ES2340304T3 - Procedimiento de preparacion de un sistema de cultivo de endometrio autologo para el co-cultivo endometrio-embrion. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de preparación, a partir de una biopsia de endometrio, de un sistema de cultivo de endometrio autólogo destinado a ser utilizado para el cocultivo endometrio-embrión durante la FIV, dicho sistema de cultivo comprendiendo las células epiteliales y de las células estromales, dicho procedimiento comprendiendo etapas conducente a la obtención: - una primera fracción endometrial dicha epitelial, conteniendo las glándulas epiteliales proveniente del depósito (residuo) retenido sobre el filtro después de una o varias etapas de lisis de tejido endometrial; - una segunda fracción endometrial dicha estromal, correspondiente a las líquidos filtrados acumulados obtenidos de las etapas de filtración efectuadas después de una o varias etapas de lisis y comprendiendo como componente mayoritario células estromales, y - una tercera fracción endometrial dicha mixta comprendiendo una mezcla de glándulas y de células estromales, correspondiendo al residuo de sedimentación de la segunda fracción, caracterizado por el hecho de que el mencionado procedimiento comprende además en otra etapa de purificación de la mencionada tercera fracción, conducente a la separación des componentes epiteliales y estromales de esta tercera fracción y la puesta en cultivo de la mezcla de estos componentes purificados para obtener un cocultivo mixto.
Description
Procedimiento de preparación de un sistema de
cultivo de endometrio autólogo para el co-cultivo
endometrio-embrión.
La presente invención se refiere al dominio de
la fecundación in Vitro y concierne en particular a un
procedimiento de preparación de un sistema de cultivo de endometrio
autólogo para el cocultivo endometrio-embrión.
La fecundación extracorporal o fecundación in
Vitro (FIV) consiste en reproducir en el laboratorio lo que
pasa naturalmente en las trompas uterinas: la fecundación y las
primeras etapas del desarrollo embrionario. Desde 1978, año de
nacimiento de Louise Brown hasta ahora, esta técnica ha permitido el
nacimiento de cientos de miles de niños en el mundo.
Para evaluar la tasa de éxito de las técnicas de
FIV, varios parámetros son utilizados en la literatura. En
referencia al número de punciones para la selección de ovocitos, es
posible tener en cuenta:
- -
- las punciones positivas (más del 95%);
- -
- las transferencias de embriones (alrededor del 80%);
- -
- el número de embarazos clínicos (estado de embarazo definido por bolsa intrauterina y actividad cardiaca);
- -
- el número de partos
- -
- el número de niños vivos nacidos.
Es el número de partos con al menos un niño
normal vivo que caracteriza probablemente al menos el éxito de las
técnicas de FIV, siendo esta tasa del orden del 12 al 15%. Esta tasa
es altamente dependiente de la edad de las mujeres afectadas y del
número de ciclos de tratamiento y del número de embriones
transferidos.
El fracaso de la implantación después del FIV
puede ser de origen maternal o embrionario. El fracaso de
implantación se ha relacionado, entre otros, a la capacidad de los
embriones para llegar a la fase de blastocito en cultivo, que está
vinculada a su vez a las condiciones del cultivo.
Básicamente, después de la fecundación in
Vitro, el embrión es puesto en medios de cultivo específicos
sintéticos elegidos en función del día de cultivo (D1 a D6). El
embrión es después vuelto a poner en el útero de la paciente al D2
o D3, es decir al estado de 4 u 8 células después del cultivo en un
medio sintético. La tasa de implantación de los embriones mayores
de 2 o 3 días sigue siendo débil (del orden de 15% por embrión).
Esta débil tasa de implantación puede explicarse en parte por la
hipermotricidad uterina y el periodo inapropiado de la
transferencia: en efecto, estos embriones son puestos en un entorno
inadecuado porque in vivo, los embriones en este estado de
desarrollo están aún en las trompas y el embrión no llega al útero
hasta el estado de blastocito, es decir 5 días después de la
fecundación.
Las técnicas de cocultivo (cultivo de un embrión
hasta el estado de blastocito sobre una capa celular que sirve de
soporte nutritivo) fueron propuestas por primera vez en humanos en
1989 después de que numerosos estudios hubieran probado en animales
desde 1962 que esta técnica mejoraba la tasa de embriones
proveniente al estado de blastocito.
