ES2349894T3

ES2349894T3 - Nuevos medios y métodos para el tratamiento de la pérdida de la audición y la escucha de sonidos.

Info

Publication number: ES2349894T3
Application number: ES08004076T
Authority: ES
Inventors: Karl-Heinz Krause; Botond Banfi
Original assignee: Universite de Geneve
Current assignee: Universite de Geneve
Priority date: 2004-06-04
Filing date: 2005-06-06
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2025-06-06
Also published as: WO2005119251A3; US8088359B2; DK1923702T3; DE602005022948D1; US20090263323A1; ATE477485T1; US9650635B2; EP1602926A1; EP1766390A2; EP1923702A2; WO2005119251A2; US8722639B2; US20140356457A1; US20120252868A1; EP1923702B1; EP1923702A3

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende (a) Una siARN que enlaza específicamente un ácido nucleico que codifica una proteína NOX3, en donde dicha proteína NOX3 (i) incluye o consiste de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, o (ii) es codificada por un ácido nucleico que incluye o consiste de la secuencia de cualquiera de las SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 23 ó 24, o (iii) es un fragmento de la proteína NOX3 de acuerdo con (i) o (ii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa, o (iv) tiene una secuencia al menos 75% idéntica con la proteína NOX3 de acuerdo con (i) o (ii) o con el fragmento de acuerdo con (iii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa; y (b) un agente ototóxico seleccionado del grupo que consiste de salicilatos, antiinflamatorios no esteroideos, antibióticos, diuréticos, citostáticos, derivados de quinina y fármacos gastroprotectores.

Description

de
Esta invención se relaciona con un modulador una proteína NOX3 para uso en el tratamiento y/o prevención de la pérdida de la audición y/o la escucha de sonidos inexistentes, en donde dicha proteína NOX3 (i) incluye o consiste de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, o (ii) es codificada por un ácido nucleico que incluye o consiste de la secuencia de cualquiera de las SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 23 ó 24, o (iii) es un fragmento de la proteína NOX3 de acuerdo con (i) o (ii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa, o (iv) tiene una secuencia al menos 75% idéntica con la proteína NOX3 de acuerdo con (i) o (ii) o con el fragmento de acuerdo con (iii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa, y en donde dicho modulador es una siARN que enlaza específicamente a un ácido nucleico que codifica dicha proteína NOX3.

La discapacidad auditiva es una deficiencia sensorial severa y muy generalizada. Es la tercera discapacidad crónica más prevaleciente en el grupo de las personas con edad por encima de los 65, pero también se encuentra en personas más jóvenes. Un poco más del 1 por ciento de la gente por debajo de los 17 años tiene problemas auditivos, la prevalencia alcanza el 12 por ciento entre los 45 y los 64 años, hasta un 24 por ciento entre los 65 y los 74 años, y hasta un 39 por ciento para edades superiores a los 75 años. Existen tres causas principales de pérdida de la audición: pérdida de la audición causada por ruido, pérdida de la audición relacionada con medicamentos y pérdida de la audición relacionada con la edad. De manera muy interesante, parece existir un mecanismo común para estas tres causas principales de pérdida de la audición, a saber, destrucción del epitelio sensorial y especies oxigenadas reactivas a través de las neuronas cocleares. En términos de tratamiento, no existen hasta el momento tratamientos eficientes con fármacos o profilaxis para la pérdida de la audición y la única opción actualmente es el uso de audífonos. Esta situación se agrava más por la limitada comprensión del proceso molecular involucrado en la pérdida de la audición y la escasez de objetivos moleculares adecuados para intervención terapéutica.

El oído interno es una estructura altamente compleja involucrada en la audición y el equilibrio. La conversión de sonido en señales eléctricas se presenta dentro de la cóclea, en el órgano de Corti, y las señales eléctricas son conducidas por medio de los axones de las neuronas ganglionares en espiral hasta el cerebro. El movimiento lineal de la cabeza es detectado por los órganos otolitos (utrículo y sáculo) y los movimientos giratorios por las ámpulas de los canales semicirculares. Las señales generadas en el sistema vestibular son trasmitidas por las neuronas del ganglio vestibular al sistema nervioso central.

La discapacidad auditiva debida a la pérdida de la función coclear se presenta muy frecuentemente, si no es que invariablemente en el transcurso de la vida. El ruido y los compuestos químicos ototóxicos pueden conducir a una pérdida rápida y precoz de la audición, mientras que la edad conduce por si misma a una pérdida crónica más insidiosa de la audición. La investigación durante las últimas décadas ha identificado especies reactivas de oxígeno (ROS1) como el factor principal que media en la pérdida de la audición [1]. ROS se genera dentro de la cóclea después de una exposición a fármacos ototóxicos (por ejemplo cisplatina [2, 3], antibióticos aminoglicósidos [3])

o a ruido [4]. Las señales de estrés oxidativo, tales como daño del ADN y peroxidación de lípidos, han sido documentadas in vivo en respuesta a aquellos retos [5, 6], así como en el envejecimiento coclear [7]. El sistema vestibular también se daña por fármacos ototóxicos [8, 9] en un proceso que incluye la producción excesiva de una ROS [10, 11].

2 1Las abreviaturas utilizadas son: bp, pares de bases; DPI, difenilén yodonio; DUOX, dominio doble de oxidasa; 5-FU, 5-Fluorouracilo; GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; gp91phox , subunidad de glicoproteína de 91 kDa de la fagocito NADPH oxidasa; NOX, NADPH oxidasa; NOXA1, activador NOX 1; NOXO1, organizador NOX 1; PMA, forbol 12-miristato 13-acetato; PCR, reacción en cadena de la polimerasa; ROS, especie reactiva de oxígeno; RT-PCR, PCR de transcripción inversa; SOD, superóxido dismutasa. Aunque el papel del estrés oxidativo en el daño del oído interno está bien establecido, su fuentes poco conocida. Se ha sugerido el papel de generación no enzimática de una ROS por compuestos ototóxicos [12]. La posibilidad de poder localizar una enzima para generación de superóxido dentro del oído interno, y que por lo tanto cuente para el daño oxidativo de este órgano, ha recibido poca atención. Durante la última década, se ha probado que la expresión de NADPH oxidasas que generan superóxido no está restringida a fagocitos. Además de la subunidad catalítica bien conocida del fagocito NADPH oxidasa, gp91phox/NOX2 (para revisión ver [13]), se han identificado otras seis enzimas productoras de superóxido en mamíferos [14, 15]. Para la mayoría de enzimas NOX y DUOX, se ha descrito la localización predominante en el tejido, por ejemplo epitelio de colon para NOX1 [16, 17], corteza de riñón para NOX4 [18], órganos linfoideos y testículos para NOX5 [19], y la glándula tiroides para DUOX1 y DUOX2 [20, 21]. Para NOX3, con la excepción de algún nivel muy bajo de expresión en el riñón embrionario [22], no se ha encontrado una localización convincente en el tejido hasta ahora. Nuestro conocimiento de los mecanismos de activación de miembros de la familia NOX/DUOX varía considerablemente entre enzimas individuales. NOX1 y gp91phox/NOX2 son enzimas que dependen de una subunidad que requieren de un ensamblaje con una subunidad activadora (NOXA1 y p67phox, respectivamente) y una subunidad organizadora (NOXO1 y p47phox , respectivamente) para generar superóxido [23-26]. NOX5, DUOX1 y DUOX2, por otro lado, tienen motivos de enlazamiento de Ca2+ N terminal (dominios de mano EF), y hasta el momento uno de ellos, NOX5, se ha demostrado que se activa por una mayor concentración de Ca2+ [27]. El mecanismo de activación de NOX4 es menos claro. Hay indicios de que podría ser una enzima constitutivamente activa [18]. Tinnitus, también conocido como escucha de sonidos inexistentes, es una queja médica común y en algunos casos incapacitante. Actualmente, la patofisiología de la enfermedad es poco conocida y no se ha probado un tratamiento disponible de la causa. Existe sin embargo evidencia de que especies reactivas de oxígeno puedn jugar un papel en la patofisiología del tinnitus (Neri S. Tinnitus and oxidative stress in a selected series of elderly patients. Arch Gerontol Geriatr. 2002; 35 Suppl: 219 -23) y existen al menos algunos reportes que sugieren un efecto benéfico de medicamentos antioxidantes tales como el extracto de Gingko en el curso de la enfermedad (por ejemplo, Schneider D y colaboradores. Gingko biloba (Rokan) therapy in tinnitus patients and measurable interactions between tinnitus and vestibular disturbances. Int Tinnitus J. 2000; 6(1): 56 62). Por lo tanto, NOX3 puede estar involucrado también en la patofisiología de tinnitus y el uso de un modulador o inhibidor de NOX3 es un interesante concepto nuevo para el tratamiento de tinnitus. US-A1 20040001818 y WO-A1 0230453 describen métodos para inhibir angiogénesis, migración de células endoteliales o proliferación de células endoteliales utilizando inhibidores de NADPH oxidasa. EP-A2 1410798 describe una composición farmacéutica que incluye y utiliza inhibidores de la producción o la liberación de metabolitos reactivos de oxígeno (ROM) y de compuestos efectivos

