PT1023080E

PT1023080E - Sítio de ligação de um ligando rage e respectivos usos

Info

Publication number: PT1023080E
Application number: PT98952204T
Authority: PT
Inventors: David Stern; Ann Marie Schmidt; Shi Du Yan; Ira Lamster
Original assignee: Univ Columbia
Priority date: 1997-10-09
Filing date: 1998-10-09
Publication date: 2010-10-18
Also published as: US20010053357A1; JP2001519401A; EP1023080A1; JP2010143932A; WO1999018987A1; EP1023080B1; EP2343316A1; AU9795898A; HK1031100A1; ES2351876T3; US6555651B2; ATE476192T1; EP1023080A4; CY1110884T1; DK1023080T3; DE69841806D1

Description

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DESCRIÇÃO "SÍTIO DE LIGAÇÃO DE UM LIGANDO RAGE E RESPECTIVOS USOS" 0 presente pedido de patente reivindica a prioridade de US N° de Série 08/948,131. A invenção aqui divulgada foi realizada com o apoio do Governo, no âmbito das bolsas USPHS N° AG00690, AG00603 e HL56881 do Departamento de Saúde e Serviços Humanos. Consequentemente, o Governo dos EUA detém determinados direitos desta invenção.

Antecedentes da invenção

Ao longo deste documento, várias publicações são referenciadas pelo seu autor e data. As citações completas respeitantes a estas publicações podem ser encontradas no final desta descrição, imediatamente a seguir aos Procedimentos Experimentais e antecedendo as

Reivindicações, listadas por ordem alfabética. A divulgação destas publicações representa o estado a técnica, tal como o conhecido pelo perito na especialidade à data da invenção descrita e reivindicada no presente documento.

Doenças cardíacas isquémicas são a principal causa de morbilidade e mortalidade na população em geral, mas especialmente em doentes com diabetes. A prevalência da doença arterial coronária é tão elevada como 55% em doentes adultos com diabetes (Robert e Strong, 1968) . Na verdade, dados do Estudo Farmingham do Coração (Farmingham Heart Study) demonstram que a mortalidade resultante de doença cardiovascular e diabetes, não dependentes de insulina (NIDDM) , é superior ao dobro em homens com diabetes e mais do quadruplo em mulheres com diabetes, quando comparada com 2 sujeitos controlo não diabéticos (Kannel e McGee, 1979). Para além do incremento da prevalência, estudos demonstram que a aterosclerose em doentes com diabetes é claramente mais acelerada e extensa. Numa série de autópsias, por exemplo, doentes com diabetes demonstraram ter maior gravidade de doença da artéria coronária esquerda anterior (Waller et ai., 1980), maior incidência de twc e doença trivascular (Crall e Roberts, 1978), e uma maior difusão da distribuição as feridas ateroscleróticas (Hamby et al., 1976) . Estes resultados foram confirmados através de angiografia em doentes sintomáticos (Pyorala et al., 1978). São numerosas as razões da aterosclerose acelerada na instalação das diabetes. Contudo, mesmo após a correcção da dislipidémia, hipertensão e obesidade, estudos de análise multivariada indicaram que doentes com diabetes têm um risco acrescido de doença cardiovascular, relativamente a sujeitos não diabéticos (Kannel e McGee, 1979). Por exemplo, no Estudo de Saúde dos Enfermeiros (Nurses' Health Study) dos 1.500 sujeitos com diabetes, de entre 115.000 mulheres, a incidência de doença cardiovascular era 5 vezes mais elevada em sujeitos diabéticos, independentemente dos seus níveis de colesterol (Manson et al., 1991). Estes dados sugerem que factores únicos para a população com diabetes representam um papel importante.

Os sinais chave da doença de Alzheimer (AD) são as acumulações intracelulares e extracelulares de proteínas, cuja progressão se encontra estreitamente correlacionada com a eventual disfunção neuronal e a demência clínica (para mais detalhes consultar Goedert, 1993; Haass et al., 1994; Kosik, 1994; Trojanoswski et al., 1994; Wischik, 1989). 0 péptido β-amilóide (Αβ), que é o principal componente de depósito extracelular em AD, tanto nas placas 3 senis e difusas e na vascularidade cerebral, influencia activamente as funções celulares, tal como o indicado em várias linhas de evidência: Αβ tem sido encarado como promotor de excrescência neuritica, gerador de intermediários reactivos do oxigénio (ROIs), indutor celular de estresse oxidativo, condutor de citoxicidade neuronal e promotor de activação microglial (Behl et al., 1992; David et al., Hensley et al., 1994; Koh et al., 1990; Koo et al., 1993; Loo et al., 1993; Meda et al., 1995; Pike et al., 1993; Yankner et al., 1990) . Para que ο Αβ induza estes múltiplos efeitos celulares, a superfície celular deverá conter proteína (s) de ligação que fixem ο Αβ. Neste sentido, várias proteínas associadas à célula, bem como proteoglicanos sulfatados, podem interagir com ο Αβ. Estes incluem: o receptor da substância P, o receptor do complexo serpina-enzima (SEC), a apolipoproteína E, a apolipoproteína J (clusterina), a transtiretina, a alfa-1 anti-cromotripsina, a proteína precursora da β-amilóide e sulfatos sulfonados ou de heparina (Abraham et al., 1985; Fraser et al., 1992; Fraser et al., 1993; Ghisc et al., 1993; Joslin et al., 1991; Kimura et al., 1993; Kisilevsky et al., 1995; Strittmatter et al., 1993a; Strittmatter et al., 1993b; Schwarzman et al., 1994; Snow et al., 1994; Yankner et al., 1990) . Destes, o receptor da substância P e o receptor de SEC podem funcionar como receptores de superfície celular neuronal para Αβ, embora não tenha sido encontrada evidência directa para tal (Fraser et al., 1993; Joslin et al., 1991; Kimura et al., 1993; Yankner et al., 1990) . Na verdade, o papel dos receptores da substância P é controverso e não se sabe se Αβ interage individualmente com o receptor ou se é igualmente necessária a presença de co-estimuladores (Calligaro et al., 1993; Kimura et al., 1993; Mitsuhashi et al., 1991). Para além disso, o receptor de SEC tem ainda de ser completamente 4 caracterizado. 0 péptido β-amilóide (Αβ) é central para a patologia da Doença de Alzheimer (AD), primariamente devido ao seu efeito neurotóxico, o qual envolve a indução de estresse celular oxidativo.

Sumário da invenção A presente invenção divulga um péptido ligado a um anticorpo, ou porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE compreendendo os aminoácidos 1-30 do

domínio V de um receptor natural de RAGE e no qual a porção do anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc. A presente invenção divulga igualmente uma composição farmacêutica compreendendo o referido péptido. A invenção é também direccionada ao referido péptido, para inibição da interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor do produto de glicação avançada, o qual se encontra na superfície celular de um sujeito e ainda para inibição de (a) degeneração de uma célula neuronal; (b) formação de uma fibrilha peptídica β-amilóide numa célula; (c) arranjo extracelular de um péptido amilóide numa fibrilha; (d) inibição da agregação de um péptido β-amilóide na superfície de uma célula; (e) infiltração de uma célula microglial em placas senis; (f) activação de uma célula microglial por um péptido β-amilóide; ou (g) activação de um gene NF-κΒ numa célula, num sujeito. A invenção ainda divulga, o uso do referido péptido para tratamento de um sujeito com uma condição patológica associada com uma interacção entre o péptido β-amilóide e um receptor do produto de glicação avançada, o qual se encontra na superfície de uma célula, num sujeito, em que a condição patológica é a diabetes, Doença de Alzheimer, senilidade, insuficiência renal, aterosclerose hiperlipidémica, citotoxicidade neuronal, Síndroma de Down, demência associada a traumatismo craniano, esclerose amiotrófica lateral, esclerose múltipla, amiloidose, doença auto-imune, 5 inflamação, tumor, cancro, impotência masculina, tratamento de feridas, doença periodontal, neuropatia, retinopatia ou degeneração neuronal. A presente invenção divulga um péptido isolado contendo uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência de aminoácidos do dominio V de um receptor do produto de glicação avançada (RAGE). A presente invenção divulga ainda um péptido contendo uma sequência de aminoácidos A-Q-N-I-T-A—R—I-G-E—P—L—V-L—K—C-K—G—A-P-K—K—P—P—Q—R-L—E—W-K (Seq. ID. No. 1). A presente invenção divulga uma composição farmacêutica, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um péptido isolado, contendo uma sequência de aminoácidos do dominio V de um RAGE e um veiculo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção divulga, igualmente, um método para a inibição da interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor do produto de glicação avançada, o qual se encontra na superfície de uma célula. Este método compreende o contacto de célula com o péptido, ou com um agente funcionalmente equivalente, em que o péptido, ou o agente, é capaz de inibir a interacção do péptido β-amilóide com o receptor do produto de glicação avançada. A presente invenção divulga ainda um péptido ligado a um anticorpo, ou porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE, compreendendo os aminoácidos 1-30 do domínio V de um receptor natural de RAGE, e em que a porção do anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc, para o tratamento de um sujeito com uma condição associada ao péptido β-amilóide com um receptor do produto de glicação avançada numa célula, através da administração, ao sujeito, de um péptido, ou de um agente funcionalmente equivalente, capaz de inibir a interacção do péptido β-amilóide com o receptor do produto de glicação avançada, encontrando-se 6 este péptido, ou agente, presente numa quantidade eficaz para inibir a interacção do péptido β-amilóide com o receptor, e portanto, tratando o referido sujeito.

Breve descrição das figuras

Figura 1. Medições da perda óssea alveolar em ratinhos tratados com sRAGE. Consulte o Exemplo 2 nos Procedimentos Experimentais. Análise estatística = Grupo I vs. Grupo II: p=0,002; Grupo I vs. Grupo III: p=0,005; Grupo III vs. Grupo IV: p=0,009.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção divulga um péptido isolado ligado a um anticorpo, ou porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE compreendendo os aminoácidos 1-30 do domínio V de um receptor natural de RAGE e em que a porção do anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc. A presente invenção divulga ainda o referido péptido para tratamento ou melhoria dos sintomas, num sujeito, os quais estão associados à doença, sendo esta doença a aterosclerose, hipertensão, cura de feridas, doença periodontal, impotência masculina, retinopatia, diabetes e complicações de diabetes, através da administração, ao sujeito, de uma quantidade do péptido isolado, da presente invenção, ou de um agente capaz de inibir a interacção entre o péptido β-amilóide e RAGE, eficaz para inibir a interacção, de forma a tratar ou melhorar a doença ou condição no sujeito. O péptido pode igualmente prevenir a ocorrência destas condições no sujeito.

Em várias das realizações da presente invenção, o péptido, tendo uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência de aminoácidos do domínio V de um RAGE ou de um 7 RAGE solúvel, é exemplificado através das seguintes sequências de aminoácidos: A-Q-N-l-T-A-R-l-G-Ê-P-L-V-L-K-C-K-G-A-P-K-K-P-P-Q-R-L-E-W-K (Seq. I.D. No. 1); G-Q-N-I-T-A-R-I-G'E~P-L-V-L-S-C-K-G-A-P-K-K-P-P-Q“Q*L-E-W-K (Seq. I.D. No. 2); G-G-N-l-T-A-R-l-G-E-P-L-M-L-S-C-K-A-A-P-K-K-P-T-Q-K-L-E-W-K (Seq. I.D. No. 3); D-Q-N~l-T-A-R*l-G-K-P-L-V-L-N-C-K-G-A-P-K-K-P-P-Q-G-L-E-W-K (Seq. I.D. No, 4).

A presente invenção divulga um péptido isolado contendo uma sequência de aminoácidos, que corresponde à sequência de aminoácidos dos primeiros 1 - 112 aminoácidos da RAGE humana (que é o domínio V da RAGE humana), ou que corresponde aos aminoácidos 5 - 35 do domínio V da RAGE humana, ou a qualquer porção menor do domínio V da RAGE humana. Péptidos representativos da presente invenção incluem, mas não se encontram limitados a, péptidos tendo uma sequência de aminoácidos, a qual correspondem os aminoácidos números 2 a 30, 5 a 35, 10 a 40, 15 a 45, 20 a 50, 25 a 55, 30 a 60, 30 a 65, 10 a 60, 8 a 100, 14 a 75, 24 a 80, 33 a 75 e 45 a 110 da proteína sRAGE humana.

As abreviaturas usadas neste documento para os aminoácidos são as usadas convencionalmente: A = Ala = Alanina; R = Arg = Arginina; N = Asn = Asparagina; D = Asp = Ácido Aspártico; C = Cys = Cisteína; Q = Gin = Glutamina; E = Glu = Ácido Gutâmico; G = Gly = Glicina; H = His = Histidina; I = Ile = Isoleucina; L = Leu = Leucina; K = Lys = Lisina; M = Met = Metionina; F = Phe = fenilalanina; P = Pro = Prolina; S = Ser = Serina; T = Thr = Treonina; T = Trp = Triptofano; Y = Tyr = Tirosina; V = Vai = Valina. Os aminoácidos podem ser L ou D-aminoácidos. Um aminoácido pode ser substituído por uma aminoácido sintético, o qual é alterado, de forma a incrementar o tempo de semi-vida do péptido ou para incrementar a potência do péptido ou ainda par incrementar a biodisponibilidade do péptido. A presente invenção divulga igualmente uma composição farmacêutica, a qual compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do péptido, o qual tem uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência de aminoácidos do domínio V de um receptor do produto de glicação avançada (RAGE) e um veículo farmaceuticamente aceitável. 0 veículo pode ser um diluente, um aerossol, um veículo tópico uma solução aquosa, uma solução não aquosa ou um veículo sólido. 0 veículo pode ser um polímero ou uma pasta dentífrica. A composição farmacêutica pode compreender o péptido, tendo uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência de aminoácidos do domínio RAGE, ligado a um segundo péptido, no qual o segundo péptido pode ser uma albumina, uma globulina ou um péptido seleccionado de entre um grupo de péptidos, no qual cada péptido do grupo compreende um diferente comprimento peptidico, e no qual a sequência de cada péptido corresponde a qualquer sequência de aminoácidos retirada do aminoácido número 31 ao aminoácido número 281 da proteína sRAGE humana. A presente invenção compreende igualmente uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do péptido, o qual é um fragmento da sRAGE, compreendendo os aminoácidos 1 a 30 do domínio V de uma sRAGE natural, ligado a um anticorpo ou a uma porção derivada. Num dos aspectos, o anticorpo pode ser capaz de ligar-se especificamente ao receptor do produto de glicação avançada. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal. A porção ou fragmento de anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc. A porção ou fragmento do anticorpo pode compreender uma determinada região complementar ou uma região variável. 9 A presente invenção divulga igualmente a inibição da interacção de péptidos β-amilóides com um receptor do produto de glicação avançada, quando o receptor se encontra na superfície de uma célula, através de uma quantidade efectiva do inibidor da referida interacção, para inibir a interacção entre o péptido β-amilóide com o receptor do produto de glicação avançada, no qual o referido inibidor é um péptido ligado a um anticorpo, ou a uma porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE, compreendendo 1 a 30 aminoácidos do domínio V de uma sRAGE natural, e onde a porção de anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc. A célula pode ser uma célula eucariota. A célula pode ser a célula de um sujeito. O sujeito pode ser um humano. A célula pode ser uma célula neuronal, uma célula endotelial, uma célula glial, uma célula microglial, uma célula do músculo liso, uma célula somática, uma célula da medula óssea, uma célula hepática, uma célula intestinal, uma célula germinal, um miócito, um fagócito mononuclear, uma célula endotelial, uma célula tumoral, uma célula linfocitária, uma célula mesenquimatosa, uma célula epitelial retinosa, uma célula vascular da retina, uma célula ganglionária ou uma célula estaminal. A célula pode igualmente ser de outros tipos, não explicitamente listadas no presente documento. A célula pode ser qualquer célula humana. A célula pode ser uma célula normal, uma célula neoplásica, uma célula doente ou uma célula infectada.

