ES2340845T3

ES2340845T3 - Aceite de girasol, semillas y plantas con distribucion modificada de acidos grasos en la molecula de triacil-glicerol.

Info

Publication number: ES2340845T3
Application number: ES03782359T
Authority: ES
Inventors: Rafael Garces; Enrique Martinez-Force
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2003-11-14
Filing date: 2003-12-08
Publication date: 2010-06-10
Anticipated expiration: 2023-12-08
Also published as: AR048014A1; EP1689222A1; ATE459247T1; RU2006120541A; BR0318602A; UA92455C2; RU2337530C2; RU2008125816A; DE60331599D1; EP1689222B1; RU2502793C2; CN1886043A; BRPI0318602B1; DK1689222T3; JP2007523596A; WO2005046315A1; AU2003290006A8; JP4800034B2; CN100579364C; AU2003290006A1

Abstract

Un aceite de girasol directamente obtenido de la semillas de girasol con un contenido de ácido esteárico de 12-40,8% en relación al contenido de ácido graso total, y en donde el contenido de ácido oleico es mayor que el contenido de ácido linoleico en el aceite, caracterizado porque el coeficiente de distribución de los ácidos grasos saturados α entre las posiciones sn-1 y sn-3 es al menos del 0,28, cuyas semillas se obtienen mediante el cultivo de las plantas de girasol a partir de las semillas de girasol de una línea de alto contenido de ácido oleico y ácido esteárico, cultivar las plantas de girasol de las semillas de girasol de CAS-36, que tiene un número de acceso del depósito de ATCC PTA-5041, cruzar las líneas para producir semillas F1 y recolectar las semillas, producir las semillas F2 y seleccionar las semillas con más de un valor de α de 0,28, alto contenido de ácido esteárico y más contenido de ácido oleico que de ácido linoleico, en donde el coeficiente α se calcula usando la fórmula **(Ver fórmula)** S1 es el contenido de ácido graso saturado en la posición sn-1 de TAG, S3 es el contenido de ácidos grasos saturados en la posición sn-3 de TAG y αS es el menor de los dos valores, excepto cuando ambos son 0,5, entonces α es 0,5.

Description

Aceite de girasol, semillas y plantas con distribución modificada de ácidos grasos en la molécula de triacil-
glicerol.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención es un aceite de girasol que se obtiene directamente de la semilla de girasol con de 12-40,8% de ácido esteárico calculado en relación al contenido total de ácidos grasos y con una distribución de ácidos grasos modificada entre las posiciones sn-1 y sn-3 de la molécula de triacilglicerol (TAG) comparado con el aceite obtenido del tipo silvestre de semillas de girasol. La invención también se refiere a una planta de girasol y a semillas que contienen un aceite endógeno con las características mencionadas.

Los aceites y las grasas están hechos principalmente de triglicéridos, son éstos moléculas formadas por un esqueleto de glicerol y tres ácidos grasos esterificados en los tres grupos hidroxilos del glicerol (Gunstone et al. 1994). Las propiedades químicas y físicas, y también, las propiedades nutritivas de los aceites se determinan por la composición de los ácidos grasos de los aceites y la distribución de estos ácidos grasos en las especies de triglicéridos diferentes. Las tres posiciones estereoquímicas de los ácidos grasos se llaman sn-1, sn-2 y sn-3. El hecho de que una grasa sea sólida a una temperatura específica o tenga buena estabilidad está relacionado con un nivel reducido de enlaces dobles en los ácidos grasos. Los ácidos grasos principales que se encuentran en semillas de girasol son el ácido linoleico (18:2) con 18 átomos de carbono y dos enlaces dobles y el ácido oleico (18:1) con solo un doble enlace, lo que hace que estos aceites sean líquidos a temperatura ambiente. Algunos aceites, como los derivados de soja y canola, contienen también ácido linolénico (18:3), con 18 átomos de carbono y 3 enlaces dobles. Estos ácidos grasos son insaturados ya que tienen uno o más enlaces dobles. Los aceites vegetales contienen también cantidades pequeñas de ácidos grasos saturados, sin ningún enlace doble, como el ácido palmítico que tiene 16 carbonos (16:0), ácido esteárico con 18 carbonos (18:0), ácido araquídico con 20 carbonos (20:0) y ácido behénico (22:0) con 22
carbonos.

Los ácidos grasos insaturados son beneficiosos para la salud y los ácidos grasos saturados son neutros o poco sanos, dependiendo del ácido graso y de su posición en la molécula de triglicérido. Por otro lado algunos aceites vegetales tropicales y algunas grasas animales tienen ácidos grasos saturados de cadena corta y mediana como el ácido láurico con 12 átomos de carbono (12:0) y mirístico, un ácido graso saturado de 14 átomos de carbono (14:0), el último es el peor para la salud. El ácido palmítico y el ácido esteárico son los ácidos grasos saturados usuales de los aceites vegetales de la zona templada (Tabla 1). Al ácido palmítico se le considera un poco no saludable y al ácido esteárico se le considera neutro.

Sin embargo, es muy importante considerar una segunda propiedad que depende de la posición de los ácidos grasos en la molécula de triglicérido. Un ácido graso saturado de cadena larga es menos dañino si no está unido a la posición media (sn-2) del glicerol. Durante la digestión de las grasas la lipasa pancreática hidroliza los ácidos grasos que se encuentran en las posiciones sn-1 y sn-3 de la molécula de glicerol. Mientras que el ácido graso en la posición media se mantiene unido al glicerol formando un monoglicérido que tiene propiedades de detergente y se asimila perfectamente, los ácidos grasos liberados de las posiciones sn-1 y sn-3 reaccionan con calcio o magnesio produciendo sales insolubles con estos metales, lo que hace que su absorción intestinal sea muy difícil. Como resultado de esto se eliminan cuando se excretan. Como se muestra en la tabla 1, todos los ácidos grasos saturados de los aceites vegetales, con la excepción del aceite de palma, no están situados en la posición sn-2, por esta razón no afectan negativamente la concentración de colesterol, aunque tengan un contenido palmítico alto como la manteca de cacao o medio como el aceite de
oliva.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