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para depurar los ROM. Los usos están dirigidos a la fabricación de un medicamento para el tratamiento del Síndrome de Dificultad Respiratoria en Adultos (ARDS), isquemia o reperfusión, enfermedad infecciosa, enfermedades autoinmunes o inflamatorias, y enfermedades neurodegenerativas. Los compuestos efectivos para inhibir la producción o liberación enzimática de ROM incluyen inhibidores de NADPH oxidasa.

EP-A2 0914821 se relaciona con un método para el diagnóstico de aterosclerosis que involucra la medición de la actividad de NADPH oxidasa.

WO-A2 9719679 describe el uso de inhibidores de NADPH oxidasa para la fabricación de de un medicamento para la prevención de aterosclerosis.

US-A1 20040009901 se relaciona con un método para tratar un mamífero que tiene una condición autoinmune que involucra deficiencia de NADPH oxidasa. También, se describe un método para la identificación de un agente que refuerza la actividad de la NADPH oxidasa. WO-A2 02079224 se relaciona con péptidos y proteínas humanas que están relacionados con una subfamilia de NADPH oxidasa y métodos para identificar moduladores de los mismos. Las proteínas son descritas como sustancialmente similares a p47phox .

WO-A2 04007689 describe proteínas reguladoras para enzimas Nox, que se denominan como proteínas Nox p41, y secuencias de ácido nucleico que codifican estas proteínas. Además, se rescribe un método para identificar un compuesto que modula producción de superóxido, donde el método involucra la administración de la proteína. Las indicaciones médicas previstas se reflacionan con crecimiento y proliferación anormales e incluyen cáncer, hipertrofia prostática y aterosclerosis.

La entrada en la base de datos de proteínas NCBI Entrez NP_056533 incluye la secuencia de aminoácidos de NADPH oxidasa 3 humana (NOX3). La secuencia tiene 568 aminoácidos de longitud. La entrada de la base de datos se refiere a la similitud con gp91 phox. Paffenholz y colaboradores. (referencia 39) describe defectos vestibulares en ratones de cabeza ladeada resultantes de mutaciones en Nox3, que codifican una NADPH oxidasa. Borghi y colaboradores. (Medical Hypotheses 58, 399 402 (2002)) describe un posible papel de inhibidores de HMG-CoA reductasa para el tratamiento de la pérdida súbita de la audición neurosensorial (SSHL).

En vista de la limitada comprensión de los procesos que conducen a la pérdida de la audición y la escucha de sonidos inexistentes, el problema técnico fundamental de la presente invención fue por lo tanto el suministro de medios y de métodos para el desarrollo de medicamentos para el tratamiento de la pérdida de la audición y la escucha de sonidos inexistentes.

Por lo tanto, esta invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende

(a) un siARN que se enlaza específicamente con un ácido nucleico que codifica una proteína NOX3, en donde dicha proteína NOX3 (i) incluye o consiste de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, o (ii) es codificada por un ácido nucleico que incluye o consiste de la secuencia de cualquiera de las SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 23 ó 24, o (iii) es un fragmento de la proteína NOX3 de acuerdo con (i) o (ii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa, o (iv) tiene una secuencia al menos 75% idéntica con la proteína NOX3 de acuerdo con (i) o (ii) o con el fragmento de acuerdo con

(iii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa; y (b) un agente ototóxico seleccionado del grupo que consiste de salicilatos, antiinflamatorios no esteroideos, antibióticos, diuréticos, citostáticos, derivados de quinina y fármacos gastroprotectores. En una modalidad preferida de la composición farmacéutica, dicho agente ototóxico es un antibiótico aminoglicósido, preferiblemente gentamicina. En otra modalidad preferida de la composición farmacéutica, dicho agente ototóxico es un citostático, preferiblemente cisplatina. La invención proporciona además el uso de un modulador de una proteína NOX3 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de

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la pérdida de la audición y/o la escucha de sonidos inexistentes, en donde dicha proteína NOX3 (i) incluye o consiste de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, o (ii) es codificada por un ácido nucleico que incluye o consiste de la secuencia de cualquiera de las SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 23 ó 24, o (iii) es un fragmento de la proteína NOX3 de acuerdo con (i) o (ii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa, o (iv) tiene una secuencia al menos 75% idéntica con la proteína NOX3 de acuerdo con (i) o (ii) o con el fragmento de acuerdo con (iii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa, y en donde dicho modulador es un siARN que se enlaza específicamente con un ácido nucleico que codifica dicha proteína NOX3. También se suministra un modulador de una proteína NOX3 para uso en el tratamiento y/o la prevención de la pérdida de la audición y/o la escucha de sonidos inexistentes, en donde dicha proteína NOX3 (i) incluye o consiste de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, o (ii) es codificada por un ácido nucleico que incluye o consiste de la secuencia de cualquiera de las SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 23 ó 24, o (iii) es un fragmento de la proteína NOX3 de acuerdo con (i) o (ii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa, o (iv) tiene una secuencia al menos 75% idéntica con la proteína NOX3 de acuerdo con (i) o (ii) o con el fragmento de acuerdo con (iii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa, y en donde dicho modulador es un siARN que se enlaza específicamente con un ácido nucleico que codifica dicha proteína NOX3. Preferiblemente dicha pérdida de la audición es una pérdida de la audición relacionada con fármacos, rudo o con la edad.

El término "modulador" designa un compuesto que modula la actividad de una molécula objetivo, preferiblemente llevando a cabo uno o más de los siguientes efectos: (i) se modula la transcripción del gen que codifica la proteína que va a ser modulada, (ii) se modula la traducción del ARNm que codifica la proteína que va a ser modulada, (iii) la proteína lleva a cabo su función bioquímica con eficiencia modulada en presencia del modulador, y (iv) la proteína lleva a cabo su función celular con eficiencia modulada en presencia del modulador. De acuerdo con la invención, el modulador es el siARN como se define en las reivindicaciones.