Numa outra divulgação, o inibidor compreende um péptido, um composto péptido-mimético, uma molécula de ácido nucleico, uma pequena molécula, um composto orgânico, um composto inorgânico, um anticorpo ou um fragmento deste. O inibidor pode ser um péptido isolado, tendo uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência do domínio V de um 10 receptor do produto de glicação avançada. O inibidor pode ser qualquer dos compostos ou composições descritos no presente documento. O inibidor pode ser um domínio V solúvel de um receptor do produto de glicação avançada. O inibidor pode compreender um anticorpo ou fragmento deste. O anticorpo pode ser capaz de se ligar especificamente ao receptor do produto de glicação avançada. 0 anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal ou um fragmento de um anticorpo. O fragmento de anticorpo pode compreender um fragmento Fab ou um fragmento Fc. 0 fragmento de anticorpo pode conter uma determinada região complementar.

Num dos aspectos da presente invenção, o inibidor é capaz de se ligar especificamente ao péptido β-amilóide. A presente invenção divulga ainda um inibidor de interacção entre um péptido β-amilóide e um receptor do produto de glicação avançada, no qual o referido inibidor é um péptido ligado a um anticorpo ou porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE compreendendo os aminoácidos 1 a 30 do domínio V de uma RAGE natural, e no qual a porção de anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc, para inibição da degeneração de células neuronais.

Num outro aspecto da presente invenção, é divulgado um inibidor da interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor do produto de glicação avançada, no qual o referido inibidor é um péptido ligado a um anticorpo ou a uma porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE compreendendo os aminoácidos 1 a 30 do domínio V de uma sRAGE natural, e no qual a porção de anticorpo é um 11 fragmento Fab ou um fragmento Fc, para a inibição da formação de uma fibrilha de péptido β-amilóide numa célula.

Num outro aspecto da presente invenção, é divulgado um inibidor da interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor do produto de glicação avançada, no qual o referido inibidor é um péptido ligado a um anticorpo ou a uma porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE compreendendo os aminoácidos 1 a 30 do domínio V de uma sRAGE natural, e no qual a porção de anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc, para a inibição do arranjo extracelular de um péptido β-amilóide numa fibrilha.

Num outro aspecto da presente invenção, é divulgado um inibidor da interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor do produto de glicação avançada, no qual o referido inibidor é um péptido ligado a um anticorpo ou a uma porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE compreendendo os aminoácidos 1 a 30 do domínio V de uma sRAGE natural, e no qual a porção de anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc, para a inibição da agregação de um péptido β-amilóide na superfície de uma célula.

Num outro aspecto da presente invenção, é divulgado um inibidor da interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor do produto de glicação avançada, na superfície de uma célula microglial, no qual o referido inibidor é um péptido ligado a um anticorpo ou a uma porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE compreendendo os aminoácidos 1 a 30 do domínio V de uma sRAGE natural, e no qual a porção de anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc, para a inibição da infiltração de uma célula microglial nas placas senis. 12

Num outro aspecto da presente invenção, é divulgado um inibidor da interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor do produto de glicação avançada, na superfície de uma célula microglial, no gual o referido inibidor é um péptido ligado a um anticorpo ou a uma porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE compreendendo os aminoácidos 1 a 30 do domínio V de uma sRAGE natural, e no qual a porção de anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc, para a inibição da activação de uma célula microglial por um péptido β-amilóide.

Num outro aspecto da presente invenção, é divulgado um inibidor capaz de inibir a interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor do produto de glicação avançada, no qual o referido inibidor encontra-se presente numa quantidade eficaz para inibir a interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor, no qual o referido inibidor é um péptido ligado a um anticorpo ou porção de anticorpo, o qual o péptido é um fragmento de sRAGE, compreendendo os aminoácidos 1 a 30 do domínio V de uma sRAGE natural, e no qual a porção de anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc, para ser administrado no tratamento de um sujeito com uma condição associada a uma interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor do produto de glicação avançada.

Num outro aspecto da invenção, a condição é a diabetes, Doença de Alzheimer, senilidade, insuficiência renal, aterosclerose hiperlipidémica, citotoxicidade neuronal, Síndroma de Down, demência associada a traumatismo craniano, esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla, doença auto-imune, inflamação, tumor, cancro, impotência masculina, tratamento de feridas, doença periodontal, neuropatia, retinopatia, nefropatia ou 13 degeneração neuronal. 0 sujeito pode ser um mamífero. 0 mamífero pode ser um humano. A administração pode compreender injecção intralesional, intraperitoneal, intramuscular ou intravenosa; infusão; administração mediada por lipossomas; tópica, nasal, oral, anal, subcutânea, vaginal, sublingual, ureteral, transdérmica, intracecal, ocular ou ótica. A condição pode estar associada com a degeneração de uma célula neuronal, no sujeito. A condição pode estar associada à formação de uma fibrilha de péptido β-amilóide. A condição pode estar associada à agregação de péptidos β-amilóides, com infiltração de uma célula microglial numa placa senil ou com a activação de uma célula microglial por um péptido β-amilóide. 0 inibidor pode consistir, essencialmente, numa porção do péptido, que contém uma sequência do domínio V de um receptor do produto de glicação avançada. 0 inibidor pode compreender a composição farmacêutica, a qual compreende um péptido contendo uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência de aminoácidos de um domínio V de um receptor do produto de glicação avançada e um veículo. A presente invenção divulga um método de avaliação da capacidade de um agente para inibição da ligação a um péptido β-amilóide com um domínio V de um receptor do produto de glicação avançada, na superfície de uma célula, que compreende: (a) o contacto de célula com um agente e um péptido β-amilóide; (b) determinação da quantidade de péptido β-amilóide ligado à célula; e (c) comparação da quantidade de péptido β-amilóide determinada no passo (b) com a quantidade determinada na ausência do agente, 14 avaliando assim, a capacidade do agente para inibir a ligação do péptido β-amilóide ao domínio V, do receptor do produto de glicação avançada, na superfície de uma célula.

Num aspecto da presente invenção, a célula é colocada em contacto com o agente e com o péptido β-amilóide, em simultâneo. Noutro aspecto da presente invenção, a célula é colocada em contacto com o agente e com o péptido β-amilóide. A célula pode ser uma célula neuronal, uma célula endotelial, uma célula glial, uma célula microglial, uma célula do músculo liso, uma célula somática, uma célula da medula óssea, uma célula hepática, uma célula intestinal, uma célula germinal, um miócito, um fagócito mononuclear, uma célula endotelial, uma célula tumoral, uma célula linfocitária, uma célula mesenquimatosa, uma célula epitelial da retina, uma célula vascular da retina, uma célula ganglionar ou uma célula estaminal. 0 agente pode compreender um péptido, um composto péptido-mimético, uma molécula de ácido nucleico, uma pequena molécula, um composto orgânico, um composto inorgânico, um anticorpo ou um fragmento deste. 0 agente pode ser um péptido, tendo uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência do domínio V de um receptor do produto de glicação avançada.

Noutro aspecto da presente invenção, o agente é péptido contendo uma sequência de aminoácidos A-Q-N-I-T-A-R-I-G-E-P-L-V-L-K-C-K-G-A-P-K-K-P-P-Q-R-L-E-W-K (Seq. ID No. 1).

Noutro aspecto da presente invenção, o agente é péptido contendo uma sequência de aminoácidos A-Q-N-I-T-A-R-I-G-E (Seq. ID No. 5). Num outro aspecto, o agente é um domínio V solúvel de um receptor do produto de glicação avançada. 0 agente pode ser uma porção extracelular de um receptor do 15 produto de glicação avançada. 0 agente pode ser um anticorpo, um fragmento deste, ou estar ligado a um anticorpo ou a um fragmento deste. 0 anticorpo pode ser capaz de se ligar especificamente ao receptor do produto de glicação avançada. 0 anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal. 0 anticorpo pode ser um anticorpo policlonal. 0 fragmento de anticorpo pode compreender um fragmento Fab ou um fragmento Fc. 0 fragmento de anticorpo pode conter uma determinada região complementar.

Noutro aspecto da invenção, o agente é capaz de ligar-se especificamente ao péptido β-amilóide. Noutro aspecto, o agente encontra-se ligado a um suporte sólido. Noutro aspecto, o agente é expresso na superfície de uma célula.

Noutro aspecto, a presente invenção divulga um inibidor da interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor do produto de glicação avançada, na célula, no qual o referido inibidor é um péptido ligado a um anticorpo, ou porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE compreendendo de 1 a 30 aminoácidos do domínio V de uma sRAGE natural e, no qual a porção do anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc, para inibição da activação de um gene NF-κΒ numa célula, numa célula. A presente invenção divulga igualmente um método para inibição de doença periodontal num sujeito, o qual compreende a administração tópica, ao sujeito, de uma composição farmacêutica, a qual compreende sRAGE numa quantidade eficaz para acelerar a cura de feridas e assim inibir a doença periodontal. A composição farmacêutica pode compreender sRAGE numa pasta dentífrica. A presente invenção divulga igualmente um método para inibição da interacção entre o produto de glicação avançada 16 com um receptor do produto de glicação avançada, quando o receptor se encontra na superfície de uma célula, o qual compreende o contacto da célula com uma quantidade do inibidor da referida interacção do produto de glicação avançada eficaz para inibir a interacção do produto de glicação avançada com o receptor do produto de glicação avançada. A célula pode ser uma célula endotelial, uma célula vascular do músculo liso, uma célula neuronal, um macrófago, um linfócito, uma célula vascular da retina, uma célula neuronal da retina, uma célula associada à gengiva, uma célula associada à pele, uma célula mesenquimatosa ou uma célula do tecido conectivo. 0 produto de glicação avançada (AGE) pode ser a pentosina, a carboximetil-lisina, uma piralina, uma imidazolona, um metilglioxal ou um etilglioxal. A presente invenção divulga ainda um método para o tratamento de um sujeito com uma condição associada a uma interacção entre um produto de glicação avançada com um receptor de um produto de glicação avançada numa célula, o qual compreende a administração, ao sujeito, de um inibidor capaz de inibir a interacção do produto de glicação avançada com um receptor de um produto de glicação avançada, estando o referido inibidor presente numa quantidade eficaz para inibir a interacção do produto de glicação avançada com um receptor de um produto de glicação avançada, e assim tratar o sujeito. A condição pode estar associada à diabetes. A condição pode ser diabetes, insuficiência renal, aterosclerose hiperlipidémica associada à diabetes, citotoxicidade neuronal, Síndroma de Down, demência associada ao traumatismo craniano, esclerose amiotrófica lateral, esclerose múltipla, amiloidose, doença auto-imune, inflamação, tumor, cancro, impotência masculina, tratamento 17 de feridas, doença periodontal, neuropatia, retinopatia, nefropatia ou degenerescência neuronal. 0 produto de glicação avançada (AGE) pode ser a pentosina, a carboximetil-lisina, uma piralina, uma imidazolona, um metilglioxal ou um etilglioxal. 0 agente ou inibidor da presente invenção compreende um péptido que tem uma sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos números 1 a 30 de um domínio V de sRAGE (receptor solúvel de um produto de glicação avançada). A sRAGE pode ser uma sRAGE humana, de ratinho, de rato ou bovina. O agente da presente invenção pode ser um inibidor. O agente pode consistir nos aminoácidos números 1 a 30 de um domínio V de sRAGE. O agente pode consistir nos aminoácidos 1 a 112, os quais compreendem um domínio V de uma proteína sRAGE. O agente pode compreender um péptido contendo uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência de aminoácidos de um domínio V de uma sRAGE ligado a um segundo péptido, no qual o segundo péptido pode ser uma albumina, uma globulina ou um péptido seleccionado de entre um grupo de péptidos, no qual cada péptido do grupo compreende um péptido de diferente comprimento, e no qual a sequência de cada péptido corresponde a qualquer sequência de aminoácidos retirada de entre o aminoácido número 31 até ao aminoácido número 281 de uma proteína sRAGE humana, bovina, de ratinho ou de rato.

Na presente invenção, a célula pode ser uma célula neuronal, uma célula endotelial, uma célula glial, uma célula microglial, uma célula do músculo liso, uma célula somática, uma célula da medula óssea, uma célula hepática, uma célula intestinal, uma célula germinal, um miócito, um fagócito mononuclear, uma célula endotelial, uma célula tumoral ou uma célula estaminal. A presente invenção pode ainda incluir células de outros tipos não explicitamente 18 listadas neste documento. A célula pode ser qualquer célula num sujeito. A célula pode encontrar-se sob estresse oxidativo. 0 agente pode ser um péptido, um péptido-mimético, um ácido nucleico ou uma molécula pequena. Os termos "péptido" e "polipéptido" são usados indistintamente ao longo deste documento. 0 péptido compreende, pelo menos, uma sequência do aminoácido 1 ao aminoácido 30 de sRAGE. O péptido pode ser um péptido, consistindo essencialmente nas sequências de aminoácidos Seq. ID No. 1, 2, 3, 4 ou 5. O péptido pode compreender os aminoácidos 1 a 112 de uma proteína RAGE. O péptido pode consistir essencialmente no domínio V de uma proteína RAGE. 0 agente pode ser conjugado com um veículo. O péptido ou agente encontra-se ligado a um anticorpo, tal como um fragmento Fab ou um fragmento Fc, para administração específica alvo. O agente pode ser um domínio V solúvel de um receptor do produto de glicação avançada. 0 agente pode ser capaz de se ligar especificamente ao péptido β-amilóide. O agente pode ligar-se ao péptido β-amilóide através do sítio de ligação onde o receptor do produto de glicação avançada interage. 0 agente pode ser uma porção solúvel, extracelular, de um receptor do produto de glicação avançada.

Num dos aspectos da presente invenção, o péptido pode compreender, pelo menos, uma porção de um receptor natural e solúvel do produto de glicação avançada. 0 péptido pode compreender um domínio V de um receptor natural e solúvel do produto de glicação avançada. O péptido compreende os aminoácidos 1 a 30 do domínio V. 0 péptido pode ser um 19 domínio solúvel de sRAGE. 0 péptido pode ser um domínio V, solúvel, de RAGE. 0 polipéptido pode ser um péptido-mimético, um polipéptido sintético ou um análogo de polipéptido. 0 polipéptido pode ser um polipéptido não natural, o qual tem uma quiralidade não existente na natureza, i.e. D-aminoácidos ou L-aminoácidos. 0 polipéptido pode ser um derivado de um péptido natural, um polipéptido modificado, um polipéptido marcado ou um polipéptido que inclui péptidos não naturais. 0 péptido-mimético pode ser identificado através de pesquisa em grandes bibliotecas de diferentes compostos, que são péptido-miméticos, para a determinação de um composto que seja capaz de inibir a interacção de um péptido β-amilóide com um receptor de um produto de glicação avançada. 0 péptido, ou polipéptido, da presente divulgação, pode compreender alterações às sequências listadas nas Seq. ID No. 1 a 5. 0 péptido da presente invenção pode compreender alterações nas sequências, as quais não afectam a funcionalidade do péptido, de uma forma negativa, mas que podem incrementar a funcionalidade do péptido de uma forma positiva, i.e. incrementar a potência do péptido. Alguns exemplos dessas alterações, à sequência humana dos primeiros 30 aminoácidos do domínio V de sRAGE (Seq. ID No. 1) , encontram-se listadas abaixo, no presente documento, como exemplos: (a) Substituição da D-alanina pela L-alanina na posição 6; (b) Substituição D-lisina por L-lisina na posição 15; (c) Substituição D-alanina por L-alanina na posição 6 e D-lisina por L-lisina na posição 15; (d) Omissão dos aminoácidos 1-5 do domínio V, tornando a L-alanina o N-aminoácido do grupo final; 20 (e) Omissão dos aminoácidos 1-5 do domínio V tornando a D-alanina o N-aminoácido do grupo final; (f) Substituição da D-lisina por L-lisina no aminoácido número "30" posição do domínio V da Sequência ID. No. 1; (g) Substituição da L-arginina por L-lisina na posição 30 do domínio V; (h) Substituição da L-arginina por L-lisina na posição 30 do domínio V e adição da glicina como grupo terminal carboxilo, para produção de um péptido com 31 aminoácidos; (i) Substituição da L-arginina por L-lisina na posição 30 do péptido de aminoácidos que contém a sequência de aminoácidos 6 a 30, descrita para o domínio V da sRAGE; (j) Substituição da L-arginina por L-lisina na posição 30 do péptido de aminoácidos que contém a sequência de aminoácidos 6 a 30, descrita para o domínio V da sRAGE e adição da glicina como grupo terminal carboxilo, para produção de um péptido com 25 aminoácidos; (k) Substituição da D-lisina por L-lisina na posição 30, da sequência de aminoácidos 6-30 designada para o domínio V; (l) Substituição da D-lisina por L-lisina na posição 30 da sequência de aminoácidos 6-30 designada para o domínio V e adição de L-alanina na posição do C-terminal do novo péptido de 26 aminoácidos; (m) Substituição da D-valina por L-valina na posição 13, do domínio V do péptido de 30 aminoácidos, designado 6-30 do domínio V da sRAGE V; (n) Substituição da D-valina por L-valina na posição 13 do péptido de 25 aminoácidos, designado 6-30, do domínio V da sRAGE; (o) Substituição da D-alanina por L-alanina na posição 6, do péptido de 30 aminoácidos, e a D-valina por L-valina, na posição 13 dos 30 aminoácidos do domínio V; 21 (p) Substituição da D-alanina por L-alanina na posição 6 e a D-valina por L-valina na posição 13 do péptido de 25 aminoácidos, designado 6-30 do domínio V da sRAGE; (q) os péptido acima listados (a) - (p) , serializados através de ácido carboxílico na posição 30, com albumina, globulinas ou péptidos de diferentes comprimentos, compostos por aminoácidos contidos entre as posições 31 a 281 da proteína sRAGE humana, de ratinho, rato ou bovina.