\newpage

TABLA 1

Composición de ácidos grasos de grasas y aceites comestibles (Álvarez-Ortega et al. 1997; Chow 1992;
Gunstone et al. 1994)

1

En muchas preparaciones alimenticias la industria alimentaria necesita grasas con plasticidad o sólidas (tales como grasas animales) de buena estabilidad. Los bollos, pastas y pasteles y, por descontado, la margarina y pastas para untar requieren grasa sólida, mientras que la industria de los fritos quiere aceite líquido resistente a la termooxidación. En los años ochenta, la industria alimentaria siguiendo las recomendaciones de los expertos en nutrición y las demandas de los consumidores cambió de usar grasas animales a usar aceites vegetales. Estos aceites no tienen las propiedades apropiadas para uso en estas preparaciones alimenticias; deben ser modificados químicamente por medio de la hidrogenación parcial y/o transesterificación. La hidrogenación reduce los enlaces dobles de los ácidos grasos insaturados con hidrógeno y un metal pesado como catalizador. Durante este proceso se aumenta los ácidos grasos saturados, pero al mismo tiempo el número de isómeros artificiales de ácidos grasos cis y trans aumenta. Los isómeros trans, aunque sean ácidos grasos insaturados, tienen propiedades físicas similares a los ácidos grasos saturados. El principal problema con estos ácidos grasos trans es que son incluso peores que los ácidos grasos saturados de origen animal en relación a las concentraciones de colesterol, y que están relacionados con algunas deficiencias esenciales de ácidos grasos o con ciertos cánceres, como el cáncer de mama de las mujeres.

La transesterificación química conduce a una redistribución de todos los ácidos grasos dentro de las moléculas de triglicérido; después puede obtenerse una porción enriquecida en triglicéridos saturados por fraccionamiento. Por medio de este proceso se convierte un aceite vegetal saludable en una grasa insaludable, como la manteca de cerdo, con gran cantidad de ácidos grasos saturados en la posición sn-2. Este aceite aumentará el colesterol de baja densidad (el malo). En conclusión, los procedimientos usados para modificar químicamente los aceites vegetales no son particularmente saludables, cambiando las propiedades de estos aceites de tal manera que los nuevos son menos saludables. Teniendo en cuenta los datos tecnológicos y nutritivos, el mejor aceite debería ser un aceite vegetal natural con un contenido mayor de ácido esteárico como ácido graso saturado, preferiblemente unido al esqueleto del glicerol en las posiciones sn-1 y sn-3, y los ácidos oleico o linoleico como ácidos grasos insaturados que están unidos a las tres posiciones sn.

Se han seleccionado y fijado varias líneas mutantes de girasol de ácidos grasos después de un programa de mutagénesis (Osorio et al. 1995). Algunos de estos mutantes tienen un contenido alto de ácidos grasos saturados en el aceite de las semillas: CAS-3 con al menos un 26% de ácido esteárico; CAS-4 y CAS-8 con al menos concentraciones medias de ácido esteárico (12-16%). Este material y otros como CAS-29, 30 y 31, seleccionados después de estudios bioquímicos y recombinaciones adicionales, constituyen una amplia colección de plasma germinal (Tabla 2).

TABLA 2 Composición de ácidos grasos de material de girasol seleccionado de la colección de girasol del Instituto de la Grasa, CSIC, Sevilla, España

2

La caracterización genética de los mutantes ha mostrado que la herencia de las concentraciones de ácidos grasos diferentes es gametofítica y está controlada por alelos en un número reducido de lugares, haciendo factible su transferencia a líneas endogámicas diana en unos pocos ciclos de cruce de un híbrido de primera generación con sus padres. El estudio de la expresión temporal y espacial de estos caracteres mutantes mostró que los caracteres mutantes se expresan solo durante la formación de la semilla, están influidos poco por la temperatura de crecimiento y no están expresados en los tejidos vegetativos. Estas líneas mutantes de girasol no tienen ningún efecto colateral negativo como los que se encuentran en los mutantes de arabidopsis y de canola de esteárico alto.

Los triglicéridos vegetales se producen por la ruta del glicerol-3-P (ruta de Kennedy). Inicialmente (Figura 1), ocurren dos acilaciones del glicerol 3-fosfato en las posiciones sn-1 y sn-2 con ésteres de acil-CoA, produciéndose fosfatidato por las enzimas, glicerol 3-fosfato aciltransferasa (GPAT) y lisofosfatidato aciltransferasa (LPAAT), respectivamente. A continuación el fosfatidato es hidrolizado a diglicérido por la fosfatidato fosfohidrolasa y, subsecuentemente, el diglicérido puede ser acilado adicionalmente por el acil-CoA para dar el triglicérido (una reacción catalizada por la diglicérido aciltransferasa, DAGAT). La última enzima es exclusiva de la biosíntesis de triglicéridos. Esas aciltransferasas regulan la distribución estereoquímica de los ácidos grasos.

Durante el análisis de la composición de los mutantes del girasol, se encontraron 38 especies moleculares diferentes (Fernández-Moya et al. 2000). Pero inesperadamente, los triglicéridos sintetizados por las líneas de esteárico alto no tienen una distribución aleatoria en las posiciones sn-1 y sn-3 como se esperaba por la teoría de Vander Wal (1960) que supuestamente se aplicaba a todos los aceites. Las enzimas responsables de esta distribución poco corriente son las aciltransferasas que sintetizaron los triglicéridos desde la reserva de acil-CoA y glicerol-3-P. Teniendo en cuenta que en los sistemas vegetales la síntesis de los triglicéridos implica que ningún ácido graso saturado estará unido en la posición sn-2 del glicerol (Álvarez-Ortega et al.; 1997), las enzimas específicas responsables de este efecto deberían ser la glicerol-3P aciltransferasa y/o la diglicérido aciltransferasa.

