ES2339181T3

ES2339181T3 - Acido hialuronico acrilatado.

Info

Publication number: ES2339181T3
Application number: ES07758243T
Authority: ES
Inventors: Richard A. Gross; Vineet Kumar
Original assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 2006-03-14
Filing date: 2007-03-09
Publication date: 2010-05-17
Anticipated expiration: 2027-03-09
Also published as: AU2007226690B2; EP1999160B1; BRPI0708776A2; WO2007106738A2; ATE453670T1; JP2009530445A; CA2647481A1; PL1999160T3; JP5123285B2; US20090118423A1; CN101405303B; DE602007004086D1; CN101405303A; EP1999160A2; WO2007106738A3; DK1999160T3; AU2007226690A1

Abstract

Proceso para la preparación de un producto de ácido hialurónico acrilatado comprendiendo las fases siguientes que consisten en: a) preparar un líquido acuoso comprendiendo ácido hialurónico donde el pH se mantiene en un pH adecuado; b) preparar un líquido orgánico comprendiendo cloruro de acriloilo y un solvente orgánico; y c) mezclar el líquido orgánico de (b) y el líquido acuoso de (a), donde el pH se mantiene en un pH adecuado.

Description

Ácido hialurónico acrilatado.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para producir un ácido hialurónico acrilatado (AH).

Antecedentes de la invención

El ácido hialurónico (AH) es un polímero carbohidrato natural y lineal que pertenece a la clase de los glicosaminoglicanos no sulfatados. Se compone de beta-1,3-N-acetil glucosamina y unidades de disacárido repetición de beta-1,4-ácido glucurónico con un peso molecular (PM) hasta 6 MDa. El AH está presente en el cartílago hialino, el líquido de articulación sinovial, y los tejidos de la piel, tanto dermis como epidermis. El AH puede ser extraído a partir de tejidos naturales incluyendo el tejido conjuntivo de vertebrados, del cordón umbilical humano y de las crestas de gallos. Sin embargo, actualmente se prefiere preparar este último por medio de métodos microbiológicos para minimizar el riesgo potencial de transferencia de agentes infecciosos, y para incrementar la uniformidad, calidad y disponibilidad del producto, (patente U.S. nº.6,951,743: WO 03/0175902).

Se han identificado numerosas funciones del AH en el cuerpo. Tiene un papel importante en organismos biológicos, como soporte mecánico para células de varios tejidos, tales como piel, tendones, músculos y cartílago. El AH se implica en procesos biológicos claves, tales como la humectación de tejidos, y la lubricación. También se supone que cumple un papel en muchas funciones fisiológicas, como la adhesión, el desarrollo, la motilidad de las células, el cáncer, la angiogénesis, y la curación de heridas. Debido a las propiedades físicas y biológicas únicas del AH (incluyendo viscoelasticidad, biocompatibilidad, biodegradabilidad), el AH se emplea en una amplia gama de aplicaciones actuales y en desarrollo en cosmética, oftalmología, reumatología, administración de medicamentos e inserción de genes, curación de heridas y la ingeniería de tejidos. El uso de AH en alguna de estas aplicaciones es limitado por el hecho de que el AH es soluble en agua a temperatura ambiente, es decir que, a aproximadamente 20ºC, se degrada rápidamente por hialuronidasa en el cuerpo, y es difícil de procesar en biomateriales. Por lo que se ha introducido la reticulación de AH para mejorar las propiedades físicas y mecánicas del AH y su tiempo de residencia in vivo.

El AH acrilatado se puede utilizar para realizar una reticulación mediada por enzima y producir materiales en forma de hidrogeles. El AH reticulado se puede utilizar en aplicaciones cosméticas, biomédicas y farmacéuticas. Por medio de la reticulación de AH es posible diseñar un compuesto con propiedades específicas para aplicaciones específicas. El AH acrilatado provee grupos reactivos funcionalizados que pueden ser modificados también por una adición de tipo Michael para introducir péptidos bioactivos para diferentes aplicaciones.