Además de la sincronización
endometrio-embrión, el hecho de poder cultivar un
embrión hasta el estado de blastocito permite seleccionar los
embriones con potencial de desarrollo alto y efectuar un diagnóstico
preimplantación. Por otro lado, las técnicas de cocultivo de
embriones permiten obtener blastocitos de mejor calidad, en relación
a los blastocitos cultivados en los medios sintéticos.
Técnicas de cocultivo del embrión hasta el
estado de blastocito sobre líneas celulares animales, como las
células Vero provenientes del epitelio de riñón de mono verde de
África, por ejemplo, han dado resultados mejorados en relación a
los resultados de las transferencias precoces D2-D3
en los medios sintéticos. Sin embargo, estas células animales no
han sido objeto de ningún procedimiento de validación respecto de la
seguridad sanitaria según la legislación en vigor, con el objetivo
de una utilización terapéutica. El decreto del 12.01.1999, que fija
las reglas de buenas prácticas en A.M.P. (ayuda médica a la
procreación) en Francia, precisa que sólo el
co-cultivo sobre células autólogas no conlleva
riesgos de infección exógenos.
Ante el principio de precaución, el
co-cultivo ha sido abandonado en los años
98-99 en la práctica en los laboratorios FIV en
beneficio de medios sintéticos. Nuevos medios sintéticos permiten el
cultivo del embrión hasta el estado de blastocito, medios llamados
(secuenciales), han hecho su aparición. Ninguno de estos medios ha
podido sin embargo reproducir el efecto del
co-cultivo. En efecto, estudios comparativos entre
los blastocitos resultantes de medios secuenciales y aquellos
resultantes de co-cultivo muestran que la tasa de
blastulación es más importante en co-cultivo
(alrededor del 45% contra el 30 a 35%) sea cual sea el monocultivo y
que los blastocitos obtenidos son de mejor calidad (número de
blastómeros más importante, grado más elevado, tasa de
fragmentación disminuida). El efecto positivo de los
co-cultivos sobre el desarrollo del embrión está
relacionado a las interacciones embrión-células
elaboración de citoquinas y/o de los factores embriotoficos y
trofoblasticos y a la desintoxicación del medio de cultivo por las
células somáticas.
La utilización de un co-cultivo
de células somáticas autólogas aparece desde entonces como una
solución ideal permitiendo tasas de implantación criadas siempre
previniendo la contaminación del embrión con virus exógenos.
Entre estas células somáticas humanas, las
células de endometrio ocupan una plaza particular. Son en efecto
las células fisiológicas de implantación, lo que las recomienda como
el soporte ideal del embrión durante el
co-cultivo.
Sistemas de cultivo de endometrio autólogo
destinados a ser utilizados para el co-cultivo
endometrio-embrión durante la FIV, que consisten en
un cultivo de células epiteliales purificadas, son conocidos. Su
utilización queda sin embargo limitada, pues el cultivo de células
epiteliales de las glándulas es muy frágil, tiene una duración de
vida limitada a 2 a 4 días, no soportan más que un solo paso en
cultivo y es siempre de débil cantidad.
El Solicitante ha constatado, y es uno de los
méritos de la invención, que durante la separación de diferentes
fracciones celulares a partir de una biopsia de endometrio, es
posible obtener, además de una primera fracción endometrial dicha
epitelial (comprendiendo mayoritariamente glándulas) y de una
segunda fracción endometrial dicha estromal (comprendiendo
mayoritariamente células estromales), una tercera fracción
endometrial dicha mixta que conduce, después de la separación y la
purificación de las glándulas y células estromales que la componen
y la puesta en cultivo, a un cultivo mixto (de células epiteliales y
estromales) de cualidad, utilizable para el
co-cultivo endometrio-embrión
durante la FIV.
La presente invención tiene por finalidad
proponer un procedimiento de preparación de un nuevo sistema de
cultivo de endometrio autólogo para el co-cultivo
endometrio-embrión.
