JPH10506990A

JPH10506990A - アルツハイマー病に関する細胞試験と診断指数

Info

Publication number: JPH10506990A
Application number: JP8512021A
Authority: JP
Inventors: アルコン，ダニエル・エル; エトチェバーリガレイ，リーニ; キム，クリストファー・エス; ハン，イ−ファン; ネルソン，トム・ジェイ
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1994-09-26
Filing date: 1995-09-26
Publication date: 1998-07-07
Also published as: AU714118B2; EP0783695A1; CA2200963A1; WO1996010182A1; US6080582A; EP1310798A2; EP0783695B1; US5976816A; AU3759295A; DE69529992D1; ATE235057T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト細胞を使用するアルツハイマー病の診断のための方法を提供する。より詳細には、一つの方法は、アルツハイマー病患者および正常提供者からの細胞中のカリウムチャンネルの相違、並びに、細胞内カルシウム濃度を増加させることが知られている化学物質に対する応答におけるアルツハイマー細胞および正常細胞間における細胞内カルシウム濃度の相違を検出する。他の方法は、アルツハイマー細胞および正常細胞の間における記憶関連ＧＴＰ結合Ｃｐ２０タンパク質レベルの相違を検出する。さらに、アルツハイマー細胞および非アルツハイマー細胞の間の改良された評価のための診断インデックスが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】アルツハイマー病に関する細胞試験と診断指数本出願は、１９９３年５月３日に出願された米国特許出願第０８／０５６，４５６号の一部継続出願である、１９９４年９月２６日に出願された米国特許出願第０８／３１２，２０２号の一部継続出願である。発明の分野本発明はアルツハイマー病の診断方法に関する。この方法は健康なドナーからの細胞とアルツハイマー病を有するドナーからの細胞との間に新たに発見された差異を用いる。１つの方法では、機能的カリウムチャンネルの存在下での差異を評価する。別の方法では、カリウムチャンネルブロッカー（blocker）による減極(depolarization)に応ずる細胞内カルシウムレベルの差異を評価する。さらに他の方法では、細胞内蓄積からカルシウムを放出させて細胞内カルシウムレベルを高めることが知られる薬物(chemical)に応ずる細胞内カルシウムレベルの差異を評価する。他の方法では、健康なドナーからの細胞とアルツハイマー病患者からの細胞との間の記憶関連ＧＴＰ結合タンパク質（Ｃｐ２０）レベルの差異を評価する。本発明はＣｐ２０タンパク質のアミノ酸配列にも関する。さらに、アルツハイマー病患者の細胞を対照細胞から区別する診断指数も提供する。発明の背景アルツハイマー病は脳における特定のニューロン部分母集団の大規模な損失に関連し（Ｓｉｍｓ，Ｎ．Ｒ．等，（１９８７）ＡｎｎａｌｓｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，２１：４５１）、記憶喪失が最も一般的な症状である（Ｋａｔｚｍａｎ，Ｒ．（１９８６）ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，３１４：９６４）。アルツハイマー病は遺伝的起源に関連づけられている（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｄ．等，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：６６８；Ｌｉ，Ｇ．等，（１９９１）ＰｓｙｃｈｉａｔｒｉｃＣｌｉｎｉｃｓｏｆＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａ，１４：２６７；Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ，Ｐ．Ｈ．等，（１９８９）ＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆＡｇｉｎｇ，１０：４１７；Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ，Ｐ．Ｈ．等，（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：８８５）。この疾患の早期に発症する家族性形は染色体２１の遺伝的欠失を示す（Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ，Ｐ．Ｈ．等，（１９８７））。ニューロン損失を生じる細胞変化とこの疾患の根源的な病因とはまだ不明である。提案された原因は、環境的要因を包含し（Ｐｅｒｌ，Ｄ．Ｐ．等，（１９８５）ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，６３：１４９；Ｋａｔｚｍａｎ，Ｒ．（１９８６））、金属毒性（Ｐｅｒｌ，Ｄ．Ｐ．等，（１９８０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０８：２９７）、β−アミロイドタンパク質の代謝における欠陥（Ｓｈｏｊｉ，Ｍ．等，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１２６；Ｊｏａｃｈｉｍ，Ｃ．Ｌ．とＳｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（１９９２），ＡｌｚｈｅｉｍｅｒＤｉｓｅａｓｅＡｓｓｏｃ．Ｄｉｓｏｒｄ．６：７；Ｋｏｓｉｋ，Ｋ．Ｓ．（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：７８０；Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（１９９１），Ｎｅｕｒｏｎ，６：４８７；Ｈａｒｄｙ，Ｈ．とＡｌｌｓｏｐ，Ｄ．（１９９１），ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１２：３８３）及び異常なカルシウムホメオスタシス及び／又はカルシウム活性化キナーゼ（Ｍａｔｔｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．等，（１９９２），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１２：３７６；Ｂｏｒｄｅｎ，Ｌ．Ａ．等，（１９９１），ＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆＡｇｉｎｇ，１３：３３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｅ．等，（１９８９），ＡｎｎａｌｓｏｆＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，５６８：２６２；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．等，（１９８８），ＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆＡｇｉｎｇ，９：２６１；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．等，（１９８６），ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，８３：７９９９）を包含する。アルツハイマー病は神経病理学的変化に関して良好に特徴づけられる。しかし、アルツハイマー病が全身性障害であり、中枢神経系の病変が最も顕著であると言う可能性を支持する末梢組織の異常が報告されている（Ｒｉｚｏｐｏｕｌｏｓ，Ｅ．等，（１９８９），ＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆＡｇｉｎｇ，１０：７１７；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（１９８６））。カリウムチャンネルが記憶蓄積中に変化することが判明している（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ，Ｒ．等，（１９９２），ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，８９：７１８４；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ａｎｄｒｅｓ，Ｊ．Ｖ．とＡｌｋｏｎ，Ｄ．Ｌ．（１９９１），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｌｏｂｉｏｇｙ，６５：７９６；Ｃｏｌｌｉｎ，Ｃ．等，（１９８９），ＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓＪｏｕｒｎａｌ，５５：９５５；Ａｌｋｏｎ，Ｄ．Ｌ．等，（１９８５），ＢｅｈａｖｉｏｒａｌａｎｄＮｅｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ４４：２７８；Ａｌｋｏｎ，Ｄ．Ｌ．（１９８４），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６：１０３７）。この観察は、アルツハイマー病患者における記憶喪失の殆どあらゆる症状と共に、アルツハイマー病の病理学の可能なサイト(site)としてのカリウムチャンネル機能の研究と本発明とを生じた。いわゆるパッチクランプ方法とその改良方法とが細胞内の電流の研究のために開発されている。この方法はチャンネルを通るイオン移動の研究に用いられる。これらの電流を測定するために、細胞膜をパッチマイクロピペット(patch micro pipette)の開口に、非常に気密なシールが得られるように密接に取り付ける。このシールは電流がパッチマイクロピペットの外側に漏出するのを防止する。シールを横切って生じる高い電気抵抗を利用して、高分解能の電流測定を行い、膜を横切って電圧を与えることができる。種々な形態のパッチクランプ方法を用いることができる（Ｓａｋｍａｎｎ，Ｂ．とＮｅｋｅｒ，Ｅ．（１９８４），Ａｎｎｕａｌ．ＲｅｖｉｅｗｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，４６：４５５）。現在、アルツハイマー病の研究用診断試験は存在しない。それ故、アルツハイマー病患者と、正常な老齢者と、他の神経変性疾患、例えばパーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、Ｗｅｒｎｉｃｋｅ−Ｋｏｒｓａｋｏｆｆ又は精神分裂病に罹患した人々とを迅速にかつ明確に識別する方法が切望されている。アルツハイマー病の診断に線維芽細胞におけるカルシウムイメージング(calcium imaging )測定が臨床的に利用可能であることを数人の研究者が示唆しているが（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等，１９８６，１９８８，上記文献）、同様な細胞ラインと方法とを用いた他の研究者はアルツハイマー病患者の線維芽細胞と正常な対照の線維芽細胞との間のカルシウムレベルの差異を実証していない（Ｂｏｒｄｅｎ等，１９９１，上記文献）。したがって、後者の研究は前者の研究の結果に反論している。アルツハイマー病患者の脳において非常に一貫して確認される２種類のタンパク質はβ−アミロイドとタウであり、脳細胞の生理学又は病態生理学におけるそれらの役割は完全には理解されていない。しかし、上記その他のタンパク質を含むアルツハイマー病の診断実験室試験も予後実験室試験も今までに存在しない。さらに、アルツハイマー病に関して生理学的意味を有する他のタンパク質は殆ど同定されていない。患者から単離された細胞を用いる本発明のアルツハイマー病の診断方法は必要とされており、現在の非常に複雑な、アルツハイマー病の臨床診断方法を非常に改良するであろう。これらの方法はアルツハイマー病患者を他の神経変性病患者から識別することができるので、特に重要である。発明の概要本発明は患者から単離された細胞を用いるアルツハイマー病の分析方法を提供する。本発明の１実施態様では、特定のカリウムチャンネルの有無を測定する。健康な対照からの細胞では、１１３ｐＳ（ピコジーメンス）と１１３ｐＳの傾斜コンダクタンスを有するカリウムチャンネルが存在し、機能的である。アルツハイマー病患者の細胞では、１１３ｐＳカリウムチャンネルが欠失するか又は非機能的である。本発明の第２実施態様では、細胞内カルシウムレベルに対する１１３ｐＳカリウムチャンネルに特異的なカリウムチャンネルブロッカーの効果を評価する。この方法では、細胞内カルシウムレベルが正常な細胞ではカリウムチャンネルブロッカーに応じて上昇するが、アルツハイマー病のドナーからの細胞では上昇しないことが発見される。好ましいカリウムチャンネルブロッカーは、１００ｍＭの最終細胞外濃度でのテトラエチルアンモニウム（“ＴＥＡ”）である。しかし、１１３ｐＳカリウムチャンネルを特異的にブロックする他のカリウムチャンネルブロッカーも使用可能である。さらに、ＴＥＡを用いる場合には、ＴＥＡレベルが正常な細胞におけるカルシウムレベルを上昇させるが、アルツハイマー病のドナーからの細胞におけるカルシウムレベルを上昇させない限り、ＴＥＡの他の最終濃度も使用可能である。本発明の第３実施態様では、患者からのサンプル細胞を細胞内カルシウム放出の活性化剤と、細胞内蓄積サイトからカルシウムを放出させるために充分な量で接触させ、結果として生ずる細胞内カルシウムレベル上昇を測定する。この実施態様では、正常な細胞とアルツハイマー病患者からの細胞の両方が細胞内カルシウムの上昇を示す；しかし、アルツハイマー病患者における上昇の方が非常に大きい。細胞内カルシウムレベルを上昇させるためにイノシトール−１，４，５− トリスホスフェート（ＩＰ₃）活性化剤を用いる場合には、この好ましい実施態様は１μｍの最終細胞外濃度へのボンベシン(bombesin)添加を用いる。しかし、他の最終濃度を用いることもできる。実施例に示すように、本発明の第２実施態様と第３実施態様との組合せを連続的に用いて、疑似陽性も疑似陰性もない、ＡＤの非常に正確な診断方法を提供することができる。さらに、これらの方法はアルツハイマー病患者を他の神経変性病患者から識別することができる。パーキンソン病、精神分裂病、ハンチングトン舞踏病及びＷｅｒｎｉｃｋｅ−Ｋｏｒｓａｋｏｆｆを有する患者からの細胞は、ＴＥＡ又はボンベシンのいずれかで処理した場合に、正常細胞の反応を示す。本発明の第４実施態様では、アルツハイマー病患者からの細胞における記憶関連ＧＴＰ結合タンパク質（Ｃｐ２０）のレベルを評価する。この方法では、Ｃｐ２０タンパク質レベルがアルツハイマー病患者からの細胞では健康な対照からの細胞に比べて有意に減少することが発見される。Ｃｐ２０タンパク質レベルがアルツハイマー病患者の密接な近親者の細胞内でも減少し、このことはこの分析法の予後使用をも示唆する。本発明の方法によって検出される欠陥がアルツハイマー病の臨床的発現よりも前に発現するのか又は同時に発現するのかは現在の時点では知られていない。しかし、前者が事実であるならば、本発明の方法がアルツハイマー病の検出において予測的並びに診断的に用いられることが予想される。本発明はまた、Ｃｐ２０タンパク質の部分的アミノ酸配列をも提供する。それ故、本発明は、このアミノ酸配列を用いて誘導され、例えば核酸プローブ又はＣｐ２０タンパク質と反応するモノクローナル若しくはポリクローナル抗体のような、Ｃｐ２０診断分析法の実施に有用な生成物にも及ぶ。本発明はまた、例えばＤＮＡプローブ、抗体、キット等のような、Ｃｐ２０診断分析法の実施に有用な生成物を含むキットにも及ぶ。本発明のさらに他の実施態様では、アルツハイマー病患者の細胞を非ＡＤ細胞から識別する確率を高める、本明細書で述べる２個以上の診断試験を用いる診断指数を提供する。図面の簡単な説明図１Ａ−１Ｂ．１１３ｐＳチャンネル。（１Ａ）．アルツハイマー病線維芽細胞と対照線維芽細胞とからの細胞付着記録。−４．５ｐＡユニタリー電流サイズ（０ｍＶピペット電位）が、同じ動力学(kinetics)で、年齢一致対照（ＡＣ）と若い対照（ＹＣ）の線維芽細胞に出現したが、ＡＤ線維芽細胞には完全に存在しなかった（１Ａ，底部）。下方への偏位は開放状態を表す。（１Ｂ）．Ｉ／Ｖ関係と傾斜コンダクタンス。Ｉ／Ｖ関係と傾斜コンダクタンス（線形回帰によって測定）は調べた電圧範囲内で殆ど同じであった、ＹＣでは１１３．２±０．９ｐＳ（平均値±Ｓ．Ｄ．，ｎ＝８）、ＡＣ線維芽細胞では１１２．９±３．２ｐＳ（ｎ＝７）。図２Ａ−２Ｂ．１６６ｐＳチャンネル。（２Ａ）．アルツハイマー病線維芽細胞と対照線維芽細胞とからの細胞付着記録。第２チャンネル（１６６ｐＳ）は３群（ＡＤ、ＹＣ、ＡＣ）の全ての線維芽細胞から同じ条件下で記録された。（２Ｂ）．Ｉ／Ｖ関係と傾斜コンダクタンス。Ｉ／Ｖ関係と傾斜コンダクタンス［ＹＣ＝１７４±５．７ｐＳ、ｎ＝４；ＡＣ＝１６９．２±２．８ｐＳ、ｎ＝４；ＡＤ＝１５７．６±４．７ｐＳ、ｎ＝６（平均値±Ｓ．Ｄ．）］は全ての群で殆ど同じであった。膜電位は対照（−４２．６±５．４、平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝７）とＡ．Ｄ．（−４５．４±６．９、ｎ＝３）とにおいて同じであった。図３Ａ−３Ｃ．（３Ａ）と（３Ｂ）．５０ｍＭ塩化カリウムの添加に反応した細胞の％と反応細胞の平均値［Ｃａ²⁺］_i（ｎＭ）。高カリウム誘導減極は３群（ＡＤＮ＝１３細胞ライン；ＡＣＮ＝１０；ＹＣＮ＝６］の全てにおいて［Ｃａ²⁺］_i上昇（少なくとも１００％上昇）を生じた。反応細胞の割合と［Ｃａ²⁺］_iピーク値とはＹＣ（ｎ＝１８３細胞）線維芽細胞（Ｘ²＝１４．２２、ｐ＜０．００１）では、ＡＣ（ｎ＝２９９）及びＡＤ（ｎ＝２６８）線維芽細胞に比べて有意に高かった（３Ａと３Ｂ）。（３Ｃ）．５０ｍＭＫＣｌの添加後の細胞におけるＣａ²⁺反応の時間経過のサンプルトレース。［Ｃａ²⁺］_iピークは刺激後の１０〜１５秒間に生じ、１００秒間後に基底レベルに戻った。外部［Ｃａ²⁺］が低下した場合［“公称的にＣａ²⁺を含まない”溶液、５ｍＭＥＧＴＡを添加した（推定遊離Ｃａ²⁺＝０．０４μＭ）］又は刺激前にＣａ²⁺チャンネルブロッカー（０．１ｍＭＬａＣｌ₂、１０ｍＭＣｏＣｌ₂、１０ｍＭＮｉＣｌ₂、１０ｍＭＣｄＣｌ₂又は１０μＭニフェジピン）を加えた場合（“０Ｃａ²⁺”）には、反応は観察されなかった。図４Ａ−４Ｃ．ＴＥＡに反応した［Ｃａ²⁺］_i上昇。（４Ａ）ＴＥＡに反応した細胞の割合と（４Ｂ）ＴＥＡ処理後の細胞における平均［Ｃａ²⁺］_i反応。１ｍＭＴＥＡ供給はＹＣ線維芽細胞（ｎ＝１３０細胞）では［Ｃａ²⁺］_iを上昇させたが、ＡＣ（ｎ＝１８４）又はＡＤ線維芽細胞（ｎ＝１９５）では［Ｃａ²⁺ ］_iを上昇させなかった。１０ｍＭＴＥＡはＹＣ（ｎ＝１７６細胞）、ＡＣ（ｎ＝２３１）では［Ｃａ²⁺］_iを上昇させたが、ＡＤ（ｎ＝２０４）線維芽細胞では［Ｃａ²⁺］_iを上昇させなかった（χ １３４．００、ｐ＜０．００１）。同様に、１００ｍＭＴＥＡはＹＣ（ｎ＝５３２細胞）、ＡＣ（ｎ＝４１７）では［Ｃａ²⁺］_iを上昇させたが、ＡＤ（ｎ＝７３８）線維芽細胞では［Ｃａ²⁺］_i を上昇させなかった（χ² ２３１．４４、ｐ＜０．００１）（表２も参照のこと）。基底［Ｃａ²⁺］_iレベルは実際に同じであった（Ｓ．Ｅ．＜２ｎＭ）、それ故、標準誤差バーはこれらの群の算術平均値を表すバーから識別不能であった。