ES2341174T3 - Nueva proteina de fijacion del fosfato, composiciones farmaceuticas que lo contienen y sus utilizaciones. - Google Patents

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ES2341174T3 ES04805350T ES04805350T ES2341174T3 ES 2341174 T3 ES2341174 T3 ES 2341174T3 ES 04805350 T ES04805350 T ES 04805350T ES 04805350 T ES04805350 T ES 04805350T ES 2341174 T3 ES2341174 T3 ES 2341174T3
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Carlos Contreras-Martel
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Abstract

Proteína, caracterizada porque comprende o está constituida por: - la secuencia SEC ID nº 1, o - cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 1, que tiene una homología de por lo menos 80% con la secuencia SEC ID nº 1, con la condición de que dicha secuencia homóloga se una al fosfato.

Description

Nueva proteína de fijación del fosfato, composiciones farmacéuticas que lo contienen y sus utilizaciones.
La presente invención tiene por objeto una nueva proteína, procedente del suero humano, de fijación del fosfato, unas composiciones farmacéuticas que la contienen, así como sus utilizaciones, en particular en el marco del tratamiento de la hiperfosfatemia y de las enfermedades cardiovasculares o de la artritis.
El fosfato es una molécula muy importante implicada en numerosos mecanismos biológicos. El fosfato se encuentra en particular en los fosfolípidos, en el mecanismo de producción de energía (ATP, ADP), en los procesos de señalización celular, en la composición del material genético en los huesos (en forma de fosfato de calcio).
La hiperfosfatemia es una patología relacionada con un exceso de fosfato en el organismo y provoca en particular un aumento de los riesgos de enfermedades cardiovasculares, favoreciendo los procesos de ateroesclerosis y de calcificación de las arterias (Dorozhkin y Epple, 2002; Amann et al., 2003; Blazheevich et al., 1975). Efectuándose la calcificación a nivel de las articulaciones, la hiperfosfatemia puede asimismo provocar artritis (pseudo-gota).
Las sales de fosfato de calcio producidas en el suero durante una hiperfosfatemia precipitan en los tejidos blandos con calcificación ectópica en diferentes tejidos: vasos (accidentes vasculares cerebrales o cardiacos), articulaciones (pseudo-gota), cristalino, intersticio renal (nefrocalcinosis), subcutáneas (prurito), pulmonares, pancreáticas.
De esta manera, la mitad de los fallecimientos en las personas que padecen insuficiencia renal se debe a unas enfermedades cardiovasculares relacionadas con la hiperfosfatemia. A este respecto, ciertos quelantes del fosfato que complejan el fosfato en la luz intestinal se utilizan actualmente como medicamento. Sin embargo, todos estos quelantes no son fisiológicos. Por ello se derivan ciertas complicaciones o restricciones en cuanto a su utilización.
Las preparaciones que contienen magnesio están limitadas por la aparición de trastornos digestivos (diarrea) y se deben prohibir debido al riesgo de hipermagnesemia. Asimismo, la prescripción de hidróxido de aluminio, utilizado durante mucho tiempo debido a su eficacia, se debe evitar, o por lo menos limitar a periodos muy cortos, debido al riesgo de intoxicación alumínica (anemia hipocroma microcitaria, osteomalacia, miopatía, demencia).
La prescripción de sales de calcio es el mejor medio para corregir al mismo tiempo la hipocalcemia y la hiperfosforemia, permitiendo por un lado aumentar la cantidad de calcio absorbido por el intestino delgado a pesar del déficit en calcitriol y, por otro lado complejar el fósforo en la luz intestinal en forma de fosfato de calcio que se eliminará en las heces. Sin embargo, el inconveniente principal de los quelantes que contienen calcio es que inducen una hipercalcemia que, en ciertas series, ha podido ser observada en 20% de los enfermos. Este riesgo ha conducido a realizar otros productos capaces de limitar la hiperfosforemia.
El medicamento más utilizado actualmente es el Renagel® (Ramsdell; 1999). Se trata de un polímero catiónico, no absorbible capaz de quelatar el fosfato.
La presente invención tiene por objetivo proporcionar un nuevo quelante proteico fisiológico que se une al fosfato, que no necesita la utilización de otros iones que pueden provocar unas complicaciones, y que ofrece perspectivas más amplias de utilización que los quelantes actuales.