A tal efecto y según un primer aspecto, la
invención tiene por objeto un procedimiento de preparación de un
sistema de cultivo de endometrio autólogo destinado a ser utilizado
por el co-cultivo endometrio-embrión
durante la FIV, dicho sistema de cultivo comprendiendo células
epiteliales y células estromales, caracterizada en que dicho
procedimiento comprende etapas que conducen a la obtención de una
primera fracción endometrial dicha epitelial, una segunda fracción
endometrial dicha estromal y de una segunda fracción endometrial
dicha mixta comprendiendo una mezcla de glándulas y de células
estromales y que comprende además una etapa de purificación de
dicha tercera fracción.
En una variante de realización, la etapa de
purificación de la tercera fracción comprende: a) la obtención de
células estromales a partir de la tercera fracción y b) la obtención
de glándulas a partir de la tercera fracción y c) la mezcla de
células estromales y de las glándulas así obtenidas.
En una variante de realización, la etapa a) de
obtención de células estromales a partir de la tercera fracción
endometrial dicha mixta comprenden las operaciones de:
a1. la suspensión de dicha tercera fracción
endometrial en un medio de cultivo apropiado que permita la
obtención de una primera suspensión;
a2. filtración de dicha primera suspensión, la
cual permite obtener un primer filtrado y de una primera fracción
retenida sobre el filtro;
a3. centrifugación de dicho primer filtrado que
permita la obtención de un primer residuo conteniendo células
estromales de la tercera fracción endometrial;
a4. recuperación de dicho primer residuo en un
medio FIV para la obtención de una segunda suspensión de células
estromales de la tercera fracción endometrial.
En una variante de realización, la etapa b) de
obtención de las glándulas a partir de la tercera fracción
endometrial dicho mixta comprendiendo la filtración de la dicha
primera fracción retenida y la puesta en suspensión de la segunda
fracción retenida así obtenida, conducente a la obtención de una
tercera suspensión conteniendo glándulas de la tercera fracción
endometrial, en un medio FIV.
En una variante de realización, la etapa c)
consiste en la mezcla de dichas segunda y tercera suspensión para
obtener una tercera fracción endometrial purificada.
La mezcla de glándulas y de células estromales
de la tercera fracción endometrial obtenida en la etapa c) es
después puesta en cultivo en un medio FIV. Las células son
mantenidas en cultivo varios días.
En una variante preferida de realización, la
biopsia de endometrio es crioconservada a la recepción, en cuyo
caso, alrededor del día de inicio de la ovulación en el paciente, la
biopsia es descongelada y sometida al tratamiento según el
procedimiento descrito, después las glándulas y las células
estromales de la tercera fracción endometrial purificada están
puestas en cultivo.
En una otra variante de realización, la biopsia
de endometrio esta tratada según el procedimiento de la invención
inmediatamente después su recepción al laboratorio. La mezcla de
glándulas y de células estromales de la tercera fracción
endometrial purificada así obtenida es puesta en cultivo durante
varios días; esta cultura celular es crionizada y descongelada
aproximadamente del día del comienzo de la ovulación de la
paciente.
En todos los casos, el procedimiento de puede
comprender una etapa suplementaria de condicionamiento de dicho
sistema de cultivo de endometrio autólogo a través de un medio FIV
semi sólido, en vista del transporte hacia el laboratorio de
Procreación Médica Asistida.
Según un segundo aspecto, la invención concierne
un sistema de cultivo de endometrio autólogo destinado a ser
utilizado para el co-cultivo
endometrio-embrión durante la FIV, el dicho sistema
comprende un cultivo de células epiteliales y estromales de la
tercera fracción endometrial purificada.
Según un tercero aspecto, la invención se
refiere a la utilización del sistema de cultivo de endometrio
autólogo descrito para la preparación de co-cultivo
endometrio-embrión durante la FIV.
Según un cuarto aspecto, la invención se trata
de un sistema de cultivo de endometrio autólogo listo para el uso,
destinado a ser utilizado para el co-cultivo
endometrio-embrión durante la FIV, caracterizado en
que comprende:
- -
- un cultivo de células epiteliales y estromales de la tercera fracción endometrial purificada;
- -
- un medio de cultivo FIV semi-sólido, para el dicho cultivo;
- -
- un embalaje estéril para el sistema de cultivo comprendiendo dicho cultivo y el mencionado medio de cultivo.