Para além das formas naturais dos polipéptidos derivados de sRAGE, a presente invenção divulga ainda outros polipéptidos tais como polipéptidos análogos de sRAGE, os quais têm funcionalidade equivalente à do péptido com Seq. ID. No. 1 ou a funcionalidade mais potente ou mais positiva. Tais análogos incluem fragmentos de sRAGE. Seguindo os procedimentos do pedido de patente publicado, de Alton et Aloe (WO 83/04053) é possível conceber e produzir rapidamente, genes codificadores para a expressão microbiana de polipéptidos com conformações primárias, que diferem dos mencionados neste documento, em termos de identidade e localização de um ou mais resíduos (ex. substituições, adições e remoções terminais e intermediárias). Alternativamente, modificações do cADN e de genes genómicos, podem ser rapidamente conseguidas por reconhecidas técnicas de mutagénese dirigida, e utilizadas para gerar análogos e derivados de polipéptidos sRAGE. Tais produtos partilham, pelo menos, de uma das propriedades biológicas de sRAGE, mas podem diferir noutras. Como exemplos, produtos da presente invenção incluem reduções, por ex. por deleção; ou produtos mais estáveis à hidrólise (e portanto, podem apresentar efeitos mais pronunciados ou mais prolongados comparativamente aos naturais); ou que tenham sido modificados para remover ou adicionar um ou mais sítios potenciais para O-glicosilação e/ou N-glicosilação, ou que tenham um ou mais resíduos de 22 cisteína removidos ou substituídos por, como ex. resíduos de alanina ou serina e são potencialmente mais facilmente isoláveis em formas activas de sistemas microbianos: ou que tenham um ou mais resíduos de tirosina, substituídos por fenilalanina, e ligam-se mais ou menos rapidamente às proteínas alvo ou a receptores nas células alvo. De igual forma, a presente invenção compreende ainda fragmentos polipeptídicos duplicando apenas uma parte da sequência contínua de aminoácidos ou conformações secundárias na sRAGE, cujos fragmentos podem possuir uma propriedade da sRAGE e não outras. É de realçar que não é necessário que um ou mais dos polipéptidos da invenção apresente utilidade terapêutica ou utilidade noutros contextos, tais como em testes de antagonismo da sRAGE. Antagonistas competitivos podem ser bastante úteis, por exemplo, em casos de superprodução de sRAGE.

Sobre a aplicabilidade dos análogos polipeptídicos da invenção, existem relatórios sobre a propriedade imunológica de péptidos sintéticos, os quais duplicam substancialmente a sequência de aminoácidos em proteínas de ocorrência natural, glicoproteínas e nucleoproteínas. Mais especificamente, polipéptidos de baixo peso molecular relativo, têm demonstrado participar em reacções imunes, que são similares em duração e extensão às reacções imunes de proteínas fisiologicamente significativas, tais como antigenes virais, polipéptidos hormonais e similares. Incluídas entre as reacções imunes destes polipéptidos, encontra-se a indução de formação de anticorpos específicos, em animais imunologicamente activos (Lerner et al., 1981; Ross et al., 1981; Walter et al., 1981; Wong et al. , 1982; Baron et al., 1982; Dressman et al., 1982; Lerner, Scientific American, 1983. Ref. também a, Kaiser et al., 1984), relativo às propriedades biológicas e 23 imunológicas de péptidos sintéticos, os quais partilham aproximadamente, as estruturas secundárias de péptidos hormonais, mas podem não partilhar a sua conformação estrutural primária. 0 polipéptido da presente invenção pode ser um composto péptido-mimético, que pode, pelo menos parcialmente, ser não natural. 0 composto péptido-mimético pode ser uma pequena molécula mímica de uma porção de sequência de aminoácido de sRAGE. 0 composto pode ter estabilidade, eficácia, potência e biodisponibilidade incrementadas, em virtude do mímico. Adicionalmente, o composto pode ter toxicidade diminuída. 0 composto péptido-mimético pode ter permeabilidade da mucosa intestinal aumentada. 0 composto pode ser sinteticamente preparado. 0 composto da presente invenção pode incluir L-, D-, DL- ou aminoácidos não naturais, aminoácidos alfa ou alfa substituídos, N-alquil-aminoácidos, ácido láctico (um análogo da alanina isoelectrónico). 0 esqueleto peptídico do composto pode ter, pelo menos, uma ligação substituída por PSI-(CH=CH) (Kempf et ai., 1991). 0 composto pode ainda incluir trifluor-tirosina, p-Cl-fenilalanina, p-Br-fenilalanina, poli-L-propargilglicina, poli-D, L-alil -glicina ou poli-L-alil-glicina.

Um dos aspectos da presente invenção, relaciona-se com um composto péptido-mimético com actividade biológica de prevenção da aterosclerose acelerada num sujeito, no qual o composto tem uma ligação, um esqueleto peptídico ou um componente aminoácido substituído por um mímico adequado. Exemplos de aminoácidos não naturais, que podem ser aminoácidos mímicos adequados, incluem a alanina, ácido L-a-amino butírico, ácido L-Y-amino butírico, ácido L-a-amino isobutiríco, ácido L-s-amino capróico, ácido 7-amino heptanóico, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, cisteína (acetamindometil) , Ν-ε-Boc-N-cx-CBZ-L-lisina, N-s-Boc-N-a- 24

Fmoc-L-lisina, L-metionina sulfona, L-norleucina, L-norvalina, Ν-α-Boc-N-SCBZ-L-ornitina, Ν-δ-Boc-N-a-CBZ-L-ornitina, Boc-p-nitro-L-fenilalanina, Boc-hidroxiprolina, Boc-L-tioprolina (Blondelle, et al. 1994; Pinilla, et al. 1995) .

De acordo com o método da presente invenção, o agente pode compreender um péptido, um péptido-mimético, uma molécula orgânica, um hidrato de carbono, um lípido, um anticorpo ou um ácido nucleico. 0 péptido da presente invenção pode compreender um péptido produto de glicação avançada, ou uma porção derivada deste, um receptor de produto de glicação avançada, ou um derivado deste, um receptor solúvel de um produto de glicação avançada, ou um derivado deste. 0 péptido da presente invenção pode compreender qualquer parte dos primeiros 112 aminoácidos de uma proteína sRAGE. 0 péptido da presente invenção pode conter um domínio V de uma proteína solúvel de RAGE. 0 péptido da presente invenção pode ser uma pequena porção de domínio V de uma proteína solúvel RAGE. 0 péptido da presente invenção pode ser um péptido, o qual corresponde ao domínio V da RAGE humana, de ratinho, de rato, bovina ou de peixe.

De acordo com o método da presente invenção, o agente pode ser um péptido (polipéptido), um péptido-mimético, uma molécula orgânica, um hidrato de carbono, um lípido, um anticorpo ou um ácido nucleico. No caso dos polipéptidos, o polipéptido pode ser um polipéptido produto de glicação avançada (AGE) , ou uma porção deste derivada, um polipéptido produto de glicação avançada, ou uma porção deste derivada, um receptor solúvel de um polipéptido de produto de glicação avançada, ou uma porção deste derivada, ex. RAGE solúvel, ou um polipéptido recombinante. 0 polipéptido pode ser um domínio V de sRAGE ou os aminoácidos 1 a 30 de um domínio V de sRAGE. O polipéptido 25 da presente invenção, pode compreender um polipéptido produto de glicação avançada, ou uma porção deste derivada, um receptor para um polipéptido produto de glicação avançada, ou uma porção deste derivada, um receptor solúvel para um polipéptido produto de glicação avançada, ou uma porção deste derivada. 0 polipéptido da presente invenção pode compreender qualguer parte dos primeiros 112 aminoácidos de uma proteína sRAGE. 0 polipéptido da presente invenção pode conter um domínio V de uma proteína solúvel de RAGE. 0 polipéptido da presente invenção pode ser uma pequena porção de domínio V de uma proteína solúvel RAGE. 0 polipéptido da presente invenção pode ser um polipéptido, o qual corresponde ao domínio V da RAGE humana, de ratinho, de rato, bovina ou de peixe. 0 polipéptido pode ser sintetizado quimicamente ou produzido por métodos comuns de recombinação de ADN. No caso de anticorpos, o anticorpo pode ser um anticorpo anti-RAGE ou um fragmento F(ab')2 de anti-RAGE.

Um aspecto da presente invenção relaciona-se com um agente, o qual é capaz de inibir a interacção de um péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada à superfície de uma célula neuronal, no qual o referido agente é um péptido ligado a um anticorpo, sendo o péptido um fragmento de sRAGE, compreendendo os aminoácidos 1 a 30 de um domínio V de uma sRAGE natural, e no qual a porção do anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc, para inibição da degeneração de uma célula neuronal.

Outro aspecto de presente invenção relaciona-se com um agente, o qual é capaz de inibir a interacção de um péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada à superfície de uma célula, no qual o referido agente é um péptido ligado a um anticorpo, sendo o péptido um fragmento 26 de sRAGE, compreendendo os aminoácidos 1 a 30 de um domínio V de uma sRAGE natural, e no qual a porção do anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc, para inibição da formação de um fibrilha peptídica β-amilóide numa célula.

Noutro aspecto da presente divulgação, relaciona-se com um método para inibir a formação extracelular de um péptido β-amilóide, numa fibrilha, o qual inclui o contacto de um péptido β-amilóide com um agente capaz de inibir a interacção de um péptido β-amilóide com outros péptidos β-amilóides.

Outro aspecto da presente divulgação relaciona-se com um método para inibir a agregação de um péptido β-amilóide à superfície de uma célula, o qual inclui o contacto de um péptido β-amilóide com um agente capaz de inibir a interacção de um péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada.

Outro aspecto da presente divulgação relaciona-se com um método para inibir a agregação de um péptido β-amilóide à superfície de uma célula, o qual inclui o contacto de um receptor de produto de glicação avançada com um agente capaz de inibir a interacção de um péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada.

Outro aspecto da presente divulgação relaciona-se com um método para inibir a infiltração de uma célula microglial em placas senis, o qual inclui o contacto de uma célula microglial com um agente capaz de inibir a interacção de um péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada, à superfície de uma célula microglial.

Outro aspecto da presente divulgação relaciona-se com um método para inibir a activação de uma célula microglial por 27 um péptido β-amilóide, o qual inclui o contacto de uma célula microglial com um agente capaz de inibir a interacção de um péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada, à superfície de uma célula microglial. A inibição da activação pode incluir o decréscimo da produção de citoquinas pela célula microglial. A interacção pode ser a ligação de um péptido β-amilóide ao receptor de produto de glicação avançada, à superfície da célula.

Outro aspecto da presente divulgação relaciona-se com um método para criar um sujeito com uma condição associada à interacção de um péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada numa célula, o qual compreende a administração ao sujeito de um agente capaz de inibir a interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada, estando o agente presente numa quantidade eficaz para inibir a interacção de um péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada numa célula, tratando assim o sujeito. A condição pode ser diabetes, Doença de Alzheimer, Senilidade, insuficiência renal, aterosclerose hiperlipidémica, citotoxicidade neuronal, Síndroma de Down, demência associada a traumatismo craniano, esclerose amiotrófica lateral, esclerose múltipla, amiloidose, doença auto-imune, inflamação cancro ou degeneração neuronal. 0 sujeito pode ser um mamífero ou um não mamífero. 0 sujeito pode ser um mamífero ou um humano. 0 sujeito pode ser um ratinho, uma vaca, um macaco, um cavalo, um porco ou um cão. 0 sujeito pode ser um sujeito diabético. 0 sujeito pode padecer de deficiência apolipoproteica ou de hiperlipidémia. A hiperlipidémia pode ser hipercolesterolémia ou hipergliceridémia. 0 sujeito pode 28 ter uma desordem do metabolismo glucolítico. 0 Sujeito ode ser um sujeito obeso. 0 sujeito pode ter uma hiperlipidémia geneticamente mediada ou dieteticamente induzida. AGEs forma em ambiente rico em lípidos, mesmo em euglicémia. 0 sujeito pode padecer de estresse oxidativo. 0 sujeito pode padecer de degeneração neuronal ou neurotoxicidade.

Noutro aspecto da presente divulgação, o método pode ainda compreender a administração ao sujeito, de um veiculo farmaceuticamente aceitável, durante a administração do agente. A administração pode compreender injecção intralesional, intraperitoneal, intramuscular ou intravenosa; infusão; administração mediada por lipossomas; administração tópica, nasal, oral, ocular ou ótica. 0 agente pode estar ligado a um veiculo farmaceuticamente aceitável. 0 agente pode ser administrado a cada hora, diariamente, semanalmente, mensalmente anualmente (ex. numa forma de libertação prolongada) ou numa unidose. A administração pode ser uma administração continua ou limitada a um período temporal, como por ex. numa administração intravenosa. 0 agente, ou composição farmacêutica, da presente invenção, pode ser administrado intercranialmente ou no fluido espinal. A quantidade eficaz do agente pode compreender desde cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal até cerca de 100 mg/kg de peso corporal. Num aspecto da presente invenção, a quantidade eficaz pode compreender desde cerca de 0,001 mg/kg de peso corporal até cerca de 50 mg/kg de peso corporal. Noutro aspecto da presente invenção, a quantidade eficaz pode variar desde cerca de 0,01 mg/kg de peso 29 corporal até cerca de 10 mg/kg de peso corporal. A quantidade efectiva será baseada na dimensão do agente, na biodegradabilidade do agente, na bioactividade do agente e na biodisponibilidade do agente. O agente pode ser administrado topicamente sob a forma de creme ou veiculo. Pode ser aplicado de acordo com a necessidade, baseada na absorvência do veiculo na pele, mucosa ou ferida. Caso o agente não se degrade rapidamente, seja biodisponivel e altamente activo, pode ser necessária apenas uma pequena quantidade para ser eficaz. A quantidade eficaz será conhecida pelo perito na especialidade; será igualmente dependente da forma do agente, dimensão do agente e bioactividade do agente. O perito na especialidade pode, rotineiramente, desenvolver testes de actividade, para um agente, de forma a determinar empiricamente a bioactividade, em bioensaios, e assim determinar a quantidade eficaz.

Neste aspecto, a condição pode estar associada à degeneração de uma célula neuronal num sujeito, com formação de uma fibrilha de péptido β-amilóide, com agregação de péptidos β-amilóides, com infiltração de uma célula microglial numa placa senil ou com a activação de uma célula microglial por um péptido β-amilóide, na qual a activação compreende a produção de citoquinas pela célula microglial.

