MX2008008104A - Mediadores redox. - Google Patents
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Abstract
La presente solicitud se dirige a complejos de conformidad con las Fórmulas (I) o (II) como se describen en la presente y a su uso como mediadores redox en biosensores electroquímicos.
Description
MEDIADORES REDOX CAMPO DE LA INVENCION La presente invención concierne a nuevos complejos de rutenio o de osmio y a su uso en biosensores. En particular la invención concierne al uso de complejos de rutenio que tengan una carga total sobre las especies que contengan rutenio de menos de 3+ en el estado de rutenio (III) como mediadores redox.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los biosensores son herramientas analíticas que combinan un componente de reconocimiento bioquímico o elemento sensor con un transductor físico. Tienen amplia aplicación en campos diversos tales como monitoreo de la salud personal, monitoreo y selección ambiental, monitoreo de bioprocesos, y en la industria de alimentos y bebidas. El elemento sensor biológico puede ser una enzima, anticuerpo, secuencia de ADN, o aún un microorganismos. El componente bioquímico sirve para catalizar selectivamente una reacción o facilitar un evento de enlace. La selectividad del evento de reconocimiento bioquímico permite la operación de biosensores en una matriz de muestra compleja, es decir, un fluido corporal.
El transductor convierte el evento bioquímico en una señal medible, proporcionando asi los medios para detectarla. Los eventos medibles varían a partir de cambios espectrales, los cuales son debido a la producción o consumo de un producto/sustrato de reacción enzimática, para cambiar la masa a partir de complejación bioquímica . En general, el transductor toma muchas formas y dicta el parámetro fisicoquímico que será medido. Así, el transductor puede estar basado ópticamente, medir cambios tales como absorción óptica, fluorescencia, o índice de refracción. Puede estar basado en masa, medir el cambio en la masa que acompaña a una reacción de enlace derivada biológicamente. Adicionalmente , puede estar basada térmicamente (medir el cambio en la entalpia (calor) o basado en amperometría o impedancia (medir el cambio en las propiedades eléctricas) que acompañan la interacción de las capas analito/bio-reconocimiento . Los biosensores ofrecen la conveniencia y la facilidad de mediciones distribuidas, esto es, la habilidad potencial para tomar el ensayo en el punto de interés o de cuidado. Diseñado y fabricado apropiadamente, dispositivos biosensores pueden ser convenientemente producidos en masa.
Sin embargo, hay varias limitaciones al uso de biosensores. Estas incluyen una vulnerabilidad del transductor a incrustaciones e interferencias. Biosensores basados en enzimas son usados ampliamente en la detección de analitos en aplicaciones clínicas, ambientales, agrícolas y biotecnológicas . Los analitos que pueden ser medidos en ensayos clínicos de fluidos del cuerpo humano incluyen, por ejemplo, glucosa, lactato, colesterol, bilirrubina y aminoácidos. Los niveles de estos analitos en fluidos biológicos, tales como sangre, son importantes para el diagnóstico y el monitoreo de enfermedades. Se proporcionan sensores que pueden ser usados generalmente en sistemas basados en enzimas, ya sea como punto de cuidado o en los dispositivos contadores. Pueden ser usados para probar muestras de sangre fresca, sin modificar, entera de punzadura de dedo, para determinar las concentraciones de colesterol total, t riglicéridos , HDL y LDL, en 1 a 2 minutos de adición de la muestra al dispositivo (nota: esta vez no es fijado y podría ser sometido a variaciones significativas) . Estos cuatro parámetros, en combinación, han sido probados clínicamente para dar un muy buen indicio del riesgo de enfermedades cardíacas en adultos. Es bien sabido que el colesterol alto es asintomático por consiguiente se
recomienda que cada adulto deberá tener una prueba para evaluar su riesgo. Si se encuentra que su riesgo es alto puede reducirse significativamente por el manejo correcto de ya sea solo de la dieta, o en combinación con fármacos terapéuticos. En un ejemplo de un biosensor basado en enzima se utilizó un ensayo electroquímico para detectar el analito en cuestión. Se hace uso de un cambio en el estado de oxidación de un mediador que interactúa con una enzima que ha reaccionado con el analito a ser determinado. El estado de oxidación del mediador es seleccionado de modo que esté solamente en el estado que interactuará con la enzima además del sustrato. El analito reacciona con la concentración estequiométrica del mediador vía la enzima. Esto causa que el mediador sea oxidado o reducido (dependiendo de la reacción enzimática) y este cambio en el nivel del mediador puede ser medido por determinación de la corriente generada a un potencial dado. Los ensayos electroquímicos se efectúan típicamente en células con dos o tres electrodos, incluyendo al menos un electrodo de trabajo o medidor y un electrodo de referencia. En estos sistemas de tres electrodos, el tercer electrodo es un contra electrodo. En dos sistemas de electrodos, el electrodo de referencia también sirve como el contra-electrodo. Los electrodos son conectados a
través de un circuito, tal como un potenciostato . El electrodo de medición o de trabajo es un conductor metálico o de carbón. A partir del paso de una corriente a través del electrodo de trabajo una enzima redox es electro-oxidada o electro-reducida. La enzima es especifica para el analito a ser detectado, o para un producto del analito. La velocidad de inversión de la enzima está relacionada típicamente (preferible, pero no necesariamente, linealmente) a las concentraciones del analito mismo, o a su producto, en la solución de prueba.
La electro-oxidación o electro-reducción de la enzima a menudo es facilitada por la presencia de un mediador redox en la solución o sobre el electrodo. El mediador redox generalmente auxilia en la comunicación eléctrica entre el electrodo de trabajo y la enzima. El mediador redox puede ser disuelto en el fluido a ser analizado, el cual está en contacto electrolítico con los electrodos. Los dispositivos útiles pueden elaborarse, por ejemplo, por recubrimiento de un electrodo con una película que incluye un mediador redox y una enzima, donde la enzima es catalíticamente específica al analito deseado, o a sus productos. Un mediador redox difusional, el cual puede ser soluble o insoluble en agua, funciona por electrones oscilantes entre, por ejemplo, la enzima y el electrodo. En cualquier caso, cuando el sustrato de la
enzima es electro-oxidado, el mediador redox transporta electrones desde la enzima reducida con el sustrato al electrodo; cuando el sustrato es electro-reducido, el mediador redox transporta electrones desde el electrodo a la enzima oxidada por el sustrato. Muchas enzimas usadas previamente basadas en sensores electroquímicos han empleado numerosos mediadores redox diferentes tales como ferrocenos monoméricos, compuestos quinoides incluyendo quininas (por ejemplo, benzoquinonas ) , ciclamatos de níquel, y aminas de rutenio. Para la mayor parte, estos mediadores redox tienen una o más de las siguientes limitaciones; la solubilidad de los mediadores redox en las soluciones de prueba es baja, su estabilidad química, a la luz, térmica, o de pH es pobre, o no intercambian electrones suficientemente rápido con enzimas o con el electrodo o con ambos. Adicionalmente , el potencial redox de muchos de estos mediadores redox reportados son tan oxidantes que en el potencial en el que el mediador reducido es electro-oxidado sobre el electrodo, los componentes de la solución diferentes del analito son también electro-oxidados; en otros casos son tan reductores que los componentes de la solución, tales como, por ejemplo, oxígeno disuelto son también elect o-reducidos
rápidamente. Como un resultado, el sensor que utiliza el mediador no es suficientemente especifico. Los complejos basados en rutenio han sido utilizados previamente como mediadores redox en reacciones que contienen por ejemplo, colesterol deshidrogenasa . Por ejemplo, cualquier especie de [Ru11 (NH3 ) 6]2+ que está presente es convertida a [Ru111 (NH3) 6]3+ en un electrodo mantenido a un potencial adecuado: la corriente que pasa es proporcional a la cantidad de especies de RuI:[(NH3) 6 formadas vía la reacción enzimática. No obstante, una especie tal muy cargada como [Ru111 (NH3) 6]3+, forman en mayor o menor grado, complejos, usualmente en la forma de pares iónicos, con grupos cargados negativamente sobre enzimas y la superficie del electrodo impidiendo asi las reacciones necesarias para que tenga lugar el proceso analítico efectiva y eficientemente. Por consiguiente, sería deseable, utilizar un mediador redox que forme menos complejos fuertes o ninguno de todos con los componentes de la mezcla analítica y el electrodo y conducir así a respuestas medidas a partir de dichos mediadores que sean más confiables, estables y reproducibles .
SUMARIO DE LA INVENCION De conformidad con un primer aspecto de la presente invención se proporciona el uso de un complejo de Fórmula 1^
Fórmula I como un mediador redox en donde M es rutenio u osmio y tiene un estado de oxidación de 0, 1, 2, 3 o 4; x, y n son independientemente un entero seleccionado de 1 a 6; y es un entero seleccionado de 1 a 5; m es un entero de -5 a +4 y z es un entero desde -2 a +1; A es un ligando mono- o bidentado aromático que contenga 1 o 2 átomos de nitrógeno; B es seleccionado independientemente para ser cualquier ligando adecuado diferente de un ligando que contenga nitrógeno heterocíclico ; X es cualquier contra ión adecuado donde A es opcionalmente sustituido por 1 a 8 grupos seleccionados independientemente de grupos alquilo, alquenilo o arilo sustituidos o no sustituidos, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, -C02H, -S03H, -NHNH2, -SH, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilamino carbonilo, -OH, alcoxi, -NH2, alquilamino, dialquilamino,
alcanoilamino, arilcarboxamido, alquilhidrazino, hidroxilamino, alcoxiamino, alquiltio; en donde el número de átomos de coordinación es 6. El ligando A puede ser un ligando monodentado sustituido por uno o más grupos CO2 2, o un ligando di- o tridentado opcionalmente sustituido por uno o más grupos C02R2. El grupo R2 puede ser seleccionado para ser H. El ligando A puede ser seleccionado de ácido nicotinico, ácido isonicotinico, 2, 2 ' -bipiridina , ácido 2, 2-bipiridin-5, 5' -dicarboxilico, ácido 2, 2- bipiridin-4, 4'- dicarboxilico, o 5- cloro- 8- hidroxiquinolina . De conformidad con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un complejo de Fórmula II
como un mediador redox en donde M es rutenio u osmio y tiene un estado de oxidación de 0, 1, 2, 3 o ; x, y n son independientemente un entero seleccionado de 1 a 6; y es un entero seleccionado de 0 a 5; m es un entero de -5 a +4 y z es un entero desde -2 a +1; A es un ligando bi-, tri-, tetra-, penta- o hexadentado que pueda ser ya sea lineal que tenga la fórmula RXRN (C2H4NR) « 1 o cíclico que tenga la fórmula
(RNC2H4)V, (RNC2H4)p(RNC3H6)q, o [ ( RNC2H4 ) ( RNC3H6 ) ]s , en donde w es un entero desde 1 a 5, v es un entero desde 3 a 6, p y q son enteros desde 1 a 3 con los cuales la suma de p y q es 4, 5, o 6, y s es ya sea 2 o 3, y en donde R y R1 son ya sea hidrógeno o metilo; B es seleccionado independientemente para ser ligando adecuado; X es cualquier contra ión adecuado donde B es opcionalmente sustituido por 1 a 8 grupos seleccionados independientemente de grupos alquilo, alquenilo o arilo sustituidos o no sustituidos, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, -C02H, -S03H, -NHNH2, -SH, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilamino carbonilo, -OH, alcoxi, -NH2, alquilamino, dialquilamino, alcanoilamino , arilcarboxamido, alquilhidrazino, hidroxilamino, alcoxiamino, alquiltio; en donde el número de átomos de coordinación es 6. El ligando A puede ser un ligando bi-, tri- o tetra, dentado que pueda ser ya sea lineal que tenga la fórmula RXRN (C2H4NR) «R1 o cíclico que tenga la fórmula (RNC2H4)V, (RNC2H4) p (RNC3H6) q, [ (RNC2H4) (RNC3H6) ]s, en donde v es un entero desde 1 a 3, v es ya sea 3 o 4, p y q son enteros desde 1 a 3 con los cuales la suma de p y q es 4 y s es ya sea 2 o 3.
