아밀로이드심근병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, AA 아밀로이드증(amyloid-associated amyloidosis) 및 AL 아밀로이드증(amyloid-light chain amyloidosis) 등의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 뿐 아니라, 본 발명에서 확인된 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 상호작용 부위는 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제 스크리닝 방법에도 유용하게 이용될 수 있다.

Description

RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제, 및 이를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{RAGE protein-beta amyloid interaction inhibitor, and pharmaceutical composition for preventing or treating diseases associated with beta amyloid accumulation containing the same as an active ingredient}

본 발명은 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 부위를 표적으로 하는 펩티드, 항체, 및 이를 모방한 저분자화합물을 포함한 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제, 이를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 상호작용부위를 이용한 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

노인성 치매의 대표적 질환인 알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 현재 미국에서만 450만 명 이상의 환자가 있으며, 전 세계적으로 65세 이상 인구 중 10% 이상의 유병률을 나타내는 퇴행성 신경질환이다. 치매로 분류되는 환자의 약 50% 정도가 알츠하이머 병으로 확진된다. 알츠하이머 병은 유전적인 원인에 의하여 나타나는 유전성 알츠하이머 병(familial AD, FAD)과 그 원인이 아직 명확하게 밝혀지지 않은 원발성 알츠하이머 병(sporadic AD, SAD)이 있으며, 유전성 알츠하이머 병은 전체 알츠하이머 병 환자 중에 1-5%에 그치고 있고 나머지는 모두 원발성 알츠하이머 병 환자들이다.

다국적 시장조사 기관인 디시전 리소시스 社(Decision Resources)는 미국 등 주요 7개국 치매 치료제 시장규모가 2007년 기준 30억 달러에서 2017년에는 90억 달러 수준까지 높아질 것이라고 전망하였다.

더욱이 현재까지 개발되고 있는 약재들을 포함해서 지금까지 나온 모든 약재들은 알츠하이머 병의 진행을 약간 늦출 수 있거나 알츠하이머 병에 의해 나타나는 증상에 대한 치료를 위해 개발된 약물이 대부분이다. 최근 20년 동안 인지능력 특히 병의 초기와 중기에 해당하는 환자들에서 나타나는 인지능력을 향상시킬 수 있는 약재들이 개발되었고, 이러한 약재들이 현재 알츠하이머 병에 걸려 있는 환자들의 일차적 치료 약물로 사용되고 있는 중이다.

현재 치매치료제로 시판중인 약물은 콜린성 가설(cholinergic hypothesis)에 근거하여 대부분은 기억 기능에 있어서 매우 중요한 화학 물질인 아세틸콜린의 분해를 억제하는 아세틸콜린에스테라제 저해제다. 이 약물은 2007년 기준 전체 치매치료제 시장의 70%를 차지하고 있다.

아세틸콜린에스테라제 저해제는 원인치료보다는 증상완화에 초점을 맞춘 약물로서, 타크린, 아리셉트, 엑셀론 등이 있다.

하기 화학식으로 나타낸 타크린은 최초로 FDA 공인을 받은 약물로서, 1933년에 개발되었다. 상기 타크린은 뇌에서 생성되는 아세틸콜린이 분해되는 것을 억제함으로써 약 30% 정도의 초기 및 중기에 알츠하이머 병 환자들의 인지기능의 소실을 늦출 수 있다고 알려져 있다. 타크린은 아세틸콜린의 분해를 억제함으로써 인지기능의 감소를 늦출 수 있는 것으로 알려져 있으나, 알츠하이머 병의 근본적 문제인 뇌 세포의 퇴행성 변화 자체를 막을 수 없을 뿐만 아니라 간과 관련된 부작용을 많이 일으키기 때문에 현재는 거의 사용되지 않는다.

또한, 1996년 미국 식품의약청(FDA)에서 승인받은 아리셉트(Aricept)는 아세틸콜린의 이용도를 높임으로써 작용하는 것으로 알려져 있다. 타크린과 동일하게 초기 및 중기의 알츠하이머 병에 걸려있는 일부 환자들에게서 인지 기능이 향상되는 것으로 밝혀졌으나, 상기 타크린과 아리셉트 모두 알츠하이머 병 자체를 멈추거나 개선시킬 수 없으며, 더욱이 얼마나 오랫동안 환자들이 이러한 약들을 복용해야 하는지 또 얼마나 오랫동안 효과가 있는지에 대해서는 아직 명확하지 않고, 또한, 콜린에스테라제의 억제로 인한 과도한 아세틸콜린의 증가로 심한 설사 및 구토, 요실금, 맥박의 변화, 위장의 통증 등의 부작용과 부교감신경을 항진시키는 부작용이 나타날 수 있는 것으로 알려져 있다.

이에, 알츠하이머의 증상을 약화시키는 약물이 아닌 알츠하이머 병의 근본적인 병 자체를 치료할 수 있도록 하는 약물의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

알츠하이머 병의 병리학적 특징으로는 베타아밀로이드 펩티드(amyloid-beta peptide, A)가 침착되어 나타나는 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)와, 미세소관(microtubule)을 안정화시키는 기능을 하는 타우(tau) 단백질이 과인산화(hyper-phosphorylation) 되어 서로 엉키어 형성되는 신경섬유 매듭(Neurofibrillary tangle)을 들 수 있다.

베타아밀로이드 펩티드는 아밀로이드베타 전구단백질(amyloid- precursor protein, APP)가 베타시크리테아제와 감마시크리테아제에 의해 잘려 생성되며, 정상인의 뇌에서는 그 수준이 일정하게 유지된다. 하지만 알츠하이머 병 환자에서는 과다 생성 또는 대사이상에 인한 베타아밀로이드 펩티드의 과다 축적으로 플라크가 생성된다. 베타아밀로이드 펩티드 및 플라그의 독성으로 인해 신경세포의 소실이 나타나게 되고, 이로 인하여 인지기능 장애 및 기억 장애를 유발하게 된다.

혈액-뇌 관문(blood-brain barrier, BBB)에는 베타아밀로이드 펩티드의 농도를 일정하게 유지시켜주는 조절 시스템이 존재하는데, 이 시스템은 RAGE(Receptor for advanced glycation end products; Deane R & Zlokovic BV et al., Nat. Med., 2009, vol 9, 907)와 LRP-1(Low density lipoprotein receptor-related protein-1; Zlokovic BV et al., Neuron, 2004, vol 43, 333; Deane R & Zlokovic BV et al., Stroke, 2004, vol 35, 2628) 단백질을 매개로 하여 그 평형을 유지하게 된다.