En la investigación que condujo a la invención se ha desarrollado un coeficiente matemático, alfa S (\alphas), que calcula la distribución relativa de los ácidos grasos saturados en las posiciones TAG sn-1 y sn-3. El valor de \alphas va desde 0, que significa que una de las posiciones no tiene ningún ácido graso saturado, a 0,5, donde ambas posiciones tienen el mismo contenido de ácidos grasos saturados. Si la distribución de un triglicérido se ha hecho según la teoría de Vander Wal, entonces \alpha = 0,5 y los ácidos grasos diferentes están distribuidos de forma uniforme en el triglicérido. Esto es muy importante en el caso de la distribución de ácidos grasos saturados entre las posiciones sn-1 y sn-3, ya que si hay más ácidos grasos saturados en una de estas posiciones \alpha es menor de 0,5 y la cantidad de triglicéridos disaturados es más pequeña que la que se esperaría por la teoría. Esto es exactamente lo que los inventores encontraron en los aceites de girasol, principalmente en los que tenían un ácido esteárico mayor del 12%. La cantidad máxima de triglicéridos disaturados, que son ventajosos para hacer grasas con plasticidad para pastas para untar, margarinas, manteca para hacer la pastelería más friable (shortening), bollos, pastas y pasteles etc., se obtiene cuando \alpha = 0,5, cuanto más pequeño sea esta valor de \alpha en la distribución de ácidos grasos saturados en las posiciones sn-1 y sn-3 de la molécula del triglicérido, peor es este aceite para este propósito específico de alimento. De esta manera, para usos particulares pueden elegirse girasoles mutantes que tengan una distribución relativa ventajosa de ácidos grasos saturados en las posiciones TAG sn-1 y sn-3 basado en el cálculo del valor de \alpha.

Este coeficiente se calculó conociendo la composición total de ácidos grasos saturados del trigicérido(s), la composición de ácidos grasos saturados en sn-2 (S_{2}), ambas pueden calcularse según Álvarez-Ortega et al. (1997), y la composición de las especies moleculares del triglicérido, que puede calcularse según Fernández-Moya et al. (2000).

TABLA 3 Porcentajes de ácidos grasos saturados e insaturados en cada posición de TAG (S_{1}, S_{2} y S_{3}) en función de S, S_{2} y \alphaS; S: contenido total de ácidos grasos saturados; S_{2}: contenido de ácidos grasos saturados en sn-2; \alpha: coeficiente de distribución de ácidos grasos saturados entre las posiciones sn-1 y sn-3

3

Los porcentajes de las diferentes subclases TAG (Trisaturados, SSS; Disaturados, SUS; Monosaturados, SUU; y Triinsaturados, UUU) se calculan usualmente usando las fórmulas siguientes:

4

Usando los valores dados para S_{1}, S_{2}, S_{3}, U_{1}, U_{2} y U_{3} en la Tabla 3 podemos calcular el valor para el coeficiente de distribución \alpha con la siguiente lógica para un TAG diferente:

a) A partir de especies de TAG trisaturadas (SSS):

5

Sustituyendo los valores para S_{1}, S_{2} y S_{3} de la Tabla 3, obtenemos:

6

Igualando a 0 en (i),

7

Sustituyendo por el valor de S_{1}S_{2}S_{3} de la ecuación (v),

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

el valor de \alpha se calcula como en una ecuación cuadrática (ax^{2} + bx + c = 0) que pude simplificarse porque a = -b

donde a = - 9S^{2}S_{2} + 6SS_{2}^{2} -S_{2}^{3}, b = 9S^{2}S_{2} - 6SS_{2}^{2} + S_{2}^{3} y c = 10.000SSS (%), SSS (%) es la cantidad total de TAGs trisaturados en la semilla/aceite.

\vskip1.000000\baselineskip

b) A partir de especies de TAG disaturadas (SUS):

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

Sustituyendo los valores para S_{1}, S_{2}, S_{3} , U_{1}, U_{2} y U_{3} de la Tabla 3, obtenemos:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

Igualando a 0 en (ii),

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

Sustituyendo los valores para U_{1}S_{2}S_{3}, S_{1}U_{2}S_{3} y S_{1}S_{2}U_{3} de las ecuaciones (vi), (vii) y (viii) respectivamente, y agrupando en función de \alpha:

12

el valor de \alpha se calcula como en una ecuación cuadrática que pude simplificarse porque a = -b

13

donde a = 600SS_{2} - 18SS_{2}^{2}+ 27S^{2}S_{2} - 900S^{2} -100S_{2}^{2} + 3S_{2}^{3} y c = 300SS_{2} - 100S_{2}^{2} - 10.000SUS (%), SUS (%) es la cantidad total de TAGs disaturados en la semilla/aceite.

\vskip1.000000\baselineskip

c) A partir de especies de TAG monoinsaturadas (SUU):

14

Sustituyendo los valores para S_{1}, S_{2}, S_{3}, U_{1}, U_{2} y U_{3} de la Tabla 3, obtenemos:

15

Igualando a 0 en (iii),

16

Sustituyendo los valores para S_{1}U_{2}U_{3}, U_{1}S_{2}U_{3}, y U_{1}U_{2}S_{3} de las ecuaciones (ix), (x) y (xi) respectivamente, y agrupándolos en función de \alpha:

17

18

donde a = -1.200SS_{2} + 18SS_{2}^{2} - 27S^{2}S_{2} + 1.800S^{2} + 200S_{2}^{2} - 3S_{2}^{3} y c = -600SS_{2} + 200S_{2}^{2} + 30.000S - 10.000SUU (%), SUU (%) es la cantidad total de TAGs monosaturados en la semilla/aceite.