Noutro aspecto, a presente invenção relaciona-se com um método para avaliação da capacidade de um agente de inibir a ligação ao péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada, à superfície de uma célula, o qual inclui: a) o contacto de célula com um agente e um péptido β-amilóide; (b) determinação da quantidade de péptido β-amilóide ligado à célula; e (c) comparação da quantidade de péptido β-amilóide determinada no passo (b) com a 30 quantidade determinada na ausência do agente, avaliando assim, a capacidade do agente para inibir a ligação do péptido β-amilóide ao domínio V, do receptor do produto de glicação avançada, à superfície de uma célula.

Neste aspecto, a célula é colocada em contacto com o agente e com o péptido β-amilóide, em simultâneo, ou pode ser colocada em contacto com o agente e com o péptido β-amilóide. 0 agente pode ser capaz de se ligar especificamente ao péptido β-amilóide. O agente pode ser capaz de se ligar ao péptido β-amilóide ao sítio de ligação onde o receptor de produto de glicação avançada interage. O agente pode ser uma porção extracelular do receptor de produto de glicação avançada. O agente pode estar ligado a um suporte sólido. 0 agente pode ser expresso à superfície de uma célula.

Outro aspecto da presente invenção divulga um método para inibição da activação de um gene NF-κΒ numa célula, o qual compreende o contacto da célula com um agente, o qual é capaz de inibir a interacção do péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada, inibindo assim a activação de NF-κΒ na célula. A presente invenção divulga também uma composição farmacêutica, a qual compreende um agente capaz de inibir a interacção do péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada, sendo o referido agente um péptido ligado a um anticorpo, ou a uma porção de anticorpo, no qual o péptido é um fragmento de sRAGE compreendendo os aminoácidos 1 a 30 de um domínio V de uma sRAGE natural, e no qual a porção do anticorpo é um fragmento Fab ou um fragmento Fc, e um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo pode ser um diluente, um aerossol, um veículo 31 tópico, uma solução aquosa, uma solução não aquosa ou um veiculo sólido.

De acordo com o âmbito da presente invenção, "estresse oxidativo" compreende perturbação da capacidade de uma célula de recuperar dos efeitos tóxicos de oxidantes. Oxidantes podem incluir peróxido de hidrogénio ou radicais de oxigénio, capazes de reagir com bases nas células, incluindo ADN. Uma célula em "estresse oxidativo" pode sofrer modificações bioquímicas, metabólicas, fisiológicas e/ou químicas, de forma a contrariar a introdução dos referidos oxidantes. Tais modificações podem incluir peroxidação lipídica, activação de NF-κΒ, indução de oxigenase heme do tipo I e mutagénese de ADN. De forma análoga, antioxidantes, tais como a glutationa, são capazes de baixar os efeitos dos oxidantes. A presente invenção divulga agentes e composições farmacêuticas capazes de inibir os efeitos do estresse oxidativo numa célula. A invenção divulga ainda métodos para melhorar os sintomas de estresse oxidativo num sujeito, os quais compreendem a administração, ao sujeito, de uma quantidade eficaz do agente ou da composição farmacêutica, para inibir o estresse oxidativo, e assim melhorar os sintomas do estresse oxidativo no sujeito.

De acordo com a presente invenção, o termo "neurotoxicidade" compreende efeitos negativos ao nível do metabolismo, bioquímica e fisiologia de uma célula neuronal, a qual pode resultar em debilitação das funções celulares neuronais. Tais funções podem incluir a memória, aprendizagem, percepção, electrofisiologia neuronal (ex. potenciais de acção, polarizações e sinapses), formação de sinapses, tanto funções de canal químico e eléctrico, libertação de neurotransmissores e funções de detecção e 32 neuromotoras. Neurotoxicidade pode incluir citoxicidade neuronal.

De acordo com o usado no presente documento, o termo "degeneração neuronal" compreende o declínio do normal funcionamento de uma célula neuronal. Esse declínio inclui declínio de memória, de aprendizagem, percepção, electrofisiologia neuronal (ex. potenciais de acção, polarizações e sinapses), formação de sinapses, tantas funções de canal químico e eléctrico, libertação de neurotransmissores e funções de detecção e neuromotoras.

Na prática de cada um dos aspectos da presente invenção, ou preparação de uma composição farmacêutica, uma "quantidade eficaz" é uma quantidade capaz de inibir a ligação de um péptido β-amilóide com um receptor de produto de glicação avançada. Nesse sentido, a quantidade eficaz varia de acordo com o sujeito a ser tratado, bem como com a condição a ser tratada.

De acordo com a presente invenção, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" compreende qualquer veículo farmaceuticamente aceite como padrão, tais como solução salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com acetato (um veículo provável para administração parentérica), água, emulsões, tais como uma emulsão óleo/água, ou uma emulsão de triglicéridos, vários tipos de agentes humidificantes, drageias revestidas e cápsulas. Um exemplo de uma emulsão de triglicéridos aceitável, aplicável em administração intravenosa e intraperitoneal dos compostos, é a emulsão comercialmente conhecida como Intralipid®.

Quando administrada oralmente ou topicamente, tais agentes e composições farmacêuticas serão administradas usando 33 diferentes veículos. Tipicamente, estes veículos contêm excipientes tais como amido, leite, açúcar, determinados tipos de argila, gelatina, ácido esteárico, talco, gorduras ou óleos vegetais, gomas, glicóis ou outros excipientes conhecidos. Tais veículos podem ainda incluir aromatizantes e colorantes ou outros ingredientes. 0 veículo específico pode necessitar de ser seleccionado com base no método de administração desejado, ex. PBS pode ser usado para administração intravenosa ou sistémica e gorduras vegetais, cremes, bálsamos, unguentos ou géis podem ser usados para administração tópica. A invenção divulga ainda composições farmacêuticas, incluindo guantidades eficazes de composições proteicas e/ou agentes capazes de inibir a ligação de um péptido β-amilóide a um receptor de produto de glicação avançada, num sujeito, conjuntamente com diluentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adjuvantes e/ou veículos adequados, úteis no tratamento de degradação neuronal devido ao envelhecimento, incapacidade de aprendizagem ou disfunção neurológica. Tais composições são líquidas ou liofilizadas, ou ainda formulações secas, e incluem diluentes contendo variados conteúdos tamponados (ex. Tris-HCL, acetato, fosfato) , pH e força iónica, aditivos, tais como albumina ou gelatina, para prevenção da absorção às superfícies, detergentes (Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de ácidos biliares), agentes solubilizantes (ex. glicerol, polietileno-glicerol), antioxidantes (ex. ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (ex. Thimerosal, álcool benzílico, parabenos), substâncias brutas ou modificadores da tonicidade (ex. lactose, manitol), ligação covalente do agente a polímeros, tais como polietileno-glicol, complexação com iões metálicos ou incorporação do agente em ou a preparações de partículas, tais como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, 34 hidrogéis, etc. ou a lipossomas, micro-emulsões, vesículas multi- ou unilamelares, eritrócitos fantasma ou esferoplastos. Tais composições influenciam o estado físico, a solubilidade, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa de dissipação do agente ou composição. A selecção das composições depende das propriedades físicas e químicas do agente capaz de aliviar os sintomas de desordem cognitiva da memória ou da incapacidade de aprendizagem do sujeito. 0 agente da presente invenção poderá ser administrado localmente, através de uma cápsula, que permite a libertação prolongada do agente ou do péptido ao longo de um determinado período de tempo. Composições de libertação controlada ou prolongada incluem formulações em depósitos lipídicos (ex. ácidos gordos, ceras, óleos). Igualmente compreendido no âmbito da presente invenção, encontram-se composições particuladas revestidas com polímeros (ex. poloameros ou poloxaminas) e o agente acoplado a anticorpos dirigidos contra receptores de tecidos específicos, ligandos ou antigénios ou acoplado a ligandos de receptores de tecidos específicos. Outros aspectos das composições da invenção incorporam revestimentos protectores de formas particuladas, inibidores de protease ou amplificadores de permeação para várias vias de administração, incluindo parentérica, pulmonar, nasal e oral.

Porções doa gente da invenção podem ser "marcados" através de associação a uma substância marcadora detectável (ex. radiomarcado com I ou biotinilado) de forma a proporcionar reagentes úteis na detecção e quantificação do composto, ou seu receptor, contendo células, ou seus derivados, em tecido sólido e amostras de fluidos, como por exemplo, de sangue, fluido cerebrospinal ou urina. 35

Quando administrados, os agentes (tais como um péptido compreendendo o domínio V de uma sRAGE), são frequentemente dissipados com rapidez, da circulação, e podendo portanto, elicitar relativamente actividade farmacológica de curta duração. Consequentemente, pode ser necessária a administração de injecções frequentes, de doses relativamente elevadas, de agentes bioactivos de forma a sustentar a eficácia terapêutica. Agentes modificados através de ligações covalentes a polímeros, tais como polietileno-glicol, copolímeros de polietileno-glicol e polipropileno-glicol, carboximetilcelulose, dextrano, polivinil álcool, polivinil-pirrolidona ou poliprolina, são reconhecidos por apresentarem tempos de semi-vida substancialmente mais longos, no sangue, em seguimento de injecção intravenosa, do que os correspondentes agentes não modificados (Abuchowski et al., 1981; Newmanark et al., 1987). Tais modificações podem igualmente incrementar a solubilidade do agente em solução aquosa eliminando a agregação, reforçando a estabilidade física e química do agente, e reduzindo substancialmente a imunogenicidade e reactividade do agente. Como resultado, a actividade in vivo desejada pode ser alcançada pela administração de tais aductos polímero-agente, menos frequentemente ou em doses menores do que com o agente não modificado. A ligação de polietileno-glicol (PEG) a agentes, é particularmente útil devido ao facto do PEG apresentar baixa toxicidade em mamíferos (Carpenter et al., 1971) . Por exemplo, um aducto PEG de adenosina deaminase foi aprovado nos EUA, para uso em humanos, no tratamento de síndroma de imunodeficiência grave e combinado. Uma segunda vantagem conseguida pela conjugação de PEG, é a redução efectiva da imunogenicidade ou antigenicidade de compostos heterólogos. Por exemplo, um aducto de PEG com uma proteína humana pode 36 ser útil no tratamento de uma doença noutra espécie de mamífero, sem o risco de despoletar uma resposta imune grave. 0 composto da presente invenção, capaz de aliviar os sintomas de desordem cognitiva da memória ou de aprendizagem, pode ser administrado num dispositivo de microencapsulação, de forma a reduzir ou prevenir uma resposta imune no hospedeiro contra o agente ou contra células que possam produzir o composto. 0 agente da presente invenção pode ser igualmente administrado de forma microencapsulada numa membrana, tal como um lipossoma.

Polímeros tais como o PEG podem ser convenientemente ligados a um ou mais resíduos aminoacídicos numa proteína, tal como o grupo alfa-amino do grupo terminal aminoácido, aos grupos épsilon amino das cadeias laterais de lisina, aos grupos sulfidril das cadeias laterais da cisteína, aos grupos carboxil das cadeias laterais do aspartil e do glutamil, ao grupo alfa-carboxil do grupo carboxi terminal das cadeias laterais da tirosina ou aos derivados activados das cadeias glicosil ligadas a determinados resíduos de asparagina, serina ou treonina.

Encontram-se descritas numerosas formas de PEG activadas, adequadas para reagir directamente com proteínas. Reagentes de PEG úteis para reagir com grupos amina das proteínas, incluem ésteres activos de ácidos carboxílicos ou derivados carbonados, particularmente aqueles cujos grupos removidos são N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenol, imidazole ou l-hidroxi-2-nitrobenzeno-4-sulfonato. Derivados de PEG contendo grupos maleimido ou haloacetil são úteis como reagentes para modificação dos grupos livres sulfidril das proteínas. De forma análoga, os reagentes PEG contendo grupos amino hidrazina ou hidrazida são úteis para reacções com aldeídos gerados por oxidação de periodato dos grupos hidrocarbonados das proteínas. 37

Cura de feridas

Os péptidos e agentes da presente invenção podem ser usados para curar feridas em sujeitos. A cura de feridas pode estar associado a várias doenças ou condições. As doenças ou condições podem prejudicar a cura normal das feridas ou contribuir para a existência de feridas, que requeiram tratamento. Os sujeitos podem ser tratados com os péptidos ou agentes ou composições farmacêuticas da presente invenção, de forma a tratar a cura lenta, doença periodontal recalcitrante, impedimento de cura de feridas devido a diabetes e impedimentos de cura de feridas devido a doenças auto-imunes. A presente invenção divulga compostos e composições farmacêuticas úteis para o tratamento de cura de feridas prejudicado pelo envelhecimento. 0 efeito da administração tópica do agente pode ser potenciado através de administração parentérica do ingrediente activo numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável.

Doença neurológica

Os indicadores patológicos da doença de Alzheimer (AD) são a deposição de proteínas filamentosas intracelular e extracelular, o que se relaciona estreitamente com a eventual disfunção neuronal e demência clínica (para revisões consultar Goedert, 1993; Haass et al., 1994;

Kosik, 1994; Trojanowski et al., 1994; Wischik, 1989). 0 péptido β-amilóide (Αβ) é o principal componente dos depósitos extracelulares em AD, tanto em placas senis como em difusas e na vascularidade cerebral. Αβ tem demonstrado promover o crescimento da neurite excrescente, gerando intermediários oxigenados reactivos (ROIs), indução de estresse oxidativo celular, conduzindo à citotoxicidade neuronal e promovendo a activação microglial (Behl et al., 1994; Davis et al., 1992; Hensley, et al., 1994; Koh, et 38 al., 1990; Koo et al., 1993; Loo et al., 1993; Meda et al., 1995; Pike et al., 1993; Yankner et al., 1990). Para que Αβ induza estes efeitos celulares múltiplos, é necessário que as membranas plasmáticas apresentem proteína(s) de ligação que engaje ο Αβ. Neste sentido, várias proteínas associadas à célula, bem como proteoglicanos sulfatados, podem interagir com Αβ. Estes incluem: receptor da substância P, receptor do complexo serpina-enzima (SEC), apoliproteína E, apoliproteína J (clusterina), transtirrina, alfa-l-anti-quimotripsina, precursor proteico β-amilóide e sulfatos heparan/sulfonatos (Abraham et ai., 1988; Fraser et al., 1992; Fraser et al., 1993; Ghiso et al., 1993; Joslin et al., 1991; Kimura et al., 1993; Kisilevsky et ai., 1995; Strittmatter et al., 1993a; Strittmatter et al., 1993b; Schwarzman et al., 1994; Snow et al., 1994; Yankner et al., 1990). Destes, o receptor da substância P e o receptor SEC podem funcionar como receptores de superfície da célula neuronal para Αβ, embora falte evidência directa para teoria (Fraser et al., 1993; Joslin et al., 1991; Kimura et al., 1993; Yankner et al., 1990) . Na verdade, o papel dos receptores de substância P é controverso e não é sabido se Αβ interage individualmente com os receptores ou se é requerida a presença de coestimulantes (Calligaro et al., 1993; Kimura et al., 1993; Mitsuhashi et al., 1991). Para além disso, o receptor SEC tem ainda de ser completamente caracterizado.

Aspectos clínicos

Em determinados aspectos da presente invenção, o sujeito pode padecer dos aspectos clínicos mencionados anteriormente e ainda descritos em: Harper's Biochemistry, R. K. Murray, et al. (Eds.) 21a Ed., (1988) Appelton & Lange, East Norwalk, CT. Estes aspectos clínicos podem predispor o sujeito para contrair ou acelerar a 39 aterosclerose. Assim, estes sujeitos beneficiarão da administração do polipéptido derivado de sRAGE numa quantidade eficaz durante um tempo eficaz. 0 sujeito da presente invenção pode demonstrar sinais clínicos de aterosclerose, hipercolesterolémia ou outras desordens de acordo com o descrito no presente documento. A hipercolesterolémia pode ser tratada pela interrupção da circulação enterohepática dos ácidos biliares. Encontra-se relatado que reduções significativas do colesterol plasmático podem ser efectuadas através deste procedimento, o qual pode ser conseguido pelo uso de resina colestiramina ou cirurgicamente, por operações de exclusão ileal. Ambos os procedimentos causam um bloqueio da reabsorção dos ácidos biliares. Assim, devido à libertação da regulação de retorno, normalmente excretada pelos ácidos biliares, a conversão do colesterol em ácidos biliares é substancialmente incrementada, num esforço para manutenção da quantidade de ácidos biliares. Os receptores da LDL (proteína de baixa densidade), no fígado, são regulados a montante, causando um importe de LDL, com a consequente redução do colesterol plasmático.