La invención va ahora a ser descrita en
detalle.
La presente invención tiene por objeto, según un
primer aspecto, un procedimiento de preparación de una fracción
endometrial mixta purificada comprendiendo células estromales y
glándulas, a partir de una biopsia de endometrio. La biopsia esta
pre criada sobre la paciente en fase lútea del ciclo menstrual. La
biopsia es inmediatamente puesta en un medio de cultivo específico
para el transporte y es mantenido a una temperatura comprendida
entre 4 y 8ºC durante todo el tiempo del transporte. El transporte
entre el sitio de extracción y el laboratorio que realiza el cultivo
celular debe hacerse la más rápidamente posible; en general, la
biopsia es llevada al laboratorio al día siguiente a la
extracción.
El endometrio está constituido de un tejido
estromal comprendiendo células mesenquimales dichas estromales, y
las glándulas secretoras constituidas de células epiteliales con una
luz al centro donde se vierte los productos de secreción.
El tratamiento de la biopsia puede, según la
invención, comprende dos etapas de lisis de la biopsia seguidas de
una secuencia de etapas de separación y de purificación de dos tipos
celulares. Por "lisis de la biopsia de endometrio" se entiende
la disolución de la estructura tejidular del endometrio conducente a
la obtención de células (tales como las células estromales) o
grupos de células (tales que las glándulas secretoras) aisladas.
La lisis de la biopsia puede efectuarse por
digestión enzimática, por ejemplo con la ayuda de la colagenasa. En
un otro modo de realización, la biopsia puede ser sometida a lisis
mecánicamente.
El principio de purificación de las glándulas y
de las células estromales esta basada sobre la diferencia de talla
y de peso entre las células estromales pequeñas y ligeras en
relación a las glándulas más voluminosas y más pesadas.
A recepción, la biopsia es enjuagada y un
control microbiologico del medio de transporte es efectuado. Después
se corta en pequeños fragmentos y los elementos contaminantes del
endometrio (mucosa, sangre,... ) son eliminados. Es entonces
crioconservada, o bien tratada inmediatamente para aislar las
diferentes fracciones de células.
Los fragmentos de biopsia son sometidos a una
primera lisis. En una variante de realización, la biopsia es
digerida con la ayuda de una encima, tal que la colagenasa.
El lysat es homogeneizado después filtrado,
conducente a la obtención de un líquido F1 y de un depósito
(residuo) D1 rica en glándulas (que corresponde a la primera
fracción endometrial).
El mencionado F1 es centrifugado durante 5
minutos alrededor de 400, permitiendo la obtención de un residuo
C1.
La etapa de lisis es repetida al menos una vez,
como sigue: el depósito (residuo) D1 rico en glándulas se vuelve a
coger en un medio apropiado para obtener una suspensión S1
comprenden, además de las glándulas, de los fragmentos de
endometrio aún no digerido.
Por "medio apropiado" se entiende toda
solución que asegura la viabilidad y la funcionalidad optima de una
población de células dadas.
La suspensión S1 es sometida a una segunda lisis
conducente a la obtención de un segundo lysat. Este es homogeneizado
después filtrado conducente a la obtención de un líquido F2 y de un
depósito (residuo) D2 rico en glándulas.
Si la biopsia de endometrio es muy compacta, una
tercera lisis sobre el depósito (residuo) D2 puede resultar
necesario.
El líquido filtrado F2 es centrifugado durante 5
minutos alrededor a 400g alrededor, permitiendo la obtención de un
residuo C2.
El residuo C1 se vuelve a coger en un medio
apropiado, conducente a la obtención de una suspensión S2, que
servirá igualmente para volver a poner el residuo C2; una suspensión
S3 rica en células estromales groseramente aislada y así obtenida;
corresponde a la segunda fracción endometrial.
Esta suspensión S3 se deja sedimentar durante 30
a 60 minutos aproximadamente, conducente a la obtención de un
flotante SN1 rico en células estromales y de un residuo C3
comprendiendo una tercera fracción endometrial dicha mixta
comprendiendo una mezcla de células estromales y de glándulas.
De manera característica para la invención, es
posible separar las glándulas y las células estromales de esta
tercera fracción endometrial, afín de contabilizarlos para mejor
conocer y controlar el cultivo.