El ligando A puede ser seleccionado desde 1, 4, 7-trimetil- 1, 4, 7- triazaciclononano, o 1, 1, 4, 7, 10, 10- hexametiltrietilentetramina , 1, 2-dimetiletilendiamina, o 1, 1, 2, 2-tetrametiletilendiamina . El ligando B en la Fórmula I o en la Fórmula II pueden ser seleccionados de ligandos amina tales como NH3 o de CO; CN; halógeno, y acetilacetonato (acac) , 3-bromo- acetilacetonato (Bracac) , oxalato, piridina, o 5-cloro- 8- hidroxiquinolina . Los ligandos A y B ya sea en la Fórmula I o bien en la Fórmula II pueden ser seleccionados para ser bidentados y la geometría del complejo cis o trans. El estado de oxidación del metal en los complejos ya sea de la Fórmula I o en la Fórmula II puede ser seleccionado para ser 2+, 3+ o 4+. El estado de oxidación del metal en los complejos ya sea de la Fórmula I o bien de la Fórmula II pueden ser seleccionados para ser 3+. Los ligandos A y B ya sea en la Fórmula I o en la
Fórmula II pueden ser seleccionados del grupo +2, +1, 0, -1, -2 y -3. El contra ión en los complejos de Fórmula I o de Fórmula II puede ser seleccionado de F~, Cl~, Br", I", N03"
, ?? , NR4" PF6~, CF3SO3', S042~, CIO4", K+, Na+ , Li+. Puede usarse una combinación de contra iones. El complejo de Fórmula I o de Fórmula II puede ser seleccionado de [Ru111 (NH3) s (piridina-3-C00H)](PF6)2(CF3S03) , [RuTII(2, 4 -pentandionato ) 2 (piridina-3-C00H) (piridina-3-C00) ], [RuITI(3- bromo- 2, 4-pentandionato) 2- (piridina- 3- COOH) (piridina-3-C00) ], [RuIIJ(2, 4- pentandionato) 2 (2, 2' -bipiridina-5, 5' - (COOH) (C00)], [RuIXI(2, 4- pentandionato ) 2 (2,2'-bipiridina- 4, 4'- (COOH) (COO) ], [RuIXI(2, 4-pentandionato) 2 (2, 2 ' -bipiridina ) ]C1 , [RuIJI(2, 4-pentandionato) 2 (piridin-4-COOH) (piridina-4-COO) ], [RuII:t(5- cloro- 8- hidroxiquinolina ) 2 (piridina-3-COOH) (Piridina-3-C00) ], [RuXII(l, 1, 4, 7, 10, 10-hexametiletiltrietilen tetramina) (2, 4-pentandionato) (PF6) (CF3SO3)], [RuITI(l, 1, 4, 7, 10, 10-hexametiltrietilentetramina ) (2, 4- pentandionato ) ]C12 , [Os"(2, 2' -bipiridina) 2 (2, 4- pentandionato ) ]C1 , [Ru"(2, 2' -bipiridina) 2 (2, 4- pentandionato ) ]C1 , [Ru"(2,2'-bipiridina) 2 (C204], K[RuITI (C204 ) 2 (piridina-3-COOH2] , [RuJII(l, 4, 7- trimetil- 1, 4, 7- triazaciclononano) (2, 4-pentandionato (piridina )] (N03 ) 2 · El complejo de Fórmula I o de Fórmula II puede ser seleccionado de [RuIIi:(2, 4-
pentandionato ) 2 (piridina- 3- COOH) (piridina-3-COO) ], [RuI];i(l, 4, 7- trimetil- 1, 4, 7- triazaciclononano) (2,
4- pentandionato) (piridina) ] (N03) 2, o [RuXII(l, 1, 4, 7, 10, 10- hexametiltrietilentetramina) (2, 4-pentandionato) ]C12. El mediador redox puede ser usado en un sensor electroquímico. El sensor electroquímico puede incluir un electrodo de micro-banda. El sensor electroquímico puede ser un biosensor electroquímico. El biosensor electroquímico puede ser usado para detectar analitos en fluidos corporales, muestras ambientales, alimentos y bebidas, muestras veterinarias, productos farmacéuticos.
De conformidad con un tercer aspecto de la presente invención se proporciona el uso de un complejo de rutenio de Fórmula I o de Fórmula II como se definió previamente en un biosensor. El complejo de Fórmula I o de Fórmula II puede ser usado a un pH de 6 a 10. El complejo de Fórmula I o de Fórmula II puede ser usado a un pH de 7 a 9. El biosensor puede ser usado con cualquier analito bioquímico compatible. El analito puede encontrarse en un fluido biológico, y puede también ser seleccionado de cualquiera de una enzima, sustrato enzimático, antígeno, anticuerpo, secuencia de ácido nucleico, colesterol,
ásteres de colesterol, lipoproteinas , triglicéridos o un microorganismo . De conformidad con un cuarto aspecto de la presente invención se proporciona un sistema de detección para medir un analito, que comprende: (a) poner en contacto una muestra que contiene el analito con solución que contenga un mediador redox seleccionado de un grupo de compuestos que contengan Ru o que contengan Os e conformidad con la Fórmula I o con la Fórmula II; (b) incubar la muestra puesta en contacto bajo condiciones que causan que la enzima actúe sobre el analito ; (c) someter la muestra incubada de la etapa (b) a condiciones que dan como resultado un cambio en una señal medible; y (d) medir la señal resultante. La señal medible puede ser una señal electroquímica, colorimétrica , térmica, impedométrica , capacitora o espectroscópica . La señal medible puede ser una señal electroquímica medida en un electrodo de micro-banda. De conformidad con un quinto aspecto de la presente invención se proporciona un complejo de conformidad con la Fórmula I [M(A)x(B)y]m(Xz)n
Fórmula I en donde es rutenio u osmio y tiene un estado de oxidación de 0, 1, 2, 3 o 4; x, y n son independientemente un entero seleccionado de 1 a 6; y es un entero seleccionado de 0 a 5; m es un entero de -5 a +4 y z es un entero desde -2 a +1; A es un ligando mono- o bidentado aromático que contenga 1 o 2 átomos de nitrógeno; B es seleccionado independientemente para ser ligando adecuado diferente de un ligando que contenga nitrógeno heterociclico; X es cualquier contra ión adecuado; donde A es opcionalmente sustituido por 1 a 8 grupos seleccionados independientemente de grupos alquilo, alquenilo o arilo sustituidos o no sustituidos, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, -C02H, -S03H, -NHNH2, -SH, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilamino carbonilo, -OH, alcoxi, -NH2, alquilamino, dialquilamino, alcanoilamino, arilcarboxamido, alquilhidrazino, hidroxilamino , alcoxiamino, alquiltio; en donde el número de átomos de coordinación es 6. El ligando A puede ser un ligando monodentado sustituido por uno o más grupos C02R2, o un ligando di- o tridentado opcionalmente sustituido por uno o más grupos C02R2;
El grupo R2 puede ser seleccionado para ser H. El ligando A puede ser seleccionado de ácido nicotinico, ácido isonicotinico, ácido 5- carboxi-nicotinico, ácido 6- piridil nicotinico, ácido 2,2'-bipiridin-5 , 5 ' -bis carboxilico, ácido 2, 2'- bipiridin-4, 4'- bis- carboxilico, o 2 , 2 ' -piridina , ácido 1, 10-fenantrolin- 3, 8- bis- carboxilico. De conformidad con un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un complejo de conformidad con la Fórmula II [ (A)x(B)y]m(Xz)n Fórmula II en donde M es rutenio u osmio y tiene un estado de oxidación de 0, 1, 2, 3 o 4 ; x, y n son independientemente un entero seleccionado de 1 a 6; y es un entero seleccionado de 0 a 5; m es un entero de -5 a +4 y z es un entero desde -2 a +1; A es un ligando bi-, tri-, tetra-, penta- o hexadentado que puede ser ya sea lineal que tenga la fórmula RXRN (C2H4NR) «R1 o cíclico que tenga la fórmula (RNC2H4)V, (RNC2H4) p (RNC3H6) q, o [ ( RNC2H4 ) ( RNC3H6 ) ]s , en donde w es un entero desde 1 a 5, v es un entero desde 3 a 6, p y q son enteros desde 1 a 3 con los cuales la suma de p y q es 4, 5, 0 6, y s es ya sea 2 o 3, y en donde R y R1 son ya sea hidrógeno o metilo;
B es seleccionado independientemente para ser cualquier ligando adecuado; X es cualquier contra ión adecuado en donde B es opcionalmente sustituido por 1 a 7 grupos seleccionados independientemente de grupos alquilo, alquenilo o arilo sustituidos, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, -C02H, -S03H, -NHNH2, -SH, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, -OH, alcoxi, -NH2, alquilamino, dialquilamino, alcanoilamino, arilcarboxamido, alquilhidrazino , hidroxilamino, alcoxiamino, alquiltio; en donde el número de átomos de coordinación es 6. El ligando A puede ser un ligando bi-, tri- o tetra, dentado que pueda ser ya sea lineal que tenga la fórmula R1RN (C2H4NR) «R1 o cíclico que tenga la fórmula (RNC2H4)V,
(RNC2H4) p (RNC3H6) q, [(RNC2H4) (RNC3H6)]S, en donde w es un entero desde 1 a 3, v es ya sea 3 o 4, p y q son enteros desde 1 a 3 con los cuales la suma de p y q es 4 y s es ya sea 2 o 3. El ligando A puede ser seleccionado desde 1, 4, 7-trimetil- 1, 4, 7- triazaciclononano, o 1, 1, 4, 7, 10, 10- hexamet iltriet ilentetramina , 1, 2- dimetiletilen diamina, o 1, 1, 2, 2- tetrametiletilendiamina . El ligando B puede ser seleccionado de ligandos amina tales como NH3 o NMe de CO; CN; halógeno,
acetilacetonato (acac) , 3- bromo- acetilacetonato (Bracac) , oxalato, éter coronado de 1, 4, 7-trietileno, o 5- cloro- 8- hidroxiquinolina . La geometría del complejo puede ser cis o trans cuando los ligandos A o B son seleccionados para ser bidentados . Los estados de oxidación del metal en los complejos de Fórmula I o de Fórmula II pueden ser seleccionados para ser 2+ o 3+. El estado de oxidación del metal en los complejos de Fórmula I o de Fórmula II pueden ser seleccionados ara ser 3+. Los ligandos A y B pueden ser seleccionados de modo que la carga total del complejo de Fórmula I o de Fórmula II sea seleccionada del grupo +2, +1, 0, -1, -2 y -3. El contra ión puede ser seleccionado de F, Cl-, Br-,
I-, N03-, NH , NR4+, PF6-, CF3SO3-, S042", C104-, K+, Na+ , Li+. Puede usarse una combinación de iones contrarios. El complejo de Fórmula I o de Fórmula II puede ser seleccionado de [Ru111 (NH3) 5 (piridina-3-COOH ) ] ( PF6) 2 (CF3SO3) , [RuIXI(2, 4-pentandionato) 2 (piridina-3-COOH) (piridina-3-COO) ], [RuI:II(3- bromo- 2, 4- pentandionato) 2-(piridina- 3- COOH) (piridina-3-COO) ], [RuIIT(2, 4-pentandionato) 2 (2, 2' -bipiridina-5, 5' - (COOH) (COO)],
[RuTII(2, 4- pentandionato) 2 (2, 2' -bipiridina-4 , 4' -
(COOH) (COO)], [RuIJI(2, 4- pentandionato ) 2 ( 2 , 2 ' -bipiridina ) ]C1 , [RuIi:E(2, 4- pentandionato) 2 (piridin-4-COOH) (piridina-4-COO) ], [RuI?I(5- cloro- 8-hidroxiquinolina ) 2 (piridina-3-C00H) ( Piridina-3-C00) ], [RuJII(l, 1, 4, 7, 10, 10- hexamet iletil trietilentetramina) (2, 4- pentandionato) ( PF6) (CF3SO3) ], [RuI?I(l, 1, 4, 7, 10, 10- hexametiltrietilentetramina) (2, 4- pentandionato) ]C12, [Os?I(2, 2 ' -bipiridina ) 2 ( 2 , 4-pentandionato) ]C1, [Ru??(2, 2 ' -bipiridina ) 2 ( 2 , 4-pentandionato) ]C1, [Ru11 (2, 2' -bipiridina) 2 (C204],
K[Ru??? (C204) 2 (piridina-3-COOH2][Ru111 (1, 4, 7- trimetil- 1, 4, 7- triazaciclononano) (2, 4- pentandionato
(piridina)] (N03)2. Se comprenderá en cada uno de los complejos de Fórmula I o de fórmula II que el metal puede ser seleccionado para ser rutenio u osmio según se requiera. Además, los metales en los complejos específicos descritos anteriormente pueden ser cambiados para formar el complejo de rutenio o de osmio correspondientes. Un experto en el arte apreciará que sustituir el rutenio con el osmio en un complejo cambiará el potencial de trabajo del complejo en alrededor de -400 mV a -600 mV y que el potencial de trabajo puede ser adicionalmente de ajuste fino en la dirección contraria si es necesario, al
alterar los ligandos alrededor del centro del metal, hasta los mediadores alcanzan un potencial de trabajo de -300 mV a - 300 mV Vs . Ag/AgCl. Por ejemplo: [Ru111 (acac) 2 (py-3-COOH) (py-3-C00) ] tiene un potencial