Los grupos de acrilato en AH han sido introducidos por síntesis de conjugados de metacrilato de glicidilo-AH (GMAH). Los derivados de GMAH son útiles para preparar hidrogeles biomiméticos de AH para estimular la reparación de tejidos y la curación de heridas. También se ha descubierto que las cantidades aumentadas de grupos de metacrilato conjugados corresponden a densidades reticuladas aumentadas e índices de degradación reducidos, y tienen un efecto insignificante en la citocompatabilidad y proliferación de células aórticas endoteliales humanas. Los derivados de GMAH se han preparado por tratamiento de un 1% p/v de solución de AH derivado de una fermentación (\sim2 X 10^{6} de peso molecular) en agua destilada con un exceso molar multiplicado por 6, 10 y 20 de metacrilato de glicidilo en presencia de un exceso de trimetilamina y bromuro de tetrabutilamonio durante toda la noche a temperatura ambiente, seguido de una incubación de 1 hora a 60ºC. Por ejemplo el GMAH con un exceso molar multiplicado por seis de GM se preparó mediante la disolución de 1.0 g AH en 100 ml de agua destilada. A la solución se añadió 2.2 ml de trietilamina de, 2.2 ml de metacrilato de glicidilo y 2.2 g de bromuro de tetrabutilamonio y se agitó durante toda la noche, seguido de una incubación a 60ºC durante una hora. Por este proceso se obtuvo un 5% de metacrilación. Utilizando un exceso molar multiplicado por 10 y 20 se obtuvo una acrilación del 7 y 11% (Leach y Schmidt, 2005, Biomaterials 26, 125-135; Yonese et al., 2002, Chem. Pharm. Bull. 50, 1341-1348; Schmidt et al., 2003, Biotechnology and Bioengineering 82(5), 578-589).

Los conjugados de GMAH se han preparado también por disolución de AH en tampón de carbonato a un pH 11.0. Se añadió metacrilato de glicidilo a la solución anterior y la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 7 días. El pH de la solución resultante se ajustó a 7.0 con HCl. Se filtró y se liofilizó (Yonese, 2001. Journal of Controlled Release 73, 173-181). El conjugado de GMAH se reticuló también con acrilado de hidroxietilo para preparar un hidrogel.

Se han introducido también grupos acrilatados en AH por síntesis de conjugados de N-3-aminopropilo metacrilamida-AH por modificación de los grupos de carboxilo presentes en AH. Tanto el AH nativo y el degradado enzimáticamente fueron usados posteriormente para una modificación química. Ambos AH fueron modificados utilizando metacrilamida N-(3-aminopropilo) como agente acrilante. El grupo aminopropilo reaccionó con un grupo carboxilo de AH en presencia de N-(3-dimetilaminopropilo)-N'-etilcarbodiimida (EDCl) como agente de acoplamiento produciendo la formación de un enlace amido con grupos acrilo pendientes en el otro extremo. En una reacción típica el AH fue disuelto en agua destilada. A la solución se añadió EDCl seguido de metacrilamida N-3-aminopropilo. La mezcla reactiva se incubó a pH 6.5 durante dos horas seguidas de la adición posterior de EDCl y metacrilamida N-3-aminopropilo y fue incubada además durante 2 horas a temperatura ambiente. La solución se filtró, dializó contra NaCl seguido de agua y liofilizado finalmente para formar AH metacrilatado. El grado de acrilación logrado fue de aproximadamente el 10% (Tirelli et al., 2003, Biomaterials, 24, 893-900; Kim and Park 2002, Journal of Controlled Release, 80, 69-77).

El ácido hialurónico metacrilatado (HAMA) ha sido sintetizado por adición de anhídrido metacrílico (\simmultiplica-
do por 20) a una solución de 1% de AH en agua desionizada ajustada a un pH de 8 con NaOH y reaccionada sobre hielo durante 24 horas. El polisacárido modificado fue precipitado y lavado con etanol para eliminar el anhídrido metacrílico. En el proceso se puede conseguir una metacrilación de hasta un 17%. El % reducido de metacrilación (17%) logrado se debía a la reactividad reducida del anhídrido metacrílico con hidroxilos de AH (Smeds and Grinstaff 2001, Journal of Biomedical Materials Research, 54, 115-121; Langer et al., 2005, Biomacmmotecules, 6, 386-391).

Los métodos conocidos para la acrilación de AH son largos y complicados, y se necesita en la técnica un proceso más simple para la acrilación de AH. Es un objeto de la presente invención de proporcionar un proceso simple para la acrilación de ácido hialurónico.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a métodos para producir un ácido hialurónico acrilatado, dicho método incluyendo las etapas que consisten en:

(a): preparar un líquido acuoso con un pH de 7 a 11 comprendiendo ácido hialurónico;

(b): preparar un líquido orgánico comprendiendo cloruro de acrílico y cloruro de metileno/éter dietílico; y

(c): mezclar el líquido orgánico de (b) con el líquido acuoso de (a), donde el pH se mantiene entre 7 y 11.

