ES2337577T3 - Procedimiento para la preparacion de plantas transgenicas caracteriza das por resistencia duradera a los geminivirus. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de plantas transgenicas caracteriza das por resistencia duradera a los geminivirus. Download PDFInfo
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Abstract
Secuencia de genes V1/AR1/AV1 o C1/AL1/AC1 mutados de un geminivirus que infecta al tomate, en la que las mutaciones consisten en mutaciones puntuales distribuidas a lo largo de la secuencia de tal modo que la homología continua entre la secuencia mutada y la secuencia de genes virales correspondiente se encuentra por debajo de o es igual a 8 nucleótidos, preferentemente por debajo de o igual a 5 nucleótidos, codificando la citada secuencia mutada para una proteína de la cápside de tipo natural o para una proteína Rep truncada, respectivamente.
Description
Procedimiento para la preparación de plantas
transgénicas caracterizadas por resistencia duradera a los
geminivirus.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de plantas transgénicas de
resistencia duradera a los geminivirus.
De forma más en particular, la invención se
refiere a un procedimiento para la preparación de plantas
transgénicas de resistencia duradera a los geminivirus, en el que
el transgen consta de una secuencia de polinucleótidos, procedente
del patógeno, modificada de forma adecuada a efectos de dar como
resultado una diana ineficaz del silenciamiento génico
post-transcripcional inducido por los
geminivirus.
Se sabe que los geminivirus son un tipo de virus
de plantas amplio y diversificado que infecta varias plantas de
interés agronómico, lo que causa graves pérdidas en las cosechas.
Dichos virus se caracterizan por viriones que constan de dos
partículas icosaédricas geminadas. Su genoma, que consta de una o
dos moléculas circulares de ADN monocatenario (ADNmc), se replica
en el núcleo de células infectadas a través de compuestos
intermedios bicatenarios (Hanley-Bowdoin y col.,
1999).
La familia Geminiviridae se divide en
cuatro géneros denominados Mastrevirus, Begomovirus,
Curtovirus y Topocuvirus en base al insecto vector, el
espectro del huésped y la estructura del genoma (Briddon y col.,
1985; Fauquet y col., 2003).
Una grave enfermedad de la planta del tomate,
transmitida por la mosca blanca Bemisia tabaci, se conoce
desde hace mucho tiempo como "rizadura amarilla del tomate" en
las áreas del Oriente Medio, Sudeste Asiático y África, (Czosnek y
col., 1997). Esta enfermedad, que puede causar pérdidas en las
cosechas del 100% (Pico y col., 1996; Czosnek y col., 1997), se
difunde de forma sucesiva tanto a través del Mediterráneo
Occidental, alcanzando Cerdeña, Sicilia y España (Czosnek y col.,
1997), como a través de América (Polston y col., 1997).
Recientemente se han identificado y aislado los
agentes de la enfermedad, que son virus que pertenecen a la familia
Geminiviridae, género Begomovirus. Estudios
filogenéticos han resaltado la presencia de distintas especies
virales relacionadas con los distintos orígenes geográficos del
Begomovirus: Asia, África y América (Czosnek y col.,
1997).
El genoma de las especies de Cerdeña del virus
de la rizadura amarilla del tomate (TYLCSV, por sus siglas en
inglés), es monopartito (Kheyr-Pour y col., 1991).
El ADN se transcribe de forma bidireccional y contiene seis marcos
de lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés), dos en la cadena
viral (V): V1 y V2 y cuatro en la cadena complementaria (C): C1,
C2, C3 y C4, tal como se muestra en la figura 1. Entre los ORFs C1 y
V2 hay una región no codificante denominada región intergénica (IR,
por sus siglas en inglés) análoga a la que se encuentra presente en
el genoma de todos los virus de la familia Geminiviridae. La
organización genómica del TYLCSV es estructuralmente similar a la
del componente A de los Begomovirus bipartitos, tales como el
virus del mosaico dorado del tomate (TGMV, por sus siglas en
inglés) y el virus del ñame africano (ACMV, por sus siglas en
inglés). En el caso de los Begomovirus bipartitos la
nomenclatura de los ORFs presentes en el componente A de la cadena
complementaria es: AL1 o AC1, AL2 o AC2, AL3 o AC3, AL4 o AC4,
mientras que en la cadena viral es AR1 o AV1, AR2 o AV2; en la
cadena complementaria del componente B la nomenclatura es: BL1 o
BC1 y en la cadena viral es BR1 o BV1.
