WO2014097218A1 - Óleo de girassol (helianthus annuus) modificado enzimaticamente, processo de obtenção e uso dos seus derivados como antimicrobianos - Google Patents

Óleo de girassol (helianthus annuus) modificado enzimaticamente, processo de obtenção e uso dos seus derivados como antimicrobianos Download PDF

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WO2014097218A1 PCT/IB2013/061153 IB2013061153W WO2014097218A1 WO 2014097218 A1 WO2014097218 A1 WO 2014097218A1 IB 2013061153 W IB2013061153 W IB 2013061153W WO 2014097218 A1 WO2014097218 A1 WO 2014097218A1
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oil
food
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Evanguedes KALAPOTHAKIS
Júnia Maria Netto VICTORIA
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Universidade Federal De Minas Gerais - Ufmg
Phoneutria Biotecnologia E Serviços Ltda
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A23D9/02—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils characterised by the production or working-up
    • A23D9/04—Working-up
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
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    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3472—Compounds of undetermined constitution obtained from animals or plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom

Definitions

  • the present invention provides an alternative to overcome the limitations encountered in the use of essential oils as preservatives by proposing enzymatically modified sunflower oil through lipase treatment, the process of obtaining modified sunflower oil (Heliantus annuus) and its derivatives and the use thereof. use of these derivatives as antimicrobial agents for the preservation of food, cosmetics and medicines.
  • OTD OTD-associated bowel disease
  • organs and systems can also be observed (meninges, kidneys, liver, central nervous system and peripheral nerve endings) (Carmo, GMI; Oliveira, AA Dimech, CP; Santos, DA; Almeida, MG; Berto, LH; Alves, RMS; Carmo, EH Epidemiological Surveillance of Foodborne Diseases in Brazil, 1999-2004 Ministry of Health Secretariat of Health Surveillance Department of Epidemiological Surveillance Epidemiological e-newsletter, year 5, n.6 , 2005).
  • antibiotics can act on the digestive tract by eliminating bacteria that positively assist the digestive process by breaking enzymes from different substrates (Mathew AG, Cissell R, Liamthong S., Antibiotic resistance in bacteria associated with food animals: a United States perspective of livestock production Foodborne Pathog Dis 2007 Summer; 4 (2): 1 15-33).
  • Chlorine dioxide is another example of an antimicrobial agent that has been used to sterilize food and or its packaging (Vandekinderen I, Devlieghere F, Van Camp J, Kerkaert B, Rucert P, De Bruyne J , By Meulenaer B.
  • Pasteurization is characterized by a heat treatment of the food at temperatures below 100 and C. It is especially useful when more severe heat treatments change important food characteristics (eg autoclaving and sterilization).
  • the use of ultrasound, radiation, electric fields, freezing, desiccation with or without lyophilization, tindalization and filtration are other examples of mechanisms used in food sterilization [Chandrapala J, Oliver C, Kentish S, Ashokkumar M. Ultrasonics in food processing. Ultrason Sonochem. 2012 Sep; 19 (5): 975-83.
  • Antimicrobial composition formulated with essential oils is an alternative that has been increasingly studied and used [Antimicrobial composition formulated with essential oils. Publication number: EP1278420 (A1). Antidiarrheal and antimicrobial compositions, use of the compositions, antidiarrheal and antimicrobial drug, method of treating conditions, diseases or dysfunctions of microbial origin, or relating to the presence of microorganisms and method of treating diarrhea, of inflammatory origin or caused by microorganisms. Publication number: PI0802674-2 A2].
  • Essential oils are defined as volatile molecules extracted from oils, for example by distillation. Many of them have antimicrobial activities for food conservation and sterilization of environments where there is a high risk of contamination (work benches, bathrooms, etc.).
  • Several components of the essential oils have been isolated and characterized, as examples are: carvacrol, thymol, picymene, linalool, cinnamaldehyde, anethole, limonene, apiole, beta fenchylacetate, perillene.
  • Carvacrol can be isolated from oregano (origanum vulgaré), thyme (Thymus vulgaris) and other sources.
  • Carvacrol inhibits the growth of bacteria such as Escherichia coii and Baciilus cereus, Pseudomonas aeruginosa, etc.
  • the mechanism of action is believed to involve damage to the cell wall and membrane of these microorganisms.
  • Patent application number PI0905003-5 A2 describes antimicrobial formulations using thymol and carvacrol for application in alcoholic fermentations to control bacterial and fungal growth in the culture medium, enabling the use of inactivated yeast as a food supplement without incurring risks to human or animal health. Therefore, thymol (2-isopropyl-5-methylphenol, thymol) is another example of a component found in essential oils with strong antimicrobial activity. In addition to acting on various types of bacteria, thymol has a proven action in inhibiting the growth of various types of fungi (Antimicrobial composition Publication number: US 201 1/02231 14).
  • Antimicrobial packaging material EP1773130 A4 (taken from WO2006000032A1). Breath freshening and oral cleansing product with cinnamaldehyde US 2004/0086546 A1.
  • Bactericidal preparation A4 (taken from WO2001070215A1).
  • Microbiocidal formulation comprising citral EP1434486 B2. Use of benzoic acid and thymol, eugenol and piperine in animal feeding EP2042041 A2.
  • compositions and methods for preservation of food EP1476194 A4 (taken from WO2003070181 A2).