Aterosclerose colesterolémica e Doença Cardíaca Coronária

Os péptidos, agentes e composições farmacêuticas da presente invenção, podem ser usados como agentes terapêuticos para inibir sintomas de doenças, num sujeito, associadas ao metabolismo do colesterol, da aterosclerose ou da doença cardíaca coronária. Alguns dos sintomas das referidas doenças, os quais podem ser inibidos, melhorados ou prevenidos através da administração do agente e das composições farmacêuticas da presente invenção, são discutidas abaixo, no presente documento. Por exemplo, os agentes e as composições farmacêuticas da presente 40 invenção, podem ser administradas a um sujeito padecendo de sintomas de doença cardíaca coronária, de forma a proteger a integridade das células endoteliais do sujeito, e assim inibir os sintomas da doença cardíaca coronária. Vários investigadores demonstraram a correlação entre a subida dos níveis de lípidos no soro e a incidência de doença cardíaca coronária e aterosclerose em humanos. Relativamente aos lípidos no soro, o colesterol tem sido o mais apontado como sendo o principal responsável por esta relação. Contudo, outros parâmetros, tais como a concentração de triglicerol no soro, apresentam correlações similares. Doentes com doença arterial podem ter qualquer uma das seguintes anomalias: (1) elevadas concentrações de VLDL (lipoproteína de muito baixa densidade) com concentrações normais de LDL; (2) LDL elevado com VLDL normal; (3) ambas as fracções lipoproteicas aumentadas. Existe igualmente uma relação inversa entre o HDL (lipoproteína de elevada densidade) (HDL3) e a doença cardíaca coronária. Alguns consideram que a relação mais prevista é a razão de colesterol LDL:HDL. Esta relação é explicável em termos dos papéis propostos do LDL no transporte do colesterol aos tecidos, e da acção do HDL como decompositor do colesterol. A aterosclerose é caracterizada pela deposição de colesterol e éster colesteril de lipoproteínas contendo apo-B-100 no tecido conectivo das paredes arteriais. Doenças nas quais níveis elevados e prolongados de VLDL, IDL ou LDL ocorrem no sangue (ex. diabetes, mellitus nefrose lípidica, hipotiróidismo e outras condições associadas à hiperlipidémia) são frequentemente acompanhadas de aterosclerose prematura ou mais severa. 41

Testes sobre a indução de aterosclerose em animais indicam uma larga variabilidade da susceptibilidade nas espécies. 0 coelho, porco, chimpanzé e humanos são espécies nas quais a aterosclerose pode ser induzida por alimentação com colesterol. 0 rato, cão, ratinho e gato são mais resistentes. Tiróidectomia ou tratamento com fármacos contendo tiouracil, permitem a indução de aterosclerose em cães e ratos. Baixos niveis de colesterol é caracteristica de hipertiroidismo.

Factores hereditários desempenham um papel importante na determinação das concentrações individuais de colesterol no sangue, mas dos factores dietéticos e ambientais que reduzem o colesterol no sangue, a substituição de ácidos gordos polinsaturados por alguns ácidos gordos saturados, na dieta, têm sido os mais intensamente estudados. Óleos naturais, que contêm uma elevada proporção de ácido linoleico, beneficiam a redução do colesterol no sangue, e incluem óleo de amendoim, sementes de algodão, milho e soja, enquanto que a manteiga, gordura de bovino e óleo de coco, contendo uma elevada proporção de ácidos gordos saturados, aumentam o nível. Sucrose e frutose têm um maior efeito no aumento do nível de lípidos no sangue, particularmente de triacilgliceróis, do que outros hidratos de carbono. A razão do efeito de redução do colesterol, por ácidos gordos polinsaturados permanente pouco clara. Contudo, várias hipóteses têm sido avançadas para explicar este efeito, incluindo a da estimulação da excreção do colesterol para o intestino, e a da estimulação da oxidação do colesterol nos ácidos biliares. É possível que os ésteres colesteril dos ácidos gordos polinsaturados sejam mais rapidamente metabolizados pelo fígado e outros 42 tecidos, o que pode potenciar a sua taxa de recuperação e excreção. Existe outra evidência que aponta para o efeito ser larqamente devido a uma mudança na distribuição do colesterol, do plasma para os tecidos, devido à taxa catabólica aumentada do LDL. Os ácidos qordos saturados causam a formação de partículas mais pequenas de VLDL, que contêm relativamente mais colesterol, e são utilizadas pelos tecidos extra-hepáticos a uma taxa mais lenta do que as partículas maiores. Todas estas tendências podem ser encaradas como aterogénicas.

Factores adicionais, considerados como desempenhando um papel na doença cardíaca coronária, incluem a elevada pressão arterial, o tabagismo, obesidade, sedentarismo e consumo de água "mole", em oposição à água "dura". A elevação de ácidos gordos livres, no plasma, conduzem igualmente ao aumento da secreção de VLDL pelo fígado, envolvendo o aporte extra de triacilglicerol e colesterol para a circulação. Factores que conduzem a níveis mais elevados ou flutuantes de ácidos gordos livres incluem o estresse emocional, a nicotina do fumo de cigarros, consumo de café e ingestão de poucas mas abundantes refeições ao invés da ingestão contínua de alimentos. As mulheres em pré-menopausa parecem estar protegidas contra a maioria destes factores deletérios, possivelmente porque apresentam concentrações mais elevadas de HDL do que os homens e as mulheres em pós-menopausa.

Quando as medidas dietéticas não são bem sucedidas na redução dos níveis de lípidos no soro, o uso de fármacos hipolipidémicos deve ser reconsiderado. Tais fármacos podem ser usados em conjunto com os agentes e composições farmacêuticas da presente invenção, i.e. fármacos para administração a um sujeito, conjuntamente com os agentes da presente invenção. São conhecidos vários fármacos que 43 bloqueiam a formação de colesterol nos vários estádios da sua via biossintética. Muitos destes fármacos têm efeitos nocivos, mas os inibidores fúngicos da HMG-CoA reductase, compactina e mevionolina, reduzem os níveis de colesterol LDL, com poucos efeitos secundários. 0 sitoesterol é um agente hipocolesterolémico que actua através do bloqueio da absorção do colesterol no tracto gastrointestinal. As resinas, como a cloestipol e colestiramina (Questran) previnem a reabsorção dos sais biliares. 0 clofibrato e o gembivrozil, devem, pelo menos em parte, o seu efeito hipolipidémico à recondução do fluxo hepático dos ácidos gordos livres, das vias de esterificação para as de oxidação, decrescendo assim a secreção de triacilglicerol e colesterol, contendo VLDL, pelo fígado. Adicionalmente, facilitam a hidrólise dos trigliceróis VLDL pela lipoproteína lipase. 0 probucol parece incrementar o catabolismo do LDL através da via do receptor independente. 0 ácido nicotínico reduz o fluxo de FFA pela inibição da lipólise tecidular adiposa, portanto inibindo a produção de VLDL pelo fígado.

Desordens das lipoproteínas do plasma (dislipoproteinémias)

Poucos indivíduos, numa população, exibem condições hereditárias nas suas lipoproteínas, conduzindo à condição primária de hipo ou hiperlipidémia. Muitos outros que apresentam condições, tais como diabetes mellitus, hipotiroidismo e aterosclerose, também apresentam padrões lipoproteicos anormais, os quais são bastante similares, tanto a uma ou a outra, condições hereditárias.

Virtualmente, todas estas condições primárias são devidas a defeitos, num dos estágios de formação das lipoproteínas, transporte ou destruição. Nem todas as anormalidades são patológicas. 44

Hipolipoproteinémia 1. A-beta-lipoproteinémia: Esta é uma rara doença herdada, caracterizada pela ausência de β-lipoproteína (LDL) no plasma. Os lípidos do sangue encontram-se presentes em baixas concentrações, especialmente os acilgliceróis, os quais estão virtualmente ausentes, uma vez que não há formação de quilomicrons ou VLDL. Tanto o intestino como o figado acumulam acilgliceróis. A a-beta-lipoproteinémia é devida a um defeito na síntese da apoproteína B. 2. Hipo-beta-lipoproteinémia familiar - na hipo-beta-liporoteinémia a concentração de LDL encontra-se entre 10 e 50% do normal, mas ocorre a formação de quilomicrons. Deve-se concluir que a apo-B é essencial para o transporte de triacilglicerol. A maior parte dos indivíduos são saudáveis e têm grande longevidade. 3. Deficiência familiar de alfa-lipoproteína (doença de Tangier) - Nos indivíduos homozigóticos existe uma quase total ausência de HDL plasmático e acumulação de colesteril ésteres nos tecidos. Não existe impedimento na formação de quilomicrons ou na secreção de VLDL hepática. Contudo, na electroforese, não existe pré-β-lipoproteína, mas apenas uma larga banda β, contendo um triacilglicerol, pode ser visualizada.

Isto é devido ao facto da pré-banda β conter outras apoproteínas normalmente fornecidas pela HDL. Os doentes tendem a desenvolver hipertriglicerolémia, em resultado da ausência de apc-II, a qual normalmente activa a lipase lipoproteica. 45

Hiperlipoproteinémia 1. Deficiência familiar da lipoproteína lipase (tipo I) esta condição é caracterizada pela muito lenta dissipação dos quilomícrons da circulação, conduzindo a um aumento anormal dos níveis de quilomícron. A VLDL pode estar aumentada, mas existe um decréscimo de LDL e HDL. Assim, a condição é induzida pela gordura. Pode ser corrigida pela redução da gordura e aumento da proporção de hidratos de carbono na dieta. A variação desta doença é causada pela deficiência em apo-C-II, que é requerida como co-factor para a lipase lipoproteína. 2. Hipercolesterolémia familiar (tipo II) - os doentes caracterizam-se por apresentarem hiper-beta- lipoproteinémia (LDL), a qual está associada ao aumento de colesterol total no plasma. Também pode ocorrer uma tendência para o VLDL estar elevado, no tipo Ilb. Assim, o doente pode, de alguma forma, ter os níveis de triacilglicerol elevados, mas o plasma permanecer limpo, ao contrário do que acontece nos outros tipos de hiperlipoproteinémia. É comum a deposição de lípidos nos tecidos (ex. xantomas, ateromas). 0 padrão do tipo II pode igualmente ocorrer como resultado secundário de hipotiroidismo. A doença parece estar associada com baixas taxas de dissipação de LDL da circulação, devido a receptores de LDL defeituosos e está associada a um aumento da incidência de aterosclerose. A redução do colesterol na dieta, bem como de gorduras saturadas, pode ser útil no seu tratamento. Uma doença igualmente causadora de hipercolesterolémia, mas devido a diferente origem, é a Doença de Wolman (doença de armazenamento de colesteril-éster). Esta é originada por uma deficiência da colesteril-éster-hidrolase nos lipossomas das células, tais como nos fibroblastos, que normalmente metabolizam o LDL. 46 3. Hiperlipoproteinémia familiar (tipo III) - (Doença Beta

Larga, dis-beta-lipoproteinémia familial) - esta condição é caracterizada por um aumento nos quilomícrons e VLDL remanescentes. Estes últimos são lipoproteinas com densidade inferior a 1,019, mas na electroforese aparecem como uma banda p larga (β-VLDL). Causam hipercolesterolémia e hipertrialcil-glicerolémia. Os xantomas e aterosclerose encontram-se presentes, tanto nas artérias periféricas como coronárias. É recomendado o tratamento através da redução do peso e de dietas contendo hidratos de carbono complexos, gorduras insaturadas e baixo colesterol. Esta doença é devido a uma deficiência no metabolismo remanescente do figado, causada por uma anomalia na apo-E, a qual se encontra usualmente presente sob 3 isoformas: E2, E3 e E4. Doentes com hiperlipoproteinémia tipo III apenas possuem E2, que não reage com o receptor E. 4. Hipertriacilglicerolémia familiar (tipo IV) - Esta condição é caracterizada pelos elevados niveis de triacil-glicerol (VLDL) produzido via endógena. Os niveis de colesterol aumentam proporcionalmente aos da hipertriacilglicerémia e a intolerância à glucose é frequente. Tanto o LDL como o HDL encontram-se presentes em quantidades abaixo das normais. Este padrão lipoproteico é também frequentemente associado à doença cardíaca coronária, diabetes mellitus tipo II não dependente da insulina, obesidade e muitas outras condições incluindo alcoolismo e toma de hormonas progestrogénicas. O tratamento primário das hiperlipoproteinémia tipo IV realiza-se através da redução de peso, substituição de hidratos de carbono solúveis por hidratos de carbono complexos na dieta, gorduras insaturadas, dietas pobres em colesterol e também agentes hipolipidémicos. 47 5. Hiperlipoproteinémia familiar tipo V - o padrão lipoproteico é complexo, uma vez que tanto os quilomicrons e o VLDL se encontram elevados, causando triacilglicerolémia e colesterolémia. As concentrações de LDL e HDL são baixas. Os xantomas encontram-se frequentemente presentes, mas a incidência de

aterosclerose aparentemente não é substancial. A tolerância à glucose é anómala e frequentemente associada à obesidade e diabetes. A razão desta condição, que é hereditária, não se encontra clarificada. 0 tratamento tem consistido em redução do peso seguido por uma dieta não muito rica em hidratos de carbono ou gorduras. Tem sido sugerido que um outro caso de hipolipoproteinémia está relacionado com a super produção de apo-β, a qual pode influenciar as concentrações plasmáticas de VLDL e HDL. 6. Hiper-alfa-lipoproteinémia familiar - esta é uma condição rara associada ao aumento das concentrações de HDL, aparentemente benéfico para a saúde.

Deficiência familial de lecitina:colesterol aciltransferase (LCAT): nos sujeitos afectados, as concentrações plasmáticas de colesteril-ésteres e lisolecitina são baixas, enquanto que a concentração em colesterol e lecitina se encontram aumentadas. 0 plasma tende a ficar turvo. São igualmente encontradas anomalias nas lipoproteinas. Uma fracção de HDL contém estruturas em forma de disco, empilhadas ou enroladas, as quais são claramente HDL nascente, incapaz de tomar o devido colesterol, devido à ausência de LCAT. A lipoproteína X encontra-se igualmente presente sob a forma de uma sub-fracção de LDL anómala, normalmente encontrada apenas em doentes com colestase. 0 VLDL é também anómalo, migrando como β-lipoproteínas na electroforese (β-VLDL). Doentes com 48 doença do fígado parenquimatoso apresentam igualmente um decréscimo na actividade da LCAT e anomalias nos lípidos e lipoproteínas do soro.

Veículos farmacêuticos

Num dos aspectos preferidos da invenção o veículo farmacêutico pode ser um liquido e a composição farmacêutica será apresentada na forma de solução. Noutro aspecto igualmente preferido da invenção, o veículo farmaceuticamente aceitável é um sólido e a composição está na forma de pó ou comprimido. Num outro aspecto da invenção, o veiculo farmacêutico é um gel e a composição está na forma de supositório ou creme. Num outro aspecto da invenção, o ingrediente activo pode ser formulado como parte de uma compressa transdérmica farmaceuticamente aceitável.