상기 진행성 당화 최종 생성물의 수용체(RAGE)는 면역 글로불린 상과에 속하는, 다중 리간드 세포 표면 구성원이다. RAGE는 세포 외 도메인, 단일 막-확장 도메인(membrane-spanning domain) 및 시토졸 미부로 이루어져 있다. 상기 수용체의 세포 외 도메인은 하나의 V형 면역 글로불린 도메인을 포함하고, 이 도메인에 이어서는 2개의 C형 면역 글로불린 도메인이 존재한다. RAGE는 또한 가용성 형태로서도 존재한다(sRAGE). RAGE는 다수의 상이한 조직 예를 들어, 폐, 심장, 신장, 골격근 및 뇌를 구성하는 다수의 세포 유형 예를 들어, 내피 세포 및 평활근 세포, 대식 세포 및 림프구에 의해 발현된다. 발현량은 만성 염증 상태 예를 들어, 류머티즘성 관절염과 당뇨병성 신증에서 증가한다. 비록 RAGE의 생리적 기능에 관하여는 별로 알려진 바가 없지만, 이는 염증 반응에 관여하며, 다양한 발생 과정 예를 들어, 근아세포 분화 과정 및 신경 발생 과정에 있어서 중요한 역할을 할 수 있는 것으로 파악된다.

RAGE와 리간드인 AGE에 연관된 질환으로는 신장병(nephropathy; Teillet et al., 2000, J. Am. Soc. Nephrol., 11:1488-1497), 혈관투과성 증가 (increased vascular permeability; Wautier et al., 1996, J. Clin. Invest., 97:238-243), 동맥경화증(atherosclerosis; Vlassara et al., 1996, The Finnish Medical Society DUODECIM. Ann. Med., 28:419-426), 망막병증(retinopathy; Hammes et al., 1999, Diabetologia, 42:603-607) 등을 포함하는 당뇨합병증 (diabetic late complications), 그리고 RAGE 단백질에 연관된 질환으로는 발기부전(erectile dysfunction), 신부전증 (kidney failure; D'Agati and Schmidt, 2010, Nat Rev Nephrol. 6:352-60), 낭창성 신염(lupus nephritis 또는 inflammatory lupus nephritis), 종양의 침투와 전이(tumor invasion and metastasis; Taguchi et al., 2000, Nature, 405:354-357), 그리고 염증(inflammation; Hoffman et al., 1999, Cell 97:889-901) 등이 알려져 있다.

RAGE에 대한 연구는 초기에는 당뇨병에서의 중요성이 부각되면서 진행되었다. 그러나, 알츠하이머 병의 가장 중요한 원인 단백질인 베타아밀로이드 펩티드가 RAGE의 리간드라는 연구결과가 발표되면서 알츠하이머 병과의 연관성을 밝히고자 연구가 시작되었고, RAGE는 정상 조건 하에서는 뇌에 낮은 농도로 존재하지만 진행성 당화 최종 생성물(AGE) 또는 Aβ와 같은 단백질이 당화(glycation)나 산화작용에 의해 변형되어 혈관 내에 축적되면(예를 들면 AD) 뇌혈관, 신경세포, 미세아교세포(microglia) 등에 RAGE 발현이 몇 배 증가하게 됨으로써, A와 결합하여 산화손상, 미세아교세포 활성 및 신경염증 등의 기전으로 신경세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.

특히, 알츠하이머 병 환자의 경우, 베타아밀로이드 펩티드의 유입에 중요한 역할을 하는 RAGE의 발현 정도가 증가되어 있다는 것이 보고되었고(Donahue JE & Stopa EG et al. Acta Neuropathol., 2006, vol 112, 405), 이를 통한 베타아밀로이드 펩티드의 뇌 내로의 과다한 유입은 베타아밀로이드 펩티드의 축적 정도를 가속화시켜서 결국 뇌 내 아밀로이드 플라크 형성을 촉진하게 된다. 또한 RAGE는 베타아밀로이드 펩티드의 유입뿐만 아니라 베타아밀로이드 펩티드와의 상호작용에 의해 여러 신호전달과정을 일으키게 되는데, 특히 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 발생과 염증 등을 유발하여 세포자살을 일으킨다고 보고되었다(Zlokovic BV et al., Neuron, 2004, vol 43, 333). 그러므로, 만일 RAGE와 베타아밀로이드 펩티드의 상호작용을 막을 수 있다면, 베타아밀로이드 펩티드의 축적과 이로 인한 세포내 신호전달(downstream signaling)을 막을 수 있으며, 결국에는 알츠하이머 병의 진행속도를 늦추는 데에도 큰 영향을 줄 수가 있을 것으로 기대된다(Zlokovic BV, Neurotherapeutics, 2008, Vol 5, 409). 또한, RAGE 단백질과 리간드의 결합 저해를 통해 리간드의 수송을 억제할 수 있다면, 치매, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 아밀로이드심근병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, AA 아밀로이드증(amyloid-associated amyloidosis) 및 AL 아밀로이드증(amyloid-light chain amyloidosis)과 같은 베타아밀로이드 집적에 의한 질환에서 베타아밀로이드 축적 감소 효과에 기인하여 질환 증상의 개선이나 인지기능의 개선이 가능하다.

현재까지 RAGE와 베타아밀로이드 펩티드의 상호작용을 막고자 하는 노력은 화합물을 이용하는 분야와 대체 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 만들어지는 RAGE의 아형(isoform)인 용해성 RAGE(soluble RAGE, sRAGE)를 이용하는 분야로 진행되고 있다. 용해성 RAGE는 리간드와의 결합에 있어 RAGE와 경쟁적인 관계로서, 세포막에 존재하는 RAGE(full-length RAGE)에 베타아밀로이드 펩티드가 상호작용하기 전에 용해성 RAGE-베타아밀로이드 펩티드 복합체를 형성함으로써 RAGE의 활성화에 의한 베타아밀로이드 펩티드의 중추신경계 내로의 유입이나 신호전달과정이 일어나지 못하게 하는 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여 베타아밀로이드 펩티드의 신호전달을 중화시키는 시약으로서 용해성 RAGE가 적용 가능한지에 대한 연구가 진행되고 있다.

