ES2342155T3

ES2342155T3 - Uso de derivados 4-(4-tiazolil)fenoxialcoxi-benzamidina para el tratamiento de la osteoporosis.

Info

Publication number: ES2342155T3
Application number: ES02707300T
Authority: ES
Inventors: Hong-Suk Suh; Jin-Soo Lee; Pan-Soo Kim; Yun-Ha Hwang; Jei-Man Ryu; Yong-Ho Chung; Eun-Joo Kim; Do-Hui Kim; Yong-Youp Park
Original assignee: Dong Wha Pharm Co Ltd
Current assignee: Dong Wha Pharm Co Ltd
Priority date: 2001-07-19
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2010-07-02
Anticipated expiration: 2022-03-19
Also published as: EP1411935A1; US20100120875A1; JP4047275B2; HK1069771A1; CN100435794C; EP1411935B1; ZA200400331B; US8227496B2; US20040186150A1; EP1411935A4; JP2004537549A; WO2003007947A1; ATE468117T1; BR0211329A; CN1533275A; US7662840B2; KR20030008654A; CA2454022A1; KR100454767B1; DE60236438D1

Abstract

Uso de un compuesto de la fórmula 1 siguiente, **(Ver fórmula)** donde R es un átomo de hidrógeno y un grupo hidroxilo, o sus sales farmacéuticamente aceptables, en una cantidad eficaz para la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la osteoporosis.

Description

Uso de derivados 4-(4-tiazolil)fenoxi alcoxi-benzamidina para el tratamiento de la osteoporosis.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene derivados 4-[(4-tiazolil)-fenoxi]alcoxi benzamidina representados por la fórmula 1 siguiente para su uso en la prevención y tratamiento de la osteoporosis y, más en particular, a la composición farmacéutica que contiene 4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina (denominado a partir de ahora en este documento "DW1352") o N-hidroxi-4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina (denominado a partir de ahora en este documento "DW1350") representados por la fórmula 1 siguiente, que se notifica tiene un antagonismo con el receptor del leucotrieno-B4 (denominado a partir de ahora en este documento "LTB-4") para su uso en la prevención y tratamiento de la osteoporosis.

Fórmula 1

1

Donde, R es un átomo de hidrógeno y un grupo hidroxilo.

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Antecedentes de la técnica

El hueso es el material estructural del armazón del organismo y sirve para mantener la masa ósea y la estructura necesarias. El hueso contiene calcio (Ca^{2+}) y tiene una función importante para el mantenimiento del nivel de calcio en la sangre. Para este fin, el crecimiento del hueso es un equilibrio metabólico entre la actividad de los osteoblastos y de los osteoclastos en el ciclo de remodelación ósea.

Cuando el equilibrio entre la absorción ósea y la formación ósea se interrumpe, la cantidad de tejido óseo sustituido por los osteoblastos no coincide con la absorbida por los osteoclastos induciendo, por tanto, osteoporosis, una afección frecuente que produce pérdida de densidad ósea o masa ósea. Esta enfermedad aparece frecuentemente en mujeres de mediana edad o ancianas.

Hasta la fecha, la estrategia establecida ha sido producir fármacos capaces de prevenir la pérdida ósea inhibiendo la absorción ósea osteoclástica. Se han hecho intentos por desarrollar tratamientos alternativos, como antagonistas del receptor del LTB-4, pero su desarrollo hacia un fármaco antiosteoporótico eficaz ha sido infructuoso debido a la inhibición insuficiente de la absorción ósea osteoclástica. Por tanto, existe una necesidad urgente de nuevos tratamientos para la osteoporosis que tengan como objetivo suprimir la absorción ósea osteoclástica.

El derivado 4-[(4-tiazolil)-fenoxi]alcoxi-benzamidina, junto con su proceso de preparación, es ya conocido como un antagonista del receptor del leucotrieno-B4 (Lee Sung-eun, Síntesis y actividad biológica de productos naturales y nuevos compuestos híbridos diseñados para el tratamiento de la enfermedad relacionada con LTB-4, Tesis doctoral, Escuela de Estudios de Postgrado de la Universidad de Pusan, agosto de 1999).