El residuo C3 se vuelve a poner en un medio de
cultivo apropiado, para obtener una suspensión S4 (etapa a1), que
es enseguida filtrada, conducente a la obtención de un líquido
filtrado y de una fracción retenida sobre el filtro FR1 (etapa
a2).
El líquido filtrado es centrifugado alrededor 5
minutos a 400 g, lo que conduce a la obtención de un residuo C4
conteniendo células estromales de la tercera fracción endometrial
(etapa a3). El residuo C4 se vuelve a poner en un medio FIV
conducente a la obtención de una suspensión S5 de células estromales
de la tercera fracción endometrial (etapa a4). Sobre esta
suspensión S5 se efectúan entonces estudios de viabilidad y una
numeración celular.
Por "medio FIV" se entiende todo medio de
cultivo utilizado por los laboratorios de procreación durante la
manipulación de los gametos y de los embriones.
Por otro lado, la fracción retenida FR1 es
filtrada, permitiendo recuperar las glándulas. La fracción retenida
FR2 así obtenida es enseguida puesta en suspensión, conducente a la
obtención de una suspensión S6 conteniendo glándulas de la tercera
fracción endometrial, en un medio FIV. Una numeración de glándulas
purificadas es efectuada por la suspensión S6.
Las suspensiones S5 y S6 son enseguida mezcladas
para obtener una tercera fracción endometrial purificada
(etapa c).
(etapa c).
La mezcla de glándulas y de células estromales
de la tercera fracción endometrial purificada obtenida a la etapa
c) y enseguida puesta en cultivo en un medio FIV. Las células
epiteliales (proveniente de las glándulas) y de las células
estromales dejadas en cultivos durante algunos días.
En una variante preferida de realización, la
biopsia de endometrio es crioconservada a la recepción, en el caso,
aproximadamente el primer día de la ovulación en el paciente, la
biopsia es descongelada y sometida al tratamiento siguiendo el
procedimiento descrito, después las glándulas y las células
estromales de la tercera fracción endometrial purificada son
puestas en cultivo durante varios días.
En una otra variante de realización, la biopsia
de endometrio es tratada según el procedimiento de la invención
inmediatamente después de su recepción en el laboratorio. La mezcla
de glándulas y de células estromales de la tercera fracción
endometrial purificada así obtenida es puesta en cultivo durante
varios días; este cultivo celular es crioconservado y descongelado
alrededor del día de la punción ovocitaria de la paciencia.
En todos los casos, el procedimiento de
preparación de un sistema de cultivo de endometrio autólogo
destinado a ser utilizado por el co-cultivo
endometrio-embrión durante la FIV puede comprender
una etapa suplementaria de condicionamiento del dicho sistema de
cultivo de endometrio autólogo por medio de un medio FIV semi sólido
o de un medio FIV líquido, en vista de transporte hacia el
laboratorio de Procreación Medica Asistida.
El condicionamiento del sistema de cultivo de
endometrio autólogo comprende antemano la preparación de un medio
FIV semisólido con la ayuda de una solución concentrada de agarosa y
el medio FIV. Esta mezcla es repartida uniformemente en dos cajas
estériles y conservada a 4ºC.
El día de la fecundación in Vitro, el
cultivo de células de endometrio autólogo debe estar preparado para
ser enviada al laboratorio de procreación Medica Asistida afín de
poner ahí el embrión. La condición requerida tiene que tener un
tapiz celular con un mínimo de 60% de confluencia.
En una variante de realización, el medio FIV
semisólido, equilibrado previo a 37ºC y en una atmósfera conteniendo
5% de CO_{2} durante al menos 2 h, es depositado sobre el tapiz
de células.
La placa es enseguida depositada en un blíster
estéril y todo es sellado por un opérculo estéril. El aire en el
interior del blíster contiene 5% de CO_{2}. Dicho blíster esta
condicionado en un segundo blíster más grande. El condicionamiento
así obtenido es un doble blíster.
En una otra variante de realización, los
pocillos conteniendo el tapiz de células están llenas de 500
\mu.l./pocillos de medio de cultivo líquido (equilibrado
previamente a 37ºC y en una atmósfera conteniendo 5% de CO_{2}
durante al menos 2 h), después son cerrados con tapones en silicona.