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Los procesos de la presente invención son muy rápidos debido a una reactividad muy alta del agente reactivo acrilante utilizado, reduciendo así los tiempos de reacción convencionales. El % de acrilación obtenido es mucho más elevado usando los procesos de la presente invención. Mediante el uso del proceso simple y rápido una acrilación superior al 90% puede ser obtenida en un tiempo de reacción mucho más corto (1-2 horas) en comparación con un 17% divulgado hasta la fecha mediante el uso de procesos complejos. Este es el % máximo de acrilación obtenido sin usar ningún agente de acoplamiento. Además los productos adicionales obtenidos en los procesos de la presente invención son muy inferiores y pueden se eliminados fácilmente en comparación con los protocolos provistos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a procesos de producción de un ácido hialurónico acrilatado comprendiendo las siguientes fases que consisten en: a) preparar un líquido acuoso comprendiendo ácido hialurónico donde el pH se mantiene entre 7 y 11: b) preparar un líquido orgánico comprendiendo cloruro de acriloilo y un solvente orgánico; y c) mezcla del líquido orgánico de (b) y el líquido acuoso de (a) donde el pH se mantiene entre 7 y 11.

Con los métodos de la presente invención, el AH puede ser acrilatado y reticulado de forma controlada para formar hidrogeles altamente hidratados y degradables con una amplia gama de propiedades para diferentes aplicaciones en la curación de heridas, matrices de ingeniería de tejidos y una amplia gama de otras aplicaciones biomédicas.

La fórmula estructural de la sal sódica de AH es mostrada más abajo:

1

El "ácido hialurónico" se define aquí como un compuesto glicosaminoglicano no sulfatado de unidades disacáridas de repetición de N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido glucurónico (GlcUA) unidos entre sí por enlaces glicosídicos alternantes beta-1,4 y beta-1,3, que se producen naturalmente en superficies celulares, en las sustancias extracelulares básicas del tejido conjuntivo de vertebrados, en el líquido sinovial de las articulaciones, en el fluido endobulbar del ojo, en el tejido de cordón umbilical humano y en las crestas de gallos. El ácido hialurónico también se conoce como hialuronano, hialuronato, o AH. Los términos hialuronano y ácido hialurónico se utilizan aquí indistintamente.

Se entiende aquí que el término "ácido hialurónico" incluye un grupo de polisacáridos de N-acetilo-D-glucosami-
na y ácido D-glucurónico con pesos moleculares variantes o incluso fracciones degradadas del mismo.

La presente invención describe un proceso simple para la acrilación de AH evitando el uso de catalizadores de transferencia de fase y agentes de acoplamiento. Un problema que resolver por la presente invención es cómo preparar intermedios de ácido hialurónico acrilatados, para la fabricación de hidrogeles con base de AH reticulados, en un proceso simple y rápido.

El AH utilizado en la presente invención puede ser cualquier AH disponible, incluyendo AH derivado de tejidos naturales incluyendo el tejido conjuntivo de vertebrados, el cordón umbilical humano y las crestas de gallos. En una forma de realización particular el ácido hialurónico o sal del mismo son producidos de forma recombinante, preferiblemente por una bacteria gram-positiva o célula huésped, más preferiblemente por una bacteria del género Bacillus. En otra forma de realización, el AH se obtiene a partir de una célula de Streptococcus.

La célula huésped puede ser cualquier célula de Bacillus adecuada para la producción recombinante de ácido hialurónico. La célula huésped de Bacillus puede ser una célula de Bacillus de tipo salvaje o una mutante de ésta. Células Bacillus útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a éstas, Bacillus agaraderhens, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y células de Bacillus thuringiensis. Células de Bacillus subtilis mutantes particularmente adaptadas para la expresión recombinante se describen en WO 98/22598. Las células no encapsulantes de Bacillus son particularmente útiles en la presente invención.

En una forma de realización preferida, la célula huésped de Bacillus es un Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis o célula de Bacillus subtilis. En una forma de realización más preferida, la célula del bacillus es una célula del bacillus amyloliquefaciens. En otra forma de realización más preferida, la célula de Bacillus es una célula de Bacillus clausii. En otra forma de realización más preferida, la célula de Bacillus es una célula de Bacillus lentus. En otra forma de realización más preferida, la célula de Bacillus es una célula de Bacillus licheniformis. En otra forma de realización más preferida, la célula de Bacillus es una célula de Bacillus subtilis. En una forma de realización más preferida, la célula huésped de Bacillus es Bacillus subtilis A164\Delta5 (véase patente US nº. 5,891,701) o Bacillus subtilis 168\Delta4.