Las estrategias usadas hasta ahora para
controlar la infección de los geminivirus transmitida por la
Bemisia tabaci se basan en el uso de costosos tejidos con
mallas finas (para el cultivo de tomates frescos) y en particular
en los tratamientos reiterados con insecticidas (en el cultivo tanto
de tomates frescos, como de tomate de industria). Dichas
estrategias dan como resultado un aumento de los gastos de
producción y representan un serio peligro para la salud de los
operarios agrícolas y de los consumidores. Además, ya se ha
informado la aparición de poblaciones de Bemisia tabaci
resistentes al insecticida imidacloprid (Cahill y col., 1996;
Williams y col., 1996).
El desarrollo de especies cultivadas resistentes
representa la forma más práctica y económica para controlar las
infecciones virales. Los programas clásicos de mejora genética para
la introducción de resistencia a los geminivirus que causan la
rizadura amarilla del tomate se basaban en la transferencia de genes
de resistencia procedentes de especies silvestres de
Lycopersicon a especies cultivadas de tomate. De ese modo, se
han obtenido y comercializado líneas con niveles variables de
resistencia al TYLCSV, mostrando las mejores líneas síntomas
reducidos y baja replicación viral. No obstante, las plantas con
niveles bajos y medios de resistencia representan un receptáculo
potencial para infecciones posteriores.
Otro aspecto importante a tener en cuenta es que
las características agronómicas de las líneas obtenidas no son
siempre óptimas y sin embargo reflejan a las de los genotipos de los
tomates de cultivo utilizados en los programas de mejora
genética.
Aún no se ha producido una línea de tomate
inmune a los virus que causan la enfermedad de la rizadura amarilla
del tomate, a saber, sin síntomas y sin replicación de ADN
viral.
Con la llegada de la ingeniería genética se
abrieron nuevas perspectivas para la introducción de caracteres de
resistencia contra virus de plantas. La mayoría de las estrategias
se basan en la introducción y la expresión de secuencias
procedentes de patógenos en la planta de interés, resistencia
procedente de patógenos (PDR, por sus siglas en inglés) (Sanford y
Johnson, 1985; Abel y col., 1986; Tavazza y Lucioli, 1993).
Aunque dichas estrategias se han aplicado con
éxito para la introducción de caracteres de resistencia hacia virus
de plantas con genoma de ARN (Beachy, 1997), en el caso de los
geminivirus, con un genoma de ADN, la expresión de secuencias
procedentes de patógenos ha producido plantas sin resistencia
duradera y/o sin tolerancia.
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Los mecanismos que inducen resistencia a los
virus logrados a través de la expresión de secuencias procedentes
de patógenos se pueden agrupar en dos amplias categorías:
- a)
- resistencia mediada por la expresión de una proteína de patógeno tal como, por ejemplo, la expresión de un mutante negativo dominante;
- b)
- resistencia mediada por el silenciamiento génico post-transcripcional (Baulcombe, 1996; Beachy, 1997; Zaitlin y Palukaitis, 2000).
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El silenciamiento génico
post-transcripcional es un proceso omnipresente en
los eucariotas, que implica la degradación de ARNs específicos
después de la formación de moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) que
tienen secuencias homólogas a las del ARN diana.
Aunque pueden existir distintos contextos
capaces de inducir la producción de ARNbc homólogo al transgen
(transcripción de ARNs transgénicos aberrantes, presencia en el ARN
transgénico de secuencias invertidas y repetidas lo suficientemente
largas, integración del transgen en el genoma de la planta en copias
múltiples invertidas y repetidas), una vez que se produce el ARNbc,
éste último se reconoce y se degrada en moléculas cortas de ARNbc de
aproximadamente 21-26 nucleótidos, conocidas como
ARNip.
A continuación los ARNip se integran en un
complejo de multiproteína denominado RISC, que es capaz de degradar
todos los ARNs que tienen homología de secuencia con los ARNip. Los
últimos representan, por consiguiente, los factores determinantes
de la especificidad del silenciamiento del ARN y su presencia
relacionada con una secuencia determinada establece de forma
unívoca que esta secuencia de ARN se encuentra silenciada
post-transcripcional-
mente.
mente.