\vskip1.000000\baselineskip

d) A partir de especies de TAG triinsaturadas:

19

Sustituyendo los valores para U_{1}, U_{2} y U_{3} de la Tabla 3, obtenemos:

20

Igualando a 0 en (iv),

21

Sustituyendo los valores para U_{1}U_{2}U_{3} de la ecuación (xii), y agrupándolos en función de \alpha:

22

23

donde a = 600SS_{2} - 6SS_{2}^{2} + 9S^{2}S_{2} - 900S^{2} - 100S_{2}^{2} + S_{2}^{3}, y c = 300SS_{2} - 100S_{2}^{2} - 30.000S + 1.000.000 - 10.000UUU (%), UUU (%) es la cantidad total de TAGs triinsaturados en la semilla/aceite.

\vskip1.000000\baselineskip

Para evitar desviaciones por errores experimentales en la determinación por cromatografía de líquido gas (GLC) de las especies de TAG definimos \alphaS como el promedio ponderado de los valores de \alpha calculados a partir de SSS (\alphaSSS), a partir de SUS (\alphaSUS), a partir de SUU (ASUU) y a partir de UUU (\alphaUUU).

24

En una distribución aleatoria de los ácidos grasos saturados entre las posiciones sn-1 y sn-3 de las moléculas de triglicéridos el 50% de los ácidos grasos saturados debería estar en cada posición, lo óptimo es tener el máximo de moléculas de triglicérido SUS, S es un ácido graso saturado y U es insaturado, respectivamente. La Figura 2 muestra la proporción de las diferentes especies de TAG en el aceite de girasol con un contenido de ácidos grasos saturados en aumento si ocurre una distribución aleatoria entre sn-1 y sn-3. Estas curvas se han generado sustituyendo \alpha por 0,5, usando el contenido de ácidos grasos saturados de girasol en la posición sn-2 (Álvarez-Ortega et al. 1997) y valores en aumento para el contenido total de ácidos grasos saturados en las fórmulas (i), (ii), (iii) y (iv).

El coeficiente \alpha de un aceite podría también calcularse analizando químicamente la composición de los ácidos grasos de las tres posiciones sn de la molécula de TAG. Este análisis podría realizarse siguiendo los métodos propuestos por Laakso y Christie (1990) o Takagi y Ando (1991). Estos métodos hacen posible conocer el contenido de ácidos de las tres posiciones sn, pero se necesita una muestra de gran tamaño y no podría ser aplicado a una muestra pequeña, como la mitad de una semilla, como en nuestro método. En este caso la fórmula es como se presenta a continuación, \alphaS es el menor de estos dos valores, excepto cuando ambos son 0,5. En este caso \alpha = 0,5.

25

Los inventores han estudiado esta distribución de TAG en aceites de girasol reales. Los datos muestran, como se esperaba, que los ácidos grasos saturados (S) están situados principalmente en las posiciones sn-1 y sn-3 de la molécula de glicerol en aceites de girasol corrientes y aceites de girasol muy saturados y en muy pequeña cantidad en la posición sn-2. Los ácidos grasos principales en esta posición son los ácidos oleico y linoleico como se esperaba y de acuerdo con los datos de Álvarez-Ortega et al. (1997). Sin embargo, los grupos acilo no estaban distribuidos según la teoría de 1,3-aleatorio, 2-aleatorio (Vander Wal, 1960). Los ácidos grasos saturados, palmítico y esteárico, no estaban distribuidos de forma uniforme. Estos resultados concuerdan con datos anteriores (Reske et al., 1997) que muestran una preferencia por la posición sn-3 sobre la posición sn-1 de los ácidos grasos saturados, principalmente cuando se aumentó el contenido de esteárico (11%) en relación al girasol corriente que tenía 4,8%. En la Figura 3 se muestra la distribución de TAG de aceites de girasol que son diferentes en el contenido de ácido esteárico y en la relación oleico/linoleico, desde oleico alto hasta linoleico alto. Se encontró que los valores teóricos de los grupos de especies de TAG de girasoles (SSS, SUS, SUU y UUU) que se esperaban para contenidos diferentes de ácidos grasos saturados, basado en la composición observada en la posición sn-2 y el contenido total de ácidos grasos aplicando la teoría de 1,3-aleatorio 2-aleatorio, son diferentes de las composiciones TAG encontradas en las semillas analizadas. La composición de TAG se ha determinado por GLC y los datos de las especies de TAG se han agrupado por el nivel de insaturación (Fernández-Moya et al., 2000).

Como muestra la Figura 3, los ácidos grasos saturados de girasol siguen una distribución asimétrica en TAG, los valores obtenidos para SUU son siempre mayores que los valores esperados y los valores para SUS y UUU más bajos que los valores anticipados por una distribución no específica en las posiciones sn-1 y sn-3.

Estos resultados concuerdan también con resultados anteriores con especies de TAG mutante de girasol con esteárico alto que contienen dos moléculas de ácido linoleico y un ácido graso saturado que fueron más abundantes que los que se esperaba por la teoría de 1,3-aleatorio 2-aleatorio (Fernández-Moya et al., 2000). El aumento de SUU y la reducción de UUU de especies de TAG se correlacionaron directamente con el contenido total de ácido esteárico en el aceite.

Se ha calculado el coeficiente de distribución (\alpha) de los ácidos grasos saturados entre las posiciones sn-1 y sn-3 en los controles y las líneas mutantes de esteárico alto (Tabla 4). Este coeficiente está siempre entre 0,19 y 0,37 cuando el contenido de ácido linoleico es mayor que el contenido de ácido oleico y entre 0,15 y 0,27 cuando el contenido de ácido oleico es mayor que el contenido de ácido linoleico.

TABLA 4

Se muestra el contenido de ácido esteárico (18:0), contenido total de ácidos grasos saturados (S), grupos diferentes de TAG (SUS, SUU y UUU), y el coeficiente de distribución \alpha en varias líneas normales y mutantes de girasol. RHA-274 proviene de USDA-ARS, Northern Crop Science Lab, Fargo, ND. Otras líneas son del Instituto de la Grasa, CSIC, Sevilla, España. El contenido de ácidos grasos diferentes en las líneas está representado como: HS, esteárico alto; MS, esteárico medio; HL, linoleico alto y HO, oleico alto.