지금까지 RAGE 억제제로는 화이자 사(社)(Pfizer, Inc.)에서 개발된 PF-04494700(TTP488)가 경증 내지 중등증 AD 환자를 대상으로 제2상 임상연구를 마친 상태로 확인되고, 당뇨병성 신장증(diabetic nephropathy)을 앓고 있는 환자에 대해서도 임상 2상 연구가 진행되고 있으며, 식용가능한 소분자 물질로 베타아밀로이드 펩티드 양을 줄인다고 보고된 바 있으나, 아직까지 RAGE 단백질에서 베타아밀로이드와 상호작용에 중요한 역할을 하는 부위를 확인하고, 이를 표적으로 한 억제제의 개발은 이루어지지 않고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 RAGE 단백질과 베타아밀로이드의 상호작용 부위를 확인하기 위해 예의 노력한 결과, RAGE 단백질의 V domain 상에서 베타아밀로이드와의 상호작용에 중요한 펩티드 부분을 동정하였으며, 이를 표적으로 하는 펩티드, 화합물 또는 항체를 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제로 개발하여 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 상호작용에 길항 효과를 나타냄을 확인하였다. 아울러, 상기 억제제를 포함하는 조성물이 베타아밀로이드 집적 관련 질환, 즉 알츠하이머 병 등의 베타아밀로이드 집적에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료제로 개발될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 부위를 표적으로 하는 펩티드, 항체, 및 이를 모방한 저분자화합물 등을 포함한 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제, 이를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 상호작용부위를 이용한 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 RAGE (Receptor for advanced glycation end products) 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제로서, 상기 억제제는 RAGE (Receptor for advanced glycation end products) 단백질 V-도메인의 β-3 또는 β-8 가닥을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 β-3 가닥은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 β-8 가닥은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 억제제는 화합물, 펩티드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 항체는 RAGE 단백질의 V-도메인 내에서 서열번호 4(PWDSVARVLP, RAGE 단백질 V-도메인의 β-5 가닥)의 아미노산 서열을 항원결정기로 인지하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적에 의한 세포 독성 및 기억력 손상 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 베타아밀로이드 집적 관련 질환은 치매, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 아밀로이드심근병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, AA 아밀로이드증(amyloid-associated amyloidosis) 및 AL 아밀로이드증(amyloid-light chain amyloidosis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 약제학적 유효량을 개체내 투여하는 단계를 포함하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다:

1) 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 포함하는 RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 또는 β-8 가닥 단백질이 부착된 고체기판에, 베타아밀로이드 및 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제 후보물질을 처리한 후 세척하는 단계;

2) 상기 기판에 베타아밀로이드에 대한 항체를 처리한 후 세척하는 단계; 및

3) 상기 기판 위에 베타아밀로이드에 대한 항체의 부착 정도가 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 후보물질을 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제로 선별하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 1)의 고체기판은 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막, 마이크로플레이트, 유리기판, 폴리스티렌, 실리콘기판 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

아울러, 본 발명은 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 포함하는 RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 또는 β-8 가닥 단백질 및 NF-κB를 각각 코딩하는 재조합 발현벡터가 함께 도입된 세포주를, 베타아밀로이드 펩티드 및 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제 후보물질과 접촉시켜 NF-κB 발현양상을 측정하는 단계를 포함하는 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 NF-κB를 코딩하는 재조합 발현벡터는 NF-κB-루시퍼레이즈를 코딩하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 세포주가 HEK293 세포주(Human embryonic kidney cell)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 RAGE 단백질 V-domain 유래 펩티드 및 이를 표적으로 하는 펩티드, 화합물 또는 항체는 RAGE 단백질에 길항작용을 함으로써, 상기 펩티드, 화합물 또는 항체는 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제로 개발할 수 있다.

아울러, 상기 억제제는 베타아밀로이드 집적에 의해 유발되는 질환인 치매, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 아밀로이드심근병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, AA 아밀로이드증(amyloid-associated amyloidosis) 및 AL 아밀로이드증(amyloid-light chain amyloidosis) 등의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 뿐 아니라, 본 발명에서 확인된 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 상호작용 부위는 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제 스크리닝 방법에도 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 베타아밀로이드가 RAGE 단백질의 V 도메인에 결합함을 나타내는 결과이다.
도 2는 Swiss-Model 서버에 의해 제작된 RAGE 단백질 V 도메인의 구조(위쪽 그림), 및 사람(Homo sapiens), 랫트(Rattus norvegicus), 쥐(Mus musculus), 개(Canis lupus familiaris), 돼지(Sus scrofa) , 소(Bos Taurus)의 RAGE V 도메인의 아미노산 서열을 상호 비교하고 돌연변이를 일으킨 아미노산 위치를 표시한 그림이다(아래쪽 그림):
검은색 배경색 표시: conserved residue;
Closed circle 표시: positively charged surface;
Open circle 표시: hydrophobic patch; 및
붉은색 역삼각형 표시: RAGE 단백질 V-도메인에 point mutation을 일으킨 위치로, 51번째 트립토판 아미노산 residue 및 115번째 발린 아미노산 residue.
도 3은 본 발명에서 사용한 RAGE deletion 돌연변이 클론을 도식화한 그림이다.
도 4 및 도 5는 RAGE deletion 돌연변이체와 GST-베타아밀로이드의 결합을 분석하기 위해 GST pull-down 분석을 수행한 결과이다.
도 6은 RAGE point 돌연변이체와 GST-베타아밀로이드의 결합을 확인하기 위해 GST pull-down 분석을 수행한 결과이다.
도 7은 RAGE point 돌연변이체가 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호결합을 저해함으로써, NF-kB 신호 전달 경로를 활성화시키지 못함을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명에서 제작된 RAGE 단일클론항체가 RAGE V 도메인을 특이적으로 인지함을 면역침강법을 이용해 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명에서 제작된 RAGE 단일클론항체가 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호결합을 저해함을 확인하기 위하여 GST pull-down 분석을 수행한 결과이다.
도 10은 본 발명에서 제작된 RAGE 단일클론항체가 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호결합을 저해함을 확인하기 위하여 ELISA를 수행한 결과이다.
도 11은 본 발명에서 제작된 RAGE 단일클론항체가 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호결합을 저해함으로써, NF-kB 신호 전달 경로를 활성화시키지 못함을 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명에서 제작된 RAGE 단일클론항체가 베타아밀로이드 펩티드의 뇌내 이동을 차단함을 생체 내에서 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명에 따른 β-3 펩티드 및 β-8 펩티드가 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호결합을 저해함을 확인하기 위하여 GST pull-down 분석을 수행한 결과이다.
도 14는 본 발명에 따른 β-3 펩티드 및 β-8 펩티드가 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호결합을 저해함을 확인하기 위하여 ELISA를 수행한 결과이다.
도 15는 본 발명에 따른 β-3 펩티드가 베타아밀로이드 펩티드의 뇌내 이동을 차단함을 생체 내에서 확인한 결과이다.