Ei 2 de -175 mV. [RuIIX(3- Braca ) 2 (py-3- COOH) (py-3-COO) ] es similar a [Ru111 (acac) 2 (py- 3- COOH) (py- 3- COO)], pero tiene bromuro de acac en lugar de acac y tuvo un potencial de Ei/2 de -142 mV. [Ru111 (acac) 2 (py- 4- COOH) (py- 4- COO)] es similar a
[Ru111 (acac) 2 (py- 3- COOH) (py- 3- COO)], pero tiene el COOH en un lugar diferente (py- 4- COOH en vez de py- 3- COOH) y tiene un potencial de Ei 2 de -165 mV. Un experto en el arte puede comprender que el potencial de trabajo es de aproximadamente 150 mV sobre la Ei/2. Los complejos correspondientes a los complejos de Ru descritos en la presente son: [Os111 (NH3) 5 (piridina-3-COOH) ] (PF6) 2 (CF3SO3) , [Os111 (2, 4-pentandionato) 2 (piridina-3-COOH) (piridina-3-COO) ], [Os111 (3- bromo- 2, 4- pentandionato ) 2~ (piridina- 3-COOH) (piridina-3-COO) ], [OsIXI(2, 4- pentandionato ) 2 (2,2'-bipiridina-5, 5' - (COOH) (COO) ], [OsXI1(2, 4- pentandionato)? (2,2' -bipiridina-4 , 4 ' - ( COOH ) ( COO ) ] , [OsIIJ(2, 4-pentandionato) 2 (2, 2' -bipiridina) ]C1, [OsIIX(2, 4-
pentandionato) 2 (piridin-4-COOH) (piridina-4-C00) ], [Os111 (5-cloro- 8- hidroxiquinolina ) 2 (piridina-3-C00H ) (Piridina-3-C00)], [Os11^!, 1, 4, 7, 10, 10- hexametiletil triet ilentetramina ) (2, 4- pentandionato) (PF6) (CF3SO3)], [Os i(l, 1, 4, 7, 10, 10- hexamet iltriet ilentetramina ) ( 2 , 4- pentandionato) ]C12, [Os11^, 2 ' -bipiridina ) 2 ( 2 , 4-pentandionato) ]C1, [Os11 (2,2' -bipiridina) 2 (C204],
K[OsIIJ (C204) 2 (piridina-3-COOH) 2], [Os^d, 4, 7- trimetil-1, 4, 7- triazaciclononano) (2, 4- pentandionato (piridina) ] (N03) 2-
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Cuando se usa en la presente, las siguientes definiciones definen los términos establecidos: El término "alquilo" incluye hidrocarburos lineales o ramificados, alifáticos saturados. Ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, ter- butilo, ciclopentilo y los similares. A menos que se indique de otra manera, el término "alquilo" incluye tanto grupos alquilo como cicloalquilo . El término "alcoxi" describe un grupo alquilo unido al remanente de la estructura por medio de un átomo de oxigeno. Ejemplos de grupos alquilo incluyen metoxi, etoxi, n- propoxi, isopropoxi, butoxi, ter-butoxi,
ciclopentoxi , y los similares. Además, a menos que se indique de otra manera, el término "alcoxi" incluye tanto grupos alcoxi como cicloalcoxi. El término "alquenilo" describe un hidrocarburo alifático ramificado o lineal insaturado que tenga al menos un doble enlace carbono-carbono. Ejemplos de grupos alquenilo incluyen etenilo, 1- propenilo, 2- propenilo, 1- butenilo, 2- metil- 1- propenilo, ciclopentenilo y los similares. Además, a menos que se indique de otra manera, el término "alquenilo" incluye tanto grupos alquenilo como cicloalquenilo . Un "grupo reactivo" es un grupo funcional de una molécula que es capaz de reaccionar con otro compuesto para acoplar al menos una porción del otro compuesto a la molécula. Los grupos reactivos incluyen carboxi, éster activado, haluro de sulfonilo, éster sulfonato, isocianato, isotiocianato, epóxido, aziridina, haluro, aldehido, cetona, amino, acrilamida, tiol, acilo, azida, haluro de acilo, hidrazina, hidroxilamina , haluro de alquilo, imidazol, piridina, fenol, alquilo, sulfonato, halotriazina, imido éster maleimida, hidrazida, hidroxi, y grupos aril azido foto-reactivos. Esteres activados, como se entiende en el arte, generalmente incluyen ésteres de succinimidilo, benzotriazolilo, o arilo
sustituido por grupos ávidos de electrones tales como grupos sulfo, nitro, ciano, o halo. El término "acac" se refiere al anión acetonato de acetilo el cual es la base conjugada de 2, 4- pentadiona. Un grupo funcional "sustituido" (por ejemplo, grupos alquilo, alquenilo o alcoxi sustituidos) incluyen al menos un sustituyente seleccionado de los siguientes: halógeno, alcoxi, mercapto, arilo, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, -OH, -NH2, alquilamino, dialquilamino, trialqui lamonio, alcanoilamino, dialcanoilamino , arilcarboxamido, hidrazino, alquiltio, alquenilo y grupos reactivos. Un fluido biológico" es cualquier fluido corporal o derivado de fluido corporal en el cual el analito puede ser medido, por ejemplo, sangre, fluido intersticial, plasma, fluido dérmico, sudor y lágrimas. Un "sensor electroquímico" es un dispositivo configurado para detectar la presencia de o medir la concentración o cantidad de un analito en una muestra vía reacciones de oxidación o de reducción electroquímica. Estas reacciones pueden ser transducidas típicamente a una señal eléctrica que pueda ser correlacionada a una cantidad o concentración de analito. Un "mediador redox" es un agente de transferencia de electrones para portar electrones entre un analito o una
enzima oxidada a analito o reducida a analito y un electrodo, ya sea directamente o via uno o más agentes de transferencia de electrones adicionales. La "Electrólisis" es la electro-oxidación o electro-reducción de un compuesto ya sea directamente en un electrodo via uno o más agentes de transferencia de electrones (por ejemplo, mediadores redox o enzimas. El término "electrodo de referencia" incluye ambos a) un electrodo de referencia y b)un electrodo de referencia que puede también funcionar como contra electrodo (es decir, electrodos contrario/ de referencia) a menos que se indique de otra manera. El término "electrodo contrario" incluye ambos a) un electrodo contrario y b) un electrodo contrario que pueda funcionar también como un electrodo de referencia (es decir, electrodo de referencia contrario) , a menos que se indique de otra manera. El término "señal medible" quiere decir una señal que pueda ser fácilmente medida tal como potencial del electrodo, fluorescencia, absorción espectroscópica , luminiscencia, dispersión luminosa, NMR, IR, espectroscopia de masa, cambio térmico, o cambio piezo-eléctrico . El término "analito biológico" incluye cualquier sustancia bioquímica o química medible que pueda estar
presente en un fluido biológico y también incluye cualquiera de una enzima, un anticuerpo, una secuencia de ADN, o un microorganismo. "Monodentado, bidentado y tridentado", de conformidad con la presente invención, tiene su significado generalmente aceptado en el arte. Esto es, un ligando monodentado se define como un grupo o porción química que tiene un átomo de coordinación potencial. Más de un átomo de coordinación potencial se define como un ligando multidentado donde el número de átomos de coordinación potenciales es indicado por los términos bidentado, tridentado, etc. Los biosensores conocidos que pueden ser usados de conformidad con la presente invención pueden consistir de, por ejemplo, una banda con cuatro pocilios de reactivos y una pseudo referencia común; con cada pocilio que tenga su propio electrodo de trabajo de micro-banda tubular. El componente sensor de la banda s e proporciona por reactivos, especialmente formulados, secado diferente que comprenden al menos una enzima y un mediador que interactuará con analitos específicos en la muestra de prueba en cada pocilio. Puesto que, reactivos diferentes pueden ser añadidos y secados en cada pocilio , es claro que es posible completar las pruebas multi-analitos usando una muestra de prueba única. El número de pocilios
es variable, por consiguiente el número de pruebas únicas es variable, por ejemplo pueden usarse sensores que usan entre 1 y 6 pocilios. Pueden usarse microelectrodos convencionales, típicamente con un microelectrodo de trabajo y un electrodo de referencia. El electrodo de trabajo usualmente es elaborado de paladio, platino, oro o carbono. El electrodo contrario es típicamente carbono, Ag/AgCl, Ag/Ag2S04, paladio, oro, platino, Cu/CuS04, Hg/HgO, Hg/HgCl2, Hg/HgS04 o Zn/ZnS04. En un microelectrodo preferido el electrodo de trabajo está en una pared de un receptáculo que forma dicho microelectrodo. Ejemplos de microelectrodos que pueden ser usados de conformidad con la presente invención son aquellos descritos en la WO 03/097860.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Se describirán ahora a manera de ejemplo modalidades de la presente invención solamente y con referencia a las figuras anexas, en las cuales: La Figura 1, muestra la voltametrías de una solución de 10 m del mediador [Ru"(py-3- COOH) (NH3 ) 5 ( PF6) 2] en KC1 0.1 M en regulador registrado usando los electrodos de pocilio estándares como se describieron en WO 2003/56319 con una velocidad de exploración de 100 mVs"1;
La Figura 2, muestra pruebas de oxidación repetitivas (a +0.25 v Vs . Ag/AgCl) del nuevo mediador de 10 mM [RuII(py-l- COOH) (NH3) 5] ( PF6) 2 en KC1 0.1 M registrado en medios oxigenados (azul) y desoxigenados (rojo) ; La Figura 3, muestra la voltametria cíclica del nuevo mediador [Ru11 (py-3-COOH) (NH3) 5] ( PF6) 2 en regulador Tris 0.1 M a pH de 9 (gue contenía KC1 0.1 M) (a), y en una solución de KC1 0.1 M (elaborada con agua) (b) ; La Figura 4A muestra pruebas de oxidación repetitivas (a + 0.25 V Vs . Ag/AgCl) del nuevo mediador [Ruir(py- 3- COOH) (NH3) 5] (PF6) 2 en KC1 0.1 M registrado en medios oxigenados. La Figura 4B muestra los datos de calibración del Ru2+ para la concentración del mediador con corriente; La Figura 5 muestra voltamogramas cíclicos de [(RuIJ(py- 3- COOH) (NH3) 5] (PF6) 2 en la ausencia (negro -(a) ) y presencia (gris -(b) ) de glucosa oxidasa; La Figura 6, muestra el voltamograma cíclico de [Ru111 (NH3) 5 (py- 3- COOH) ] ( PF6) 2 (CF3SO3) ; la mezcla de colesterol total como se describe en WO 2003/56319; La Figura 7A, muestra la oxidación de la mezcla de colesterol total con el nuevo mediador [Ru111 (NH3) 5 (py- 3-
COOH) ] ( PF6) 2 (CF3SO3) , con plasma como solución de prueba al tiempo de 118 segundos; La Figura 7B, muestra la corriente de reducción de la mezcla de colesterol total con el mediador [RUI:II(NH3)5 (py- 3- COOH- piridina) ] (PF6) 2 ( C F3 SO3 ) , con plasma como solución de prueba al tiempo de 118 segundos; La Figura 7C muestra un experimento en tiempo puntual con el mediador [Ru111^^^ (3- COOH-piridina) ] ( PF6) 2 (CF3SO3) , que muestra el cambio en la corriente de oxidación promedio con el tiempo con diferentes concentraciones de colesterol; La Figura 8A, muestra un experimento en tiempo puntual de la corriente de oxidación con el mediador [RuIII(NH3)5 (3- COOH-piridina ) ] ( PF6) 2 ( C F3 SO3 ) al tiempo de 118 segundos; La Figura 8B muestra un experimento en tiempo puntual de la corriente de oxidación con el mediador
[RuIII(NH3)5 (3- COOH- piridina )]( PF6 ) 2 ( C F3 SO3 ) , al tiempo de 202 segundos; La Figura 8C muestra un experimento en tiempo puntual de la corriente de reducción con el mediador [RuIJI(NH3)5 (3- COOH- piridina )]( PF6 ) 2 ( C F3 SO3 ) , al tiempo de 202 segundos;