  • Methods and compositions for the treatment of infection or infectious colonization of the eyelid, ocular surface, skin or ear EP2018103 A2 (taken from WO2007120817A2).
  • Compositions and methods comprising terpenes or terpene mixtures selected from thymol, eugenol, geraniol, citral, and 1-carvone PI0619383-8 A2].
  • the antimicrobial activity of aliphatic tail medium chain fatty acids of 6 to 12 carbons has also been presented in studies and patents.
  • the patent application “Medium chain fatty acids applicable to antimicrobial agents” uses caproic acid (C6) CH 3 (CH 2 ) 4 COOH, caprylic acid (C8) CH 3 (CH 2 ) 6 COOH and capric acid ( C10) CH 3 (CH 2 ) 8 COOH in the elaboration of a product with antimicrobial action.
  • Another example of medium chain fatty acids is lauric acid (CH3 (CH2) ioCOOH) found in coconut oil and also in human breast milk. Its antimicrobial properties are also described in various publications and patents.
  • Antimicrobial agents for foods EP0847704 A1. Antimicrobial compositions within antioxidant solutions used to protect whole protein foods US20120219682 A1)].
  • the second reagent, Surfactin is a lipopeptide produced by Bacillus subtilis.
  • the two technologies described by Melvin Joe et al. (2012a, 2012b) differ from the present technology which does not use detergents or surfactin emulsifying agent in the treatment of sunflower oil.
  • FIGURE 1 Inhibition of microbial growth of different strains after incubation with compound PHT436 (aqueous phase obtained by oil treatment) sunflower seeds) 1: 2 and 1: 4 dilutions.
  • PHT436 aqueous phase obtained by oil treatment
  • sunflower seeds 1: 2 and 1: 4 dilutions.
  • Candida krusei yeast
  • lipase enzymatically treated sunflower oil (Heliantus annuus) is used as antimicrobial agent. It was also verified that the active ingredient responsible for antimicrobial activity is resistant to sterilization processes with high temperatures and pressure (autoclaving), which will favor food preparation and sterilization processes. Soybean, olive, corn, sesame, palm, macauba, and sunflower oils were tested, however, only lipase-treated sunflower oil showed significant antimicrobial activity. Further, it is possible to use the aqueous, intermediate and oily derivatives of sunflower oil in compositions comprising other preservatives to maximize the effect of the composition.
  • Sunflower oil was incubated with lipase diluted in sterile buffer (10 mM Tris-HCl pH 9.8) or pure water at 37 Q C under gentle stirring for times ranging from 4 hours to 20 days. Temperatures between 20 Q C and 45 Q C also showed efficient results in this process.
  • sterile buffer 10 mM Tris-HCl pH 9.8
  • oil was also incubated in the same condition except for the absence of lipase enzyme.
  • the oil was preferably sterilized by autoclaving (15 minutes, 121 ° C, 1 ATM) prior to treatment with the lipase enzyme. After the incubation period the oil phase, intermediate phase (emulsified oil) and aqueous phase were separated by a separatory funnel.
  • Sterility tests were performed by plating the phases obtained in 100 - 90 mm petri dish with appropriate culture medium (2XYT, BHI or Muller Hinton and incubation for 24 hours.
  • appropriate culture medium (2XYT, BHI or Muller Hinton and incubation for 24 hours.
  • Different trademarks of sunflower oil were used. they were in some cases centrifuged for 10 - 30 minutes with 1 000 - 10,000 rpm in a tube compatible with the volume produced for better phase separation.
  • oily, intermediate (emulsified oil) and aqueous phases obtained by treating sunflower oil with lipase and separated by a separatory funnel were used.
  • Sample 4 aqueous phase obtained by treating sunflower oil with lipase.
  • Sample 5 lipase enzyme.
  • Sample 6 lipase enzyme solubilization vehicle (10 m Tris pH 9.8 or ultra-pure water).
  • Disc - diffusion method A.D. echo from 8-24h cultures of Staphylococcus aureus ⁇ TCC 25923, Bacilius cereus ⁇ TCC 14579 bacteria, and Candida krusei ATCC 9 yeast were adjusted to 0.1 and 0.01. Then 1 ml of the culture of each microorganism was spread on the surface of 2xYT agar (Staphylococcus aureus, BaciHus cereus and Candida krusei) or in BHI or Muller Hinton medium in 90 - 100 mm diameter petri dishes (excess was pipetted and discarded).
  • Sample 1 untreated sunflower oil; Sample 2 - oil phase of lipase treated sunflower oil; Sample 3 - intermediate phase (emulsified oil) after lipase treatment; Sample 4 - aqueous phase obtained by treating sunflower oil with lipase; Sample 5 - lipase enzyme; Sample 6 - lipase enzyme solubilization vehicle (10 m Tris pH 9.8 or water-scented water); 7 - control with culture medium).
  • the inhibitory capacity of the compound was evaluated by serial dilution antimicrobial susceptibility testing.
  • cultures of Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus cereus (ATCC 14579), Escher ⁇ chia coli (ATCC 1 1303), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), and Candida krusei (ATCC 9) in LB broth were prepared and incubated during LB broth. 24 hours at 37 Q C.
  • Listeria monocytogenes ATCC 15313
  • Salmonella enterica ATCC 10708 was used BHI medium.
  • each microorganism was incubated with different concentrations of PHT436 for 24 hours at 37 Q C. Finally, the mixture was plated on plates containing solid media to verify the growth of microorganisms. In parallel, a control was performed only with the culture of all standard strains (without sample PHT436) with the same dilutions ( Figure 1).