이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 RAGE (Receptor for advanced glycation end products) 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제에 관란 것으로, 상기 억제제는 RAGE (Receptor for advanced glycation end products) 단백질 V-도메인의 β-3 또는 β-8 가닥을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 제공한다.

상기 RAGE 단백질은 인간에서 유래한 것으로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 랫트, 마우스, 개, 돼지, 소에서 유래한 단백질도 가능하다.

상기 β-3 가닥은 RAGE 단백질의 38번째 아미노산 residue부터 52번째 아미노산 residue에 해당하는 펩티드인 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 β-8 가닥은 RAGE 단백질의 114번째 아미노산 residue부터 117번째 아미노산 reidue에 해당하는 펩티드인 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 억제제는 펩티드, 항체, 및 이를 모방한 저분자화합물인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 상기 RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 또는 β-8 가닥을 표적으로 하는 물질이라면 어느 것이든 가능하다.

상기 항체는 RAGE 단백질의 V-도메인 내에서 RAGE 단백질 V-도메인의 β-5 가닥에 해당하는 서열번호 4(PWDSVARVLP)의 아미노산 서열을 항원결정기로 인지하는 것이 바람직하나, 상기 RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 또는 β-8 가닥을 표적으로 하여 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합을 저해하는 항체라면 어느 것이든 가능하다.

본 발명의 일 실시예에서는 RAGE 단백질의 V-도메인에 베타아밀로이드가 결합함을 확인하였고(도 1 참조), RAGE 단백질 V-도메인의 deletion 돌연변이체를 이용한 GST pull-down 분석을 통해 RAGE 단백질의 38번째 아미노산 residue에서 52번째 아미노산 residue, 및/또는 RAGE 단백질의 114번째 아미노산 residue에서 117번째 아미노산 residue가 deletion될 경우, RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합이 저해됨을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조). 이를 재확인하기 위하여, 38번째 아미노산 residue에서 52번째 아미노산 residue 사이에 존재하는 51번째 아미노산, 및/또는 114번째 아미노산 residue에서 117번째 아미노산 residue 사이에 존재하는 115번째 아미노산을 point mutation시켜, RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합이 저해됨을 확인하였으며(도 6 참조), 이를 통해, RAGE 단백질의 38번째 아미노산 residue에서 52번째 아미노산 residue(RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 가닥), 또는 RAGE 단백질의 114번째 아미노산 residue에서 117번째 아미노산 residue(RAGE 단백질 V-도메인의 β-8 가닥)가 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합 부위임을 확인하였다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 RAGE 단백질의 point 돌연변이체가 세포 내에서 베타아밀로이드에 의한 NF-κB 신호전달을 저해함을 확인하였다(도 7 참조).

아울러, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 가닥 또는 β-8 가닥에 구조적으로 결합할 수 있는 RAGE 단백질 V-도메인에 대한 단일클론항체를 제조하였고, 상기 RAGE 단일클론 항체에 의해 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합을 저해하고, 세포 내에서 베타아밀로이드에 의한 NF-κB 신호전달을 저해함을 확인하였으며(도 8 내지 도 11 참조), 또 다른 실시예에서는 RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 가닥 또는 β-8 가닥과 일치하는 펩티드가 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합을 저해함을 확인하였다(도 13 및 도 14 참조).

따라서, RAGE (Receptor for advanced glycation end products) 단백질 V-도메인의 β-3 또는 β-8 가닥을 표적으로 한 화합물, 펩티드 또는 항체는 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제로 유용하게 이용될 수 있다.

상기 베타아밀로이드 집적 관련 질환은 치매, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 아밀로이드심근병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, AA 아밀로이드증(amyloid-associated amyloidosis) 및 AL 아밀로이드증(amyloid-light chain amyloidosis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, RAGE 단백질에 의해 전달되는 베타아밀로이드의 집적에 의해 유발되는 질환이라면 어느 것이든 가능하다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에서 제조한 RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 가닥 또는 β-8 가닥에 구조적으로 결합할 수 있는 RAGE 단백질 V-도메인에 대한 단일클론항체가 생체 내에서 뇌내로 베타아밀로이드의 집적을 저해하는지 확인하였으며, 그 결과 본 발명의 RAGE 단일클론항체는 RAGE 단백질과 베타아밀로이드의 결합을 저해하여, 마우스 뇌내에 베타아밀로이드가 집적되는 것을 효과적으로 저해함을 확인하였다(도 12 참조).

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 가닥과 일치하는 펩티드가 생체 내에서 뇌 내로의 베타아밀로이드 펩티드 유입을 저해함을 확인하였다(도 15 참조).

따라서, 본 발명의 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제는 베타아밀로이드 집적에 의해 유발되는 세포 독성 및 기억력 손상 억제를 위한 약학적 조성물 또는 베타아밀로이드 집적과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

상기 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

상기 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 200 mg/kg/일의 양으로 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격을 1일 수회, 바람직하게는 1일 1회 내지 3회로 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여할 수 있다.

상기 단계 1)의 고체기판은 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막, 마이크로플레이트, 유리기판, 폴리스티렌, 실리콘기판 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 베타아밀로이드에 대한 항체는 리간드에 결합된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 상기 리간드는 바이오틴, 아비딘 또는 스트렙트아비딘인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법은 리간드 특이적 결합분자에 결합된 발색효소 또는 형광분자가 결합된 시각화 컨쥬게이트를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)이고, 형광분자는 콜로이드 골드(colloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 3)의 결합 정도는 웨스턴블랏팅(Western blotting)법, 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 NF-κB를 코딩하는 재조합 발현벡터는 NF-κB-루시퍼레이즈를 코딩하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 상기 세포주는 HEK293 세포주(Human embryonic kidney cell)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 RAGE 단백질의 38번째 아미노산 residue에서 52번째 아미노산 residue(RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 가닥), 또는 RAGE 단백질의 114번째 아미노산 residue에서 117번째 아미노산 residue(RAGE 단백질 V-도메인의 β-8 가닥)가 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합 부위임을 확인하였으며, 상기 RAGE 단백질의 point 돌연변이체가 세포 내에서 베타아밀로이드에 의한 NF-κB 신호전달을 저해함을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 확인된 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 상호작용 부위는 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제 스크리닝 방법에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> RAGE 단백질과 베타아밀로이드의 결합 부위 확인

RAGE 단백질과 베타아밀로이드의 결합 부위를 확인하기 위하여, 우선적으로, Ni-column을 이용하여 bacterial expressed biotinylated human RAGE with 6xHis tag 재조합 단백질을 분리정제하는 기술을 확립하였다. 이때, 베타아밀로이드가 RAGE 단백질의 어떤 부위에 결합하는지 확인하기 위하여, RAGE 단백질은 FL(full-length sRAGE) 도메인, V 도메인, C1 도메인으로 부위별로 나누어 제조하였다. 이후, 상기 정제한 RAGE 단백질을 96 웰 플레이트에 고정시키고 베타아밀로이드 펩티드(A)가 들어있는 용액과 반응시켜 결합을 유도한 다음, 결합된 베타아밀로이드 펩티드를 베타아밀로이드 펩티드 특이적 항체인 4G8-HRP(Covance)를 이용해 검출하였다.

