ES2340262T3

ES2340262T3 - Medicion de analito.

Info

Publication number: ES2340262T3
Application number: ES03732643T
Authority: ES
Inventors: Emma N.K. c/o Oxford Biosensors Ltd WALLACE-DAVIS; Yann A.N. c/o Inorganic Chemistry Dept. ASTIER
Original assignee: Oxford Biosensors Ltd
Current assignee: Oxford Biosensors Ltd
Priority date: 2002-05-17
Filing date: 2003-05-16
Publication date: 2010-06-01
Anticipated expiration: 2023-05-16
Also published as: JP2005526260A; EP1506308A1; AU2003239672A1; ATE455184T1; WO2003097860A1; EP1506308B1; US7534583B2; US20050164329A1; GB0211449D0; DE60330961D1

Abstract

Un método para determinar la concentración de un analito en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un micro electrodo que comprende una enzima capaz de reaccionar con dicho analito y un mediador redox que es capaz de convertirse estando oxidado o reducido por dicha enzima una vez que esta última ha reaccionado con el analito, en el que dicha enzima y dicho mediador están presentes típicamente en exceso en comparación con dicho analito, permitiendo que el analito reaccione con la enzima, reaccionando dicha enzima substancialmente por completo con dicho analito antes de aplicar un potencial, aplicando después un potencial a través del electrodo y midiendo la concentración resultante del mediador convertido electroquímicamente.

Description

Medición de analito.

Esta invención se refiere a un método para determinar la concentración de un analito de una muestra y, en particular, a un método para determinar la concentración electroquímicamente.

Es particularmente valioso para determinar la concentración de un componente específico en una muestra que es de origen biológico, por ejemplo sangre. Para este propósito se usa un biosensor; se hace uso de un cambio en el estado de oxidación de un mediador que interacciona con una enzima que ha reaccionado con el analito a determinar. El estado de oxidación del mediador se elige de modo que éste se encuentre en el estado en el que únicamente interaccionará con la enzima sobre la adición del sustrato. El analito reacciona con una concentración estequiomérica del mediador mediante la enzima. Esto hace que el mediador se oxide o se reduzca (dependiendo de la reacción enzimática) y este cambio a nivel del mediador puede medirse determinando la corriente generada a un potencial determinado.

Normalmente, se toma una medición de la oxidación (o reducción) del mediador por la enzima, ya que esta reacciona con el analito. Esto puede, sin embargo, dar lugar a resultados poco fiables. Se ha propuesto, por lo tanto, esperar que la reacción finalice y después tomar una medición. Sin embargo, el valor obtenido cambia con el tiempo de manera que generalmente es necesario tomar una serie de lecturas y luego determinar la concentración usando un algoritmo o por la integración del área bajo la curva que es propia del gráfico de los valores. Este cambio en el valor es causado por el efecto de difusión que se produce esencialmente de manera lineal a partir del electrodo. De esta manera como algo del mediador se oxida (o reduce) en el electrodo se difunde más mediador hacia el electrodo en una base permanente. Sin embargo, esta difusión lineal produce el agotamiento del material electro activo alrededor del electrodo de trabajo.

Con el fin de determinar la concentración es necesario obtener en primer lugar un valor en ausencia del analito y restar este valor "de fondo" del valor mejorado que se obtiene cuando el analito está presente. Se apreciará que este procedimiento es complicado y propenso a errores.

Recientemente, se han tomado medidas para reducir el tamaño de los biosensores mediante el uso de un micro electrodo. Esto puede definirse como un electrodo en el que al menos una de la dimensiones no supera las 50 \mum y con frecuencia es de 1 a 25 ó 30 \mum.

Los micro electrodos se concibieron porque se observó que mejoraban la medición de corrientes muy pequeñas. Esto es debido al uso de un conjunto de micro electrodos que proporciona una mejor relación de señal con respecto a interferencia que la proporcionada por un solo electrodo. Por lo tanto los micro electrodos se concibieron para la determinación de corriente continua y no han encontrado utilidad como biosensores que impliquen una enzima y un mediador. Sin embargo, sorprendentemente se ha descubierto que el uso de un micro electrodo puede, si se usa de una manera particular, superar las desventajas de los macro electrodos.