Por consiguiente, las plantas transgénicas
silenciadas post-transcripcionalmente para
secuencias procedentes del genoma de ARN viral, son resistentes al
virus homólogo y a los virus con secuencias de nucleótidos
estrechamente relacionadas con el transgen.
El silenciamiento del transgen también se puede
inducir después de la infección por el virus.
De hecho, la replicación viral es capaz de
inducir el silenciamiento de un transgen, inicialmente no
silenciado, si la secuencia de nucleótidos del transgen es homóloga
a una parte del genoma del virus infectante. La activación del
mecanismo de silenciamiento implica la degradación específica de las
moléculas de ARN que tienen homología de secuencia con el ARN
inductor.
Como consecuencia directa, la activación del
silenciamiento mediante el virus se asocia con una degradación de
las secuencias de ARNm transgénico homólogas al virus y del genoma
viral. Esto da como resultado la recuperación del huésped después
de una etapa infecciosa inicial, de forma que la nueva parte
vegetativa resulta estar libre del virus. Una característica
peculiar de los tejidos de las plantas que desarrollan
posteriormente al fenómeno de recuperación es que son muy
resistentes a una infección posterior por parte del mismo virus.
La resistencia mediada por el silenciamiento
génico post-transcripcional, dado que se basa en el
reconocimiento a nivel nucleotídico, confiere resistencia solo
contra aislados virales estrechamente homólogos al genoma del virus
del que se derivó el transgen. En lugar de eso, las estrategias
basadas en la expresión de una proteína de patógeno normalmente
producen plantas resistentes también a cepas o aislados virales que
no están estrechamente relacionados desde un punto de vista
nucleótido.
También se ha mostrado que el silenciamiento del
transgen se encuentra influido por la temperatura, siendo inactivo
a temperaturas por debajo de 15ºC (Szittya y col., 2003). Por
consiguiente, las plantas expuestas en condiciones de campo a un
intervalo de temperatura situado por debajo de 15ºC pueden perder la
resistencia mediada por el silenciamiento.
Se debe tener en cuenta que, aunque durante
varios años se han logrado obtener plantas transgénicas resistentes
a virus con genoma de ARN a través de mecanismos basados en el
silenciamiento del transgen, hasta el momento no se ha informado
que dicha estrategia se pueda aplicar con éxito a los geminivirus
(virus con genoma de ADN).
Es evidente que la mejor estrategia para obtener
plantas resistentes a un amplio espectro de geminivirus es una
estrategia en la que el producto de interferencia sea la proteína.
Es evidente que la anchura del espectro de resistencia aumenta el
valor agronómico y comercial de la planta producida.
De ese modo, la expresión en plantas
transgénicas de variantes disfuncionales de la proteína Rep
replicativa de los geminivirus se ha utilizado para obtener plantas
con mayores niveles de resistencia o de inmunidad contra los
geminivirus.
En la bibliografía se conoce que la expresión de
una proteína Rep replicativa truncada (Rep-210) del
TYLCSV es capaz de conferir resistencia contra la infección viral,
aunque dicha resistencia no es duradera porque el virus es capaz de
superarla con el transcurso del tiempo. En las Tablas 1 y 2 se
muestran los resultados del análisis de la resistencia de plantas
transgénicas de Tomate 47 x wt que expresan la
Rep-210 agroinoculada con TYLCSV (Brunetti y col.
1997) y de la línea 102.22 de N. benthamiana (Noris y col.
1996), respectivamente.
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A partir de los resultados presentados en las
Tablas 1 y 2, se puede deducir claramente que la resistencia contra
el TYLCSV mediada por la expresión transgénica de una secuencia
procedente del patógeno se supera con el transcurso del tiempo.
De forma similar, también la resistencia
inducida por la expresión transgénica de un mutante negativo
dominante de la Rep del geminivirus bipartito "virus del mosaico
del ñame africano" se supera con el transcurso del tiempo
(Sangaré y col., 1999).
Otro ejemplo está representado por la expresión
transgénica de la proteína de la cápside del TYLCV en un híbrido
interespecífico de tomate (Lycopersicon esculentum X L.
pennellii) que confiere una resistencia parcial contra la
infección viral (Kunik y col., 1994). Incluso en este caso, la
resistencia mediada por la expresión de la proteína de la cápside
no es de larga duración y da como resultado ser poco útil desde un
punto de vista agronómico.
