JP2008501106A - 生体親和性結合反応の結合パラメーターを決定するための方法及びキット - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
(a)固体表面に、(a1)結合パートナー又は(a2)生体分子のいずれかを固定すること、
(b)液相中及び固体表面上の両方において結合パートナーと生体分子の間の結合を許すこと、
(c)もし該結合パートナーが段階(a1)に従い固体表面に固定されていたならば(c1)生体分子に、又はもし該生体分子が段階(a2)に従い固体表面に固定されていたならば(c2)結合パートナーにマーカーを結合させること;
(d)マーカーが沈殿物を生成することを許すこと;及び
(e)該沈殿物の形成による固体表面上の表面物質量(surface mass)の変化を測定することにより、該固体表面上に沈殿物が形成されたまま、該沈殿物を検出すること、
を特徴とする。
小型単層のベシクル(SUV)が、20%ジオレオイル−ホスファチジルセリン(DOPS)及び80%のジオレオイル−ホスファチジルコリン(DOPC)のリン脂質混合物の超音波処理により製造された。種々の濃度(25〜500nM)の精製されたウシ因子IIが、0.1MのNaCl,3mMのCaCl2,0.5g/lのウシ血清アルブミン、及び100ng/mlのウサギ抗ウシ因子II−HRP共役(rabbit anti-bovine factor II-HRP conjugate)を含む0.05MトリスHCl緩衝液(pH7.5)中の0.05mM(合計のリン脂質)のSUVに添加された。シリカ表面は、0.020mMのSUVへのスライドの前暴露により、リン脂質二重膜で被覆された。因子IIの遊離濃度は、市販入手可能なエリプソメーター(EL-X-02C、Dr. Riss Ellipsometerbau、GmbH、Ratzeburg、ドイツ)を使用して、DAB−H2O2基質の添加後の沈殿速度から偏光解析法により測定された。結果は、図1に示され、Kd=123±21nMの値が得られた。
FABPが抗原として使用され、モノクロナール抗FABP(53E9)が対応する抗体として使用された。両方ともカリム研究所(CARIM)の生理学科のJ.Glatz博士の寄贈品であった。この抗体の解離定数Kdは、1.35nMであることが報告されている(Roos等、J.Immunol.Meth.(1995年)、第183巻:149〜153ページ)。FABP(0.67nM)は、バルク溶液における平衡が確立されるまで、種々の濃度の抗体53E9と共に、30分間インキュベートされた(図2)。次に、遊離のFABPの濃度が、53E9キャッチャー、及び別のHRPでマークされたFABPに対する抗体(118ng/ml)で被覆された小さな表面積を有するシリカ表面上で沈殿の速度の短い測定(10分)により見積もられた。液相中の平衡は、後者の操作によって妨害されないことが重要である。従って、洗浄することなく(ワンステップ法)、遊離のFABP濃度が、DAB−H2O2基質の添加後の沈殿形成の速度から測定された。このようにして測定されたFABP−53E9相互作用の解離定数Kdは、8nMであった。
高親和性の抗ヒトIL6抗体は、アムステルダムのサンキン研究所のL.アーデン博士(L. Aarden, Sanquin Research, Amsterdam)の親切な寄贈であった。血漿(5倍希釈)は、図3に示されるように、種々の濃度の高親和性モノクロナール抗ヒトIL6抗体aIL6.16と共に、60分間インキュベートされた。培地は、αIL6.16で被覆されたシリコンスライドとさらに120分間、接触された。次に、本発明に従うワンステップ法が実行されて、遊離のIL6の濃度を測定した。シミュレーションされた曲線(図3)から推定された解離定数Kdの値は、24pMであった。
まず、図4aに示されるように、種々の時間間隔の間、IL6(4pM)がαIL6.16(30pM)とともにインキュベートされた。次に、培地はα―IL6.16で被覆されたシリコンスライドとともにさらに10分間インキュベートされた。次に、本発明に従うワンステップ法が行われて、遊離のIL6濃度を測定した。シミュレーションされた曲線から計算されたKd,Kon,及びKoffは、それぞれ29pM、6.8 106 M−1s−1及び0.00020s−1であった。
いくつかのスライド(5.1〜5.4)は以下のように作成された。
キット(6.1.及び6.2.)は、以下のように組み立てられた。
Claims (31)
- 共に液相に存在する生体分子とその結合パートナーの間の結合の、解離定数及び吸着速度定数を含む結合パラメーターを測定する方法であって、マーカーフリーの結合段階を含む方法において、以下の段階、
(a)固体表面に(a1)結合パートナー又は(a2)生体分子のいずれかを結合させること、
(b)液相中及び固体表面上の両方において結合パートナーと生体分子の間の結合を許すこと、
(c)もし該結合パートナーが段階(a1)に従い固体表面に固定されていたならば(c1)生体分子に、又はもし該生体分子が段階(a2)に従い固体表面に固定されていたならば(c2)結合パートナーに、マーカーを結合させること、
(d)マーカーが沈殿物を生成することを許すこと、及び
(e)該沈殿物の形成による固体表面上の表面物質量の変化を測定することにより、該固体表面上に沈殿が形成されたまま、該沈殿物を検出すること、
