ES2338340T3 - Proceso para determinar los parametros de enlace de reacciones de enlace de bioafinidad. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para determinar parámetros de enlace, incluyendo constantes de disociación y constantes de velocidad de sorción, del enlace entre una biomolécula y una pareja de enlace de la misma, estando ambas presentes en una fase líquida, y comprendiendo una etapa de enlazamiento sin marcador, caracterizado por las siguientes etapas: (a) fijar (a1) la pareja de enlace, o (a2) la biomolécula, a una superficie sólida; (b) permitir el enlazamiento entre la pareja de enlace y la biomolécula, tanto en la fase líquida como sobre la superficie sólida; (c) fijar un marcador a: (c1) la biomolécula, si dicha pareja de enlace se ha fijado a la superficie sólida de acuerdo con la etapa (a1), o a (c2) la pareja de enlace, si dicha biomolécula se ha fijado a la superficie sólida de acuerdo con la etapa (a2); (d) permitir que el marcador dé lugar a un precipitado; (e) detectar dicho precipitado a medida que se forma sobre dicha superficie sólida, determinando un cambio de la masa superficial en la superficie sólida debido a la formación de dicho precipitado; (f) determinar las concentraciones libres de la pareja de enlace o la biomolécula en la fase líquida comparando la velocidad de formación del precipitado con una curva estándar, y (g) calcular las constantes de enlace a partir de las concentraciones libres de la pareja de enlace o la biomolécula determinadas de este modo.
Description
Proceso para determinar los parámetros de enlace
de reacciones de enlace de bioafinidad.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para determinar parámetros de enlace, incluyendo
constantes de disociación y constantes de velocidad de sorción, del
enlace entre una biomolécula y una pareja de enlace de la misma,
estando ambas presentes en una fase líquida, y comprendiendo una
etapa de enlazamiento sin marcador.
Los procedimientos para determinar los
parámetros de enlace del enlazamiento libre de marcador entre
biomoléculas y sus parejas de enlace son generalmente conocidos en
la técnica. Haake, H.M., Schütz, A. en Gauglitz, G., Fresenius, J.
Anal. Chem. (2000) 366: 576-585, proporcionan una
notable revisión de los mismos.
Tal como es generalmente conocido en el estado
de la técnica, la constante de disociación (abreviada como K_{d})
de un enlace particular se define como la relación entre la llamada
"constante de velocidad de activación de sorción" (abreviada
como k_{on}) y la "constante de velocidad de desactivación de
sorción" o constante de velocidad de desorción (abreviada como
k_{off}), y se puede expresar mediante la ecuación K_{d} =
k_{off}/k_{on}.
En el contexto de la presente invención, el
término "biomolécula" se define como una molécula de origen
biológico, tales como, aunque sin limitarse a las mismas, una
proteína, ácido nucleico, lípido, hidrato de carbono, esteroide y
prostaglandina, la cual se forma in vivo o in vitro, y
que, en el último caso, es idéntica o equivalente a la forma
natural de dicha biomolécula, presentando la misma habitualmente,
aunque no necesariamente, una actividad biológica o
fisiológica.
En el contexto de la presente invención, el
término "pareja de enlace" se define como una molécula que
presenta una afinidad, y hasta cierto grado también especificidad,
por una biomolécula particular. Habitualmente, aunque no
necesariamente, la pareja de enlace es un compuesto orgánico de bajo
peso molecular (por ejemplo, un esteroide, siendo la biomolécula
una proteína receptora de superficie celular; o una molécula de
substrato orgánico, siendo la biomolécula una enzima); sin embargo,
la propia pareja puede ser también una biomolécula (por ejemplo, un
anticuerpo, que esencialmente es una proteína, siendo la biomolécula
un antígeno que, a su vez, puede ser una proteína).
Esencialmente, los métodos según la técnica
anterior (FÄGERSTAM y otros (1992), J. Chromatog., 597,
397-410; WO-A- 03/056296) miden el
enlazamiento de una biomolécula (tal como un anticuerpo) sobre
superficies sólidas recubiertas con una pareja de enlace para una
biomolécula (tal como un antígeno) en soluciones tampón.
Habitualmente, la superficie se recubre, por ejemplo, con la
biomolécula, ya sea por acoplamiento covalente o por adsorción
física. A continuación, el valor de K_{d} se estima para una serie
de concentraciones crecientes de la pareja de enlace, esencialmente
como la concentración para la cual el enlace es la mitad del máximo.