La Figura 8D muestra un experimento en tiempo puntual con el mediador de Ru [Ru(NH3)5 (py~ 3-COOH) ] (PF6) 2 (CF3SO3) , que muestra el cambio en la corriente de oxidación promedio durante el tiempo con diferentes concentraciones de colesterol; La Figura 9, muestra un voltamograma cíclico para una banda de micro-electrodo de carbono impresa en pantalla en una solución que consiste de 10 m de [Ru111 (acac) 2 (py- 3- COOH) (py- 3- COO)], KC1 0.1 , 16 mM de CHAPS y regulador Tris =.1 M (pH de 9) registrado con una velocidad de exploración de 100 mV.s"1; La Figura 10, muestra una gráfica de corriente de oxidación versus la concentración de colesterol total (TC) para diferentes muestras de plasma humano en pocilios usando [Ru111 (acac) 2 (py- 3- COOH) (py- 3- COO)] como el mediador, Las corrientes fueron registradas después de un potencial de oxidación de + 0.15 V (vs Ag/AgCl de referencia) fue aplicado al electrodo de trabaj o, La Figura 11, muestra un voltamograma cíclico para una banda de microelectrodo de carbono impresa en pantalla en una solución que consiste de 10 mM de [Ru111 (3-Bracac) 2 (py- 3- COOH) (py- 3- COO)], KC1 0.1 M, 16 mM de CHAPS y regulador Tris 0.1 M (pH de 9) registrada con una velocidad de exploración de 100 mV.s"1;
La Figura 12 muestra el espectro de absorción UV-visible de una solución que consiste de 0.5 mM de [Ru?II(3- Bracac)2 (py- 3- COOH) (py. 3- COO] en la ausencia de (negro -(a) ) y presencia (gris -(b) ) de 0.75 mM de NADH y 0.03 mg/ml de PdR; La Figura 13, muestra una gráfica de corriente de oxidación versus la concentración de colesterol total (TC) para diferentes muestras de suero liofilizadas en pocilios, usando [Ru111 ( 3-Bracac) 2 (py- 3- COOH ) py-3-COO) ] como el mediador. Las corrientes fueron registradas después de que se aplicó un potencial de oxidación de + 0.15 V (vs Ag/AgCl de referencia) al electrodo de traba j o ; La Figura 14, muestra un voltamograma cíclico para una banda de micro-electrodo de carbono impresa en pantalla en una solución que consistió de 1 mM de [Ru111 (acac) 2 (2, 2'- bpy- 5, 5'- (COOH ) ( COO )] , KC1 0.1 M, 16 mM de CHAPS y regulador Tris 0.1 M (pH de 9) registrada con una velocidad de exploración de 100 mV. s"
La Figura 15, muestra una gráfica de calibración de corriente de oxidación versus la concent ación de colesterol total (TC) para diferentes muestras de suero liofilizadas en pocilios usando [Ru111 (acac) 2 (2, 2'- bpy-5, 5'- (COOH) (COO) ], como el mediador. Las corrientes
fueron registradas después de que se aplicó un potencial de oxidación de + 0.15 V (vs Ag/AgCl de referencia) al electrodo de trabajo; Figura 16, muestra un voltamograma cíclico para una banda de micro-electrodo de carbono impresa en pantalla en una solución que consistió de 10 mM de [Ru111 ( acac ) 2
(2, 2'- bpy)]Cl, KC1 0.1 M, 16 mM de CHAPS y regulador Tris 0.1 M (pH de 9.0) registrado con una velocidad de exploración de 100 mV.s"1; La Figura 17, muestra el espectro de absorción UV-visible de una solución de 1 mM de [Ru111 ( acac ) 2 (2, 2'-bpy]Cl, y 1 mM de NADH en la ausencia (oscuro - (a) ) y presencia (luminoso - (b) ) de 0.17 mg/ml de PdR; La Figura 18, muestra una gráfica de corriente de oxidación versus la concentración de colesterol total (TC) para diferentes muestras de suero liofilizado en pocilios usando [Ru111 ( acac ) 2 (2, 2'- bpy)]Cl como el mediador. Se registraron las corrientes que fueron después de que se aplicó un potencial de oxidación de + 0.15 V(vs Ag/AgCl de referencia) ; La Figura 19, muestra un voltamograma cíclico para una banda de micro-electrodo de carbono impresa en pantalla en una solución que consistió de 10 mM de [Ru111 (acac) 2 (py- 4- (COOH) (py- 4- COO)], KC1 0.1 M, 16 mM
de CHAPS y regulador Tris 0.1 M (pH de 9.0) registradas con una velocidad de exploración de 100 mV. s"1. La Figura 20, muestra una gráfica de corriente de oxidación versus la concentración de colesterol total (TC) para diferentes muestras de plasma humano en pocilios usando [RuIH(acac)2 (py- 4- (COOH) (py- 4- COO)], como el mediador. Se registraron las corrientes después de que se aplicó un potencial de oxidación de + 0.15 V (vs Ag/AgCl de referencia) ; La Figura 21, muestra un voltamograma cíclico para una banda de micro-electrodo de carbono impreso en pantalla en una solución que consiste de 10 mM de [Ru111 (5-Cl-Quin) 2 (py-3-COOH) (py-3-COO) ], KC1 0.1 M, 16 mM de CHAPS y regulador Tris 0.1 M (pH de 9.0) registrado con una velocidad de exploración de 100 mV.s-1; La Figura 22 muestra un voltamograma cíclico (a 10 mV.s"1) de [Ru111 ( 5-Cl-Quin ) 2 (py-3-COOH) (py-3-COO) ] 1 mM en regulador Tris 0.1 M (pH de 9.0) sobre una banda de micro-electrodo de carbono impreso en pantalla, que contenía (a) 0, (b)0.1, (c)0.5, (d) 1 y (e)5 mg.ml"1 PdR en la presencia de 10 mM de NADH; La Figura 23 muestra el espectro de absorción UV-visible de una solución que contenía 0.25 mM de [Ru:iI(5-Cl-Quin) 2 (py-3-COOH) (py-3-COO) ] y 0.25 mM de NADH en la
ausencia (oscuro - (a) ) y presencia (claro - (b) ) de 0.033 mg.mr1 PdR; La Figura 24 muestra un voltamograma para una banda de micro-electrodo de carbono impreso en pantalla en una solución gue consistía de 5 mM de [Ru111 (Me6-tet) (acac) ] (PF6) (CF3SO3) , KC1 0.1 M, 16 mM de CHAPS y regulador Tris 0.1 M (pH de 9.0) registrado con una velocidad de exploración de 100 mV.s-1; La Figura 25, muestra un espectro de absorción UV-visible de una solución gue consistió de 5 mM de [Ru111 (Me6-tet) (acac) ] (PF6) (CF3SO3) y 0.5 mM de NADH en la ausencia (oscuro - (a)) y presencia (gris - (b) ) de 0.033 mg.ml"1 de PdR. La Figura 26 muestra una gráfica de corriente de oxidación versus la concentración de colesterol total para diferentes muestras de plasma humano en pocilios usando [Ru111 (Me6-tet ) (acac) ] ( PF6) (CF3SO3) como el mediador. Las corrientes fueron registradas después de la aplicación de un potencial de oxidación de +0.15 V (vs Ag/AgCl de referencia) ; La Figura 27, muestra un voltamograma cíclico para una banda de micro-electrodo de carbono impresa en pantalla en una solución que consistió de 10 mM de [Os11 (2, 2' -bpy) 2 (acac) ]C1, KC1 0.1 M, 16 mM de CHAPS y
regulador Tris 0.1 M (pH de 9.0) registrada con una velocidad de exploración de 100 mV.s-1; La Figura 28, muestra un voltamograma cíclico (a 10 mV.s"1) de [Os11 (2, 2' -bpy) 2 (acac) ]C1 (1 mM) en Tris 0.1 M (pH de 9.0) sobre una banda de micro-electrodo de carbono impresa en pantalla que contenía (a) 0, (b) 0.1, (c)0.5, (d) 1 y (e) 5 mg.ml"1 de PdR en la presencia de 10 mM de NADH ; La Figura 29 muestra voltamogramas cíclicos para una banda de micro-electrodo de carbono impreso en pantalla en una solución que contenga 1 mM de [Rui:[(2,2'-bpy) 2 (acac) ]C1, KC1 0.1 M, 16 mM de CHAPS y regulador Tris 0.1 M (pH de 9.0) registrado con una velocidad de exploración de 10 mV.s-1; La Figura 30, muestran voltamogramas cíclicos (a 10 mV.s"1) de [Ru11 ( 2 , 2 ' -bpy ) 2 ( acac) ]C1 (1 mM) en un Tris 0.1 M (pH de 7.0) sobre una banda de micro-electrodo de carbono impreso en pantalla, que contenía (a) 0, (b) 0.5, (c) 1.25 y (d) 2.5 mg.ml"1 de glucosa oxidasa en la presencia de glucosa 0.1 M; La Figura 31 muestra, voltamogramas cíclicos (a 10 mV.s"1) de [Ru11 (2, 2' -bpy) 2 (C204) ] (1 mM) en un Tris 0.1 M (pH de 7.0) sobre una banda de micro-electrodo de carbono impreso en pantalla, que contenía (a) 0, (b) 0.25, (c)
1.25, (d) 5 mg.ml"1 de glucosa oxidasa en la presencia de glucosa 0.1 M; La Figura 32 muestra voltamogramas cíclicos (a 100 mV.s-1) de K[RuIXI (C204) 2 (py- 3- COOH)2] (5 mM) en Tris 0.1 M (pH de 7.0) sobre una banda de micro-electrodo de carbono impreso en pantalla, que contenía (a) 0 y (b) 5 mg.ml"1 de glucosa oxidasa en la presencia de glucosa 0.1 M; La Figura 33 muestra un espectro de masa ESI (modalidad +ve) de [Ru11 (Me3TACN) (acac) (py) ]PF6 en CH3CN; La Figura 34 muestra un espectro de masa ESI (modalidad +ve) de [Ru111 (Me3TACN) (acac) (py ) ] (N03) 2 en metanol ; La Figura 35 muestra un voltamograma para una banda de micro-electrodo de carbono impreso en pantalla en una solución que contenía 10 mM de
[Ru111 (Me3TACN) (acac) (py) ] (N03) 2, C1 0.1 M y regulador Tris 0.1 M (pH de 9.0) registrado con una velocidad de exploración de 100 mV.s-1; La Figura 36, muestra el espectro de absorción UV-visible de una solución que contenía 2 mM de
[Ru111 (Me3TACN) (acac) (py) ] (N03) 2 y 5 mM de NADH en la ausencia (oscuro- (a)) y presencia (claro (b) ) de 0.033 mg.ml"1 de PdR;
La Figura 37, muestra una gráfica de corriente de oxidación versus concentración de NADH para una solución de 10 mM de [Ru111 (Me3_TACN) (acac) (py) ] (N03) 2 que contenia 1 mg.ml"1 de PdR; La Figura 38, muestra un voltamograma cíclico para una banda de micro-electrodo de carbono impreso en pantalla en una solución que contenía 3.3 mM de [Ru111 (acac) 2 (2, 2' -bpy-4, 4'- (COOH) (COO], KC1 0.1 M, y regulador Tris 0.1 M (pH de 9) registrado con una velocidad de exploración de 100 mV.s_1;La Figura 39, muestra voltamogramas (a 100 mV.s"1) de [Ru111 (acac) 2 (2, 2' -bpy- 4,4'- (COOH) (COO) ) ] (3.3 mM) en una solución que contenía KC1 0.1 M, y regulador Tris 0.1 M (pH de 9.0) sobre una banda de micro-electrodo de carbono impreso en pantalla, que contenía (a) 0, y (b) 10 mg.ml-1 de PdR en la presencia de 50 mM de NADH. La Figura 40 muestra las formas reducidas (izquierda) y oxidada (derecha de 10 mM de soluciones de los mediadores de la presente invención en KC1 0.1 M; y La Figura 41, muestra ejemplos de complejos de rutenio de conformidad con la presente invención. Todas las soluciones fueron preparadas usando ya sea agua reactiva de Milli-Q desde un sistema de purificación de agua Millipores Synergy 185 o solventes grado reactivo. Todos los sólidos fueron usados como se
recibieron, sin purificación adicional. Los mediadores fueron probados para mediación usando la mediación enzimática o bien usando una cascada enzimática. El electrodo y las formulaciones para la cascada enzimática se describen en nuestra solicitud de WO2003/56319. Se sintetizaron los mediadores siguientes: [Ru111 (NH3)5(py- 3- COOH)] ( PF6 ) 2 ( CF3S03 ) ;
[Ru111 (acac) 2 (py- 3- COOH) (py-3-COO) ]; [RuIXI(3- Bracac)2(py-3-C00H (py-3-C00) ]; [Ru111 ( acac ) 2 ( 2 , 2 ' - bpy- 5 5' -(COOH) (COO)]; [Ru111 (acac) 2 (2, 2' -bpy) ]C1; [Ru111 (acac) 2 (py- 4-COOH) (py- 4- COO)]; [RuI3:i(5- Cl- Quin)2(py- 3- COOH) (py-3- COO)]; [Ru111 (Me6-tet) (acac) ] (PF6) (CF3SO3) ; [Ru111 (Me6-tet) (acac)Cl2]; [OsII(2,2'- bpy) 2 (acac) ]C1; [RuIX(2,2'-bpy)2(acac)] Cl; [Ru11 ( 2 , 2 ' -bpy ) 2 (C204 ) ] ; K (Ru111 (C204) (py-3-COOH)2; y [Ru111 (Me3- TACN) (acac) (py)] (N03)2, Donde py = piridina; 3- Bracac = 3- bromo- 2, 4-pentandionato ; acac = 2, 4- pentandionato; 2, 2' -bpy = 2, 2' -bpy; 2, 2' -bpy = 2, 2- bipiridina; 2, 2'- bpy- 5, 5'-(COOH)2 = 2 , 2 ' -bipiridina- 5, 5'- dicarboxilico ; Me6-tet = 1, 1, 4, 7, 10, 10- hexametiltrietilen, Me3-TACN = 1, 4, 7- trimetil- 1, 4, 7- triazaciclononano, y 5- Cl- Quin = 5- cloro Quin, y 5- Cl- Quin = 5 cloro- 8-hidroxiquinolina.