La presente invención se refiere a una proteína, caracterizada porque comprende o esta constituida por:
-
la secuencia SEC ID nº 1, o
-
cualquier secuencia derivada de la secuencia SEC ID nº 1, en particular mediante sustitución, supresión o adición de uno o varios aminoácidos, con la condición de que dicha secuencia derivada se una al fosfato, o
-
cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 1, que tiene preferentemente una homología de por lo menos aproximadamente 80% con la secuencia SEC ID nº 1, con la condición de que dicha secuencia homóloga se una al fosfato, o
-
cualquier fragmento de una de las secuencias definidas anteriormente, con la condición que dicho fragmento se una al fosfato, en particular cualquier fragmento que está constituido por lo menos por aproximadamente 20 aminoácidos contiguos en la secuencia SEC ID nº 1.
La presente invención se refiere a una proteína tal como se ha definido anteriormente, caracterizada porque comprende o está constituida por:
-
la secuencia SEC ID nº 2 o la secuencia SEC ID nº 3, o
-
cualquier secuencia derivada de la secuencia SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, en particular mediante sustitución, supresión o adición de uno o varios aminoácidos, con la condición de que dicha secuencia derivada se una al fosfato, o
-
cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, que tiene preferentemente una homología de por lo menos aproximadamente 80% con la secuencia SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, con la condición de que dicha secuencia homóloga se una al fosfato, o
-
cualquier fragmento de una de las secuencias definidas anteriormente, con la condición de que dicho fragmento se una al fosfato, en particular cualquier fragmento constituido por lo menos por aproximadamente 20 aminoácidos contiguos en la secuencia SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3.
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La secuencia SEC ID nº 2 corresponde a la proteína humana de fijación del fosfato. Esta nueva proteína ha sido aislada en el plasma humano y su estructura tridimensional muestra que pertenece a la clase de los "phosphate binding protein" (proteínas de fijación del fosfato: PBP). Se denominará asimismo a continuación HPBP (proteína humana de fijación del fosfato).
La secuencia SEC ID nº 3 corresponde a una proteína homóloga de la proteína de secuencia SEC ID nº 2, que presenta un porcentaje de identidad de aproximadamente 90% con la secuencia SEC ID nº 2, y que presenta las mismas propiedades de fijación al fosfato que la secuencia SEC ID nº 2.
La propiedad de fijación del fosfato de las secuencias de la invención se pueden verificar mediante el ensayo siguiente de fijación del fosfato mediante marcaje radioactivo:
La proteína se fija sobre una membrana de nitrocelulosa (dot blot por aspiración). Se deja incubar la membrana en un tampón radioactivo (^{32}P (10 mCi/ml, Amersham-Biosciences) 2M; Tris 50 mM; pH 8,0)
La membrana se aclara rápidamente 2x1 minuto en un tampón de Tris 50 mM, pH 8,0. Exponiendo una película fotográfica con la membrana (aproximadamente 45 minutos) se pueden detectar las zonas que fijan el fosfato radioactivo (véase la figura 3 siguiente).
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La presente invención se refiere asimismo a una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína tal como se ha definido anteriormente.
La presente invención se refiere asimismo a un vector recombinante, en particular plásmido, cósmido, fago o ADN de virus, que contiene una secuencia nucleotídica tal como se ha definido anteriormente.
Según un modo de realización ventajoso, la presente invención se refiere a un vector recombinante tal como se ha definido anteriormente, que contiene los elementos necesarios para la expresión en una célula hospedante de los polipéptidos codificados por la secuencia nucleotídica tal como se ha definido anteriormente, insertada en dicho
vector.
La presente invención se refiere asimismo a una célula hospedante, seleccionada en particular de entre las bacterias, los virus, las levaduras, los hongos, las plantas o las células de mamíferos, siendo dicha célula hospedante transformada, en particular con la ayuda de un vector recombinante tal como se ha definido anteriormente.
La presente invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica que comprende a título de sustancia activa, una proteína tal como se ha definido anteriormente, en particular SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica tal como se ha definido anteriormente, en la que la proteína de la invención, en particular SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, está en asociación con una variante de la proteína paraoxonasa, que tiene una actividad de hidrólisis del paraoxón.
Entre las variantes de la paraoxonasa, se pueden citar las variantes PON1, PON2, PON3, de origen humano o no, tales como SEC ID nº 4 (PON1 humana; Hassett et al., 1991), SEC ID nº 5 (PON2 humana; Primo-Parmo et al., 1996), SEC ID nº 6 (PON3 humana; Reddy et al., 2001), SEC ID nº 7 (PON1 de conejo; Hassett et al., 1991), SEC ID nº 8 (PON1 de rata; Rodrigo et al., 1997), SEC ID nº 9 (PON1 de ratón; Sorenson et al., 1995), SEC ID nº 10 (PON2 de ratón; Primo-Parmo et al., 1996) y SEC ID nº 11 (PON3 de ratón; Primo-Parmo et al., 1996).