Estos micro electrodos pueden usarse con este fin son particularmente sorprendentes por dos razones principales. En primer lugar, la potenciación de la corriente debido a la presencia del analito sobre el nivel de fondo para un micro electrodo es por supuesto mucho más pequeña que para un macro electrodo. Por consiguiente con la disminución del tamaño, es imposible obtener mediciones precisas. En segundo lugar, como el área del electrodo es muy pequeña en relación al volumen de la muestra la difusión hacia la superficie del electrodo ya no tiene lugar linealmente como en el macro electrodo sino, en su lugar, radialmente. La distancia a través de la cual se produce la reacción en solución es grande comparada con el tamaño de los micro electrodos de tal manera que podría esperarse que haya poca o ninguna mejora catalítica. Por lo tanto podría esperarse que con la disminución del tamaño del electrodo no pueda obtenerse ninguna medida significativa.

En condiciones normales de estado continuo, la distancia media que el estado oxidado del mediador difundirá antes de que reaccione para cambiar al estado reducido será (Dt_{L})^{1/2} en la que D es el coeficiente de difusión del estado oxidado y t_{L} es la semi vida de la reacción antes de que cambie el estado oxidado. Se apreciará que como el tamaño del micro electrodo es pequeño en comparación con la distancia de difusión, normalmente hay muy poca mejora de la corriente en presencia de la reacción catalítica. En otras palabras, la presencia del analito que promueve la reacción catalítica conduce únicamente a un pequeño aumento de corriente por encima de la inicialmente presente. La pequeña magnitud de esta "corriente de perturbación" significa por tanto que no pueden obtenerse resultados analíticos precisos.

A pesar de estos inconvenientes significativos se ha descubierto sorprendentemente que si la determinación se realiza después de que la reacción haya tenido lugar, la forma de la curva de potencial después de un máximo inicial es sustancialmente horizontal, con el resultado de que, en primer lugar, puede obtenerse una medición directa sin necesidad de restar el valor de fondo y que, en segundo lugar, sólo se necesita una medición. La Figura 1 ilustra una curva típica que puede obtenerse. En otras palabras, la concentración puede determinarse directamente a partir de un valor único.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para determinar la concentración de un analito en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un micro electrodo que comprende una enzima capaz de reaccionar con dicho analito y un mediador redox que es capaz de convertirse estando oxidado o reducido por dicha enzima una vez que esta última ha reaccionado con el analito, en el que dicha enzima y dicho medidor están típicamente presentes en exceso en comparación con dicho analito, permitiendo que el analito reaccione con la enzima, reaccionando sustancialmente dicha enzima por completo con dicho analito antes de aplicar un potencial, aplicando después un potencial a través de electrodo, y midiendo la concentración resultante del mediador convertido electroquímicamente. Típicamente, la corriente resultante puede medirse y determinarse la concentración directamente por comparación con un conjunto de datos de referencia almacenados. La corriente catalítica se genera ya que la enzima renueva continuamente el sustrato y la enzima se reutiliza continuamente. De acuerdo con la presente invención, la reacción finaliza o alcanza un estado de equilibrio estable que puede ser menor del 100% de conversión y puede ser tan bajo como, por ejemplo, el 50% de conversión antes de que se aplique el potencial; el estímulo para finalizar la reacción surge del gran exceso de la enzima en este sistema - muchos órdenes de magnitud superiores al del sistema catalítico.