Alternativamente, el valor para la constante de velocidad de
adsorción (k_{on}) se estima a partir de la fase inicial de
adsorción, y el valor para la constante de velocidad de desorción
(k_{off}) se estima a continuación eliminando la pareja de enlace
(por ejemplo, mediante lavado o enjuagado) y midiendo de algún modo
la desorción.
Sin embargo, los procedimientos según la técnica
anterior para determinar los parámetros de enlace presentan
diversas desventajas, particularmente en el caso en que los valores
de K_{d} son menores de 10^{-9} M. En primer lugar, incluso
para la adsorción limitada por el transporte de la pareja de enlace
(que generalmente no se alcanza), la adsorción de la pareja de
enlace conlleva en la práctica demasiado tiempo cuando las
concentraciones de dicha pareja de enlace están dentro del
intervalo 10^{-10} M - 10^{-11} M. En segundo lugar, debido a
los elevados valores de k_{on} involucrados, la adsorción renovada
de la pareja de enlace durante el enjuagado o lavado (que se
requiere para cada concentración de biomolécula o pareja de enlace)
resulta significativa, y la llamada "k_{off} aparente"
(abreviada como k_{off,app}) se vuelve mucho menor que el valor de
la k_{off} real. Además, las interacciones débiles y no
específicas de las moléculas de pareja de enlace adsorbidas con la
superficie pueden interferir negativamente en la desorción, incluso
hasta el punto de que el enlace se vuelve prácticamente
irreversible.
Existe la necesidad de un procedimiento que esté
menos sujeto, o preferentemente no lo esté en absoluto, a las
limitaciones mencionadas anteriormente con respecto a las mediciones
cuando las constantes de disociación son menores de 10^{-9} M.
Además, existe una necesidad de un procedimiento para determinar los
parámetros de enlace del enlazamiento entre una biomolécula y una
pareja de enlace de la misma que comprenda menos etapas y, en
consecuencia, resulte menos laborioso y fatigoso que el método según
la técnica anterior.
El procedimiento para determinar parámetros de
enlace según la presente invención es un procedimiento tal como se
reivindica en las reivindicaciones 1 a 15 y se caracteriza por las
siguientes etapas:
- (a)
- fijar (a1) la pareja de enlace o (a2) la biomolécula, a una superficie sólida;
- (b)
- permitir el enlazamiento entre la pareja de enlace y la biomolécula, tanto en la fase líquida como sobre la superficie sólida;
- (c)
- fijar un marcador a: (c1) la biomolécula, si dicha pareja de enlace se ha fijado a la superficie sólida según la etapa (a1), o a (c2) la pareja de enlace, si dicha biomolécula se ha fijado a la superficie sólida según la etapa (a2);
- (d)
- permitir que el marcador dé lugar a un precipitado; y
- (e)
- detectar dicho precipitado a medida que se forma sobre dicha superficie sólida, determinando un cambio de la masa superficial en la superficie sólida debido a la formación de dicho precipitado.
\vskip1.000000\baselineskip
La superficie sólida se utiliza como herramienta
de medición cuando se mide el equilibrio de enlace en la fase
líquida. La pareja de enlace o la biomolécula se fijan a una
superficie sólida pretratada (etapa a). La cantidad de enlazamiento
a la superficie por parte de la pareja de enlace (o,
respectivamente, la biomolécula) es una medida de la concentración
libre de la pareja de enlace (o, respectivamente, la biomolécula) en
la fase líquida (etapa b). La amplificación de la señal resulta
necesaria para medir las concentraciones, a menudo muy bajas, y la
misma se alcanza fijando un marcador a la biomolécula (o,
respectivamente, a la pareja de enlace) (etapa c). El enlace en sí
está libre de marcador (evitándose de este modo los cambios
inducidos por el marcador en las afinidades de enlazamiento y un
posible error en la estimación de la constante de disociación). A
continuación, se deja que el marcador dé lugar a un precipitado
(etapa d) y la velocidad de formación de dicho precipitado sobre la
superficie sólida se detecta determinando un cambio de masa
superficial en la superficie sólida debido a la formación de dicho
precipitado.
Una ventaja del presente procedimiento consiste
en que, dado que el precipitado se detecta determinando un cambio
de la masa superficial en la superficie sólida, únicamente el
substrato convertido directamente en la superficie contribuye a la
formación de precipitado. Los pequeños agregados de substrato
convertido en la fase líquida no interfieren en la medición. Este
hecho conduce a un así denominado procedimiento de ensayo en una
etapa para determinar los parámetros de enlace, desprovisto de las
laboriosas y fatigosas etapas de lavado o enjuagado, obligatorias
cuando se utilizan los procedimientos según la técnica anterior.