  • test sample and controls [(Sample 1 - untreated sunflower oil; Sample 2 - lipase-treated sunflower oil oily phase; Sample 3 - intermediate phase (emulsified oil)] after lipase treatment; Sample 4 - aqueous phase obtained by treating sunflower oil with lipase; Sample 5 - lipase enzyme; Sample 6 - lipase enzyme solubilization vehicle (10 m Tris pH 9.8 or ultra-pure water); 7 - culture medium) were added to tube 1 containing 200 ⁇ of the diluted culture. After votex homogenization for 20 seconds from the first tube, the test sample and controls (1: 2) were serially diluted to tube 8 (1: 256 final dilution).
  • Table II Method of liquid inhibition of modified sunflower oil derivatives. Result expressed as percentage of microbial growth in relation to the control group. Control group 1 (microorganisms incubated with non-lipase treated sunflower oil) with 100% growth.

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Abstract

A presente invenção apresenta uma alternativa para superar as limitações encontradas no uso de óleos essênciais como conservantes, propondo o óleo de girassol modificado enzimaticamente através do tratamento com lipase, o processo de obtenção do óleo de girassol (Heliantus annuus) modificado e seus derivados e o uso desses derivados como agentes antimicrobianos para conservação de alimentos, cosméticos e medicamentos.

Description

ÓLEO DE GIRASSOL (Helianthus annuus) MODIFICADO
ENZIMATICAMENTE, PROCESSO DE OBTENÇÃO E USO DOS SEUS
DERIVADOS COMO ANTIMICROBIANOS
A presente invenção apresenta uma alternativa para superar as limitações encontradas no uso de óleos essênciais como conservantes, propondo o óleo de girassol modificado enzimaticamente através do tratamento com lipase, o processo de obtenção do óleo de girassol {Heliantus annuus) modificado e seus derivados e o uso desses derivados como agentes antimicrobianos para conservação de alimentos, cosméticos e medicamentos.
A contaminação de alimentos por microrganimos patogênicos é um problema mundial. No Brasil dados da Secretaria de Vigilância em Sáude brasileira, indicam 6.062 surtos de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) entre os anos de 1999 a 2008. Aproximadamente 1 17 mil pessoas foram afetadas resultando no registro de 64 óbitos. Entre os agentes etiológicos envolvidos com os surtos de DTA, as bactérias aparecem com 84% seguidas por vírus com 14% do total de casos. Salmonella spp, E. coli, S. aureus, Shigella spp, B. cereus e C. períríngens, foram os agentes bacterianos mais frequentes. Foi verificado ainda, que Salmonella spp. foi responsável por 42% dos casos, seguida pelo S. aureus com 20% e B. cereus por 7% (Brasil, Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde - SVS. 2008. Disponível em: http://portal. saúde. gov.br/portal/saude/visualizar_texto. cfm?idtxt=27500).
A presença de agentes responsáveis por manifestações severas como, por exemplo, a Escherichia coli 0157:H7 tem sido uma grande preocupação no Brasil e no mundo (Regua-Mangia AH, Gonzalez AG, Cerqueira AM, Andrade JR. Molecular characterization of Escherichia coli O157:H7 strains isolated from different sources and geographic regions. J Vet Sei. 2012 Jun;13(2):139- 44.)
Os sintomas causados por DTA são amplos com destaque para um leve desconforto intestinal até quadros sérios, como desidratação grave, diarréia sanguinolenta, insuficiência renal aguda e insuficiência respiratória. Dependendo do agente etiológico envolvido, da idade, estado nutricional e da saúde da pessoa contaminada, o acometimento de órgãos e sistemas também podem ser observados (meninges, rins, fígado, sistema nervoso central e terminações nervosas periféricas) (Carmo, G. M. I.; Oliveira, A. A. Dimech, C. P.; Santos, D. A.; Almeida, M. G.; Berto, L. H.; Alves, R. M. S.; Carmo, E. H. Vigilância epidemiológica das doenças transmitidas por alimentos no Brasil, 1999-2004. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Boletim eletrônico epidemiológico, ano 5, n.6, 2005).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária brasileira determinou, por meio da Resolução - RDC nQ 12, de 2 de janeiro de 2001 , regulamentos técnicos sobre padrões microbiológicos para alimentos (Brasil. Mistério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nQ 12 de 2 de janeiro de 2001 . Regulamento Técnico sobre Padrões Microbiológicos para Alimentos. Brasília, 2001 ). Existe uma descrição qualitativa e quantitativa máxima permitida sobre a presença de, por exemplo, coliformes a 45°C ou coliformes de origem fecal em todos os grupos de alimento; bolores e leveduras em frutas, produtos de frutas e similares, e em alimentos para grupos populacionais específicos (para imunosuprimidos e imunocomprometidos); estafilococos coagulase positiva em vários grupos de alimentos; B. cereus em alguns alimentos; clostrídio sulfito redutor a 46°C (para indicação de Clostrídium perfringens) em carnes e produtos cárneos; Vibrío parahaemolyticus em produtos à base de pescados; Pseudomonas aeruginosa em água envasada para o preparo de mamadeiras e de alimentos para imunosuprimidos, imunocomprometidos e para dietas enterais; e aeróbios mesófilos viáveis em alguns alimentos.