La presente invención se refiere asimismo a la utilización de una proteína tal como se ha definido anteriormente, en particular SEC ID nº 2 y SEC ID nº 3, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de enfermedades relacionadas con una hiperfosfatemia, tales como las enfermedades cardiovasculares y la artritis (pseudo-gota).
El término "hiperfosfatemia" designa un exceso de fosfato en el organismo. Más exactamente, la hiperfosfatemia se define por un aumento de la concentración plasmática de fosfato por encima de 1,44 mmoles/l (45 mg/l), siendo dicha cantidad obtenida mediante dosificación del fosfato total (la dosificación mediante el método colorimétrico se lleva a cabo después de un procedimiento de mineralización).
Según un modo de realización ventajoso, la proteína de la invención podrá ser administrada en forma intravenosa para poder fijar una cantidad máxima de fosfato durante largos periodos, del orden de la semana. Eliminando ulteriormente la proteína, se eliminará así una gran cantidad de fosfato rápidamente. Esto permite espaciar y disminuir los tiempos de diálisis.
La presente invención se refiere más particularmente a la utilización de una proteína tal como se ha definido anteriormente, en particular SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, en el marco de la prevención o del tratamiento de las enfermedades cardiovasculares.
La presente invención se refiere asimismo a la utilización de una proteína según la invención, en particular de la proteína representada por la secuencia SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, en asociación con una proteína tal como una variante de la proteína paraoxonasa, en el marco de la profilaxis o del tratamiento de las intoxicaciones provocadas por unos insecticidas o unos agentes neurotóxicos, tales como el soman, el VX, el tabun o el sarin, o en el marco del tratamiento de la ateroesclerosis.
La presente invención se refiere asimismo a un producto de combinación que comprende por lo menos una proteína tal como se ha definido anteriormente, en particular SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, y por lo menos una variante de la proteína paraoxonasa, para una utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo, destinado a la profilaxis o al tratamiento de las intoxicaciones provocadas por unos insecticidas o unos agentes neurotóxicos, tales como el soman, el VX, el tabun o el sarin.
La utilización combinada de la proteína de la invención, en particular SEC ID nº 2, con una variante de la proteína paraoxonasa, permite aumentar la estabilidad de la paraoxonasa, en particular en el marco de la profilaxia o del tratamiento de las intoxicaciones provocadas por unos insecticidas o unos agentes neurotóxicos.
La presente invención se refiere asimismo a un método de dosificación de la proteína tal como se ha definido anteriormente, caracterizada porque comprende las etapas siguientes:
-
unos anticuerpos monoclonales de conejo dirigidos contra diferentes epítopos de la proteína de la invención (anti-HPB) se fijan sobre una placa, y el suero humano a analizar que contiene dicha proteína (HPB) se deposita sobre la placa mencionada anteriormente,
-
la placa se aclara y se lava,
-
se depositan sobre la placa unos anticuerpos anti-anticuerpo de conejo (anti-lGrabbit-per) marcados con peroxidasa durante 30 minutos, con el fin de formar un complejo ternario entre un anticuerpo monoclonal de conejo, la proteína según la invención y un anticuerpo anti-anticuerpo de conejo mencionado anteriormente (anti-HPB - HPB - anti-lGrabbit-per),
-
la placa se aclara y se lava,
-
se hace reaccionar la peroxidasa fijada sobre la placa con su sustrato (kit disponible en el comercio, Chemiluminescent Peroxidase Substrate (Sigma)), y la reacción se detiene al cabo de 30 minutos con la 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB, Sigma),
-
la densidad óptica del producto formado en la etapa anterior se mide a 450 nm con la ayuda de un espectrómetro, y la comparación de esta medida con una curva patrón permite determinar la concentración de la proteína según la invención (HPB) presente en el suero.
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De esta forma, el método de dosificación mencionado anteriormente utiliza un método de inmunodosificación del tipo ELISA (Engvall et al., 1971).
Se pueden utilizar otros métodos para dosificar la concentración de la proteína de la invención en el plasma, tales como:
-
los métodos electroforéticos, o
-
la cuantificación de su actividad.
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La presente invención se refiere asimismo a la aplicación del método de dosificación tal como se ha definido anteriormente
para el diagnóstico in vitro de enfermedades relacionadas con una hiperfosfatemia en particular cuando la cantidad de proteína tal como se ha definido anteriormente, en particular SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, dosificada según el método tal como se ha definido anteriormente, es inferior a la cantidad de esta proteína normalmente presente en la sangre de un individuo sano, o
para el diagnóstico in vitro de enfermedades relacionadas con una hipofosfatemia en particular cuando la cantidad de proteína tal como se ha definido anteriormente, en particular SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, dosificada según el método tal como se ha definido anteriormente, es superior a la cantidad de esta proteína normalmente presente en la sangre de un individuo sano, o
para el diagnóstico in vitro de una predisposición de un individuo a dichas patologías.