Um veiculo sólido pode incluir uma ou mais substâncias, que podem actuar também como agentes aromatizantes, lubrificantes, solubilizantes, agentes de suspensão, de enchimento, deslizantes, auxiliares de compressão, ligantes ou agentes de desintegração de drageias, podendo também incluir um material para encapsulação. Quando em pó, o veículo é um sólido finamente dividido, o qual se encontra misturado com o ingrediente activo finamente dividido. Quando em drageias, o ingrediente activo está misturado com o veiculo, tendo as propriedades de compressão necessárias, em proporções adequadas, e compactado numa forma e dimensão desejadas. Os pós e drageias contêm, preferencialmente, até 99% do ingrediente activo. Veículos sólidos adequados incluem, por exemplo, fosfato de cálcio, estearato de magnésio, talco, açúcares, lactose, dextrina, amido, gelatina, celulose, polivinil-pirrolidona, ceras com baixo ponto de fusão e resinas de troca iónica. 49

Os veículos líquidos são usados na preparação de soluções, suspensões, emulsões, xaropes, elixires e composições pressurizadas. 0 ingrediente activo pode ser dissolvido ou suspendido num veículo farmaceuticamente aceitável, tal como a água, um solvente orgânico, uma mistura de ambos ou óleos ou gorduras farmaceuticamente aceitáveis. 0 veículo líquido pode conter outros aditivos farmaceuticamente adequados, tais como solubilizantes, emulsionantes, tampões, conservantes, adoçantes, agentes aromatizantes, agentes de suspensão, agentes espessantes, cores, reguladores da viscosidade, estabilizantes ou reguladores de osmose. Exemplos adequados de veículos líquidos, para administração oral e parentérica, incluem água (parcialmente contendo aditivos de acordo com o referido anteriormente, ex. derivados de celulose, preferencialmente uma solução sódica de carboximetil-celulose), álcoois (incluindo álcoois mono e poli-hídricos, ex. glicóis) e seus derivados, e óleos (ex. óleo de coco fraccionado e óleo araquis). Para administração parentérica, o veículo pode também ser uma gordura esterif içada, tal como etiloleato e isopropil miristato. Veículos líquidos estéreis são úteis em composições estéreis, sob a forma líquida, para administração parentérica. 0 veiculo liquido, para composições pressurizadas, pode ser um hidrocarboneto halogenado ou outro farmaceuticamente aceitável.

Composições farmacêuticas liquidas, as quais são soluções estéreis ou suspensões, podem ser utilizadas, como por exemplo, na administração de injecções por via intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal ou subcutânea. As soluções estéreis podem também ser administradas por via intravenosa. 0 ingrediente activo pode ser preparado como composição sólida estéril, a qual pode ser dissolvida ou suspendida na altura da administração, utilizando-se água esterilizada, soluções 50 salinas ou outros meios injectáveis adequados e esterilizados. Os veiculos incluem necessariamente ligantes inertes, agentes de suspensão, lubrificantes, aromatizantes, adoçantes, conservantes, colorantes e revestimentos. O ingrediente activo da presente invenção (ex. polipéptido do dominio V derivado de sRAGE ou composições derivadas) pode ser administrado oralmente, na forma de uma solução ou suspensão estéril contendo outros solutos ou agentes de suspensão, como por exemplo, uma quantidade salina ou de glucose suficiente para tornar a solução isotónica, sais biliares, acácia, gelatina, monoleato de sorbitan, polisorbato 80 (esteres oleatos de sorbitol e seus anidridos copolimerizados com óxido de etileno) e similares. O ingrediente activo pode também ser administrado oralmente, sob a forma de composição liquida ou sólida. Composições adequadas para a administração oral incluem formas sólidas, tais como comprimidos, cápsulas, grânulos, drageias e pós, bem como formas liquidas tais como, soluções, xaropes, elixires e suspensões. Formas úteis para administração parentérica incluem soluções, emulsões e suspensões estéreis.

Aterosclerose

Num dos aspectos da presente invenção o sujeito pode ter predisposição para aterosclerose. Esta predisposição pode incluir predisposição genética, predisposição ambiental, predisposição metabólica ou predisposição física. Existem estudos recentes sobre a aterosclerose e doença cardiovascular. Por exemplo, Keating and Sanguinetti, (May 1996) Molecular Genetic Insights into Cardiovascular Disease, Science 272: 681-685, é incorporado por 51 referência, na sua totalidade, no presente pedido de patente. Os autores estudam a aplicação de ferramentas moleculares a formas de doença cardiovascular herdadas, tais como as arritmias, cardiomiopatias e doença vascular. A Tabela 1 desta referência inclui doenças cardíacas e a proteína aberrante associada a cada doença. As doenças listadas são: doença LQT, cardiomiopatia familiar hipertrófica, distrofia muscular de Duchenne e Becker, Síndroma de Barth, deficiências de acil-CoA desidrogenase, desordens mitocondriais, hipercolesterolémia familiar, hipo-beta-lipoproteinémia, homocitinúria, hiperlipoproteinémia Tipo III, estenose aórtica supra-valvular, Síndroma Ehler-Danlos IV, Síndroma de Marfa e telangiectásia hemorrágica hereditária. Estas condições estão incluídas como predisposições possíveis, num sujeito, para a aterosclerose.

Além disso, modelos com ratinhos, relacionados com a aterosclerose, foram estudados em Breslow (1996) "Mouse Models of Atherosclerosis, Science 272: 685". Esta referência é igualmente incorporada por referência, na sua totalidade, no presente pedido de patente. Breslow inclui igualmente uma tabela (Tabela 1), a qual lista vários modelos com ratinhos, relacionados com estímulos aterogénicos. Por exemplo, os modelos incluem C57BL/6; deficiência de ApoE; lesão de ApoE; ApoE R142C; deficiência do receptor de LDL; e HuBTg. Um dos aspectos da presente invenção refere-se a um sujeito com predisposição para aterosclerose, de acordo com o demonstrado nos modelos de ratinhos apresentados na publicação de Breslow.

Gibbons e Dzau analisaram a doença vascular em "Molecular Therapies for Vascular Disease, Science Vol. 272, pag. 52 689-693". Num dos aspectos da presente invenção o sujeito pode manifestar eventos patológicos, tais como os descritos na Tabela 1 da publicação de Gibbons e Dzau. Por exemplo, o sujeito pode ter uma disfunção endotelial, uma lesão endotelial, activação celular e modulação fenotípica, crescimento celular desregulado, apoptose desregulada, trombose, ruptura das plaquetas, migração celular anómala ou modificação da matriz extracelular ou intracelular.

Noutro aspecto da presente invenção o sujeito pode ter diabetes. 0 sujeito pode ainda demonstrar complicações associadas à diabetes. Alguns exemplos de tais complicações incluem a activação dos receptores endoteliais e dos macrófagos AEG, lipoproteínas alteradas das proteínas membranares da matriz e basais, alteração da contractilidade e da resposta hormonal do músculo liso vascular, permeabilidade celular endotelial alterada, acumulação de sorbitol, depleção do mio-inositol neural ou actividade Na-K ATPase alterada. Tais complicações são discutidas numa publicação recente de Porte e Schwartz, "Diabetes Complications: Why is Glucose potentially Toxic?, Science, Vol. 272, pag. 699-700". A presente invenção é ilustrada na seguinte secção Detalhes Experimentais. Estas secções têm como propósito facilitar a compreensão da invenção, mas não pretendem, e não devem ser encaradas, como limitativas em de alguma forma, o âmbito das correspondentes Reivindicações. 53

Detalhes experimentais

Exemplo 1: Os primeiros 30 aminoácidos do domínio de solúvel extracelular do tipo V (sRAGE) medeia as suas interacções com os Produtos de Glicação Avançada (AGEs) e o Péptido β-amilóide. O domínio extracelular de RAGE (Receptor para Produtos de Glicação Avançada) contém um domínio do tipo "V" seguido de 2 domínios de imunoglobulinas do tipo "C". Esta porção da molécula, denominada solúvel ou RAGE, medeia a interacção dos Produtos de Glicação Avançada (AGEs) e o péptido β-amilóide com o receptor de superfície celular. A sRAGe liga-se a AGEs ou ao péptido β-amilóide e interfere com a capacidade destes ligandos de interagir, e activar, a RAGE celular numa vasta gama de tipos de células. In vivo, a administração de sRAGE suprime a aterosclerose acelerada, em modelos de murinos com doença vascular diabética acelerada, em ratos com ausência de apolipoproteína E e melhora a cura dificultada de feridas em ratinhos geneticamente diabéticos db+/db+. De forma a delinear qual a porção de sRAGE que medeia estas interacções, tanto com AGEs ou com o péptido β-amilóide, foram geradas séries de moléculas contendo ADN (incluindo ADN codificador para o domínio V, domínio Cl ou domínio C2), conjuntamente com séries de péptidos representantes das sequências dos três domínios.

Os resultados aqui apresentados indicam que o domínio de ligação ao ligando, para ambos AGEs e péptido β-amilóide das sRAGE, se encontra entre os 30 primeiros aminoácidos do domínio V. Adicionalmente, os dados indicam que o domínio Cl ou o domínio C2 ou sequências peptídicas destes domínios não medeiam a interacção destes ligandos com a sRAGE. Estes dados indicam que os primeiros 30 aminoácidos da sRAGE podem representar um importante alvo para a identificação 54 de fármacos, pesquisa e desenvolvimento, para o tratamento de doenças nas quais existe a acumulação de sRAGE, tais como complicações da diabetes, bem como Doença de Alzheimer. A RAGE foi inicialmente identificada como um sitio de interacção celular para a interacção dos Produtos de Glicação Avançada (AGEs), os produtos da glicação não enzimática irreversível e oxidação de proteínas / lípidos, os quais se acumulam durante o envelhecimento normal, diabetes, bem como na insuficiência renal e amiloidoses (Ruderman et al., 1992; Baynes, 1991; Sell et al ., 1989;

Brownlee et al., 1988; Hicks et al., 1988). A RAGE (Schmidt et al., 1992; Neeper et al., 1992) é membro da superfamília das imunoglobulinas da superfície celular das células, cuja porção extracelular contém um domínio do tipo "V" seguido por dois domínios de imunoglobulinas do tipo "C". 0 "plot" putativo de hidropatia também prediz que esta porção extracelular é precedida por um péptido líder com aproximadamente 22 aminoácidos e é seguida por um putativo abrangente domínio transmembranar hidrofóbico e, finalmente, por um domínio citossólico de elevada carga (Neeper et al., 1992). A RAGE é marcadamente conservada entre as diferentes espécies examinadas (bovina, humana, ratinho e rato) (Neeper et al., 1992) com mais de 90% de homologia observada tanto ao nível dos ácidos nucleicos como dos aminoácidos. A RAGE como receptor para os Produtos de Glicação Avançada (AGEs). Estudos prévios demonstraram que a RAGE se encontra presente em tipos de células que são alvos específicos na patogénese de complicações da diabetes, especificamente nas células endoteliais, células do músculo liso vascular, macrófagos, células mesangiais, células vasculares e 55 neurais da retina, bem como dos neurónios (no Sistema Nervoso Central e Periférico) (Brett et al., 1993) . Neste contexto, a interacção das AGEs com a RAGE resulta num número de alterações no fenótipo celular vascular e inflamatório, os quais são provavelmente importantes na patogénese das complicações da diabetes e envelhecimento (Schmidt et al., 1993; Schmidt et al., 1994; Schmidt et al., 1995; Wautier et al., 1996; Yan et al., 1994; Miyata et al., 1996; Lander et al., 1997). Por exemplo, a interacção AGE-RAGE resulta no aumento da migração e activação dos macrófagos (Schmidt et al., 1993), expressão aumentada da interleucina-6 em figados de ratinhos tratados com AGE (Schmidt et al., 1994), expressão aumentada da molécula-1 da adesão celular vascular pelo endotélio vascular (Schmidt et al., 1995), hiper-permeabilidade vascular (Wautier et al., 1996) e aumento do estresse celular oxidativo (Yan et al., 1994, Miyata et al., 1996). 0 método central, através do qual a interacção AGE-RAGE transmite estes efeitos, realiza-se pela activação das vias oxidativas sensíveis, incluindo p21ras e MPA quinases (Lander et al., 1997).

Os efeitos da interacção AGE-RAGE são em grande parte bloqueados pelo pré-tratamento do sistema de cultura de células do fígado de ratinho com um composto anti-RAGE, constituído por um domínio do tipo "v" e dois domínios do tipo "C" (Schmidt et al., 1993; Schmidt et al., 1994;

Schmidt et al., 1995; Wautier et al., 1996; Yan et al., 1994; Miyata et al., 1996; Lander et al., 1997). Para além disso, verificou-se em estudos recentes, que o tratamento de ratinhos diabéticos com sRAGE resultou numa melhoria da cura dificultada de feridas na espessura total de um modelo de excisão (Wu et al., 1997) e suprimiu a aterosclerose acelerada diabética em ratinhos com ausência de 56 apolipoproteína E tornados diabéticos com estreptozotocina (Park et al. , 1997). A RAGE como receptor para o péptido beta-amilóide. 0 péptido beta-amilóide é uma importante espécie patogénica no desenvolvimento da toxicidade na doença de Alzheimer (Yan et al., 1996). A RAGE foi identificada como o sitio central de interacção para o péptido beta-amilóide nos neurónios. Esta interacção, da qual resulta um aumento do estresse oxidativo, da citotoxicidade neuronal e da expressão do factor estimulante da colónia de macrófagos (Yan et al., 1996; Yan et al., 1997). Estes efeitos, tal como no caso da AGE, são bloqueados em modelos de cultura celulares, em presença tanto de IgG anti-RAGE ou sRAGE (Yan et al., 1996; Yan et al., 1997).

Assim, a objectivo dos estudos abaixo apresentados consistiu no delineamento do local preciso de interacção das AGEs e do péptido beta-amilóide, como meio de compreensão sobre a forma como a sRAGE transmite os seus efeitos benéficos. Em última análise, os resultados destes estudos são de importante aplicação no desenvolvimento de fármacos concebidos para o tratamento de disfunções, nas quais existe a acumulação de AGEs, tais como as complicações da diabetes, bem como da Doença de Alzheimer.

Materiais: os Produtos de Glicação Avançada (AGEs) foram preparados de acordo com o descrito previamente (Schmidt et al., 1992; Neeper et al., 1992) com materiais da Sigma®. 0 péptido beta-amilóide (1-42) foi adquirido à Quality control Biochemicals. Todos os péptidos foram preparados de acordo com a sequência humana (Neeper ela 1., 1992), pela

Quality control Biochemicals.

Sistemas de ADN: foi usado o sistema de proteína de fusão GST para a preparação do domínio V solúvel, e dos domínios 57

Cl e C2 solúveis, de acordo com as instruções do fabricante (Pharmacia®).

Ensaios de Ligação: albumina AGE sérica bovina (5yg) foi colocada nos poços de uma placa Maxisorp da NUNC® numa solução tampão de sódio bicarbonato/sódio (pH 9.8), durante a noite, a 4°C. Na manhã seguinte, os poços foram aspirados e bloqueados com uma solução tampão salina de fosfato (com cálcio/magnésio) contendo albumina sérica bovina (1%), durante 2h a 37°C. Os poços foram, em seguida, lavados um vez com uma solução tampão salina de fosfato (sem cálcio/magnésio) contendo Tween® 20 (20%), 150 ml/poço. Em seguida foi efectuado um ensaio radiológico de ligação em solução tampão salina de fosfato contendo 0,2% de albumina sérica bovina, durante 2h a 37°C, com RAGE solúvel total (lOOnM; actividade específica 7.000-8.000 cpm/ng), radiomarcada (com utilização de 125I e Iodogen (Pierce®) ) , em presença ou ausência de RAGE solúvel não marcada (50x excesso molar) ou do excesso molar indicado do domínio ou do péptido. Os poços foram, em seguida, eluídos após lavagem como o acima descrito, com uma solução tampão contendo NP-40 (1%) e NaCl (0,15M). O material colectado foi contado num contador gama (LKB®). Em ensaios com péptido beta-amilóide, o péptido beta-amilóide 1-42 (5pg) foi colocado nos poços de uma placa Maxisorp da NUNC®, numa solução tampão de sódio bicarbonato/sódio (pH 9.8), durante a noite, a 4°C. Na manhã seguinte, os poços foram aspirados e bloqueados com uma solução tampão salina de fosfato (sem cálcio/magnésio) contendo albumina sérica bovina (1%), durante 2h a 37°C. 0 ensaio de ligação foi realizado em solução tampão salina de fosfato contendo 0,2% de albumina sérica bovina, durante 2h a 37°C, utilizando-se RAGE solúvel total radiomarcada (com utilização de 125I e Iodogen (Pierce®)), (950nM; actividade específica 7.000-8.000 cpm/ng), em presença ou ausência de RAGE solúvel não marcada (excesso molar abaixo indicado) ou o excesso molar 58 indicado do domínio ou do péptido. Os poços foram, em seguida, eluídos após lavagem como o acima descrito, com uma solução tampão contendo NP-40 (1%) e NaCl (0,15M). 0 material colectado foi contado num contador gama, tal como o acima descrito.