Según la presente invención, el equilibrio se obtiene de forma
bastante rápida. La concentración de pareja de enlace libre (o
biomolécula libre) se puede determinar comparando la velocidad de
formación del precipitado con una curva estándar. A partir de las
concentraciones libres medidas de este modo, se calculan las
constantes de enlace. Una importante ventaja del procedimiento
según la presente invención consiste en que las concentraciones
libres se pueden medir mientras están en equilibrio con complejos de
la biomolécula y la pareja de enlace de la misma. De este modo, las
interacciones no específicas mencionadas anteriormente, así como los
problemas derivados de las diferencias entre las constantes de
sorción reales y las constantes de sorción aparentes, que pueden
dar lugar a errores considerables, se evitan al aplicar el
procedimiento según la presente invención. Finalmente, y tal como
se ilustra a continuación, el área de superficie de la presente
superficie sólida según la presente invención se puede mantener muy
pequeña, impidiéndose cualquier influencia significativa de la
adsorción de proteínas en la concentración de proteína libre.
Una realización preferente de la presente
invención se refiere a un procedimiento para determinar los
parámetros de enlace, en el que la biomolécula es una enzima y la
pareja de enlace es un inhibidor o un substrato de la misma. Según
otra realización preferente, la biomolécula es una proteína de
membrana celular y la pareja de enlace es un ligando de la misma.
Preferentemente, dicha proteína de membrana celular es un receptor.
Según otra realización de la presente invención, la biomolécula es
una proteína de membrana celular y la pareja de enlace es una
estructura de membrana celular. Preferentemente, dicha estructura de
membrana celular es artificial, y, según una realización
particular, dicha estructura de membrana celular es una célula
completa.
Una variante preferente de la presente invención
se refiere a un procedimiento en el que la biomolécula es un
anticuerpo o un fragmento del mismo, y la pareja de enlace es un
antígeno de dicho anticuerpo o fragmento. Preferentemente, el
marcador del presente procedimiento es una enzima que produce un
precipitado a partir de un substrato soluble.
Son realizaciones particularmente preferentes de
la presente superficie sólida (i) una placa de silicio, y (ii) un
vidrio recubierto de cromo por pulverización catódica.
Aunque la etapa (e) según el presente
procedimiento se puede llevar a cabo de diversas maneras, resulta
preferente que la determinación del cambio de masa superficial se
lleve a cabo por elipsometría. Sin embargo, para llevar a cabo el
método según la presente invención, se pueden aplicar otras técnicas
analíticas para la determinación del cambio de masa superficial,
por ejemplo una técnica de análisis basada en el principio de
Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) o de Fluorescencia de
Reflexión Interna Total (TIRF). Mediante ambas técnicas (SPR y
TIRF), pero en particular con la técnica SPR, se pueden alcanzar
resultados similares.
Preferentemente, la etapa de determinación del
cambio de masa superficial se lleva a cabo sobre un área de
superficie menor de 3,0 mm^{2}.
De acuerdo con una realización particular del
presente procedimiento, la constante de disociación es menor de
10^{-9} M, y particularmente está comprendida dentro del intervalo
10^{-9} M - 10^{-13} M.
Además, se da a conocer una placa para llevar a
cabo el presente procedimiento. Dicha placa debe estar recubierta
con una capa absorbente de proteínas, preferentemente un polímero
sintético. Preferentemente, dicha placa se corta a partir de una
oblea de silicio dopada con fósforo y recubierta con sílice, y se
recubre con una capa de PVC o una capa de poliestireno. Resulta
preferente que la capa de PVC tenga un grosor de
10-30 nm. Según otra realización preferente de la
placa mencionada anteriormente, la misma se recubre con una capa de
silano, que presenta preferentemente un grosor de
1-5 nm. Las placas se pueden modificar a efectos de
permitir la fijación de una biomolécula o una pareja de enlace. Una
placa preferente se caracteriza porque se corta partir de una oblea
de silicio dopada con fósforo y recubierta con sílice, y se modifica
mediante la fijación de una molécula con un grupo amino. A
continuación, el grupo amino está disponible para el enlace
covalente de la biomolécula o la pareja de enlace de la misma,
mediante un tratamiento con
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato
(SPDP).