Para cada uno de los complejos específicamente el complejo de rutenio o de osmio correspondiente puede ser preparado después de que el mismo procedimiento sintético y cambiar simplemente, el compuesto inicial al compuesto de rutenio y de osmio correspondiente. Síntesis de [Ru11 (NH3) 5 (py- 3- C02H)](PF6)2 y [Ru^íNHs py- 3- C02H) (PF6)2 y Ru111 (NH3) 5 (py- 3- C02H] (PF6)2 (CF3SO3)
Materiales RuCl3.3H20 (Heraeus) Monohidrato de hidrazina (80 %, RDH) Acido nicotínico (Aldrich) Sulfonato de plata-p-tolueno (Aldrich) Triflurometansulfonato de plata (Aldrich) Hexafluorofosfato de amonio (Aldrich) Se preparó cloruro de cloropentaaminarutenio ( 111 ) , [Ru (NH3) 5C1]C12, de conformidad con un método de la literatura (A. D. Alien, Inorg. Synth. 1970, 12, 2) desde
tricloruro de rutenio y se purificó por recristalización a partir de HC1 0.1 M a 40 °C . [Ru11 (NH3) 5 (py-3-C02H) ]PF6) 2 A una suspensión de [Ru (NH3) 5C1]C12 1.0 g, 3.4 mmoles) en 40 mi de agua se añadieron dos equivalentes de p-toluen sulfonato de plata (1.9 g, 6.8 mmoles) . Después de agitar la mezcla por 1 hora a temperatura ambiente, la solución fue filtrada para remover el AgCl . A la solución amarillo claro resultante, la cual ha sido desgasificada con argón, se añadió, exceso de cuatro veces de ácido nicotinico (py-3-C02H, 1.67 g, 13.6 mmoles) y 12 - 15 piezas de amalgama de granalla de zinc (aprox. 10 g) . Después de agitar la mezcla por 2 horas a temperatura ambiente bajo argón, la solución fue filtrada. A la solución naranja rojizo resultante, se añadió exceso de hexafluorofosfato de amonio (NH4PF6, 3 g) , y la mezcla se dejó a 4 °C toda la noche. Después de filtración y recristalización de este producto crudo a partir de éter diet ilico-acetona . Se obtuvieron 0.6 g de [Ru11 (NH3) 5 (py-3-C02H) ] (PF6) 2. (Rendimiento de 29.5 %) . [RuIII (NH3) 5 (py-3-C02H) ] (PF6) 2 (CF3S03) A una solución de [Ru11 (NH3) 5 (py-3-C02H] ( PF6) 2 (160 mg, 0.27 mmoles en 30 mi de acetona, 1.3 equivalentes de trifluorometansulfonato de plata (AgCF3S03, 89 mg) se
añadieron y la mezcla fue agitada en la oscuridad por 1 hora a temperatura ambiente. Se retiró la plata por centrifugación para dar una solución amarillo claro, Se añadió gota a gota la solución amarillo claro resultante con agitación a 250 mi de éter y la mezcla se dejó a 4 °C por 3 horas para obtener un precipitado amarillo claro. El producto fue lavado con éter dietilico y se recristalizó a partir de acetona y éter dietilico (Rendimiento: 90 mg, 44 %) . Síntesis de cis-fRu11 (acac) 2 (py-3-COOH) 2]
Una mezcla de Ru (acac) 3 (200 mg, 0.5 mmoles) y ácido nicotinico (494 mg, 4 mmoles) en etanol fue reflujada bajo argón con varias piezas de amalgama de granalla de zinc por 5 horas. La mezcla marrón rojizo resultante fue enfriada y el Zn/Hg se retiró por filtración. El precipitado marrón rojizo fue colectado por filtración y lavado con HC1 0.1 , agua y éter dietilico. (Rendimiento
de producto crudo: 250 mg, 91 % que contenia desechos de Zn/Hg) . Síntesis de cis-Ru111 (acac) 2 (py-3-COOH) (py-3-COO) ] Se disolvió cis-[Ru" (acac) 2 (py-3-COOH) 2] (200 mg) en NH3 0.1 M y luego se filtró. El filtrado marrón rojizo fue agitado en aire toda la noche (aproximadamente 18 horas) para dar una solución púrpura oscuro. La solución fue filtrada y evaporada a sequedad. El residuo púrpura oscuro fue colectado y lavado con acetona y éter dietilico, y luego se secó al aire (Producto: 150 mg) . Síntesis de cis-fRu111 (3-Bracac) 2 (py-3-COO) (py-3-COOH) ]
Se disolvió cis-fRu111 (acac) 2 (py-3-COO) (py-3-COOH) ] (93 mg, 0.17 mmoles) en 2 mi de H20, se añadieron entonces 4.3 mi de agua bromada 0.41 M (0.17 mmoles de Br2) . La suspensión azul púrpura resultante fue agitada en aire toda la noche. El precipitado azul se colectó y
lavó con agua. Rendimiento = 25 % ; E° = 0.15 V vs NHE a pH de 8 (regulador de fosfato) . Síntesis de [Ru111 (acac) 2- (5 , 5' (COO) (COOH) 2 , 2 ' -bpy) ]
Se reflujo bajo argón una mezcla roja de Ru (acac) 3 (200 mg, 0.5 mmoles) y 5,5'- (COOH) 2-2 , 2 ' -bpy (122 mg, 0.5 mmoles en 30 mi de etanol con varias piezas de granalla de amalgama de zinc/ Hg toda la noche. La mezcla marrón resultante fue enfriada y la amalgama de zinc fue retirada con tenacillas. El precipitado marrón fue colectado y lavado con etanol y éter dietilico. El sólido marrón se disolvió entonces en 50 mi de NH3 0.1 M y se filtró. El filtrado verde se agitó en aire toda la noche para dar una solución roja. La solución fue filtrada y luego evaporada a sequedad. El precipitado púrpura rojizo se colectó y lavó con acetona y éter dietilico y luego se secó al aire. Rendimiento : 22 % ; E° = 0.18 V vs. NHE a pH = 8 (regulador de fosfato) .
[Ru111 (acac) 2 (2 , 2 ' -bpy) ] (PF6)
Se disolvió [Ru11 ( acac ) 2 ( 2 , 2 ' -bpy ) ] (75 mg, 0.165 mmoles) en diclorometano (15 ml) . Se añadió en pequeñas porciones una solución de hexafluorofosfato de ferrocenio (54.6 mg, 0.165 mmoles) en diclorometano (10 ml) a la solución de [Ru11 (acac) 2 (2, 2 ' -bpy) ] con agitación vigorosa a temperatura ambiente. El color de la solución de verde oscuro se tornó rojizo después de unos cuantos minutos. Después de agitar por diez minutos más, la solución se filtró y se añadió éter dietilico y se colectó el precipitado por centrifugación y se lavó con éter dietilico. (Rendimiento = 50 %) . Síntesis de [Ru111 (acac) 2 (2 , 2 ' -bpy) ]C1 Se añadió gota a gota una solución de [Bu4N]Cl (463 mg, 1.667 mmoles) en acetona (15 ml) a una solución de [Ru111 (acac) 2 (2, 2' -bpy) ] (PF5) (200 mg, 0.333 mmoles) en 20 ml de acetona con agitación a temperatura ambiente. El
precipitado púrpura se colectó por filtración, se lavó con acetona y éter dietilico y luego se secó al aire. El precipitado fue re-disuelto en acetonitrilo y se purificó por cristalización vía difusión de vapor con éter dietilico. (Rendimiento = 50 %) . Síntesis de [Ru11 (acac) 2 (py-4-COOH) 2]
Una mezcla roja de Ru(acac)3 (200 mg, 0.5 mmoles) y py- 4- COOH (124 mg, 1 mmol) en 40 mi de etanol fue reflujado bajo argón con varias piezas de granalla de amalgama de zinc/ Hg por 4 horas. La mezcla púrpura oscuro resultante fue enfriada y la amalgama de zinc fue retirada con tenacillas. El precipitado marrón oscuro fue colectado por filtración y fue lavado con HC1 0.1 M, agua y éter dietilico. (Rendimiento del producto crudo = 250 mg, 91 %, contiene amalgama de zinc) . Síntesis de [Ru111 (acac) 2 (py-4-COOH) (py-4-COO)] Se disolvió Ru11 (acac)2(py- 4- COOH)2 (250 mg) en NH3 0.1 M y luego se filtró. El filtrado marrón rojizo
fue agitado en aire toda la noche para dar una solución púrpura. La solución fue filtrada y luego evaporada a sequedad. El precipitado púrpura fue colectado, lavado con acetona y éter dietilico y luego fue secado al aire. Rendimiento = 50 % ; E° = 0.12 V vs NHE a pH = 8 (regulador de fosfato). Síntesis de [RuII]:(5- Cl- Quin) 2 (py-3-COOH) (py-3-COO)]
Fórmula Química: C3oH18Cl2 2N406Ru2" Masa Exacta: 779.89 Una solución de ácido nicotínico (92.3 mg, 0.75 mmoles) y Ru(5- Cl. Quin)3 (200 mg, 0.37 mmoles) en etanol (25 mi) se reflujo bajo argón con varias piezas de amalgama de zinc por 24 horas. El sólido marrón claro resultante fue aislado por filtración, lavado con etanol y secado al aire. El sólido marrón fue suspendido en agua (15 mi) y se añadió KOH (0.2 g, 3.57 mmoles) . Después de agitar por 0.5 horas, la solución marrón oscuro
resultante se filtró y rota-evaporó a sequedad. El residuo fue lavado con etanol y se recristalizó por disolución en metanol /etanol 1:1 y luego se evaporó lentamente la solución hasta alrededor de aproximadamente 50 % de su volumen original. El sólido fue secado al vacio a 60 °C . Rendimiento: 57 % (150 mg, 0.21 mmoles) . MS: m/z 634 (M+l), E° = 0.097 V vs . NHE a pH = 8 (regulador de fosfato) . Síntesis de [Ru11 (Ter-Me6) (acac)](PF6) [Ru (Me6-2, 2, 2-tet) (acac) ]2+
Fórmula Química:
Peso Molecular: 724.60 Análisis elemental: C, 29.84; H, 5.15; F, 23.60; N , 7.73; O, 11.04; P, 4.27; Ru, 13.95; S, 4.43 Una mezcla amarilla de cis[RuIIJ (Tet-Me6) Cl2] ( PF6) (100 mg, 0.18 mg) y Li (acac) (40 mg, 0.36 mmoles) en 10 mi de etanol se reflujo toda la noche. La solución marrón resultante se enfrió y luego se filtró. El filtrado se concentró hasta aproximadamente 1 mi, se añadió éter
etílico y se filtró el precipitado marrón, se lavó con éter dietílico y luego se secó al aire. Rendimiento = 85 %. Calculado para RuCi7H37N402PF6; C, 35.48; H, 6.48; N, 9.73 %; encontrado C, 35.39; H, 6.37 %; N, 9.60 % Síntesis de [Ru111 (Tet-Me6) (acac) ] (PF6) (CF3SO3) Se añadió AgCF3S03 (67 mg, 0.26 moles) a una solución de [Ru11 (Tet- e6) ( acac] ( PF6) (125 mg, 0.22 moles) en 10 mi de acetona. La solución marrón se tornó azul inmediatamente y la mezcla se agitó en la oscuridad por 30 minutos. El metal plata en la solución se retiró por centrifugación y la solución azul se añadió entonces lentamente hasta aproximadamente 80 mi de éter dietílico. El precipitado azul se colectó por filtración con éter dietílico y luego se secó al vació toda la noche. Rendimiento = 70 % ; E° = 0.18 V Vs NHE a pH = 8 (regulador de fosfato) . Síntesis de [Ru111 (Tet-Me6) (acac) ]C12 La adición de [n-Bu4N]Cl a una solución de [Ru (Me6~ tet ) (acac) ] (PF6) (CF3SO3) en MeOH dio como resultado un precipitado de [Ru (Me6-tet ) (acac)]Cl2, el cual se filtró y secó al vacío toda la noche.