El peso molecular medio del ácido hialurónico se puede determinar usando métodos estándar en la técnica, tal como los que se describen en Ueno et al., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272, 1-40; y Wyatt Technologies, 1999, "Light Scattering University DAWN Course Manual" y el "DAWN EOS Manual", Watt Technology Corporation, Santa Barbara. California.

En una forma de realización preferida, el ácido hialurónico, o sal del mismo, de la presente invención, tiene un peso molecular de aproximadamente 10,000 hasta aproximadamente 10,000,000 Da. En una forma de realización más preferida tiene un peso molecular de aproximadamente 25,000 hasta aproximadamente 5,000,000 Da. En una forma de realización más preferida, el ácido hialurónico tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 hasta aproximadamente 3,000,000 Da.

En los procesos de la presente invención, el cloruro de acriloilo usado puede ser cualquier cloruro de acriloilo disponible.

El cloruro de acriloilo tiene la estructura siguiente:

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donde, en una forma de realización particular, R_{1} es seleccionado en el grupo que consiste en hidrógeno, metilo, cloruro y COCl, R_{2} es seleccionado en el grupo que consiste en hidrógeno, metilo, fenilo, cloruro, fenilo de 2-cloro, COCl y CH_{2}COCl y R_{3} es seleccionado en el grupo que consiste en hidrógeno, metilo, cloruro, fenilo de 4-nitro, 3-trifluorometilfenilo y fracciones de stirilo.

El cloruro de acriloilo, conocido también como cloruro de 2-propenoilo o cloruro de ácido acrílico es un líquido claro, amarillo claro, inflamable con un olor acre. Pertenece al grupo de compuestos de cloruros ácidos y es en consecuencia un derivado del ácido acrílico. Este compuesto producirá las reacciones comunes de cloruros de ácido: reaccionará violentamente con agua produciendo ácido acrílico. Unas reacciones con alcoholes producirán la formación de ésteres y reacciones con aminas producirán amidas. El cloruro de acriloilo es empleado más comúnmente en la síntesis orgánica para la introducción de fracciones acrílicas en otros compuestos. También se utiliza extensamente en la preparación de monómeros y polímeros acrilatados.

En una forma de realización particular de la presente invención el cloruro de acriloilo es seleccionado en el grupo que consiste en cloruro de acriloilo, cloruro de metacriloilo, cloruro de crotonilo, cloruro de cinamoilo, cloruro de fumarilo, cloruro de itaconilo, cloruro de 3,3-dimetilacriloilo, cloruro de tricloroacriloilo, cloruro de 2-clorocinnamoilo, cloruro de trans-4-nitrocinamoilo, cloruro de trans-3-(trifluorometil)cinamoilo, cloruro de trans-3-(trifluorometil)cinamoilo y cloruro de cinamilidenemalonilo.

En los métodos de la presente invención, AH reacciona con un cloruro de acriloilo según la reacción mostrada más abajo:

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donde R_{1} es seleccionado en el grupo que consiste en hidrógeno, metilo, cloruro y COCl, y R_{2} comprende una estructura seleccionada en el grupo que consiste en hidrógeno, metilo, fenilo, cloruro, fenilo de 2-cloro, COCl y CH_{2}COCl y R3 es seleccionado en el grupo que consiste en hidrógeno, metilo, cloruro, 4-nitro fenilo, 3-trifluorometilfenilo y fracciones de stirilo.

En una forma de realización particular de la presente invención el líquido acuoso de a) se prepara de la siguiente manera: el AH se disuelve en agua en agua desionizada particular para formar un líquido acuoso que comprende AH. Se añade hidróxido sódico gota a gota al líquido acuoso comprendiendo AH. Es importante que los grupos de hidróxido de AH sean deprotonados. El líquido acuoso es dejado por un periodo de tiempo a temperaturas bajas para asegurar la conversión del hidróxilo en iones hidróxidos.

En una forma de realización particular de la presente invención la temperatura del líquido acuoso se baja a alrededor de 0ºC a 5ºC después de la disolución del AH y se mantiene entre 0ºC y 15ºC durante la reacción.