El índice de la proteína según la invención es un indicador de predisposición a un riesgo de enfermedad cardiovascular. De esta manera, las personas que tienen un índice bajo de dicha proteína tendrán un índice más importante de fosfato libre que precipitará con el calcio del plasma para formar unas placas de fosfato de calcio, lo que es un factor que agrava en particular los riesgos de enfermedades cardiovasculares o de artritis.
Un índice anormal de esta proteína es asimismo la señal de una patología existente. Por ejemplo una hiperfosfatemia puede iniciar una producción aumentada de proteína con el objetivo de limitar el índice de fosfato. Un índice bajo puede ser asimismo revelador de una disfunción.
La presente invención se refiere asimismo a la aplicación tal como se ha definido anteriormente al diagnóstico in vitro de enfermedades relacionadas con una hiperfosfatemia tales como las enfermedades cardiovasculares, en particular las enfermedades cardiovasculares relacionadas con la formación de placas de ateromas, o al diagnóstico in vitro de una predisposición de un individuo para desarrollar una de las enfermedades mencionadas anteriormente.
La presente invención se refiere asimismo a la aplicación tal como se ha definido anteriormente al diagnóstico in vitro de enfermedades relacionadas con una hipofosfatemia, o al diagnóstico in vitro de una predisposición de un individuo para desarrollar estas enfermedades.
Entre las señales clínicas o fisiológicas que caracterizan las enfermedades relacionadas con una hipofosfatemia, se pueden citar:
-
una desmineralización de los huesos,
-
las manifestaciones musculares de la hipofosfatemia que comprenden una miopatía proximal que afecta al músculo esquelético y una disfagia y un íleo que afecta a los músculos lisos,
-
unas carencias cardiopulmonares por falta de ATP, y
-
una encefalopatía metabólica.
Leyendas de las figuras
La figura 1 representa un gel SDS-PAGE de las fracciones finales en el marco de la purificación de la paraoxonasa humana y de la proteína de la invención SEC ID nº 2.
La columna A corresponde al marcador de peso molecular y las columnas B, C y D a tres purificaciones diferentes procedentes de diferentes bolsas de plasma humano. Las tres contienen todas paraoxonasa humana y la proteína de fijación del fosfato.
La figura 2 representa la estructura esquemática de la proteína de la invención SEC ID nº 2 a la que se fija una molécula de fosfato.
La figura 3 corresponde a un ensayo de fijación del fosfato por la proteína de la invención SEC ID nº 2.
Las columnas A a E corresponden a diferentes lotes de purificación de la proteína de la invención que proceden de diferentes bolsas de plasma humano; la columna G al lisozima 1 mg/ml y la columna H a la \beta-lactoglobulina.
La figura 4 representa un gel bidimensional de electroforesis de la mezcla de la proteína de la invención SEC ID nº 2 y de la paraoxonasa.
La figura 5 representa las coordenadas moleculares de la proteína cristalizada de la invención SEC ID nº 2.
Parte experimental Aislamiento de la proteína
La proteína SEC ID nº 2 se obtiene a partir del plasma humano según el procedimiento de Gan et al. (1991) siguiente:
La proteína SEC ID nº 2 se purifica a partir de bolsas de plasma congelado (\sim200 ml) suministradas por el Etablissement de Transfusion Sanguine de Lyon-Beynost. El coágulo de fibrina, formado mediante la adición de 1 M (1%, v/v) de CaCl_{2} al plasma, se separa del suero mediante filtración. El suero se mezcla entonces con 400 ml de gel de afinidad (Cibacron 3GA-Agarose, C-1535, Sigma) equilibrado con un tampón A (Tris/HCI 50 mM, CaCl_{2} 1 mM, NaCl 4M, pH 8). En estas condiciones, principalmente son adsorbidas las HDL ("high density lipoprotein": lipoproteínas de alta densidad). Después de 6 a 8 horas de incubación, las proteínas no adsorbidas sobre el gel son eliminadas mediante filtración sobre sinterizado de porosidad nº 2. Este lavado se efectúa hasta que ya no se detecte ninguna proteína en el eluato (absorción UV a 280 nm). El gel se equilibra a continuación con un tampón B (Tris/HCI 50 mM, CaCl_{2} 1 mM, pH 8) y después se dispone en columna XK 50/30 (Pharmacia). La elución se lleva a cabo añadiendo 1 g/l de desoxicolato de sodio y 0,1% de tritón X-100 al tampón B. Las fracciones que muestran una actividad arilesterasa se inyectan sobre 50 ml de un gel intercambiador de aniones (DEAE Sepharose Fast Flow, Pharmacia) dispuesto en columna XK 26/70 (Pharmacia) y se equilibra con el tampón B y 0,05% de tritón X-100. La elución se lleva a cabo mediante gradiente de NaCl. Un primer nivel se realiza a 87,5 mM de NaCl con el fin de eliminar la apo A-l, una proteína unida a la paraoxonasa, y la mayoría de las proteínas contaminantes. La paraoxonasa humana (PON1) está aproximadamente eluida a la concentración de 140 mM de NaCl. Todas las fracciones conservadas muestran una actividad paraoxonasa y arilesterasa, siendo estas actividades verificadas según los ensayos mencionados más adelante. Las fracciones eluidas no se agrupan. Los geles SDS-PAGE de las fracciones obtenidas muestran unas bandas comprendidas entre 38 kDa y 45 kDa (véase la figura 1). Cada purificación no aporta siempre la misma distribución de masa aparente. Esta ligera heterogeneidad puede explicarse mediante la presencia de 2 cadenas glicosiladas sobre la PON1.