El término "NADPH oxidasa" incluye cualquier NADPH oxidasa. Incluye enzimas NOX tales como NOX1, NOX2, NOX3, NOX4 y NOX5 así como enzimas DUOX tales como DUOX1 y DUOX2 (ver las referencias 13 a 27).

El término "compuesto principal" designa un compuesto que es un candidato para un fármaco y que puede requerir modificaciones químicas con el propósito de optimizar sus propiedades farmacológicas y eventualmente convertir se en un fármaco para ser formulado como un medicamento. Los métodos de optimización son conocidos en el arte y se los detalla adicionalmente más adelante.

El término "pérdida de la audición" de acuerdo con la invención abarca pérdida de la audición relacionada con fármacos, ruido y con la edad. La pérdida de la audición relacionada con la edad es denominada también como presbiacusia. El término "escucha de sonidos inexistentes", también conocida como "tinnitus", es una enfermedad médica común y en algunos casos invalidante.

El término "proteína" mencionada en la reivindicación principal se extiende a homólogos que tienen al menos 75% de identidad de secuencia. Preferiblemente, el nivel de identidad de secuencia es del 80% o 85%, más preferiblemente del 90% o 95%, y aún más preferiblemente del 98% o 99%. Con el propósito de determinar el nivel de identidad de secuencia, se pueden alinear dos secuencias de nucleótidos o de proteína electrónicamente utilizando programas adecuados de computador conocidos en el arte. Tales programas incluyen BLAST (Altschul y colaboradores. (1990), J. Mol. Biol. 215, 403 -410), variantes del mismo tales como WU-BLAST (Altschul & Gish (1996), Methods Enzymol. 266, 460 -480), FASTA (Pearson & Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 -2448) o

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implementaciones del algoritmo de Smith-Waterman (SSEARCH, Smith & Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195 -197). Estos programas, además de proporcionar una alineación por pares de la secuencia, también reporta el nivel de identidad de la secuencia (usualmente en porcentaje de identidad) y la probabilidad de que ocurra una alineación por casualidad (valor P). Se pueden utilizar

5 programas tales como CLUSTALW (Higgins y colaboradores. (1994), Nucleic Acids Res. 22, 4673 4680) para alinear más de dos secuencias.

A continuación se ejemplifican las interacciones de una NADPH oxidasa con sus subunidades para la NADPH oxidasa 3 (NOX3). La actividad de NOX3 requiere de una amplia distribución en la membrana de la subunidad NOX p22phox. Sin embargo, a saber, en ausencia de otras

10 subunidades citoplasmáticas, se presenta la generación de no de alto nivel, sino de bajo nivel de una ROS. En contraste, en presencia de la combinación de una subunidad activadora (ya sea NOXA1 o p67phox/NOXA2) y una subunidad organizadora (ya sea NOXO1 o p47phox/NOXO2) NOX3 es capaz de generar altos niveles de una ROS. Además, la actividad de NOX3 muy probablemente también involucra que esté siempre presente la proteína Rac para enlazamiento de GTP. Los sitios de

15 interacción entre las parejas están descritos en el siguiente esquema.

imagen1

Una interacción clave es el enlazamiento del dominio del activador de las subunidades

activadoras (aminoácidos 202 -212 para hNOXA1 y aminoácidos 200 -210 para hp67phox/NOXA2)

con NOX3. No es claro si existe una interacción directa de las subunidades organizadoras con NOX3,

20 pero existe una interacción indirecta con NOX3 a través del enlazamiento con p22phox por el dominio en tándem de SH3 (aminoácidos 158 -217 y 233 -289 para hNOXO1 y aminoácidos 156 -216 y 226 -286 para hp47phox/NOXO2) y a través del enlazamiento con un dominio de SH3 de la subunidad activadora (aminoácidos 402 -463 para hNOXA1 y aminoácidos 457 -513 para hp67phox/NOXA2) a través de su región rica en prolina (aminoácidos 321 -331 para hNOXO1 y 360 -370 para

25 hp47phox/NOX02). El sitio preciso de interacción entre NOX3 y p22phox, así como los sitios de interacción de Rac1 con NOX3 y las subunidades activadoras (NOXA1 o p67phox) no son conocidos. La siguiente tabla hace una recopilación de los sitios de interacción.

región de enlazamiento de la subunidad: objetivos

región activadora de la subunidad activadora (aa 202 -212 para hNOXA1 y aa 200 -210 para hp67phox/NOXA2);: NOX3

dominio en tándem de SH3 de la subunidad organizadora (aa 158 -217 y aa 233 -289 para hNOXO1 y aa 156 -216 y 226 -286 para hp47phox/NOXO2): p22phox

región de enlazamiento de la subunidad: objetivos

región rica en prolina de la subunidad organizadora (aa 321 -331 para hNOXO1 y 360 -370 para hp47phox/NOXO2): dominio de SH3 de la subunidad activadora (aa 402 -463 para hNOXA1 y aa 457 -513 para hp67phox/NOXA2)

Los métodos para cuantificar ROS son conocidos en el arte y están ejemplificados además en el Ejemplo 4 que se presenta más adelante. Los inventores demostraron por primera vez el alto nivel de expresión de la NADPH oxidasa 5 NOX3 en el oído interno. Por lo tanto, se proporciona una proteína adecuada como objetivo para intervención terapéutica en la pérdida de la audición y la escucha de sonidos inexistentes.

El epitelio sensorial vestibular y coclear desarrollados a partir de un engrosamiento común del ectodermo en la región de la cabeza, llamado placoda [34]. La placoda ótica también da lugar a las neuronas que formarán los ganglios del oído interno [35]. Los datos presentados en los Ejemplos y las

10 Figuras presentadas aquí sugieren que la expresión del ARNm de NOX3 puede seguir este patrón. Además, los inventores demostraron por primera vez que NOX3 es una enzima que genera superóxido. También se ha demostrado que el patrón de dependencia de la subunidad y del estímulo es distinto de otra familia NOX conocida de NADPH oxidasas. NOX3, en lugar de NOX1 y de NOX2, produce bajos niveles de superóxido después de la activación de PKC sin la necesidad de las

15 subunidades. Aunque se piensa que la activación del fagocito NADPH oxidasa ocurre a través de fosforilación que depende de PKC de p47phox [13], este, obviamente, no puede ser el mecanismo de la activación independiente de la subunidad de NOX3. En este punto, existen numerosas rutas posibles de cómo PKC puede activar NOX3 (por ejemplo, fosforilación directa de NOX3, activación de la pequeña proteína GTPasa Rac1, o cambios en el ambiente lipídico). La generación de una ROS en

20 forma independiente de la subunidad por parte de NOX3 es de bajo nivel en las células transfectadas. Teniendo en cuenta la localización de NOX3 en el oído interno, cerca o dentro de las células altamente sensible a la ROS, es tentador especular que una baja generación de superóxido en vez de una alta generación es el modo por defecto de la función de NOX3.

Sin embargo, se puede reforzar masivamente la actividad de NOX3 por medio del 25 organizador conocido NOX y de subunidades reguladoras/activadoras. Las búsquedas de bases de datos genómicas humanas y de ratón sugieren que probablemente no existen otros homólogos

de p47phox

cercanos y p67phox que NOXO1 y NOXA1, respectivamente. Por lo tanto, si NOX3 funciona in vivo en una forma que depende de la subunidad, tendría que utilizar subunidades de otras enzimas NOX. Con base en los datos de PCR mostrados en la Figura 2, NOX3 podría potencialmente

30 interactuar con NOXA1 y/o p47phox en el oído interno. Sin embargo, no puede excluirse que, bajo circunstancias específicas o en un número muy limitado de células, pueden expresarse otras subunidades de NOX en el oído interno.