En una forma de realización más particular de la presente invención la temperatura del líquido acuoso se mantiene a 0ºC y 5ºC durante la reacción.

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En una forma de realización particular de la presente invención el pH se mantiene entre 7 y 11 durante esta primera fase del proceso. En una forma de realización más particular de la presente invención el pH se mantiene entre 8 y 10. En un forma de realización más particular de la presente invención el pH se mantiene entre 8.5 y 9.5. El pH se mantiene bien por tampón y/o por adición de diluido de hidróxido sódico.

El líquido orgánico se prepara mediante la mezcla de cloruro de acriloilo y un solvente inmiscible de bajo punto de ebullición. El solvente inmiscible de bajo punto de ebullición se puede seleccionar en el grupo que consiste en éter dietílico y diclorometano.

La acrilación depende principalmente del pH de la solución. En una forma de realización particular el cloruro de acriloilo se añade gota a gota a la solución de AH. Una cantidad de ácido acrílico se formará mediante la cual el pH disminuye, por lo que es necesario añadir una base para aumentar el pH. En una forma de realización particular el pH se mantiene entre 7 y 11 mediante el uso de tampones y/o por adición de NaOH preferiblemente 1 N-5 N NaOH. En una forma de realización particular de la presente invención el pH se mantiene entre 7.5 y 10 durante la reacción. En una forma de realización más particular de la presente invención el pH se mantiene entre 7.5 y 9.5 durante la reacción. En una forma más particular de la invención el pH se mantiene entre 8 y 9.

El pH óptimo para la presente reacción está entre 8 y 9.5. Puede ser difícil mantener el pH estable durante la adición de cloruro de acriloilo ya que los cambios de pH son muy rápidos debido a la reacción relativamente rápida del cloruro de acriloilo con agua para formar ácido acrílico.

Para poder mantener el pH entre 8 y 9.5 durante la reacción de AH con cloruro de acriloilo se descubrió que el uso de una bomba de jeringa para añadir cloruro de acriloilo podía resolver el problema y mantener la adición de cloruro de acriloilo a 500-1000 uL/hora. A través del uso de una bomba de jeringa se añade una cantidad más pequeña de cloruro de acriloilo y así el pH se puede mantener fácilmente. Así, en una forma de realización particular se utiliza una bomba de jeringa para mantener el pH estable.

La proporción de AH en cloruro de acriloilo en una base molar está preferiblemente entre 1:10a 1:60. En una forma de realización preferida, 50 mg de AH (0.125 mmol) en 25 ml de agua desionizada se trató con 120 microlitros de cloruro de acriloilo (1.48 mmol) en una proporción de aproximadamente 1:12, produciendo un 17% de acrilación de AH. En otra forma de realización preferida, la misma concentración de AH (0.125 mmole) fue tratada con una cantidad más elevada de cloruro de acriloilo (250 microlitros, 3.07 mmole) en una proporción de aproximadamente 1:25, produciendo 34% de acrilación de AH. En una forma de realización más preferida, se trató 0.125 mmol de AH con 500 microlitros de cloruro de acriloilo (6.15 mmol) en una proporción de aproximadamente 1:50, produciendo 90% acrilación de AH.

Después de la adición completa del cloruro de acriloilo, se agita la mezcla reactiva líquida para asegurar una reacción completa.

Una vez finalizada la reacción, el producto de AH acrilatado es precipitado por adición de un exceso de un solvente orgánico como etanol, acetona, metanol o alcohol isopropílico. Para la purificación del producto derivatizado, éste es centrifugado, y lavado con un solvente tal como etanol, metanol o acetona. El producto puede ser dializado para proveer un producto de AH acrilatado substancialmente puro.

El AH acrilatado puede ser formulado en un polvo seco, por ejemplo, por liofilización o secado por atomización.

La presente invención también se refiere a AH acrilatado que posee la siguiente estructura:

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donde R_{1} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, metilo, cloruro y COCl, y R_{2} comprende una estructura seleccionada en el grupo que consiste en hidrógeno, metilo, fenilo, cloruro fenilo de 2-cloro, COCl y CH_{2}COCl y R_{3} se selecciona en el grupo que consiste en hidrógeno, metilo, cloruro, 4-nitro fenilo, 3-trifluorometilfenilo y fracciones de estiril.