Además de la PON1 en estos lotes, se ha aislado otra proteína mediante cristalización, sustituyendo el tritón por el C12-maltósido y utilizando el sulfato de amonio como agente precipitante. Los cristales obtenidos son los de una proteína desconocida caracterizada mediante radiocristalografía y que corresponde a la secuencia SEC ID nº 2 de la invención. La cristalización es actualmente el único procedimiento existente para purificar esta proteína.
La actividad paraoxonasa se mide en un tampón de glicina 50 mM/NaOH, CaCl_{2} 1 mM, en presencia de 1 M de NaCl, pH 10,5, y se determina por medio de un espectrofotómetro de doble haz (Shimadzu UV 160A) termostatado a 25ºC. La velocidad de hidrólisis se determina según la variación de absorbancia a 412 nm, que corresponde a la formación de p-nitrofenol liberado por la hidrólisis de paraoxón, en función del tiempo, \varepsilon = 18.290 M^{-1}cm^{-1} (Smolen, 1991).
La actividad arilesterasa se mide en un tampón tris 50 mM/HCl, CaCl_{2} 1 mM, pH 8 y se determina por medio de un espectrofotómetro de doble haz (Shimadzu UV 160A) termostatado a 25ºC. La velocidad de hidrólisis se determina según la variación de absorbancia a 270 nm, que corresponde a la formación de fenol liberado por la hidrólisis de acetato de fenilo, en función del tiempo, \varepsilon = 1.310 M^{-1}cm^{-1} (Smolen, 1991).
Estructura
La estructura de la proteína cristalizada SEC ID nº 2 se ha obtenido mediante cristalografía de los rayos X. La estructura a 1,9 \ring{A} de resolución se ha obtenido mediante el método SIRAS (Single Isomorphous Replacement and Anomalous Scattering) (figura 2).
Los datos de difracción de los rayos X han sido recogidos sobre la línea BM30 de ESRF (Grenoble).
Se ha obtenido un derivado de sal de átomo pesado poniendo en remojo un cristal en una disolución que contiene unas sales de uranio.
Las imágenes han sido integradas, puestas a escala y combinadas con los programas XDS2000 (Kabsch, 1993) y la sucesión CCP4 (COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT, NUMBER 4. 1994. "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50, 760-763).
Se han utilizado los programas CNS (BRUNGER, 1998) y SnB (Weeks, 1999) para localizar los átomos de uranio. Se ha utilizado el programa SHARP (Copyright© 2001-2002 the Buster Development Group) para obtener las fases mediante la técnica SIRAS.
Se han construido 372 aminoácidos automáticamente en el mapa de densidad electrónica mediante el programa ARP/wARP (Perrakis, 1997). Este primer modelo ha sido afinado a continuación mediante el programa CNS.
Debido a la muy buena calidad de los mapas de densidad electrónica, la secuencia primaria de la proteína ha podido ser asignada con 80% de fiabilidad. Una molécula de fosfato ha podido asimismo ser localizada.
La estructura obtenida no corresponde para nada a la paraoxonasa humana. La secuenciación obtenida identificando los aminoácidos a partir de la densidad electrónica indica que ni esta proteína humana ni su gen han sido descritos antes. Se trata por lo tanto de una nueva proteína.
La estructura de la proteína de la invención muestra una homología muy alta con la proteína de fijación del fosfato ("phosphate binding") de Escherichia coli. Esta proteína en esta bacteria sirve para transportar el fosfato a través del periplasma. Se encuentra en muchos procariotas pero en ningún eucariota.
La densidad electrónica ha demostrado asimismo que una molécula de fosfato se había fijado a la nueva proteína de la invención, de la misma manera que en la de Escherichia Coli.