En vista de lo anterior, es evidente la
necesidad de tener nuevos procedimientos que permitiesen usar con
éxito las secuencias de polinucleótidos procedentes de los
geminivirus para obtener plantas con resistencia de larga duración
contra los geminivirus.
Los autores de la presente invención han
preparado ahora secuencias de polinucleótidos que codifican
proteínas virales procedentes de patógenos y que son capaces de
conferir al huésped resistencia a los virus, modificadas de forma
adecuada para ser dianas ineficaces del silenciamiento génico
post-transcripcional inducido por virus para
obtener plantas transgénicas con niveles de resistencia duraderos
contra los geminivirus.
De hecho, durante los experimentos los autores
muestran que el vencimiento de la resistencia y por consiguiente la
dificultad para lograr una resistencia duradera contra los
geminivirus, se debe a capacidades inesperadas de los geminivirus
para silenciar post-transcripcionalmente el transgen
y para diseminarse en una planta en la que el transgen, con
secuencias homólogas a las del virus infectante, se encuentra
silenciado post-transcripcionalmente.
Tal como se muestra en las figuras 2 y 3,
respectivamente, tanto en las plantas transgénicas de la línea
102.22 de N. benthamiana, como en las plantas de Tomate
47 x wt, la capacidad del virus para superar la resistencia
procede del silenciamiento del transgen por parte del mismo virus y
procede de la capacidad inesperada del virus para diseminarse en
una planta silenciada.
La capacidad del TYLCSV para diseminarse en una
planta en la que el transgen Rep-210 se encuentra
silenciado post-transcripcionalmente se describe
con detalle de forma adicional tal como se expone en la figura 4.
Los resultados muestran que las plantas de tomate transgénico 47
x 10D (Brunetti y col., 1997), silenciadas
post-transcripcionalmente antes de la
agroinoculación, tal como se muestra mediante la ausencia de la
proteína Rep-210 y por la presencia concurrente de
los ARNip de transgen homólogo, son susceptibles a la infección por
el TYLCSV igual que los controles.
A partir de lo anterior resulta que, al
contrario de los virus de ARN, el geminivirus no se bloquea por un
silenciamiento activo de las secuencias de genes virales. Lo
mencionado anteriormente no se limita al tipo de planta transgénica
que se va a usar o a la forma del virus que se debería inocular, a
través de agroinfección o de Bemisia tabaci. De hecho, tal
como se muestra en la Tabla 3, mediante la utilización de una cifra
reducida de bemisia virulífera por planta, de manera que se infecte
entre el 90% y el 100% de las plantas de control, aproximadamente
el 40% de las plantas transgénicas (línea 201) cuyo transgen se
encuentra silenciado post-transcripcionalmente, no
se encuentran infectadas o lo están a última hora, mientras que con
una concentración más alta de inóculo todas las plantas enfrentadas
con los insectos virulíferos se infectan de forma similar a las de
los experimentos llevados a cabo mediante la utilización de
agroinoculación.
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Por consiguiente, es importante considerar que
las condiciones de agroinoculación usadas para ensayar la
resistencia y asegurar la persistencia con el transcurso del tiempo
(tal como se muestra en las figuras 2, 3 y 4 y en las Tablas 1 y 2)
se corresponden con condiciones de presión viral alta o muy alta.
Este enfoque experimental permite identificar plantas transgénicas
con niveles de resistencia muy altos o inmunes contra la infección
viral y, por consiguiente, de un valor comercial muy elevado.
Por lo tanto, la introducción de caracteres de
resistencia contra geminivirus a través de la expresión de
secuencias procedentes de patógenos se encuentra limitada debido a
la capacidad inesperada de los geminivirus para silenciar
post-transcripcionalmente el transgen y para
diseminarse en la planta silenciada.