（４Ｃ）．Ｃａ²⁺反応の時間経過。［Ｃａ²⁺］_iピークはＹＣ及びＡＣ線維芽細胞では１００ｍＭＴＥＡ添加後の２０〜３０秒間に生じ、１００秒間後に基底レベルに戻った。ＡＤ細胞では基準（ライン中の細胞の１０％が≧１００％上昇を示す）を満たす反応が観察されなかったことを注目のこと。同様に、対照細胞では外部［Ｃａ²⁺］が低下した場合に反応が存在しなかった。図５Ａ−５Ｂ．（５Ａ）．細胞外カルシウムの不存在下での１μｍボンベシンによって誘導されたＣａ²⁺移動度(mobilization)。（５Ｂ）．１μＭボンベシン供給後４２秒間目のＣａ²⁺応答。ＡＤ細胞中の［Ｃａ²⁺］_iレベルはＡＣ及びＹＣ細胞におけるよりも非常に大きい。細胞ラインの数（Ｎ）はＡＤ、ＡＣ及びＹＣに関してそれぞれ９、８及び６である。数値は平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。図６Ａ−６Ｂ．（６Ａ）．細胞外カルシウムの存在下での１μｍボンベシンによって誘導されたＣａ²⁺反応。１μｍボンベシンは、細胞外２．５ｍＭＣａＣｌ₂の存在下で、ＹＣ及びＡＣ細胞では［Ｃａ²⁺］_iのピークを迅速に誘発し、その後に持続相を生じるが、ＡＤ細胞では［Ｃａ²⁺］_iのピークを誘発しなかった。矢印は薬物投与を示す。（６Ｂ）．ボンベシン供給後９０秒間に明らかな差異を説明する棒グラフ。正常な細胞外カルシウム（２．５ｍＭ）の存在下で、対照細胞では持続的なカルシウム侵入が初期ボンベシン反応に続くが、ＡＤ線維芽細胞では完全に存在しない。ボンベシン供給後９０秒間に明らかな差異を示す、これはｐ＜０．００１の有意性レベルを有する。図７Ａ−７Ｄ．ヘルミセンダ（Ｈｅｒｍｉｓｓｅｎｄａ）眼（７Ｂ）、イカ(s quid)視葉（７Ｃ）及びイカ３〜３０ｋＤａ画分（７Ａ）からのタンパク質のＡ₂ ₄₀ ＨＰＬＣトレーシング。光回転に連携するように訓練されたＨｅｒｍｉｓｓｅｎｄａからの３６個の眼又は１／１０イカ視葉をテキストに記載されたようにアニオン交換ＨＰＬＣによって分析した。調節されない(unconditioned)Ｈｅｒｍｉｓｓｅｎｄａでは、Ｃｐ２０ピーク（矢印）はここに示した調節された動物からのＣｐ２０ピークよりも３〜４倍小さかった。（７Ｄ）．イカ視葉タンパク質からのＨＰＬＣトレーシングからのｔ_Rの、訓練されたＨｅｒｍｉｓｓｅｎｄａ眼からのタンパク質の基準クロマトグラムからのｔ_R（保持時間）に対する相関曲線。図８．精製イカＣｐ２０のＲＰ−ＨＰＬＣＡ₂₄₀プロフィル（上部）。１５ ’におけるピークはＤＴＴ成分と緩衝剤成分とを含有する非保持画分である。下部：以前の実験（ＮｅｌｓｏｎＴ．等，（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４７９〜１４８３）からの１つのＨｅｒｍｉｓｓｅｎｄａＣＮＳからのＣｐ２０ピークのＲＰ−ＨＰＬＣ再クロマトグラフィー。４、１２、１５、４２、４６及び７８分間目のピークは緩衝剤成分である。流量：０．５ｍｌ／分。図９Ａ−９Ｄ．精製イカＣｐ２０のＳ−３００（９Ａ）及びＣＭ−３００（９Ｂ）カチオン交換ＨＰＬＣＧＴＰアーゼプロフィル。各画分の半分をＧＴＰアーゼ活性に関して分析し、半分をＳＤＳゲル上で分析した。（９Ｂ）における１８分間後に、ＨＰＬＣ溶媒による分析の干渉のためにＧＴＰアーゼ基底ラインは急激に上昇した。（９Ｃ）ＤＴＴ（ジチオトレイトール）の不存在下で精製されたイカＣｐ２０のＧＰＣ−１００サイズ排除ＨＰＬＣＧＴＰアーゼプロフィル。この段階までに、Ｃｐ２０の大部分はダイマー化した。（９Ｄ）抗Ｃｐ２０の特異性。１０個のＨｅｒｍｉｓｓｅｎｄａＣＮＳからの上澄みをＡＸ−３００カラムに供給した。各画分をブロットし、マウス抗Ｃｐ２０と反応させ、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）／ＢＣＩＰ（ブロモー４クロロー３−インドリルホスフェート）によって展開させた。ブロットを走査し、Ｏ．Ｄ．に換算し、コンピュータによって積分した。３１分間目の大きいピークはＡ₂₄₀プロフィルにおけるＣｐ２０ピークと一致した。図１０Ａ−１０Ｌ．（１０Ａ，１０Ｂ）Ｃｐ２０の２０ｋＤａ形と４０ｋＤａ形とのＤＴＴによる相互変換。ＤＴＴの不存在下でアニオン交換ＨＰＬＣによって精製されたＣｐ２０を非変性(non-denaturing)ゲル上で分画した。このゲルの４０ｋＤ領域を溶出させ、ＤＴＴ（１０Ａ）又は水（１０Ｂ）と反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。（１０Ｃ）精製されたイカＣｐ２０のＳＤＳゲル。（１０Ｄ−１０Ｇ）イカ上澄み（１０Ｄ）と、Ｈｅｒｍｉｓｓｅｎｄａ上澄み（１０Ｅ）と、ウサギ海馬粒子（１０Ｆ）及び上澄み画分（１０Ｇ）とのウェスターンブロット、抗Ｃｐ２０モノクローナルＡＢと反応させたもの。（１０Ｈ）精製イカＣｐ２０と抗Ｇｉαとの交差反応のウェスターンブロット（染色：１０Ａ−１０Ｃ，ＣＧ（コロイド金）；１０Ｄ−１０Ｇ，ＡＰ／ＢＣＩＰ；１０Ｈ −１０Ｌ，ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／ジアミノベンジジン（ＤＡＢ））。（１０Ｉ−１０Ｌ）：（１０Ｉ，１０Ｊ）ＡＲＦ、（１０Ｋ）酵母Ｓａｒｌｐ、及び（１０Ｌ）抗Ｃｐ２０ポリクローナル抗体と反応させたイカＣｐ２０のウェスターンブロット（染色：ＨＲＰ／ＤＡＢ）。（１０Ｊ）は（１０Ｉ）におけるＡＲＦ帯を一層明確に示すために対比強化した(contrast-en hanced)ものである。図１１Ａ−１１Ｂ．ＤＴＴの存在下で精製された、イカＣｐ２０（１１Ａ）とＨｅｒｍｉｓｓｅｎｄａＣｐ２０（１１Ｂ）との２Ｄゲル（コロイド金染色）。図１２Ａ−１２Ｂ．（１２Ａ）ｃｐ２０（配列番号１）のトリプシンペプチドおよび他のタンパク質の配列。上段の配列は、ｃｐ２０の３個の異なるバッチからの同一のペプチドの配列のコンセンサスである。Ｇｉα（配列番号４）（Mich el T.，et al.（1986）Proc ．Nat．Acad．Sci．USA 7663-7667.）、ｒａｓ（配列番号５）（Santos E.，Nebreda A.R.（1989）FASEB J. 3，2151-2163.）、ｒａｂ（配列番号６）（Zahraoui A.，et al.（1989）J ．Biol．Chem．264，12394 -12301.）、ｓｅｃ４（配列番号７）（Salminen A.，Novick P.J.（1987）Cell 49，527-538）、およびショウジョウバエＧｏα（配列番号８）配列（Schmidt C .J.，et al.（1989）Cell Regul. 1，125-134.）中の対応領域を示す。（１２Ｂ）ｃｐ２０のトリプシン消化のＲＰ−ＨＰＬＣＡ₂₁₄プロフィール図１３Ａ−１３Ｄ．Ｃｐ２０のウエスタンブロット分析。（１３Ａ）イカ視葉から精製したＣｐ２０とのモノクローナル抗−Ｃｐ２０の反応のウエスタンブロット（染色：ＨＲＰ／ジアミノベンジジン）。（１３Ｂ）Ｃｐ２０に対応する染色されたタンパク質バンドを示す代表的ウエスタンブロット（インデックス線）。視覚観察により、年齢適合対照（ＡＣ）からの繊維芽細胞と比較して、ＡＤ（アルツハイマー病繊維芽細胞）およびＥｓ（エスケーピー（Escapees）。症状を有さないアルツハイマー病患者の近親者）におけるＣｐ２０の減少が分かる。（１３Ｃ）各細胞株の定量的分析のグラフ表示は、ＡＤ（●）およびＥｓ（□）と比較した場合、対照（△）の間で、重複なしで明らかに有意な相違が存在することを示している（ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉポスト試験）。ＡＤおよびＥｓ繊維芽細胞の間に有意な相違は見つからなかった。（１３Ｄ）グループデータを示す棒グラフ。これは、ＡＤおよびＥｓ細胞株と比較した場合、対照繊維芽細胞の間の有意なＣｐ２０の相違をも示す。図１４Ａ−１４Ｂ．ＡＤ、Ｅｓ、およびＡＣ繊維芽細胞のクマシー染色タンパク質ゲル。（１４Ａ）検討した全３グループ中のタンパク質プロフィールを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。これらの領域は、Ｃｐ２０に類似した分子量（約２０ｋＤ）を有するタンパク質バンドに特別の注意を払って、ＡＤおよびＥｓ繊維芽細胞における一般化したタンパク質の変化を検出ために、詳細に分析した。（１４Ｂ）Ｃｐ２０領域の定量的分析（グラフ）により、２０ｋＤ領域付近にグループ間で相違がないという視覚的印象が確認された。同様の分析はまた、６６から３６ｋＤのＭＷを有するタンパク質の相違がグループ間になく、また２００ｋＤ分子量領域中にもないことを示した（実施例６を参照）。図１５Ａ−１５Ｄ． β−アミロイドは、対照繊維芽細胞中のＣｐ２０の減少を誘導する。（１５Ａ）β−アミロイドで４８時間処理したＡＣ繊維芽細胞（右）および同一の未処理細胞株（左）のウエスタンブロット。Ｃｐ２０（インデックスライン）の減少は、未処理カウンターパートと比較してβ−アミロイド処理細胞において明確に観察することができる。（１５Ｂ）棒グラフは、β−アミロイド処理細胞および未処理細胞の間の有意な相違（ｐ＜０．００３、Wilcoxon ）を示す定量的分析を示す。（１５Ｃ）全タンパク質プロフィール（クマシーブルー）は、処理細胞株および未処理細胞株の間の相違を明らかにしなかった。（１５Ｄ）２０ｋＤ付近のタンパク質バンド（Ｃｐ２０Ｍ．Ｗ．）の定量的分析により、β−アミロイドが２０ｋＤＭＷ領域タンパク質の一般的減少を生じさせないことが確認された（棒グラフ）。他のバンドの分析（実施例６を参照）もまたβ−アミロイド作用を示さなかった。図１６Ａ−１６Ｃ．ブラジキニン誘導応答。１００ｐＭブラジキニンに対する応答におけるカルシウム上昇は、ＡＤ細胞株にほぼ排他的に観察された。グラフは、試験した各細胞株を示す（１６Ａ）。応答の程度は、要求に応答する細胞の％として表される（ピークまたは統合領域中に相違は、応答細胞の間では見られなかった）。一つのみ（１４）のＡＤ細胞株が応答し、大部分は、応答を示した一つの対照（ＡＧ０７１４１）より高い応答細胞の％を有していた。Ｅｓからの細胞株は、対照グループと匹敵する応答を有する。高度に有意なグループ相違が棒グラフ中に示される（１６Ｂ）。応答の代表的トレースは１６Ｃに示される。実線は、Coriell Cell Repositories からの細胞である。破線は、Italian 起源の細胞である。矢印は薬物の適用を示す。図１７Ａ−１７Ｂ．ＴＥＡ誘導応答。棒は、各グループ中の応答細胞の平均％を示す。ＡＤ細胞株の応答細胞の％は、対照と比較して有意に減少した（ｐ＜０．００１）。カナダ人ＡＤ家系からのＥｓは、平均で、ＡＤ細胞株と同様の応答細胞の％を示し、対照よりも有意に低かった（１７Ａ）。典型的なＴＥＡ−誘導応答を１７Ｂに示す。点線および実線は、図１６Ａ−図１６Ｃ中におけるように、細胞の起源を示す。図１８．ＡＤのためのインデックス。ドットは、各々の特別の細胞株に対する組み合わせたスコア値を示す。図から明確に分かるように、対照（白丸）は、ＡＤ細胞株（黒丸）より有意に高い値を有している（ｐ＜０．００１）。２つのグループはまた、重複することなく分離している。発明の詳細な説明本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の診断方法に関する。本方法は、ＡＤ患者の細胞中には存在しないカリウムイオンチャンネルに特異的なカリウムチャンネルブロッカーに対する応答におけるＡＤ細胞および非ＡＤ細胞中の細胞内カルシウムイオン濃度の相違；並びに、イノシトール−１，４，５−トリスホスフェート（ＩＰ₃）の活性化剤などの細胞内カルシウム放出の活性化剤に対する応答におけるＡＤ細胞および非ＡＤ細胞の相違に基づいて、ＡＤ患者の細胞において特別のカリウムイオンチャンネルが存在しないことを検出することに基づいている。本発明はまた、ＡＤ患者の細胞における記憶関連ＧＴＰ−結合タンパク質（Ｃｐ２０）のレベルの有意な減少を検出することに基づいたＡＤのさらなる診断方法を提供する。本発明の第１の実施態様は、ＡＤを罹患しない人からの細胞は、パッチクランプ技術（実施例１を参照）により測定した場合で１１３ｐＳ（ピコジーメンス）および１６６ｐＳのコンダクタンスを有する（少なくとも）２種の機能的カリウムチャンネルを有しているという、本発明者の知見に基づくものである。１１３ｐＳチャンネルは、ＡＤの患者では、欠損しているかまたは機能的ではない。本発明の第１の実施態様は、患者の細胞が機能的１１３ｐＳカリウムチャンネルを有しているか否かを測定することによりＡＤを診断することを含む。機能的１１３ｐＳカリウムチャンネルの存在は、患者がＡＤを有していないことを示す。しかしながら、機能的１１３ｐＳカリウムチャンネルが存在しないことは、患者がＡＤを有することを示す。本発明のこの実施態様では、細胞中の電気コンダクタンスを記録するための好適な方法を使用して、細胞中の機能的カリウムチャンネルを検出しなければならない。細胞中で電気コンダクタンスを測定することができる任意の技術を使用することができる。例えば、細胞内マイクロ電極レコーディング（間接測定）、２マイクロ電極ボルテージクランプ、および単一マイクロ電極ボルテージクランプが挙げられる。本明細書中に記載したような、パッチクランプ技術は、小さな構造において電気コンダクタンスを測定するための好適な方法である。本発明の実施態様においては、パッチクランプ技術の細胞付着モードを使用して、カリウムチャンネルの存在を記録し、内側から外（inside-out）および外側から外（outs ide-out）のパッチ配置を使用して、各種の化学物質に対するカリウムチャンネルの感受性を記録する。本発明の第２の実施態様は、ＡＤの診断のための別の方法に関する。この第２の実施態様では、細胞を、１１３ｐＳチャンネルをブロックするが１６６ｐＳチャンネルをブロックしないカリウムチャンネルブロッカーと接触させる。このブロッカーは、１１３ｐＳチャンネルを実質的にブロックすることができるが、１６６ｐＳチャンネルを実質的にブロックすることができない。そのようなブロッカーの例はＴＥＡ、またはテトラエチルアンモニウムである。ブロッカーは、細胞内Ｃａ²⁺濃度を瞬間的に増加させるという作用を非ＡＤ細胞において有している。ＡＤ細胞では、ブロッカーは実質的に作用を有しておらず、実測的または技術的な誤差の範囲内で変化することが許容される。対照的に、細胞内カルシウムイオン濃度は、１００ｍＭのＴＥＡに露出した後に、非ＡＤ−細胞中で数倍に増加する（図４Ｂを参照）。細胞内Ｃａ²⁺濃度は、蛍光指示薬または吸収指示薬を添加することによって、またはＣａ²⁺電極を使用することによって、などのような多様な方法で測定することができる。好ましくは、操作の容易さのために、蛍光指示薬が使用される。本発明のこの実施態様においては、細胞を最初に、カルシウム濃度に比例した強度で蛍光を発する、クインまたはフラ−２などのようなＣａ²⁺指示薬とともに培養する。次いで細胞を、１１３ｐＳチャンネルをブロックできるが、１６６ｐＳをブロックできない選択カリウムチャンネルブロッカーと接触させる。カリウムチャンネルブロッカーの添加の前後における細胞の蛍光強度を測定する。ＡＤを罹患しない人からの細胞においては、蛍光強度は急速に増加し、ピークに達し、次いで低下する（図４Ｃ）。これは、ブロッカーがカルシウムイオン濃度を急速に増加させる作用を有していることを示している。ＡＤ患者からの細胞では、蛍光強度は、ブロッカーが添加される前後で実質的に同一である。これは、１１３ｐＳチャンネルがＡＤ患者では欠損しているか機能的ではないという事実の反映であり、従って１１３ｐＳチャンネルをブロックするが１６６ｐＳチャネルをブロックしないカリウムイオンチャンネルブロッカーはＡＤ細胞に対して影響を有さないのである。上記のとおり、本発明のこの第二の態様に用いられる選択カリウムチャンネルブロッカーは、１１３ｐＳカリウムチャンネルをブロックする能力を有するが１６６カリウムチャンネルへの効果はほとんどまたは全くないブロッカーである。そのようなブロッカーの一例はＴＥＡであり、あらゆる生物学上適合可能なカウンターアニオンを有する。好ましくは、カウンターイオンは塩素である。他の適切なカウンターチャンネルブロッカーは、以下の方法を用いて容易に発見することができる。実施例１に記載されたパッチクランプ技術を用いて、１１３ｐＳおよび１６６ｐＳチャンネルが生存可能なヒト細胞から検出される。候補となるカリウムチャンネルを、該細胞を含有する培養物に加え、そしてパッチクランプ技術を再度用いる。１６６ｐＳチャンネルはまだ機能するが１１３ｐＳチャンネルが機能しなければ、候補のブロッカーは本発明に用いるのに適している。候補のカリウムチャンネルブロッカーは、公知のカリウムチャンネルブロッカー、カリブドトキシン、アパミン、デンドロトキシン、カリドトキシン、ＭＣＤ−ペプチド、スキラトキシン、バリウム、セシウム、ライウロトキシンＩおよびノクシウストキシンを含む。実施例２に示すとおり、１０ｍＭから１００ｍＭの間のＴＥＡ濃度がうまく作用する。ＡＤおよび非ＡＤ対照細胞を用いることにより、作用可能なこの濃度範囲を拡大することは容易である。実施例２は、選択カリウムチャンネルブロッカーＴＥＡを用いてＡＤを診断し、そして細胞内カルシウムイオンへの作用を測定するための本発明の第二の態様を例示する。この方法は単純であり、イエスまたは非回答を伴い、診断のために例示された複雑高度な装置を必要としない。選択カリウムイオンチャンネルブロッカーとの接触の結果として細胞内カルシウムイオン濃度が上昇したか否かを知らせるためのあらゆる方法が、十分に診断を提供する。この好ましい方法においては、蛍光カルシウムイオン指示薬が用いられる。この場合、選択カリウムイオンチャンネルブロッカーと細胞の接触の結果として指示薬の蛍光が上昇したか否かを知らせるためのあらゆる方法が足りる。用いられるあらゆる方法が、利用可能な短い時間内の測定を可能にするにちがいない。カルシウムイオンの取り込みはブロッカーとの接触後短時間でピークに達し、そしてベースラインの値まで低下する。実施例２においては、ピークに達するまでの時間は１分より短い。蛍光カルシウムイオン指示薬を検出するための単純化された方法は、蛍光計、カルシウムイオン指示薬を励起するための光源および蛍光強度を測定するための光度計の使用を含むはずである。蛍光計はよく知られており市販されている。もっとも単純なレベルでは、カルシウムイオン指示薬を患者から採取した細胞（新鮮かまたは培養により増殖させた）に加える。指示薬と接触させてから１時間ほどのちに（約２マイクロモラー濃度）、懸濁した細胞を蛍光計の中に入れ、蛍光計からの蛍光強度を測定する。次に、選択カリウムチャンネルブロッカーを加えるが、ＴＥＡを用いる場合は約１００ｍＭの濃度を加える。蛍光を再び測定する。２０秒か４０秒の時間内で蛍光強度がＴＥＡ添加時と実質同じであれば（ＴＥＡ添加による体積の変化を考慮にいれて）、ＡＤの陽性診断がなされる。３０秒以内に強度が増加してさらに３０秒以内に沈下すれば、患者はＡＤを有さない。上記の概要の単純スキムを改良することは当業者の範囲である。例えば、２部分からなるサンプルホルダーを有する蛍光計を用いることが可能であり、２つのサンプルの蛍光の差異を測定する。各サンプルホルダーにおいて同一サンプルの患者細胞（指示役とともにインキュベーション後）から出発するならば、選択カリウムチャンネルブロッカーを一方のサンプルのみに加える。異なるシグナルにおいて変化がなければ（即ち、本質的にゼロのまま）、ＡＤの診断結果がなされる。異なるシグナルが顕著に変化すれば、患者はＡＤを有さない。この差異を用いる方法の利点は、測定の正確さを増加させる対照を構成要素として有することである。選択カリウムチャンネルブロッカーを自動的に添加し、そして一回に一測定以上を行うこと、即ち営利の医学実験室のために方法を自動化することは当業者の範囲である。本明細書において教示される方法を用いてあらゆる診断を行う前に、市販されている非ＡＤおよびＡＤ対照細胞を用いることにより実験室内の特定の装置および条件を最適化すべきである。