26

Por lo tanto existe todavía necesidad de un aceite de girasol que tenga un coeficiente de distribución superior a 0,38.

Compendio de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un aceite de girasol obtenido directamente de las semillas de girasol con de 12 - 40,8%, preferiblemente al menos 20% de ácido esteárico en relación al contenido total de ácidos grasos, y que en dicho aceite el coeficiente de distribución \alpha de los ácidos grasos saturados entre las posiciones sn-1 y sn-3 de la molécula de TAG sea al menos 0,28, preferiblemente al menos 0,32 y lo más preferible 0,36, en donde el contenido de ácido oleico es mayor que el de ácido linoleico en el aceite y el contenido de ácido esteárico es al menos del 12%, preferiblemente al menos del 20% en relación al contenido total de ácidos grasos.

La presente invención se refiere además a plantas de girasol que forman semillas que contienen un aceite endógeno, obtenible de dichas semillas de girasol, con las características indicadas anteriormente y a semillas de girasol producidas por dichas plantas de girasol.

Constituye otro objeto de la presente invención proporcionar plantas híbridas y su progenie que tienen la distribución de ácidos grasos saturados mencionada anteriormente entre las posiciones sn-1 y sn-3 y otras características deseables.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere por tanto a un aceite de girasol directamente obtenido de la semillas de girasol con un contenido de ácido esteárico de 12 - 40,8% en relación al contenido de ácido graso total y en donde el contenido de ácido oleico es mayor que el contenido de ácido linoleico en el aceite, caracterizado porque el coeficiente de distribución \alpha de los ácidos grasos saturados entre las posiciones sn-1 y sn-3 es al menos 0,28, cuyas semillas se obtienen mediante el crecimiento de las plantas de girasol a partir de las semillas de girasol de una línea de alto contenido de ácido oleico y ácido esteárico, hacer crecer las plantas de girasol de las semillas de girasol de CAS-36, que tiene un número de acceso del depósito de ATCC PTA-5041, cruzar las líneas para producir semillas F1 y recolectar las semillas, produciendo semillas F2 y seleccionando las semillas con más de un valor de \alpha de 0,28, alto contenido de ácido esteárico y más contenido de ácido oleico que de ácido linoleico, en donde el coeficiente \alpha se calcula usando la fórmula

27

S_{1} es el contenido de ácido graso saturado, en la posición sn1 de TAG, S_{3} es el contenido de ácido graso en la posición sn-3 de TAG y \alphaS es el menor de los dos valores, excepto cuando ambos son 0,5, entonces \alpha es 0,5.

Preferiblemente el coeficiente de distribución de los ácidos grasos saturados \alpha entre las posiciones sn-1 y sn-3 es al menos 0,32, más preferiblemente al menos 0,36.

La invención se refiere también a plantas de girasol que forman semillas que contienen un aceite endógeno como se definió anteriormente y a las semillas producidas por estas plantas.

También se describe aquí un método para producir una planta que forma semillas que contienen un aceite endógeno con al menos 12% de ácido esteárico en relación al contenido total de ácido graso, en donde el contenido de ácido oleico es mayor que el contenido de ácido linoleico y donde el coeficiente de distribución \alpha de los ácidos grasos saturados entre las posiciones sn-1 y sn-3 es al menos 0,28, cuyo método comprende:

a): proporcionar semillas que contienen un aceite que tiene un contenido de ácido esteárico de al menos 12% en relación al contenido de ácido graso total en el aceite y en donde el contenido de ácido oleico es mayor que el contenido de ácido linoleico;

b): proporcionar semillas que contienen un aceite que tiene un coeficiente de distribución \alpha mayor de 0,28 en el aceite;

c): cruzar plantas de las semillas proporcionadas en las etapas a) y b);

d): recolectar la progenie de las semillas F1

e): plantar las semillas de la progenie F1 para crecer plantas;

f): autopolinizar las plantas así crecidas para producir la semilla F2;

g): probar las semillas en cuanto a la presencia de un contenido de ácido esteárico de al menos 12%, un contenido de ácido oleico mayor que el contenido de ácido linoleico y un coeficiente de distribución \alpha de al menos 0,28;

h): plantar semillas que tienen los niveles de contenido deseados de ácidos esteárico, oleico y linoleico y coeficiente de distribución \alpha para crecer las plantas;

i): autopolinizar las plantas así crecidas para producir la semilla F3; y

j): opcionalmente repetir las etapas g), h) e i) hasta que el nivel deseado de contenido de los ácidos esteárico, oleico y linoleico y el coeficiente de distribución \alpha sean fijos.

\vskip1.000000\baselineskip

Las semillas que contienen un aceite con al menos 12% de ácido esteárico se procuran con el siguiente procedimiento:

a): tratar las semillas de girasol que tienen un contenido de ácido esteárico de menos del 12% con un agente mutagénico, en particular azida sódica o un agente alquilante, más particularmente metilsulfonato de etilo;

b): producir plantas de las mismas que son polinizadas para producir semillas;

c): probar las semillas en cuanto al contenido de ácido esteárico;

d): proporcionar semillas que contengan un aceite donde el contenido de ácido oleico es mayor que el contenido de ácido linoleico;

e): cruzar plantas de las semillas probadas en la etapa c) y de las semillas probadas en la etapa d);

f): recolectar la progenie de la semilla F1;

g): autopolinizar las plantas así crecidas para producir las semillas F2;

h): probar las semillas en cuanto a la presencia de un contenido de ácido esteárico de al menos 12% y un contenido de ácido oleico mayor que el contenido de ácido linoleico;

i): plantar las semillas que tienen los niveles deseados de contenido de acido esteárico, oleico y linoleico;

j): autopolinizar las plantas así crecidas para producir la semilla F3; y

k): opcionalmente repetir las etapas h), i) y j) hasta que los niveles deseados de ácido esteárico, oleico y linoleico contenidos sean fijos.