Además, los autores muestran que las
transcripciones de la cadena positiva (V1 y V2) y las de la cadena
negativa (C1, C2, C3 y C4) del TYLCSV se encuentran sometidas,
durante una infección normal en plantas de tipo natural, al
silenciamiento post-transcripcional viral, tal como
se muestra en la figura 5. Esto da como resultado la imposibilidad
de lograr una resistencia a largo plazo a través de la expresión de
secuencias procedentes del mismo patógeno, a no ser que éstas se
modifiquen de forma adecuada para no ser una diana o para ser una
diana ineficaz del silenciamiento génico
post-transcripcional inducido por el virus. En lugar
de eso, mediante la introducción en el genoma de la planta de una
secuencia mutada o escogida de forma adecuada según la invención,
es posible obtener una resistencia de larga duración contra los
geminivirus, distinta de la que se logra con los procedimientos
conocidos.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención es una secuencia de genes V1/AR1/AV1 o C1/AL1/AC1 mutados
de un geminivirus que infecta al tomate, tal como por ejemplo el
TYLCSV, en la que las mutaciones consisten en mutaciones puntuales
distribuidas a lo largo de la secuencia de tal modo que la homología
continua entre la secuencia mutada y la secuencia de genes virales
correspondiente se encuentra por debajo de o es igual a 8
nucleótidos, preferentemente por debajo de o igual a 5 nucleótidos,
codificando la citada secuencia mutada para una proteína de la
cápside de tipo natural o para una proteína Rep truncada,
respectivamente.
Las secuencias de genes según la invención
pueden ser de tipo natural o sintéticas o pueden producirse mediante
mutagénesis y las secuencias aminoacídicas procedentes de
geminivirus codificadas por ellas son secuencias de tipo natural o
mutantes que interfieren con la infección viral.
Por consiguiente, la invención incluye
secuencias de genes de geminivirus cambiadas de forma adecuada o de
tipo natural, tal como para diferir, al nivel nucleotídico, en
relación con la secuencia genómica correspondiente del geminivirus
contra el que se requiere introducir resistencia de acuerdo con los
principios definidos y especificados anteriormente.
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Objetivos adicionales de la presente invención
son:
una secuencia de genes V1/AR1/AV1 mutados que
codifica para una proteína de la cápside, teniendo la citada
proteína la secuencia con el SEQ ID No. 7;
una secuencia de genes V1/AR1/AV1 mutados que
tiene la secuencia con el SEQ ID No. 6;
una secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados que
codifica proteínas Rep truncadas que constan de entre 130
aminoácidos (Rep 130) y 210 aminoácidos (Rep 210), teniendo lugar
el citado truncamiento en el extremo terminal 3';
una secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados que
codifica para la proteína Rep 210 que tiene la secuencia de
proteína con el SEQ ID No. 3;
una secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados que
tiene la secuencia con el SEQ ID No. 2;
una secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados que
codifica para la proteína Rep 210 que tiene la secuencia de
proteína con el SEQ ID No. 5;
una secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados que
tiene la secuencia con el SEQ ID No. 4;
una secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados que
codifica para la proteína Rep 130 que tiene la secuencia de
proteína con el SEQ ID No. 9;
una secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados que
tiene la secuencia con el SEQ ID No. 8.
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Las secuencias de genes a partir de las que se
construye la secuencia de polinucleótidos según la invención pueden
proceder de los geminivirus tales como, Mastrevirus, Curtovirus,
Begomovirus, Topocuvirus y en particular pueden proceder de las
especies mostradas en la Tabla 4 y de sus aislados, más en
particular a partir de las especies de rizadura amarilla del tomate
y de sus aislados mostrados en la Tabla 5.
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Preferentemente, las especies de
Begomovirus son TYLCCNV, TYLCGV, TYLCMalV, TYLCSV, TYLCTHV,
TYLCV, ACMV, BGMV, CaLCuV, ToCMoV, TGMV, ToGMoV, ToMHV, ToMoTV,
ToMoV, ToRMV, ToSLCV, ToSRV, virus del arrugamiento de las hojas de
algodón (CLCrV, CLCuAV, ClCuGV, CLCuKV, CLCuMV, CLCuRV), virus del
mosaico del ñame del Este de África (EACMCV, EACMMV, EACMV, EACMZV),
virus del mosaico amarillo de la patata (PYMPV, PYMTV, PYMV), virus
de la rizadura de la calabaza (SLCCNV, SLCV, SLCYV), virus de la
rizadura de la batata (SPLCGV, SPLCV), virus de la rizadura del
tabaco (TbLCJV, TbLCKoV, TbLCYNV, TbLCZV), virus de la rizadura del
tomate (ToLCBV, ToLCBDV, ToLCGV, ToLCKV, ToLCLV, ToLCMV, ToLCNDV,
ToLCSLV, ToLCTWV, ToLCVV, ToLCV) y aislados de los mismos.