단계 1: RAGE 단백질과 베타아밀로이드 펩티드 의 결합 유도

시험 시작 하루 전에 DMSO에 1 mM 농도로 베타아밀로이드 1-42 펩티드(American peptide)를 준비하고, 이를 차가운 PBS 완충용액에 10 μM 농도가 되도록 희석한 후, 4℃ 에서 하룻밤동안 반응시켰다. 이후, 5% BSA TBS 완충 용액에 2 μg/ ml의 농도가 되도록 RAGE-비오틴 단백질(FL 도메인, V 도메인, C1 도메인)을 희석시키고, 희석한 RAGE 단백질을 Streptavidin plate에 웰 당 50 씩 넣었으며, 무처리군으로는 5% BSA TBS 완충용액만을 처리하였다. 이후, 준비해 두었던 10 μM 농도의 베타아밀로이드 1-42를 TBS 완충용액을 이용해 30배 희석시킨 후, 웰 당 30 씩 첨가하였다. 무처리군으로 TBS 완충용액만을 처리하였으며, 상기 플레이트를 상온에서 1시간 동안 진탕 배양하였다.

단계 2: RAGE 단백질과 베타아밀로이드 펩티드 의 결합 정도 측정

상기 플레이트에서 RAGE 단백질에 결합되지 않은 베타아밀로이드 펩티드를 제거하기 위해 Washer를 이용해 TBST(Tween 0.05%) 로 5회 세척하였다. 2.5% BSA TBS 완충용액에 4G8-HRP 항체를 1000배 희석해서 웰 당 100씩 넣고, 상온에서 1시간 동안 배양기에서 흔들면서 배양하였다. 반응이 끝난 후 Washer를 이용해 TBST(Tween 0.05%) 로 5회 세척하였다. TMB solution A와 B를 1:1로 혼합한 후 웰 당 100 씩 첨가한 다음, 냉암소에서 10분간 발색반응을 수행하였다. 반응이 충분히 완료되면 100 의 H₂O₂ 정지 완충용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이후, 마이크로플레이트 리더(Sunrise, TECAN)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 베타아밀로이드 펩티드는 RAGE 단백질의 V-도메인만으로도 충분히 베타아밀로이드와 결합함을 확인하였다(도 1).

< 실시예 2> GST pull down 분석을 이용한 베타아밀로이드와 RAGE 상호결합부위의 동정

상기 <실시예 1>에서 확인한 베타아밀로이드와 상호결합하는 RAGE 단백질의 V-도메인에서 실제 상호결합에 관여하는 부위를 동정하기 위하여, RAGE 단백질의 돌연변이체(deletion/point mutant)를 이용한 GST pull-down 분석을 수행하였으며, 그 구체적인 방법은 하기와 같다.

단계 1: GST -A42N4 (베타아밀로이드 4 tandom repeat ) 단백질의 발현

우선적으로, 베타아밀로이드 펩티드 4 tandom repeat를 보유한 재조합 단백질을 제조하기 위하여, GST-A42N4 플라스미드를 대장균 세포주 BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 이후, 상기 형질전환된 세포를 37℃에서 배양한 다음, 다음날 1/100로 희석하여 배양하고, OD550nm에서 0.6이 되었을 때 IPTG를 첨가하고 3시간을 더 배양하여 GST-A42N4(GST-A) 단백질의 발현을 유도하였다. 그 다음, 단백질 발현이 유도된 형질전환 세포를 수확하여 sonicator를 이용하여 파쇄한 세포 추출물에서 glutathione-sepharose column을 이용하여 GST-베타아밀로이드 단백질을 순수분리 하였다.

단계 2: RAGE 단백질 돌연변이체( deletion / point mutant )의 제조

본 발명에서는 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합 부위를 동정하기 위하여, RAGE 단백질의 돌연변이체를 제작하였다.

구체적으로, 본 발명에서는 RAGE wilde type 클론, RAGE deletion mutant 클론인 V, C1, C2, VC1, M1, M2, M3, M4, M5, D1, D2 및 D3, 및 RAGE point mutant인 W51P(RAGE 단백질의 51번째 아미노산인 트립토판(W)이 프롤린(P)으로 치환된 mutant), V115P(RAGE 단백질의 115번째 아미노산인 발린(V)이 프롤린(P)으로 치환된 mutant), WPVP(W51P와 V115P가 함께 치환된 double mutant) 클론을 제작하기 위하여, Muta-Direct^TM Site-Directed Mutagenesis Kit(iNtRON, #15071)를 이용하여 각각의 돌연변이체가 pCS3MT 벡터의 XhoI 및 EcoRI 제한효소 인식부위 내에 삽입되도록 하였다. 이때, 각 돌연변이체가 포함하고 있는 구체적인 아미노산 서열 및 부위는 [도 2] 및 [도 3]에 나타내었다.

pCS3MT 플라스미드는 Sp6 promoter를 가지고 있어서 in vitro에서 단백질 합성이 가능하므로, 상기 제조된 발현 플라스미드 1 μg을 TNT-coupled transcrition & translation kit(Promega, #L4600)에 반응시켜, in vitro에서 RAGE wild-type 단백질과 돌연변이체 단백질을 발현시켰다.

단계 3: GST pull down 분석

상기 단계 2에서 합성한 RAGE wild-type 단백질 및 돌연변이체 단백질과 단계 1에서 정제한 GST-A 단백질을 GST binding buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 0.05% NP-40)에서 혼합한 후, 상온에서 30분 동안 반응하였다. 반응 후 0.5% TritonX-100이 포함되어 있는 PBS buffer로 3번 씻어준 다음, GST-A 단백질에 결합한 RAGE 단백질만을 elution하고, anti-Myc antibody(Roche diagnostics)를 이용하여 immunoblotting을 수행하였다.

그 결과를 도 4 내지 도 6에서 나타내었다.