Deberá apreciarse que con una reacción de un método de este tipo dentro del mediador que ocurre en toda la solución, el mediador reacciona con la enzima y cuando se aplica el voltaje el mediador oxidado/reducido resultante se reduce/oxida a su estado de oxidación original en el electrodo. Esto contrasta con un sistema catalítico en el que el mediador se oxida/reduce y este después reacciona con la enzima - se obtiene una cantidad catalítica con un nivel reducido de enzima en toda la solución debido a la renovación continuada. De ello se deduce que en el sistema de la presente invención la enzima debe estar en exceso en el conjunto de la solución que se ensaya. En cambio en el sistema catalítico normal como la reacción se limita a la solución adyacente a la superficie del electrodo, la mayor parte de la solución de ensayo es imperturbable por la reacción enzimática. Debe observarse que este requisito no significa necesariamente que la enzima deba ser homogénea a través de la mezcla. Prácticamente se ha comprobado que convendría el exceso de enzima de manera que el tiempo de reacción predicho sea de un orden de magnitud inferior al tiempo de medición aceptable para el sensor. Por lo tanto la cantidad de enzima necesaria secada en una tira (que estará relacionada con el tiempo de funcionamiento-humedad) se estipulará por el tiempo de respuesta necesario, la velocidad de re-suspensión de la enzima junto con la cantidad de actividad retenida por la enzima, el volumen en el que se esta finalizando el ensayo y la concentración máxima del analito a ensayar. Es evidente que estos parámetros variarán de ensayo a ensayo y de enzima a enzima. Por ejemplo, si la enzima tiene una actividad de 1000 U/mg, el volumen de reacción es 10 \mul, el tiempo de respuesta necesario es de 10 segundos, el 50% de la actividad de la enzima se recupera en re-suspensión y la concentración de analito máxima es 1 mM, por tanto se necesitan 2 U/ml en la solución de deposición. Se apreciará que el mediador reaccionado está presente a una concentración correspondiente a una proporción de electrones de 1:1 con el analito.

En el método de la presente invención pueden usarse micro electrodos convencionales, típicamente con un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia, de manera que no es necesario realizar una descripción detallada de estos. En una realización preferida el electrodo de trabajo está en una pared del receptáculo que forma el mico electrodo. Del mismo modo pueden usarse enzimas y mediadores habituales. Los mediadores típicos por tanto incluyen ferricianida, alcoxi sulfatos de fenazina tales como etosulfato de fenazina y metosulfato de fenazina y alcoxi sulfatos de fenazina sustituidos incluyendo 1- metoxi fenazina metosulfato junto con fenileno diamina y compuestos de rutenio tales como hexamina rutenio. Las enzimas adecuadas que pueden usarse dependerán, por supuesto, del analito y del mediador. A modo de ejemplo, enzimas adecuadas que pueden usarse con ferricianida incluyen glucosa deshidrogenasa (para glucosa), colesterol esterasa, peroxidasa de rábano picante, colesterol deshidrogenasa y colesterol oxidasa para colesterol, lipoproteína lipasa, glicerol quinasa y glicerol-3-fosfato oxidasa para triglicéridos, lactato oxidasa y lactato deshidrogenasa para lactatos así como diaforasa. Pueden usarse estabilizadores normales para las enzimas tales como BSA (albúmina de suero bovino) así como tensioactivos de poliol no iónicos tales como los conocidos con la marca registrada Tritón X y ácido cólico y otras sales de ácidos biliares. Típicamente el mediador se usa en una concentración de 0,01 a 1 molar, tal como de 0,05 a 0,25 molar mientras que la concentración de la enzima es típicamente de 10 a 10^{6} U/ml, por ejemplo de 100 a 10.000 U/ml. El mediador normalmente debe encontrarse en exceso con respecto al analito. Deseablemente el pH se controla mediante la adición de tampones tales como fosfato de potasio de manera que el pH se mantiene al nivel óptimo para el analito particular a ensayar. Otros tampones que pueden usarse incluyen fosfato de sodio, tampón Goods, tris(hidroximetil)aminometano (Tris), citrato/fosfato, ácido 3-morfolino propano sulfónico (MOPS), ácido 2-morfolino etano sulfónico (MES), N-2-hidroxietil piperazina (HERPES), tricina, bicina, piperazina-N,N'-bis-(ácido 2-etano sulfónico) (PIPES), ácido N-tris(hidroximetil)metil)-2-amino etano sulfónico (TES), ácido 3-(ciclohexil amino)-1-propano sulfónico (CAPS) y ácido [(2-hidroxi-1,1-bis[hidroximetil]etil)amino]-1-propano sulfónico (TAPS) así como otros tampones biológicos.

Los micro electrodos típicamente comprenden un electrodo de trabajo y un contra electrodo así como un electrodo de referencia. En algunos casos el contra electrodo y el electrodo de referencia se combinan. El electrodo de trabajo está fabricado típicamente con paladio, platino, oro o carbono. El contra electrodo está fabricado típicamente con carbono. Ag/AgCl, Ag/Ag_{2}SO_{4}, paladio, oro, platino, Cu/CuSO_{4}, Hg/HgO, Hg/HgCl_{2}, Hg/HgSO_{4} o Zu/ZuSO_{4}.