En forma muy interesante, aunque no existe casi literatura sobre la función fisiológica de ROS en el oído interno, existe un número considerable de estudios sobre el efecto patológico de la 35 producción excesiva de una ROS en este órgano (para revisión ver [1] y [4]). Se ha demostrado en diferentes publicaciones que fármacos ototóxicos específicos (tales como derivados de platino o antibióticos de aminoglicósido) conducen a la acumulación de una ROS tanto en el sistema de la cóclea [3] como en el vestibular [8, 11, 36], y se ha demostrado que el trauma por ruido es una causa importante de la producción de una ROS en la cóclea [37]. Un incremento permanente en la 40 concentración de una ROS, por otra parte, conduce principalmente a la muerte de células epiteliales sensoriales, y, en menor medida, a la muerte de neuronas de inervación [1]. Con base en las

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sorprendentes observaciones presentadas aquí y que se relacionan con su localización y su capacidad para generar una ROS, es probable que NOX3 sea una fuente importante de ROS en el oído interno. La observación inesperada de que la cisplatina refuerza marcadamente la producción de superóxido que depende de NOX3, evoca la posibilidad de que NOX3 sea un mediador de la ototoxicidad que depende de cisplatina. La evolución temporal y de respuesta a la dosis de la activación de NOX3 que depende de cisplatina es compatible con la evolución temporal [2] y de respuesta a la dosis [38] de la toxicidad de la cisplatina para las células sensoriales del oído interno.

Dicho agente de ototoxicidad se selecciona del grupo que consiste de salicilatos, antiinflamatorios no esteroideos, antibióticos, diuréticos, citostáticos, derivados de quinina y fármacos gastroprotectores. Los salicilatos incluyen Aspirina y metil-salicilatos. Los antiinflamatorios no esteroideos incluyen diclofenaco, etodolac, fenprofeno, ibuprofeno, indometacina, naproxeno, piroxicam y sulindac. Los antibióticos preferidos son aminoglicósidos tales como amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina y tobramicina. Los antibióticos preferidos incluyen además eritromicina, vancomicina, minociclina, polimixina B, amfotericina B y capreomicina. Los ejemplos de diuréticos de acuerdo con la invención son bendroflumetazida, bumetadina, clortalidona, ácido etacrínico y furosemida. Los citostáticos, o fármacos antineoplásicos de acuerdo con la invención incluyen bleomicina, bromocriptina, carboplatino, cisplatina, metotrexato, mostaza nitrogenada, vinblastina y vincristina. Los derivados de quinina, que son utilizados como fármacos contra la malaria y contra la arritmia, incluyen fosfato de cloroquina, clorhidrato de quinacrina y sulfato de quinina. Misoprostol está entre los fármacos gastroprotectores previstos.

Dicha NADPH oxidasa es NOX3. Más específicamente, dicha NADPH oxidasa es la proteína NOX3 definida en la reivindicación 1.

Por "portador farmacéuticamente aceptable" se entiende un sólido no tóxico, semisólido o relleno líquido, diluyente, material de encapsulación o formulación auxiliar de cualquier tipo.

La presente invención se relaciona con una composición farmacéutica como la definida en la reivindicación.

Se pueden alinear dos secuencias de nucleótidos o de proteína electrónicamente utilizando programas adecuados de computador conocidos en el arte. Tales programas incluyen BLAST (Altschul y colaboradores. (1990), J. Mol. Biol. 215, 403 -410), variantes del mismo tales como WUBLAST (Altschul & Gish (1996), Methods Enzymol. 266, 460 -480), FASTA (Pearson & Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 -2448) o implementaciones del algoritmo de Smith-Waterman (SSEARCH, Smith & Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195 -197). Estos programas, además de proporcionar una alineación de la secuencia por pares, también reporta el nivel de identidad de la secuencia (usualmente en porcentaje de identidad) y la probabilidad de que se presente la alineación por casualidad (valor P). Se pueden utilizar programas tales como CLUSTALW (Higgins y colaboradores. (1994), Nucleic Acids Res. 22, 4673 -4680) para alinear más de dos secuencias.

La construcción de pequeños ARN de interferencia (siARN) (ver, por ejemplo Zamore Nat Struct Biol 2001, 8(9): 746 -50 o Tuschl T. CHEMBIOCHEM. 2001, 2: 239 -245) que escinden específicamente al (pre)-ARNm de un gen que contiene un ácido nucleico que codifica dicha proteína son también adecuados para la represión de la expresión. Las técnicas fundamentales para dicha represión de la expresión son bien conocidas en el arte. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden

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ser sintetizadas químicamente o transcritas por medio de un vector apropiado que contiene un gen quimérico que permite la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico en la célula.

De acuerdo con la presente invención, la composición farmacéutica incluye un agente ototóxico. Dicho agente ototóxico puede ser cualquier agente detallado aquí más arriba. Preferiblemente, dicho agente ototóxico es un medicamento, en donde dicho medicamento provoca ototoxicidad como efecto secundario. Por lo tanto, y en vista de la divulgación del mecanismo de ototoxicidad en esta solicitud, se provee una combinación terapéutica con un medicamento con efecto ototóxico secundarios y un siARN como se define en la modalidad principal. También se provee el uso de un agente ototóxico y un siARN como se definió anteriormente para la fabricación de una composición farmacéutica, en donde dicho siARN previene, alivia o cura el efecto ototóxico de dicho agente ototóxico.

En una modalidad preferida de dicha composición farmacéutica, dicho agente ototóxico es un antibiótico.

En una modalidad más preferida de dicha composición farmacéutica, dicho agente ototóxico es un antibiótico de aminoglicósido, preferiblemente gentamicina. Este tipo de terapia de combinación es particularmente apropiada para aquellas regiones o países donde son ampliamente utilizados antibióticos de aminoglicósido tales como gentamicina, debido a su bajo costo.

La presente invención también se relaciona con el uso de un modulador de la proteína NOX3 definida en la modalidad principal para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de la pérdida auditiva y/o la escucha de sonidos inexistentes, en donde dicho modulador es un siARN que enlaza específicamente un ácido nucleico que codifica dicha proteína NOX3. Dicho modulador es un inhibidor, más específicamente un siARN como se definió anteriormente.

El término "inhibidor" designa un compuesto que disminuye la actividad de una molécula objetivo, preferiblemente llevando a cabo uno o más de los siguientes efectos: (i) la disminución de la transcripción del gen que codifica la proteína que va a ser inhibida, (ii) se disminuye la traducción del ARNm que codifica la proteína que va a ser inhibida, (iii) la proteína realiza su función bioquímica con menor eficiencia en presencia del inhibidor, y (iv) la proteína realiza su función celular con menor eficiencia en presencia del inhibidor.

Los compuestos que caen en la clase (i) incluyen compuestos que interfieren con la maquinaria transcripcional y/o con su interacción con el promotor de dicho gen y/o con los elementos de control de la expresión lejos del promotor tal como los reforzadores. Los compuestos de clase (ii) incluyen construcciones antisentido y construcciones para realizar la interferencia del ARN bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo Zamore (2001) o Tuschl (2001)). Los compuestos de clase (iii) interfieren con la función molecular de la proteína que va a ser inhibida, en caso de una NADPH oxidasa con su actividad enzimática y/o su capacidad para asociarse con subunidades de NADPH oxidasa. Por lo tanto, están contemplados los compuestos que se enlazan al sitio activo, en particular compuestos capaces de enlazarse al sitio activo de cualquier NADPH oxidasa, ya que son compuestos que interfieren con la asociación de NADPH oxidasa con dichas subunidades. Se prefieren los compuestos que se enlazan específicamente con un sitio activo de NADPH oxidasa. También están contemplados los compuestos que se enlazan o que bloquean los sitios de enlazamiento del sustrato de NADPH oxidasa. La clase (iv) incluye compuestos que no se enlazan necesariamente directamente con NADPH oxidasa, pero que interfieren aún con la actividad de NADPH oxidasa, por ejemplo por medio del enlazamiento y/o la inhibición de la función o la inhibición de la expresión de miembros de

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una vía que incluye NADPH oxidasa. Estos miembros pueden estar ya sea en la parte de arriba o en la parte de debajo de la NADPH oxidasa dentro de dicha vía.