En una forma de realización particular, la presente invención divulga un AH acrilatado con la siguiente estructura:

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Los productos AH acrilatados se pueden caracterizar por el protón RMN. El % de acrilación se determina a partir de los valores de integración del 5.66 ppm de protón acrilado (1H) hasta los protones de N-acetilo de ácido hialurónico (-NHCOCH_{3}, 3H, 2.0 ppm).

El AH acrilatado se puede utilizar para llevar a cabo una reticulación mediada por enzima y producir materiales en forma de hidrogeles.

Ejemplos de reticulación/polimerización mediada por enzima:

La peroxidasa (rábano) se ha utilizado como el catalizador enzimático para mediar la polimerización/reticulación de los grupos funcionales acrilo intramoleculares o intermoleculares.

Las clases de enzimas de peroxidasas y lacasas son capaces de catalizar las reacciones mencionadas anteriormente de reticulación del acrilato de glicidilo AH y AH-acrilato.

La reacción de la reticulación enzimática del polímero AH modificado químicamente es moderada y ecológica en comparación con métodos químicos alternativos.

Previamente, la peroxidasa de rábano (HPR) se informa ha mediado en la polimerización radical libre de metacrilato metílico (Kalra, B.; Gross, R.A.: Green Chemistry, 2002, 4, 174-178). La reacción puede se realizada en un agua a temperatura ambiente. Como ejemplo, la polimerización mediada por HPR de acrilato de sodio realizada en medio acuoso produjo poli(acrilato de sodio) en rendimientos de hasta 88% durante 24 horas con un peso molecular PM de aproximadamente 119 kDa.

En una forma de realización particular la enzima es una de las peroxidasa de rábano, peroxidasa de soja, y peroxidasa de lignina.

En una forma de realización particular la enzima es una enzima recombinante.

En una forma de realización particular la enzima es una enzima termofílica.

En una forma de realización particular la enzima es una enzima mesofílica.

En una forma de realización particular de la presente invención un método para la polimerización/reticulación del producto de ácido hialurónico acrilatado de la presente invención comprende la combinación de:

a): el producto de ácido hialurónico acrilatado según la reivindicación 1;

b): una fuente de peróxido;

c): un iniciador;

d): una enzima, y

e): un solvente.

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Una fuente de peróxido útil en el presente método puede ser cualquier compuesto con un enlace oxígeno-oxígeno, tal como el peróxido de benzoilo, peróxidos de metal alcali y alcalino-térreos, mono- y dialquilperóxidos, peróxido de hidrógeno éter bis-TMS, perácidos orgánicos e inorgánicos, o peróxido de hidrógeno. Los reactivos que generan un compuesto que tiene un enlace oxígeno-oxígeno en las condiciones de reacción, también son fuentes de peróxido según el término usado aquí. Se prefiere el peróxido de hidrógeno porque genera sólo agua como subproducto.

En una forma de realización particular de la presente invención la fuente de peróxido puede ser peróxido de hidrógeno o peróxido de alquilo.

En una forma de realización particular de la presente, el producto de ácido hialurónico acrilatado es uno de los ésteres de metacrilato, ésteres de acrilato, acrilamida, estireno, y ácido acrílico y sales de éstos.

En una forma de realización particular de la presente invención el iniciador es un compuesto de beta-dicarbonilo o beta-diquetona.

En una forma de realización particular el solvente es agua o un solvente orgánico, o mezclas de éstos.

En una forma de realización particular la polimerización/reticulación se realiza en una atmósfera inerte.

Ejemplos Ejemplo 1

Ácido hialurónico de alto peso molecular (700,000-1,000,000 dalton, 50 mg) se disolvió en agua desionizada
(25 ml). La temperatura se redujo a 0ºC.

A la solución anterior se añadió una gota de 0.33 N NaOH. El pH cambió de 5.4 a 9.5. la solución se agitó en este pH durante 30 minutos. Se preparó una mezcla en cantidades similares de cloruro de acriloilo (100-500 uL) y de diclorometano (100-500 ml). Se añadió gota a gota durante una hora a la mezcla reactiva del ácido hialurónico. Durante la adición gota a gota de cloruro de acriloilo, el pH se mantuvo entre 8-9 por adición gota a gota de 1 N-5 N NaOH.

Después de la adición completa de cloruro de acriloilo, la solución se dispuso en agitación durante otra hora. A lo largo de la reacción se mantuvo la temperatura baja (0-5ºC). Se filtró. El filtrado fue precipitado usando una gran cantidad de etanol frío (500 ml-1000 ml) y lavado con etanol. Este fue centrifugado, dializado y liofilizado.