Cuando las enzimas se depositan en una superficie tal como un electrodo tienen una tendencia a desnaturalizarse y a formar "masas" relativamente insolubles. Típicamente, la solución enzimática se seca en el sensor y, por consiguiente, esta cuestión necesita tratarse para asegurar que la enzima conserva su actividad y que re-suspende dentro de una escala de tiempo razonable. Se ha descubierto que está reacción puede ayudarse depositando la solución enzimática en el electrodo en presencia de sal, tal como un cloruro o sulfato en el que catión es típicamente potasio, amoniaco o magnesio tal como cloruro de potasio y de magnesio y sulfato de amonio, o detergente tales como los conocidos con la marca registrada Tritón X por ejemplo Tritón X-100 o desoxicolato de sodio y sales de ácidos biliares similares, SDS, ácido 3-[(3-colamidopropil)dimetillamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO), 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]propanosulfónico (CHAPS), octilglucopiranósido, octiltioglucopiranósido y diversos otros polioles, polivinilalcohol (PVA), polietilenglicol (PEG), carboximetil celulosa, sulfato de dextrano, hidroxipropilmetil celulosa, almidón, n-dodecil maltósido, etil celulosa y ácido polimetacrílico o microcristales tales como sefarosa, Sephadex G25. De manera alternativa, uno o más de estos componentes pueden aplicarse a la superficie del electrodo primero y después secarse antes de aplicar la solución enzimática.

En una medición típica, después de aplicar la muestra al micro electrodo se establece un tiempo (SD) de, por ejemplo, 0,1 ó de 1 a 180, preferiblemente de 0,1, 0,5 ó 1 o incluso de 10 a 60, más preferiblemente de 0,1 a 60, especialmente de 0,5 a 20, en particular aproximadamente de 20 segundos, durante el cual todos los electrodos se mantienen al potencial terrestre es decir sin flujo de corriente. Esto es par dar tiempo a la enzima para re-suspender, para reaccionar sustancialmente por completo (o llegar a un estado de equilibrio estable) con el analito y para que los electrodos y enzima se humedezcan por completo. Después se aplica al electrodo un potencial, típicamente de -2 a 2 V, por ejemplo, de -1 a +1 V, por ejemplo aproximadamente de 0,5 V, dependiendo del sistema enzimático empleado, y esto determina la cantidad de mediador renovado estequiométricamente por la enzima. Antes de tomar una medición se toma un tiempo de retraso (D1), típicamente de 10 a 500 milisegundos y generalmente no superior a 1 ó 5 segundos. Típicamente la medición (C1) es la respuesta de la corriente. Después de este tiempo de retraso se mide la corriente. Se apreciará que no es necesario conocer la medición cuando el potencial se aplica en primer lugar. El dispositivo se puede calibrar de antemano con concentraciones determinadas de analito de modo que puede obtenerse una lectura directa. Se ha comprobado que la corriente obtenida es proporcional a la concentración de analito.

Aunque todo lo que se necesita es una sola lectura, en general es conveniente obtener más de una lectura, por ejemplo, de 10 a 100 lecturas en un estado de muestra de, por ejemplo, 25 a 1000 Hz, con el fin de eliminar errores y obtener un valor promedio. Es importante destacar, sin embargo, que estas múltiples lecturas se toman únicamente con objeto de realizar un promedio en contraste con la situación cuando se usa un macro electrodo en el que las lecturas múltiples son esenciales para obtener un valor de concentración mediante la integración o un algoritmo específico.