El producto natural LTB-4 es un metabolito del ácido araquidónico que se forma a través de la ruta de la 5-lipoxigenasa [Ford Hutchinson, A.W. y col., Nature (Londres), 286, 264-265, 1980].

Los estudios recientes se han centrado en la influencia de los metabolitos del ácido araquidónico sobre el metabolismo del tejido óseo.

Se encuentra que los metabolitos de la 5-lipoxigenasa producidos por los osteoblastos estimulan la absorción ósea (Meghji, S. y col., Calcif. Tiss. Int. 36, 139-149, 1988); las células intersticiales C433 obtenidas a partir de un tumor de células gigantes están implicadas en la producción de metabolitos de la 5-lipoxigenasa para aumentar los recuentos y la actividad de los osteoblastos (Mundy, G. R., J. Bio. Chem. 268, 10087-10094, 1993); la función de absorción ósea puede ser estimulada con la adición de LTB-4 sintético durante el proceso de cultivo del tejido óseo (Bonewald, L.F., J. Bone Miner. Res. 11, 521-529, 1996) y estudios tanto in vitro como in vivo han mostrado que LTB-4 induce la absorción ósea mediante la producción de osteoclastos (Bonewald, L.F., J. Bone Miner. Res. 11, 1619-1627, 1996).

Actualmente, están en marcha muchos estudios con la noción de que algunos compuestos que muestran una acción antagonista frente al receptor LTB-4 pueden afectar a las enfermedades embólicas del tejido óseo.

Los inventores han realizado estudios intensivos para identificar varios compuestos de estructura diversa útiles como antagonistas eficaces del receptor de LTB-4, con el objetivo de suprimir la absorción ósea osteoclástica o de estimular la formación ósea osteoblástica. En consecuencia, se ha identificado que el derivado 3-amino-1,2-benzoisoxazol, representado por la fórmula 2 siguiente, es eficaz para la prevención y tratamiento de la osteoporosis mientras ejerce una acción antagonista frente al receptor LTB-4. Los inventores presentaron una solicitud de patente para este compuesto con fecha 4 de febrero de 1998 (KR 98-3139, cf. también US 6-150-390).

Fórmula 2

2

Donde, n es un número entero entre 3 y 5.

En un esfuerzo por identificar tratamientos alternativos para la osteoporosis, los inventores han probado la acción inhibidora de los derivados 4-[(4-tiazolil)-fenoxi]alcoxi-benzamidina como antagonistas del receptor de LTB-4; se encuentra que entre estos derivados, compuestos como 4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina o N-hidroxi-4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina son significativamente eficaces para prevenir la pérdida de hueso mediante la inhibición de la absorción ósea osteoclástica. Por tanto, la presente invención se ha completado finalmente.

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Descripción de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene 4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina o N-hidroxi-4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-ben-
zamidina representados por la fórmula 1 siguiente para su uso en la prevención y tratamiento de la osteoporosis.

Fórmula 1

3

Donde, R es un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo.

Los derivados 4-[(4-tiazolil)-fenoxi]alcoxi-benzamidina, pueden prepararse mediante el procedimiento convencional (Lee Sung-eun, Síntesis y actividad biológica de productos naturales y nuevos compuestos híbridos diseñados para el tratamiento de la enfermedad relacionada con LTB-4, Tesis doctoral, Escuela de Estudios de Postgrado de la Universidad de Pusan, agosto de 1999). Los compuestos de la presente invención representados por la fórmula 1 también pueden utilizarse como sales farmacéuticamente aceptables usando los materiales siguientes: ácidos inorgánicos (ácido clorhídrico, ácido brómico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico); ácidos orgánicos (ácido cítrico, ácido acético, ácido láctico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido oxálico, ácido trifluoroacético, ácido metanosulfónico, ácido benzóico, ácido maléico, ácido glucónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido 4-toluenosulfónico, ácido galacturónico, ácido embónico, ácido glutámico o ácido aspártico). Según la presente invención, se prefiere emplear ácido clorhídrico como ácido orgánico y ácido metanosulfónico como ácido orgánico.