Así, se puede concluir que la proteína de la invención caracterizada a partir del plasma humano presenta una homología muy alta con la proteína bacteriana y que es capaz de fijar el fosfato y transportarlo.
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Secuenciación Digestión en el gel
La mezcla paraoxonasa-HPBP ha sido separada por gel electroforético con SDS-PAGE (sin calentamiento). Se han recortado varias bandas que corresponden a HPBP en los alrededores de 70 kDa.
La digestión de la proteína contenida en estas bandas se ha llevado a cabo gracias al sistema automático de digestión, MassPrep Station (Waters Manchester, G.B.). Las bandas de gel han sido lavadas dos veces con 50 \mul de una disolución a 25 mM de carbonato de amonio hidrogenado (NH_{4}HCO_{3}) y 50 \mul de acetonitrilo. Las cisteínas han sido reducidas con 50 \mul de una disolución a 10 mM de ditiotreitol a 57ºC y aciladas con 50 \mul de yodoacetamida a 55 mM. Después de la deshidratación con el acetonitrilo, la proteína ha sido digerida enzimáticamente con 10 \mul de tripsina porcina modificada a 12,5 ng/\mul (Promega, Madisson, WI, U.S.A.) o bien con lys-C de Lysobacter enzimogenes (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania) en 25 mM de NH_{4}HCO_{3}. La digestión se llevó a cabo durante una noche completa a temperatura ambiente. Los péptidos escindidos han sido extraídos con una disolución al 60% de acetonitrilo y 5% de ácido fórmico.
Análisis mediante espectrometría de masas MALDI-MS y MALDI-MS/MS
Las mediciones de masas mediante MALDI-TOF han sido efectuadas sobre un Ultraflex^{TM} TOF/TOF (Bruker, Daltonik GmbH, Brème, Alemania). Este instrumento ha sido utilizado con un potencial de aceleración máximo de 25 KV en el modo reflectrón. La muestra se ha preparado con la preparación estándar de la gota secada sobre la diana en acero inoxidable utilizando como matriz el ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico.
La calibración externa del espectro MALDI-MS se ha efectuado utilizando sólo los picos de las cargas mono isotópicas de una disolución conocida de péptidos (bradiquinina 1-7 (m/z = 757,400), angiotensina humana II (m/z = 1.046,542), angiotensina humana I (m/z = 1.296,685), sustancia P (m/z = 1.347,735), bombesina (m/z = 1.619,822), renina (m/z = 1.758,933), ACTH 1-17 (m/z = 2.093,087) y ACTH 18-39 (m/z = 2.465,199)). Las masas de los péptidos mono isotópicos han sido automáticamente anotadas gracias al programa Flexanalysis 2.0.
Los espectros MS/MS se han obtenido mediante el análisis de los iones meta-estables obtenidos por "Laser-Induced Decomposition" (LID) de un precursor iónico seccionado, sin colisión adicional en fase gaseosa. El precursor iónico ha sido acelerado a 8 kV y ha sido seleccionado gracias a una trampa con iones de selección temporal. Los fragmentos han sido acelerados a continuación a 19 kV en la célula LIFT, y sus masas han sido medidas después de su paso sobre el reflector iónico.
La secuenciación de novo de cada uno de estos espectros MS/MS se ha llevado a cabo con el programa Full DeNovo Sequencing program (Biotools, Bruker Daltonik GmbH, Brème, Alemania).
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NanoLC-MS/MS
El análisis NanoLC-MS/MS se ha llevado a cabo utilizando un CapLC (Waters, Manchester, GB) acoplado con un espectrómetro de masas "tiempo de vuelo" acelerado por un cuadripolo híbrido ortogonal Q-TOF II (Micromass, Manchester, G.B.). La separación mediante cromatografía en fase inversa se ha llevado a cabo con unos capilares (Pepmap C18, 75 \mum i.d., 15 cm de largo, LC Packings) bajo un flujo a 200 nl/min., mantenido constante gracias a una pre-columna de partición. La calibración se ha llevado acabo utilizando 1 pmol/\mul de GFP.
La adquisición de los datos de masas ha sido dirigida mediante el programa MassLynx (Micromass, Manchester, GB) que bascula automáticamente entre el modo MS y el modo MS/MS.
Los espectros MS/MS generados han sido secuenciados individualmente de novo con el fin de obtener la secuencia parcial o completa. Estas interpretaciones han sido llevadas a cabo utilizando el programa PepSeq (MassLynx, Micromass) y el programa PEAKS Studio (Bioinformatics Solutions, Waterloo, Canadá) que son capaces de tratar completamente un fichero .pkl con una secuenciación de novo automática sobre cada espectro MS/MS.