Se añadió acetil acetona (1 mi) a [Os (bipy)2Cl2] (0.25 g, 0.44 mmoles) en agua (20 mi) y alcohol (10 mi), y la mezcla se reflujo por 6 horas en la presencia de exceso de CaC03 (0.5 g) . Los materiales volátiles se separaron por evaporación y el residuo se extrajo con cloroformo (30 mi) . El extracto de cloroformo intensamente marrón-rojizo fue filtrado y secado con Na2S04 anhidro, se evaporó hasta un volumen pequeño y por adición de éter dietilico, [Os11 (bpy) 2 (acac) Cl] cristalizó como plaquetas marrón anaranjado oscuro. Estas fueron luego filtradas y secadas al aire. Rendimiento: 63 % (0.176 g, 0.28 mmoles) . S : m/z 603 (M) . E° = 0.31 V vs . NHE a pH de 8 (regulador de fosfato) .
Síntesis de [Ru11 (bipy) 2 (acac) ]C1
Fórmula Química: C25H23CIN4O2RU Masa Exacta: 548.06 Se añadió acetil acetona (1 mi, 9.70 mmoles) a [Ru (bipy ) 2CI2] (300 mg, 0.62 mmoles) suspendido en agua (20 mi) y etanol (20 mi), y la mezcla se reflujo por 6 horas en la presencia de exceso de CaC03. La mezcla se filtró y el filtrado se rotaevaporó a sequedad. El residuo se extrajo con cloroformo (30 mi) y se filtró. El filtrado se secó sobre MgS04, y luego se evaporó hasta aproximadamente 5 mi. Por adición de éter dietílico, [Ru11 (bipy) 2 ( acac)]Cl cristalizó lentamente como un sólido cristalino marrón oscuro. El sólido se secó al vacío a 60 °C. Rendimiento: 70 % (236 mg, 0.43 mmoles) . MS : m/z 513 (M) . E° = 0.71 V vs. NHE a pH = 8 (regulador de fosfato) .
Síntesis de Ru (bipy) 20x
Se suspendió Ru(bipy)2Cl2 (0.2 g, 0.41 mmoles) en agua (20 mi) y etanol (10 mi) y la mezcla se hirvió por 2 minutos. Se añadió oxalato de potasio dihidratado (52.1 mg, 0.41 mmoles) y la mezcla se calentó bajo reflujo por 2 horas para dar una solución roja brillante. Al enfriar, se obtuvo un sólido cristalino verde, el cual fue filtrado, lavado con agua y éter dietilico y se secó al aire. Rendimiento: 94 %, 0.19 g. MS : m/z 503.1 (M) . E° = 32.5 mV vs. Fc/Fc+ en TBHP 0.1 en acetonitrilo . Síntesis de KfRu111 (ox) 2 (py-3-COOH) 2]
K
Una solución de K3[Ru(ox)3] (500 mg, 1.0 mmoles) y py-3-COOH (255 mg, 2.1 mmoles) en 50 mi de H20 se reflujo en aire toda la noche. La solución marrón resultante se enfrió y luego se filtró. El filtrado se concentró hasta aproximadamente 1 mi, se añadió acetona y el precipitado marrón pálido se filtró y lavó con acetona y éter dietilico. El producto crudo fue recristali zado tres veces a partir de H20/acetona. Rendimiento: 70 %. ESI-MS:m/z = 602 (M+K)+. E1/2 de RuIII/XI = 0.16 V vs . NHE en solución reguladora de fosfato (pH de 8.05) . Preparación de [Ru11 (DMSO) 4C12] Se reflujo tricloruro de rutenio trihidratado (1.0 g) en sulfóxido de dimetilo (5 mi) por 5 min. El volumen se redujo a la mitad al vacio, la adición de acetona (20 mi) dio un precipitado amarillo. El complejo amarillo que se separó fue filtrado, lavado con acetona y éter, y se secó al vacio. Preparación de [Ru111 (L) Cl3] A una mezcla de Ru11 ( DMSO) 4C12 (1.0 g, 2.1 mmoles) en etanol absoluto (25 mi) se añadió L (0.80 g, 4.7 mmoles) (L = 1, 4, 7- trimetil- 1, 4, 7- triazaciclononano) con agitación. La suspensión se calentó a 60 °C por 1 hora hasta que se obtuvo una solución marrón rojizo intenso claro, la cual fue entonces reflujada por 2 horas. El solvente fue eliminado bajo presión reducida por
evaporación rotatoria. El residuo naranja rojizo fue tratado con HC1 concentrado y se calentó bajo reflujo por 30 minutos en la presencia de aire. Se colectó un sólido microcristalino naranja por filtración, se lavó con agua, etanol y éter dietilico, y se secó al aire. Preparación de [Ru111 (L) (acac) (OH)]PF6.H20 Se añadió RuII:I(L)Cl3 (2.0 g; 5.0 mmoles) en pequeñas cantidades a una solución de 2, 4- pentandionato (acac) de sodio (3.0 g; ~ 24 mmoles) en agua (60 mi) con agitación a temperatura ambiente. La mezcla fue agitada por 3.5 horas hasta que se obtuvo una solución roja claro. La adición de una solución de NaPF6 (2.0 g) en H20 (5 mi) y enfriamiento a 0 °C inició la precipitación de microcristales naranjas, los cuales fueron colectados por filtración, se lavó con éter dietilico, y se secó al aire . Preparación de [Ru11 (L) (acac) (py) ]PF6 Una solución que contenia [Ru111 (L) (acac) (OH) ]PF6 (105 mg, 0.20 mmoles) en etanol absoluto/piridina (5 mi) (4:1, v/v) fue calentada a reflujo bajo atmósfera de argón en la presencia de 10 piezas de amalgama de Zn por 4 horas. Después de enfriamiento a temperatura ambiente, un precipitado microcristalino rojo fue colectado por filtración, lavado con éter dietilico, y se secó al aire. El producto fue recristalizado a partir de acetona/éter
dietílico. Rendimiento: (94 mg, 79 %) ESI/MS (modalidad positiva); m/z = 451, [M]+. 1/2 de RuIIim = 0.18 V vs . FcVO en TBAH 0.1 M en CH3CN. Preparación de [Ru111 (L) (acac) (py) ] (N03) 2
Se añadió lentamente una solución de AgCF3SC>3 (42 mg, 0.16 moles) en acetona (1 mi) a una solución de acetona naranja (3 mi) que contenía [Ru11 (Me3-TACN) (acac) (py) ]PF6 (90 mg, 0.15 moles) . Después de 5 min. se añadió [n-Bu4N]N03 sólido (304 mg, 1 mmol) y se filtró el precipitado púrpura, se lavó con acetona y luego éter dietílico. El producto fue recristalizado a partir de metanol/éter dietílico. Rendimiento: (64 mg, 87 %) ESI/MS (modalidad positiva): m/z 0 451.0, [M]+; 225.4, [M]2+. E° de RuIII/TI = 0.2 V vs . NHE en regulador de fosfato a pH de 8.05. Síntesis de [Ru111 (acac) 2 (4 , 4'- (COO) (COOH) -2 , 2 ' -bpy)]
Una mezcla roja de Ru (acac) 3 (200 mg, 0.5 turnóles) y 4, 4' - (COOH) 2- 2,2'-bpy (122 mg, 0.5 inmoles) en 30 mi de etanol fue reflujada bajo argón con varias piezas de granalla de amalgama de Zn/Hg toda la noche. La mezcla marrón resultante fue enfriada y 1 amalgama de zinc fue retirada con tenacillas. El precipitado marrón fue colectado y lavado con etanol y éter dietilico. El sólido marrón fue entonces disuelto en 50 mi de NH3 0.1 , se filtró y agitó en aire toda la noche para dar una solución rojo púrpura. La solución fue filtrada y luego evaporada a sequedad. El precipitado púrpura fue colectado y lavado con acetona y éter dietilico y luego se secó al aire. Rendimiento: 45 %. E° = 0.21 V vs NHE a pH = 8 regulador de fosfato). Pruebas Electroquímicas Uso de Voltametria cíclica para probar la mediación
(PdR) A fin de probar los mediadores que fueron sintetizados en la forma reducida, es decir, [Ru111 ( 5-C1-Quin)2(py- 3- COOH) (Py- 3- COO)] y [Os (2, 2'-bpy) 2 ( acac ) ]C1 , se llevaron a cabo un grupo de experimentos donde el Ru2+ ( Ru11 ( 5-Cl-Quin ) 2 ( py_3-COOH) (py- 3- COO) o el Os2+ ( [Os11 ( 2 , 2 ' -bpy ) 2 ( acac ) ]C1 ) fueron oxidados electroquímicamente en la presencia de NADH. La adición de putdaredoxina reductasa (PdR) (enzima
mediadora) dio como resultado la electrocatálisis , identificada por un gran incremento en la corriente de oxidación y por la ausencia de un pico de reducción en la exploración en sentido contrario. Preparación de la solución para probar la mediación usando voltametria cíclica (PdR) Se elaboraron una serie de diluciones de putdaredoxina reductasa (Biocatalysts Ltd., Wales) por disolución de PdR en cristales de Trizma® Pre-set a pH de 9 hasta 0.1 (Sigma-Aldrich Company Ltd) para obtener una solución madre de 10 mg/ml la cual fue secuencialmente diluida para obtener soluciones con diferentes concentraciones de PdR. Estas soluciones fueron entonces mezcladas 1:1 (en volumen) ya sea con NADH (Sigma-Aldrich Company Ltd.) o solución de TNADH (Oriental Yeast Company, Japón) que contenía el mediador. Todas las soluciones finales probadas tuvieron 1 mM de mediador, 5 mM de TNADH (o 10 mM de NADH) y concentraciones variables de PdR (5 mg/ml o 0.1 mg/ml) . Se elaboró una serie de soluciones de glucosa oxidasa (GOx) (Sigma-Aldrich Company Ltd) por disolución de cristales de Trizma® Pre-set a pH de 7 hasta 0.1 M (Sigma Aldrich Company Ltd.) para obtener una solución madre de 10 mg/ml la cual fue secuencialmente diluida para obtener soluciones con diferentes concentraciones de
GOx . Estas soluciones se mezclaron luego 1:1 (en volumen) ya sea con NADH ( Sigma-Aldrich Company Ltd.) o bien con soluciones de TNADH (Oriental Yeast Company, Japón) que contenían el mediador. Todas las soluciones finales probadas tuvieron 1 m de mediador, 5 mM de TNADH (o 10 mM de NADH) y concentraciones variables de GOx (2.5 mg/ml a 0.5 mg/ml ) . Experimento 1 A fin de determinar la respuesta electroquímica del nuevo mediador [Ru(II) (py- 3- COOH) (NH3)5] (PF6)2, l solución de 10 mM de mediador (preparada usando agua no desoxigenada) se colocó sobre un electrodo estándar y se probó usando voltametría cíclica. Los resultados se muestran en la Figura 1, la cual es un voltamograma cíclico de 10 mM de solución de mediador (oxigenada) probada sobre un electrodo estándar, ciclizando entre -0.35 V y 0.5 V a una velocidad de exploración de 100 mV.s-1. El voltamograma muestra picos claramente definidos por la oxidación y subsecuente reducción del mediador, con una separación de picos relativamente pequeña. Experimento 2 A fin de probar la estabilidad de la forma reducida del nuevo mediador [Ru11 (py- 3- COOH ) (NH3 ) 5] ( PF6) 2 para oxidación directa por medio de oxígeno disuelto se probó
por oxidación repetida tanto en condiciones aerobias como anaerobias (usando las mismas soluciones) . La Figura 2, muestra los resultados oxidación repetida (a + 0.25 V vs . Ag/AgCl) obtenidos cuando los sensores fueron probados en la guantera (cuadrados) y al aire libre (circuios) . Los resultados mostraron que la corriente de oxidación del nuevo mediador disminuyó con la prueba de repetición - 12 % de circa con 11 oxidaciones de repetición - pero el efecto del oxigeno disuelto es reducido significativamente cuando se compara con
Ru(NH3)6Cl2. Experimento 3 La voltametria del mediador [Ru11 (py- 3- COOH) (NH3) 5] ( PF6) 2) se investigó bajo condiciones descritas en el Experimento 1 en Tris 0.1 M a pH de 9 para determinar si permaneció igual. Se efectuó la voltametria cíclica usando una velocidad de barrido de 10 mV.s"1, comenzando a 0 V, barriendo en la dirección positiva inicialmente con límites de barrido de +0.5 V y -0.35 V vs . Ag/AgCl. La Figura 3, muestra los voltamogramas del mediador en agua (que contenía KCl 0.1 M) y en Tris 0.1 , pH de 9.0. Los voltamogramas fueron muy similares con las corrientes absolutas y los potenciales de pico similar. El pico más pequeño para la