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Otras especies de geminivirus preferentes, que
pertenecen a los otros géneros Mastrevirus, Curtovirus,
Topocuvirus, son WDV, MSV, SSV, BYDV, TYDV, BCTV y sus
aislados.
La secuencia de genes que pertenece al genoma de
los geminivirus puede ser la secuencia C1/AL1/AC1, C2/AL2/
AC2, C3/AL3/AC3, C4/AL4/AC4, V1/AR1/AV1,V2/AR2/AV2, BC1/BL1 y BV1/BR1, en particular, la secuencia
C1/AL1/AC1 de los geminivirus descritos anteriormente y de sus aislados.
AC2, C3/AL3/AC3, C4/AL4/AC4, V1/AR1/AV1,V2/AR2/AV2, BC1/BL1 y BV1/BR1, en particular, la secuencia
C1/AL1/AC1 de los geminivirus descritos anteriormente y de sus aislados.
La secuencia aminoacídica codificada por la
secuencia de polinucleótidos objetivo de la presente invención es
una proteína procedente de un patógeno capaz de conferir resistencia
contra los geminivirus a las plantas que lo expresen. Dado que la
citada proteína interferente según la invención, se expresa de forma
estable, confiere una resistencia duradera independientemente del
mecanismo molecular mediante el que el producto de la proteína es
capaz de inducir resistencia.
La proteína procedente de patógeno puede ser una
proteína de la cápside, proteína viral asociada a la replicación
(Rep), proteínas codificadas por los genes C2/AL2/AC2, C3/AL3/AC3,
C4/AL4/AC4, V2/AR2/AV2, BC1/BL1 y BV1/BR1.
Un ejemplo de una secuencia de polinucleótidos
posible que satisface el requisito descrito anteriormente se expone
en las figuras 16A y 16B, que muestran el alineamiento entre la
secuencia de nucleótidos de tipo natural que codifica la proteína
Rep-210 del TYLCSV y la secuencia sintética de
nucleótidos modificada de manera que no sea una diana de la
degradación post-transcripcional inducida por el
virus infectante, en la que ambas secuencias de nucleótidos
codifican la misma proteína viral.
Las plantas, tejidos o células de una planta que
se pueden transformar con estas secuencias de polinucleótidos
pueden ser tomate, pimiento, tabaco, batata, algodón, melón,
calabaza, ñame, patata, judías, soja, judía mungo, remolacha, caña
de azúcar, maíz, trigo.
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Un objetivo adicional de la presente invención
es una construcción sintética que comprende una secuencia de
polinucleótidos heterólogos que contiene en la dirección
5'-3':
a) una secuencia de polinucleótidos que actúa
como promotor en la citada planta o tejido o células
transformadas;
b) una secuencia de polinucleótidos no traducida
situada en la posición 5' de la región que codifica;
c) una secuencia de genes mutados de acuerdo con
lo anterior;
d) una secuencia que actúa como terminador de la
trascripción, situada en la posición 3' en relación con la
secuencia de genes mutados.
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Un objetivo adicional de la presente invención
es un vector de expresión que comprende la construcción descrita
anteriormente.
Además, es un objetivo de la presente invención
una planta, tejido o células de planta transgénica, progenie de la
misma, así como las semillas que comprenden en su genoma una
secuencia de polinucleótidos según la presente invención.
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Por último, es un objetivo de la presente
invención un procedimiento para la preparación de plantas
transgénicas, tejidos de plantas o células de las mismas que tienen
una resistencia de larga duración contra los geminivirus, que
incluye las siguientes etapas:
a) identificación o selección de una secuencia
de genes virales que codifique una secuencia de aminoácidos capaz
de conferir resistencia contra los geminivirus;
b) mutagénesis de la secuencia de genes virales
de manera que se genere una diana ineficaz del silenciamiento
génico post-transcripcional inducido por el
geminivirus infectante en la que las mutaciones consisten en:
- i)
- mutaciones puntuales distribuidas a lo largo de la secuencia de tal manera que la homología continua entre la secuencia mutada y la secuencia de genes virales correspondiente de la etapa a) se encuentra por debajo de o es igual a 8 nucleótidos, preferentemente por debajo de o igual a 5 nucleótidos y/o
- ii)
- deleciones de las regiones 5' ó 3' de la secuencia de genes virales de la etapa a) hasta la identificación de la región mínima de la citada secuencia de genes que es una diana ineficaz del silenciamiento génico post-transcripcional inducido por el geminivirus infectante comparada con la secuencia viral original de la etapa a) y en la que la citada proteína truncada mantiene la capacidad de conferir resistencia contra los geminivirus;
c) inserción en la planta, tejido de la planta o
célula de la misma, de la secuencia de genes de geminivirus mutada
en la etapa b), mediante la utilización de una construcción que
comprende una secuencia de polinucleótidos heterólogos que contiene
en la dirección 5'-3':
- i)
- una secuencia de polinucleótidos que actúa como promotor en la citada planta o tejido o células transformadas;
- ii)
- una secuencia de polinucleótidos no traducida situada en la posición 5' de la región que codifica;
- iii)
- una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos procedentes de geminivirus, mutagenizados de forma adecuada para ser una diana ineficaz del silenciamiento génico post-transcripcional inducido por el geminivirus infectante;
- iv)
- una secuencia que actúa como terminador de la trascripción situada en la posición 3' en relación con la citada secuencia de polinucleótidos.