구체적으로, 도 4는 RAGE 단백질 V-domain의 N-terminus 부분의 아미노산을 deletion시켰을 때 RAGE 단백질과 베타아밀로이드와의 상호결합 정도를 확인한 결과로, RAGE 단백질의 38번째 아미노산 residue에서 52번째 아미노산 residue가 deletion되었을 때, RAGE 단백질과 베타아밀로이드와의 상호결합이 현저히 감소하고, RAGE 단백질의 C1 도메인 단독으로는 베타아밀로이드와 결합할 수 없음을 확인하였다.

또한, 도 5는 RAGE 단백질 V-domain의 N-terminus 부분의 아미노산을 deletion시켰을 때 RAGE 단백질과 베타아밀로이드와의 상호결합 정도를 확인한 결과로, RAGE 단백질의 114번째 아미노산 residue에서 117번째 아미노산 residue가 deletion되었을 때, RAGE 단백질과 베타아밀로이드와의 상호결합이 현저히 감소함을 확인하였다.

아울러, 도 6에서는 RAGE 단백질의 51번째 아미노산인 트립토판 또는 115번째 아미노산인 발린을 돌연변이시켰을 때, RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호작용이 저해됨을 확인하였다. 이때, 두 개의 돌연변이를 모두 포함한 double mutant의 경우, 더욱 현저하게 상호작용 저해 효과를 나타냄을 확인하였다.

상기 결과를 통하여, RAGE 단백질의 38번째 아미노산 residue에서 52번째 아미노산 residue(RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 가닥), 및/또는 RAGE 단백질의 114번째 아미노산 residue에서 117번째 아미노산 residue(RAGE 단백질 V-도메인의 β-8 가닥)가 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합 부위임을 알 수 있다.

< 실시예 3> NF -κB 신호전달 체계를 이용한 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 펩티드의 결합 억제 측정

RAGE 단백질은 베타아밀로이드와 결합하여, 이를 세포내로 전달함으로써, 세포의 NF-κB 신호전달체계를 활성화시키게 된다. 이에, 본 발명에서는 상기 <실시예 2>에서 확인된 RAGE-베타아밀로이드 간 상호결합부위를 저해함으로써, 세포 내 NF-κB 신호전달체계가 억제되는지의 여부를 확인하였다.

이를 위해, HEK293 세포주(Human embryonic kidney cell)에 pNF-kB-Luciferase vector(Stratagene) 및 상기 <실시예 2>에서 제작된 RAGE wild type 및 point mutant(W51P, V115P, WPVP) expression plasmid를 함께 도입하여, RAGE 단백질의 베타아밀로이드에 의한 신호전달 모니터링을 위한 형질전환 세포주를 제작하였다.

구체적으로, NF-κB 발현에 효과적인 인헨서 DNA (인헨서 염기서열: (TGGGGACTTTCCGC)5)를 효소중합 반응으로 제조하여 준비하였다. 유전자 도입을 위한 벡터로는 pLuc-MCS vector(Stratagene, Cat. no. 219087)를 사용하였고, 벡터의 MCS(multi cloning sequence)부분에 상기의 인헨서 부분을 라이게이션 하였다. 세포 내에 존재하는 NF-κB는 여러 스트레스 조건에 의해 핵 내로 이동하게 되는데, MCS 부분에 삽입된 NF-κB 발현에 효과적인 인헨서 DNA에 이 NF-kB가 붙게 되면 그 뒤에 형광을 내는 유전자가 발현이 되고, 이 형광 정도를 인식하면 세포가 어느 정도의 스트레스 상태에 있는지를 알 수 있게 된다. 이렇게 하여 pNF-kB-Luciferase vector를 구축하고, 이를 RAGE wild type 및 point mutant(W51P, V115P, WPVP) expression plasmid가 도입된 HEK293 세포주에 도입시켜 RAGE 단백질(wild type 및 mutant) 및 NF-κB 공도입(co-transfection)된 세포주를 제조하였다. 도입은 LipofectaminTM LTX 시약(Invitrogen사, Cat. No. 15338-100)을 이용하였으며, 도입 효율을 높이고자 Plus^TM 시약 (Invitrogen사, Cat. No. 11514-015)을 함께 이용하였으며, 상기 세포주를 하이그로마이신이 든 배양액에서 선택 과정(Selection process)을 거쳐 원하는 세포군집(colony)을 얻었다.

그 다음, 상기 형질전환 세포주에 96 웰 플레이트에 웰당 10,000개의 세포가 들어가도록 분주하고, Dulbescco's Modified Eagle's Medium (Hyclone)에 10 %의 소혈청 (FBS; Hyclone)과 1x10⁴ U/ml 농도의 페니실린/스트렙토마이신을 혼합한 배양액에 하루 동안 배양하였다. 3일 후, 웰에서 배양액을 버리고 새로운 배양액으로 교체한 다음, 상기 배양액에 인산염 완충액에 25 μM 농도로 희석하여 4일 동안 실온에서 응집시킨 베타아밀로이드 펩티드를 0.25 μM 농도로 처리하여 18시간 동안 반응시켰다. 반응을 종료한 세포주의 배양액을 버리고, 배양된 세포는 인산완충액으로 세척한 다음, 세포 용해액(cell lysis buffer; 40mM tricine, pH 7.8, 50mM NaCl, 2mM EDTA, 1mM MgSO₄, 5mM DTT, 1% 트리톤 X-100)을 웰당 150 μl씩 첨가하고 5분간 실온에서 방치하여 세포를 용해시켰다. 100 μl의 상기 세포 용해액을 취하여 불투명한 흰색 96웰 플레이트로 옮기고 50 μl의 루시퍼레이즈 실험액(Luciferase assay reagent: 40mM tricine(pH 7.8), 0.5mM ATP, 10mM MgSO₄, 0.5mM EDTA,10mM DTT, 0.5mM coenzyme A, 0.5mM luciferin)을 상온에서 섞은 후, luminometer(Turner Designs)로 발광수치를 측정하였으며, 이때, 측정값으로부터 베타아밀로이드 펩티드에 의한 증가값에 대비하여 RAGE 단백질의 Wild type 및 돌연변이체에 의한 루시퍼레이즈 활성 정도를 환산하였다.

그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 RAGE 단백질의 V-domain 의 N-terminus 와 C-terminus의 특정 아미노산에 대한 돌연변이 도입(RAGE 단백질의 51번째 아미노산인 트립토판과 115번째 아미노산인 발린을 돌연변이)은 세포 내에서 베타아밀로이드에 의한 NF-κB 신호전달을 저해함을 알 수 있었다.