En una modalidad preferida, el inhibidor es un compuesto de bajo peso molecular. Los compuestos de bajo peso molecular son compuestos de origen natural o son compuestos sintetizados químicamente, preferiblemente con un peso molecular entre 100 y 1000, más preferiblemente entre 200 y 750, e incluso más preferiblemente entre 300 y 600.

La eficiencia del inhibidor se puede cuantificar por comparación del nivel de actividad en presencia del inhibidor con aquel en ausencia del inhibidor. Por ejemplo, como medición de la actividad se pueden utilizar: el cambio en la cantidad de ARNm formado, el cambio en la cantidad de proteína formada, el cambio en la cantidad de sustrato convertido o de producto formado, y/o el cambio en el fenotipo celular o en el fenotipo de un organismo.

En una modalidad preferida, el nivel de actividad es menor al 90%, más preferiblemente menor al 80%, 70%, 60% o 50% de la actividad en ausencia del inhibidor. Aún más preferidos son los inhibidores que disminuyen el nivel a menos del 25%, menos del 10%, menos del 5% o menos del 1% de la actividad en ausencia del inhibidor.

También se suministra un siARN que se enlaza específicamente con dicho ácido nucleico descrito más arriba.

Las Figuras muestran: Figura 1: Distribución en el tejido del ARNm de NOX3. A) Se evaluó la expresión del ARNm de NOX3 en 12 tejidos de rata por medio de RTPCR (panel superior); se utilizó ARNm de GAPDH como un transcripto de referencia (panel inferior). "No ADNc" representa un PCR de control negativo desprovisto de ADNc añadido. El primer carril de ambos paneles muestra marcadores de tamaño de ADN. B) Cuantificación del ARN de NOX3 en 14 tejidos de ratón utilizando PCR en tiempo real. La expresión de ARN de NOX3 es mostrada con relación a la expresión de ARNr 18S. Las cantidades de NOX3 y de productos PCR 18S fueron medida utilizando SYBR Green. Figura 2: Detección por PCR de los ADNc que codifican al activador de NOX y las subunidades reguladoras en el oído interno. A, amplificación por RTPCR de NOXA1, NOXO1, y el ADNc de referencia de GAPDH de los tejidos de rata indicados. B, amplificación por RTPCR del ADNc de p67phox y p47phox de los tejidos de rata indicados. El primer carril de cada panel muestra marcadores de tamaño de A DN. Figura 3: Expresión de ARNm de NOX3 en regiones específicas de la cóclea. Se obtuvieron regiones indicadas de oído interno de rata por medio de microdisección y se evaluó la expresión de NOX3 (panel superior) y GAPDH (panel inferior) por medio de RT-PCR. Los símbolos "+" representan muestras transcritas en forma inversa (RT positivo); los símbolos "-" representan muestras no transcritas en forma inversa (RT negativo). P0, P3, y P4 indican los días después del parto cuando se tomaron las muestras. Se aisló la muestra de oído interno de control positive de una rata adulta. Figura 4: Localización del ARNm de NOX3 en el oído interno por medio de hibridación in situ. Secciones de oído interno de ratón hibridadas con sondas sentido (B, D, y F) y antisentido (A, C, y E) marcadas con digoxigenina de NOX3, mostradas con aumentos 20 (A, B) y 40 (C-F). A, La sonda antisentido hibridada con el ARN de neuronas del ganglio espiral. B, La sonda sentido, solo se obtuvo una señal débil, uniforme y sin marcación de neuronas del ganglio espiral. C, La hibridación de sonda antisentido de NOX3 con el órgano de Corti marcó el epitelio sensorial. D, La hibridación de la sonda sentido de NOX3 con el órgano de Corti no produjo señales

10 específicas. E, Sonda antisentido de NOX3 hibridada con la capa de células epiteliales sensoriales del sáculo. F, Únicamente se observó una señal uniforme semanal con la sonda sentido de NOX3. Figura 5: Producción de superóxido que depende de NOX3 en ausencia de otras subunidades de NOX. Se transfectaron células HEK293 ya sea con un vector pcDNA3.1 o NOX3, y se midió la generación de superóxido como reducción de citocromo C (panel superior) o como quimioluminiscencia amplificada por luminol (panel inferior) en presencia o en ausencia de PMA 100 nM, como se indicó. El panel superior muestra el resultado de un solo experimento representativo de tres estudios independientes. El panel inferior muestra un análisis estadístico del pico de producción de superóxido. Se midieron las señales de quimioluminiscencia con unidades relativas de luz (RLU) y se normalizó en 1 segundo y 150.000 células. Figura 6: Regulación de la subunidad de actividad de NOX3. A, B, y C, Se transfectaron células HEK293 con diferentes combinaciones de NOX3, NOXO1, NOXA1, p47phox, y p67phox, como se indicó. Se midió la generación de superóxido como reducción de citocromo C sensible a SOD (líneas y símbolos) o como quimioluminiscencia amplificada con luminol (gráficas de barras) en presencia o en ausencia de PMA (100 nM), como se indicó. Las líneas y los símbolos muestran experimentos típicos, representativos de al menos tres estudios independientes. Las gráficas de barras muestran el análisis estadístico de la producción pico de superóxido. Se midieron señales de quimioluminiscencia con unidades relativas de luz (RLU) y se normalizó en 1 segundo y 150.000 células. Figures 7: La cisplatina refuerza la producción de superóxido que depende de NOX3. Se midió la producción de superóxido de células HEK293 transfectadas ya sea como quimioluminiscencia amplificada por luminol (B, D, E y F) o con un kit de detección de superóxido con base en luminol, Diógenes (A y C). Se incubaron previamente las células en presencia o en ausencia de cisplatina 20 µM después de 12 horas (A -E). A, Se transfectaron células HEK293 con NOX3 o con el vector de control (pcDNA3.1) y se incubó con o sin cisplatina antes de la medición de superóxido. Se añadieron PMA 100 nM y DPI 5 µM como se indicó. Las trazas representan un experimento típico, representativo de tres estudios independientes. B, Las células HEK293 que expresan en forma estable NOX3/NOXA1/NOXO1 fueron incubadas previamente con o sin cisplatina antes de la medición de superóxido. Se añadieron 5 µM de DPI como se indicó. Las trazas representan un experimento típico, representativo de ocho estudios independientes. C, Análisis estadístico de la producción pico de superóxido de células HEK293transfectadas con NOX3, después de tratamiento de control o con cisplatina, en presencia

o en ausencia de PMA 100 nM. D, Análisis estadístico de la producción pico de superóxido de células HEK293 transfectadas con las construcciones indicadas e incubadas previamente con o sin cisplatina. Se llevaron a cabo las mediciones en ausencia o en presencia de PMA 100 nM, como se indicó. E, Producción de superóxido de un clon de célula HEK293 transfectada en forma estable con NOX3/NOXO1/NOXA1 después de incubación con diferentes concentraciones de cisplatina durante 12 horas. F, Producción de superóxido de un clon de célula HEK293 transfectada en forma estable con NOX3/NOXO1/NOXA1 después de incubación en presencia o en ausencia de cisplatina 20 µM durante los períodos de tiempo indicados.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no deben ser considerados como limitantes de la misma.