\vskip1.000000\baselineskip

Las semillas que contienen un aceite donde el coeficiente de distribución \alpha de los ácidos grasos saturados entre las posiciones sn-1 y sn-3 es al menos 0,38 se proporcionan con el siguiente procedimiento:

a): tratar las semillas de girasol que tiene un coeficiente de distribución \alpha más pequeño de 0,38 con un agente mutagénico, en particular azida sódica o un agente alquilante, más particularmente metilsulfonato de etilo;

b): producir plantas de las mismas que se polinizan para producir semillas;

c): probar las semillas en cuanto al valor deseado del coeficiente de distribución \alpha;

d): opcionalmente repetir las etapas b) y c).

\vskip1.000000\baselineskip

La invención además se refiere a plantas híbridas obtenibles mediante el procedimiento de cruzar una primera planta de origen que resulta de los métodos anteriores y una segunda planta de origen que tiene las características deseables, y a la progenie de la planta híbrida. La segunda planta de origen puede también ser una planta que resulte del método anterior.

La invención también se refiere al uso del aceite en la producción de productos de alimentación y a productos de alimentación preparados con, o que contienen este aceite.

También se describe un tipo nuevo de mutante del girasol, que tiene una mejor distribución \alpha que líneas de girasol previas. Así, este mutante tiene mejores propiedades para la producción de margarina, pastas para untar, etc. que las líneas disponibles en la actualidad (Figura 3). Los mejores triglicéridos para margarina son los tipos saturados-insaturados-saturados (SUS), preferiblemente un triglicérido del tipo saturado-oleico-saturado (SOS).

Esta nueva línea mutante, llamada CAS-36, obtenida por métodos tecnológicos ha sido depositada en la ATCC y se le ha dado el número de acceso PTA-5041. Este mutante tiene la mejor distribución TAG según la teoría aleatoria. Los datos del aceite de una muestra de semillas de algunas plantas CAS-36 se muestran en la tabla 5.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5

Se muestran el contenido de ácido esteárico, el contenido de ácido graso saturado total (S), la relación ácido oleico/ácido linoleico (O/L), los grupos de TAG diferentes, y el valor del coeficiente de distribución \alpha en algunas plantas mutantes CAS-36.

28

En el documento de patente de los Estados Unidos 6.475.548 hay una comparación con un producto de pasta para untar de referencia hecho con el aceite no tratado del documento de patente internacional WO95/20313, y una margarina hecha con la fracción de estearina del aceite del documento de patente internacional WO95/20313. La pasta para untar hecha con la fracción de estearina aparentemente dio buena untuosidad a temperaturas cercanas a la temperatura del refrigerador, fusión apropiada en la boca y estabilidad. La actuación de dicha mezcla de grasa aparentemente condujo a una actuación similar a composiciones de grasa de gran calidad conocidas, sin componentes no naturales como la grasa hidrogenada.

Es bien conocido que las fracciones de estearina de las grasas pueden usarse en una fase de la grasa de pastas para untar para resolver los problemas de hacer pastas para untar. Por ejemplo en el documento de patente de los Estados Unidos Nº. 4.438.149 las pastas de untar se prepararon con una fase grasa que contenía menos del 70% de grasa de mantequilla. Este producto era de consistencia demasiado blanda. Pero cuando se usó la fracción de estearina de la grasa, se hizo un producto más fácil de untar y menos caro. El documento de patente de los Estados Unidos Nº. 6.475.548 enseña un método para la preparación de una grasa de triglicéridos adecuada para estructurar un aceite vegetal líquido o pastas para untar. El método de preparación de una grasa de triglicérido fue con un aceite de girasol de alto contenido de oleico y alto contenido de esteárico (HSHOSF), con al menos 12% en peso de residuos de ácido esteárico y al menos 40% en peso de residuos de ácido oleico que se someten a fraccionamiento húmedo o a fraccionamiento seco y recogiéndose la fracción de estearina. Además la patente anterior enseña que la fracción de estearina de la mezcla de grasa se obtuvo mediante la exposición del aceite HSHOSF de partida a condiciones estándares de fraccionamiento, fraccionamiento seco o fraccionamiento húmedo. La fracción que contenía >30% en peso de triglicéridos SUS y <40% en peso de triglicéridos SUU debía recogerse y el fraccionamiento debía pararse cuando los primeros 25% en peso de grasa sólida hubiera cristalizado.

La presente invención podría de este modo emplearse en un procedimiento para la preparación de una grasa de triglicérido (HSHOSF) con un aceite de girasol de gran contenido de oleico y gran contenido de esteárico por fraccionamiento húmedo o fraccionamiento seco recolectando después una fracción de estearina. Más particularmente, la preparación de una grasa de triglicérido con un aceite de girasol (HSHOSF) de gran contenido de oleico y gran contenido de esteárico con al menos 12% en peso de ácido esteárico en relación al contenido total de ácido graso, caracterizado por que el coeficiente de distribución \alpha de los ácidos grasos saturados entre las posiciones sn-1 y sn-3 es al menos 0,28, y porque el aceite está sujeto a un fraccionamiento húmedo o a un fraccionamiento seco y porque se recoge una fracción de estearina.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra el camino biosintético de los triglicéridos.

La figura 2 es la distribución teórica de la distribución de las especies TAG de girasoles cuando se aumenta el contenido de ácido graso saturado cuando el valor del coeficiente \alpha es de 0,5. Véase la leyenda de la figura para la nomenclatura de TAGs.

La figura 3 muestra la distribución de los triglicéridos (TAGs) en las semillas segregadas por las características de alto oleico y alto esteárico frente al contenido de ácido graso saturado.

La distribución teórica, como control, se representa como líneas y la distribución de las muestras de aceites diferentes se representa como símbolos, véase la leyenda de la figura para la nomenclatura de TAGs.