La composición antiosteoporótica de la presente invención puede aplicarse en una dosis terapéuticamente eficaz a través de diversas rutas de administración. Cualquier persona que tenga un conocimiento ordinario en el campo técnico al cual pertenece la presente invención puede determinar cualquier forma de dosificación y régimen de administración dependiendo de la finalidad de la administración, vías de administración, gravedad de las enfermedades y peso corporal.

La composición antiosteoporótica de la presente invención contiene 4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina o N-hidroxi-4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-l)fenoxi]pentoxi}-benzamidina representados por la fórmula 1 siguiente y vehículos farmacéuticamente aceptables. Entre los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluirse cada tipo de vehículo farmacéutico convencional usado para las formas de administración convencionales, como solución estéril, comprimidos (incluso comprimidos recubiertos) y cápsulas. Entre los ejemplos típicos de dichos vehículo se incluyen algunos excipientes (p.ej., almidón, leche, azúcar, arcilla específica, gelatina, ácido esteárico, talco, grasa o aceite vegetal, goma, glicoles) u otros excipientes convencionales. Estos vehículos también pueden ser agentes aromatizantes, aditivos colorantes y otros materiales. La composición que contiene estos vehículos puede formularse mediante el método convencional.

La composición antiosteoporótica de la presente invención que contiene 4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina, N-hidroxi-4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-l)fenoxi]pentoxi}-benzamidina o sus sales, puede aplicarse mediante las rutas convencionales de administración (p.ej., por vía oral, intravenosa, intramuscular o transdérmica).

Se ha establecido una amplia gama de dosis terapéuticas de 4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina o N-hidroxi-4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-l)fenoxi]pentoxi}-benzamidina para la prevención y tratamiento de la osteoporosis. El nivel de dosis terapéutico para el tratamiento de la osteoporosis es de 10 a 1.000 mg diarios. Cualquier persona que tenga un conocimiento ordinario en el campo técnico al cual pertenece la presente invención puede determinar la dosis y la frecuencia de administración dependiendo de las características de un fármaco, gravedad de la enfermedad y peso corporal, tamaño de la inflamación y vías de administración.

Mejor modo de realización de la invención

La presente invención se explica con mayor detalle mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1

Efectos inhibidores sobre la diferenciación de osteoclastos de cada sustancia de ensayo

El efecto de cada sustancia de ensayo sobre la proliferación y el proceso de diferenciación de los osteoclastos se evaluó mediante cultivo simultáneo con osteoblastos.

1. Preparación de las células a) Preparación de las células de la médula ósea

Las tibias y los fémures se ectomizaron asépticamente a partir de ratones ddY machos de 6 a 8 semanas de edad para recoger las células de la médula ósea usando una jeringa (21G, Korea Green Cross).

Las células de la médula ósea se suspendieron en 5 ml de medio \alpha-MEM (Gibco BRL Co.) que contenía bicarbonato sódico (2,0 g/l), estreptomicina (100 mg/l) y penicilina (100.000 unidades/ml). Las células recogidas se centrifugaron a 800xg durante 5 minutos para recoger la cantidad completa. Para eliminar los eritrocitos de entre las células de la médula ósea, se añadieron 3 ml de Tris HCl (NH_{4}Cl al 0,83%, pH 7,5). Después de centrifugar las células anteriores, se hicieron recuentos de las células de la médula ósea y, a continuación, las células de la médula ósea se usaron inmediatamente en un sistema de cultivo simultáneo con osteoblastos.

b) Preparación de osteoblastos

Las bóvedas craneales se ectomizaron asépticamente a partir de ratones ICR neonatos de 1 a 2 días de edad, se lavaron con solución PBS y se incubaron con una mezcla de la solución enzimática (colagenasa al 0,2% y dispasa al 0,1%) a 37ºC con agitación suave. Este procedimiento se repitió de forma secuencial (10, 10, 10, 20, 20 y 20 minutos) y, a continuación, las células de las bóvedas craneales que presentaban características de osteoblastos se liberaron principalmente a partir de los grupos de digestión III y IV, se recogieron y lavaron con el medio (\alpha-MEM sin suero). Las células lavadas se cultivaron en medio \alpha-MEM que contenía suero fetal de ternera (SFT) al 10% durante 2 a 3 días. Después de distintos pases, estas células se usaron para este experimento y se diluyeron hasta alcanzar la concentración de 1 x 106 células/ml para su conservación a -70ºC.