本発明の第三の態様はＡＤを診断するためのさらに別の方法である。この方法は、イノシトール−１，４，５，−３リン酸（ＩＰ₃）を活性化するか、さもなくば細胞内貯蔵部位からのカルシウムの放出を誘導する薬剤の作用に関する。そのような貯蔵部位は、ＩＰ₃リセプターを有する小胞体または他の器官を含む。本発明に有用な細胞内貯蔵所からのカルシウムの放出を活性化する他の薬剤は、トロンビン、ブラジキニン、プロスタグランジンＦ₂ _αおよびバソプレシンを含む。例えば、ベリッジとイルビン（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄＩｒｖｉｎｅ，Ｒ．Ｆ．）（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ３１２：１３５を参照されたい。ＡＤを罹患していない人からの細胞およびＡＤを罹患していない人からの細胞は共にボンベシンに応答してカルシウムイオンを一時的に放出するが、その結果の細胞内カルシウム濃度は非ＡＤ細胞に比してＡＤ細胞においており大きい。測定は細胞内カルシウムイオン濃度を測定するためのあらゆる方法を用いて容易になされ、本発明の第二の態様に関して前に考察されたとおりである。再び、蛍光カルシウム指示薬の使用は好ましい方法である。蛍光強度を測定するための上記と同じ実験設備、即ち蛍光計を用いることができる。この方法においては、非ＡＤ細胞およびＡＤ細胞を対照として用いて蛍光装置を標準化することも可能である。この方法において、まさに患者の細胞ののちの測定が診断を提供しうる。別法として、患者の細胞を、対照としての非ＡＤ細胞を比較することができる。実施例３は、ＩＰ₃の活性化剤を使用して該活性化剤と接触後の細胞内貯蔵部位からサイトゾルへのカルシウムイオンの放出への効果を測定することによるＡＤの診断に関する本発明の第三の態様を例示する。放出されたカルシウムの量は、非ＡＤ細胞に比してＡＤ細胞の方が大きい。細胞内カルシウム濃度の増加は一時的なものであり、濃度のピークは活性化剤との接触後間もなくであり、９０秒以内にベースラインの値に戻る。この効果は、細胞外カルシウムイオン濃度がゼロまたはゼロ付近の場合に高められる（一般には名目上カルシウムを含まないＢＳＳで細胞を洗浄することにより達成されるが、しかしながら細胞外カルシウムイオンの作用を妨害するかまたは打ち消す他の方法を使用でき、例えば、それぞれ、ＥＧＴＡの添加またはカルシウムチャンネルブロッカー例えばニフェジピンの添加である）。ＩＰ₃の活性化剤例えばボンベシンと接触後、ＡＤ細胞内の細胞内カルシウムイオン濃度は最も高いピーク値に達し、若いかまたは老化した対照細胞に比してベースライン値に戻るには時間がかかる（図５Ａ）。実施例３に記載された実験装置においては、ボンベシンが細胞に添加されてから４２秒後にＡＤ細胞と対照細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の差が最大になったこと、およびそのとき即ちボンベシン適用４２秒後に、カルシウムイオン濃度はいつもＡＤ細胞の３００ｎＭより大きく、且つ対照の非ＡＤ細胞の３００ｎＭよりいつも小さかったことが見いだされた（図５Ｂ）。ＡＤおよび非ＡＤ繊維芽細胞の両者の基底レベルは８０ｎＭ±０．５ｎＭであった。しかしながら、対照値は８０ｎＭとは異なっているかもしれず、３００ｎＭより大きいかまたは小さいカルシウムシグナルの基準レベルを必要とすることは、注意すべきである。さらに、ＡＤと非ＡＤの間の繊維芽細胞のカルシウムシグナルの最大の差異を示すためには、条件の測定における差異は４２秒よりも長いかまたは短い時間を必要とするかもしれない。また、本文中で例示した複雑な方法及び装置の使用も不要である。このＡＤ診断方法は、より簡便に実施し得る。細胞内カルシウムの絶対濃度を測定する必要はなく、相対値の測定で十分である。実施例３で、静止細胞（即ち、不活性細胞）中の細胞内カルシウムイオン濃度の基底レベルは、ＡＤ細胞と非ＡＤの対照細胞との双方で８０ｎＭ±０．５ｎＭという同じ値であった。従って、ＡＤ細胞及び非ＡＤ細胞の濃度が最大に達した時点で（この時点は、例えばボンベシン及び本発明装置を使用したときは４２秒であったが、種々の活性化物質及び種々の装置の各々について実験的に算出する必要がある）、非ＡＤ細胞中の細胞内カルシウム濃度は、基底レベルの（３００／８０＝）３．７５倍未満であったが、ＡＤ細胞中の細胞内カルシウム濃度は（３００／８０＝）３．７５倍であった。市販のＡＤ細胞及び非ＡＤ細胞を使用して、ＡＤ細胞と非ＡＤ細胞とのカルシウム濃度差が最大になる時点を容易に決定できる。この決定のためには、静止細胞の細胞内カルシウムの相対濃度を測定し、ボンベシンまたはその他のＩＰ₃活性化物質を添加し、カルシウムイオンの相対濃度をほぼ１分間追跡し、（活性化物質添加後の）カルシウムイオンの相対濃度差が最大になる時点を求める。次に、患者から実際に採取した任意のサンプルについて、当業者に公知の任意の手段によって細胞内カルシウムの相対基底濃度を測定し、活性化物質を所定濃度（ボンベシンの場合には約１マイクロモル）まで添加し、所定の時間放置し、細胞内カルシウムの相対濃度を再度測定するだけでよい。活性化物質添加“以前”の細胞内カルシウムの濃度に対する活性化物質添加“以後”の細胞内カルシウム濃度の比が３．７５よりも大きい値であるならば、患者はＡＤに罹っている。３．７５未満の値であるならば、患者はＡＤに罹っていない。カルシウムの濃度差が最大になる時間を測定する必要はない。これらの比の間に再現可能な差が存在するようないかなる時間を使用してもよい。既知のＡＤ細胞及び非ＡＤ細胞を対照として用い、選択された時間におけるこれらの細胞の比を算出するだけでよい。第２及び第３の実施態様で使用されるカルシウムイオン指示薬は、細胞に侵入することができ、生体適合性であり、カルシウムイオンに結合して種を産生し、このように産生された種の濃度が任意の物理−化学手段を用いて容易に測定でき且つカルシウムイオン濃度に比例するようないかなる化合物も包含する。好ましくは、濃度測定手段が蛍光または吸光度である。好ましい蛍光指示薬としては、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から提供される市販の指示薬、ｆｕｒａ−２ＡＭ、ｆｕｒａ−２ペンタカリウム塩、ｑｕｉｎ −２、及び、ｉｎｄｏ−１がある。ｆｕｒａ−２ＡＭは、ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓに収載された５−オキサゾールカルボン酸、２−（６−（ビス（２−（（アセチルオキシ）メトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）−５− （２−（２−（ビス（２−（（アセチルオキシ）メトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）−５−メチルフェノキシ）エトキシ）−２−ベンゾフラニル）−（アセチルオキシル）メチルエステルの名称である。ｆｕｒａ−２ペンタカリウム塩は、ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓに収載された５−オキサゾールカルボン酸、２−（６−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）−５−（２−（２− （ビス（カルボキシメチル）アミノ−５−メチルフェノキシ）エトキシ）−２− ベンゾフラニル）の名称である。その他の蛍光性カルシウム指示薬としては、Ｆｌｕｏ−３、Ｒｈｏｄ−２、ＣａｌｃｉｕｍＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＣａｌｃｉｕｍＯｒａｎｇｅ（登録商標）、ＣａｌｃｉｕｍＣｒｉｍｓｏｎ（登録商標）、ＦｕｒａＲｅｄ（登録商標）及びＣａｌｃｉｕｍＧｒｅｅｎＤｅｘｔｒａｎ（登録商標）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））がある。一般には、細胞を約２マイクロモルの濃度の指示薬と共に約６０分間インキュベートする。使用され得る吸光度指示薬としては、アルゼナゾがある。最後に本発明の場合には、細胞内に挿入されたカルシウム電極によってカルシウムレベルを測定してもよい。例示した本発明の実施態様においては、パーソナルコンピュータのコントロール下のイメージング装置を用いて蛍光を測定した。無色フィルター（ｎｅｕｔｒａｌｄｅｎｓｉｔｙｆｉｌｔｅｒ）の付いた通過帯域３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの帯域フィルター（ｂａｎｄｐａｓｓｐａｔｈｆｉｌｔｅｒ）を励起に使用した。二色ミラー、遮断フィルター及び対物レンズを用いて蛍光像を作成した。全体像またはその一部分を記録し得る。顕微鏡視野の６０個の細胞を１０倍の倍率でイメージングし得るＨａｍａｍａｔｓｕＰｈｏｔｏｎｉｃｓＡｒｇｕｓ５０のカルシウムイメージング装置を使用した。倍率１０倍の視野の１／４の面積において細胞から発生した蛍光を定量した。顕微鏡の付いたこのようなイメージング装置（及び他の同様の現行の装置）は、臨床検査室で日常的に行う細胞のカルシウムシグナルの分析に適応するように設計することができる。別のカルシウム指示薬を使用するためには別の器具類及び／または別の測定法を適応させるとよい。本発明の方法において、患者から採取される細胞は任意の生細胞でよい。好ましい細胞は、繊維芽細胞；頬粘膜細胞；赤血球、リンパ球、リンパ芽球様細胞などの血液細胞；または、嗅覚ニューロンなどの神経細胞である。細胞は生鮮細胞でもよく、または、（実施例に記載したように）培養してもよい。繊維芽細胞のカリウムチャンネルの機能不全及びその結果として生じる本文に記載したようなＴＥＡ誘発カルシウムシグナルの欠如は、主として脳細胞を冒すＡＤが、体内の多くの異なるタイプの細胞のカリウムチャンネル機能を変質させ易いことを示唆する。ＡＤはまた、体内の多くの異なるタイプの細胞中でのボンベシン及び類縁物質によるカルシウムの放出を変質させ易い。従って、カリウムチャンネル機能及びカルシウム放出を測定する本文に記載の方法は、他のタイプの細胞を用いたＡＤ診断にも応用できる筈である。患者から皮膚繊維芽細胞を採取するために、皮膚のパンチ生検を使用するとよい。これらの繊維芽細胞を本文に記載の技術によって直接分析してもよく、または、細胞培養条件に導入してもよい。得られた培養繊維芽細胞を、後述するＣｏｒｉｅｌｌＣｅｌｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓから得られた培養繊維芽細胞と同様に分析する。頬粘膜細胞、嗅覚細胞のような神経細胞、赤血球及びリンパ球のような血液細胞、などの他のタイプの細胞を分析に使用する場合には別の準備段階が必要であろう。例えば、血液細胞は、末梢静脈からの採血によって容易に得られる。次に、標準手順（例えば、セルソーター、遠心分離、など）によって細胞を分離し、その後、浮遊液中または固体支持体（例えば、シャーレ）上で分析する。本発明の第４の実施態様は、更に別のアルツハイマー病診断方法に関する。この実施態様は、健康な対照の細胞に比較してアルツハイマー病患者の細胞では記憶に関連するＧＴＰタンパク質Ｃｐ２０が有意に減少しているという本発明者らの知見に基づく。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の高親和性基質であるＣｐ２０（Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５１，９０３（１９８８））は、連想学習を経験した哺乳動物と軟体動物との間でニューロンのリン酸化に種差を示す（Ｊ．Ｔ．Ｎｅａｒｙ，Ｔ．Ｃｒｏｗ，Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ２９３，６５８（１９８１）；Ｔ．Ｊ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｖ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ａｎｄｒｅｓ；Ｂ．Ｇ．Ｓｃｈｒｅｕｒｓ，Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７，２０６５（１９９１）；Ｔ．Ｊ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｃｏｌｌｉｎ，Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７，１４７９（１９９０））。このＧＴＰ結合タンパク質は、多数の記憶特異的ニューロン変化を誘発し〔例えば、Ｋ⁺電流減少、ｍＲＮＡ合成増加、神経終末の収束、Ｔ．Ｊ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｃｏｌｌｉｎ，Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７，１４７９（１９９０）；Ｔ．Ｊ．ＮｅｌｓｏｎａｎｄＤ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ，ＵＳＡ８５，７８００（１９８８）；同書８７，２６９（１９９０）；Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，１６１１（１９９０）〕、また、逆行性軸索輸送を調節し（Ｓ．Ｍｏｓｈｉａｃｈら，ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ６０５，２９８（１９９３））、ゴルジ体と小胞体との間の粒子交換に関与しているタンパク質ファミリーに属するアデノシン二リン酸リボシル化因子（ＡＲＦ）の構成員である（実施例５参照）。Ｃｐ２０は、アルツハイマー病患者及びアルツハイマー病に罹ってはいないこの患者の近親者の双方の繊維芽細胞中で例外なく有意に減少しているが、遺伝性アルツハイマー病をもつ家系の一員でない同年配の対照中では減少していないことがここに証明された。低濃度の可溶性β−アミロイドと共に正常繊維芽細胞をインキュベーションすると、Ｃｐ２０のアルツハイマー病表現型が誘発された。Ｃｐ２０タンパク質のレベル変化を検出し得るいかなるイムノアッセイ法も有効であろう。本発明の方法では、Ｃｐ２０タンパク質を認識する抗体を、イムノアッセイによって診断する患者の細胞から単離したタンパク質サンプルと接触させる。Ｃｐ２０タンパク質と抗体との複合体の形成を検出し、１つ以上の対照サンプルに比較して試験個体中のＣｐ２０タンパク質のレベル変化を測定する。アルツハイマー病のＣｐ２０診断アッセイは、アルツハイマー病の診断と明白な正の相関関係を有するので、アルツハイマー病に使用されていた複雑な臨床手順を大幅に改善するであろう。このアッセイを、アルツハイマー病の臨床診断法または他の公知のアルツハイマー病診断法と併用するのが好ましい。例えば、このアッセイによってアルツハイマー病であると診断された患者または個体は、臨床医によってアルツハイマー病の暫定診断を受けた個体、アルツハイマー病の臨床症状を殆ど示さない個体、非定型の痴呆であると診断された個体、アルツハイマー病をもつ家系の一員である個体も含む。対照サンプル（アルツハイマー病の家族性履歴をもたない健康な同年配の個体）に比較して統計的に有意なＣｐ２０タンパク質レベルの減少は、患者がアルツハイマー病であることを予測させる正当な根拠となり得る。アルツハイマー病の家族性履歴をもたない同年配の健康な個体から単離された対照タンパク質サンプルと比較することによって正常であると判断されたＣｐ２０タンパク質レベルは、被験者がアルツハイマー病でないことを証明する。このアッセイによって診断すべき患者の細胞中のＣｐ２０タンパク質のレベルを対照タンパク質サンプルに比較して評価することは当業者に理解されよう。対照タンパク質サンプルは、家系にアルツハイマー病の履歴をもたない同年配の健康な対照の適正集団のサンプルから単離しなければならない。例えば、適正なサイズの対照集団のサンプルから判断してＣｐ２０のレベルが対照よりも約４０％〜６０％またはそれ以上も減少している場合、これは、アルツハイマー病の指標となる。診断すべき患者から採取されたサンプルを同年配の健康な対照から採取した対照タンパク質サンプルと比べて評価すること、及び、被験者のタンパク質サンプル中のＣｐ２０レベルの有意な減少を所与のアッセイで使用される対照との比較に基づいて判断することは当業者に理解されよう。本発明のイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、エンザイムイムノアッセイ、免疫沈降、化学発光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ドット又はスロットブロットアッセイなどでよい。（「イムノアッセイの理論と実際（ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」（１９９１），ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＰ．Ｐｒｉｃｅ及びＤａｖｉｄＪ．Ｎｅｏｍａｎ（編），ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら，（編）（１９８７），「分子生物学の現行プロトコル（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。検出には、比色法、放射能法、または当業者に公知の他の任意の慣用方法を使用し得る。当業界で公知の標準ＥＬＩＳＡ法は、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＩｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＲｏｓｅａｎｄＢｉｇａｚｚｉ，編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９０、及びＣａｍｐｂｅｌｌら，ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，１９６４，に記載されている。双方の論文は参照によって本発明に含まれるものとする。このようなアッセイは、当業界で記載されている直接、間接、競合または非競合イムノアッセイのいずれでもよい（「イムノアッセイの理論と実際（ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」（１９９１）ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＰ．ＰｒｉｃｅａｎｄＤａｖｉｄＪ．Ｎｅｏｍａｎ（編），ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｏｅｌｌｉｒｉｃｈ，Ｍ．１９８４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：８９５−９０４；Ａｕｓｕｂｅｌら，（編）１９８７，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｌｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。この実施態様において、診断される患者から採取される細胞はいかなる細胞でもよい。使用され得る細胞の非限定例は、繊維芽細胞、頬粘膜細胞、赤血球、リンパ球、リンパ芽球様細胞などの血液細胞、及び神経細胞、並びに、Ｃｐ２０タンパク質を発現する他の任意の細胞である。剖検サンプル及び病理サンプルも使用し得る。また、これらの細胞を含む組織を使用してもよい。細胞は、生鮮細胞、培養細胞または凍結細胞のいずれでもよい。細胞または組織から単離したタンパク質サンプルを直ちに診断用アッセイに使用してもよく、または後で使用するために凍結させてもよい。好ましい実施態様では、繊維芽細胞を使用する。繊維芽細胞は前述のように皮膚のパンチ生検によって得られる。