Ejemplo 2

El ácido hialurónico de alto peso molecular (700,000-1,000,000 dalton, 50 mg) fue disuelto en 0,25-2,0 M de tampón de fosfato (25 ml) con un pH 8,0. La temperatura se redujo a 0ºC. La solución fue agitada en este pH durante 30 minutos. Una mezcla de cantidades similares de cloruro de acriloilo (100-500 uL) y diclorometano (100-500 ml) se añadió gota a gota durante una hora a la mezcla reactiva de ácido hialurónico. Después de la adición completa de cloruro de acriloilo, la solución se dispuso en agitación durante otra hora. A lo largo de la reacción se mantuvo la temperatura baja (0-5ºC). El producto resultante fue filtrado. El filtrado fue precipitado usando una gran cantidad de etanol frío (500 ml-1000 ml) y lavado con etanol. Este fue centrifugado, dializado y liofilizado.

Ejemplo 3

El ácido hialurónico de alto peso molecular (700,000-1,000,000 dalton, 50 mg) fue disuelto en agua desionizada (25 ml). La temperatura se redujo a 0ºC.

A la solución más arriba se añadió una gota de 0.33 N NaOH. El pH cambió de 5.4 a 9.5. la solución fue agitada en este pH durante 30 minutos. Se añadió cloruro de acriloilo (100-500 uL) gota a gota usando una bomba de jeringa. La proporción de adición de cloruro de acriloilo fue de 500-2000 uL/hr. El pH se mantuvo entre 8-9 por adición gota a gota de 1 N-5 N NaOH.

Después de la adición completa de cloruro de acriloilo, la solución fue dispuesta en agitación durante una hora. A través de la reacción se mantuvo la temperatura baja (0-5ºC). La mezcla de reacción fue filtrada. El filtrado fue precipitado usando una gran cantidad de etanol frío (500 ml-1000 ml) y lavado con etanol. Este fue centrifugado, dializado y liofilizado.

Con el uso del proceso más arriba, se consiguieron distintos derivados de ácido hialurónico acrilatado con un porcentaje variable de acrilación por tratamiento con cantidades variables de cloruro de acriloilo usadas para la acrilación. El % de acrilación se calculó por comparación de la señal a 2.02 (3H, -NHCOCH_{3}) y 5.6 (1H, protón H_{A} de la fracción acrílica introducida tal como se muestra a continuación):

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Como ejemplo, 50 mg de AH (0.125 mmol) en 25 ml de agua desionizada en tratamiento con 120 microlitros de cloruro de acriloilo (1.48 mmol) produjo 17% de acrilación. Usando la misma concentración de AH (0.125 mmol) y un tratamiento con una cantidad más alta de cloruro de acriloilo (250 microlitros, 3.07 mmol) produjo 34% de acrilación. Para conseguir una acrilación más alta, el AH (0.125 mmol) fue tratado con 500 microlitros de cloruro de acriloilo (6.15 mmol) que produjo 90% de acrilación de ácido hialurónico. Este es el % de acrilación más alto obtenido sin usar ningún agente de acoplamiento. Un % más alto de acrilación se obtiene debido a la alta reactividad del cloruro de acriloilo con hidroxilos primarios de AH. Los rendimientos de los productos modificados son superiores al 90%.

Ejemplo 4

Se uso una ^{1}H RMN (Varian-300) para determinar la funcionalidad final y la pureza del ácido hialurónico acrilatado (en D_{2}O). Las muestras estaban en ^{2}H_{2}O con el valor máximo ^{2}HOH en 4.79 ppm usado como la línea de referencia. La RMN de protón del ácido hialurónico acrilatado reveló distintos valores máximos de acrilo en (5.66 ppm, 1H y 6.04 ppm, 2H). El valor máximo en 5.66 ppm aparece como un doblete de doblete (11 Hz y 2 Hz). Debido al acoplamiento cis de H_{A} a través del enlace doble al protón H_{x} cerca del grupo carbonilo, se consigue una constante de acoplamiento de (11 Hz). También se acopla geminalmente al protón H_{M} y se observa una constante de acoplamiento de 2 Hz. Los protones H_{M} y H_{x} aparecen en 6.04 ppm. Una constante de acoplamiento de 17 Hz y 13 Hz se observa debido al acoplamiento de H_{x} a (trans-) H_{M} a través del enlace doble y del acoplamiento de H_{x} a (cis-) H_{A} a través del enlace doble. De forma similar se observan pares de protones (trans-) HM a través del enlace doble al protón H_{x} y una constante de acoplamiento de 17 Hz. Como los protones H_{M} y Hx aparecen en la misma región (6.04 ppm) y debido a la baja proporción de \Delta\nu/J, no es posible resolver todas las constantes de acoplamiento. El grado de modificación se determinó a partir de las integraciones relativas del acrilato de los protones de N-acetil del ácido hialurónico
(-NHCOCH_{3}, 3H, 2.0 ppm).