Existe uma preocupação permanente da indústria alimentícia na busca de mecanismos que possam ser utilizados na eliminação e redução de contaminantes biológicos nos alimentos industrializados. Antibióticos foram inicialmente utilizados em grande quantidade, por exemplo, em rações animais (Patent number: 3098744, Filing date: Apr 8, 1960, Issue date: 1963 fonte on line:
http://www.google.com/patents/US3098744?printsec=abstract&dq=food+antibio tic&ei=yW-NUI_7MfS30QHm
4HQAg#v=onepage&q=food%20antibiotic&f=false). Porém, devido aos problemas ligados a seleção de microrganismos resistentes, a adição de antibióticos aos alimentos vem sendo cada vez mais alvo de críticas de especialistas (Marshall BM, Levy SB. Food animais and antimicrobials: impacts on human health. Clin Microbiol Rev. 201 1 Oct;24(4):718-33. doi: 10.1 128/CMR.00002-1 1 ) (Juneja VK, Dwivedi HP, Yan X. Novel natural food antimicrobials Annu Rev Food Sei Technol. 2012;3:381 -403). A principal preocupação envolvem antibióticos que são utilizados na medicina humana (exemplo: penicilina e as tetraciclinas). Além disso, deve ser considerado, que antibióticos podem atuar no trato digestivo eliminando bactérias que auxiliam de forma positiva no processo digestivo pela quebra enzimática de diferentes substratos (Mathew AG, Cissell R, Liamthong S., Antibiotic resistance in bactéria associated with food animais: a United States perspective of livestock production. Foodborne Pathog Dis. 2007 Summer;4(2):1 15-33).
Conservantes químicos como os nitritos e nitratos, cloreto de sódio, açúcares, CO2, dentre outros são também exemplos importantes de mecanimos preventivos. De acordo com a legislação brasileira a utilização desses reagentes químicos devem seguir normas rígidas que assegurem o bem estar do consumidor. Por exemplo, a Portaria nQ 1 .004, de 1 1 de dezembro de 1998 determina quantidades específicas de nitrato de sódio que podem ser utilizadas em carnes e produtos cárneos (0.03 g/100g). O dióxido de cloro (CIO2) é outro exemplo de agente antimicrobiano que vem sendo utilizado na esterilização de alimentos e ou de suas embalagens (Vandekinderen I, Devlieghere F, Van Camp J, Kerkaert B, Cucu T, Ragaert P, De Bruyne J, De Meulenaer B. Effects of food composition on the inactivation of foodborne microorganisms by chlorine dioxide. Int J Food Microbiol. 2009 May 31 ;131 (2- 3):138-44. Epub 2009 Feb 1 1 . Use of chlorine dioxide gas as a chemosterilizing agent, Patent number: 4504442, Filing date: Oct 19, 1982, Issue date: Mar 12, 1985).
O controle da presença e ou crescimento de microrganismos pode também ser feito por meio de mecanismos físicos. A pasteurização é caracterizada por um tratamento térmico do alimento em temperaturas inferiores a 100 eC. É especialmente útil quando tratamentos térmicos mais severos mudam características importantes dos alimentos (exemplo: autoclavagem e esterilização) (Method of pasteurizing meat products. Patent number: 6080437 Filing date: Dec 5, 1997 Issue date: Jun 27, 2000). A utilização de ultrassom, radiação, campos elétricos, congelamento, dessecação com liofilização ou não, tindalização e filtração são outros exemplos de mecanismos utilizados na esterilização de alimentos [Chandrapala J, Oliver C, Kentish S, Ashokkumar M. Ultrasonics in food processing. Ultrason Sonochem. 2012 Sep;19(5):975-83. Epub 2012 Jan 31 ; Moosekian SR, Jeong S, Marks BP, Ryser ET. X-ray irradiation as a microbial intervention strategy for food. Annu Rev Food Sei Technol. 2012;3:493-510. Epub 201 1 Dec 9; Mosqueda-Melgar J, Elez-Martínez P, Raybaudi-Massilia RM, Martín-Belloso Effects of pulsed electric fields on pathogenic microorganisms of major concern in fluid foods: a review. O.Crit Rev Food Sei Nutr. 2008 Sep;48(8):747-59. Elmnasser N, Guillou S, Leroi F, Orange N, Bakhrouf A, Federighi M Pulsed- light system as a novel food decontamination technology: a review. Can J Microbiol. 2007, Jul;53(7):813-21 . Methods for Preparing Probiotic Nanoparticles. Application number: 12/939,395. Publication number:US 2012/01 14776 A1 . Filing date: Nov 4, 2010].
A utilização de óleos essenciais como agentes antimicrobianos é uma alternativa que vem sendo cada vez mais estudada e utilizada [Antimicrobial composition formulated with essential oils. Publication number: EP1278420 (A1 ). Composições antidiarréicas e antimicrobianas, uso das composições, medicamento antidiarréico e antimicrobiano, método de tratamento de afecções, doenças ou disfunções de origem microbiana, ou relativas à presença de microorganismos e método de tratamento de diarréia, de origem inflamatória ou causada por microorganismos. Publication number: PI0802674-2 A2].