Finalmente, también se da a conocer un kit para
llevar a cabo el procedimiento según la presente invención, que
comprende, como mínimo, una superficie sólida que consiste en placas
de silicio o vidrio recubierto con cromo por pulverización
catódica, y una pareja de enlace marcada o una biomolécula marcada.
Preferentemente, dicho kit contiene también un estándar de la
pareja de enlace o la biomolécula que se pretende determinar.
Además, se da a conocer un kit para llevar a cabo el procedimiento
según la presente invención, que comprende, como mínimo, una
superficie sólida capaz de inmovilizar la biomolécula o su pareja de
enlace, o con la biomolécula o su pareja de enlace ya enlazada. En
una realización particular, la biomolécula o su pareja de enlace es
un anticuerpo monoclonal murino, y el marcador es un anticuerpo
secundario marcado con HRP que se enlaza a los anticuerpos
monoclonales de ratón. Preferentemente, el kit comprende, como
mínimo, una superficie sólida que consiste en placas de silicio o
vidrio recubierto con cromo por pulverización catódica, así como un
marcador que se enlaza a cualquier anticuerpo utilizado como pareja
de enlace de una biomolécula que ha sido absorbida previamente
sobre la placa. En algunas realizaciones particulares, se utilizan
proteína A o proteína G marcadas con HRP como marcadores.
La presente invención se puede utilizar para
estudiar diferentes tipos de interacciones, como por ejemplo (i) la
interacción entre una proteína y una membrana (o componente de
membrana), (ii) la interacción entre una enzima y un inhibidor de
la misma, (iii) la interacción entre un receptor enlazado a membrana
y un ligando para dicho receptor, y (iv) la interacción entre un
anticuerpo y un antígeno.
A continuación, la presente invención se ilustra
mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
La figura 1 muestra un ejemplo de la
determinación de la constante de disociación de una interacción
proteína-membrana;
la figura 2 muestra un ejemplo de la
determinación de la constante de disociación de una interacción
enzima-inhibidor en el intervalo habitual de
valores;
la figura 3 muestra la determinación de la
constante de disociación para el complejo
IL6-\alpha126.16 en plasma sanguíneo, en el
intervalo de constantes de alta afinidad;
las figuras 4a-4b muestran
ejemplos de la determinación de las constantes de enlace de
\alpha-IL6.16.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon pequeñas vesículas unilamelares
(SUV) por sonicación de una mezcla de fosfolípidos de 20% de
dioleoilfosfatidilserina (DOPS) y 80% de dioleoilfosfatidilcolina
(DOPC). Se añadieron diversas concentraciones
(25-500 nM) de factor bovino II purificado a 0,05 mM
(fosfolípido total) de SUV en 0,05 M de tampón
tris-HCl (pH 7,5), que contiene 0,1 M de NaCl, 3 mM
de CaCl_{2}, 0,5 g/l de albúmina de suero bovino y 100 ng/ml de
un conjugado de factor antibovino II de conejo-HRP.
Las superficies de sílice se recubrieron con bicapas de fosfolípido
mediante exposición previa de las placas a SUV 0,020 mM. Las
concentraciones libres de factor II se midieron por elipsometría a
partir de las velocidades de precipitación tras la adición de
substrato DAB-H_{2}O_{2}, utilizando un
elipsómetro comercialmente disponible
(EL-X-02C, Dr. Riss Ellipsometerbau,
GmbH, Ratzeburg, Alemania). Los resultados se muestran en la figura
1 y se obtuvo un valor de K_{d} = 123 \pm 21 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó FABP como antígeno y se utilizó
anti-FABP (53E9) monoclonal como anticuerpo
correspondiente. Ambos fueron cedidos amablemente por el profesor
J. Glatz, Departamento de Fisiología, CARIM. Se ha documentado que
la constante de disociación K_{d} de este anticuerpo es de 13,5 nM
(Roos y otros, J. Immunol. Met. (1995) 183:
149-153). Se incubó FABP (0,67 nM) durante 30
minutos con diversas concentraciones de anticuerpo 53E9, hasta que
se estableció el equilibrio en la solución madre (figura 2). A
continuación, se estimaron las concentraciones de FABP libres
mediante mediciones cortas (10 min) de la velocidad de precipitación
sobre superficies de sílice con áreas de superficie pequeñas
recubiertas con un atrapador de 53E9, y otro anticuerpo marcado con
HRP contra FABP (118 ng/ml). Es importante que el equilibrio en la
fase líquida no se vea alterado por este último procedimiento. En
consecuencia, se midieron las concentraciones de FABP libre sin
necesidad de lavado (procedimiento en una sola etapa) a partir de
la velocidad de formación de precipitado tras la adición de
substrato DAB-H_{2}O_{2}. La constante de
disociación K_{d} de la interacción FABP-53E9
determinada de este modo fue de 8 nM.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos anti-IL6 humana
de alta afinidad fueron amablemente cedidos por el profesor L.