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En relación con la etapa a) del procedimiento
según la presente invención, el término "identificación"
significa el reconocimiento experimental de la citada secuencia de
genes virales capaz de conferir resistencia contra los geminivirus,
mientras que el término "selección" significa el
reconocimiento de una secuencia de genes virales ya disponible capaz
de conferir una resistencia no duradera contra los geminivirus. Por
consiguiente, el procedimiento según la presente invención da a
conocer además la solución al problema de la pérdida de resistencia
contra los geminivirus que tiene lugar a través del uso de las
secuencias conocidas.
Como secuencia aminoacídica codificada por la
secuencia de polinucleótidos identificada o seleccionada en la
etapa a), según la presente invención, ésta puede ser una proteína
que tenga homología del 100% en relación con la proteína viral de
tipo natural.
La mutagénesis incluye todas aquellas mutaciones
de la secuencia de nucleótidos que no reducen la capacidad de la
proteína para conferir resistencia contra los geminivirus. Las
mutaciones posibles son mutaciones puntuales silenciosas y aquellas
que conducen a la sustitución con aminoácidos que tienen
características bioquímicas, o deleciones y/o inserciones y/o
sustituciones similares.
De forma alternativa, la mutagénesis de la etapa
b) del procedimiento según la presente invención consiste en
deleciones de la secuencia de polinucleótidos en las extremidades de
manera que la citada secuencia, mientras mantiene capacidades de
interferencia similares, se encuentra insuficientemente representada
en relación con la secuencia original, en la población natural de
los ARNip producidos por el virus infectantes.
En particular, la acción de mutagénesis de la
etapa b) del procedimiento según la presente invención puede
consistir en las deleciones de la región 3' ó 5' de la secuencia de
genes virales de la etapa a), hasta que se identifica la región
mínima de la citada secuencia de genes que se encuentra
insuficientemente representada en relación con la secuencia que
codifica una proteína de tipo natural, en la población de los ARNip
y en que la citada proteína truncada mantiene la capacidad para
conferir resistencia contra los geminivirus.
Además, la secuencia de genes virales de la
etapa a) del procedimiento según la presente invención puede ser la
del gen C1/AL1/AC1 del TYLCSV y la secuencia de aminoácidos puede
ser una proteína truncada relativamente para la proteína viral de
tipo natural tal como, por ejemplo, Rep-130.
Entre las diversas aplicaciones agronómicas de
las secuencias de polinucleótidos sintéticos según la presente
invención, es de especial interés su uso para la obtención de
plantas de tomate resistentes al TYLCSV.
En esta realización en particular, la secuencia
transgénica de polinucleótidos que codifican la proteína Rep viral
truncada (Rep-210) se ha modificado a través de una
deleción 3', lo que da como resultado una diana ineficaz de
silenciamiento génico post-transcripcional inducida
por el TYLCSV, al tiempo que se mantiene la capacidad para conferir
resistencia.
En particular, mediante el uso de hibridaciones
restrictivas con sondas de ARN radioactivas, se identificó una
región transcrita del genoma del TYLCSV que se encuentra
insuficientemente representada en la población de los ARNip de
origen viral producidos durante la infección del TYLCSV en plantas
de tipo natural, tal como se muestra en las figuras 6 y 7. Esta
región se corresponde con los primeros 390 nucleótidos de los genes
que codifican la Rep del TYLCSV. Su transcripción es una diana
ineficaz del silenciamiento génico
post-transcripcional inducido por el virus,
codifica la proteína Rep-130 que resulta expresada
de forma estable, lo que da como resultado una resistencia
duradera.