reducción de la especie de Ru3+ comparada con la oxidación de la especie de Ru2+ indicó que la especie en solución fué predominantemente Ru2+. Experimentos similares llevados a cabo con Ru(NH3)6Cl2 dieron una proporción de 50:50 de corrientes de pico para la pareja redox Ru2+/Ru3+. Experimento 4 La estabilidad del mediador [Ru11 (py- 3-COOH) (NH3) 5] ( PFe) 2 para oxidación por medio de oxigeno se estudió sobre electrodos estándares. Se prepararon soluciones de 10, 5 y 1 mM del nuevo mediador en solución al 1 % de taurocolato de sodio (NaTC) , 50 mM de MgS04, KC1 0.1 M en regulador de Tris 0.1 M, a pH de 9.0, y luego se probaron sobre electrodos estándares usando el protocolo del tiempo de repetición con un potencial de + 0.25 V vs . Ag/AgCl. Los resultados se muestran en la Figura 4. Los datos mostraron que el nuevo mediador es estable a la oxidación por oxigeno a todas las concentraciones del mediador probadas. La gráfica de calibración para el nuevo mediador dio un gradiente de 156 nA/mM, en comparación con 199 nA/mM para el mediador de rutenio hexamina estándar (registrado para la misma hoja de electrodos) . El % de CV (Coeficiente de Varianza) de la gráfica (2.84 %) fue casi idéntico al observado para el rutenio hexamina (2.81 %) estándar. La
intersección para la gráfica es 95 nA, fue comparable a la observada para rutenio hexamina (72 nA) . Experimento 5 Para probar si el nuevo mediador [Ru11 (py- 3-COOH) (NH3) 5] ( PF6) 2 puede mediar la transferencia de electrones a y desde glucosa oxidasa (GOx) , se añadió una alícuota de GOx a una solución (parcialmente oxidada con oxígeno) del nuevo mediador. Todas las otras condiciones fueron como se describió en el Experimento 3. La Figura 5, muestra los voltamogramas resultantes registrados en ausencia y presencia de GOx. Los datos mostraron que el nuevo mediador podía mediar la transferencia de electrones entre GOx y un electrodo. Experimento 6 Se estudió el mediador [Ru11 (NH3 ) 5 (py- 3- COOH) ] (PF6) 2 (CF3SO3) , por voltametría cíclica sobre sensores sin revestimiento. Se prepararon 50 mM de solución de mediador en Tris 0.1 (pH 9.0), KC1 0.1 M y tensoactivo al 1 % en peso/volumen (NaTC o CHAPS) . El mediador se disolvió fácilmente para dar soluciones que fueron de color amarillo intenso. Se efectuó la voltametría cíclica usando una velocidad de barrido de 100 rnV.s"1, comenzando a 0 mV, barrido positivo inicialmente con límites de barrido de +0.7 V y -0.7 V vs . Ag/AgCl. Se efectuaron dos barridos sobre cada
pocilio y el segundo barrido fue aceptado (figura 6) . El voltamogrqma cíclico fue idéntico para cada tipo de tensoactivo. Los voltamogramas mostraron dos picos de reducción y un pico de oxidación, más un apoyo adicional sobre la onda de oxidación, implicando que el material puede contener alguna impureza. El potencial de oxidación del pico es más positivo que el rutenio hexamina, y un potencial de + 250 mV vs . Ag/AgCl fue seleccionado para experimentos cronoamperométricos de oxidación. El potencial para experimentos de reducción se dejó sin cambio a -300 mV. Se prepararon los sensores para colesterol total usando este mediador en Tris 0.1 M (pH 9) , CHAPS al 5 %, desoxi gran CHAP al 5 % y 66 mg/ml de colesterol deshidrogenasa (CHDH) . Se añadió el mediador para dar una concentración final de 48.3 mM. Las respuestas del sensor se determinaron usando una membrana de diseminación Petex y 10 µ? de plasma descongelado. Se efectuaron mediciones por quintuplicado en el primer experimento. La pendiente de la respuesta de corriente-concentración fue razonablemente alta, aunque la intersección fue también alta. Esto puede indicar que el mediador contuvo alguna impureza (por ejemplo, alguna especie de Ru11) . La gráfica de corriente promedio vs tiempo (ver las Figuras 7A-C) muestran que la respuesta
es muy estable una vez que se ha alcanzado el valor de la corriente máxima. Esta estabilidad de respuesta mejorada es más probablemente debido a la estabilidad creciente del nuevo Ru mediador. Los datos mostraron que [Ru111 (NH3) 5 (py- 3- COOH) ] ( PF6) 2 (CF3S03) funcionó como un mediador en los sensores para colesterol total, y que el nuevo mediador fácilmente llevó a cabo el intercambio de electrones con PdR. Experimento 7 Para investigar adicionalmente esta aparente estabilidad creciente del nuevo mediador [Ru111 (NH3) 5 (py- 3- COOH) ] ( PF6) 2 (CF3S03) en comparación con el complejo de hexamina, se efectuó un segundo experimento usando mediciones en tiempo de repetición por un periodo de tiempo más prolongado. Los resultados se muestran posteriormente para la respuesta del sensor al tiempo de medición usual (118 seg) y al tiempo de medición final (202 seg) . Las respuestas son casi idénticas, indicando que la respuesta, y por consiguiente el mediador, son muy estables, de acuerdo con la gráfica de corriente promedio vs . el tiempo, también se muestran en las Figuras 8A a 8D.
Claims (44)
1.- El uso de un complejo de Fórmula I [ (A)x(B)y]m(Xz)n Fórmula I como un mediador redox en donde M es rutenio u osmio y tiene un estado de oxidación de 0, 1, 2, 3 o ; x, y n son independientemente un entero seleccionado de 1 a 6; y es un entero seleccionado de 1 a 5; m es un entero de -5 a +4 y z es un entero desde -2 a + 1; A es un ligando aromático mono- o bidentado que contenga 1 o 2 átomos de nitrógeno; B es seleccionado independientemente para ser cualquier ligando adecuado diferente de un ligando heterociclico que contenga nitrógeno; X es cualquier contra ión adecuado en donde A es opcionalmente sustituido por 1 a 8 grupos seleccionados independientemente de grupos alquilo, alquenilo o arilo sustituidos o no sustituidos, - F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, -C02H, -S03H, -NHNH2, -SH, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilamino carbonilo, -OH, alcoxi, -NH2, alquilamino, dialquilamino, alcanoilamino, arilcarboxamido , alquilhidrazino, hidroxilamino, alcoxiamino, alquiltio; en donde el número de átomos de coordinación es 6.
2. - El uso de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque A es un ligando monodentado sustituido por uno o más grupos C02R2, o un ligando bi- o tridentado opcionalmente sustituido por uno o más grupos C02R2.
3. - El uso de conformidad con la Reivindicación 2, caracterizado porque R2 es seleccionado para ser H.
4. - El uso de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque A es seleccionado de ácido nicotinico, ácido isonicotinico, 2 , 2 ' -bipiridina , ácido 2 , 2-bipiridil- 5, 5' -dicarboxilico, ácido 2 , 2-bipiridil- , ' -dicarboxilico, 5- cloro- 8-hidroxiquinolina .
5.- El uso de un complejo de Fórmula II como un mediador redox en donde M es rutenio u osmio y tiene un estado de oxidación de 0, 1, 2, 3 o 4; x, y n son independientemente un entero seleccionado de 1 a 6; y es un entero seleccionado de 0 a 5; m es un entero de -5 a +4 y z es un entero desde -2 a +1; A es un ligando bi-, tri-, tetra-, penta- o hexadentado que pueda ser ya sea lineal que tenga la fórmula F^RN (C2H4NR) «R1 o bien cíclico que tenga las fórmulas (RNC2H4)V, (RNC2H4) p (RNC3H6) q, o [(RNC2H4) (RNC3H6)]S, en donde w es un entero desde 1 a 5, v es un entero desde 3 a 6, p y q son enteros desde 1 a 3 con los cuales la suma de p y q es 4, 5, o 6, y s es ya sea 2 o 3, y en donde R y R1 son ya sea hidrógeno o bien metilo; B es seleccionado independientemente para ser cualquier ligando adecuado; X es cualquier contra ión adecuado en donde B es opcionalmente sustituido por 1 a 8 grupos seleccionados independientemente de grupos alquilo, alquenilo o arilo sustituidos o no sustituidos, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, -C02H, -S03H, -NHNH2, -SH, arilo, alcoxicarbonilo , alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, -OH, alcoxi, -NH2, alquilamino, dialquilamino, alcanoilamino, arilcarboxamido, hidrazino, alquilhidrazino, hidroxilamino, alcoxiamino, alquiltio; en donde el número de átomos de coordinación es 6.
6.- El uso de conformidad con la Reivindicación 5, caracterizado porque el ligando A es un ligando bi-, tri- o tetradentado que pueda ser ya sea lineal que tenga la fórmula R1RN (C2H4NR) wR1 o bien cíclico que tenga las fórmulas (RNC2H4)V, (RNC2H4) P (RNC3H6) q, [(RNC2H4) (RNC3H6)]S; en donde w es un entero desde 1 a 3, v es ya sea 3 o 4, p y q son enteros desde 1 a 3 con lo que la suma de p y q es 4 y s es ya sea 2 o 3;
7. - El uso de conformidad con la Reivindicación 5, caracterizado porque ? es seleccionado de 1, 4, 7-trimetil- 1, 4, 7- triazaciclononano, o 1, 1, 4, 7, 10, 10- hexametiltrietilentetramina , 1, 2-dimetiletilendiamina, o 1, 1, 2, 2-tetrametiletilendiamina .
8. - El uso de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque B es seleccionado de ligandos amina tales como NH3 o NMe3, CO, CN, halógeno, y acetilacetonato (acac) , 3- bromo-acetilacetonato (Bracac) , oxalato, piridina, o 5- cloro-8- hidroxiquinolina .
9. - El uso de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes caracterizado porque cuando A o B son seleccionados para ser bidentados, la geometría del complejo cis o trans.
10. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el estado de oxidación del metal es seleccionado para ser 2+, 3+ o 4+.
11. - El uso de conformidad, con la Reivindicación 9, caracterizado porque el estado de oxidación del metal es seleccionados para ser 3+.
12. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los ligandos A y B son seleccionados de modo que la carga total del complejo sea seleccionada del grupo +3, +2, +1, 0, -1, -2 y -3.
13. - El uso de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el contra ión es seleccionado de F_, Cl~, Br~, I", N03~, NH4+, NR4+, PF6", CF3SO3", S042", CIO4", K+, Na\ Li+.