Ejemplo 1

Clonación de ADNc de NOX3 de rata y de ratón

11 Procedimientos Experimentales. Se identificaron el primero y el último exones de genes de NOX3 de ratón y de rata con base en su homología con el gen de NOX3 humana utilizando el Ensembl Genome Browser (www.ensembl.org). Se aislaron muestras de oído interno de ratón (cepa C57BI6) y de rata (cepa Sprague-Dawley) y se purificó ARN total como se describió [28]. Se diseñaron iniciadores y se los utilizó para amplificar la longitud completa de secuencias de codificación (NOX3 de ratón hacia adelante 5 -atg ccg gtg tgc tgg att ctg aac -3’ e inversa 5’-cta gaa gtt ttc ctt gtt gta ata gaa -3’, NOX3 de rata hacia adelante 5’-gtg ttg gta gta aga gaa gtg tca tg -3’ e inversa 5’-c tag aag ttt tcc ttg ttg taa tag -3’) con Taq ADN polimerasa (Qiagen) bajo condiciones estándar. Se subclonaron los productos de la PCR en el vector pcDNA3.1 (Invitrogen) y se verificó por medio de secuenciación. Resultados. Hasta el momento, solamente se ha detectado ARNm de NOX3 en riñón embrionario humano, pero los nivele de expresión fueron muy bajos [22, 30] y por lo tanto cuestionable la relevancia fisiológica. Razonamos que la ubicación fisiológicamente relevante de NOX3 puede haberse perdido ya que estudios previos habían restringido su análisis a fuentes de ARN humano comercialmente disponible. Para superar estas limitaciones, decidimos trabajar en ratón y en rata y para preparar ARN a partir de tejidos que no habían sido investigados hasta el momento. Como hasta ahora se conocía únicamente la secuencia de NOX3 humana, identificamos los genes de NOX3 de ratón y de rata por medio de búsqueda en bases de datos de ADN genómico y se diseñaron -con base en estos resultados -iniciadores para PCR de NOX3 de ratón y de rata. Preparamos entonces ARN de una variedad de tejidos de ratón y de rata, incluidos hueso (fémur, cráneo, omóplato), cartílago (articulaciones de las costillas, oído externo), y oído interno y se los analizó por la expresión de NOX3 por medio de RT-PCR. Como se muestra en la Fig. 1A, se detectaron altos niveles de transcripto de NOX3 únicamente en la muestra de oído interno de rata (a pesar de su contenido relativamente bajo de ARNm demostrado por medio de la baja cantidad de producto PCR GAPDH). Utilizando pares de iniciadores diseñados a partir de del primero y del último exones del gen de NOV3 de rata y de ratón, respectivamente, amplificamos la longitud completa de las secuencias de codificación de NOX3 de rata y de ratón a partir de muestras de oído interno. Las secuencias predichas de aminoácidos de NOX3 tanto de rata como de ratón mostraron 81% de identidad de secuencia con la secuencia humana y 93,5% de identidad entre sí.

Ejemplo 2

Distribución en el tejido de NOX3

Procedimientos experimentales. Se aisló ARN total a partir de diferentes órganos de rata y de ratón y de regiones específicas de oído interno de la rata utilizando el reactivo TRlzol. Con excepción del ARN purificado de partes del oído interno, se trataron las muestras con ADNasa, luego se las purificó adicionalmente con el kit RNeasy (Qiagen). Se transcribieron en forma inversa 2 µg de ARN total de cada tejido utilizando transcriptasa inversa Superscript (Life Technologies, Inc.). Se llevó a cabo una PCR con Taq ADN polimerasa utilizando los siguientes iniciadores: NOX3 de ratón hacia adelante 5’-gtg ata aca ggc tta aag cag aag gc -3’, inverso 5’-cca ctt tcc cct act tga ctt tag -3’; NOX3 de rata hacia adelante 5’-gcg tgt gct gta gag gac cgt gga g -3’, inverso 5’-gag cct gtc cct ctg ctc caa atg c -3’; GAPDH de ratón hacia adelante 5’-ggg tgt gaa cca cga gaa at -3’, inverso 5’-gtc atg agc cct tcc aca at -3’; GAPDH de rata hacia adelante 5’-cgg tgt caa cgg att tgg ccg tat t -3’, inverso 5’-act gtg gtc atg agc cct tcc acg a -3’; NOXO1 de rata hacia adelante 5’-acc caa acc tct gga tct gga gcc c -3’, inverso 5’-gga tgg cac tca tac agg ggc gag t -3’; NOXA1 de rata hacia adelante 5’-tac tgg ccg tag cac gcg aag act g -3’, inverso 5’-gga cct ccc agg ctt gca gtt tga a -3’; p47phox de rata hacia adelante 5’-gca gga cct gtc gga gaa ggt ggt c -3’, inverso 5’-tct gtc gct ggg cct ggg tta tct c -3’; p67phox de rata hacia

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adelante 5’-aag cag aag agc agt tag cat tgg c -3’, inverso 5’-gga gtg cct tcc aaa ttc ttg gct g -3’. Su utilizaron condiciones estándar para la PCR, y el número de ciclos para la PCR fue de 30 (Fig. 1 y 2) ó 28 (Fig. 3) para la amplificación de GAPDH y 35 para todas las otras amplificaciones.

Se llevó a cabo una PCR cuantitativa utilizando un Sistema de Detección de Secuencias ABI Prism 7900HT con un protocolo estándar de temperatura y reactivo 2 x SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Worrington, RU) en un volumen de 25 µl, por triplicado. Se utilizaron 300 nM de los siguientes pares de iniciadores para las reacciones: 18S de ratón hacia adelante 5’-aca tcc aag gaa ggc agc ag -3’ e inverso 5’-ttt tcg tca cta cct ccc cg -3’; NOX3 de ratón hacia adelante 5’-cga cga att caa gca gat tgc -3’, e inverso 5’-aag agt ctt tga cat ggc ttt gg -3’. Se llevaron a cabo todas las amplificaciones en una placa óptica de reacción de 96 pozos MicroAmp con cubiertas ópticas adhesivas (PE Applied Biosystems). Se detectó la acumulación de productos de la PCR por medio del monitoreo del incremento en fluorescencia del colorante reportero. Resultados.

NOX3 se expresa predominantemente en el oído interno -con base en la secuencia de ADNc de NOX3 de ratón, diseñamos iniciadores para PCR en tiempo real para estudiar la expresión cuantitativa de ARN de NOX3en diferentes tejidos de ratón. Se utilizó ARN 18S como gen de referencia. Los resultados de la PCR en tiempo real demostraron que NOX3 se expresó predominantemente en el oído interno (Fig. 1 B). Se pudieron detectar también bajas cantidades de ARN de NOX3 en cráneo, cerebro, y riñón embrionario. Sin embargo, el oído interno contenía 50 veces el contenido de NOX3 de cráneo y 870 veces el de riñón embrionario (Fig. 1B).