La invención será adicionalmente ilustrada con los ejemplos a continuación y que no se intenta que limiten la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Introducción

La invención se refiere a un método para preparar semillas de girasol que tengan una mejor distribución de los ácidos grasos saturados en las diferentes especies moleculares de triglicéridos comparadas con las semillas tipo silvestres. Este método incluye la etapa de tratar las semillas de origen con un agente mutagénico durante un periodo de tiempo y en una concentración suficiente para inducir una o más mutaciones en las características del gen envuelto en la biosíntesis de triglicéridos. Esto origina una producción aumentada de especies de triglicéridos del tipo SUS y menor contenido de SUU. Estos agentes mutagénicos incluyen agentes tales como la azida sódica o un agente alquilante, como metilsulfonato de etilo, pero cualquier otro agente mutagénico que tenga el mismo o similar efecto puede también usarse. Las semillas tratadas contendrán cambios genéticos hereditarios.

Estas semillas mutadas son después germinadas y las plantas progenie se desarrollan a partir de ellas. Para aumentar las características en las líneas la progenie puede cruzarse o no cruzarse. Las semillas de la progenie se recogen y analizan. Las semillas que tienen la característica de triglicérido aleatorio o casi aleatorio pueden después cruzarse con cualquier otra línea y la característica transferirse. Opcionalmente, puede haber ciclos adicionales de germinación, cultivo, y aislamiento para fijar la homocigocidad de las características en las líneas y cruzamientos y en la colección de semillas.

El metilsulfonato de etilo se usó como agente mutagénico en el ejemplo 1. Se obtuvo una línea de girasol con un valor de \alpha mayor de 0,4. La línea de origen del girasol original mutagenizada fue CAS-10 (Colección de girasol del Instituto de la grasa, CSIC, Sevilla, España). El aceite de esta línea tiene un valor de \alpha inferior a 0,38. El alto material oleico usado aquí se deriva de las líneas oleicas investigadas por los rusos (Soldatov, 1976) que tienen un valor de \alpha entre 0,15 y 0,27.

El material de esteárico alto oleico alto se derivó de los cruzamientos de la línea de oleico alto con el mutante CAS-3 depositado con el número de acceso de la ATCC 75968, y la selección de las semillas de alto esteárico alto oleico como se describe en el documento de patente internacional WO-0074470 "High oleic high stearic plants, seeds and oils". Se describe un método para las preparaciones de planta de valor \alpha alto con más ácido linoleico que ácido oleico y viceversa en los ejemplos siguientes.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Se mutagenizaron semillas con una solución 70 mM de metilsulfonato de etilo (EMS) en agua. El tratamiento se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación (60 rpm). Después de la mutagénesis la solución de EMS se despreció y las semillas se lavaron durante 16 horas con agua del grifo.

Las semillas tratadas se germinaron en el campo y las plantas se autopolinizaron. Las semillas recolectadas de estas plantas se usaron para seleccionar nuevas líneas de girasoles con modificaciones en la distribución de los triglicéridos. La composición de ácido graso de la semilla se determinó usando el método de Garcés, R. y Mancha, M (1993) y la composición de triglicéridos por cromatografía líquido gas usando el método de Fernández-Moya et al. (2000).

Se seleccionó una primera planta con un valor de \alpha de 0,42. La progenie se cultivó durante cinco generaciones en donde el valor de \alpha aumentó y la nueva característica genética se hizo fija de forma estable en el material genético de la semilla. Esta línea se llamó CAS-36 y tiene un contenido de ácido linoleico que es mayor que el contenido de ácido oleico. Los valores de \alpha mínimo y máximo de la línea fueron 0,38 y 0,5 respectivamente.

La tabla 6 muestra algunos datos del análisis de las semillas de varias plantas CAS-36 y los datos necesarios para calcular los valores de \alpha según la fórmula propuesta.

TABLA 6 Composición de ácidos grasos, ácidos grasos totales saturados (S) y ácidos grasos saturados de la posición sn-2 (S2), composición de TAG y \alphaSat calculado aplicando la fórmula para algunos aceites CAS-36

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Las plantas de girasol se cultivaron a partir de las semillas de girasol de línea de alto oleico alto esteárico como la que se muestra en la tabla 2. Las plantas de girasol también se cultivaron de las semillas de girasol CAS-36. Las líneas se cruzaron. Las plantas fueron asistidas por polinización artificial para asegurar la producción adecuada de semillas. Se produjo la semilla F1 en la línea de alto oleico alto esteárico, o viceversa, y se recolectó. Se seleccionaron las semillas F2 con más de 0,82 de valor de \alpha, alto ácido esteárico y más ácido oleico que ácido linoleico. Aunque esto produce el aceite de la presente invención el nivel de producción es limitado. Por lo tanto líneas endogámicas fijas que muestran semillas con estos valores de \alpha son deseables.

Estas líneas endogámicas fijas homocigotas de alto oleico alto esteárico pueden entonces ser cruzadas para formar semillas híbridas, que producirán semillas F2 que muestran las características deseadas del aceite de la presente invención. Para este fin las semillas F1 se plantaron y las plantas producidas se autoreprodujeron en condiciones de aislamiento y se produjo la semilla F2. La semilla F2 se probó en cuanto al valor de \alpha. La porción remanente de las semillas evidenciando la característica se empleó para cultivar plantas para formar la semilla F3. El procedimiento de autoreproducción de cribado y selección se repite para desarrollar la línea homocigota fija con un valor de \alpha mayor de 0,28, teniendo todos ellos un valor de \alpha de 0,5 o cerca de 0,5.

Una vez que la característica sea fija pueden cruzarse líneas de alto oleico similares para formar semillas híbridas que tienen la característica como se muestra en la tabla 7. Según la invención las plantas de girasol y las semillas de las que dicho aceite puede extraerse han sido obtenidas por medio de un procedimiento de biotecnología. El contenido del valor de \alpha es una característica heredable y es bastante independiente de las condiciones de cultivo.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7

Se muestran el contenido de acido esteárico (18:0), contenido de ácido graso saturado total (S), relación ácido oleico/ácido linoleico (O/L), los grupos TAG diferentes y el valor del coeficiente de distribución \alpha en las líneas derivadas de cruces de la línea mutante de CAS-36 y CAS 15 o CAS 25 (Tabla 2), líneas de alto esteárico. La relación de contenidos de ácido oleico frente a ácido linoleico está representada como O/L, siendo >1 ya que el contenido de ácido oleico es mayor que el contenido de ácido linoleico en las líneas seleccionadas.

