CN104719015B - 一种叠氮化钠诱发柑橘芽变的处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种叠氮化钠诱发柑橘芽变的处理方法，包括以下步骤：NaN3处理液配置；选取柑橘1‑2年生嫁接苗，剪除待处理枝条未完全木质化部分，摘除枝条留存部分的所有叶片和已萌发的芽；用锋利的刀片在枝条留存部分的各叶腋上刻伤；利用吸水纸缠裹待处理的枝条1‑2层，利用移液器等将NaN3处理液侵湿缠裹的吸水纸至饱和；利用保鲜膜罩裹枝条至处理结束以避免处理液蒸发；揭除包裹的吸水纸，将植株置于室外等正常培养条件下生长，5天以后即可观察到一些叶腋处萌发生长出新梢，随后进行叶片形态等变异性状观察统计。在处理后的培养生长过程，植株未处理部分生发的芽要及时抹除摘掉；实验结果统计。本发明诱变效果明显、具有应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术研发技术领域，涉及一种叠氮化钠诱发柑橘芽变的处理方法。
背景技术
相比于其他化学诱变剂，叠氮化钠(NaN3)具有无残毒、使用相对安全的优点，但至今尚未见利用叠氮化钠诱变柑橘腋芽方法的研究报道。叠氮化钠已被应用于大麦、水稻、向日葵、大豆、花卉和苹果等植物的育种研究中，并且获得了一些有益的变异植物材料；目前，柑橘新品种选育过程中，叠氮化钠诱发柑橘芽变的处理方法存在以下缺陷：
1.叠氮化钠有效引发柑橘芽变的浓度(试剂配制)和处理时间不明确
在叠氮化钠如何处理柑橘植株才能有效引起芽变的问题上，至今没有研究报道，因此叠氮化钠有效引发柑橘芽变的浓度(试剂配制)和处理时间不明确。
2.利用叠氮化钠简便、有效侵染柑橘腋芽的处理方法未有研究报道
化学试剂浸泡柑橘枝条的方法需要较多的处理液和特制的器具，成本较高，存在安全隐患，且不便于大量处理柑橘腋芽；利用注射器注入方法不易将处理液有效注入柑橘的腋芽周围的皮层内，操作困难；大量处理柑橘腋芽时，利用含有处理液棉团包覆伤口的方法较为费时、繁琐；温度和空气流动等环境因素变化容易导致涂抹和滴液侵染方法的处理液浓度变化，难以保证处理条件的有效性。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提出了一种叠氮化钠诱发柑橘芽变的处理方法，该方法明确叠氮化钠有效引发柑橘腋芽变异的浓度(试剂配制)和处理时间等条件，并且研发简便、有效侵染柑橘腋芽的化学诱变处理方法，以应用于柑橘芽变选种，解决柑橘自然变异率小无法主动大规模进行柑橘资源创新等问题。
其技术方案如下：
一种叠氮化钠诱发柑橘芽变的处理方法，包括以下步骤：
步骤1.NaN3处理液配置：称取适量的叠氮化钠加入在pH值为3.00(±0.05)的0.1mol/L磷酸钾盐缓冲液中，配置成终浓度为5mM的叠氮化钠处理液，在使用处理液时加入适量6-BA(6-BA终浓度为0.3％)。
步骤2.选取柑橘1-2年生嫁接苗，剪除待处理枝条未完全木质化部分，摘除枝条留存部分的所有叶片和已萌发的芽。
步骤3.用锋利的刀片在枝条留存部分的各叶腋上刻伤，深度刻破表皮即可，每个叶腋横向(垂直于枝条方向)和纵向(顺于枝条方向)各刻5下，刀口两端须超过叶腋处1-2mm。
步骤4.利用吸水纸(或含水性较好的卫生纸)缠裹待处理的枝条1-2层，利用移液器等将NaN3处理液侵湿缠裹的吸水纸(或含水性较好的卫生纸)至饱和(纸的最大含液量)。
步骤5.利用保鲜膜罩裹枝条至处理结束以避免处理液蒸发；处理时间为24小时；处理时枝条须避免强光照射导致增温，处理期内须保证枝条水平(防止直立时处理液由于重力原因积于下部而上部处理液不足)。
步骤6.处理结束后，揭除包裹的吸水纸，将植株置于室外等正常培养条件下生长，5天以后即可观察到一些叶腋处萌发生长出新梢，随后即可进行叶片形态等变异性状观察统计。在处理后的培养生长过程，植株未处理(刻伤和处理液侵染)部分生发的芽要及时抹除摘掉。