を含むことを特徴とする方法。 - 生体分子が酵素であり、結合パートナーがその阻害剤又は基質であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 生体分子が細胞膜タンパク質であり、結合パートナーがその配位子であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 該細胞膜タンパク質が受容体であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 生体分子が細胞膜タンパク質であり、結合パートナーは細胞膜構造であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 細胞膜構造が人工のものであることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 細胞膜構造が完全な細胞であることを特徴とする、請求項5又は6のいずれか1項に記載の方法。
- 生体分子が抗体又はそのフラグメントであり、結合パートナーが該抗体又はフラグメントの抗原であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- マーカーが、可溶性の基質から沈殿物を形成する酵素であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 固体表面がシリコンスライドであることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 固体表面が、クロムでスパッタされたガラスであることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 段階(e)の表面物質量の変化の測定が偏光解析法により行われることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 表面物質量の変化を測定する段階が、3.0mm2未満の表面積上で行われることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 解離定数が10−9Mより低いことを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 解離定数が10−9M〜10−13Mであることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 請求項1〜10又は請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法を行うためのスライド。
- スライドが、リンでドープされ、かつシリカで被覆されたシリコンウエハーから切り出され、かつタンパク質吸着性物質で被覆されていることを特徴とする、請求項16に記載のスライド。
- タンパク質吸着性物質が合成ポリマーであることを特徴とする、請求項17に記載のスライド。
- 合成ポリマーがPVCであることを特徴とする、請求項18に記載のスライド。
- 合成ポリマーがポリスチレンであることを特徴とする、請求項18に記載のスライド。
- PVC層が、10〜30nmの厚さを有することを特徴とする、請求項19に記載のスライド。
- スライドが、リンでドープされ、かつシリカで被覆されたシリコンウエハーから切り出され、かつシラン層で被覆されていることを特徴とする、請求項16に記載のスライド。
- シラン層が1〜5nmの厚さを有することを特徴とする、請求項22に記載のスライド。
- スライドが、リンでドープされ、かつシリカで被覆されたシリコンウエハーから切り出され、かつ生体分子又はその結合パートナーの化学結合を可能とする化学反応性の基を導入するように処理されたものであることを特徴とする、請求項16に記載のスライド。
- 反応性基がアミノ基であるところの、請求項24に記載のスライド。
- 結合が、N−スクシニミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)による処理で達成されることを特徴とする、請求項25に記載のスライド。
- シリコンスライド又はクロムでスパッタされたガラスからなる少なくとも1の固体表面、及びマークされた結合パートナー又はマークされた生体分子のいずれかを含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法を行うためのキット。
- 測定されるべき結合パートナー又は生体分子の標準をもまた含むことを特徴とする、請求項27に記載のキット。
- シリコンスライド又はクロムでスパッタされたガラスからなる少なくとも1の固体表面、並びにスライド上に前もって吸着されている生体分子の結合パートナーとして使用される任意の抗体に結合するマーカーを含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法を行うためのキット。
- マーカーが、結合パートナーとして使用される抗体と反応性のある、HRPでラベルされた抗体であるところの、請求項29に記載のキット。
- マーカーが、HRPでラベルされたタンパク質A又はHRPでラベルされたタンパク質Gであるところの、請求項29に記載のキット。
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