Óleos essenciais são definidos como sendo moléculas voláteis extraídas de óleos, por exemplo, por meio de destilação. Muitos deles possuem atividades antimicrobianas com utilização na conservação de alimentos e na esterilização de ambientes onde existe risco acentuado de contaminação (bancadas de trabalho, banheiros, etc). Vários componentes dos óleos essenciais têm sido isolados e caracterizados, como exemplos temos: o carvacrol, thymol, picymene, linalool, cinnamaldehyde, anethole, limonene, apiole, beta fenchylacetate, perillene. O carvacrol pode ser isolado do orégano {origanum vulgaré), tomilho (Thymus vulgaris) e de outras fontes. Carvacrol inibi o crescimento de bactérias como Escherichia coii e Baciilus cereus, Pseudomonas aeruginosa, etc. Acredita-se que o mecanismo de ação envolva danos na parede e membrana celular desses microrganismos.
O pedido de patente de número PI0905003-5 A2, descreve formulações antimicrobianas que utilizam timol e carvacrol para aplicação em fermentações alcoólicas visando o controle de crescimento bacteriano e fúngico no meio de cultivo, possibilitando o uso da levedura inativada como complemento alimentar, sem incorrer em riscos a saúde humana ou animal. Portanto, o timol (2-isopropyl-5-methylphenol, thymol) é outro exemplo de componente encontrado em óleos essenciais com forte atividade antimicrobiana. Além de atuar sobre vários tipos de bactérias o timol possui ação comprovada na inibição do crescimento de vários tipos de fungos (Antimicrobial composition Publication number: US 201 1 /02231 14). Ele é obtido de extratos de orégano {origanum vulgaré), tomilho {Thymus vulgaris), monarda {Monarda fistulosa) dentre outras plantas e tem como isômero o carvacrol (discutido acima). P-cimeno, linalol, cinamaldeído, anetole, limoneno, citral, eugenol, fitol: são outros exemplos de compostos obtidos de óleos com atividade antimicrobiana [Kiskó G, Roller S. Carvacrol and p-cymene inactivate Escherichia coli O157:H7 in apple juice. BMC Microbiol. 2005 Jun 17;5:36. Novel nutraceutical compositions containing thymol and/or p-cymene or plant extracts for cognition- EP2197435 A1 . Antimicrobial packaging material EP1773130 A4 (retirado de WO2006000032A1 ). Breath freshening and oral cleansing product with cinnamaldehyde US 2004/0086546 A1 . Antimicrobial flavouring composition EP2099421 B1 . Bactericidal preparation EP128951 1 A4 (retirado de WO2001070215A1 ). Microbiocidal formulation comprising citral EP1434486 B2. Use of benzoic acid and thymol, eugenol and piperine in animal feeding EP2042041 A2. Compositions and methods for preservation of food EP1476194 A4 (retirado de WO2003070181 A2). Methods and compositions for the treatment of infection or infectious colonization of the eyelid, ocular surface, skin or ear EP2018103 A2 (retirado de WO2007120817A2). Composições e métodos compreendendo terpenos ou misturas de terpenos selecionadas de timol, eugenol, geraniol, citral, e l-carvona PI0619383-8 A2].
A atividade antimicrobiana de ácidos graxos de cadeia média com cauda alifática de 6 a 12 carbonos vem sendo também apresentada em estudos e patentes. Por exemplo, o pedido de patente "Médium chain fatty acids applicable as anti-microbial agents" utiliza ácido caproico (C6) CH3(CH2)4COOH, ácido caprílico (C8) CH3(CH2)6COOH e ácido cáprico (C10) CH3(CH2)8COOH na elaboração de um produto com ação antimicrobiana. Outro exemplo de ácidos graxos de cadeia média é o ácido láurico (CH3(CH2)ioCOOH) encontrado no óleo de coco e também no leite materno de humanos. Suas propriedades antimicrobianas são também descritas em várias publicações e patentes [Médium chain fatty acids applicable as anti-microbial agents EP1765318 A2 (retirado de WO2006002927A2). Antimicrobial agents for foods EP0847704 A1 . Antimicrobial compositions within antioxidant solutions used to protect whole protein foods US20120219682 A1 )].
Se por um lado os compostos citados acima (óleos essenciais e ácidos graxos de cadeia média) possuem rica literatura quanto suas ações antimicrobianas, o uso de óleos não processados apresenta uma literatura bem mais limitada. Como exemplos, citamos os óleos de eucalipto ( género Eucalyptus com várias espécies), Jojoba {Simmondsia chinensis) e coco {Cocos Nucifera) que veem se destacando por suas propriedades antimicrobianas (An antimicrobial composition. EP1049378 B1 ). A modificação de óleos de coco {Cocos nucifera) e palma {Elaeis guineensis) por meio da enzima lipase foi descrita na patente US 20210/0016430 A1 "Modified coconut oils with broad antimicrobial spectrum" ano 2010. Os autores descrevem a ação do óleo modificado sobre as bactérias gram positivas Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogene, e também nas bactérias gram negativas Vibrio cholerae, Escherichia coli e sobre a levedura Cândida albicans. Nesse trabalho o óleo de coco foi usado por ser uma fonte rica em ácidos graxos de cadeia média (discutidos acima). Além disso, a propriedade antimicrobiana desses dois óleos (mesmo sem modificações enzimáticas e ou químicas) vem sendo descritas (Use of oils having a high lauric acid content as an animal feed. EP1089635 A4 (text from WO1999066804A1 ), Vijayarathna S, Zakaria Z, Chen Y, Latha LY, Kanwar JR, Sasidharan S.The Antimicrobial efficacy of Elaeis guineensis: characterization, in vitro and in vivo studies. Molecules. 2012 Apr 26;17(5):4860-77).