步骤7.实验结果统计方法：处理后30天统计变异数量；腋芽处理后成活率＝处理后腋芽成活数量/诱变处理腋芽数量，新梢变异率＝叶片变异的新梢数量/处理后腋芽成活数量。
本发明的有益效果为：
1.本方法所利用的处理液配制、处理条件等，使处理后成活腋芽发育的新梢叶片变异效率可达5％以上，因此，诱变效果明显、具有应用价值。
2.本方法操作简单、容易掌握；试剂用量较少且无需特别的器具，成本较低；因此可适用于主动大规模进行诱发柑橘芽变的柑橘资源创新工作。
附图说明
图1为本发明叠氮化钠诱发柑橘芽变的处理方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
利用本方法已于2014年3月-6月、2014年8月-11月进行了两次大规模实验：实验结果：
按本方法，第一次实验(2014年3月-6月)处理了1921个纽荷尔脐橙植株腋芽(67棵植株)；第二次实验(2014年8月-11月)处理了3088个纽荷尔脐橙植株腋芽(125棵植株)。处理结束后观察植株新稍叶片表型发现，相比于纽荷尔脐橙叶片呈椭圆形、肥厚深绿、较平整的正常状态，处理后的一些植株新稍叶片形态发生了明显的变异，表现为一些腋芽发育成的枝条上叶片有的叶缘不规则，有的叶片出现扭曲，有的叶片前段宽大，有的叶片狭长并且叶缘呈锯齿状等等。
进一步统计叶片发生变异的新梢数量结果显示(表1)，第一次实验成活腋芽发育的新梢叶片变异效率14.72％，第二次实验成活腋芽发育的新梢叶片变异效率8.59％。两次实验结果表明本方法使处理后成活腋芽发育的新梢叶片变异效率可达5％以上，诱变效果明显。
实验时间诱变处理腋芽数量腋芽处理后成活率成活腋芽发育的
新梢叶片变异效率
2014.03-2014.06 1921 10.26％14.72％
2014.08-2014.11 3088 11.69％8.59％
温度过高(高于35摄氏度)不利于柑橘萌芽生长，第二次实验的时期正处于湖南夏季高温期，因此推测第二次的诱变效率相对较低的原因可能与当时的气候有关。然而，8％以上的诱变效率仍说明本方法的柑橘诱变效果明显；此外本方法操作简单，成本较低，因此本方法能适用于主动大规模进行诱发柑橘芽变的柑橘资源创新工作、具有较大的应用价值。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一种叠氮化钠诱发柑橘芽变的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.NaN3处理液配制：称取适量的叠氮化钠加入在pH值为3.00的0.1mol/L磷酸钾盐缓冲液中，配制 成终浓度为5mM的叠氮化钠处理液，在使用处理液时加入6-BA，6-BA终浓度为0.3％；
步骤2.选取柑橘1-2年生嫁接苗，剪除待处理枝条未完全木质化部分，摘除枝条留存部分的所有叶片和已萌发的芽；
步骤3.用锋利的刀片在枝条留存部分的各叶腋上刻伤，深度刻破表皮即可，每个叶腋横向和纵向各刻5下，刀口两端须超过叶腋处1-2mm；
步骤4.利用吸水纸或含水性较好的卫生纸缠裹待处理的枝条1-2层，利用移液器将NaN3处理液浸湿缠裹的吸水纸或含水性较好的卫生纸至饱和；
步骤5.利用保鲜膜罩裹枝条至处理结束以避免处理液蒸发；处理时间为24小时；处理时枝条须避免强光照射导致增温，处理期内须保证枝条水平；
步骤6.处理结束后，揭除包裹的吸水纸，将植株置于室外正常培养条件下生长，5天以后即可观察到一些叶腋处萌发生长出新梢，随后进行叶片形态变异性状观察统计，在处理后的培养生长过程，植株未处理部分生发的芽要及时抹除摘掉；
步骤7.实验结果统计方法：处理后30天统计变异数量；腋芽处理后成活率＝处理后腋芽成活数量/诱变处理腋芽数量，新梢变异率＝叶片变异的新梢数量/处理后腋芽成活数量。
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