2. Determinación de la diferenciación de los osteoclastos a) Preparación de la muestra

N-hidroxi-4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina (DW1350) y 4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina (DW1352) usados como sustancias de prueba de la presente invención y N,N-diisopropil-4-[4-(3-aminobenzo[d]isooxazol-6-iloxi)butoxi]-3-metoxibenzamida (denominado a partir de ahora en este documento "HS-1141") y ácido 4-[5-[4-(aminoiminometil)fenoxi]pentoxi]-3-metoxi-N,N-bis(1-metiletil)benzamida maleico (Morrissey, M. M., Suh, H., patente de EE.UU. nº 5.451.700; denominado a partir de ahora en este documento "CGS-25019C"), antagonistas del receptor de LTB-4 como controles se disolvieron en agua destilada estéril para obtener las concentraciones deseadas con la dilución siguiente: el volumen de la muestra final añadida al medio se determinó a una proporción de 1: 1000.

b) Reacción con las muestras a través del sistema de cultivo simultáneo

Las células de la médula ósea, preparadas de según el nº 1 anterior, y los osteoblastos de la bóveda craneal se cultivaron conjuntamente para obtener la diferenciación de osteoclastos. Las células de la médula ósea (25.000 células/cm^{2}) y los osteoblastos (10.000 células/cm^{2}) se colocaron en placas de 96 pocillos en medio \alpha-MEM que contenía SFT al 10% con la muestra y, a continuación, la mezcla de reacción se cultivó durante 7 días. También se añadieron continuamente al medio algunos factores de diferenciación, como dexametasona (10-6 M) y vitamina D3 (10-9 M) desde el primer día de cultivo. Los medios se cambiaron por medios recién preparados que contenían una mezcla de muestras y factores de diferenciación cada 2 ó 3 días.

c) Evaluación de la diferenciación de los osteoclastos 1) Preparación de la solución de tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP)

TRAP se usó como marcador para medir los osteoclastos en consideración de sus características, que muestran una reacción positiva a la solución de tinción TRAP. La solución de tinción TRAP se preparó de manera que se disolvieron 5 mg del sustrato naftol AS-MS fosfato (sigma N-4975) y 25 mg de agente colorante (sal de rojo violeta rápido LB) en N,N-dimetilformamida (aproximadamente 0,5 ml) y con la adición de solución tampón NaHCO3 0,1N (50 ml) que contenía 50 mM de ácido tartárico, la mezcla de reacción se conservó en el refrigerador antes de su uso.

2) Procedimiento de tinción

Después de 7 días de cultivo, el medio se retiró de los pocillos y, a continuación, las células se lavaron una vez con solución PBS y se fijaron con PBS que contenía formalina al 10% durante 2 a 5 minutos. Las células también se fijaron en una solución mezcla de etanol y acetona (1/1) durante aproximadamente 1 min y se secaron. Las células se trataron adicionalmente con solución de tinción TRAP durante 15 minutos y se lavaron con PBS para determinar los resultados experimentales con el grado de tinción de las células en un examen al microscópico.

3) Análisis de los resultados experimentales

Los recuentos de osteoclastos solo con más de tres núcleos que mostraban la reacción TRAP positiva se calcularon mediante examen al microscopio y cada prueba se confirmó tres veces para obtener datos más fiables.

Como se muestra en la tabla 1 a continuación, el efecto inhibidor de cada grupo experimental sobre la diferenciación de osteoclastos frente al control se expresó mediante el valor del porcentaje de inhibición y la concentración que inhibe el 50% de la diferenciación de los osteoclastos se calculó con IC50.

El efecto antiosteoporótico de cada sustancia de prueba se comparó con los controles, como CGS-25019C y HS-1141 (patente de EE.UU. nº 6150390 y solicitud de patente coreana nº 98-3138), un fármaco antiosteoporótico convencional perteneciente al mismo grupo que CGS-25019C, que muestra acción antagonista con respecto al receptor de LTB-4.