As tecnologias acima apesar de eficientes possuem várias limitações de uso. O forte odor e ou gosto característico desses óleos alteram o sabor dos alimentos (propriedades organolépticas). Esse problema é comumente descrito nas tecnologias com óleos essenciais, por exemplo, de basil, canela, coentro, cravo-da-índia, cominho, alho, capim-limão, lima, mostarda, mentol, orégano, dentre outros. Um dos maiores problemas passa a ser a relação de quantidade de princípio ativo necessário para o efeito antimicrobiano positivo versus a quantidade de princípio ativo que não irá alterar de forma significativa as características comerciais do produto. Frequentemente as duas combinações limitam e ou invalidam a tecnologia.
A procura por novas tecnologias e ou o aperfeiçoamento daquelas já existentes passam a ter um papel fundamental no controle do crescimento de microrganimos de alimentos, cosméticos e medicamentos. Alternativas de conservação passam também a exigir o estudo e a aplicação sinérgica de diferentes técnicas para disponibilizar à população produtos de qualidade cada vez mais seguros sob o ponto de vista microbiológico e toxicológico. Nesse contexto, a tecnologia aqui proposta é uma alternativa para as limitações indicadas acima por utilizar óleo comercial de girassol {Heliantus annuus) tratado enzimaticamente com lipase.
Recentemente Melvin Joe et al. (2012a) descreveram a atividade antimicrobiana do óleo de girassol emulsificado com o surfactante Polysorbate 80. Esse detergente também chamado de Alkest, Canarcel e Tween 80 vem sendo usado como aditivo em diferentes alimentos, medicamentos e cosméticos. [Antimicrobial compositions for topical use EP0914075 A2 (retirado de WO1998049999A2). Hops acid antibacterial compositions EP1202640 A1 (retirado de WO2001006877A1 ). Antimicrobial composition formulated with essential oils EP1278420 A1 (retirado de WO2001084936A1 ). Compositions and methods for preservation of food EP1476194 A4 (retirado de WO2003070181 A2)]. Os autores encontraram uma redução significativa na população de bactérias heterotróficas produtoras de H2S e ácido lático quando filé do peixe Scomberomorus guttatus era tratado com a emulsão produzida.
Melvin Joe et al. (2012b) emulsificaram óleo de girassol {Helianthus annuus), mamona {Ricinus communis), coco {Cocos nucifera), amendoin (Arachis hypogaea) e gergelim (Sesamum indicum) com o agente surfactante surfactina. Surfactina tem sido utilizada também por suas propriedades antibióticas na composição de diferentes produtos. [Fungicidal and/or bactericidal composition EP1414306 A1 (retirado de WO2003013251 A1 )].
No entanto os registros acima não comprometem a presente tecnologia uma vez que Melvin Joe et al. (2012a, 2012b) modificaram o óleo de girassol pela emulsificação com o detergente Polysorbate 80 (Tween 80) ou com o agente surfactante e também antimicrobiano surfactina. O primeiro reagente, por ser um detergente gera limitações sobre sua utilização em alimentos. Apesar de ser considerado um reagente seguro para saúde humana e animal existe um crescente questionamento sobre seu uso principalmente para consumidores que procuram alternativas mais naturais de alimentos [Coors EA, Seybold H, Merk HF, Mahler V. Polysorbate 80 in medicai products and nonimmunologic anaphylactoid reactions. Ann Allergy Asthma Immunol. 2005 Dec;95(6):593-9]. O segundo reagente, a Surfactina, é um lipopeptídeo produzido pela bacéria Bacillus subtilis. Assim, as duas tecnologias descritas por Melvin Joe et al. (2012a, 2012b) diferem da presente tecnologia que não utiliza detergentes nem o agente emulsificador surfactina no tratamento do óleo de girassol.
BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA FIGURA 1 : Inibição do crescimento microbiano de diferentes cepas após incubação com composto PHT436 (fase aquosa obtida pelo tratamento do óleo de girassol com lipase) diluições 1 :2 e 1 :4. Em A) Bacillus cereus (gram positiva), B) Escherichia coli (gram negativa) e em C) Cândida krusei (levedura). Nas placas onde foram semeadas as cepas sem incubação com o composto houve o crescimento normal dos microorganismos (controle positivo). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A tecnologia aqui proposta é uma alternativa para as limitações indicadas no estado da técnica em relação ao uso de óleos essênciais como antimicrobianos para conservação de alimentos, cosméticos e medicamentos. Na presente tecnologia utiliza-se óleo de girassol {Heliantus annuus) tratado enzimaticamente com lipase como agente antimicrobiano. Foi ainda verificado que o princípio ativo responsável pela atividade antimicrobiana é resistente a processos de esterilização com altas temperaturas e pressão (autoclavagem), o que irá favorecer processos de preparo e esterilização de alimentos. Foram testados óleos de soja, oliva, milho, gergelim, dendê, macaúba, e girasol, no entanto, apenas o óleo de girasol tratado com lipase apresentou atividade antimicrobiana expressiva. Ainda, é possível a utilização dos derivados aquoso, intermediário e oleoso, do óleo de girassol em composições que compreendam outros conservantes para maximizar o efeito da composição.