Se ha descubierto, sin embargo, que existe una dificultad en el precalibrado de un micro electrodo, incluso aunque aparentemente esté hecho para ser idéntico a un micro electrodo previo. En otras palabras, el precalibrado del micro electrodo previo no puede usarse con precisión para el siguiente micro electrodo. Debido a los pequeños tamaños implicados es muy difícil asegurar que el área del electrodo, que, por supuesto, determina críticamente la corriente obtenida, sea precisamente la misma que la del siguiente micro electrodo. El uso de la técnica de compensación del área eliminará los errores inducidos debido a los diferentes tamaños de los electrodos en el régimen de escala temporal corta. Las diferencias en el área del electrodo se producirán también en las áreas más pequeñas alcanzando un estado casi continuo más rápido que en áreas relativamente más grandes. Esta variación será evidente en el aumento relativo de la magnitud de la respuesta electroquímica. En el caso de la respuesta de corriente, esto se agrava si el sistema funciona a escala de tiempo corta por la corriente debida a la difusión plana añadida a la corriente en estado casi continuo pero con frecuencia será evidente también en escalas de tiempo más largos cuando los electrodos han alcanzado una proporción continua.

El uso de una muestra de calibrado independiente es útil en este sentido y también para eliminar cualquier diferencia que surja de cambios en el volumen de humedad-funcionamiento. En algunas circunstancias, puede ser mejor añadir una sonda redox por separado como un calibrador, la elección juiciosa de esta sonda es esencial para asegurar que (a) el estado redox inicial de la sonda es tal que es termodinámicamente desfavorable para ella reaccionar con cualquier estado redox del mediador (b) cualquier reacción entre cualquier estado redox posterior de la medición.

De acuerdo con un aspecto particular de la presente invención, se ha descubierto un medio para eliminar cualquier error debido a diferencias en el área del electrodo. Se trata de un método particular de trabajo. Para una medición amperométrica, efectivamente después de haber obtenido la medición (i1) como se ha descrito anteriormente, por ejemplo después de un retraso de tiempo, por ejemplo, de 10 a 500 milisegundos, como antes, el potencial se invierte de modo que el mediador que se ha oxidado por la de reacción se reduce después y se obtiene otro valor (C2) de la corriente (i2), típicamente después de un tiempo de retraso similar (D3). Se podrá apreciar que en cada caso la corriente obtenida es proporcional al área de la superficie del electrodo de manera que obteniendo una proporción de las dos corrientes (i1/i2) o un porcentaje de la primera corriente con respecto a la suma de los dos corrientes (i1 /i1 + i2) puede obtenerse un valor que es independiente de la superficie del electrodo. La Figura 3 ilustra, esquemáticamente, el procedimiento. Esta proporción o porcentaje por lo tanto se puede leer directamente desde una curva de calibración exactamente del mismo modo como si se obtiene una sola medición. Para obtener una medición voltamétrica usando un par redox determinado, puede usarse un segundo par redox no reactivo; es importante que la concentración relativa de los dos pares redox se mantenga constante en todos los electrodos a ensayar.

Este método de trabajo de compensación es, por tanto, de especial valor en la eliminación de diferencias en el área de la superficie de los micro electrodos que se producen, típicamente como biosensores. Dado que la corriente observada es una combinación de difusión "plana" y "radial "el uso de la técnica proporcional puede eliminar cambios en los porcentajes relativos de estos dos componentes procedentes de tamaños de electrodos diferentes.

Por consiguiente, la presente invención también proporciona un método para determinar la concentración de un analito en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un micro electrodo que contiene una enzima capaz de reaccionar con dicho analito y un mediador redox que es capaz de convertirse oxidándose o reduciéndose por dicha enzima una vez que esta última ha reaccionado con el analito, en el que dicha enzima y dicho mediador están típicamente presentes en exceso en comparación con dicho analito, lo que permite que el analito reaccione con la enzima, aplicando después un potencial a través del electrodo, midiendo la corriente resultante, revirtiendo el potencial y midiendo de nuevo la corriente, expresando las dos corrientes como una proporción o un porcentaje y determinando la concentración del analito directamente de ella.

Para simplificar la operación, la presente invención también proporciona un micro electrodo que comprende un electrodo de trabajo y un contra electrodo, medios para aplicar un potencial positivo o negativo a través del electrodo en un momento determinado después de que la muestra se ha aplicado a ello, medios para la determinación de la corriente resultante en un tiempo establecido no superior a 1 segundo, por ejemplo, de hasta 500 milisegundos, a partir de entonces, medios para revertir el potencial a través del electrodo y determinar la corriente resultante en dicho tiempo establecido después de la inversión. Se podrá apreciar que un único procesador/microchip puede proporcionar los diversos medios.