La placa es enseguida depositada en un blíster estéril y el todo es
sellado por un opérculo estéril. El blíster es condicionado en un
segundo blíster más grande. El condicionamiento así obtenido es un
doble blíster.
El transporte hacia el laboratorio de
Procreación Medica Asistida es efectuada a 27ºC aproximadamente, en
un tiempo inferior a 36 horas, con el menor choque posible. En un
cartón adaptado al transporte de mercancías muy frágiles es puesto
un embalaje isotérmico. Al interior de esto son puesta uno o dos
ladrillos de gel eutéctico permitiendo el mantenimiento de la
temperatura en los alrededores de los 27ºC. El clister comprendiendo
el cultivo de células de endometrio autólogo y enseguida depositada
sobre (o entre) la (o los) ladrillo(s) de gel.
Según un segundo aspecto, la invención concierne
un sistema de cultivo de endometrio autólogo destinado a ser
utilizado para el cocultivo endometrio-embrión
durante la FIV, dicho sistema comprendiendo un cultivo de células
epiteliales y estromales de la tercera fracción endometrial
purificada.
En los procedimientos de tratamiento de las
biopsias de endometrio conocidos, esto son las células epiteliales,
obtenidas por puesta en cultivo de las glándulas resultante del
procedimiento de purificación a partir del depósito (residuo) D2
(primera fracción endometrial), que son consideradas como siendo los
más interesantes y son por consecuencia utilizadas durante el
co-cultivo endometrio-embrión, como
descrito en el documento Nieto F.S y all. J. Assist. Reprod. Gen
1996, 13(5), 386-389. Otros documentos, por
ejemplo, Spandorfer S.D y al J. Reprod. Med 2004, 49(6),
463-467, divulgando la posibilidad de utilizar
durante el cocultivo endometrio-embrión de las
células epiteliales en mezcla con las células estromales purificadas
a partir del flotante SN3 (segunda fracción endometrial). En todos
los procedimientos conocidos, la tercera fracción endometrial dicha
mista contenida en el residuo C3 es eliminado.
Ahora bien, el Demandante a constatado que el
cultivo de células epiteliales y estromales de la fracción
endometrial mixta purificada es de calidad superior a aquella de
las células epiteliales purificadas a partir de depósito D2.
Además, el cultivo de células epiteliales y
estromales de la fracción endometrial mixta purificada es fácilmente
realizable, lo que no es el caso para el cultivo de células
epiteliales proveniente de la primera fracción endometrial.
Según un tercer aspecto, la invención se reporta
a la utilización de uno de los sistemas de cultivo de endometrio
autólogo descrito para la preparación de cocultivos
endometrio-embrión durante la FIV.
Según un cuarto aspecto, la invención de un
sistema de cultivo de endometrio autólogo preparado para su uso,
destinado a ser utilizado para el cocultivo
endometrio-embrión durante la FIV caracterizado en
que comprende:
- -
- un cultivo de células epiteliales y estromales de la tercera fracción endometrial purificada;
- -
- un medio de cultivo FIV semi sólido, para dicho cultivo;
- -
- un embalaje estéril para el sistema de cultivo comprendiendo dicho cultivo y mencionado medio.