当業者に公知の慣用方法によってタンパク質を細胞から単離し得る。好ましい方法では、患者から単離した細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、ペレット化する。次いで、ペレットを、５０ｍＭのＮａＦと、１ｍＭのＥＤＴＡと、１ｍＭのＥＧＴＡと、２０μｇ／ｍｌのロイペプチンと、５０μｇ／ｍｌのペプスタチンと、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４とから成る「均質化バッファ」で洗浄し（実施例６参照）、遠心分離によってペレット化する。上清を廃棄し、「均質化バッファ」をペレットに添加し、次いでペレットを音波処理する。タンパク質抽出物をそのまま使用してもよく、または後で分析するために−８０℃で保存してもよい。本発明の方法で、イムノアッセイに使用する抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれを起原としてもよい。抗体産生に使用するＣｐ２０タンパク質またはその一部分は、天然ソースもしくは組換えソースに由来してもよく、または、化学合成によって作製してもよい。天然のＣｐ２０タンパク質は生物サンプルから慣用方法によって単離できる。Ｃｐ２０タンパク質の単離に使用できる生物サンプルの非限定例は、イカの視葉、Ｈｅｒｍｉｓｓｅｎｄａの神経系のような組織細胞、繊維芽細胞のような皮膚細胞、アルツハイマー病繊維芽細胞系、対照繊維芽細胞系のような繊維芽細胞系、などであり、これらはＣｏｒｉｅｌｌＣｅｌｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｄｅｎ，Ｎ．Ｊ．）から市販されており、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｉｎｇ１９９１ＣａｔａｌｏｇｏｆＣｅｌｌＬｉｎｅｓ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｎｅｒａｌＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ１９９２／１９９３ＣａｔａｌｏｇｏｆＣｅｌｌＬｉｎｅｓ〔（ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９２−２０１１（１９９２）〕に収載されている。例えば、標準方法を用いて組織を先ず均質化することによってイカの視葉からＣｐ２０を単離し得る。好ましい均質化バッファは、２０ｍＭのＤＴＴを補充した１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４と、２０μｇ／ｍｌのロイペプチンと、２０μｇ／ｍｌのペプスタチンと、５０ｍＭのＮａＦと、１ｍＭのＥＤＴＡと、１ｍＭのＥＧＴＡと、０．１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニル− フルオリド）とから成る（実施例５参照）。ホモジェネートからのタンパク質の単離及び精製は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような慣用のクロマトグラフィー法で行うことができる（実施例５参照）。精製には、アニオン交換及びカチオン交換の双方のＨＰＬＣカラムを使用するのが好ましい。更に、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安沈殿、または色素アフィニティークロマトグラフィーなど、または任意の他の慣用方法を追加の精製段階として使用し得る。あるいは、Ｃｐ２０タンパク質を認識する抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによってＣｐ２０タンパク質を精製してもよい。組換えＣｐ２０タンパク質またはペプチドをＣｐ２０抗体産生のために使用することもでき、これらの組換え体は慣用方法で産生及び精製される。合成Ｃｐ２０ペプチドは、注文通りに作製してもよく、または市販のものを利用してもよく、または、本発明で提供されるＣｐ２０タンパク質の部分的アミノ酸配列に基づいて当業者に公知の方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｓ．（１９６３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．８５：２１４９）で合成してもよい（図１２Ａ参照）。あるいは、単離したＣｐ２０を酵素消化処理し、得られたペプチドを用いて抗体を産生させてもよい。例えば、トリプシンを用いてＣｐ２０タンパク質を消化し、ペプチドを産生させる。特定のトリプシン消化条件がＣｐ２０の存在量及びＣｐ２０の調製方法（例えば、ナイロン膜もしくはニトロセルロースに結合しているのか、または、溶液中に存在するのか、溶液中に存在するならば他にどのような物質が存在するのか、など）に左右されることは当業者に理解されよう。当業者はまた、タンパク質のトリプシン消化をどのように実施し、配列決定に先立ってＨＰＬＣまたは他の手段でフラグメントをどのように精製するかに関しても知識を有しているであろう。代表的なＣｐ２０のトリプシン消化フラグメントを図１２Ａに示す。ペプチドが余りにも短くて抗原性を示さない場合には、ペプチドの抗原性を強化する担体分子にペプチドをコンジュゲートしてもよい。当業者に公知の担体分子の非限定例は、ヒトアルブミン、ウシアルブミン及びキーホールリンペットのヘモシアニンである（“ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（１９９１）Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．Ｐ．ａｎｄＴｅｒｒＡ．Ｉ．（編）ＡｐｐｌｅｔｏｎａｎｄＬａｎｇｅ，ＮｏｒｗａｌｋＣｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＳａｎＭａｔｅｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。本発明方法で使用される代表的な抗体分子は、完全形（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリン分子、実質的に完全形の免疫グロブリン分子、または、抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の部分であり、当業界では、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ’）₂及びＦ（ｖ）などがこのような免疫グロブリン分子の部分として知られている。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は当業者に公知の方法によって産生させ得る。（ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９５−４９７；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，「モノクローナル抗体技術、齧歯類及びヒトのハイブリドーマの産生及びキャラクタリゼーション（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＲｏｄｅｎｔａｎｄＨｕｍａｎＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ）」，Ｂｕｒｄｏｎら，（編）“ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌｕｍｅ１３，ＥｌｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。抗体または抗原結合フラグメントは、遺伝子工学によっても作製できる。大腸菌中でＨ鎖及びＬ鎖の双方の遺伝子を発現させる技術は、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３及びＷＯ９０１４４２４並びにＨｕｓｅら，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１の主題である。あるいは、Ｃｐ２０タンパク質またはペプチドまたはその一部分を業者に送付して抗体の産生を委託してもよい。本発明の抗体は、天然型または変性型のＣｐ２０タンパク質またはペプチドと反応し得る。どの抗体が望ましいかに関しては、抗体を用いる特異的イムノアッセイ次第で決まる。例えば、モノクローナル抗体を産生させるために、単離されたＣｐ２０またはその一部分をマウスの脾臓細胞に注入してもよい。当業者に公知の方法で脾臓をハイブリドーマ細胞に融合させ、所望のクローンを選択し、モノクローナル抗体を産生させて精製する。（Ａｕｓｕｂｅｌら，（編）１９８７，“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。ポリクローナル抗体もＣｐ２０タンパク質またはその部分またはそのペプチドを用いて標準方法で作製し得る。例としては、図１２Ａに示すＣｐ２０の部分アミノ酸配列（１文字コードで示す）に由来のペプチドを使用し得る。例えば、部分アミノ酸配列（図１２Ａ）に由来のペプチドＡＲＬＷＴＥＹＦＶＩＩＤＤＤＣ（配列番号９）を標準方法によって合成するとよい。慣用方法を使用し、好ましくはヘモ−リンペットヘモシアニンとコンジュゲートさせたＣｐ２０ペプチドによってウサギを免疫感作する。合成ペプチドを使用する場合には、コンジュゲーションを容易にするためにＣ−末端にシステイン基を付加することは当業者に容易に理解されよう。好ましくは、初回の注射には、フロインド不完全アジュバント中の約０．２〜１．０ミリグラム（ｍｇ）のペプチド−抗原を使用する。その後、不完全アジュバント中の同じ用量のブースターを動物に投与し、坑血清価をＥＬＩＳＡアッセイで測定する。抗ペプチド抗体価が平坦域に到達したときに十分な坑血清レベルが得られる。この抗体を上述の診断用イムノアッセイに使用し得る。あるいは、図１２Ａに示したＣｐ２０アミノ酸配列に由来のもっと短いペプチド配列、または、図１２Ａに示したＣｐ２０の完全アミノ酸配列を用いて動物を免疫感作しモノクローナル及びポリクローナルの双方の抗体を産生させるようにしてもよい。好ましい実施態様では、Ｃｐ２０タンパク質を認識する抗体を用いてウエスタンブロット分析によってタンパク質を検出し、アッセイによって診断すべき患者の細胞から単離したタンパク質サンプルと家系にアルツハイマー病履歴のない同年配の健康な対照個体から得られたタンパク質サンプルとを比較する。患者のサンプル中及び対照サンプル中のＣｐ２０タンパク質のレベルを肉眼によって判定してもよく、または標準的なデンシトメーターによるスキャン法を用いて判定してもよい。デンシトメーター分析には市販のコンピュータープログラムを利用し得る。対照細胞系もＣｏｒｉｅｌｌＣｅｌｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）から市販されている。予測されるＣｐ２０は、約２０キロダルトンのタンパク質であり、ＡＲＦタンパク質ファミリーの構成員であると同定できる構造的及び生化学的特徴を有している。Ｃｐ２０タンパク質はまた、約４０ｋＤの二量体の形態で存在し、アッセイでの使用条件次第で単量体または二量体として出現し得る。Ｃｐ２０の部分的アミノ酸配列を図１２Ａに示す。従って本発明はまた、図１２Ａに示すアミノ酸配列から成るＣｐ２０タンパク質に関し、より特定的には図１２Ａに示すＣｐ２０ペプチド配列に関する。本発明はまた、Ｃｐ２０タンパク質に実質的に相同で、本発明のＣｐ２０タンパク質と実質的に同じ機能を有するタンパク質またはペプチドを包含する。本発明はまた、Ｃｐ２０の核酸配列とＣｐ２０タンパク質の全部または一部を発現させるベクターとを含む組換えＣｐ２０タンパク質産生用発現ベクターに関する。このような発現ベクターに組込まれる核酸配列は、図１２Ａに示す部分アミノ酸配列に基づいて標準方法を用いて得られる。図１２Ａに示す部分アミノ酸配列から対応するＤＮＡ配列を作製しＤＮＡ配列を適当な発現ベクターに組み込むために、現存のｃＤＮＡライブラリースクリーニング技術またはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの種々の技術をどのように利用すればよいかということは当業者の知る処であろう。更に、このようなベクターに組み込む機能性要素の正しい組み合わせ、また、慣用方法（Ａｕｓｕｂｅｌら，（１９８７），“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）によってこのようなベクターを容易に構築することも当業者に明らかであろう。本発明で提供されるＣｐ２０アミノ酸配列はまた、当業者に公知の方法によって他の種からＣｐ２０のホモログを得るために使用することも可能である。本発明はまた、診断用アッセイを実施するために使用できるキットに関する。このようなキットは、Ｃｐ２０タンパク質を認識する抗体を含むであろう。この抗体はポリクローナルでもよくまたはモノクローナルでもよい。キットは更に、診断用アッセイでこれらの抗体を使用するための取扱説明書を含む。キットは更に、バッファ、第二抗体、などの他のアッセイ用試薬を含む。本発明の更に別の実施態様では、アルツハイマー診断用の診断指数が提供される。この指数は、２種類以上のアルツハイマー病診断試験を総合して、ＡＤ細胞と非ＡＤ細胞とを識別できる評点体系（スコアリングシステム）を提供する。診断指数を作成するために総合され得る診断試験の非限定例としては、本文中に記載の診断方法、例えば、アルツハイマー病患者の細胞中の１１３ｐｓのカリウムイオンチャンネルの欠失を検出する方法、ＡＤ細胞中で欠失しているカリウムイオンチャンネルに特異的なカリウムチャンネルブロッカーに応答して生じたＡＤ細胞及び非ＡＤ細胞中の細胞内カルシウムイオン濃度の差を検出する方法、細胞内カルシウム放出活性化物質に対する応答が示したＡＤ細胞及び非ＡＤ細胞の差を検出する方法、ＡＤ患者の細胞中の記憶関連ＧＴＰ結合タンパク質（Ｃｐ２０）のレベル低下を検出する方法がある。好ましくは診断指数を作成するために少なくとも２種類の診断試験を使用し、更に好ましくは診断指数を作成するために３種類の診断試験を使用する。診断指数を作成するために使用される２種またはそれ以上の診断試験は、ＡＤ細胞対非ＡＤ細胞の同じ変質を判定し得るかまたはＡＤ細胞対非ＡＤ細胞の異なる変質を判定し得る。例えば、指数を与える評点体系を３種類の診断試験から構成し、第一の試験は、カリウムイオンチャンネルブロッカーに応答して生じたＡＤ細胞及び非ＡＤ細胞中の細胞内カルシウムイオン濃度の差を評価し、他の２種類の試験は、異なる２種類の細胞内カルシウム放出活性化物質に応答して生じたＡＤ細胞及び非ＡＤ細胞中の細胞内カルシウム放出の差を評価する。カリウムイオンチャンネルブロッカーの例はＴＥＡであり、細胞内カルシウム放出活性化物質の例はボンベシンまたはブラジキニンである。個々の試験において、標準または規準となる細胞サンプル集団に関する統計的分析を行うことによって当該試験の結果に基づくアルツハイマー病診断の信頼レベルを決定し得ることは当業者に理解されよう。従って、各試験毎に、得点段階を任意にいくつかの範囲に分割し、正しい組合わせの評点を含む範囲によって確かな信頼度を有する診断指数が与えられるようにする。このような分割は、使用された細胞もしくは細胞系の試験の多変数回帰（ｔｅｓｔｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）によって得られた度数分布グラフの分析または他の典型的な分析技術もしくは他の分類技術を非限定例とする慣用の分類方法によって得られる。例えば、多変数回帰分析が、このような分割のためにも使用でき、または、複合的臨床指数が夫々の試験で得られる個々の指数よりも高度な有効性を有するか否かを判断するための実験的及び／または任意的分割を分析するためにも使用できることは当業者に明らかであろう。各試験は、評価されるＡＤ細胞と非ＡＤ細胞との差が最大になるように行うのが好ましい。ＡＤ細胞と非ＡＤ細胞との差が最大になるように操作し得るパラメーターの非限定例としては、試験に使用する薬剤もしくは試薬の濃度、応答の潜伏時間、Ｃｐ２０タンパク質の量、またはタンパク質のリン酸化状態がある。診断指数は例えば、ブラジキニンに応答する細胞内カルシウムレベルの低下をＡＤ対非ＡＤの比較によって評価する試験、ボンベシンに応答する細胞内カルシウムの放出をＡＤ対非ＡＤの比較によって評価する試験、及び、ＴＥＡに接触後のカリウムチャンネル機能をＡＤ対非ＡＤの比較によって評価する試験、から得られた評点、評価値またはシグナルを総合することによって作成できる（実施例２、３及び７参照）。例えば、応答の分割または分類は、所与の試験における応答細胞のパーセンテージに基づいて及び／または応答の積算面積の大きさに基づいて行う。例えば、ボンベシンを用いる診断試験では、時間積算したカルシウム（Ｃａ²⁺）濃度が、＜２３０００ナノモル（ｎＭ）−秒（ｓｅｃ）であるときを評点０とする。各試験毎に、標準または規準のサンプル集団を評価し、信頼レベルが最大になるように分割して評点をつける。サンプルの臨床指数は以下のごとく与えられる。上記のサンプル診断指数を用いる場合、所与の診断試験に０．１ｎＭの濃度のブラジキニンを使用し、１３５秒以下の時間内に応答を測定するのが好ましい。ＴＥＡの場合は、所与の試験に１００ｍＭの濃度を使用し、６０秒以下の時間内に応答を測定するのが好ましい。ボンベシンの場合には、所与の試験に１μＭの濃度を使用し、４０秒以下の時間内に応答を測定するのが好ましい。ボンベシンの場合の積算面積はナノモル（ｎＭ）のカルシウム濃度−秒（ｎＭ−ｓｅｃ）を単位として表す。最終的に正の評点は非ＡＤの指標であり、最終的に負の評点はＡＤの指標である。評点の数値に係数を掛けたり、偏りを付けたりしてもよいことは当業者に理解されよう。本発明はまた、アルツハイマー病のサンプル評点体系、並びに、第一診断試験、第二診断試験及び任意の追加試験に対応するシグナルを提供する手段を含む。本発明は更に、夫々のシグナルを複合的な１つの評点として総合する手段を提供する。これらの手段は、公知の信号またはデータ取得装置及び技術に従って慣用コンピューターで使用されるソフトウエアとして作製される。本文中で引用した全ての書物、論文または特許は参照によって本文の記載に含まれるものとする。次に、代表的な実施例に基づいて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。実施例１パッチ−クランプ診断試験ＣｏｒｉｅｌｌＣｅｌｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（ＣａｍｄｅｎＮＪ）から得られた（表３に記載の）培養皮膚繊維芽細胞を、高度に標準化した条件下で増殖させた。Ｃｒｉｓｔａｆａｌｌｏ，Ｖ．Ｊ．ａｎｄＣｈａｐｅｎｔｉｅｒ，Ｒ．Ｊ．（１９８０）ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ６：１１７。実験には以下の細胞系を使用した：若年者の対照繊維芽細胞（“ＹＣ ”）３６５２，３６５１，２９８７，４３９０，３３７７，８３９９（２１．５ ±２．８歳、平均±標準偏差）；同年配者の対照繊維芽細胞（“ＡＣ”）３５２４，６０１０，６８４２，７６０３，９８７８（６５．２±６．０歳）；及び、アルツハイマー病患者の繊維芽細胞（“ＡＤ”）６８４８，７６３７，５８０９，８１７０，６８４０，８２４３，６２６３（６０．６±８歳）。５つのＡＤ細胞系は家族性患者から採取した。いくつかの細胞系（２つのＡＣ及び４つのＡＤ）はカナダ人の親族から採取した。データのフェーズアウト（ｐｈａｓｅｏｕｔ）時間は、ＡＤ細胞系と対照細胞系（ＹＣ及びＡＣ）とで違わないことは文献と一致している。