상기 결과를 통하여, RAGE 단백질의 38번째 아미노산 residue에서 52번째 아미노산 residue, 및 RAGE 단백질의 114번째 아미노산 residue에서 117번째 아미노산 residue가 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합 부위임을 재확인하였다.

< 실시예 4> 시험관 내( In vitro )에서 RAGE 단일클론항체에 의한 RAGE -베타아밀로이드 간 상호결합 저해 측정

상기 <실시예 2> 및 <실시예 3>에서 RAGE-베타아밀로이드 간 상호결합 부위로 확인된 RAGE 단백질의 38번째 아미노산 residue에서 52번째 아미노산 residue(RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 가닥), 또는 RAGE 단백질의 114번째 아미노산 residue에서 117번째 아미노산 residue(RAGE 단백질 V-도메인의 β-8 가닥)에 대하여, 상기 부위를 표적으로 하는 물질에 의해 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합이 저해되는지를 확인하였다.

단계 1. RAGE 단백질의 V-도메인에 특이적으로 결합하는 RAGE 단일클론항체의 제조

상기 RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 가닥 또는 RAGE 단백질 V-도메인의 β-8 가닥을 표적으로 하는 물질을 개발하기 위해, RAGE 단백질의 V-도메인 내 PWDSVARVLP(서열번호 4) 부분을 항원결정기로 인지하는 마우스 단일클론항체를 Abmart(http://www.ab-mart.com/)에서 제작하였다. 이때, 상기 펩티드 부위(서열번호 4의 아미노산 서열)는 항체와의 결합에 있어 높은 항원성을 나타내고, β-3 가닥 또는 β-8 가닥과 구조적으로 가깝게 위치하여, 상기 β-3 가닥 또는 β-8 가닥을 표적으로 할 수 있다.

단계 2. 시험관 내( In vitro )에서 RAGE 단일클론항체에 의한 RAGE -베타아밀로이드 간 상호결합 저해 측정

상기 단계 1.에서 제작된 RAGE 단일클론항체를 이용하여, RAGE-베타아밀로이드 간 상호결합 저해 활성을 확인하였으며, 이를 위해, 상기 <실시예 1>, <실시예 2> 및 <실시예 3>에 기재된 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 결합 부위 확인 방법, GST pull-down 분석, NF-κB reportor 분석 방법을 이용하여, 본 발명의 RAGE 단일클론항체가 RAGE-베타아밀로이드 간 상호결합을 저해하는지를 측정하였다.

이때, RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 결합을 측정하는 방법으로 ELISA 방법을 추가하여 수행하였다. 구체적으로, ELISA는 바이오틴 표지된-인간 RAGE 재조합 단백질(FL domain, V domain) 1 μg, RAGE 단일클론항체 용액 0.2 μg, 10 μM의 베타아밀로이드 1 μl를 100 μl의 TBST(2.5% BSA 포함) 용액에 포함하여 streptavidin 코팅된 플레이트에서 60분 동안 배양한 후, TBST로 세척하고, 1차 항체로 horseradish-peroxidase가 접합된 4G8(4G8-HRP, 1:1000 희석)이 포함된 100 μl의 TBST(2.5% BSA 포함) 용액을 각 웰에 처리한 다음, 2차 항체로 HRP 항체를 이용하여 베타아밀로이드와 결합된 RAGE 단백질만을 검출하였다. 상기 검출에는 TMB substrate를 이용하였으며, 황산으로 반응을 중지시킨 다음, Sunrise 플레이트 리더(TECHAN)에서 450nm의 흡광도에서 OD를 측정하였다.

그 결과를 도 8 내지 도 11에서 나타내었다.

구체적으로, 도 8에서는 본 발명의 RAGE 단일클론항체가 RAGE 단백질의 V-도메인에 특이적으로 인지함을 알 수 있다.

또한, 도 9는 GST pull-down 분석 결과이고, 도 10은 ELISA 결과로, 상기 결과로부터 본 발명의 RAGE 단일클론항체를 처리할 경우, 농도의존적으로 RAGE 단백질과 베타아밀로이드의 상호작용을 현저히 저해함을 알 수 있다.

아울러, 도 11에서는 본 발명의 RAGE 단일클론항체가 농도의존적으로 RAGE 단백질과 RAGE 결합에 의한 NK-κB 신호전달경로를 저해함을 알 수 있다.

< 실시예 5> 생체 내( in vivo )에서 RAGE 단일클론항체에 의한 RAGE-베타아밀로이드 간 상호결합 저해 측정

상기 <실시예 4>의 단계 1.에서 제조된 본 발명의 RAGE 단일클론항체가 생체 내에서 RAGE 단백질의 기능을 저해하는지 확인하기 위하여, RAGE 급성 동물을 이용하여 하기 실험을 수행하였다.

단계 1: 베타아밀로이드 펩티드 1-42 준비

베타아밀로이드 펩티드 1-42(American peptide) 1 mg에 HFIP 2 ml를 넣은 후 실온에서 3일 동안 충분히 녹인 다음 100 μl씩 실리콘 튜브(fisher 02-681-320)에 분주하고, 고속 진공기(speed vacuum)를 이용하여 10분 동안 HFIP를 증발시킨 후, 밀봉하여 사용하기 전까지 -80 ℃ 초저온냉동고(deep freezer)에 보관하였다.

실험하기 전 초저온냉동고에 보관중인 튜브 하나를 꺼내어 무수 DMSO(Sigma, Cat no.276855) 10 μl에 충분히 녹인 후, PBS 390 μl를 추가로 첨가하여 최종 베타아밀로이드 펩티드 1-42를 25 μM의 200 μl를 준비하여 RAGE 급성 모델에 사용하였다.

단계 2: RAGE 급성 모델 마우스의 제조

모든 실험에는 수컷 ICR 마우스(25g, 샘타코)를 사용하였다. 준비된 3개월령의 ICR 마우스에 본 발명의 RAGE 단일클론항체를 농도별(1 and 10 mg protein/200μl PBS)로 먼저 꼬리 정맥에 투여한 후 10분간 방치한 다음, 상기 단계 1.에서 준비된 베타아밀로이드 펩티드 1-42 25 μM 200 μl를 꼬리정맥으로 투여였다. 정맥투여 30분 후 안와정맥(orbital venous plexus)에서 모세관(sodium-heparinized capillary tube., MARIENFELD,1303451)을 이용하여 50 μl 정도 채혈한 후, 13,000rpm에서 원심분리한 상층액을 튜브에 옮겨서 플라즈마(plasma)를 준비하였고, 채혈 후 즉시 오른쪽 뇌는 적출하여 액체질소를 이용하여 급속냉동시켰다.