Aarden, Sanquin Research, Ámsterdam. Se incubó plasma (diluido 5
veces) durante 60 minutos con diversas concentraciones del
anticuerpo anti-IL6 humana monoclonal de alta
afinidad \alphaIL6.16, tal como se indica en la figura 3. El
medio se puso en contacto durante 120 min adicionales con una placa
de silicio recubierta con \alphaIL6.16. A continuación, se llevó
a cabo un procedimiento en una etapa según la presente invención a
efectos de determinar la concentración de IL6 libre. El valor de la
constante de disociación K_{d} deducido de la curva simulada
(figura 3) fue de 24 pM.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, se incubó IL6 (4 pM) con
\alphaIL6.16 (30 pM) durante diversos intervalos de tiempo, tal
como se indica en la figura 4a. A continuación, el medio se incubó
durante 10 min adicionales con una placa de silicio recubierta con
\alphaIL6.16. A continuación, se llevó a cabo el procedimiento en
una etapa según la presente invención a efectos de determinar la
concentración de IL6 libre. Los valores de K_{d}, k_{on} y
k_{off} calculados a partir de la curva simulada fueron de 29 pM,
6,8 10^{6} M^{-1}s^{-1} y 0,00020 s^{-1},
respectivamente.
Aplicando un procedimiento "inverso", en
primer lugar se preincubó IL6 (400 pM) con \alphaIL6.16 (1 nM)
durante 50 minutos. A continuación, el medio de preincubación se
diluyó 100 veces. Tras diversos intervalos de tiempo, el medio se
puso en contacto durante 10 minutos adicionales con una placa de
silicio recubierta con \alphaIL6.16. A continuación, se llevó a
cabo el procedimiento en una etapa según la presente invención a
efectos de determinar la concentración de IL6 libre. Los valores de
K_{d}, k_{on} y k_{off} calculados a partir de la curva
simulada (figura 4b) fueron de 25 pM, 6,3 10^{6} M^{-1}s^{-1}
y 0,00016 s^{-1}, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon diversas placas
(5.1-5.4) del modo siguiente.
- 5.1.
- Se recubrieron placas cortadas a partir de obleas de silicio dopadas con fósforo y recubiertas con sílice con capas de PVC con un grosor de 10-30 nm. Esto se llevó a cabo por retracción de la placa de una solución de PVC en ciclohexanona a velocidades controladas, utilizando un dispositivo de inmersión mecánico.
- 5.2.
- Se recubrieron placas cortadas a partir de obleas de silicio dopadas con fósforo y recubiertas con sílice con capas finas de silano (1-5 nm), utilizando Sigmacote® y un protocolo según las indicaciones del fabricante.
- 5.3.
- Se sometieron a terminación con grupos amino placas cortadas a partir de obleas de silicio dopadas con fósforo y recubiertas con sílice mediante inmersión en una solución de (3-aminopropil)trietoxisilano (Sigma) en acetona. Utilizando el reactivo N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), dichas placas se utilizaron para el enlazamiento covalente de anticuerpos.
- 5.4.
- Se acopló covalentemente estreptavidina a las placas terminadas con grupos amino preparadas tal como se ha descrito en el punto 5.3. Dichas placas se utilizaron para el enlazamiento covalente de anticuerpos biotinilados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los kits (6.1 y 6.2) se montaron del modo
siguiente.
- 6.1.
- Se montó un kit que comprendía un anticuerpo marcado con HRP adecuado del modo siguiente. Ocho placas altamente hidrofóbicas, preparadas tal como se ha descrito en el ejemplo 5 (5.1), junto con anti-FABP humano 66E2 marcado con HRP (marcador), un estándar de FABP humano recombinante, tampón de bloqueo, y substrato de HRP formador de precipitado (DAB+H_{2}O_{2}). Para utilizar este kit, los anticuerpos anti-FABP que se pretenden caracterizar deben estar acoplados a las placas mediante incubación durante toda la noche en 2 mg/l de anticuerpo a 4ºC. A continuación, las placas se deben incubar en tampón de bloqueo. Se preincubó una cantidad conocida de FABP durante 30 minutos con cinco concentraciones diferentes de anticuerpo y, a continuación, se introdujeron en celdas de elipsómetro, que contenían las placas. Utilizando el procedimiento en una etapa según la presente invención, incluyendo tres calibradores, se pueden medir las cantidades de FABP libre. El kit también contiene dos placas extra, a las que se debe acoplar FABP, a efectos de comprobar que el anticuerpo que se pretende caracterizar no compite con la etiqueta 66E2 anti-FABP.