30

31

Referencias

1. Álvarez-Ortega, R., Cantisán, S., Martinez-Force, E. y Garcés, R. (1997) Characterization of polar and non-polar seed lipid classes from highly saturated fatty acid sunflower mutants. Lipids 32, 833-837.

2. Chow, C. K. (1992) Fatty acids in food and their health implications. Marcel Dekker, New York.

3. Fernández-Moya, V., Martínez-Force, E. y Garcés, R. (2000) Identification of triacylglycerol species from high-saturated sunflower (Helianthus annuus) mutants. Agric. Food Chem. 48, 764-769.

4. Garcés, R. y Mancha, M. (1993) One-step lipid extraction and fatty acid methyl esters preparation from fresh plant tissues. Anal. Biochem. 211, 139-143.

5. Gunstone, F. D., Harwood, J. L. y Padley, F. B. (1994) The Lipid Handbook. Chapman and Hall. London.

6. Laakso, P. y Christie, W. W. (1990) Chromatographic resolution of chiral diacylglycerol derivatives: potential in the stereo-specific analysis of triacyl-sn-glycerols. Lipids 25, 349-353.

7. Osorio, J., Fernández-Martínez, J., Mancha, M. y Garcés, R. (1995) Mutant sunflowers with high concentration of saturated fatty acids in the oil. Crop Sci. 35, 739-742.

8. Reske, J., Siebrecht, J. y Hazebroed, J. (1997). Triacylglycerol composition and structure in genetically modified sunflowers and soybean oils. J. Am. Oil Chem. Soc. 74, 989-998.

9. Takagi, T. y Ando, Y. (1991) Stereospecific analysis of triacyl-sn-glycerols by chiral HPLC. Lipids 26, 542-547.

10. Vander Wal, R. J. (1960) Calculation of the distribution of the saturated and unsaturated acyl group in fats, from pancreatic lipase hydrolysis data. J. Am. Oil Chem. Soc. 37, 18-20.

11. Soldatov, K. I. (1976). Chemical mutagenesis in sunflowers breeding. Págs 352-357. En: Proc. 7^{th} Int. Sunflower Association. Vlaardingen, Holanda.

Claims

1. Un aceite de girasol directamente obtenido de la semillas de girasol con un contenido de ácido esteárico de 12-40,8% en relación al contenido de ácido graso total, y en donde el contenido de ácido oleico es mayor que el contenido de ácido linoleico en el aceite, caracterizado porque el coeficiente de distribución de los ácidos grasos saturados \alpha entre las posiciones sn-1 y sn-3 es al menos del 0,28, cuyas semillas se obtienen mediante el cultivo de las plantas de girasol a partir de las semillas de girasol de una línea de alto contenido de ácido oleico y ácido esteárico, cultivar las plantas de girasol de las semillas de girasol de CAS-36, que tiene un número de acceso del depósito de ATCC PTA-5041, cruzar las líneas para producir semillas F1 y recolectar las semillas, producir las semillas F2 y seleccionar las semillas con más de un valor de \alpha de 0,28, alto contenido de ácido esteárico y más contenido de ácido oleico que de ácido linoleico, en donde el coeficiente \alpha se calcula usando la fórmula

32

S_{1} es el contenido de ácido graso saturado en la posición sn-1 de TAG, S_{3} es el contenido de ácidos grasos saturados en la posición sn-3 de TAG y \alphaS es el menor de los dos valores, excepto cuando ambos son 0,5, entonces \alpha es 0,5.

2. El aceite de girasol según la reivindicación 1, caracterizado porque el coeficiente de distribución de ácidos grasos saturados \alpha entre las posiciones sn-1 y sn-3 es al menos 0,32.

3. El aceite de girasol según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el coeficiente de distribución de ácidos grasos saturados \alpha entre las posiciones sn-1 y sn-3 es al menos 0,36.

4. El aceite de girasol según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado por que el contenido de ácido esteárico en relación al contenido total de ácidos grasos es al menos del 20%.

5. Una planta de girasol que forma semillas que contienen un aceite endógeno según las reivindicaciones 1-4.

6. Semillas de girasol producidas por plantas de girasol según la reivindicación 5.

7. Una planta de girasol híbrida cuyas semillas contienen un aceite endógeno con un contenido de ácido esteárico del 12-40,8% en relación al contenido total de ácidos grasos, y en cuyo aceite el contenido de ácido oleico es mayor que el contenido de ácido linoleico, y un coeficiente de distribución \alpha de ácidos grasos saturados entre las posiciones sn-1 y sn-3 de al menos 0,28, dicha planta se obtiene cruzando una primera planta de origen como se reivindica en la reivindicación 5 y una segunda planta de origen que tiene características deseables.

8. La planta hibrida de girasol como se reivindicó en la reivindicación 7, que se obtiene cruzando una primera planta de origen que es una planta como se reivindicó en la reivindicación 5 y una segunda planta de origen que es una planta como se reivindicó en la reivindicación 5 con otras características deseables.

9. La progenie de la planta de girasol reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 7-8, cuyas semillas contienen un aceite endógeno con un contenido de ácido esteárico de 12-40,8% en relación al contenido de ácido graso total y en cuyo aceite el contenido de ácido oleico es mayor que el contenido de ácido linoleico y un coeficiente de distribución \alpha de ácidos grasos saturados entre las posiciones sn-1 y sn-3 de al menos 0,28.

10. Un aceite de girasol como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la producción de un producto alimenticio.

11. El producto alimenticio que comprende un aceite de girasol como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.