１０％のウシ胎仔血清を補充したダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）中の３５ｍｍのＮｕｎｃシャーレに細胞を播種し（約５細胞／ｍｍ²）、２〜４日の平板培養後、すべての細胞系の細胞密度が等しくなったときに使用した。平均して、ＡＤ患者及び対照から採取した繊維芽細胞は、エロージョン密度（５０細胞／ｍｍ²）に到達するまで同じ時間を要した。ＳａｋｍａｎｎＢ．ａｎｄＮｅｈｅｒ，Ｅ．（１９８３）ＳｉｎｇｌｅＣｈａｎｎｅｌｓＲｅｃｏｒｄｉｎｇｓ（ＰｌｅｎｕｍＮｅｗＹｏｒｋ）とＫｕｋｕｌｊａｎ，Ｍ．ら，（１９９１）Ｊ．ＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌ．１１９：１８７に記載された標準手順に従ってパッチ−クランプ実験を室温（２１〜２３℃）で実施した。記録を取る前に、培養培地を以下の溶液と交換した：１５０ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのＫＣｌ，２ｍＭのＣａＣｌ₂、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＮａＣｌ），ｐＨ＝７．４。ＢＢ−ＣＨＭｅｃａｎｅｘの引取装置を用いてＢｌｕｅＴｉｐ毛細管（内径１．１〜１．２ｍｍ）からピペットを作製し、次いで、１４０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ₂、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨ），ｐＨ＝７．４から成る高カリウム溶液を充填した。ピペットの抵抗は約６Ｍオームであった。Ａｘｏｐａｔｃｈ−１Ｃ増幅器（ｄｃ−１０ｋＨｚ）を用いて記録を採取し、テープ（ＴｏｓｈｉｂａＰＣＭ−ビデオレコーダー）に記憶させ、その後、Ａｘｏｌａｂインタフェースを用いてパーソナルコンピューターに移した。３分間以上続いた記録だけを最終分析の対象とした。ｐＣｌａｍｐプログラムセットを単一チャンネルデータ取得及び分析に使用した。増幅器、インタフェース及びソフトウェアはＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）から得られた。細胞付着モードでは、ヒトの皮膚繊維芽細胞から２種類のカリウムチャンネルを記録した。ピペットに高カリウム溶液を充填したので、カリウム電流は予想通り内向きで、それらの反転電位は細胞の残留電位にほぼ一致した。等しい動力学をもつ約４．５ｐＡの単一電流サイズ（ピペット電位０Ｖ）のカリウムチャンネル（１１３ｐＳ）は、ＹＣ及びＡＣの双方の繊維芽細胞には出現したが、ＡＤ繊維芽細胞の記録には完全に欠如していた（図１Ａ）。下向きの偏向は開状態（ｏｐｅｎｓｔａｔｅ）を示す。図１Ａ（図１Ｂ）の同じチャンネルのＩ／Ｖ関係及び（線形回帰によって測定した）スロープコンダクタンスは、試験した電圧範囲内ではほぼ等しく、ＹＣ繊維芽細胞では１１３．２±０．９ｐＳ（平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝８）であり、ＡＣ繊維芽細胞では１１２．９±３．２ｐＳ（ｎ＝７）であった。第二のチャンネル（１６６ｐＳ）は、３つのグループ全部の繊維芽細胞から同じ条件下で記録した（図２Ａ）。Ｉ／Ｖ関係（図２Ｂ）及びコンダクタンスはどのグループでもほぼ同じであった（ＹＣ＝１７３．４±５．７ｐＳ、ｎ＝４；ＡＣ＝１６９．２±２．８ｐＳ、ｎ＝４；ＡＤ＝１５７．６±４．７ｐＳ、ｎ＝６（平均±標準偏差））。膜電位は、対照繊維芽細胞（−４２．６±５．４、平均 ±標準偏差、ｎ＝７）及びＡＤ繊維芽細胞（−４５．４±６．９、ｎ＝３）で同様の値であった。双方のチャンネルが線形の電圧−電流関係を有しており、夫々１１３ｐＳ及び１６６ｐＳのスロープコンダクタンスを有していた（図１Ａ−１Ｂ及び２Ａ−２Ｂ）。ピペット電位０ｍＶのときにチャンネルを、夫々の単一電流サイズ（図１Ａ及び２Ａ）と、夫々の開時間のパーセンテージ、即ち１１３ｐＳのＫ⁺チャンネルでは約６０％、１６６ｐＳのＫ⁺チャンネルでは約１０％とから容易に同定できた。（ピペット電位＋６０Ｖ〜−４０Ｖのとき）双方のチャンネルの開時間のパーセンテージは有意な電圧従属性を示さなかった。１１３ｐＳのＫ⁺チャンネルは、ＹＣ細胞の４７％（ｎ＝３０）、及びＡＣ細胞の９４％（ｎ＝１７）で観察されたが、ＡＤの繊維芽細胞（ｎ＝２４）で全く観察されなかった（Ｘ²＝１８．９６、ｐ＜０．００１（表１））。観察可能な１１３ｐＳチャンネルをもつ繊維芽細胞を有するＡＤ細胞系（Ｎ＝６）は存在しなかった。対照的に、すべてのＡＣ細胞系（Ｎ＝５）と６つのうちの３つのＹＣ細胞系は観察可能な１１３ｐＳチャンネルを有する繊維芽細胞を含んでいた（Ｘ²＝１１．９３、ｐ＜０．００５（表２））。１６６ｐＳのチャンネルは３つのグループ全部に同様の頻度で観察された（Ｘ²＝０．８９、Ｎ．Ｓ．（表１及び２））。ＡＤ繊維芽細胞中で“欠失している”ことが観察された１１３ｐＳチャンネルは、存在しているが機能性でない可能性もある。このような機能不全には、チャンネルの構造的変化及び／またはチャンネルの活性調節にかかわる過程で生じた変質が関与していることもある。無細胞パッチを使用して上述の方法に従って処理した場合には、５０ｍＭのＢａ²⁺に対して双方のチャンネルが感受性であったが（インサイド−アウト、各チャンネル毎にｎ＝４）、Ｋ⁺チャンネルブロッカーであるテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）に対しては１１３ｐＳのチャンネルだけが感受性であった（アウトサイド−アウト、ｎ＝４ＹＣ，ｎ＝３ＡＣ）。１００ｍＭのＴＥＡの添加後に対照細胞（ｎ＝４）が１３−２０ｍＶの脱分極を生じたので、１１３ｐＳチャンネルのＴＥＡブロッカーは（場合によっては他のチャンネルと共に）膜電位に有意な影響を与えた。対照細胞を使用する場合には、同年配者の対照細胞が最良である。実施例２ＴＥＡ−Ｃａ²⁺診断試験ＣｏｒｉｅｌｌＣｅｌｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）からの培養皮膚繊維芽細胞（表３に記載）を実施例１に記載したように増殖させた。ＡＤ１３個、ＡＣ１０個及びＹＣ６個を使用してカルシウムイメージング実験を行った。培地を交換し、１４０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、２．５ｍＭＣａＣｌ₂、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭグルコース、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨ）（ｐＨ７．４）から構成される基本塩類溶液（「ＢＳＳ」）で３回洗浄した。公称無Ｃａ²⁺ＢＳＳは、ＣａＣｌ₂を加えないＢＳＳとして調製した。フラ２（アセチルオキシメチルエステル）（フラ２ＡＭ）をＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入し、１ｍＭジメチルスルホキシド溶液として保存した。フラ２ＡＭを最終濃度２μＭまで加え、細胞を室温（２１〜２３℃）で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、［Ｃａ²⁺ ］_i測定前に細胞を室温でＢＳＳで少なくとも３回洗浄した。ＨａｍａｍａｔｓｕＡＲＧＵＳ５０イメージングシステム（浜松ホトニクス）をパーソナルコンピューター（浜松イメージングソフトウェアパッケージ）の制御で使用して蛍光を測定した。３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの励起を中性密度フィルターで減衰させた。４００ｎｍ二色ミラーと５１０ｎｍ長帯域遮断フィルターを用いて蛍光画像を獲得した。対物レンズはＸ１０ＮｉｋｏｎＵＶフルオールとした。画像全体の均一照射部分（１／４）の内側で蛍光を測定した。サイトゾル及び核細胞区画で１５×１５画素内に得られた平均Ｃａ²⁺応答を、５１０ｎｍで発光し且つ３４０ｎｍで活性化される蛍光と５１０ｎｍで発光し且つ３８０ｎｍで活性化される蛍光の比で定量化した。下式：Ｒ＝Ｒ_max＋（Ｒ_min−Ｒ_max）／（１＋（［Ｃａ²⁺］_i／Ｋｄ）^b）による校正後に、これらの比を［Ｃａ²⁺］の絶対値に変換した。なお上記式中、Ｒは３４０ｎｍにより照射される蛍光強度を３８０ｎｍにより照射される蛍光強度で除した値（Ｆ３４０／Ｆ３８０）を表し、Ｒ_max及びＲ_min はカルシウム濃度がそれぞれ最大及び最小値（即ち測定条件下で機械により測定可能な最大値及び最小値）のときのＲの値を表す。ＫｄはＣａ²⁺に関するフラ２の解離定数であり、２４０ｎＭとして決定した。ｂの値は不斉度を決定し、１．２とした。ＴＥＡを添加すると、１個の若年対照を除く全対照細胞系の細胞の少なくとも１８％で最低１００％の［Ｃａ²⁺］_i上昇を生じた。従って、１個の系の細胞の少なくとも１０％における１００％［Ｃａ²⁺］_i上昇の応答を陽性応答の穏当な基準とみなした。１個のＡＤ細胞系だけは、応答が基準を優に下回る細胞を含んでいた（細胞の４％で１００％［Ｃａ²⁺］_i上昇）。高濃度外部カリウム中で潅流により繊維芽細胞を脱分極すると、ＡＣ及びＡＤ細胞に比較してＹＣのほうが顕著な細胞内Ｃａ²⁺（［Ｃａ²⁺］_i）上昇を生じた（図３Ａ〜３Ｃ）。外部カルシウム濃度を下げるか又はカルシウムチャンネルブロッカーを加えることにより、この脱分極により誘導した［Ｃａ²⁺］_i上昇を排除した（図３Ｃ）。高濃度Ｋ⁺で脱分極を誘導すると、全３群（ＡＤ，ｎ＝１３細胞系；ＡＣ，ｎ＝１０；ＹＣ，ｎ＝６）で顕著な［Ｃａ²⁺］_i上昇（少なくとも１００％上昇）を生じた。応答細胞の割合と［Ｃａ²⁺］_iピーク値は、ＡＣ（ｎ＝２９９）及びＡＤ（ｎ＝２６８）繊維芽細胞よりもＹＣ（ｎ＝１８３細胞）繊維芽細胞のほうが有意に高かった（χ²＝１４．２２，ｐ＜０．００１）。［Ｃａ²⁺］_iピークは刺激後１０〜１５秒に生じ、１００秒後に基底濃度に戻った。刺激前に「公称無Ｃａ²⁺」溶液又は５ｍＭＥＧＴＡ（推定遊離Ｃａ²⁺＝０．０４μＭ）又はＣａ²⁺チャンネル阻害剤（０．１ｍＭＬａＣｌ₃，１０ｍＭＣｏＣｌ₂，１０ｍＭＮｉＣｌ₂，１０ｍＭＣｄＣｌ₂又は１０μＭニフェジピン）を加えて外部カルシウム濃度を下げた場合には、応答は観察されなかった。対照繊維芽細胞をＴＥＡで脱分極すると同様に［Ｃａ²⁺］_i上昇を生じたので、外部カルシウム濃度を下げるか又はカルシウムチャンネル阻害剤を加えて排除した。他方、ＡＤ繊維芽細胞は外部カリウム濃度が高い場合にしか［Ｃａ²⁺］_i 上昇を示さず、１００ｍＭＴＥＡを加えても［Ｃａ²⁺］_i応答がなかった。全ＡＣ細胞系（Ｎ＝１０）と１個を除く全ＹＣ細胞系（Ｎ＝６）はＴＥＡに応答する細胞を含んでいたが、試験した１３個のＡＤ細胞系のうちで１００ｍＭＴＥＡに応答する細胞を含むものは皆無であった（χ²＝２５．６６，ｐ＜０．００１）（表３及び５）。１ｍＭＴＥＡを加えると、ＹＣ繊維芽細胞（ｎ＝１３０細胞）では［Ｃａ²⁺ ］_iが上昇したが、ＡＣ（ｎ＝１８４）又はＡＤ（ｎ＝１９５）繊維芽細胞では上昇しなかった。１０ｍＭＴＥＡを加えると、ＹＣ（ｎ＝１７６）とＡＣ（ｎ＝２３１）では［Ｃａ²⁺］_iが上昇したが、ＡＤ繊維芽細胞（ｎ＝２０４）では上昇しなかった。同様に、１００ｍＭＴＥＡを加えると、ＹＣ（ｎ＝５３２）とＡＣ（ｎ＝４１７）では［Ｃａ²⁺］_iが上昇したが、ＡＤ繊維芽細胞（ｎ＝７３８）では上昇しなかった（χ²＝２３１．４４，ｐ＜０．００１）。各実験群で少なくとも４１７個の細胞を試験した（表４）。１０及び１００ｍＭＴＥＡ添加後に応答細胞の［Ｃａ²⁺］_i値はＹＣ細胞とＡＣ細胞で同等であった。基底［Ｃａ²⁺］_i濃度はほぼ同一（Ｓ．Ｅ．＜０．５ｎＭ）であったので、これらの群の算術平均を表す値から標準誤差値を区別することはできない（図４Ｂ）。Ｃａ²⁺応答の時間経過を調べると、ＹＣ及びＡＣ繊維芽細胞では１００ｍＭＴＥＡの添加後２０〜３０秒に［Ｃａ²⁺］_iピークが現れ、１００秒後に基底濃度に戻る。ＡＤ細胞では応答（１個の系の細胞の１０％で≧１００％上昇）は全く観察されなかった。また、外部［Ｃａ²⁺］_iを下げても対照細胞では応答がなかった（図４Ｃ）。アルツハイマー患者及び対照繊維芽細胞を含むコード化サブサンプルを使用して、ＴＥＡによる［Ｃａ²⁺］_i上昇を繰り返した。実験と分析は、実験者に細胞系の種類を知らせずに実施した。結果は非盲検サンプルと完全に一致した。盲検試験したＡＤ細胞系（Ｎ＝１１）のうちでＴＥＡに応答して［Ｃａ²⁺］_i上昇を示したものは皆無であり、１個を除く全対照細胞系（ＡＣ４個及びＹＣ６個）はＴＥＡ応答を示した（χ²＝１７．３３，Ｐ＜０．００１（表５））。高カリウムに応答する［Ｃａ²⁺］_i上昇はＡＣ細胞とＡＤ細胞でほぼ同一であったので、ＡＤ細胞がＴＥＡに応答しないのは、Ｃａ²⁺チャンネル機能不全でなく、恐らくＫ⁺チャンネル機能不全に起因すると思われる。［Ｃａ²⁺］_i測定値は、ＡＤ繊維芽細胞でカリウムチャンネル機能不全を示すという点でパッチ−クランプ測定値に一致する。表５参照。アルツハイマー繊維芽細胞は家族性（Ｎ＝８）及び非家族性症例（Ｎ＝５）に由来するものであった。５人（＋）はカナダ人家族９６４の構成員であり、１と２のみは近縁者（血縁者）である。「＋＋」は家族７４７の構成員（血縁者）である。３症例（＊）では剖検によりアルツハイマー病を確認した。高齢対照（Ｎ＝１１）細胞系のうちの２人はカナダ人家族（９６４）の非罹病構成員である。全若年対照系（Ｎ＝６）はＡＤ家族病歴のない正常個体である。（１００ｍＭＴＥＡに対する）基準［Ｃａ²⁺］_i応答は＋として示し、使用した全ＡＣ系と１個を除く全ＹＣ系で観察された。１１３ｐＳＫ⁺チャンネルの存在は「＋」記号により示す。ＡＤ系のうちで「陽性」応答を示したものは皆無であった。盲検プロトコルを実施してアルツハイマー（Ｎ＝１１）及び対照（ＹＣ＝６，ＡＣ＝４）繊維芽細胞におけるＴＥＡ応答を測定した。結果は非盲検サンプルの結果を正確に再現し、ＡＤ細胞系はＴＥＡ応答を全く示さず、１０個の対照細胞のうちの９個がＴＥＡ応答を示した（χ²＝１７．３３，ｐ＜０．００１）。「Ｎ．Ｔ．」なる表記は試験しなかった細胞系／症状を示す。実施例３ボンベシン−Ｃａ²⁺診断試験表３に示したヒト皮膚繊維芽細胞を使用した。使用したＡＤ細胞系の平均年齢は６０．５±５．９歳であり、ＡＣ細胞系は６２．３±９．６歳であり、ＹＣ細胞系は２１．５±２．２歳である。細胞保存方法は実施例１に記載した通りであり、即ちカルシウム測定前に５０細胞／ｍｍ²の密度に達するようにＣＯ₂／空気（５％／９５％）中で３７℃で３〜５日間保存した。継代数は１９未満とした。ボンベシンはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ボンベシンは１ｍＭ蒸留水溶液として保存した。フラ２（アセチルオキシメチルエステル）、フラ２（五カリウム塩）及びω−コノトキシン（ω−ＣｇＴＸ）ＧＶＩＡはＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手した。フラ２ＡＭは１ｍＭジメチルスルホキシド溶液として保存し、フラ２五カリウム塩は６ｍＭ酢酸カリウム溶液として保存し、ω−ＣｇＴＸは１００μＭ蒸留水溶液として保存した。フェニトインを除く全化学物質は−２０℃で遮光下に保存した。細胞をＢＳＳ（実施例１に記載）中２μＭフラ２ＡＭと共に室温（２１〜２３ ℃）で６０分間インキュベートした。ＢＳＳで少なくとも３回洗浄後、細胞を室温で［Ｃａ²⁺］測定に使用した。実施例２に記載したように細胞蛍光を測定した。実施例２に記載したように絶対カルシウム値を計算した。細胞に最終濃度１μＭとなるようにボンベシンを加えた。ボンベシン処理後− ３０秒〜１５０秒にカルシウム移動濃度を測定した（図５Ａ）。実施した特定実験の結果、ボンベシンの添加後４２秒でＡＤ細胞と対照細胞の間に［Ｃａ²⁺］_i の最大差が生じた。ボンベシン処理後４２秒で細胞外Ｃａ²⁺の不在下ではアルツハイマー病細胞の［Ｃａ²⁺］_i濃度は高齢及び若年対照よりも著しく高い（ｐ＜０．０００１）。アルツハイマー病、高齢及び若年細胞の細胞系の数（Ｎ）はそれぞれ１０、８及び６である。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（図５Ｂ）。ボンベシンは、全群からの繊維芽細胞で細胞内貯蔵部位からＩＰ₃により誘導されるＣａ²⁺遊離を刺激したが、ＡＤ繊維芽細胞での応答が特に大きく且つ長時間続いた。ＡＤ細胞におけるこの大きく且つ長時間の応答は細胞外Ｃａ²⁺から独立していた。他方、ＡＣ及びＹＣ細胞ではＩＰ₃に媒介されるＣａ²⁺応答後にＣａ²⁺流入が生じた。細胞外Ｃａ²⁺を除去するか又は無機Ｃａ²⁺阻害剤で阻害してこのＣａ²⁺流入を減らすと、ボンベシンにより対照細胞に誘発されたＣａ²⁺応答はＡＤ細胞よりも迅速に基底濃度に戻ることが判明した（図５Ａ）。図５Ａに示す結果は公称無Ｃａ²⁺ＢＳＳで洗浄した細胞の結果である。ＡＤ細胞ではボンベシンにより誘導されるＣａ²⁺流入が観察されなかったので、貯蔵されたカルシウムの減少後のこのＣａ²⁺流入経路が変化していると思われる。この試験は、カリウムチャンネル機能不全に基づく上述の試験により実施した診断を独立して裏付けるものであった。特に、細胞外Ｃａ²⁺の不在下でＡＤ繊維芽細胞における１μＭボンベシン刺激から４２秒後のＣａ²⁺応答は常に３００ｎＭを上回った。これに対して、ＡＣ及びＹＣでは［Ｃａ²⁺］はそれぞれ３００ｎＭ及び２００ｎＭ未満であった（図５Ｂ）。上記実験の変法として、細胞外カルシウムの存在下で１μＭボンベシンによりＣａ²⁺応答を誘導した。２．５ｍＭ細胞外ＣａＣｌ₂の存在下で１μＭボンベシンは［Ｃａ²⁺］_iの迅速なピークを誘発し、ＹＣ及びＡＣ細胞では維持相がこれに続いたが、ＡＤ細胞では認められなかった（図６Ａ）。この相違はボンベシン添加後９０秒で明白であり、有意レベルはｐ＜０．００１であった（図６Ｂ）。細胞外カルシウムの存在下におけるＡＤ及び非ＡＤ細胞のボンベシン応答のこの相違を利用してＡＤの「イエスノー」診断を実施することができる。本発明の第２の態様として選択カリウムチャンネル阻害剤（例えばＴＥＡ）に対する非ＡＤ及びＡＤ細胞間の応答の差を検出してＡＤの診断を行う方法を上述したが、これらの方法と同様の検出方法を使用することができる。更に、この診断試験を上記診断試験のいずれか１種と組み合わせると、ＡＤであるか非ＡＤであるかの正確な診断の信頼性レベルは一層高くなる。実施例４神経病理非ＡＤ繊維芽細胞の応答実施例２及び３に記載した方法を使用して、他の疾患をもつ供与者からの細胞についてＴＥＡ又はボンベシンに応答する細胞内カルシウム濃度を測定した。パーキンソン病供与者からの繊維芽細胞は正常なＴＥＡ応答（＋として示す）及びボンベシン応答（「Ｎ」）を示し、高齢対照群で観察された応答と有意差はなかった。２人の精神分裂病患者からの繊維芽細胞は正常なＴＥＡ及びボンベシン応答を示した。更に、ハンチントン病の７症例のうち５症例では正常なＴＥＡ応答が観察され、ボンベシン応答は全ハンチントン病症例で正常であった。更に、ヴェルニッケ−コルサコフ病の４症例のうち４症例で正常なＴＥＡ及びボンベシン応答が観察された（表６）。これらの応答はＡＤ繊維芽細胞との間にｐ＜０．０００１のレベルまでの有意差を示した（フィッシャーの精密試験）。「＊」は剖検確認を示す。上記全引用文献はその開示内容全体を参考資料として本明細書の一部とする。実施例５Ｃｐ２０蛋白質の特性評価材料および方法動物組織新鮮なイカ（ロリオグペアレイ（Ｌｏｒｉｏｇｐｅａｌｅｉ）、Ｃａｌａｍａｒｉ，Ｉｎｃ．）からの視葉を切り出し、液体窒素で凍結して− ８０℃で保存した。ヘルミセンダクラッシコルニス（Ｈｅｒｍｉｓｓｅｎｄａｃｒａｓｉｃｏｒｎｉｓ）はＳｅａＬｉｆｅＳｕｐｐｌｙ，ＳａｎｄＣｉｔｙ，ＣＡから生きたまま得られた。ｃｐ２０の精製１５０のイカ視葉を１００ｍｌの緩衝液（１０ｍＭトリス− ＨＣｌｐＨ７．４、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、２０μｇ／ｍｌペプスタチン、５０ｍＭＮａＦ、１ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭＥＧＴＡ）へ加えた。ＰＭＳＦおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）を各々０．１ｍＭおよび２００ｍＭになるまで加え、高速ホモジナイザー中で、続いて超音波処理することにより視葉を４℃にてホモジナイズした。ホモジネートは遠心分離し（１００，０００ｇｘ９０分）、上澄み液は０．２２μｍフィルターを通して濾過し、Ａｍｉｃｏｎフィルター（３０ｋＤａカットオフ）を通過させた。低ＭＷ分画は次に二次フィルター（３ｋＤａカットオフ）で濃縮し、続いてＢＳＡで前処理したＣｅｎｔｒｉｃｏｎｓ（ＡｍｉｃｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中で１００μｌに濃縮した。非処理Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎｓを使用すると、蛋白質が完全に失われた。保持された分画はＡＸ−３００陰イオン交換ＨＰＬＣカラム（１ｘ２５ｃｍ、Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ）に注入された。カラムは２ｍｌ／分の流速を用い１０℃ にて、２０分で０−０．６Ｍの緩衝液（１ＭＫＡｃ、ＨＡｃでｐＨを７．４に調節）の濃度勾配、続いて４０分０．６Ｍ緩衝液で溶出した。各々のクロマトグラムは以前の文献に記載されているように（ＮｅｌｓｏｎＴ．，ｅｔａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７，１４７９−１４８３）、参照クロマトグラム（前の実験で条件付けしたヘルミッセンダの群から切り出された５つの目からの蛋白質のクロマトグラム）中のすべてのピークのｔ_Rに対してプロットされた各々のピークのｔ_Rと相関曲線を作ることにより統計的に分析された。簡単に記すと、ヘルミッセンダ条件付けは光を３秒、２秒回転させて終了させる組み合わせを７５回行うことから成っている。この訓練のこれらのセッションを継続する。条件刺激（光）が非条件付け刺激（回転）による前にのみ惹起される応答を惹起する場合、動物は連合学習を示す。そのｔ_Rが期待されるｔ_Rと±０．２％以内で一致し、およびもし１０またはそれ以上の他のピークもまた同じ正確さで一致したときのみｃｐ２０ピークの候補と考えられた。ｃｐ２０ピークが明白に同定できなかったら、または独特の相関曲線が構築できなかったらその試料は廃棄された。分画は０．２ｍＭの最終濃度でトリトンＸ−１００を含むポリプロピレン試験管に集めた。最終ｃｐ２０ピークの周りの各々のＨＰＬＣ分画の一部をＳＤＳゲルで分析し、ブロットして金コロイド（ＣＧ）で染色して銀（ＩｎｔｅｎＳＥＢＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）で増感した。もし、ブロットのデンシトメトリーが８５％未満の純度を示したら、その試料は再精製するかまたは廃棄された。陽イオン交換ＨＰＬＣいくつかの実験において、ｃｐ２０はさらに陽イオン交換ＨＰＬＣ（Ｓ−３００、４．６ｘ２５０ｍｍ、Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ）により精製された。カラムは０．２ＭＬｉＣｌｐＨ６．０、を用いて０．５ｍｌ／分で１０分間、続いて６０分で０．０２から０．７ＭのＬｉＣｌ濃度勾配で溶出させた。各々の分画はＧＴＰａｓｅを分析し、ＳＤＳゲルで分析された。いくつかの試料は、３０分で０から１ＭのＫＡｃ濃度勾配を用いてＣＭ３００ＨＰＬＣ（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ）により分析された。逆相ＨＰＬＣＣ１８カラム（Ｍａｃｒｏｓｐｈｅｒｅ３００，５μ）から０．３５ｍｌの流速にて、９０分をかけた２０−１００％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡの濃度勾配で、続いて１００％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡで９０分間溶出させた。ＧＴＰａｓｅは以前に記載されているようにして（ＮｅｌｓｏｎＴ．，ｅｔａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７，１４７９−１４８３）測定した。簡単に記すと、分画を１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４および１０ｍＭＭｇＣｌ₂の存在下で³²Ｐ−ＧＴＰと１２０分インキュベートした。放出された³ ² Ｐ−（Ｐ−³²無機リン酸）は珪タングステン酸と反応させた後にベンゼン中に抽出し、シンチレーションカウンターで放射活性の量を測定した。ペプチドおよび蛋白質は金コロイド試薬（Ａｕｒｏｄｙｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて定量した（ＮｅｌｓｏｎＴ．，ｅｔａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７，１４７９−１４８３により改良されたＨｕｎｔｅｒＪ．，ＨｕｎｔｅｒＳ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４，４３０−４３３の方法）。光アフィニティー標識試料をα−³²Ｐ−ＧＴＰと２５℃にて３０分間０．５ｍｌの密封した試験管中でインキュベートし、ＵＶ光で照射して以前に記載されているように（ＮｅｌｓｏｎＴ．，ｅｔａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７，２０６５−２０６９）ＳＤＳゲルに続いてのオートラジオグラフィーで分析した。モノクローナル抗体２０のイカ視葉からのｃｐ２０をマウス脾臓に注入した。一回の注入でニトロセルロースに結合した約５０ナノグラム（ｎｇ）の蛋白質が投与された。脾臓リンパ球はマウスミエローマ細胞Ｘ６３−Ａｇ８−６５３（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と融合させた。ハイブリドーマ細胞は視葉抽出物で被覆されたプレートを用いるＥＬＩＳＡで選択された。イカ視葉抽出物はイカ視葉を水中でホモジナイズし、５−１０，０００ｇで１０−２０分遠心分離することにより作成した。ＥＬＩＳＡプレートは各々のウェルを０．１ｍｌの視葉抽出物で満たし、室温で１時間以上インキュベートすることにより被覆した。ハイブリドーマは限外希釈によりクローン化し、無血清培地（改良イーグル培地）で培養した。ＩｇＭ分画は（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で沈殿させ、ＰＢＳに対して透析することにより精製した。ポリクローナル抗体ＡＲＬＷＴＥＹＦＶＩＩＤＤＤＣ（溶解性のための２つのグルタメートおよびＫＬＨへの複合のためのシステインを持つ）に対応する合成ペプチドが合成され、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に複合され、フロイントアジュバンドに懸濁された。約０．１ｍｇのペプチドが４ヶ月に渡り２週間毎に一匹のウサギの腹腔に注射された。試験血が２週間毎に採られ、粗視葉ホモジネートのウェスタンブロット中のイカｃｐ２０を認識する効力で試験された。ウェスタンブロット分析レーン当たり４０μｇ（マイクログラム）までの蛋白質を４−２０％グラジエントトリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（ＮｏｖｅｘＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ．）に加え、強化ニトロセルロース上にブロットした。ＢＳＡを用いて１２時間４で阻止した後、ブロットを１：６００に希釈したポリクローナル抗血清または１：２０００に希釈したモノクローナル抗体（硫酸アンモニウム分画）と室温で２時間インキュベートした。ｃｐ２０はアルカリ性ホスファターゼ複合ウサギ抗マウス（Ｓｉｇｍａ）またはヤギ抗ウサギ第二抗体（Ｓｉｇｍａ）（１：２０００）を用いて可視化し、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウムクロリド）−ＢＣＩＰで発色させた。一匹のヘルミセンダＣＮＳは総蛋白質量で８μｇおよびｃｐ２０はナノグラム以下の量しか含んでいないので、特性評価に適当な量のｃｐ２０を得るためには異なった供給源（イカ視葉）を用いることが必要であった。ＨＰＬＣプロファイルのコンピューター支援パターンマッチングは、イカ視葉およびヘルミセンダの目からの細胞質蛋白質のＨＰＬＣプロファイルはｃｐ２７ピーク（２９．５分）（イカではヘルミセンダより小さかった）および２，３の他のピーク（これらはイカでより大きかった）を除いて非常に類似していることを示した（図７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ）。ＡＸ−３００ＨＰＬＣカラムがＧ蛋白質を適切に分離するかどうかを決定するため、イカホモジネートのＡＸ−３００でのクロマトグラフィーを行い、すべてのＧＴＰａｓｅの分子量が決定された。イカからのＧＴＰａｓｅ活性の８４％が１２−１８および１９−２１分の大きな未分離ピークに溶出した。Ｒａｓ、ｒａｐおよびＳａｒｌｐ（ＨＰＬＣ分画のウェスタンブロッティングにより測定された）は各々２２．８、２０．５および１９．４分に溶出した（データは示されていない）。従って、ＨＰＬＣカラムはｃｐ２０（ｔ_R ３０分）と他のＧＴＰ結合蛋白質との分離に非常に有効であった。興味あることに、大きな非保持ピーク（６−１０分）にはＧ蛋白質は検出されなかった（図７Ａ参照）。ｃｐ２０の純度を検定するため、イカｃｐ２０がＲＰ−ＨＰＬＣで再分析された。ＤＴＴおよび塩により生じる大きな非保持ピークの後に一つのピークが観察された（図８）。そのＧＴＰａｓｅ活性は測定が困難であり、多分きびしい条件（１００％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ）のせいであろう。他の位置でも活性は観察されなかった。ｔ_Rはヘルミセンダの目およびＣＮＳからのｃｐ２０で以前に観察されているもの（ＮｅｌｓｏｎＴ．，ｅｔａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７，１４７９−１４８３）と一致した。イカ視葉およびヘルミセンダＣＮＳ両方からのｃｐ２０はまたＳ−３００およびＣＭ−３００陽イオン交換ＨＰＬＣにより再クロマトグラフィーが行われた（図９Ａ、９Ｂ）。各々の分画はＧＴＰａｓｅ活性が試験され、ＳＤＳゲルで分析された。両方の場合において、ＧＴＰａｓｅ活性の二つのピークが観察され（２０および４０ｋＤａのＭｒ）、ホモ二量体構造を示唆した。同様な実験において、ＤＴＴ不在下で精製されたｃｐ２０が非変性ゲルで分画された。ゲルの４０ｋＤａ部分が溶出された時、ＤＴＴと反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると２０ｋＤａバンドが観察された。対照的に、ＤＴＴ不在下では４０ｋＤａ蛋白質バンドのみが観察された（図１０Ａ、１０Ｂ）．従って、４０ｋＤａは不純物ではなく二量化したｃｐ２０である。二量化のさらなる証拠は、³²Ｐ−ＧＴＰを持つ２０および４０ｋＤａピークを光アフィニティー標識化してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析することにより得られた。４０および２０ｋＤａのＭｒを持つ³²Ｐ−標識化バンドは４０および２０ｋＤａＨＰＬＣピークの両方に対応するレーンに観察された（データは示されていない）。従って、４０ｋＤａバンドは光標識化の後生物ではなく、自然の二量化により生じている。しかしながら、生理学的条件下で二量化が起こるかどうかは未だ知られていない。精製されたイカｃｐ２０に対して調製されたモノクローナル抗体はまたイカ上清液中の２０ｋＤおよび４０ｋＤ、およびヘルミセンダの２０ｋＤバンドも認識した（図１０Ｄ、１０Ｅ）。４０ｋＤでの染色の比率は、もし試料が分析前に４ ℃で放置されていると増加した。抗体がイカ蛋白質に対して高められたという事実にも関わらず、ヘルミセンダｃｐ２０により強く反応した。ｃｐ２０はまたウサギ海馬粒子分画にも検出されたが、上清には検出されなかった（図１０Ｆ、１０Ｇ）。ヘルミセンダ上清からのＨＰＬＣ分画のウェスタンブロットは３１分により大きなピークがｃｐ２０と同時に存在し、より小さなピークが２８分に存在することを明らかにした（多分、ｃｐ２０の脱リン酸化形）（図９Ｄ）。イカｃｐ２０はｐａｎ−ｒａｓ、抗ＡＲＦまたは抗ｒａｐモノクローナルとは交差反応しなかった（データは示されていない）。ｃｐ２０はＧＴＰ活性部位に対する抗体、抗Ｇｉα（ＧｏｌｄｓｍｉｔｈＰ．，ｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６４７６−６４７９）と弱く交差反応した（図１０Ｈ）。この抗体はクローン化ｒａｓの試料とは交差反応せず、ｃｐ２０がｒａｓよりも三量体Ｇ蛋白質により近く関連していることを示唆している。ｃｐ２０の最も大きなトリプシンペプチドから誘導されるペプチドＡＲＬＷＴＥＹＦＶＩＩＤＤＤＣに対するポリクローナル抗体はｃｐ２０およびＳａｒｌｐと交差反応し、クローン化ＡＲＦと弱く交差反応したが（図１０Ｉ−１０Ｌ）、ｒａｓとは交差反応せず、ｃｐ２０がｒａｓよりＡＲＦファミリー蛋白質により近いという結論と一致している。ｃｐ２０を単量体へ変換するＤＴＴの能力を用いて、２つの超遠心分離工程および単一のＨＰＬＣカラム工程でｃｐ２０を明らかに均質に精製することが可能であった（図１０Ｃ、１１Ａ）。いくつかの調製試料の精製されたイカｃｐ２０への³²Ｐ−ＧＴＰ結合の化学量論は０．９０−０．９５の範囲であり、蛋白質が９０−９５％純粋であったことを示している。本蛋白質は純粋である場合、トリトンＸ−１００が加えられていなければ濃縮器およびポリプロピレン試験管に吸着された。イカｃｐ２０のｐＩは電気泳動では５．２であり、クロマトフォーカシングでは５．８６であった。ヘルミセンダｃｐ２０ではＭｒおよびｐＩの両方ともイカと同一であった（図１１Ｂ）。イカｃｐ２０からの５つのトリプシンペプチドの配列決定で、ＡＲＦファミリー中の２１ｋＤａＧＴＰ結合蛋白質、Ｓａｒｌｐ（ＮａｋａｎｏＡ．ＭｕｒａｍａｔｓｕＪ．，（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９，２６７７ −２６９１）と全体で５０％の同一性（２３／４６アミノ酸）を示した（図１２Ａ）。ｃｐ２０およびＳａｒｌｐのいくつかの非一致残基は保存的置換である（例えば、Ｄ→Ｅ、Ｎ→Ｄ、Ａ→Ｌ）。ＳａｒｌｐはＥＲからゴルジ装置への蛋白質の運搬に関与している（ＮａｋａｎｏＡ．ＭｕｒａｍａｔｕＪ．，（１９８９）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０９，２６７７−２６９１；ＢａｒｌｏｗＣ．，ｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，８７３− ８７９；ＯｋａＴ．，ｅｔａｌ．（１９９１）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１４，６７１−６９）。この配列はより程度は低いがＡＲＦおよびＧＩα三量体Ｇ蛋白質にも類似しているが、ｒａｓとの類似はほとんどないことを示している。ヘルミセンダ光受容体へのｃｐ２０の注入はＫ⁺電流Ｉ_AおよびＩ_K+ca2+の著しい減少を起こし、その両方とも連合学習後に減少することが知られている（ＡｌｋｏｎＤ．Ｌ．，ｅｔａｌ．（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２１，１２０１−１２０３）。ｃｐ２０の注入はまた以前に観察されている連合学習後の神経構造の構造変化（ＣｏｌｌｉｎＣ．，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．印刷中）を再現する。ｒａｓを含むいくつかの他のＧＴＰ結合蛋白質（ＳａｎｔｏｓＥ．，ｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，９８５３−９８５８）はホモ二量体を形成することが知られている。ヘルミセンダにおいて、ｒａｐもまた主として４６ｋＤａの二量体として存在している（ＭａＰｈｉｅ，Ｄ．，私信）。ＳａｒｌｐおよびＡＲＦとの相同性のため、ｃｐ２０は多分低ＭＷＧＴＰ結合蛋白質のＡＲＦファミリーの一員である。酵母において、Ｓａｒｌｐ、ＡＲＦおよびＹＰＴ１を含むこれらの蛋白質は膜胞輸送のいくつかの工程に関与している（ＮａｋａｎｏＡ．ＭｕｒａｍａｔｕＪ．，（１９８９）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０９，２６７７−２６９１；ＡｌｋｏｎＤ．Ｌ．，ｅｔａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７，１６１１−１６１６；ＷａｌｋｅｒＭ．，ｅｔａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，３２３０−３２３５；ＳｅｇｅｖＮ．，ｅｔａｌ（１９８８）Ｃｅｌｌ５２，９１５−９２４）。低ＭＷＧＴＰ結合蛋白質の一群は急速な軸索内輸送に付随して観察されている（ＢｉｅｌｉｎｓｋｉＤ．Ｆ．，ｅｔａｌ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１８３６３−１８３６７）。従って、ｃｐ２０およびＡＲＦ関連蛋白質間の類似性は軸索内粒子運動の制御に対して観察されたｃｐ２０の影響と一致している（ＭｏｓｈｉａｃｈＳ．，ｅｔａｌ．（１９９３）ＢｒａｉｎＲｅｓ．６０５，２９８−３０４）。膜胞膜への会合もまたＣ１８ＨＰＬＣでのｃｐ２０の長い保持時間と一致しており、それはｃｐ２０が親油性の特性を持っていることを示唆している。ｃｐ２０の観察された生理学的効果のどれがｃｐ２０へ直接的に起因するのか、およびそれらがプロテインキナーゼＣのようないくつかの他の分子により媒介されるのかどうかは未だ確立されていない。ｒａｓはマイクロインジェクションされたｃｐ２０のいくつかの効果を生み出すことできるが、それらはより高い濃度でのみ有効である（ＣｏｌｌｉｎＣ．，ｅｔａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０，１７４３−１７４５）。ｃｐ２０同様に、ＡＲＦはｒａｓよりも三量体Ｇ蛋白質のα−サブユニットにより強く相関している（ＳｅｗｅｌｌＪ．，ＫａｈｎＲ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５，４６２０−４６２４）。本データはｃｐ２０はｒａｓではなく、ＳａｒｌｐおよびＡＲＦに関連した新規蛋白質であることを示している。ＥＲおよびゴルジ間の信号伝達および分子の制御に関連する蛋白質の範疇内へのｃｐ２０の明白な特性評価、ならびにその以前より確立されている神経機能および構造への影響およびその記憶貯蔵における因果的意味は、記憶貯蔵がニューロン内のオルガネラ間での粒子のやり取りの制御に一部は依存することができる可能性を示唆している初めての証拠を提供している。実施例６アルツハイマー患者におけるｃｐ２０蛋白質レベルの変化材料および方法細胞株および細胞培養法ヒト皮膚線維芽細胞は１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）を含む７５ｃｃの増殖表面培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）でコンフルエントになるまで増殖させた。