Expresión de subunidades de NOX citoplasmático en el oído interno -NOX1 y p47phox)

gp91phox/NOX2 requieren de subunidades organizadoras citoplasmáticas (NOXO1, y subunidades activadoras (NOXA1, p67phox) para formar una enzima funcional. Ya que NOX3 muestra un alto grado de homología con NOX1 y gp91phox/NOX2 [31], consideramos que puede ser también una enzima que depende de la subunidad y por lo tanto se investigó la expresión de subunidades NOX citoplasmáticas en el oído interno. El análisis por medio de RT-PCR (utilizando 35 ciclos para la PCR) mostró que el ARNm de la subunidad activadora NOXA1, así como ARNm de la subunidad organizadora p47phox se expresó en el oído interno (Fig. 2). El ARNm de la subunidad activadora, p67phox, y la subunidad organizadora, NOXO1, se pudo detector únicamente con un número de ciclos muy alto (40 ciclos de la PCR; no se muestran los datos). Ya que el ARNm de p47phox se expresa en células fagocíticas, su detección puede ser debida a la contaminación de células sanguíneas. En contraste, NOXA1 no se expresa en células sanguíneas [24] ni en tejidos cercanos al oído interno (Fig. 2A); por lo tanto, lo más probable es que se expresen dentro de células del oído interno.

Expresión de NOX3 en diferentes partes de la cóclea -Con el propósito de identificar regiones del oído interno que expresan NOX3, aislamos diferentes partes de cóclea de rata tales como el órgano de Corti, estría vascular, y ganglios espirales de ratas recién nacidas (1 a 4 días después de nacidas) como se describió anteriormente [32]. Como tejido de control, utilizamos ganglios de la raíz dorsal. Se extrajo el ARN total de estos tejidos y se analizó la expresión del gen de NOX3 y del gen de mantenimiento de GAPDH por medio de RT-PCR. Los resultados muestran que NOX3 se expresa en ganglios en espiral y en el órgano de Corti, mientras que la estría vascular y los ganglios de la raíz dorsal carecían de ARNm de NOX3 (Fig. 3). Nuestros experimentos demostraron que i) NOX3 se expresa únicamente en estructuras seleccionadas de la cóclea (es decir el órgano de Corti y los ganglios espirales), y ii) su expresión no es una propiedad general del sistema nervioso periférico (es decir, estaba ausente de los ganglios de la raíz dorsal). Ejemplo 3

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Procedimientos experimentales. Para los experimentos de hibridación in situ se generaron sondas de ARNc sentido y antisentido marcadas con digoxigenina (control negativo) (nucleótidos 560 -849 de mNOX3) y utilizaron como se describió anteriormente [19] sobre secciones descalcificadas de oído interno de 7 µm de espesor.

Resultados. Para definir adicionalmente el sitio de expresión de NOX3, llevamos a cabo una hibridación in situ de secciones de oído interno de ratón adulto. La sonda antisentido de NOX3 etiquetó neuronas de ganglio espiral (Fig. 4A) y células del órgano de Corti (Fig. 4C). Las estructuras celulares dentro del órgano de Corti no estaban suficientemente bien preservadas para identificar en forma más precisa células que expresan NOX3. La sonda sentido produjo únicamente una señal de fondo débil y uniforme demostrando la especificidad de la hibridación antisentido (Fig. 4 B y D). Se observó también marcación específica para NOX3 en el sistema vestibular, es decir en la capa de células epiteliales sensoriales del sáculo (Fig. 4 E, F). Ejemplo 4 Medición de especies reactivas de oxígeno Procedimientos experimentales.

Cultivo de células y transfección -Se mantuvieron HEK293 en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco / Mezcla Nutriente de Ham F12 que estaba suplementado con suero de ternera fetal al 10%, penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 µg/ml), y 4 mmol/litro de L-glutamina. Se subclonaron los ADN de NOX3, NOXO1, NOXA1, p47phox, y los ADNc de p67phox en pcDNA3.1 (Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y se transfectó en células HEK293 con el sistema de transfección Effectene (Qiagen). Para obtener clones estables, se seleccionaron células HEK293 transfectadas con NOX3, NOXO1, NOXA1 con 400 µg/ml de G418 partiendo del segundo día después de la transfección. Después de 14 días de selección, se analizaron 24 clones supervivientes por la producción de superóxido. Se verificaron los clones positivos para expresar ARN de NOX3, NOXO1, y NOXA1 por medio de RT-PCR.

Se midió la generación de ROS por medio de la técnica de quimioluminiscencia amplificada con luminol que depende de peroxidasa (denominada como quimioluminiscencia amplificada con luminol) en microplacas de 96 pozos utilizando el Luminómetro Wallac 1420 Multilabel Counter (Perkin-Elmer Life Sciences). Las mediciones fueron realizadas en solución salina balanceada de Hanks suplementada con 1 mg/ml de D-glucosa, 1 unidad/ml de peroxidasa de rábano, y 250 µM de luminol. En algunos experimentos, se añadió éster de forbol (PMA) durante las mediciones hasta una concentración final de 100 nM. Cuando se investigó el efecto de la cisplatina o del 5-Fluorouracilo (5FU), se incubaron previamente estos compuestos con las células durante el tiempo y la concentración indicados en medio para cultivo de células. Antes de las mediciones de la ROS, se cambió el medio para cultivo de células con la solución del ensayo y se midió la quimioluminiscencia o absorción (ver más abajo) a 37 °C. Después de las mediciones se contaron las células, y se normalizaron los resultados para 150.000 células. Se midió la producción extracelular de superóxido en microplacas de 96 pozos a 550 nm como la reducción de sensibilidad de SOD de ferricitocromo C 100 µM (denominada como técnica de reducción de de citocromo). Se calculó la producción de O-2 utilizando un coeficiente de absorción de 21,1 mM-1 cm-1 y se normalizó hasta 107 células [29]. Resultados.

Generación de superóxido que depende de NOX3 en ausencia de subunidades -Para investigar su función molecular, expresamos en forma transitoria NOX3 en células HEK293, que no muestran expresión endógena de la enzima. Se midió la producción de superóxido con la técnica de

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reducción de citocromo C y con quimioluminiscencia amplificada con luminol. Utilizando cualquier técnica, la células transfectadas con NOX3 generaron bajas cantidades de superóxido, pero únicamente en presencia de un activador de proteína quinasa C (éster de forbol, PMA) (Fig. 5). Ya que tanto NOX1 como gp91phox/NOX2 tienen el requerimiento obligatorio de una subunidad, la actividad que depende del estímulo e independiente de la subunidad de NOX3 es una característica única y distintiva de esta isoforma de NOX.

Regulación de NOX3 por parte de las subunidades activadora y organizadora de NOX1 y gp91phox/NOX2 -Ya que se detectó la expresión de las subunidades activadora y reguladora de NOX en el oído interno (ver más arriba, Fig. 2), razonamos que pueden influenciar la actividad de NOX3. Por lo tanto, investigamos la generación de superóxido por NOX3 después de cotransfección con subunidades citoplasmáticas. En la primera serie de experimentos, se cotransfectó NOX3 con las subunidades citosólicas del fagocito de NADPH oxidasa, p67phox y p47phox. En estos transfectantes, se incrementó marcadamente la generación de superóxido que depende de NOX3, incluso sin ayuda de un estímulo (Fig. 6A). La adición de PMA, sin embargo, condujo a un fuerte reforzamiento de la

p47phox

actividad de NOX3 (Fig. 6A). Las células HEK293, transfectadas con y p67phox pero desprovistas de NOX3, no produjeron ningún superóxido (no se muestran). En forma muy interesante, p67phox solo, en ausencia de p47phox, fue suficiente para duplicar la generación de superóxido inducida por PMA de NOX3, mientras que p47phox, en ausencia de p67phox, no modificó la actividad de NOX3 (comparar la Fig. 5 con la Fig. 6A). Después se investigó si NOX3 podía ser regulado por las subunidades NOXO1 y NOXA1, que están asociadas con NOX1 en el colon. La cotransfección de NOX3 con NOXO1 y NOXA1 resultó en un incremento masivo de la producción de superóxido (Fig. 6B). La generación de superóxido mejorada por NOXO1/NOXA1 fue insensible a PMA (Fig. 6B). La coexpresión de NOXA1 con NOX3, en ausencia de NOXO1, tuvo un efecto reforzador sobre la actividad de NOX3 estimulada por PMA. NOXO1 solo, sin embargo, no influenció la producción de superóxido que depende de NOX3 (Fig. 6B, panel inferior).