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Fijación del fosfato
La fijación del fosfato por la proteína de la invención SEC ID nº 2 se ha demostrado según el ensayo siguiente:
Se depositan 200 \mul de la proteína de la invención SEC ID nº 2 (columnas A-F de la figura 3), o del lisozima 1 mg/ml (columna G) o de la \beta-lactoglobulina sobre nitrocelulosa (dot blot por aspiración).
El conjunto se incuba durante 2 h 30 min. en una mezcla que comprende: tris 50 mM; pH 8,0; ^{32}P (10 mCi/ml) 2 mM.
Se efectúa después un aclarado 2 veces durante 1 minuto con tris 50 mM a pH 8,0, y después se expone el conjunto a temperatura ambiente durante 45 minutos.
Se observa entonces (véase la figura 3) que la proteína de la invención ha fijado el fosfato radiactivo (columnas A a F), mientras que los controles de ensayo no lo han fijado (columnas G y H).
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Papel y utilización de la proteína SEC ID nº 2
Para dosificar la concentración de esta proteína en el plasma, los métodos que se pueden utilizar son:
-
los métodos electroforéticos,
-
la purificación de la proteína,
-
la cuantificación de su actividad,
-
la inmunodosificación de la proteína utilizando unos anticuerpos policlonales/monoclonales dirigidos contra la proteína.
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Asociación con la paraoxonasa Electroforesis bidimensional
Las proteínas purificadas (40 \mug) al igual que en el protocolo descrito anteriormente, se mezclan con 100 \mul de una disolución que contiene 9,8 M de urea, 4% (v/v) de tritón X100, 2 mM de tributil fosfina, 0,2% (v/v) de anfolina 3-10 (Bio-Lytes 3-10; Bio-Rad), y 0,001% (m/v) de azul de bromofenol. Se utilizan unas tiras (IPG-Strips; Bio-Rad) de gel de poliacrilamida (T: 4%; C: 3%) listas para usar. Se han fijado unas anfolinas de manera covalente a la poliacrilamida de manera que se obtiene un gradiente lineal de pH preestablecido. El gradiente de pH utilizado está comprendido entre 3,0 y 10,0.
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1. Isoelectroenfoque (IEF)
Las tiras se disponen en contacto con las muestras proteicas en el aparato Protean IEF Cell (Bio-Rad) y se rehidratan activamente (50 V constante) durante 15 horas a 20ºC. El isoelectroenfoque se lleva a cabo a continuación en 3 etapas a 20ºC. En primer lugar, se aplica un voltaje bajo de 250 V durante 15 minutos; en segundo lugar, se programa en 2 h una subida en gradiente de 250 a 4.000 V (amperaje limitado por tira a 50 \muA). En tercer lugar, el voltaje se mantiene constante a 4.000 V durante 4 horas. Después de la migración, las tiras se conservan a -20ºC.
Según el protocolo de purificación anterior, la proteína HPBP de la invención se copurifica con la paraoxonasa humana (PON) (Fokine et al., 2003). Realizando un gel bidimensional con el protocolo anterior, se han identificado 2 puntos por secuenciación N-terminal como respectivamente la proteína de la invención HPBP y la paraoxonasa humana (véase la figura 4). Las dos proteínas tienen aproximadamente la misma masa molecular (aproximadamente 40 kDa) y unos puntos isoeléctricos distintos, 6,9-8,5 para HPBP y 4-5 para la PON1. Teniendo en cuenta que ha sido preciso utilizar unas condiciones drásticas para conseguir separar sobre gel las 2 proteínas (9 M de urea y 4% de tritón) y que las 2 proteínas que tienen unos puntos isoeléctricos muy diferentes siguen copurificadas después del paso en una columna intercambiadora de anión (DEAE sefarosa), se concluye que se asocian formando un complejo.
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<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE HENRI POINCARE DE NANCY
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<120> NUEVA PROTEÍNA DE FIJACIÓN DEL FOSFATO, COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE LO CONTIENEN Y SUS UTILIZACIONES
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<130> WOB 03 BU CNR HPBP
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<150> FR 03/12729
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<151> 30/10/2004
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<160>11
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 376
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(1)
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<223> D ó S
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<220>
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<222> (3)..(3)
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<223> N ó D
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (11)..(11)
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<223> Q ó E
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (30)..(30)
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<223> V ó T
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (43)..(43)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> E ó Q
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<220>
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<223> D ó N
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> A ó G
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (122)..(122)
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<223> D ó N
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<220>
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<222> (143)..(143)
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<223> S ó V
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<220>
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<223> T ó S
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<222> (224)..(224)
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<223> D ó N
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<222> (252)..(252)
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<223> V ó S
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (266)..(266)
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<223> D ó N
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<400> 1
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1
2 
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<210> 2
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<211> 376
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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3
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<210> 3
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<211> 376
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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5
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<213> Homo sapiens 
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12 
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<210> 7
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<211> 359
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<213> Oryctolagus cuniculus 
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<400> 7
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<213> Rattus rattus 
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<400> 8
15
16 
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<210> 9
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<213> Mus musculus 
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<213> Mus musculus 
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<400> 10
19
20 
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<210> 11
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<211> 354
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 11
21
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Claims (15)

1. Proteína, caracterizada porque comprende o está constituida por:
-
la secuencia SEC ID nº 1, o
-
cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 1, que tiene una homología de por lo menos 80% con la secuencia SEC ID nº 1, con la condición de que dicha secuencia homóloga se una al fosfato.