１３人のＡＤ患者からの細胞［ＡＧ０６８４０、ＡＧ０６８４４ ’、ＡＧ０６８４８’、ＡＧ０８１７０、ＡＧ７６３７、ＡＧ０８５２７’家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）＃９６４、男性４人、女性２人）；ＡＧ０４４０１（ＦＡＤ、＃７４７、女性）；ＡＧ０７３７６、ＡＧ０７３７７、ＡＧ０６２６２、ＡＧ０５７７０’、ＡＧ０６２６３、ＡＧ０７３７５（非ＦＡＤ、男性５人、女性１人）、６０．４±６．０５才（平均±ＳＤ）、”’”＝剖検確認］、９人のＡＣ［ＧＭ０４２６０、ＧＭ０４５６０、ＧＭ０３５２４、ＡＧ０７３０３、ＡＧ０８０４４、ＡＧ０９８７８、ＡＧ０７１４１、ＡＧ０７３１０、ＡＧ０６２４１（すべて明らかに正常、個々の家族歴不明、男性３人、女性６人）、６２．８９±５．１６才］および４人の”エスケイピー（ｅｓｃａｐｅｅ）”［ＡＧ０６８３８＋，ＡＧ０６８４２＋、ＡＧ０７６６５＋＋（ファミリー＃９６４の一員）；ＡＧ０８２６５＋（ファミリー＃２０９０の一員）、６７．２５± ６．８５才、”＋”近親者（親および／または兄弟）が冒されている、”＋＋” 伯父が冒されている］がｃｐ２０および全蛋白質検定に使用された。これらの細胞株はＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｉｎｇ、１９９１年細胞株カタログ（１９９１）；ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｎｅｒａｌＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ、１９９０／１９９１年細胞株カタログ（ＮＩＨ出版９１−２０１１、１９９０）を通して入手可能である。同一のＡＣ細胞株は二重に増殖させた。一組の細胞は１０ｎＭのβ−アミロイドで処理し（ＤＭＳＯ中）、および他の組はＤＭＳＯ単独で４８時間処理した。総ＤＭＳＯは両方の群において０．１％未満であった。β−アミロイド１−４０ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ）はＤＭＳＯ（２３０μＭ）で調製し、後で蒸留水（Ｐｉｃｏｐｕｒｅ，Ｈｙｄｒｏ）で１０ｎＭの最終インキュベーション濃度に達するまで希釈した。この低β−アミロイド濃度は、細胞内Ｃａ²⁺基本レベルを変化させることなく、および非特異的細胞障害を起こすことなく１１３ｐＳＫ⁺チャンネルに対する特異的ＡＤ様効果を持っていることが示されている（Ｒ．Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ，Ｅ．Ｉｔｏ，Ｃ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｄ．Ｌ．Ａｌｋｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４，２７６（１９９４））。細胞ホモジナイズ化および蛋白質抽出法吸引して培養培地を除き、約２０ｍｌの冷（４℃）ＰＢＳと置き換えた。細胞をフラスコからこすり取り１０，０００ｇで１０分間遠心分離した（４℃）。上澄み液は廃棄し、ペレットは１ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、約２−３分逆さにして残っているＰＢＳを除去した。ペレットを１ｍｌの”ホモジナイズ化緩衝液”（５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、５０μｇ／ｍｌのペプスタチン、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４）で洗浄し、Ｅｐｐｅｎｎｄｏｒｆチューブへ移して１０，０００ｇで１０分間遠心分離した（４℃）。上澄み液を捨て、チューブを２−３分間逆さにし、５０から７０μｌのホモジナイズ化緩衝液を加えた。ペレットは最後に１０−２０秒間超音波処理（超音波ホモジナイザー、Ｃｏｌｅ−ＰａｒｍｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を行った。粗蛋白質抽出物はその後の分析まで−８０℃で保存した。タンパク質アッセイ、免疫染色法(immunoblotting)及び総タンパク質分析方法全てのホモジネートについて、タンパク質濃度が、確立されている染料−結合タンパク質アッセイに従って決定された。(R.D.Lane et al．J.Immunol．Method s 92:261(1986))。免疫染色体(immunoblots)については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ４〜２０％の勾配、１．５ｍＭの厚いゲルが用いられた(Novex,San Diego,Californi a)。サンプルの体積は、タンパク質濃度が１μｇ／μｌになるように調製された。Novexサンプル緩衝液（１６μｌ）が、サンプル１６μｌに添加され、この溶液が２分間、８５℃に加熱され、前記ゲルに担持され、１１５ｍＶで１．５時間印可された。Rainbow（登録商標）分子量基準(Amersham)もまた担持された。散らされたタンパク質は、８ｃｍ×８ｃｍの修飾されていないニトロセルロース紙 (Pierce)に、電気泳動的（５１．２ｍＡで２時間）に移動させられた。移動の際の緩衝液は下記の通りである：陽極側、４０ｍＭＥ−アミノヘキサン酸、２５ｍＭ TRIS、２０％メタノール、ｐＨ＝９．４；陰極側、２５ｍＭ TRIS、２０％メタノール、ｐＨ＝１０．４、及び、３００ｍＭ TRIS、２０％メタノール、ｐＨ＝１０．４。前記ニトロセルロース紙は一晩、SuperBlock（登録商標）(Pierce)に曝され、そして、Ｃｐ２０モノクロナール（原料及び方法に記載されているもの、実施例５参照のこと）抗体（１：１０００に希釈）及びSuperBlo ck（登録商標）を含有する１０ｍｌの溶液とともに、室温にて１．５時間インキュベートされた。SuperBlock（登録商標）で５回、洗浄された後に、このニトロセルロース紙は、SuperBlock中のタンパク質Ａアルカリ性ホスファターゼ共役体 (１：５００に希釈、Cappel Organon Teknika)と共に室温にて１時間インキュベートされた。SuperBlock（登録商標）で２回、ＰＢＳで２回、ＡＰＳ（１００ｍＭ TRIS，100mM NaCl，5mM Mgl₂，pH=9.4）で洗浄された後に、このニトロセルロース紙は、染色溶液（４０ｍｌのＡＰＳ、３ｍｇのニトロ青(NitroBlue登録商標)、テトラゾリウム(Pierce)及び５ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−イドリルリン酸トルイジン塩を含有するもの）により、約７〜１０分間、染色された。染色反応は、蒸留水で洗浄することで停止された。次いで、免疫染色体(immun oblots)は、平床式スキャナーでデジタル化され、定量分析のために研究所(TNIm age，T.J.Nelson)で書かれたイメージ化ソフトウェアで分析された。ゲル間における全体的な着色の差異を補整するために、興味のあるバンドの積算値は、染色の背景強度の平均に対して、正規化された。タンパク質の組成全体を研究するために、各々のサンプルのアリコットが、ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により分析され、このゲルは染色溶液（０．１％クーマシー(Coomassie)青 R-250、４０％メチルアルコール、１０％酢酸）に２０分間曝され、徐々に２４時間、デスティン(destine)（７．５％酢酸、１５％メチルアルコール）された。分子量は、マーク１２(Mark12 登録商標)標準と比較して、決定された。ゲルの定量分析は、免疫染色の分析と同様の方法で行われた。興味のある領域の測定は、レーン当たりの濃度計上の総面積に対して正規化された。モノクロナール抗体Ｃｐ２０は、実施例５の原料及び方法に記載されているように、２０個のイカ眼葉(optic lobe)から精製された。簡潔に述べると、精製されたタンパク質は、マウスの脾臓に注射され、次いで、脾臓リンパ球が、マウス骨髄腫細胞Ｘ６３− ＡＧ８−６５３と、実施例５に記載されているように、融合された。ハイブリドーマ細胞は、実施例５に記載されているように、眼葉抽出物で被覆されているプレートを用いて、ELISAで選択された。このハイブリドーマは、限界希釈によりクローンされ、血清を含有していない培地で培養された。IgM分画は、（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄と共に沈殿させ、次いで、ＰＢＳに対して透析することにより、精製した。抗体は、数種において、Ｃｐ２０を特異的に認識することが既に示されており、かかる種としては、ヘルミセンダ、ウサギ、ラット、ウニ、イカ、並びに、ＨＰＬＣで精製されたイカのＣｐ２０が挙げられる（実施例５、図１３Ａを参照のこと）。ＡＤ患者からの繊維芽細胞及び年齢が対応した（ＡＣ）コントロールが、コリエル細胞収納所(Coriell Cell Repositories,Camden，NJ)から得られ、原料及び方法に記載されているように培養された。Ｃｐ２０は、Ｃｐ２０モノクロナール抗体、及び、標準的な免疫染色法(Western)を用いて評価された（実施例５及び６の原料及び方法を参照のこと）。９つのＡＣ細胞ラインの全てについて、顕著に濃いバンドが、イムノブロットの２０ｋＤ領域に観察された。一方、１３のＡＤ細胞ライン（家系のもの及び家系でないものの双方がある。）においては、かかるバンドはほとんど欠如しているか又は大幅に減少していた（図１３Ｂ及び１３Ｃ）。この２０ｋＤのバンドは、診療上、正常な４個体（逸出者、Ｅｓ）の免疫染色物においても、減少又は欠如していた。ここで、これらの４個体は、家族性アルツハイマー病の患者の近親者である(T.D.Bird，アルツハイマー病(Rave n，New York，1994;R.D.Terry，R．Katzman，K.L．Bick eds.)pp.65-74.)。免疫染色物の定量分析（図１３Ｃ−１３Ｄ）により、ＡＤ及びＥｓ細胞ラインと比べて、ｐ＜０．００１で、コントロールのＣｐ２０レベルは有意に高いことが確認された（ANOVA,Bonferroni ポスト試験）。ＡＤ細胞ラインとＥｓ細胞ラインとの間では、何ら有意な差異は観られなかった。２０ｋＤの全てのタンパク質の一般的な効果を排除するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシーブルーで染色されたゲルについて、総タンパク質分析を行った。分子量２０ｋＤの領域を目で観察したところ（図１４Ａ）、定量分析で確認されたように（図１４Ｂ）、グループ間の差異は、ｐ＞０．０５（特定されず(n.s.)）で示されなかった（ANOVA,Bonfer roni ポスト試験；インストレーション版１．１５、Graphpadソフトウェア、サンディエゴ、ＣＡ）。６６〜３３ｋＤの分子量領域の分析においても、グループ間の差異は、ｐ＞０．０５（特定されず(n.s.)）で示されなかった（ANOVA,Bonf erroni ポスト試験）。分子量が大きい領域（２００ｋＤ）における更に二つのタンパク質バンドにおいても、グループ間の差異は、ｐ＞０．０５（特定されず (n.s.)）で示されなかった（ANOVA,Bonferroni ポスト試験）。低濃度のβ−アミロイドで処理することにより、コントロール細胞がＡＤ様のＫ⁺機能不全を引き起こすことが既に観察されていることから(R.Etcheberrigara y,E.Ito，C.S.Kim，D.L.Alkon，Science 264,276(1994))、我々は、９つのＡＣ細胞ラインを１０ｎＭのβ−アミロイドで４８時間処理した。同じ免疫染色方法及び分析に従ったところ、β−アミロイドで処理された細胞では、処理されていない対照物と比べて、Ｃｐ２０が有意に減少することが分かった、ｐ＜０．００３（Wilcoxon）（図１５Ａ−１５Ｂ）。総タンパク質分析は、β−アミロイド処理が２０ｋＤ領域の全てのタンパク質についての一般的な効果ではないことを示した（図１５Ｃ−１５Ｄ）（ｐ＞０．１、Wilcoxon）。更に、６３−３３ｋＤの領域及び２００ｋＤの領域においても、グループ間の差異は観察されなかった。これらの結果が明らかに示すことは、Ｃｐ２０、即ち、記憶に関連するタンパク質であって記憶の獲得及び記録の間に多くの分子上の若しくは細胞上の変化を誘導するもの（T.J.Nelson，C.Collin，D.L.Alkon，Science 247,1479(1990);T. J.Nelson and D.L.Alkon，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 85,7800(1988);ibid 87,26 9(1990);D.L.Alkon et al．Proc．Natl.Acad.Sci．USA 87,1611(1990);S.Moshia ch,T.J.Nelson;J.V.Sanchez-Andres,M.Sakakibara,D.L.Alkon,Brain Research 6 05,298(1993);実施例５）が、アルツハイマー病の患者の繊維芽細胞において、顕著に減少しているというものである。このことは、我々の従来の知見(実施例１〜４参照のこと；R．Etcheberrigaray et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.（USA ）90，8209(1993);E.Ito et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.（USA）91，534(1994 ))を新たに、また、特異的に拡張するものであり、かかる従来の知見は、記憶の記録の際の細胞上の工程（Ｋ⁺チャネルの制御、Ｃａ²⁺の放出）がアルツハイマー病では変性しているというのに留まっていた。Ｃｐ２０がＫ⁺チャネルの制御に極めて有効な制御因子であるので（T.J.Nelson，C.Collin，D.L.Alkon，Scien ce 247，1479(1990)）、ＡＤにおけるＣｐ２０の欠如又は減少は、従来観察されていた、ＡＤにおける繊維芽細胞のＫ⁺チャネル（R．Etcheberrigaray et al.,P roc．Natl．Acad．Sci．(USA)90，8209(1993);R．Etcheberrigaray，E.Ito，C.S .Kim，D.L.Alkon，Science 264,276(1994)）及び嗅覚神経細胞（データは示されていない）の差異と相関がある可能性がある。従来、Ｃｐ２０が、逆行性軸索移動及びこの続発的相同となるＡＲＦタンパク質サールプ(Sarlp)（小胞のトラフィッキング；実施例５参照のこと）を制御することが示されており、かかる知見は、Ｃｐ２０の欠如が、ヒト脳におけるアルツハイマー病の病理学の特徴である、タンパク質様のプラーク及び神経細線維のもつれあいの素因及び／又は発達にも影響を与えるものであることを示唆する。これらの病理学的プロセスは、Ｃｐ２０のように、直接的に又は間接的に小胞のトラフィッキング（S.Estus et al ．Science 255，736(1992);T.E.Golde，S.Estus，L.H.Younki，D.L.Selkoe，S.G .Younkin，ibid.,728(1992);C.Haass，E.H.Koo，A.Mellon，A.Y．Hung，D.J．Se lkoe, Nature 357，500(1992);J．Busciglio，D.H．Gabuzda，P.Matsudaira，B. A．Yankner Proc．Natl．Acad．Sci.（USA）90,2092(1993);N.K.Robakis，アルツハイマー病(Raven，New York，1994; R.D．Terry，R．Katzman，K.L．Bickeds.)pp.3 17-326）及び、多分、微細管に関連するタンパク質の変性（K.A.Crutcher，B.H. Anderton，S.W．Barger，T.G．Ohm，A.D.Snow，Hippocampus 3，271(1993);K.S. Kosik及びS.M.Greenberg，アルツハイマー病(Raven，New York，1994; R.D．Ter ry，R．Katzman，K.L．Bick eds.)pp.335-344）に関与するものである。分裂促進剤(mitogen)により活性化されたタンパク質（ＭＡＰ）キネーゼで引き起こされるタウ(tau)のリン酸化（潜在的に病理学的な出来事である）は、ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質、即ち、β−アミロイドが生成する元となるタンパク質）により促進されることができ、一方、rasタンパク質の阻害により阻止することもできる（K.S.Kosik 及びS.M.Greenberg，アルツハイマー病(Raven，New Y ork，1994; R.D．Terry，R．Katzman，K.L．Bick eds.)pp.335-344;S.M.Greenbe rg，E.H.Koo，W.Q.Qiu，A.W.Sandrock，K.S.Kosik，Soc.Neurosci.ABs．19, 127 6(1994);K.S.Kosik，JAMA 271，89(1994)[Medical News & Perspectives by P.C otton中]）。このプロセスにおけるrasの関与は、ras及びＣｐ２０が機能的性質（C.Collin，A.G．Papagorge，D.L．Lowy，D.L．Alkon，Science 250，1743(199 0)）及びある程度の相同（実施例５参照のこと）が共通であることから、悩ましいものである。更に、タウの正常な機能と示唆されているものの一つは、微細管の延長及び軸索の形状の形成に関与することであるので(K.S.Kosik，Brain Path ology 3，39(1993))、微細管の延長及び軸索の形状の形成は、Ｃｐ２０が記憶の獲得過程で引き起こす樹状突起の変化(S.Moshiach，T.J.Nelson，J.V.Sanchez-A ndres，M.Sakakibara，D.L.Alkon，Brain Research 605，298(1993))に関連がある可能性がある。また、興味深いことに、Ｇ₀、即ち、異種三量体であるＧＴＰ結合性タンパク質であって膜移動及び軸索移動に関与するものが(M.Bomsel，K.M ostov，Molec.Biol.Cell 3，1317(1992))、ＡＰＰの細胞質ドメインに関連する（Nishimoto,I.et al,Nature 362(1993)）。従って、Ｃｐ２０の変性（この変性は、多分、β−アミロイドの代謝及びタウのリン酸化に関連するもの）は、正常な軸索移動及び細胞内における小胞のトラフィッキングに影響し、アルツハイマー病の病理学に寄与している可能性がある。Ｃｐ２０は、Ｅｓ（即ち、家族性アルツハイマー病の個人の近親者）においても減少しているので、Ｃｐ２０の減少の観察は、診断上、アルツハイマー病、並びに、アルツハイマー病の明白な臨床的症状がない場合であっても、アルツハイマー病の遺伝的素因を示すものとしてもよい可能性がある。実施例７アルツハイマー病の診断指数原料及び方法細胞培養方法培養された繊維芽細胞は、コリエル細胞収納所(Coriell Cell Repositories,C amden，NJ)、及び、ブレシア聖心病院（Brescia Sacred Heart Hospital，Bresc ia、イタリア）、分子及び細胞神経生物学研究所(Laboratory of Molecular and Cellular Neurobiology)から得られた。細胞ラインには、ＡＤ、年齢が対応するコントロール、ＡＤ以外の神経性及び精神性疾患を有するコントロール、及び、カナダ系ＡＤ家族９６４の診療上影響を受けていない家族構成員からの３個の細胞ラインが含まれる(Nee，L.E.;Arch．Neurol.40:203-208;1983)。