A presente invenção poderá ser melhor compreendida através dos exemplos, não limitantes, que se seguem:
Exemplo 1 - Obtenção da lipase
Microrganismos produtores de lipase previamente isolados e caracterizados pela empresa Phoneutria Biotecnologia e Serviços foram utilizados na produção das enzimas utilizadas nesse estudo. Os estudos foram realizados preferencialmente mas não exclusivamente com a lipase obtida do isolado PHT436 (fase aquosa obtida pelo tratamento do óleo de girassol com lipase). Enzimas foram esterelizadas por meio de filtração, em filtro de poro de 0.22 micra. Exemplo 2- Tratamento do óleo
Óleo de girassol foi incubado com lipase estéril diluída em tampão (10 mM de Tris-HCI pH 9,8) ou água ultrapura a 37Q C sob agitação leve por tempo variando de 4 horas até 20 dias. Temperaturas entre 20Q C e 45Q C também mostraram resultados eficientes nesse processo. Como controle negativo, óleo foi também incubado na mesma condição, exceto pela ausência da enzima lipase. O óleo foi preferencialmente esterelizado por autoclavagem (15 minutos, 121 °C, 1 ATM) antes do tratamento com a enzima lipase. Após o período de incubação a fase oleosa, fase intermediária (óleo emulsificado) e fase aquosa foram separadas por meio de um funil de decantação. Testes de esterilidade foram realizados por plaqueamento das fases obtidas em placa de petri de 100 - 90 mm com meio de cultura apropiado (2XYT, BHI ou Muller Hinton e incubação por 24 horas. Diferentes marcas comerciais de óleo de girassol foram utilizadas. As amostras acima foram em alguns casos submetidas a centrifugação por 10 - 30 minutos com 1 .000 - 10.000 rpm em tubo compatível com o volume produzido para uma melhor separação das fases.
Exemplo 3- Âtlvldade antimlcrobiana de óleo vegetal modificado por lipase.
As fases oleosa, intermediária (óleo emulsificado) e aquosa obtidas pelo tratamento do óleo de girassol com lipase e separadas por meio de um funil de decantação foram utilizadas.
Como controles foram utilizados óleo de girassol não tratado, enzima lipase, veículo de solubilização da enzima lipase (10 mM de Tris pH 9,8 ou água últrapura) e meio de cultura. As amostras testadas foram identificadas por números como indicado abaixo:
Amostra 1 - óleo de girassol não tratado.
Amostra 2 - fase oleosa do óleo de girassol tratado com lipase.
Amostra 3 - fase intermediária (óleo emulsificado) após tratamento com lipase.
Amostra 4 - fase aquosa obtida pelo tratamento do óleo de girassol com lipase. Amostra 5 - enzima lipase. Amostra 6 - veículo de solubilização da enzima lipase (10 m de Trís pH 9,8 ou água últrapura).
Amostra 7 - controle com meio de cultura.
Método de disco - difusão, A D. O. eco de culturas de 8-24hs das bactérias Staphylococcus aureus ÂTCC 25923, Bacilius cereus ÂTCC 14579, e a levedura Cândida krusei ATCC 9, foram ajustadas para 0,1 e 0.01 . Em seguida, 1 ml da cultura de cada microrganismo foi espalhado na superfície do ágar 2xYT (Staphylococcus aureus, BaciHus cereus e Cândida krusei) ou em BHI ou ainda meio Muller Hinton em placas de petri de 90 - 100 mm de diâmetro (o excesso foi pipetado e descartado).
Discos de papel de filtro estéreis (autoclavados) de 6 mm de diâmetro receberam 5 - 10 μί de cada amostra (Amostra 1 - óleo de girassol não tratado; Amostra 2 - fase oleosa do óleo de girassol tratado com lipase; Amostra 3 - fase intermediária (óleo emulsificado) após tratamento com lipase; Amostra 4 - fase aquosa obtida pelo tratamento do óleo de girassol com lipase; Amostra 5 - enzima lipase; Amostra 6 - veículo de solubilização da enzima lipase (10 mM de Tris pH 9,8 ou água últrapura); 7 - meio de cultura). Após secagem das placas de cultura inoculadas com microrganimos (05 - 10 minutos em temperatura ambiente) os discos de papel de filtro foram gentilmente colocados na superfície do meio. As placas foram incubadas a 37°C (bactéria) ou 25°C (levedura) por 24 hs e a inibição de crescimento observada pela formação do "halo de inibição". Os resultados podem ser observados na Tabela I.
Tabela I - Método de disco - difusão. Diâmetro do "halo de inibição" produzido na cultura de microrganismos em milímetros.
Microrganismo Amostra testada
i 3 4 5 6 7 óleo de fase oleosa fase fase aquosa enzima veículo de Meio de girassol do óleo de intermediária obtida pelo lipase solubilização cultura não tratado girassol tratamento
tratado do óleo de
com lipase girassol
com lipase
Staphylococcus 0 9 8 0 0 0 aureus Bacillus cereus 0 10 9 8 0 0 0
Cândida krusei 0 6 5 6 0 0 0
Amostra 1 - óleo de girassol não tratado; Amostra 2 - fase oleosa do óleo de girassol tratado com lipase; Amostra 3 - fase intermediária (óleo emulsificado) após tratamento com lipase; Amostra 4 - fase aquosa obtida pelo tratamento do óleo de girassol com lipase; Amostra 5 - enzima lipase; Amostra 6 - veículo de solubilização da enzima lipase (10 m de Tris pH 9,8 ou água uitrapura); 7 - controle com meio de cultura).