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TABLA 1

4

Como se muestra en la tabla 1, los resultados experimentales indican que el efecto inhibidor tanto de DW1350 como de DW1352 frente a la proliferación y diferenciación de osteoclastos era significativamente mejor que el de HS-1141 y CGS-25019C. Puede comprobarse que estas sustancias de prueba, que afectan a la diferenciación de los osteoclastos a concentración baja, son eficaces para la prevención y tratamiento de la osteoporosis.

Ejemplo 2

Ensayo de fusión

Este ensayo se diseñó para evaluar las influencias de cada sustancia de ensayo en términos de fusión de osteoclastos durante el proceso de diferenciación, en el que los osteoclastos prefusión inmaduros (OCp; estructura de los osteoclastos con más de un núcleo) se transformaban en osteoclastos maduros multinucleados (OCL) mediante la fusión célula a célula (Gregg Wesolowski y col. Experimental Cell Research 219, 679-686, 1995).

1. Preparación de osteoclastos prefusión (OCp)

Los osteoclastos prefusión pueden obtenerse mediante cultivo simultáneo de células de médula ósea y osteoblastos, como se preparó en el Ejemplo 1. La mezcla de ambas células, osteoblastos (aproximadamente 5 x 10^{5} células/placa) y células de la médula ósea (aproximadamente 1 x 10^{7} células/placa) se cocultivó en una placa de cultivo de 100 mm. Se añadieron a los medios varios factores de diferenciación, como dexametasona (10^{-6} M) y vitamina D_{3} (10^{-9} M) desde el primer día de cultivo. El medio se cambió por medio recién preparado que contenía factores de diferenciación cada 2 días.

Puesto que se formaron un gran número de osteoclastos prefusión que tenían uno o más núcleos en el proceso de fusión durante los 4 días de cultivo conjunto, las células se separaron del cultivo simultáneo después de 4 días. Se eliminó el medio de las células y con la adición de solución de colagenasa al 0,2% (4 ml), las células se incubaron a 37ºC durante 20 minutos para separar las células pegadas. Puesto que la mayoría de las células separadas eran osteoblastos, todos los osteoblastos se lavaron dos o tres veces con solución de PBS para su completa separación.

Después, el resto de los osteoclastos prefusión se separaron mediante reacción durante 20 minutos con la adición de equistatina que contenía BSA al 10%, las células se recogieron mediante centrifugación.

2. Experimento de reacción de fusión

Las sustancias de prueba diluidas a cada concentración se diluyeron a la concentración deseada en medio \alpha-MEM (adición de SFT al 10%) para cargarlas posteriormente en una microplaca de 96 pocillos en una dosis de 100 \mul por pocillo. Los monocitos osteoclásticos, separados según el nº 1 anterior, se colocaron en placas de 96 pocillos a dosis de 5 x 10^{3} células/\mul por pocillo y se cultivaron a 37ºC durante 24 horas dando lugar, de este modo, a la fusión de osteoclastos con éxito. En el caso de controles sin muestra y positivos, se realizaron experimentos de la misma forma descrita anteriormente. El control positivo utilizado para este experimento incluye 4-{4-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]butoxi}-benzamidina (denominado a partir de ahora en este documento "DW1351") y N-hidroxi-4-{4-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4 il)fenoxi]butoxi}-benzamidina (denominado a partir de ahora en este documento "DW1349") que tiene una estructura química similar a HS-1141, CGS-25019C, DW1350 y DW1352.

3. Determinación de la fusión de osteoclastos y su análisis

El medio se eliminó de las células y, a continuación, las células se lavaron una vez con PBS y se fijaron con una solución de PBS que contenía formalina al 10% durante aproximadamente 5 minutos. Las células se fijaron una vez más en una solución mezcla de etanol y acetona (1/1) durante aproximadamente 5 min y se secaron. Las células se trataron adicionalmente con solución de tinción TRAP durante 15 minutos y se lavaron con agua para su observación al microscopio. Se realizaron los recuentos de osteoclastos TRAP positivos, que se diferenciaron de monocito a células multinucleadas (osteoclastos que tienen más de 10 núcleos) mediante el proceso de fusión.