Claims (15)
1. Procedimiento de preparación, a partir de una
biopsia de endometrio, de un sistema de cultivo de endometrio
autólogo destinado a ser utilizado para el cocultivo
endometrio-embrión durante la FIV, dicho sistema de
cultivo comprendiendo las células epiteliales y de las células
estromales, dicho procedimiento comprendiendo etapas conducente a
la obtención:
- una primera fracción endometrial dicha
epitelial, conteniendo las glándulas epiteliales proveniente del
depósito (residuo) retenido sobre el filtro después de una o varias
etapas de lisis de tejido endometrial;
- una segunda fracción endometrial dicha
estromal, correspondiente a las líquidos filtrados acumulados
obtenidos de las etapas de filtración efectuadas después de una o
varias etapas de lisis y comprendiendo como componente mayoritario
células estromales, y
- una tercera fracción endometrial dicha mixta
comprendiendo una mezcla de glándulas y de células estromales,
correspondiendo al residuo de sedimentación de la segunda
fracción,
caracterizado por el hecho de que el
mencionado procedimiento comprende además en otra etapa de
purificación de la mencionada tercera fracción, conducente a la
separación des componentes epiteliales y estromales de esta tercera
fracción y la puesta en cultivo de la mezcla de estos componentes
purificados para obtener un cocultivo mixto.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que la etapa de purificación de
la mencionada tercera fracción endometrial comprende: a) la
obtención de células estromales a partir de la tercera fracción y
b) la obtención de glándulas a partir de la tercera fracción y c) la
mezcla de las células estromales y de las glándulas así
obtenidas.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado por el hecho de que la etapa a) comprende las
operaciones de:
a1. la suspensión de la tercera fracción
endometrial en un medio de cultivo apropiado que permita la
obtención de una suspensión S4;
a2. filtración de la suspensión S4, la cual
permita la obtención de un filtrado y de una fracción retenida
sobre el filtro FR1;
a3. centrifugación del mencionado filtrado que
permita la obtención de un residuo C4 conteniendo células estromales
de la tercera fracción endometrial;
a4. recogida del residuo C4 en un medio FIV
conducente a la obtención de una suspensión S5 de células estromales
de la tercera fracción endometrial.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 o 3, caracterizado por el hecho de que la
etapa b) comprende operaciones de:
b1. puesta en cultivo en presencia de factores
favoreciendo la adhesión de las células de la fracción retenida FR1
durante una duración suficiente para permitir la adhesión de células
estromales, conducente a la obtención de un flotante SN4;
b2. filtración del flotante SN4 y puesta en
suspensión de la fracción retenida FR2 así obtenida, conducente a
la obtención de una suspensión S6 conteniendo glándulas de la
tercera fracción endometrial, en un medio FIV.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento según las reivindicaciones 3 y
4, caracterizado por el hecho de que la etapa c) consiste en
la mezcla de las suspensiones S5 y S6 para obtener una tercera
fracción endometrial purificada.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado por el hecho de que comprende además una etapa
de puesta en cultivo de las glándulas y las células estromales de la
tercera fracción endometrial purificada.
7. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que
comprende una etapa suplementaria de condicionamiento del mencionado
sistema de cultivo de endometrio autólogo a través de un medio FIV
semi sólido, en vista del transporte hacia un laboratorio de
Procreación Médica Asistida.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizado por el hecho
de que la biopsia habiendo sido tratada inmediatamente después su
recepción en el laboratorio, el cultivo de células así obtenida es
crioconservada y descongelada alrededor del día de la punción
ovocitaria de la paciente.
9. Procedimiento según una cualquier de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que, la
biopsia de endometrio habiendo sido crioconservada a la recepción
la puesta en cultivo de las glándulas y de las células estromales
de la tercera fracción endometrial purificada es realizada
aproximadamente el día de la punción ovocitaria de la paciente,
después de la descongelación y tratamiento de la mencionada
biopsia.
10. Procedimiento, según una cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que
comprende al menos una etapa de lisis de la biopsia de
endometrio.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado por el hecho de que la lisis es efectuada con
colagenasa.
12. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado por el hecho de que la lisis es efectuada de
manera mecánica.
13. Sistema de cultivo de endometrio autólogo
destinado a ser utilizado para el cocultivo
endometrio-embrión durante la FIV
caracterizado por el hecho de que comprende células
epiteliales y células estromales de la tercera fracción endometrial
purificada según el procedimiento según una de las reivindicaciones
1 a 12.
14. Utilización del sistema de cultivo de
endometrio autólogo, obtenido por la puesta en marcha del
procedimiento según las reivindicaciones 1 a 12, para la
preparación de cocultivos endometrio-embrión durante
la FIV.
15. Sistema de cultivo de endometrio autólogo
preparado para el uso, destinado para ser utilizado para el
cocultivo endometrio-embrión durante la FIV,
caracterizado por el hecho de que comprende:
- -
- un cultivo de células epiteliales y estromales de la tercera fracción endometrial purificada según el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12;
- -
- un medio de cultivo FIV semisólido, para el dicho cultivo;
- -
- un embalaje estéril para el sistema de cultivo comprendiendo el mencionado cultivo y el mencionado medio.
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