De acordo com os resultados observa-se que todas as fases, oleosa, intermediária e aquosa, obtidas através da modificação do óleo de girassol, apresentaram atividade antimicrobiana.
Método de inibição em meio líquido
A capacidade inibitória do composto foi avaliada através de testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos por diluição seriada. Para isso, foram preparadas culturas de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus cereus (ATCC 14579), Escheríchia coli (ATCC 1 1303), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), e Cândida krusei (ATCC 9) em LB caldo, e incubadas durante 24 horas a 37QC. Para Listería monocytogenes (ATCC 15313) e Salmonella entérica (ATCC 10708) o meio utilizado foi BHI. Após ajuste da densidade óptica da cultura (DO6oo=0,01 ), cada microrganismo foi incubado com diferentes concentrações do composto PHT436 por 24 horas a 37QC. Por fim, essa mistura foi semeada em placas contendo meio sólido para verificar o crescimento dos microrganismos. Paralelamente, foi feito um controle somente com a cultura de todas as cepas padrão (sem amostra PHT436) com as mesmas diluições (Figura 1 ).
A D. O. eco de culturas de 8-24hs das bactérias Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus cereus (ATCC 14579), Escheríchia coli (ATCC 1 1303), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), e da levedura Cândida krusei (ATCC 9) cultivadas em LB caldo e das bactérias Listería monocytogenes (ATCC 15313) e Salmonella entérica (ATCC 10708) cultivadas em meio BHI foram ajustadas para 0,1 e 0.01 . Em seguida, 200 μΙ da cultura diluída foram distribuídas em tubos de 2,0 mis. 200 μΙ da amostra teste e controles [(Amostra 1 - óleo de girassol não tratado; Amostra 2 - fase oleosa do óleo de girassol tratado com lipase; Amostra 3 - fase intermediária (óleo emulsificado)] após tratamento com lipase; Amostra 4 - fase aquosa obtida pelo tratamento do óleo de girassol com lipase; Amostra 5 - enzima lipase; Amostra 6 - veículo de solubilização da enzima lipase (10 m de Tris pH 9,8 ou água últrapura); 7 - meio de cultura) foram adicionadas no tubo 1 contendo 200 μΙ da cultura diluída. Após homogeneização em votex por 20 segundos do primeiro tubo, procedeu-se a uma diluição seriada da amostra teste e dos controles (1 :2) até o tubo 8 (diluição final de 1 :256). A quantidade de microrganismo foi mantida constante em todos os tubos. Após a diluição, o conteúdo de cada tubo foi novamente homogeneizado em votex por 20 segundos e então 100 μΙ do conteúdo de cada tubo foram adicionados em poços de uma placa de microtitulação de 96 poços. Um controle extra contendo apenas o microrganismo diluído na D.0.60o = 0,01 foi também utilizado. Após incubação a 37°C (bactéria) ou 25°C (levedura) por 12 horas, 100 μΙ de cada amostra foram plaqueados em placa de 90 - 100 mm contendo o meio de cultura apropriado nas diluições 1 :100 e 1 :1000 e incubadas a 37°C (bactéria) ou 25°C (levedura) por 24hs. O número de colónias foi determinado por contagem direta. Todos os pontos foram feitos em tríplicata com repetições de no mínimo 3 vezes realizadas em dias diferentes. O procedimento foi também realizado com óleo comercial de girassol de diferentes marcas. Os resultados podem ser observados na tabela II.
Tabela II - Método de inibição em meio líquido dos derivados de óleo de girassol modificados. Resultado expresso em porcentagem de crescimento microbiano em relação ao grupo controle. Grupo 1 controle (microrganismos incubados com óleo de girassol não tratato com lipase) com 100% de crescimento.
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Através dos resultados observa-se que todas as fases obtidas do óleo de girassol tratado com lipase (fase oleosa, aquosa e intermediária) foram efetivas em inibir o crescimento de todos os microrganismos testados. Os melhores resultados foram obtidos com as diluições de 1 :2 e 1 :4 dos antimicrobianos testados. A figura 1 ilustra alguns desses resultados.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1- Processo de obtenção de óleo de girassol modificado caracterizado por compreender os seguintes passos:
a- Incubar o óleo de girassol com lipase, diluída em tampão ou água, em temperatura selecionada na faixa de 20 a 50°C.
b- Centrifugar e ou decantar a mistura
c- Isolar as fases aquosa, intermediária e oleosa.
2- Óleo de girassol (helianthus annuus) modificado caracterizado por ser através da ação de lipase e apresentar uma fase aquosa, uma intermediária e uma oleosa.
3- Uso dos derivados do óleo de girassol modificado caracterizado por ser na preparação de composições antimicrobianas e pelo óleo de girassol ser modificado pelo tratamento com lipase, através do processo apresentado na reivindicação 1 e seus derivados serem representados pelas fases aquosa, intermediária e oleosa.
4- Uso dos derivados do óleo de girassol modificado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser como conservante de alimentos e/ou cosméticos e/ou medicamentos.
5- Uso dos derivados do óleo de girassol modificado, de acordo com as reivindicações 3 e 4 caracterizado por ser na preparação de composições em que seus derivados, aquoso, intermediário e oleoso estejam isolados ou associados a outros conservantes.
6- Uso dos derivados do óleo de girassol modificado, de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelos conservantes serem selecionados do grupo compreendendo cloreto de sódio, nitratos, ácido acético, ácido sórbico, ácido cítrico e sorbatos.
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