RESULTADOS

Interacção das AGEs com as sRAGE. Os primeiros ensaios tiveram como finalidade determinar quais dos três domínios extracelulares, compreendendo sRAGE, interagiam com AGEs. Os ensaios radiológicos de ligação revelaram que enquanto a RAGE solúvel não marcada (total) competia, em 83%, pela ligação à sRAGE radiomarcada com AGE imobilizada, o domínio V não marcado competia, em 89%, enquanto que os domínios Cl e C2 não apresentaram efeito (respectivamente, 30% e 19% de competição), quando todos os competidores não marcados foram utilizados a 50 vezes o excesso molar (Tabela I) . Estes dados indicam que apenas o domínio V parece mediar a interacção com as AGEs. Estes efeitos, do domínio V não marcado, eram dependentes da dose: a 100 vezes o excesso molar, foi observado 80% de competição. Este valor diminuía para 53% a um excesso molar de 12,5 vezes e para não competição (0) a um excesso molar de 1,56 de domínio V não marcado (Tabela II). Uma série de péptidos foi então preparada compreendendo diferentes porções de domínio V de sRAGE. Estes dados indicam, essencialmente, que não era obtida competição, a 50 vezes de excesso molar, com os seguintes péptidos (péptidos consistindo nos aminoácidos de sRAGE números: 1 - 13, 18 - 28, 31 - 60 e 46 - 60; Tabela III). Foram igualmente utilizados péptidos controlo, de domínios Cl e C2 (péptido consistindo nos aminoácidos de sRAGE números: 157 - 169 e 270 - 281, respectivamente), os quais não produziram efeitos (Tabela III). Contudo, os péptidos consistindo nos aminoácidos números 1 - 30 e 16 - 59 30 do domínio V, inibiram a ligação da sRAGE radiomarcada à AGE imobilizada. A 50 vezes de excesso molar, o péptido consistindo nos aminoácidos números 1 a 30 de sRAGE inibiu a ligação em 78%, a 25 vezes de excesso molar o péptido consistindo nos aminoácidos números 1 a 30 da sRAGE inibiu a ligação a 76% e a 1 vez de excesso molar não houve competição (0) (Tabela III). A 50 vezes de excesso molar, o péptido consistindo nos aminoácidos números 16 a 30 de sRAGE inibiu a ligação de sRAGE radiomarcada com AGE imobilizada em 73%, a 25 vezes de excesso molar o péptido consistindo nos aminoácidos números 16 a 30 da sRAGE inibiu a ligação a 20% e a 1 vez de excesso molar não houve competição (Tabela III). Em seguida foram preparados péptidos menores (péptidos consistindo nos aminoácidos números 1 a 25 e 10 a 25 da sRAGE) num esforço para ainda melhor delinear, de forma precisa, o sitio de ligação. Mesmo a 50 vezes de excesso molar, um péptido não marcado, consistindo nos aminoácidos números 1 a 25 de sRAGE, apenas inibiu a ligação à sRAGE radiomarcada a AGE imobilizada, em 31% e um péptido não marcado, consistindo nos aminoácidos números 10 a 25 de sRAGE, apenas apresentou 26% de efeito competitivo (Tabela III). Estes dados sugerem que o péptido consistindo nos aminoácidos números 1 a 30 de sRAGE é um competidor eficaz da ligação de sRAGE à AGE imobilizada.

Interacção do péptido beta-amilóide com sRAGE.

Primeiramente foi determinado quais dos três domínios extracelulares, compreendendo sRAGE, interagiam com AGEs. Os ensaios radiológicos de ligação revelaram que enquanto a RAGE solúvel não marcada (total) competia pela ligação à sRAGE radiomarcada com AGE imobilizada, em cerca de 80%, o domínio V não marcado competia, em 71,4%, enquanto que os domínios Cl e C2 não apresentaram efeito (respectivamente, 15,2% e 21,4% de competição), quando todos os competidores 60 não marcados foram utilizados a 100 vezes o excesso molar (Tabela IV).

Estes dados indicam que apenas o domínio V parece mediar a interacção com as AGEs. Estes efeitos, do domínio V não marcado, eram dependentes da dose: a 100 vezes o excesso molar, foi observado 72,5% de competição. A 50 vezes de excesso molar foi observado 41,4% de competição. Este valor diminuía para 34% a um excesso molar de 25 vezes e para competição insignificante (3, 9%) a um excesso molar de 10 de domínio V não marcado (Tabela V).

Uma série de péptidos foi então preparada compreendendo diferentes porções de domínio V de sRAGE. Estes dados indicam, essencialmente, que não era obtida competição, a 100 vezes de excesso molar, com os seguintes péptidos (péptidos consistindo nos aminoácidos de sRAGE números: 1-13, 18-28, 31-60 e 46-60; Tabela VI) . Foram igualmente utilizados péptidos controlo, de domínios Cl e C2 (péptido consistindo nos aminoácidos de sRAGE números: 157-169 e 270-281, respectivamente) , os quais não produziram efeitos (Tabela VI) . Contudo, os péptidos consistindo nos aminoácidos números 1-30 do domínio V, inibiram a ligação da sRAGE radiomarcada à AGE imobilizada em cerca de 29,7% (Tabela VI) . Em seguida foram preparados péptidos menores (péptidos consistindo nos aminoácidos números 1 a 25 e aminoácidos números 10 a 25 da sRAGE) num esforço para ainda melhor delinear, de forma precisa, o sítio de ligação. Mesmo a 100 vezes de excesso molar, um péptido não marcado, consistindo nos aminoácidos números 1 a 25 de sRAGE, apenas inibiu a ligação à sRAGE radiomarcada a AGE imobilizada, em 5% e o péptido não marcado, 10 a 25 de sRAGE, apenas apresentou 18% de efeito competitivo (Tabela VI) . Estes dados sugerem que o péptido consistindo nos aminoácidos números 1 a 30 de sRAGE é um competidor eficaz 61 da ligação de sRAGE ao péptido beta-amilóide imobilizado (1-42) .

DISCUSSÃO

As interacções das AGEs ou do péptido beta-amilóide com a RAGE à superfície celular são contribuições importantes para o desenvolvimento de complicações em situações nas quais se verifica uma acumulação de AGEs, tais como na diabetes, retinopatia, neuropatia periférica vascular, impotência masculina, perda de memória senil ou doença de Alzheimer, respectivamente. A RAGE ou a RAGE solúvel e dois terços de RAGE extracelular, incluindo complicações de diabetes crónica, actuando através do bloqueio destes efeitos em modelos in vitro e in vivo, podem ter implicações importantes como alvo para o desenvolvimento de fármacos para tratamento destas condições. 0 domínio V de sRAGE tem demonstrado mediar as interacções entre a sRAGE completa com as AGEs ou com os péptidos beta-amilóides, de uma forma dosagem-dependente. Para além disso, os primeiros 30 aminoácidos do domínio V contém sequências envolvidas na mediação destas interacções. É contudo provável, que nem todos os aminoácidos presentes nos aminoácidos 1 a 30 da sRAGE, sejam necessários para efeitos desta ligação. É também possível, que um pequeno número de aminoácidos, para além dos 30 primeiros aminoácidos da sRAGE (ou seja, do domínio V) , compreendam um sítio de interacção para ligandos da AGE ou do péptido beta-amilóide. A presente invenção divulga compostos e composições, as quais compreendem polipéptidos contendo os referidos aminoácidos, de acordo com o anteriormente discutido.

Um estudo sobre as sequências obtidas a partir do GenBank, dos 30 primeiros aminoácidos do domínio V, de entre as 62 espécies humana, de ratinhos, ratos e bovina, revela uma homologia marcada (Tabela VII). Por exemplo, dos primeiros 10 aminoácidos do domínio V, verifica-se a existência de uma completa identidade entre as espécies, no que respeita aos resíduos de aminoácidos 2 a 9 (8 dos primeiros 10 aminoácidos). Dos 10 aminoácidos seguintes, do domínio V (11 a 20), existe identidade entre espécies no que se refere a 7 dos 10 aminoácidos, incluindo os aminoácidos 11, 12, 14, 16, 17, 19 e 20. Dos aminoácidos 21 a 30, do domínio V, existe identidade entre as quatro espécies, no que se refere a 8 dos 10 aminoácidos, incluindo os aminoácidos 21, 22, 23, 25, 27, 28, 29 e 30.

De uma forma geral, existe, portanto, 76% de identidade aminoacídica entre as quatro espécies testadas até agora. Estes dados são consistentes com o conceito de que as sequências críticas, para a ligação de AGEs ou péptidos beta-amilóides com as sRAGE, podem estar contidas entre os primeiros 30 aminoácidos do domínio V.

No seu conjunto, estes dados indicam que os primeiros 30 aminoácidos do domínio V são importantes na mediação da interacção entre a sRAGE, quer com os AGEs como com os péptidos beta-amilóides. Isto sugere que a região do domínio V é, provavelmente, um alvo importante a ter em consideração na concepção de fármacos para o tratamento de condições, nas quais existe uma acumulação de AGEs, tais como nas complicações da diabetes, envelhecimento, insuficiência renal, amiloidoses, retinopatia, neuropatia periférica vascular, impotência masculina, perda de memória senil ou doença de Alzheimer.

Tabela I. O domínio V de sRAGE medeia a interacção com as AGEs. Foram efectuados ensaios de ligação, tal como o acima 63 descrito. A sRAGE radiologicamente marcada foi ligada a AGE imobilizada em presença ou ausência da quantidade de excesso molar indicada de um competidor não marcado. Consequentemente, nestes ensaios, quanto mais próximo de 100% for o valor apurado, mais eficaz é o competidor, para a ligação da sRAGE radiomarcada à AGE imobilizada.

Competidor não Excesso %competição/125I-sRAGE marcado molar sRAGE completa 50 83% Domínio V 50 89 Cl 50 30 C2 50 19

Tabela II. O domínio V inibe a ligação de sRAGE radiomarcada com AGE imobilizada de uma forma dependente da dosagem. Foram realizados ensaios de ligação, de acordo com o mencionado anteriormente. A sRAGE radiomarcada foi ligada a AGE imobilizada em presença de quantidade de excesso molar de domínio V não marcado.

Competidor não marcado Excesso molar Domínio V 100 Domínio V 50 Domínio V 25 Domínio V 12,5 Domínio V 6,25 Domínio V 3, 12 Domínio V 1,56

%competição/125I-sRAGE 80 86 76 53 28 16 0

Tabela III. Os primeiros 30 aminoácidos do domínio V da sRAGE medeiam a interacção com as AGEs. Foram realizados ensaios de ligação, de acordo com o descrito anteriormente. A sRAGE radiomarcada foi ligada à AGE imobilizada, na presença da quantidade de excesso molar indicada, de péptido não marcado. 64 64 Péptido/Domínio V Excesso %competição/125I- (aminoácidos #) molar SRAGE 1-30 100 77 50 78 25 76 1 0 1-25 50 31 25 24 1 0 10-25 50 26 25 17 1 0 16-30 100 69 50 73 25 20 1 0 31-60 100 25 50 11 25 0 1 0 46-60 100 0 50 0 25 0 1 0 1-13 100 0 50 0 25 0 1 0 18-28 100 0 50 0 25 0 1 0 157-169 100 3 50 0 25 0 1 0 270-281 100 0 50 0 25 0 1 0 Tabela IV. O domínio V de SRAGE medeia a interacção com o péptido beta-amilóide. Foram realizados ensaios de ligação, de acordo com o descrito anteriormente. A sRAGE radiomarcada foi ligada ao péptido beta-amilóide imobilizado, na presença ou ausência da quantidade de excesso molar indicada de um competidor não marcado. Consequentemente, nestes ensaios , quanto mais próximo de 100% for o valor apurado, mais eficaz é o competidor, para a ligação da sRAGE radiomarcada ao péptido beta-amilóide imobilizado.

Competidor não

Excesso %competição/125I- 65 marcado molar sRAGE sRAGE completa 100 80% Domínio V 100 71,5 Domínio Cl 100 15,2 Domínio C2 100 21,4

Tabela V. O domínio V inibe a ligação de sRAGE radiomarcada com o péptido beta-amilóide imobilizado de uma forma dependente da dosagem. Foram realizados ensaios de ligação, de acordo com o mencionado anteriormente. A sRAGE radiomarcada foi ligada ao péptido beta-amilóide imobilizado, em presença de quantidade de excesso molar de péptido não marcado. Competidor Excesso %competição/125I- não marcado molar sRAGE Domínio V 100 72,5 Domínio V 50 41,4 Domínio V 25 34 Domínio V 10 3,9

Tabela VI. Os primeiros 30 amlnoácldos do domínio V da sRAGE medeiam a Interacção com o péptldo beta-amllólde.

Foram realizados ensaios de ligação, de acordo com o descrito anteriormente. A sRAGE radiomarcada foi ligada ao péptido beta-amilóide imobilizado, na presença da quantidade de excesso molar indicada, de péptido não marcado.

Aminoácido competidor não marcado (#) Excesso molar %competição/ sRAGE 1-30 100 55 16-30 100 29.7 1-25 100 5 10-25 100 18 31-60 100 2.6 46-60 100 0 1-13 100 0 18-28 100 27 157-167 100 0 270-281 100 0 66

Tabela VII. Comparação dos primeiros 30 aminoácidos do dominio V de sRAGE entre espécies humanas, murino, rato e bovina. A sequência aminoacídica dos primeiros 30 aminoácidos do dominio V encontra-se indicada para as quatro espécies referidas. As letras indicam os aminoácidos de acordo com o seguinte: A, ala; C, cys; D, asp; E, glu F, phe, G, gly; H his; I, ile; K, lys; L, leu; M, met ; N asn ; P, pro; Q, gin; R, arg; S, ser; T, thr; V, vai ; W trp ; and Y, tyr. 1-10

Humano A Q N I T A R I G E Ratinho G Q N I T A R I G E Rato G Q N I T A R I G K Bovino D Q N I T A R I G K 11 - 20 Humano P L V L K C K G A P Ratinho P L V L s C K G A P Rato P L M L s C K A A P Bovino P L V L N C K G A P 21 - 30 Humano K K P P Q R L E W K Ratinho K K P P Q R L E W K Rato K K P T Q K L E W K Bovino K K P P Q Q L E W K Exemplo 2: SRAGE suprime a Doença Periodontal acelerada em ratinhos diabéticos: foi estudado um modelo de Doença Periodontal acelerada em ratinhos diabéticos e os efeitos da sRAGE. A eficácia da sRAGE encontra-se demonstrada em ratinhos diabéticos (estreptozitocina, ratinhos C57BL6/J). A administração de RAGE solúvel (forma extracelular completa de, aproximadamente, 40 kDa) inibe a perda acelerada de osso alveolar, a qual é o indicador chave da Doença Periodontal. 67 A injecção intraperitoneal de RAGE solúvel suprime a perda óssea em ratinhos diabéticos (db+/db+). A administração de RAGE solúvel suprime a perda óssea alveolar num modelo de murino com Doença Periodontal acelerada da diabetes. A diabetes foi induzida em ratinhos C57BL6/J através da administração de estreptozitocina. A diabetes foi definida como o resultado de duas medições da glucose sérica >_ 300 mg/dl. Alternativamente, o mesmo número foi tratado com um veiculo para a estreptozitocina, solução tampão fosfato salina. Um mês após a indução da diabetes os ratinhos foram tratados, em cada dia alternado, durante 4 dias consecutivos, com uma administração oral/anal do patogénio periodontal humano, Porphyromonas gingivalis (Pg) ou com o veiculo solução tampão fosfato salina. Dois meses mais tarde, os ratinhos foram sacrificados e decapitados. As mandíbulas foram isoladas e, num microscópio de dissecação (Olympus), usando-se um fórceps de microdissecação curvo (2 3A polegadas, 0,6mm de largura) e um bisturi com lâmina n°15, foi dissecado o tecido línguo-gengival da área posterior de cada quadrante. A gengiva foi reflectida (espessura total) por iniciação de uma incisão em sulco horizontal, na margem da gengiva dos dentes posteriores, com a lâmina do bisturi. Foram realizadas incisões de libertação verticais e o tecido foi removido (separação do tecido com uma incisão horizontal imediatamente debaixo da junção mucogengival). O tecido foi então colocado em formalina (10%) para posterior análise.