En la tabla 2 a continuación se muestran las diferencias de los recuentos celulares determinados frente al control como % de la concentración inhibidora.

TABLA 2

5

Como se muestra en la tabla 2, los resultados experimentales muestran que tanto DW1350 como DW1352 ejercían los efectos inhibidores significativos frente a la fusión de osteoclastos (IC_{50}: 0,81 y 0,74 \muM, respectivamente). Más específicamente, los efectos inhibidores de DW1350 y DW1352 frente a la fusión de osteoclastos hacen posible prevenir la formación de osteoclastos maduros que dará lugar a la inhibición significativa de la absorción ósea dependiente de osteoclastos. El control CGS-25019c mostró un pequeño efecto inhibidor frente a la fusión de osteoclastos, independientemente de las concentraciones del fármaco. El efecto inhibidor de HS-1141 frente a la fusión de osteoclastos era menor que el de DW1350 y DW1352, aunque este último era dependiente de las concentraciones del fármaco. En el caso de DW1349 y DW1352, que tienen una estructura extremadamente similar a DW1350 y DW13523, sus efectos inhibidores frente a la fusión de osteoclastos eran significativamente menores a los de DW1350 y DW1352, aunque el último dependía de las concentraciones del fármaco, como en el caso de HS-1141.

Por tanto, se prevé que entre los derivados 4-[(4-tiazolil)fenoxi]alcoxi-benzamidina, tanto DW1350 como DW1352 puedan desarrollarse como fármacos antiosteoporóticos inhibiendo de forma eficaz la formación de osteoclastos maduros en base al mecanismo inhibidor de la fusión de osteoclastos.

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Ejemplo 3

Determinación de la resorción ósea (ensayo de formación de caveolas)

El osteoclasto maduro (OCL) está implicado principalmente en la eliminación mineral mediante resorción ósea. Este experimento se diseña para medir los efectos inhibidores de cada sustancia de ensayo sobre la resorción ósea del osteoclasto usando un fragmento de marfil (Eijiro Jimi y col. Endocrinology 137, págs. 2.187-2.190, 1996).

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1. Preparación de osteoclastos maduros a) Preparación de solución en gel de colágeno

El sistema de cultivo simultáneo de células de médula ósea y osteoblastos se realizó usando una placa de cultivo que contenía gel de colágeno (matriz celular de tipo I-A). Se mezclaron colágeno, medio \alpha-MEM concentrado 5 veces y solución tampón NaOH 0,05M (NaHCO3 al 2,2%, pH 7,4) en una proporción 7:2:1 a baja temperatura y, a continuación, se conservó a baja temperatura. Después se añadieron 4 ml de la solución mezclada a una placa de cultivo de 100 mm, se aplicó de forma regular y se dejó a 37ºC durante 5 minutos.

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b) Preparación de osteoclastos maduros mediante el sistema de cultivo simultáneo

Usando medio \alpha-MEM, la mezcla de células de médula ósea (aproximadamente 1 x 107 células/placa) y osteoblastos (aproximadamente 5 x 105 células/placa), separados a partir del ejemplo 1, se colocó en una placa de 100 mm que contenía gel de colágeno. Los cultivos simultáneos se realizaron en presencia de factores de diferenciación, como vitamina D (10-9 M) y dexametasona (10-6 M). Como se describe anteriormente, se obtuvo un gran número de osteoclastos multinucleados maduros con la capacidad de resorción ósea mediante el cultivo simultáneo durante 7 días. Se eliminó el medio de las células y, con la adición de una solución de colagenasa al 0,2%, las células despegadas se separaron por incubación durante 20 minutos. Las células se recogieron mediante centrifugación. Los osteoclastos recogidos sin procesar se diluyeron de nuevo en medio \alpha-MEM hasta tener las células a 5.000 células/
100 \mul.