14. - El uso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque se usa una combinación de contra iones.
15. - El uso de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 14 caracterizado porque dicho complejo es cualquiera de [Ru111 (NH3) 5 (piridina-3-COOH) ] (PF6) 2 (CF3SO3) , [RuIIX(2, 4-pentandionato) 2 (piridina-3-COOH) (piridina-3-COO) ], [Rui (3- bromo- 2, 4-pentandionato) 2- (piridina- 3- COOH) (piridina-3-COO) ], [RuII];(2, 4- pentandionato) 2 (2, 2' -bipiridina-5, 5' - (COOH) (C00) ], [RuXII(2, 4- pentandionato ) 2 ( 2 , 2 ' -bipiridina-4, 4' - (COOH) (COO)], [Ru?II(2, 4- pentandionato ) 2 ( 2 , 2 ' - bipiridina ) ]C1 , [Ru l ( 2 , 4- pentandionato) 2 (piridin-4-COOH) (piridina-4-C00) ], [Ru111^- cloro- 8-hidroxiquinolina ) 2 (piridina-3-C00H) ( Piridina-3-C00) ], [Rui (l, 1, 4, 7, 10, 10- hexametiltrietilen tetramina) (2, 4- pentandionato) ( PF6) (CF3S03) ], [RuIJI(l, 1, 4, 7, 10, 10- hexametiltrietilentetramina ) (2, 4-pentandionato) ]C12, [OsJI(2, 2 ' -bipiridina ) 2 ( 2 , 4-pentandionato) ]C1, [Ru(2, 2 ' -bipiridina ) 2 ( 2 , 4-pentandionato) ]C1, [Ru11 (2,2' -bipiridina) 2 (C204], K[RuIIJ (C204) 2 (piridina-3-COOH2], [RuITI(l, 4, 7- trimetil-1, 4, 7- triazaciclononano) (2, 4-pentandionato (piridina)] (N03) 2 ·
16.- El uso de conformidad con la Reivindicación 15, caracterizado porque dicho complejo es [RuIII:(2, 4-pentandionato) 2 (piridina- 3- COOH) (piridina-3-COO) ], [Ru111!!, 4, 7- trimetil- 1, 4, 7- triazaciclononano) (2, 4- pentandionato) (piridina) ] (N03) 2, o [RuIXI(l, 1, 4, 7, 10, 10- hexametiltrietilentetramina) (2, 4-pentandionato)]Cl2.
17.- El uso de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el mediador redox es usado en un sensor electroquímico.
18. - El uso de conformidad con la Reivindicación 17, caracterizado porque el sensor electroquímico incluye un electrodo de micro-banda.
19. - El uso de conformidad con la Reivindicación 18, caracterizado porque el sensor electroquímico es un bio-sensor electroquímico.
20. - El uso de conformidad con la Reivindicación 19, caracterizado porque dicho biosensor electroquímico es usado para detectar analitos en fluidos corporales, muestras ambientales, alimentos y bebidas, muestras veterinarias, productos farmacéuticos.
21. - El uso de un complejo de rutenio o de osmio de Fórmula I o de Fórmula II de conformidad con las Reivindicaciones 1 a 16 en un biosensor.
22.- El uso de conformidad con la Reivindicación 21, caracterizado porque los complejos son usados a un pH de 6 a 10.
23. - El uso de conformidad con la Reivindicación 22, caracterizado porque los complejos son usados a un pH de 7 a 9.
24. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-23, caracterizado porque el biosensor es usado con cualquier analito compatible.
25. - El uso de conformidad con la Reivindicación 24, caracterizado porque el analito es para ser encontrado en un fluido biológico, y puede también ser seleccionado de cualquiera de una enzima, sustrato enzimático, antigeno, anticuerpo, secuencia de ácido nucleico, colesterol, ésteres de colesterol, lipoproteinas, triglicéridos o unos microorganismos.
26.- Un sistema de detección para medir un analito, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra que contenga el analito con solución que contenga una enzima y un mediador redox seleccionado de un grupo de compuestos que contengan Ru o que contengan Os de conformidad con la Fórmula I o con la Fórmula II; (b) incubar la muestra puesta en contacto bajo condiciones que causen que la enzima actúe sobre el analito; (c) someter la muestra incubada de la etapa (b) a condiciones que den como resultado un cambio en una señal medible; y (d) medir la señal resultante.
27.- El sistema de conformidad con la Reivindicación 26, caracterizado porque la señal medible es una señal electroquímica, color imétrica , térmica, impedométrica , capacitora o espectroscópica .
28.- El sistema de conformidad con la Reivindicación 27, caracterizado porque la señal medible es una señal electroquímica medida utilizando un electrodo de micro-banda .
29. - El sistema de conformidad con la Reivindicación 28, caracterizado porque la señal electroquímica es detectada usando un electrodo de micro-banda en un método de detección amperométrico .
30. - Un complejo de conformidad con la Fórmula I [M(A)x(B)y]m(Xz)n Fórmula I en donde M es rutenio u osmio y tiene un estado de oxidación de 0, 1, 2, 3 o 4; x, y n son independientemente un entero seleccionado de 1 a 6; y es un entero seleccionado de 1 a 5; m es un entero de -5 a +4 y z es un entero desde -2 a +1; A es un ligando aromático mono- o bidentado que contenga 1 o 2 átomos de nitrógeno; B es seleccionado independientemente para ser uno o más de cualquier ligando adecuado diferente de un ligando heterocíel ico que contenga nitrógeno; X es cualquier contra ión adecuado; en donde A es opcionalmente sustituido por 1 a 8 grupos seleccionados independientemente de grupos alquilo, alquenilo o arilo sustituidos o no sustituidos, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, -C02H, -S03H, -NHNH2, -SH, arilo, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilamino carbonilo, -OH, alcoxi, -NH2, alquilamino, dialquilamino, alcanoilamino, arilcarboxamido , hidrazino, alquilhidrazino, hidroxilamino , alcoxiamino, alquiltio; en donde el número de átomos de coordinación es 6.
31.- Un complejo de conformidad con la Reivindicación 30, caracterizado porque A es un ligando monodentado sustituido por uno o más grupos CO2R2, o un ligando bi- o tridentado opcionalmente sustituido por uno o más grupos CO2R2, en donde dichos uno o más grupos están cada uno en la posición meta relativa al heteroátomo o heteroátomos coordinadores.
32.- Un complejo de conformidad con la Reivindicación 31, caracterizado porque R es seleccionado para ser H.
33.- Un complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32 caracterizado porque A es seleccionado de ácido nicotinico, ácido isonicotinico, ácido 5- carboxi-nicotinico, ácido 6- piridil nicotinico, ácido 2 , 2 ' -bipiridin-5 , 5 ' -bis carboxilico, ácido 2, 2'-bipiridin- 4, 4'- bis- carboxilico, 2 , 2 ' -bipiridina , ácido 1, 10- fenantrolin- 3, 9- bis- carboxilico.
34.- Un complejo de conformidad con la Fórmula II [M(A)x(B)y]m(X2)n Fórmula II en donde M es rutenio u osmio y tiene un estado de oxidación de 0, 1, 2, 3 o 4 ; x, y n son independientemente un entero seleccionado de 1 a 6; y es un entero seleccionado de 0 a 5; m es un entero de -5 a +4 y z es un entero desde -2 a +1; A es un ligando bi-, tri-, tetra-, penta- o hexadentado que puede ser ya sea lineal que tenga la fórmula R1RN (C2H4NR) «R1 o bien cíclico que tenga la fórmula (RNC2H4)V, (RNC2H4) p (RNC3H6) q, o [(RNC2H4) (RNC3H6)]S, en donde w es un entero desde 1 a 5, v es un entero desde 3 a 6, p y q son enteros desde 1 a 3 con los cuales la suma de p y q es 4, y s es ya sea 2 o 3, y en donde R y R1 son ya sea hidrógeno o metilo; B es seleccionado independientemente para ser cualquier ligando adecuado; X es cualquier contra ión adecuado; en donde A es opcionalmente sustituido por 1 a 7 grupos seleccionados independientemente de grupos alquilo, alquenilo o arilo sustituidos o no sustituidos, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, -C02H, -S03H, -NHNH2, -SH, arilo, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, -OH, alcoxi, -NH2, alquilamino, dialquilamino, alcanoilamino, arilcarboxamido, alquilhidrazino, hidroxilamino, alcoxiamino, alquiltio; en donde el número de átomos de coordinación es 6.
35. - El uso de conformidad con la Reivindicación 34 caracterizado porque A es un ligando bi-, tri- o tetra, dentado que pueda ser ya sea lineal que tenga la fórmula R1RN ( C2H4NR) «R1 o bien cíclico que tenga la fórmula (RNC2H4)V, (RNC2H4) p (RNC3H6) q, [(RNC2H4) (RNC3H6)]S, en donde w es un entero desde 1 a 3, v es ya sea 3 o 4, p y q son enteros desde 1 a 3 con los cuales la suma de p y q es 4 y s es ya sea 2 o 3.
36. - Un complejo de conformidad con la Reivindicación 35, caracterizado porque A es seleccionado desde 1, 4, 7- trimetil- 1, 4, 7- triazaciclononano, o 1, 1, 4, 7, 10, 10- hexametiltrietilentetramina , 1, 2-dimetiletilen diamina, o 1, 1, 2, 2-tetramet iletilendiamina .
37.- Un complejo de conformidad con las Reivindicaciones 30 a 36, caracterizado porque B es seleccionado de ligandos amina tales como NH3,. CO; CN; halógeno, y acetilacetonato (acac) , 3- bromo-acetilacetonato (Bracac) , oxalato, o 5- cloro- 8-hidroxiquinolina .
38.- Un complejo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 30 a 37, caracterizado porque cuando A o B es seleccionado para ser bi-dentado, la geometría del complejo puede ser cis o trans.
39.- Un complejo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 30 a 38, caracterizado porque el estado de oxidación del metal es seleccionado para ser 2+ o 3+.
40.- Un complejo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 30 a 39 caracterizado porque el estado de oxidación del metal es seleccionado para ser 3+.
41. - Un complejo de conformidad con la Reivindicación 40, caracterizado porque los ligandos A y B son seleccionados de modo que la carga total del complejo sea seleccionado del grupo +2, +1, 0, -1, -2 y -3.
42. - Un complejo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 30 a 41, caracterizado porque el contra ión puede ser seleccionado de F, Cl", Br~, I~, N03_ , NH , NR4 +, PF6~, CF3SO3", S042", CIO4", OH", K+, Na+ , Li+.
43. - Un complejo de conformidad con la Reivindicación 42, caracterizado porque se usa una combinación de contra iones.
44. - Un complejo de conformidad con las Reivindicaciones 30 a 43 caracterizado porque dicho complejo es [Ru111 (NH3) 5 (piridina-3-COOH ) ] ( PF6) 2 (CF3SO3) , [RuII3:(2, 4-pentandionato) 2 (piridina-3-COOH) (piridina-3-COO)], [RuIIX(3- bromo- 2, 4- pentandionato ) 2- (piridina- 3- COOH) (piridina-3-COO) ], [RuIXI(2, 4- pentandionato) 2 (2, 2' -bipiridina-5, 5' - (COOH) (COO) ], [Rui (2, 4-pentadionato) 2 (2, 2' -bipiridina-4, 4' - (COOH) (COO)], [RuTII(2, 4- pentadionato) 2 (2, 2' -bipiridina) ]C1, [RuXII(2, 4-pentandionato) 2 (piridin-4-COOH) (piridina-4-COO) ], [RuJII(5-cloro- 8- hidroxiquinolina) 2 (piridina-3-COOH) (Piridina-3-COO)], [RuIIT(l, 1, 4, 7, 10, 10- hexametil trietilentetramina) (2, 4- pentadionato) ( PF6) (CF3S03) ], [RuXII(l, 1, 4, 7, 10, 10- hexametiltrietilentetramina) (2, 4- pentadionato) ]C12, [OsJI(2, 2 ' -bipiridina ) 2 ( 2 , 4-pentadionato) ]C1, [Ru(2, 2 ' -bipiridina ) 2 ( 2 , 4-pentadionato) ]C1, [Ru11 (2,2' -bipiridina) 2 (C204) ], K[RuIJI (C204) 2 (piridina-3-COOH2], [RuI]:i(l, 4, 7- trimetil-1, 4, 7- triazaciclononano) (2, 4- pentadionato (piridina)](N03)2.
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