Los siguientes ejemplos, a continuación, ilustran la presente invención. Se han usado los siguientes sensores:

Sensor colesterol oxidasa:

Peroxidasa de rábano picante a 400 U/ml

Colesterol oxidasa a 700 U/ml

Colesterol esterasa a 700 U/ml

Ferricianida de potasio 0,08 M

Cloruro de potasio 0,1 M

Fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,4

Triton X-100 100g/dm^{-3 }

Sephadex G25 0,2 g/ml

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Sensor de triglicéridos:

Glicerol fosfato oxidasa a 4500 U/ml

Glicerol quinasa a 4500 U/ml

Lipasa a 100.000 U/ml

Cloruro de potasio 0,2 M

Ferricianida de potasio 0,2

Trifosfato de adenosina 0,025 M

Sulfato de amonio 0,002 M

Cloruro de magnesio 0,002 M

Sephadex G25 0,1 g/ml

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Si se traza como función de la concentración de glicerol, la primera corriente oxidativa depende de la renovación de la enzima pero también del área de la superficie del electrodo. Debido a que los micro electrodos desechables tienden a tener áreas de superficie variables, la relación entre la corriente de oxidación y la concentración de oxidación se ve comprometida.

Por otro lado, dividiendo la corriente de oxidación de la primera etapa de potencial por la corriente de reducción de la segunda etapa de potencial, se obtiene una proporción sin unidades lo que elimina el factor de área del electrodo.

La Figura 1 muestra la respuesta de la corriente durante los experimentos de doble etapa potencial. El valor de la corriente se observa que llegar a ser constante en aproximadamente 400 ms en la etapa de potencial. Los valores de la corriente para la etapa de oxidación y las corrientes de reducción se leen de la gráfica 400 ms después de la primera y la segunda etapa de potencial respectivamente.

La figura 2 muestra las corrientes de oxidación es decir, únicamente desde la primera etapa de potencial, representada en función de concentraciones de glicerol. Estas corrientes están sujetas a la variabilidad del área de electrodo.

La figura 3 es un gráfico de proporciones obtenidas de las corrientes de oxidación representadas en la figura 2, divididas por sus corrientes respectivas de reducción obtenidas de la segunda etapa de potencial (como se muestra en la Figura 1) Estas proporciones son el resultado de una compensación de área y confirman que son lineales con la concentración de glicerol.

Ejemplo 1

Las mediciones se realizaron en electrodos del tipo descrito en la solicitud británica n° 01306844. Los electrodos de trabajo eran de carbono Coates impresos sobre un sustrato superior de 250 \mum melones. Este se adhirió a un sustrato inferior de 125 micras melonex para formar la cavidad. Ag/AgCl se imprimieron en el sustrato superior. Los componentes de la solución recubriendo el biosensor (concentraciones) eran cloruro de hexa amino rutenio (III) (4,8 mM), NAD + (0,8 mM), PdR (1.6 \muM), detergente polimérico (2.5 M) y glucosa deshidrogenasa (UI/biosensor). El electrolito de soporte era fosfato 0,1 M, pH 7,4. Se aplicó un potencial de +0,2 V frente a Ag/Ag Cl y se tomaron mediciones 0,5 s después de la aplicación del potencial. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4.

Ejemplo 2

Los electrodos se construyeron como en el Ejemplo 1 de una capa PET de 250 \mum en la que se había estarcido una capa de tinta Coates de carbono de 7 \mum seguido de una capa dieléctrica de 30 \mum Dupont 5036. Esta capa se había perforado para producir un orificio de 1 mm de diámetro y después se había adherido a una capa base PET de 125 \mum usando laminación sensible a presión, con una contra referencia Ag/AgCl propia (usando Ercon E0430-128) en la parte superior de la tira.

La corriente amperométrica se midió 1 segundo después de la aplicación de 0,15 V seguido por la aplicación de -0,45 V frente Ag/AgCl sobre la adición de cantidades variables de colesterol LDL en tampón Tris 0,1 mol dm a pH 7,4 conteniendo KCl 0,1 mol dm^{-3} para electrodos en los que se había secado 0,3 \mul de una solución que contenía NAD a 0,022 g/ml, hexa amino rutenio a 0,021 g/ml, colesterol esterasa a 1,25 kU/ml, colesterol deshidrogenasa a 4,2 kU/ml, putidaredoxin reductasa a 650 kU/ml, KCl 0,1 M, Tris-HCl 0,1 M a pH 9, octil glucopiranósido a 100 g/dm^{3}.

Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

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Se puede observar que el uso de compensación de área disminuye la magnitud del error y por lo tanto es extremadamente útil en la producción de sensores de precisión.

Ejemplo 3

Se construyeron electrodos como en el ejemplo 1 de una capa PET de 250 \mum en la que se había estarcido una capa de tinta de carbono Coates 268203 de 20 \mum, seguido por una capa dieléctrica de 30 \mum Esta capa se había perforado para producir un orificio de 1 mm de diámetro y posteriormente se había adherido a la capa base de PET usando adhesivo laminar 7841, con una contra referencia Ag/AgCl propia (Ercon E0430-128) en la parte superior de la tira.

La corriente amperométrica se midió 1 segundo después de la aplicación de 0,20 V frente Ag/AgCl sobre la adición de glicerol 2, 5, 7,5, 10, 12,5 y 15 mmol dm^{-3} en tampón Tris 0,1 mmol dm^{-3} a pH 9, que contenía KCl 0,1 mol dm^{-3} y OGP al 1%, para electrodos en los que se había secado 0,3 \mul de una solución que contenía hexa amino rutenio 0,1 mol dm^{-3}, sulfato de amonio 0,15 mol dm^{-3}, NAD 0,04 mol dm^{-3}, glicerol deshidrogenada 150 U/ml y diaforasa
6,7 kU/ml.

Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

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Ejemplo 4

Se construyeron electrodos como en el ejemplo 1 de una capa PET de 250 \mum en la que se había estarcido una capa de tinta de carbono Coates 268203 de 7 \mum, seguido por una capa dieléctrica de 30 \mum Dupon. Esta capa se había perforado para producir un orificio de 1 mm de diámetro y posteriormente se había adherido a la capa base de PET de 125 \mum usando laminación sensible a presión, con una contra referencia Ag/AgCl propia (usando Ercon E0430-128) en la parte superior de la tira.

La corriente amperométrica se midió 1 segundo después de la aplicación de 0,15 V seguido por la aplicación de 0,45 V frente Ag/AgCl sobre la adición de colesterol LDL 1, 3, 5 mmol dm^{-3} en tampón Tris 0,1 mol dm^{-3} a pH 7,4 con 0,1 mol dm^{-3} KCl para electrodos en los que se habían secado 0,3 \mul de una solución que contenía NAD a 0,022 g/ml, hexa amino rutenio a 0,021 g/ml, colesterol esterasa a 1,25 kU/ml, colesterol deshidrogenasa a 4,2 kU/ml, putidaredoxin reductasa a 650 kU/ml, KCL 0,1 M, Tris-HCl 0,1 M a pH 9, octil glucopiranósido a 100g/dm^{3}.

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 5.

Ejemplo 5

Se construyeron electrodos como en el ejemplo 1 de una capa PET de 250 \mum en la que se había estarcido una capa de tinta de carbono Coates 268203 de 15 \mum, seguido por una capa dieléctrica de 30 \mum Ronseal. Esta capa se había perforado para producir un orificio de 1 mm de diámetro y posteriormente se había adherido a la capa base de PET usando adhesivo laminar Arcare 7841, con una contra referencia Ag/AgCl propia en la parte superior de la tira.

La corriente voltamétrica cíclica se midió a 0,15 V frente Ag/AgCl inmediatamente después de la adición de 2, 4, 6, 8 y 10 mmol dm NADH en 0,1 mol dm^{-3} de tampón Tris a pH 9 que contenía 0,1 mol dm^{-3} de KCl para electrodos en los que se había secado 0,2 \mul de una solución que contenía hexa amina rutenio 0,2 mol dm y putidaredoxin reductasa 650 KU/ ml.

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 6.