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. A pesar de que se ha confeccionado con la mayor diligencia; la OEP no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Bibliografía de patentes citada en la descripción

US 6951743 B [0002]

WO 030175902 A [0002]

WO 9822598 A [0019]

US 5891701 A [0020]

Bibliografía distinta de patentes citada en la descripción

- Leach; Schmidt Biomaterials, 2005, vol. 26, 125-135 [0005]

- Yonese et al. Chem. Pharm. Bull, 2002, vol. 50, 1341-1348 [0005]

- Schmidt et al. Biotechnology and Bioengineering, 2003, vol. 82, no. 5. 578-589 [0005]

- Yonese Journal of Controlled Release, 2001, vol. 73, 173-181 [0006]

- Tirelli et al. Biomaterials, 2003, vol. 24, 893-900 [0007]

- Kim Park Journal of Controlled Release, 2002, vol. 80, 69-77 [0007]

- Smeds Grinstaff Journal of Biomedical Materials Research, 2001, vol. 54, 115-121 [0008]

- Langer et al. Biomacmmotecules, 2005, vol. 6, 386-391 [0008]

- Ueno et al. Chem. Pharm. Bull., 1988, vol. 36, 4971-4975 [0021]

- Wyatt Anal. Chim. Acta, 1993, vol. 272, 1-40 [0021]

- Technologies Wyatt Light Scattering University DAWN Course Manual 1999. [0021]

- Watt DAWN EOS Manual Technology Corporation [0021]

- Kalra, B. Gross, R.A. Green Chemistry, 2002, vol. 4, 174-178 [0047]

Claims

1. Proceso para la preparación de un producto de ácido hialurónico acrilatado comprendiendo las fases siguientes que consisten en:

a): preparar un líquido acuoso comprendiendo ácido hialurónico donde el pH se mantiene en un pH adecuado;

b): preparar un líquido orgánico comprendiendo cloruro de acriloilo y un solvente orgánico; y

c): mezclar el líquido orgánico de (b) y el líquido acuoso de (a), donde el pH se mantiene en un pH adecuado.

2. Proceso según la reivindicación 1, donde la mezcla en la fase c) es realizada por agitación.

3. Proceso según la reivindicación 1, donde la fase a) es mantenida a un pH entre 7 y 11.

4. Proceso según la reivindicación 1, donde el líquido acuoso de la fase a) comprende un tampón de fosfato.

5. Proceso según la reivindicación 4, donde el tampón de fosfato está presente en una cantidad entre 0.1 molar a 1 molar.

6. Proceso según la reivindicación 1, donde la fase c) es mantenida a un pH entre 7 y 11.

7. Proceso según la reivindicación 1, donde la fase c) es mantenida a un pH entre 7 y 11 mediante el uso de un tampón y/o la adición gota a gota de NaOH diluido.

8. Proceso según la reivindicación 1, donde la temperatura es mantenida entre 0ºC y 15ºC durante la fase a).

9. Proceso según la reivindicación 1, donde la temperatura es mantenida entre 0ºC y 5ºC durante la fase c).

10. Proceso según la reivindicación 1, donde el pH del líquido acuoso de la fase a) es ajustado por adición de NaOH gota a gota.

11. Proceso según la reivindicación 1, donde el pH del líquido acuoso de la fase a) es ajustado por un tampón y/o adición de NaOH gota a gota.

12. Proceso según la reivindicación 1, donde la adición de cloruro de acriloilo en la fase c) se consigue mediante el uso de una bomba de jeringa.

13. Proceso según la reivindicación 1, comprendiendo también una fase de recuperación.

14. Proceso según la reivindicación 13, donde la fase de recuperación comprende una fase de precipitación.

15. Proceso según la reivindicación 13, donde la fase de recuperación comprende también una fase de filtración de la mezcla reactiva y una precipitación del filtrado.