단계 3: 뇌 내의 베타아밀로이드 펩티드 1-42 농도 측정

얼린 뇌 조직은 RIPA 완충용액(100 mM Tris, pH8.0, 150 mM NaCl, 0.5% DOC, 1% NP-40, 0.2% SDS and proteinase inhibitor cocktail)으로 20초 동안 균질화(homogenize)한 후, BCA 활성측정기를 이용하여 400 μg 단백질을 준비하였다.

준비된 플라즈마 샘플과 뇌조직 샘플은 베타아밀로이드 펩티드 1-42 측정 키트(IBL., code no.27711)의 프로토콜을 이용하여 수행하고, 플라즈마 혹은 뇌 속 베타아밀로이드 펩티드 1-42 양의 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 12에 보는 바와 같이, 본 발명에서 제조된 RAGE 단일클론항체는 급성 동물모델에서 뇌조직으로의 베타아밀로이드 펩티드 유입을 농도 의존적으로 억제하였으며, 최고 농도에서 50% 이상 억제하여 RAGE의 활성을 저해하는 효과가 매우 우수함을 확인하였다.

<실시예 6> 시험관 내( In vitro )에서 RAGE 의 베타 가닥 펩티드에 의한 RAGE -베타아밀로이드 간 상호결합 저해 측정

상기 <실시예 2> 및 <실시예 3>를 통해 RAGE-베타아밀로이드 간 상호결합에 관여하는 것으로 확인된 RAGE 단백질 V-도메인의 β-3 가닥 및 β-8 가닥이 RAGE 단백질과 베타아밀로이드 간 상호결합에 영향을 미치는지 확인하였다.

이를 위해, <실시예 2> 및 <실시예 4>에 기재된 GST pull-down 분석 방법, ELISA 방법으로, β-3 가닥과 일치하는 펩티드(서열번호 2) 및 β-8 가닥과 일치하는 펩티드(서열번호 3)를 이용하여, RAGE-베타아밀로이드 간 상호결합이 저해되는지 측정하였다.

그 결과, 도 13의 GST pull-down 분석 결과와 같이, RAGE-베타아밀로이드 간 상호결합이 β-3 펩티드 및 β-8 펩티드에 의해 효과적으로 저해됨을 알 수 있다.

또한, 도 14의 ELISA 결과에서도 마찬가지로 β-3 펩티드 및 β-8 펩티드가 RAGE-베타아밀로이드 간 상호결합을 현저히 저해하는 것으로 나타났다.

상기로부터, RAGE 단백질의 세 번째 및 여덟 번째 베타 가닥이 베타아밀로이드와 상호 결합하는 부위임을 알 수 있다.

<실시예 7> 생체 내( in vivo )에서 RAGE 의 베타 가닥 펩티드에 의한 RAGE -베타아밀로이드 간 상호결합 저해 측정

RAGE V-도메인의 베타 가닥 펩티드가 생체 내에서 RAGE 단백질의 기능을 저해하는지 확인하기 위하여, 생쥐를 동물 모델로 사용하여 생체 내 실험을 수행하였다.

이를 위해, β-3 가닥과 일치하는 펩티드(서열번호 2)를 이용하여, <실시예 5>에 기재된 급성 동물모델 뇌 내의 베타아밀로이드 펩티드 1-42 농도 측정 방법으로, 뇌 속 베타아밀로이드 펩티드 1-42 양의 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 15에 보는 바와 같이, β-3 펩티드가 급성 동물모델에서 뇌조직으로의 베타아밀로이드 펩티드 유입을 효과적으로 억제함을 확인함으로써, β-3 펩티드를 이용하여 RAGE-베타아밀로이드 간 상호결합을 저해할 수 있음을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> RAGE protein-beta amyloid interaction inhibitor, and pharmaceutical composition for preventing or treating diseases associated with beta amyloid accumulation containing the same as an active ingredient <130> PB13-11768 <150> KR 10-2013-0006149 <151> 2013-01-18 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 404 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu 1 5 10 15 Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu 20 25 30 Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg 35 40 45 Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu 50 55 60 Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 65 70 75 80 Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile 85 90 95 Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn 100 105 110 Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp 115 120 125 Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys 130 135 140 Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp 145 150 155 160 Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln 165 170 175 Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu 180 185 190 Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro 210 215 220 Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu 225 230 235 240 Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr 245 250 255 Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met 260 265 270 Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu 275 280 285 Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr 290 295 300 His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile 305 310 315 320 Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser 325 330 335 Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly 340 345 350 Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg 355 360 365 Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu 370 375 380 Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser 385 390 395 400 Thr Gly Gly Pro <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Val Arg Val 1 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro 1 5 10

Claims

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RAGE(Receptor for advanced glycation end products) 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 유효성분으로 함유하는, 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로서,
상기 억제제는 RAGE 단백질 V-도메인의 β-8 가닥에 대응하는 서열번호 3으로 이루어지는 펩티드, 또는 RAGE 단백질 V-도메인내의 서열번호 4로 이루어지는 항원결정기를 인지하는 항체이고,
상기 베타아밀로이드 집적 관련 질환은 치매, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 아밀로이드심근병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, AA 아밀로이드증(amyloid-associated amyloidosis) 및 AL 아밀로이드증(amyloid-light chain amyloidosis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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하기의 단계를 포함하는, RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제를 스크리닝하는 방법;
1) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 RAGE 단백질 V-도메인의 β-8 가닥 단백질이 부착된 고체기판에, 베타아밀로이드 및 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제 후보물질을 처리한 후 세척하는 단계;
2) 상기 기판에 베타아밀로이드에 대한 항체를 처리한 후 세척하는 단계; 및
3) 상기 기판 위에 베타아밀로이드에 대한 항체의 부착 정도가 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 후보물질을 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제로 선별하는 단계.
서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 RAGE 단백질 V-도메인의 β-8 가닥 단백질 및 NF-κB를 각각 코딩하는 재조합 발현벡터가 함께 도입된 세포주를, 베타아밀로이드 펩티드 및 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제 후보물질과 접촉시켜 NF-κB 발현양상을 측정하는 단계를 포함하는 RAGE 단백질-베타아밀로이드 상호작용 억제제의 스크리닝 방법.
제 10항에 있어서, 상기 NF-κB를 코딩하는 재조합 발현벡터는 NF-κB-루시퍼레이즈를 코딩하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 10항에 있어서, 상기 세포주가 HEK293 세포주(Human embryonic kidney cell)인 것을 특징으로 하는, 방법.