Ejemplo 6

Los electrodos se construyeron como en el ejemplo 1 de una capa PET de 250 \mum en la que se había estarcido una capa de tinta de carbono Coates 26-8203 seguido por una capa de 30 micras Ronseal. Esta capa se había perforado para producir un orificio de 1 mm de diámetro y posteriormente se había adherido a una capa de 125 micras de PET base con adhesivo laminar ARcare 7841, con una contra referencia común de Ag/AgCl en la parte superior de la tira.

La corriente amperiométrica se midió 1 segundo después de la aplicación 0.15 V frente Ag/AgCl sobre la adición de 2, 4, 6, 8 y NADH 10 mmol dm ^{-3} en tampón Tris 0,1 mol dm^{-3} a pH 9 con KCl 0,1 mol dm^{-3} para electrodos en los que se había secado 0,2 \mul de una solución que contenía hexa amina rutenio 0,2 mol dm^{-3} y putidaredoxin reductasa 650 KU/ml. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 7.

Claims

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1. Un método para determinar la concentración de un analito en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un micro electrodo que comprende una enzima capaz de reaccionar con dicho analito y un mediador redox que es capaz de convertirse estando oxidado o reducido por dicha enzima una vez que esta última ha reaccionado con el analito, en el que dicha enzima y dicho mediador están presentes típicamente en exceso en comparación con dicho analito, permitiendo que el analito reaccione con la enzima, reaccionando dicha enzima substancialmente por completo con dicho analito antes de aplicar un potencial, aplicando después un potencial a través del electrodo y midiendo la concentración resultante del mediador convertido electroquímicamente.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la concentración resultante se mide a partir de la corriente resultante.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en el que el micro electrodo comprende un electrodo de trabajo, un contra electrodo y un electrodo de referencia.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3 en el que el contra electrodo y el electrodo de referencia están combinados.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4 en el que el electrodo de trabajo está fabricado con paladio, platino, oro o carbono y el contra electrodo está fabricado con carbono, Ag/AgCl, Ag/Ag_{2}SO_{4}, paladio, oro, platino, Cu/CuSO_{4}, Hg/HgO, Hg/HgCl_{2}, Hg/HgSO_{4}, o Zu/ZuSO_{4}.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el mediador es ferricianida, fenazina etosulfato, fenazina metosulfato, 1-metoxi fenazina metosulfato, fenileno diamina o rutenio hexamina.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la enzima es glucosa deshidrogenasa, colesterol esterase, peroxidasa de rábano picante, colesterol deshidrogenasa, colesterol oxidasa, lipoproteína lipasa, glicerol quinasa, glicerol deshidrogenasa, glicerol-3-fosfato oxidasa, lactato oxidasa o lactato deshidrogenasa.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende dejar transcurrir un tiempo de 0,5 a 180 segundos después de haber aplicado la muestra al micro electrodo antes de aplicar un potencial a través del electrodo y realizar una medición electroquímica no superior a 5 segundos después.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8 en el que el potencial aplicado es de -2 a +2 voltios.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9 en el que la medición se realiza de 10 a 500 milisegundos después de haber aplicado el potencial.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en el que se toman de 10 a 100 mediciones.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el micro electrodo se ha calibrado previamente para proporcionar una lectura directa.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el mediador está presente en exceso con respecto al analito.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el mediador que ha reaccionado está presente a una concentración correspondiente a una proporción de electrones 1:1 con el analito.
15. Un método para determinar la concentración de un analito en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un micro electrodo que contiene una enzima capaz de reaccionar con dicho analito y un mediador redox que es capaz de convertirse estando oxidado o reducido por dicha enzima una vez que esta última ha reaccionado con el analito, en el que dicha enzima y dicho mediador están presentes típicamente en exceso en comparación con dicho analito, dejar que el analito reaccione con la enzima, aplicar después un potencial a través del electrodo, medir la corriente resultante, invertir el potencial y medir de nuevo la corriente, expresar las dos corrientes como la proporción o porcentaje y determinar la concentración del analito directamente a partir de esto.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 15 que comprende dejar transcurrir un tiempo de 0,5 a 180 segundos después de haber aplicado la muestra al micro electrodo antes de aplicar un potencial a través del electrodo y realizar una medición electroquímica no superior a 5 segundos después de esto.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 15 o 16 en el que el potencial aplicado es de -2 a +2 voltios.
18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 en el que el mediador está presente en exceso con respecto al analito.