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2. Preparación de la solución de tinción de hematoxilina

La solución de tinción de hematoxilina se preparó de modo que la hematoxilina preparada (1 g) se disolvió en 500 ml de agua destilada y con la adición de 500 ml de agua destilada y yoduro sódico (0,2 g), la mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos. Posteriormente, se añadió a la mezcla de reacción aluminio y amonio sulfato dodecahidrato (50 g) y 7,5 ml de ácido acético y se filtró.

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3. Reacción sobre el fragmento de marfil

Después, los fragmentos de marfil se cortaron con un grosor de 1 mm, se esterilizaron, cada fragmento se colocó en una placa de 96 pocillos y, a continuación, se añadieron 100 \mul de medio \alpha-MEM (SFT al 10%). Para determinar su efecto inhibidor contra la formación de caveolas de osteoclastos, cada sustancia de prueba se añadió en una cantidad máxima de 3 \mul por concentración. Con la adición de las sustancias de prueba, se añadieron posteriormente 100 \mul de solución de osteoclastos, se mezclaron vigorosamente y se cultivaron usando un incubador de CO_{2} al 5% a 37ºC durante 24 horas. Para observar las caveolas formadas en los fragmentos de marfil, la porción de crecimiento de osteoclastos se colocó hacia arriba y se puso sobre un papel de cocina después de retirar los fragmentos de la placa de 96 pocillos. Con la separación de las células del marfil, se añadieron 10 \mul de solución de hematoxilina sobre el marfil para realizar la tinción durante aproximadamente 5 minutos. La superficie de los fragmentos de marfil se frotó con un bastoncillo de algodón suave para eliminar por completo la solución de colorante.

4. Observación y análisis de la formación de caveolas

En la tabla 3 siguiente se muestra el número de caveolas en los fragmentos de marfil frente al control como porcentaje de inhibición a diversas concentraciones mediante examen microscópico.

TABLA 3

6

Como se muestra en la tabla 3, los resultados experimentales muestran que tanto DW1350 como DW1352 ejercían el efecto inhibidor significativo frente a la resorción ósea de los osteoclastos. También se mostró que DW1350 y DW1352 presentaban valores de IC_{50} de 0,075 \muM y 0,131 \muM, respectivamente, efecto inhibidor de 3 a 6 veces superior que HS-1141. En el caso del control positivo CGS-25019c, este presentaba un efecto inhibidor bajo frente a la resorción ósea osteoclástica.

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Ejemplo 4

Evaluación de la actividad fosfatasa alcalina (ALP) para determinar la actividad de los osteoblastos

Este experimento se diseña para evaluar la diferenciación y actividad de los osteoblastos a través de la actividad ALP, que está relacionad de cerca con la formación ósea osteoblástica (Y. Wada y col., Bone, 22, 479-485, 1998).

Las células MC3T3-E1 (3.000 células/pocillo) derivadas de osteoblastos se colocaron en una placa de 96 pocillos y después de 24 horas de cultivo, los medios se cambiaron por medio recién preparado que contenía diversos factores de diferenciación, como ácido ascórbico (100 \mug/ml) y ácido \beta-glicerofosfato (5 mM). El medio también se trató con las sustancias de prueba y el medio, que contenía factores de diferenciación y muestra, se cambió por medio recién preparado cada 3 días.

El cultivo se dio por terminado después de dos semanas para determinar la actividad ALP. Con la eliminación del sobrenadante, se añadió Tritón X-100 al 0,5% para la lisis de las células. Se añadieron 100 \mul de p-nitrofenilfosfato (1,21 mM) a 50 \mul de la mezcla anterior. La mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos y la reacción se terminó con la adición de hidróxido sódico 0,2 M (50 \mul). La curva patrón estaba indicada a una absorbancia de 405 nm usando p-nitrofenol como material patrón y, a continuación, se determinó la absorbancia de las sustancias de prueba, cuando reaccionaban, para observar la producción de la cantidad de p-nitrofenol.

Como se muestra en la tabla 4 a continuación, las unidades de actividad ALP se determinaron como la cantidad de p-nitrofenol (nM) producido por tiempo (por minuto u hora)/1 \mug de proteína después de medir las cantidades de proteína contenidas en la mezcla de reacción de cada sustancia de prueba.