Após os procedimentos acima mencionados, as mandíbulas foram expostas a KOH (2%) durante três dias e depois descarnadas mecanicamente. As mandíbulas (exposição das superfícies línguais de cada ^ da mandíbula) foram então 68 embebidas em "Lab Putty". De forma a remover a angulação, como factor variável, as cúspides bucal e lingual dos dentes posteriores, na ½ mandíbula, foram sobrepostas durante o processo de embebição, e visualizadas a partir da superfície da língua antes de se fotografar. As mandíbulas descarnadas foram fotografadas usando-se um microscópio de dissecação e um filme Ektachrome® 160T (slides coloridos). Estes slides, com uma ampliação de 40x, foram ainda aumentados 4x. As imagens foram então delineadas num papel de desenho. Foi medida, para cada ratinho, a área total da distância entre a junção cimento-esmalte (CEJ) e a cristã ósseo alveolar (BC) para um total de 6 dentes posteriores, através da digitalização do traçado para um computador/digitalizador Macintosh®. As imagens foram analisadas usando-se o programa NIH Image 157® (em conjunto com o programa de fotografia Adobe Photoshop®). Foi anotada a área total (em unidades pixel arbitrárias) para cada ratinho (6 dentes), de acordo com o indicado na Figura 1. Foi realizada a análise estatística com uma análise de variância. Aos dois meses foi observado um aumento significativo, de 1,55 vezes, na perda óssea alveolar de ratinhos diabéticos, quando comparado com ratinhos controlo não diabéticos (ref. dados específicos em baixo). Resultados similares foram observados nos ratinhos db+/db+ (geneticamente diabéticos insulino-resistentes) um mês após a infecção com Pg, comparados com ratinhos controlo não diabéticos (m+/db+). Alguns ratinhos diabéticos foram tratados com sRAGE (MSR, tanto 35yg IP/dia durante dois meses ou 3,5pg IP/dia durante dois meses), de forma a se testar se a administração de sRAGE melhora a perda óssea alveolar em ratinhos C57BL6/J tratados com Pg. Os ratinhos diabéticos controlo foram tratados com uma concentração equimolar de albumina sérica de ratinho (70pg IP/dia durante dois meses). Todos os ratinhos foram tratados com 69

Pg. No final desse tempo, foram efectuadas medições da perda óssea alveolar. Os resultados foram os seguintes:

Condição Perda óssea alveolar _(CEJ para BC alveolar) (I) Diabético/albumina 6.222 + 406 pixéis (SD) (II) Não diabético/albumina 4.018 + 501 pixéis (SD) (III) Diabético/MSR 35pg/dia 5.242 + 463 pixéis (SD) (IV) Diabético/MSR 3,5pg 6.198 + 427 pixéis (SD)

Muitas das complicações da diabetes podem resultar da interacção das AGEs com a RAGE, causando perturbações celulares. A AGE actua como ligando para o dominio V da RAGE, para mediar as referidas perturbações celulares. A presente invenção divulga um método para inibição da perturbação celular, num sujeito, associada a uma condição diabética, o qual compreende a administração, ao sujeito, de uma quantidade eficaz de um inibidor da interacção entre as AGEs com a RAGE à superfície celular, para inibição da interacção e assim, inibição da perturbação celular, no sujeito, e tratamento da condição diabética.

As AGEs (Produto de Glicação Avançada) constituem um grupo de compostos heterogéneo. Foram identificados um único, ou específico, composto(s) de AGE patogénico. Exemplos de AGEs incluem, mas não se encontram limitados a: pentosidina (individualmente ou modificação de ligação a uma proteína); carboxietil-lisina (individualmente ou modificação de ligação a uma proteína); pirralinas (individualmente ou modificação de ligação a uma proteína); metilglioxal (individualmente ou modificação de ligação a uma proteína); e etil-glioxal (individualmente ou modificação de ligação a uma proteína). Um destes AGEs podes ser um ligando patogénico para uma perturbação celular específica, devido a uma interacção do AGE com o domínio V de RAGE. Esta interacção pode ser um factor de contribuição crítico em muitas das complicações associadas à diabetes. 70 A presente invenção divulga inibidores de tal interacção, que podem ser administrados a sujeitos com complicações da diabetes.

As células, sobre as quais esta ligação, dos AGEs à RAGE da superfície celular, pode actuar, incluem células endoteliais, células do músculo liso vascular, células neuronais, macrófagos, linfócitos, células vasculares da retina, células neuronais da retina, células mesangiais e células do tecido conectivo, e células associadas ao tecido conectivo, tais como as células associadas com a gengiva e a pele. As células, sobre as quais esta ligação, dos AGEs com a RAGE, pode actuar, não se encontram limitadas a esta lista, mas podem incluir outras células presentes no corpo humano. A presente invenção divulga compostos e composições, os quais podem ser úteis na inibição desta interacção, melhorando assim a perturbação celular e, em última análise, os sintomas associados à diabetes.

As perturbações celulares nas células que a sRAGE, outros polipéptidos ou agentes divulgados na presente invenção, incluem, mas não estão limitados a: estresse oxidativo, hiperpermeabilidade, expressão aumentada da adesão molecular, tais como Molécula de Adesão Celular Vascular -1, expressão aumentada do factor de tecido, quimiotaxia e activação dos macrófagos aumentada, tal como com a produção aumentada de citoquinas e factores de crescimento, migração aumentada das células do músculo liso, activação das células do músculo liso, estresse oxidante neuronal e apoptose. Os produtos de glicação avançada (AGE) são o resultado irreversível da glicação e oxidação não enzimática. Estes AGEs formam-se em conjunto com um número de condições, tais como envelhecimento, diabetes, inflamação, insuficiência renal, amiloidose e hiperlipidémia. 71

Os AGEs também se formam com outros estados de doença e condições anómalas, as quais não se encontram explicitamente listadas no presente documento, mas estão compreendidas no âmbito da presente invenção.

Exemplo 3: Agentes terapêuticos identificados através de ensaios in vitro, demonstram ser eficazes in vivo na inibição dos sintomas associados a complicações da diabetes.

Os agentes terapêuticos identificados podem ser eficazes na cura de feridas. Em testes realizados, nestas situações, foi usado um modelo de segunda intenção de feridas, em ratinhos geneticamente diabéticos. 0 agente (ou péptido ou composição farmacêutica) é aplicado topicamente na área ferida e efectuaram-se medições no fecho da ferida (alteração na área ferida), e epitelização e outros indícios histológicos (tais como produção de colagénio, produção de matriz extracelular, fibrina, etc.). Cada uma destas medições representa um índice de eficácia do agente, na cura de feridas.

Na doença periodontal foram utilizados ratinhos geneticamente diabéticos e tratados com estreptozitocina, como modelo de sistema animal, para analisar a perda óssea após tratamento com péptidos contendo a Seq. ID. No. 1. A perda óssea é medida quantitativamente através de métodos histológicos e determinação geométrica da área. 0 péptido com a Seq. ID. No. 1, péptido com o domínio V, agente ou composição farmacêutica é administrado localmente (ex. "cobrindo" o agente) e/ou sistemicamente. A redução da perda óssea é uma indicação da eficácia do agente. 72

Na aterosclerose acelerada, os ratinhos "knock-out" tratados com ApoE e estreptozitocina, alimentados com uma dieta padrão comum, foram utilizados como modelo animal desta condição patológica. 0 agente (ou péptido ou composição farmacêutica) é administrado sistemicamente e os dados quantitativos são aferidos através da medição da área de lesão em animais após o seu tratamento. Estes dados dão uma indicação da eficácia de cada agente. Quanto menor for a área da lesão, comparativamente aos animais controlo não tratados, mais eficaz é o agente.

Na impotência diabética, foi utilizado como modelo de ratos, animais tratados com estreptozitocina, nos quais a erecção é monitorizada em sequência da administração de apomorfina. 0 número e frequência das erecções são medidos na presença e na ausência do agente, sendo os respectivos dados comparados de forma a avaliar a eficácia do agente na inibição dos sintomas de impotência.

Na retinopatia diabética foram utilizados sistemas de modelos de ratinhos e ratos de forma a medir as alterações no fluxo sanguíneo e a patologia da retina. De novo, o agente (ou péptido ou composição farmacêutica) é administrado sistemicamente. Os dados quantitativos são aferidos através da medição do fluxo sanguíneo e os dados qualitativos são medidos pelo exame da retinopatia em animais após o tratamento.

Na nefropatia diabética foram utilizados ratinhos e ratos diabéticos como modelos. Foram medidas as alterações na taxa de filtração glomerular e fluxo sanguíneo renal em animais que receberam o agente terapêutico e em animais que receberam um placebo. Adicionalmente, foi determinado, em cada animal, o aparecimento de proteínas na urina e alterações histológicas nos glomérulos. A eficácia do 73 agente, na inibição da nefropatia diabética, foi avaliada com base nestas medições.

Na neuropatia diabética, foram utilizados ratinhos geneticamente diabéticos, como modelo animal, para a determinação da eficácia doa gente da presente invenção. Os ratinhos foram tratados sistemicamente com o composto. Os ratinhos foram então observados para determinação das alterações da velocidade de condução no nervo e alterações no número de fibras nervosas periféricas mielinizadas. Estes dados foram comparados com dados resultantes de medições equivalentes realizadas em animais não tratados, fornecendo assim uma indicação da eficácia do agente da presente invenção.

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LISTA DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) Requerente: The Trustees of Columbia

University in the City of New York

(ii) EPÍGRAFE: SÍTIO DE LIGAÇÃO DE UM LIGANDO RAGE E RESPECTIVOS USOS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 5 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Cooper & Dunham (B) RUA: 1185 Avenue of the Américas (C) CIDADE: New York

(v) SUPORTE PARA LEITURA POR COMPUTADOR (A) Tipo de meio: Disquete; (B) Computador: IBM PC Compatível

(C) Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1,0, Versão #1,30

(vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO DE PATENTE (A) N°pedido de patente int.: ainda não conhecido (B) Data do pedido: incluída no documento (C) Classificação:

(vii) INFORMAÇÃO DO AGENTE/REPRESENTANTE (A) Nome: White, John P. (B) N° registo: 28.678 (C) N0 Ref/Documentado: 53447 INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES (A) Te 1: 2 12-27 8-04 0 0 (B) Fax: 212-319-0526 (ix) 81 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. No.1 (i) Características da sequência (A) Comprimento: 30 aminoácidos (B) Tipo: aminoácidos (C) Cadeia: simples (D) Tipologia: linear (ii) Tipo de molécula: péptido (xi)Descrição da sequência: SEQ. ID. No. 1

Ala Gin Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Vai Leu Lys Cys 15 10 15

Lys Gly Ala pro Lys Lys Pro Pro Gin Arg Leu Glu Trp Lys 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. No.2 (i) Caracteristicas da sequência (A) Comprimento: 30 aminoácidos (B) Tipo: aminoácidos (C) Cadeia: simples (D) Tipologia: linear (ii) Tipo de molécula: péptido ( xi)Descrição da sequência: SEQ. ID. No. 2

Gly Gin Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Vai Leu ser Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Gin Leu Glu Trp Lys 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. No.3 (i) Caracteristicas da sequência (A) Comprimento: 30 aminoácidos (B) Tipo: aminoácidos (C) Cadeia: simples (D) Tipologia: linear 82 (ii) Tipo de molécula: péptido ( xi)Descrição da sequência: SEQ. ID. No. 3

Gly Gin Asn Ile Thr Ala Arg Xle Gly Glu Pro Leu Met Leu Ser Cys 1 5 10 15

Lys Ala Ala Pro Lys Lys Pro Thr Gin Lys Leu Glu Trp Lys 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. No.4 (i) Caracteristicas da sequência (A) Comprimento: 30 aminoácidos (B) Tipo: aminoácidos (C) Cadeia: simples (D) Tipologia: linear (ii) Tipo de molécula: péptido (xi)Descrição da sequência: SEQ. ID. No. 4

Asp Gin Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Lys Pro leu Vai Leu Asn Cys 15 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gin Gin Leu Glu Trp Lys 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID. No.5 (i) Características da sequência (A) Comprimento: 10 aminoácidos (B) Tipo: aminoácidos (C) Cadeia: simples (D) Tipologia: linear (ii) Tipo de molécula: péptido (xi)Descrição da sequência: SEQ. ID. No. 5

Ala Gin Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu 15 10

Lisboa, 11 de Outubro de 2010.

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um péptido ligado a um anticorpo, ou a uma porção de anticorpo, em que o péptido é um fragmento de sRAGE compreendendo os aminoácidos 1 a 30 do domínio V de uma sRAGE natural e em que o anticorpo ou porção de anticorpo é um fragmento de Fab ou um fragmento de Fc.

2. Um péptido ligado a um anticorpo, ou a uma porção de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o péptido compreende um domínio "V" de uma sRAGE natural.

3. Um péptido ligado a um anticorpo, ou a uma porção de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que a sRAGE é uma sRAGE humana, de ratinho, de rato ou de bovino.

4. 0 péptido da reivindicação 1, o qual está ligado a um anticorpo.

5. 0 péptido da reivindicação 1, no qual o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

6. O péptido da reivindicação 1, no qual a porção de anticorpo é um fragmento Fab.

7. O péptido da reivindicação 1, no qual a porção de anticorpo é um fragmento Fc.

8. Uma composição farmacêutica que compreende um péptido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

9. A composição farmacêutica da reivindicação 8, na qual o veículo é um diluente, um aerossol, um veículo tópico, uma solução aquosa, uma solução não aquosa, um polímero ou um veículo sólido. 2

10. A composição farmacêutica da reivindicação 9, na qual o veiculo é uma solução aquosa.

11. O péptido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, para inibição da interacção entre um péptido β-amilóide e um receptor para os produtos de glicação avançada à superfície da célula num sujeito.

12. 0 péptido da reivindicação 11, para inibição da referida interacção, na qual a célula é uma célula neuronal, uma célula endotelial, uma célula da glia, uma célula microglial, uma célula do músculo liso, uma célula somática, uma célula da medula óssea, uma célula do fígado, uma célula intestinal, uma célula germinal, um fagócito mononuclear, uma célula tumoral, uma célula linfocitária, uma célula mesangial, uma célula epitelial da retina, uma célula vascular da retina, uma célula ganglionar ou uma célula estaminal.

13. O péptido da reivindicação 11, para inibição da referida interacção, em que a célula é uma célula normal, uma célula activada, uma célula neoplásica, ma célula doente ou uma célula infectada.

14. O péptido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, para inibição de: a) Degeneração de uma célula neuronal; b) Formação de uma fibrilha de péptido β-amilóide numa célula; c) Arranjo extracelular de um péptido β-amilóide numa fibrilha; d) Inibição da agregação de um péptido β-amilóide à superfície de uma célula; e) Infiltração de uma célula microglial em placas senis; 3 f) Activação de uma célula microglial por um péptido β-amilóide; ou g) Activação de um gene NF-κΒ numa célula.

15. 0 péptido, de acordo com as reivindicações 1 a 7, para tratamento de um sujeito com uma condição patológica associada a uma interacção entre um péptido β-amilóide com um receptor de produtos de glicação avançada, à superfície de uma célula, num sujeito, em que a condição patológica é diabetes, Doença de Alzheimer, senilidade, insuficiência renal, aterosclerose hiperlipidémica, citoxicidade neuronal, Síndroma de Down, demência associada a traumatismo craniano, esclerose amiotrófica lateral, esclerose múltipla, amiloidose, uma doença auto-imune, inflamação, um tumor, cancro, impotência masculina, cura de feridas, doença periodontal, neuropatia, retinopatia, nefropatia ou degeneração neuronal.

16. 0 péptido da reivindicação 15, em que a condição está associada à degeneração de uma célula neuronal.

17. 0 péptido da reivindicação 15, em que a condição está associada à activação de uma célula microglial por um péptido β-amilóide. Lisboa, 11 de Outubro de 2010.