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2. Proteína según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende o está constituida por:
-
la secuencia SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, o
-
cualquier secuencia homóloga de la secuencia SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, que tiene una homología de por lo menos 80% con la secuencia SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, con la condición de que dicha secuencia homóloga se una al fosfato.
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3. Secuencia nucleotídica que codifica para una proteína tal como la definida según la reivindicación 1 ó 2.
4. Vector recombinante, plásmido, cósmido, fago o ADN de virus, que contiene una secuencia nucleotídica según la reivindicación 3.
5. Vector recombinante según la reivindicación 4, que contiene los elementos necesarios para la expresión en una célula hospedante de los polipéptidos codificados por una secuencia nucleotídica según la reivindicación 3, insertados en dicho vector.
6. Célula hospedante aislada, seleccionada de entre las bacterias, las levaduras, las células de hongos, las células de plantas o las células de mamíferos, siendo dicha célula hospedante transformada con la ayuda de un vector recombinante según una de las reivindicaciones 4 ó 5.
7. Composición farmacéutica que comprende a título de sustancia activa una proteína según la reivindicación 1 ó 2, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, que comprende a título de sustancia activa una proteína representada por la secuencia SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3.
9. Composición farmacéutica según la reivindicación 8, en la que la proteína tal como la definida según la reivindicación 1 ó 2 está en asociación con una variante de la proteína paraoxonasa, de SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 11.
10. Utilización de una proteína según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de la artritis o de enfermedades relacionadas con una hiperfosfatemia, tales como las enfermedades cardiovasculares o, en asociación con una variante de la proteína paraoxonasa de SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 11, en el marco de la profilaxia o del tratamiento de las intoxicaciones provocadas por unos insecticidas o unos agentes neurotóxicos tales como el soman, el VX, el sarin o el tabun, o en el marco del tratamiento de la ateroesclerosis.
11. Producto de combinación que comprende por lo menos una proteína según la reivindicación 1 ó 2, y por lo menos una variante de la proteína paraoxonasa de SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 11, para una utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo destinado a la profilaxia o al tratamiento de las intoxicaciones provocadas por unos insecticidas o unos agentes neurotóxicos tales como el soman, el VX, el sarin o el tabun.
12. Método de dosificación de la proteína tal como la definida según la reivindicación 1 ó 2, siendo dicho método seleccionado de entre
-
los métodos electroforéticos,
-
la purificación de dicha proteína,
-
la cuantificación de su actividad, y
-
la inmunodosificación de dicha proteína utilizando unos anticuerpos policlonales/monoclonales dirigidos contra dicha proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Aplicación del método de dosificación según la reivindicación 12
-
para el diagnóstico in vitro de enfermedades relacionadas con una hiperfosfatemia, en particular cuando la cantidad de proteína según la reivindicación 1 ó 2, dosificada según el método de la reivindicación 12, es inferior a la cantidad de esta proteína normalmente presente en la sangre de un individuo sano, o
-
para el diagnóstico in vitro de enfermedades relacionadas con una hiperfosfatemia, en particular cuando la cantidad de proteína según la reivindicación 1 ó 2, dosificada según el método de la reivindicación 12, es superior a la cantidad de esta proteína normalmente presente en la sangre de un individuo sano, o
-
para el diagnóstico in vitro de una predisposición de un individuo a dichas patologías.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Aplicación según la reivindicación 13 para el diagnóstico in vitro de enfermedades relacionadas con una hiperfosfatemia tales como las enfermedades cardiovasculares relacionadas con la formación de placas de ateromas, o para el diagnóstico in vitro de una predisposición de un individuo para desarrollar una de las enfermedades mencionadas anteriormente.
15. Aplicación según la reivindicación 13 para el diagnóstico in vitro de enfermedades relacionadas con una hipofosfatemia, o para el diagnóstico in vitro de una predisposición de un individuo para desarrollar estas enfermedades.
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