TABLA 4

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Como se muestra en la tabla 4, los resultados experimentales muestran que DW1350 ejercía la mayor actividad ALP entre todas las sustancias de prueba. También se encontró que las actividades ALP de DW1352 eran superiores a las de los controles HS-1141 y CGS-25019C. Este experimento ha indicado que tanto DW1350 como DW1352 son eficaces para estimular la actividad osteoblástica afectando a la diferenciación y formación de los osteoblastos. Por tanto, DW1350 y DW1352 son fármacos bastante útiles para la prevención y tratamiento de la osteoporosis, ya que pueden suprimir la función osteoclástica, al tiempo que estimula la actividad osteoblástica.

Aplicabilidad industrial

Los ejemplos mencionados anteriormente han mostrado que tanto DW1350 como DW1352, antagonistas del receptor de LTB-4, ejercen el mejor efector inhibidor frente a los osteoclastos en términos de diferenciación, formación, fusión y absorción ósea.

Puede comprobarse que ambos fármacos son eficaces para la prevención y tratamiento de la osteoporosis, ya que pueden suprimir la función osteoclástica potenciando la estimulación de la actividad osteoblástica, en comparación con DW1349 y DW1351 con similitud estructural, así como con HS-1141 y CGS-25019C.

Por tanto, se prevé que el compuesto de la presente invención puede proporcionar la base de nuevos tratamientos para la osteoporosis que tienen como objetivo suprimir la resorción ósea osteoclástica y estimular la formación ósea osteoblástica, incluso el tratamiento de las enfermedades relacionadas con LTB-4.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet KR 983138 [0010] [0030]

\bullet US 6150390 A [0010] [0030]

\bullet US 5451700 A, Morrissey, M. M., Suh, H. [0024]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bullet Synthesis and Biological Activity of Natural Products and Designed New Hybrid Compounds for the Treatment of LTB4 Related Disease. Lee Sung-eun. Ph. D thesis. Graduate School of Pusan Univ, August 1999 [0005] [0014]

\bulletFord-Hutchinson, A. W. et al. Nature (London), 1980, vol. 286, 264-265 [0006]

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\bulletBonewald, L. F. J. Bone Miner. Res., 1996, vol. 11, 521-529 [0008]

\bulletBonewald, L. F. J. Bone Miner. Res., 1996, vol. 11, 1619-1627 [0008]

\bullet Gregg Wesolowski et al. Experimental Cell Research, 1995, vol. 219, 679-686 [0032]

\bullet Eijiro Jimi et al. Endocrinology, 1996, vol. 137, 2187-2190 [0041]

\bullet Y. Wada et al. Bone, 1998, vol. 22, 479-485 [0048]

Claims

1. Uso de un compuesto de la fórmula 1 siguiente,

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donde R es un átomo de hidrógeno y un grupo hidroxilo, o sus sales farmacéuticamente aceptables, en una cantidad eficaz para la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la osteoporosis.

2. El uso del compuesto según la reivindicación 1, en el que el compuesto es N-hidroxi-4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina o sus sales farmacéuticamente aceptables.

3. El uso del compuesto según la reivindicación 1, en el que el compuesto es 4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina o sus sales farmacéuticamente aceptables.

4. El uso del compuesto según la reivindicación 2, en el que el compuesto es metanosulfonato de N-hidroxi-4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina.

5. El uso del compuesto según la reivindicación 3, en el que el compuesto es clorhidrato de 4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina.

6. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la fórmula 1 siguiente,

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donde R es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o sus sales farmacéuticamente aceptables, en una cantidad eficaz y un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en la prevención o tratamiento de la osteoporosis.

7. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 6, en el que el compuesto es N-hidroxi-4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina o sus sales farmacéuticamente aceptables.

8. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 6, en el que el compuesto es 4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina o sus sales farmacéuticamente aceptables.

9. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 7, en el que el compuesto es metanosulfonato de N-hidroxi-4-{5-[4-(5-isopropil-2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina.

10. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 8, en el que el compuesto es clorhidrato de 4-{5-[4-(5-isopropil2-metil-1,3-tiazol-4-il)fenoxi]pentoxi}-benzamidina.