- 6.2.
- Se montó un kit que comprendía una IgG policlonal anti-ratón del modo siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ocho placas de los tipos mencionados
anteriormente 5.1-5.4 (ejemplo 5), que permiten el
acoplamiento pasivo o covalente del antígeno a dichas placas, IgG
anti-ratón marcada con HRP (marcador), tampón de
bloqueo, y substrato de HRP de precipitación (DAB +
H_{2}O_{2}).
Para utilizar este kit, el antígeno utilizado
por el usuario debe estar acoplado a las placas y, a continuación,
incubarse en tampón de bloqueo. Se debe preincubar una concentración
prefijada del anticuerpo que se pretende caracterizar con cinco
concentraciones diferentes de antígeno y, a continuación,
introducirse en celdas de un elipsómetro. A continuación, aplicando
el procedimiento en una etapa según la presente invención,
incluyendo tres calibradores, se pueden medir las cantidades de
anticuerpo libre.
Claims (15)
1. Procedimiento para determinar parámetros de
enlace, incluyendo constantes de disociación y constantes de
velocidad de sorción, del enlace entre una biomolécula y una pareja
de enlace de la misma, estando ambas presentes en una fase líquida,
y comprendiendo una etapa de enlazamiento sin marcador,
caracterizado por las siguientes etapas:
(a) fijar
- (a1)
- la pareja de enlace, o
- (a2)
- la biomolécula, a una superficie sólida;
(b) permitir el enlazamiento entre la pareja de
enlace y la biomolécula, tanto en la fase líquida como sobre la
superficie sólida;
(c) fijar un marcador a:
- (c1)
- la biomolécula, si dicha pareja de enlace se ha fijado a la superficie sólida de acuerdo con la etapa (a1), o a
- (c2)
- la pareja de enlace, si dicha biomolécula se ha fijado a la superficie sólida de acuerdo con la etapa (a2);
(d) permitir que el marcador dé lugar a un
precipitado;
(e) detectar dicho precipitado a medida que se
forma sobre dicha superficie sólida, determinando un cambio de la
masa superficial en la superficie sólida debido a la formación de
dicho precipitado;
(f) determinar las concentraciones libres de la
pareja de enlace o la biomolécula en la fase líquida comparando la
velocidad de formación del precipitado con una curva estándar, y
(g) calcular las constantes de enlace a partir
de las concentraciones libres de la pareja de enlace o la
biomolécula determinadas de este modo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la biomolécula es una enzima y la pareja
de enlace es un inhibidor o un substrato de la misma.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la biomolécula es una proteína de
membrana celular y la pareja de enlace es un ligando de la
misma.
4. Procedimiento, según la reivindicación 3,
caracterizado porque la proteína de membrana celular es un
receptor.
5. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la biomolécula es una proteína de
membrana celular y la pareja de enlace es una estructura de
membrana celular.
6. Procedimiento, según la reivindicación 5,
caracterizado porque la estructura de membrana celular es
artificial.
7. Procedimiento, según la reivindicación 5 o la
reivindicación 6, caracterizado porque la estructura de
membrana celular es una célula completa.
8. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la biomolécula es un anticuerpo o un
fragmento del mismo, y la pareja de enlace es un antígeno de dicho
anticuerpo o fragmento.
9. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el marcador es
una enzima que produce un precipitado a partir de un substrato
soluble.
10. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la superficie
sólida es una placa de silicio.
11. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la superficie
sólida es un vidrio recubierto de cromo por pulverización
catódica.
12. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la
determinación del cambio de masa de la superficie en la etapa (e)
se lleva a cabo por elipsometría.
13. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la etapa de
determinación de un cambio de masa de la superficie se lleva a cabo
sobre un área de superficie menor de 3,0 mm^{2}.
14. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la constante de
disociación es menor de 10^{-9} M.
15. Procedimiento, según la reivindicación 14,
caracterizado porque la constante de disociación está dentro
del intervalo 10^{-9} M - 10^{-13} M.
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