Al menos a nivel bioquímico, existe promiscuidad entre las subunidades reguladora y organizadora: NOXO1 es capaz de funcionar con p67phox, y NOXA1 con p47phox [24 -26]. Por lo tanto, investigamos que combinaciones de subunidades activadora y organizadora son capaces de regular NOX3, y que tipo de propiedades pueden tener esos complejos. La expresión de NOXO1, p67phox, y NOX3 en células HEK293, condujo a la generación espontánea de superóxido que no pudo ser reforzada por PMA (Fig. 6C). Sin embargo, cuando p47phox, NOXA1, y NOX3 fueron expresados, la producción de superóxido por parte de las células HEK293 fue muy dependiente de PMA (Fig. 6C). Por lo tanto, la subunidad organizadora (p47phox versus NOXO1) determina si la actividad de NOX3 es dependiente o independiente de PKC.

La cisplatina refuerza la actividad de NOX3 -La cisplatina es un fármaco ototóxico que ejerce su efecto tóxico, al menos en parte, a través de la inducción de la generación de ROS en el oído interno [2]. Por lo tanto investigamos el efecto de este fármaco sobre la actividad de NOX3. Se transfectaron células HEK293 con NOX3 o con un vector de control (pcDNA3.1) y se incubó durante 12 horas en presencia o en ausencia de cisplatina 20 µM. La cisplatina sola provocó la producción de superóxido en células transfectadas con NOX3, pero no en células transfectadas con el control (Fig. 7A, ver las trazas antes de la adición de PMA y la Fig. 7C). La adición de PMA incrementó más la generación de superóxido, mientras que un inhibidor de NADPH oxidasa, yoduro de difenileno (DPI), la bloqueó completamente (Fig. 7A).

Cuando las células HEK293 fueron cotransfectadas con NOX3, NOXO1 y NOXA1, produjeron ROS en forma constitutiva (ver la Fig. 6B). Para investigar el efecto de cisplatina bajo

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estas condiciones, generamos clones de HEK293 que expresan en forma estable subunidades NOX3, NOXO1, y NOXA1. Estos clones produjeron superóxido en forma constitutiva y espontanea como se observa en los transfectantes transitorios. Después de la incubación con cisplatina 20 µM (12 horas), se detectó un marcado incremento de superóxido por medio de quimioluminiscencia amplificada con luminol (Fig. 7B y C), y también por reducción de citocromo C (no se muestra). La generación de superóxido fue insensible a PMA y podría ser abolido por DPI (Fig. 7B y D). Como control investigamos el efecto de otros fármacos quimioterapéuticos de 5-fluorouracilo, que están desprovistos de ototoxicidad; la incubación de células que expresan NOX3/NOXO1/NOXA1 con este compuesto (100 µM, 17 horas) no influenció la producción de superóxido (datos no mostrados). Las células HEK293 fueron cotransfectadas también con NOX3, p47phox, y p67phox, e incubadas con cisplatina 20 µM durante 12 horas. La cisplatina mejoró la producción de superóxido de células transfectadas con NOX3, p47phox, y p67phox por medio de un factor de aproximadamente 3.3 (Fig. 7D); esta producción de superóxido podría ser bloqueada por medio de la adición de DPI 5 µM (no se muestra).

A continuación se investigó la dependencia con la concentración y el tiempo del efecto de la cisplatina sobre la actividad de NOX3 utilizando un clon estable transfectado con NOX3/NOXO1/NOXA1. Después de incubar las células con diferentes concentraciones de cisplatina durante 12 horas, se midió la producción de superóxido (Fig. 7E). La cisplatina provocó un incremento en la generación de ROS que depende de NOX3 ya sea en una concentración de 1 µM, y la cisplatina 20 µM tuvo un efecto máximo (Fig. 7E). La EC50 de la activación de NOX3 por la cisplatina fue de 3,6 +/-1,4 µM.

Con el propósito de examinar el transcurso en el tiempo de la activación de NOX3 por la cisplatina, se incubó un clon estable transfectado con NOX3/NOXO1/NOXA1 con cisplatina 20 µM durante diferentes períodos de tiempo. La cisplatina reforzó la actividad de NOX3 ya después de 5 horas de tratamiento y alcanzó su efecto máximo alrededor de las 17 horas (Fig. 7F); la t50 fue de 11,5 +/-1,7 horas. Referencias Adicionales

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LISTADO DE SEQUENCIAS

<110> Universidad d Ginebra (Université de Genève)

<120> Nuevos medios y métodos para el tratamiento de la pérdida de la audición y la escucha de sonidos inexistentes.

<130> K1785 EP/1

<150> EP 04 01 3266.4

<151> 2004-06-04

<160> 26

<170> Patent In versión 3.1

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Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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[0069]

Claims

1. Una composición farmacéutica que comprende

(a): Una siARN que enlaza específicamente un ácido nucleico que codifica una proteína NOX3, en donde dicha proteína NOX3

(i): incluye o consiste de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, o

(ii): es codificada por un ácido nucleico que incluye o consiste de la secuencia de cualquiera de las SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 23 ó 24, o

(iii) es un fragmento de la proteína NOX3 de acuerdo con (i) o (ii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa, o

(iv) tiene una secuencia al menos 75% idéntica con la proteína NOX3 de acuerdo con

(i) o (ii) o con el fragmento de acuerdo con (iii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa; y

(b): un agente ototóxico seleccionado del grupo que consiste de salicilatos, antiinflamatorios no esteroideos, antibióticos, diuréticos, citostáticos, derivados de quinina y fármacos gastroprotectores.

2.: La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde dicho agente ototóxico es un antibiótico aminoglicósido, preferiblemente gentamicina.

3.: La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde dicho agente ototóxico es un citostático, preferiblemente cisplatina.

4.: El uso de un modulador de una proteína NOX3 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la pérdida de la audición y/o la escucha de sonidos inexistentes, en donde dicha proteína NOX3

(i): incluye o consiste de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5,o

(iv) tiene una secuencia al menos 75% idéntica con la proteína NOX3 de acuerdo con (i)

o (ii) o con el fragmento de acuerdo con (iii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa; y en donde dicho modulador es un siARN que enlaza específicamente un ácido nucleico que codifica dicha proteína NOX3.

5. Un modulador de una proteína NOX3 para uso en el tratamiento y/o la prevención de la pérdida de la audición y/o de la escucha de sonidos inexistentes, en donde dicha proteína NOX3

(i): incluye o consiste de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos:1, 3 ó 5, o

o (ii) o con el fragmento de acuerdo con (iii) y exhibe actividad de NADPH oxidasa,

114

y en donde dicho modulador es un siARN que enlaza específicamente un ácido nucleico que codifica dicha proteína NOX3.

6. El uso de la reivindicación 4 o del modulador de la reivindicación 5, en donde dicha pérdida de la audición es una pérdida de la audición relacionada con fármacos, ruido o con la edad.

“Siguen 10 páginas de dibujos”