イタリア系細胞ライン（表７で、Ｉと表示されているもの）は、生存している患者からのものであり、繊維芽細胞の調製及び診断手続は、既に記載されている(Govoni，S． et al;Neurology 43:2581-2586(1993))。コリエル細胞ラインの更なる情報は、他からも得られる（National Institute of Aging，1991 細胞ラインのカタログ。１９９１；National Institute of General Medical Sciences，1990/1991 細胞ラインのカタログ（ＮＩＨ出版物９１−２０１１、１９９０））。細胞は、既に記載されているように接種され(実施例１〜４；R．Etcheberrigaray et al. ,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:8209-8213;1993)、即ち、３５ｍｍのナンク(N unc)ペトリ皿に接種され、接種後３〜４日の比較できるレベルの合流(confluenc e)（１ｍｍ²当たり６０〜８０細胞）で使用された。カルシウムイメージ化培養培地が除去され、細胞はＢＳＳ（単位ｍＭ：ＮａＣｌ１４０、ＫＣｌ５、ＣａＣｌ₂ ２．５、ＭｇＣｌ₂ １．５、ＨＥＰＥＳ１０、グルコース５、ｐＨ＝７．４）で少なくとも３回洗浄された。２μＭ（ＢＳＳ中）フラ２ −ＡＭ（分子状プローブ）中、室温にて６０分間、細胞をインキュベートすることにより、蛍光性プローブが担持された。担持後、細胞は、ＢＳＳ又はＢＳＳ− ０Ｃａ²⁺（単位ｍＭ：ＮａＣｌ１４０、ＫＣｌ５、ＣａＣｌ₂ ０．１、ＭｇＣｌ₂ １．５、ＥＧＴＡ１、ＨＥＰＥＳ１０、グルコース５、ｐＨ＝７．４）で徹底的に洗浄された。洗浄後、細胞内のＣａ²⁺のベースラインを測定するために、１ｍｌの新鮮な溶液が添加された。ＴＥＡで修飾されたＢＳＳ（ＴＥＡ−ＭＢＳＳ）溶液（単位ｍＭ：ＴＥＡ１３３．３、ＮａＣｌ６．７、ＫＣｌ５、ＣａＣｌ₂ ２．５、ＭｇＣｌ₂ １．５、ＨＥＰＥＳ１０、グルコース５、ｐＨ＝７．４）３ｍｌがペトリ皿に添加されることにより、TEA( シグマ社)チャレンジが行われた。この溶液が、重量オスモル濃度が変化しなくなるように、調製された。ボンベシン(Bombesin)刺激は、ＢＳＳにボベジンを含有させた溶液１ｍｌを添加することにより達成され、かかる溶液は、最終的なボンベシン(Calbiochem社)濃度が１μＭのものと１００ｎＭのものがあり、また、外部Ｃａ²⁺を含むものと含まないものとがある。ＢＳＳ及びＢＳＳ−０Ｃａ²⁺ 中のブラジキニン(Bradykinin)(Calbiochem社)は、１００ｐＭ、１ｎＭ及び１０ｎＭの濃度で用いられた。３４０ｎｍ及び３８０ｎｍにおける蛍光イメージは、２．６／秒の速度で、２００秒、浜松Argus 50システム（浜松フォトニクス）により得た。対物レンズは、１０ｘニコンフルオラ(fluor)であった。イメージ全体のうち、均等に照明された１／４の領域のみについて得た。個々の比の値は、興味ある領域内の全ての細胞のオフーラインについて得た。与えられた細胞ラインの３〜５個の皿は、各々の実験条件に用いられた。細胞ライン当たりで測定された細胞の数は、少なくとも５０であった。殆どのケースで、各々の細胞ラインの実験は、少なくとも１回、別個に繰り返された（最低でも１週間の間隔があけられた）。ブラジキニン誘導応答ブラジキニンで誘導された放出が、ＩＰ₃で仲介された機能の測定として、本研究で試験された。１００ｐＭブラジキニンを浴により適用しても、コントロール細胞（Ｎ＝１１細胞ライン）は、実質的に何ら応答しなかった。一つの細胞ライン（ＡＧ０７１４１）のみが、気付き得る程度の応答を示したが、”基準”レベル（ＣＲ、下記参照のこと）に至らなかった。これに対して、１４のＡＤ細胞ラインのうち１３細胞ラインにおいて、明白な応答が観られ、一つのライン（Ｉ４）のみが基準レベルに到達しなかった。応答した細胞の割合についての統計的な分析は、ＡＤとコントロールとの間で、顕著に有意な差異を示した、ｐ＜０．０００３(Mann-Whitney)。この２グループの間の差異について分割表（応答／非応答、ＣＲに基づくもの）でも分析したところ、差異は顕著に有意であった、ｐ＜０．０００５（Fisher's 正確試験）。Ｅｓからの細胞ラインは、コントロール細胞ラインと同様の応答を示した、ｐ＝０．３（Mann-Whitney,有意でない）。図１６Ａは、ブラジキニン応答の分布を示し、応答した細胞の％で表示されている。コントロール細胞ライン及びＥｓ細胞ラインについては、”応答セル０％ ”に又はその近傍に密集していることが明らかである。一方、ＡＤ細胞ラインは、より広範で、かつ、より高い分布を示している。図１６Ｂは、グループデータの差異を示すものであり、図１６Ｃは、ブラジキニンが誘導する応答の典型的な時間コースを示すものである。コリエルのサンプルとイタリア系のサンプル（” Ｉ”で示されている）との比較は、応答／非応答の点については、差異を示さなかった、ｐ＝０．２３、有意でない（Fisher's 正確試験）。ブラジキニン濃度が更に高い（１ｎＭ）場合には、類似する程度の応答が誘導され、ＡＤ及びコントロールにおいて応答する細胞の数に大きな違いがなくなり、従って、グループ間におけるブラジキニン感受性の差異は不明瞭になった。ボンベシン誘導応答既に報告されているように(実施例１〜４；Ito，E．et al.，Proc．Natl．Aca d．Sci.（USA）91:534-538;1994)、１μＭのボンベシンの添加は、外部Ｃａ²⁺が欠如しているものまで含めて、全ての細胞ラインにおいて応答を誘導するものである。応答した細胞の％は、ＡＤ細胞ラインにおいて高い傾向にあるが、統計的有意にまで至らなかった（ｐ＝０．０８、Mann-Whitney）。しかし、その下にリストしてあるボンベシンＣＲにおいては、コントロールの細胞ライン(5402.3±3 606.4)と比べて、ＡＤ細胞ライン(26956±4497 平均±SEM)の応答の規模(magni tude)（応答の開始から終了までにおいて、全ての細胞のカーブの下の領域を積算することにより測定されたもの）が、有意に高かった、ｐ＜０．００４(Mann- Whitney)。同じＣＲを用いて分割表（応答／非応答、ＣＲに基づくもの）でも分析したところ、両グループの差異は有意であった；３つを除いた全てのＡＤ細胞ライン（総数は１４）が応答し、一方、１０のコントロール細胞ラインのうち２つのみが応答した、ｐ＜０．００７（Fisher's 正確試験）。更に、全ての応答（ただし、ＣＲは考慮しない）を考慮した場合であっても、応答の規模は、コントロールと比べて、ＡＤ細胞ラインは未だ有意に高かった、ｐ＜０．００５ (Mann-Whitney)。ブラジキニンについては、ボンベシン応答の規模が、イタリア系細胞ラインとコリエル細胞ラインとで、同様であった、ｐ＝０．７９、有意でない(Mann-Whitney)。ＴＥＡ誘導応答ＴＥＡによる刺激（１００ｍＭ）は、予想された通り（実施例１〜４参照のこと）、コントロール細胞ラインにおけるＣａ²⁺の上昇をもたらした。１１のコントロール細胞ライン全ては、顕著なＣａ²⁺上昇を示し、”ＣＲ ”を満たした（下記参照のこと）。予想された通り、ＡＤ細胞ラインの大部分（１４のうち１０）はＣＲを満たさなかった。応答した残りの４つの細胞ラインについての平均は、応答した細胞のパーセントが低かった。全体として、全てのコントロール細胞ラインとの比較において、ＡＤにおいて応答した細胞のパーセントは、顕著に有意な差異があった、ｐ＜０．０００５(Mann-Whitney)。分割表（応答／非応答）の分析もまた、明白かつ有意な差異を示した、ｐ＜０．０００４（Fisher's 正確試験）。３つのＥｓ細胞ラインでは、応答した細胞のパーセントが低く（なお、一つの細胞ラインでは、ＣＲを満たさなかった）、その平均としては、コントロール細胞ラインよりもＡＤに近い値であった。図１７Ａの棒グラフはこれらの結果を示すものである。ＴＥＡ誘導応答の典型的なトレースは図１７Ｂで示される。応答が開始するまでの潜伏期及び応答の規模は、コントロール細胞ラインどうしでも、また、応答した４つのＡＤ細胞ラインとでも、ほぼ同様であった。ＡＧ０６２４１、ＡＧ０６２４０及びＡＧ０７１４１で使用されたコントロール細胞ラインは、本研究において実質的に同一の応答を示した。既にされた研究及び本研究で使用されたＡＤ細胞ライン、ＡＧ０６８４４、ＡＧ０６８４８、ＡＧ０７３７５、ＡＧ０７３７７及びＡＧ０８１７０においては、応答の欠如が観られた。オリジナルに試験されたコントロール細胞ラインからのＴＥＡ応答（実施例１〜４；R．Etcheberrigaray et al.,Proc．Natl．Acad．Sci.（ USA）90:8209-8213;1993）と、今回のコントロールグループからのＴＥＡ応答との比較は、二つのコントロールグループの間に有意な差異を示さなかった、ｐ＝０．３８（Fisher's 正確試験）。同様に、既に試験されたＡＤグループにおける応答の欠如は、本研究で用いられたＡＤ細胞ラインと有意な差がなかった。更に、本サンプルとオリジナルサンプルとの間における、ＴＥＡ応答／非応答についての全体的な比較は、差を示さなかった、ｐ＝０．５５（Fisher's 正確試験）。更に、差異がないことは（応答／非応答）、コリエルのサンプルとイタリア系のサンプルとの間でも観察された、ｐ＝０．２４、有意でない（Fisher's 正確試験）。アルツハイマー病用積算指数ＡＤ細胞について記載された、個々の分子上の変性は、高い特異性及び感受性を示すとともに、コントロールからＡＤケースを正確に同定し、区別するものである。診断目的では、特異性及び感受性を最大化することが所望される。従って、それぞれ、ＡＤ細胞及びコントロール細胞からの繊維芽細胞の観察可能な応答であって変性されたもの及び正常なものについて、組み合わせスコアシステムが考案された。かかる組み合わせスコアは、数値指数を作成するものであり、個々のチャレンジについての負の値は病理学的応答を示す。正の値はその逆である。組み合わせ指数値が０より小さい場合には、ＡＤを示し、０．５以上の値は正常な条件又はＡＤでない条件を同定するものである。検査された全ての細胞ラインの応答に基づいて定められる基準となる応答、並びに、個々のチャレンジについてのスコアの基準は、下記の通りである。応答の全体的プロフィールを考慮に入れると、これらの細胞の変化の診断的数値は増加することを、結果は明確に示している。指数により、全ての対照者およびＡＤ患者の検出を単一の重複なしに行うことができる。ＡＤ細胞株のあるものは全てのＡＤ「分子発現型」を発現しないけれども、組み合わせてそれらは指数システムによって正確に同定するのに十分な交代物を発現している。従って、３以上の診断パラメーターを考慮する本方法は、特異性および選択性を付加するのである。ボンベシン誘導応答は予期された通りＡＤ繊維芽細胞ではより高かった。（実施例１〜４を参照）ボンベシンおよびブラジキニンの結果は、両方の試薬がＩＰ₃ の生成を誘導するので一致する。１００ｐＭブラジキニンにより誘導される応答は、ＴＥＡまたはボンベシン誘導応答よりも、ＡＤ細胞を同定するための特異性の程度がより高いことが判明した。表７は、この方法で分析した各細胞株についてのスコアおよび最終指数を示す。ＡＤ細胞は負のスコアを有する一方、対照細胞株は正のスコアを有することは明白である。対照株の一つのみが、０のスコアを有し、これは全てのＡＤ細胞株よりかなり大きい。指数の統計的分析により非常に有意な相違がＡＤおよび対照の間に見られた（ｐ＜０．０００１、Mann-Whitney）。図１８は、対照およびＡＤ細胞株のスコアの分布を記載する。ＡＤスコアリングシステムにおいて、数字の値を各々の細胞株に対する応答に従って付ける（テキスト参照）。スコアの合計が最終の指数値を生み出す。この指数値はＡＤを全部の対照から区別する。この試料の指数の感受性および特異性は１００％である。本発明を、その好適な実施態様を特に参照することにより詳細に説明してきたが、本発明は他の異なる実施態様も可能であることが理解されるであろう。当業者には容易に明白であるように、変更や改良を本発明の精神および範囲の中で行うことができる。従って、前記の開示および記載は例示目的のためのみのものであり、いかなる意味においても本発明を限定するものではなく、本発明は請求の範囲によってのみ特定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者エトチェバーリガレイ，リーニアメリカ合衆国メリーランド州20892，ロックヴィル，ビレッジ・スクエア・テラス 12221 (72)発明者キム，クリストファー・エスアメリカ合衆国メリーランド州20904，シルバー・スプリング，ベニス・ドライブ 902 (72)発明者ハン，イ−ファン中国シャンハイ 200080，リヤン・ロード，レーン 964，ナンバー 161 (72)発明者ネルソン，トム・ジェイアメリカ合衆国メリーランド州20906，シルバー・スプリング，グランド・プレ・ロード 14130，アパートメント 43

Claims

【特許請求の範囲】１．患者におけるアルツハイマー病を診断するための方法であって、下記の工程：ａ．該患者からタンパク質試料を入手すること；そしてｂ．該試料中のＣｐ２０タンパク質のレベルを検出することを含む上記の方法。２．該タンパク質試料が、繊維芽細胞、頬粘膜細胞、ニューロンおよび血液細胞から成る群から選択される細胞から単離される、請求項１に記載の方法。３．該細胞が繊維芽細胞である、請求項２に記載の方法。４．該検出工程（ｂ）が免疫アッセイにより実施される、請求項１に記載の方法。５．該免疫アッセイが、以下の工程：（ａ）該患者からのタンパク質試料をＣｐ２０タンパク質を認識する抗体と接触させること；そして（ｂ）該抗体と該Ｃｐ２０タンパク質との複合体を検出することを含む、請求項４に記載の免疫アッセイ。６．該抗体がモノクローナル抗体である請求項５に記載の免疫アッセイ。７．該抗体がポリクローナル抗体である請求項５に記載の免疫アッセイ。８．該免疫アッセイが、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降、ケミルミネッセントアッセイ、免疫組織化学アッセイ、ドットおよびスロットブロットアッセイから成る群から選択される、請求項４に記載の方法。９．該免疫アッセイがウエスタンブロットアッセイである、請求項８に記載の方法。１０．図１２Ａに示すアミノ酸配列またはその実質的に相同な配列を含む、Ｃｐ２０タンパク質。１１．図１２Ａに示すアミノ酸配列またはその実質的に相同な配列を含む、Ｃｐ２０ペプチド。１２．Ｃｐ２０タンパク質またはその一部と反応性を有する抗体。１３．該抗体がモノクローナルである、請求項１２に記載の抗体。１４．該抗体がポリクローナルである、請求項１２に記載の抗体。１５．図１２Ａに示すＣｐ２０アミノ酸配列をコードする、単離かつ精製された核酸配列。１６．アミノ酸配列ＡＲＬＷＴＥＹＦＶＩＩＤＤＤＣ（一文字コード）を含むＣｐ２０ペプチド。１７．請求項１６に記載のＣｐ２０ペプチドと反応性を有する抗体。１８．該抗体がポリクローナルである、請求項１７に記載の抗体。１９．該抗体がモノクローナルである、請求項１７に記載の抗体。２０．Ｃｐ２０タンパク質を認識する抗体を含む、アルツハイマー病の診断分析を実施するためのキット。２１．コントロール試料として使用するためのＣｐ２０タンパク質試料をさらに含む、請求項２０に記載のキット。２２．試料中のアルツハイマー病を診断するための評価方法であって、下記の工程：ａ）該試料の一部分に適用された第１のアルツハイマー病診断試験から第１の値を獲得し；ｂ）該試料の第２部分に適用された第２のアルツハイマー病診断試験から第２の値を獲得し；そしてｃ）該第１および該第２のアルツハイマー病診断試験のために予め選択した数値スケールに従って該第１の値および該第２の値を組み合わせて診断インデックスを提供することを含む上記の方法。２３．該患者から得た該試料の第３部分に適用された第３のアルツハイマー病診断試験から第３の値を獲得する工程をさらに含み、上記組み合わせが、該第３のアルツハイマー病診断試験のために決定した予め選択した数値スケールに従って該第１および第２の値と該第３の値を組み合わせることを含む、請求項２２に記載の方法。２４．該予め選択した数値スケールの各々が、各々の診断試験をアルツハイマー病細胞の試料集団に適用し、第１の応答値を獲得し、そして各々の診断試験を非アルツハイマー病細胞の試料集団に適用し、第２の応答値を獲得し、第１および第２の応答シグナルに基づいて細胞を分類してスコアインデックスを提供することにより、決定される、請求項２２に記載の方法。２５．該アルツハイマー病診断試験の少なくとも１つが；（ｉ）１１３ｐｓカリウムイオンチャンネル試験；（ii）カリウムチャンネル遮断剤試験の存在中における細胞内カルシウム濃度試験；（iii）カルシウム放出試験の活性化剤の存在中における細胞内カルシウム濃度；および（iv）記憶関連ＧＴＰ結合タンパク質（Ｃｐ２０）試験から成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。２６．該活性化剤が、ブラジキニン、ボンベシン、プロストグランジン、Ｆ₂ およびバソプレッシンから選択される、請求項２５に記載の方法。２７．該カリウムチャンネル遮断剤が、ＴＥＡ、チャリブドトキシン、アパミン、デンドラトキシン、カロトキシン、ｍｃｄペプチド、ソイイルトキシン、ボリウム、セシウム、レイブロトシキン、Ｉおよびノキシウストキシンから成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。２８．該カリウムチャンネル遮断剤がＴＥＡである請求項２７に記載の方法。２９．該活性化剤がブラジキニンである請求項２６に記載の方法。３０．該活性化剤がボンベシンである請求項２６に記載の方法。３１．該第１の診断試験が、試料部分を１３５秒以下の時間の間ブラジキニンと接触させることを含み；そして該第１の値が細胞応答の指標である、請求項２６に記載の方法。３２．該予め選択されたスケールが細胞応答の百分率の範囲に割り当てられたスコアであり、該数値スコアが：（ｉ）応答細胞の百分率が１．５％未満である場合は第１の値；（ii）応答細胞の百分率が１．５％以上である場合は第２の値；そして（iii）細胞応答の百分率が４％以上である場合は第３の値である、請求項３１に記載の方法。３３．該第１の診断試験が、試料部分を４０秒以下の時間の間ボンベシンと接触させることを含み；そして該第１の値が細胞応答の指標であり、時間統合したカルシウムイオン濃度として表示した応答の規模であり、それによって時間の関数として測定したカルシウムイオン濃度のグラフの下の領域を表示する、請求項２６に記載の方法。３４．該予め選択されたスケールが細胞応答の百分率の範囲に割り当てられたスコアであり、応答の規模がナノモル−秒の単位であり、該スコアおよび規模が：（ｉ）応答細胞の百分率が５０％未満または＜２３０００ｎＭ−秒の領域である場合は第１の値；（ii）応答細胞の百分率が５０％以上であり、２３０００ｎＭ−秒以上の領域である場合は第２の値；そして（iii）細胞応答の百分率が５０％以上であり、３００００ｎＭ−秒以上の領域である場合は第３の値である、請求項３３に記載の方法。３５．該診断試験が、試料部分を６０秒以下の時間の間ＴＥＡと接触させることを含み；そして該第１のシグナルが細胞応答の指標である、請求項２８に記載の方法。３６．該予め選択されたスコアが細胞応答の百分率の範囲に割り当てられたスコアであり、該数値スコアが：（ｉ）応答細胞の百分率が５％未満である場合は第１の値；（ii）応答細胞の百分率が５％以上である場合は第２の値；そして（iii）細胞応答の百分率が１６％以上である場合は第３の値である、請求項３５に記載の方法。３７．ｉ）試料中の第１の診断試験に対応したシグナルを提供するための第１の診断手段； ii）試料中の第２の診断試験に対応したシグナルを提供するための第２の診断手段；および該第１および第２のシグナルを複合スコア中に組み合わせるための手段：を含む、アルツハイマー病のための試料評価システム。