Por consiguiente, en una realización en
particular de la invención, la secuencia de aminoácidos de los
geminivirus, tales como el TYLCSV, codificada por la secuencia de
polinucleótidos según la invención, puede ser la proteína
Rep-130 truncada (SEQ ID No. 9). En este caso la
secuencia de genes virales hecha una diana ineficaz o no hecha una
diana del silenciamiento post-transcripcional, es el
SEQ ID No. 8.
Un objetivo adicional de la presente invención
es un procedimiento tal como el descrito anteriormente en el que la
mutagénesis de la etapa b) consiste en mutaciones puntuales
silenciosas de la secuencia de genes virales de la etapa a) que
mantienen la capacidad de la secuencia de aminoácidos codificada,
para conferir resistencia contra los geminivirus y para ser una
diana ineficaz o no ser una diana del silenciamiento
post-transcripcional.
En particular, la secuencia de genes virales de
la etapa a) puede ser el gen V1/AR1/AV1 (CP) por ejemplo del TYLCSV
(SEQ ID No. 12) y en una realización en particular la secuencia de
genes virales hecha una diana ineficaz o no hecha una diana del
silenciamiento post-transcripcional es el SEQ ID No.
6.
Además, la secuencia de genes virales de la
etapa a) puede ser el gen C1/AL1/AC1 del TYLCSV y en este caso la
secuencia de genes virales que se hizo una diana ineficaz o que no
se hizo una diana del silenciamiento
post-transcripcional puede ser el SEQ ID No. 2 o el
SEQ ID No. 4.
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A continuación se describirá la presente
invención a modo de ilustración pero no de forma limitante, de
acuerdo con realizaciones preferentes de la misma, haciendo
referencia en particular a las figuras de los dibujos adjuntos, en
las que:
la figura 1 muestra el genoma del virus de la
especie de Cerdeña de la rizadura amarilla del tomate (TYLCSV). El
ADN se transcribe de forma bidireccional y contiene seis marcos de
lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés) parcial o
totalmente solapados, dos en la cadena viral (V) V1 y V2 y cuatro en
la cadena complementaria (C) C1, C2, C3 y C4;
la figura 2 muestra la expresión de la proteína
Rep-210 en plantas transgénicas de N.
benthamiana (línea 102.22) agroinoculadas con TYLCSV. Los
símbolos (-), (+) y NI significan plantas sanas, infectadas y no
inoculadas, respectivamente. El análisis se ha llevado a cabo
después de la agroinoculación con TYLCSV (0 spi) y cuatro y ocho
semanas después de ésta (respectivamente, 4 y 8 spi (spi= semanas
post infección)).
la figura 3 muestra la expresión de la proteína
Rep-210 y la de los ARNm transgénicos en plantas de
tomate (línea 47 X wt) antes de la agroinoculación con TYLCSV (0
spi) y 22 semanas después de ésta (22 spi). Los símbolos (+) y (-)
significan plantas que se encuentran, respectivamente, infectadas o
sanas en el tiempo especificado;
la figura 4 muestra el análisis de la expresión
de la proteína Rep-210 y de los ARNip
correspondientes a la transcripción relativa en plantas
transgénicas de tomate (línea 47 X 10D) antes de la agroinoculación
del TYLCSV. Los símbolos (+) y (-) situados encima del panel
significan la presencia o ausencia del transgen C1 sentido y
antisentido, respectivamente; wt (por sus siglas en inglés)
significa planta de control de tipo natural; mientras que los
símbolos (+), (-) y NI situados debajo del panel de los ARNip
significan la presencia (+) y la ausencia (-), respectivamente, del
virus y la no agroinoculación (NI) como control;
la figura 5 muestra los resultados de la técnica
de hibridación tipo Northern de pequeños ARNs extraídos de plantas
de tomate de tipo natural infectadas con TYLCSV (muestras
1-4) y no infectadas como control (muestra C); M
significa un marcador de peso molecular;
la figura 6 muestra el análisis de distribución
de los ARNs interferentes pequeños en relación con el genoma del
TYLCSV. En la parte superior, el mapa lineal del genoma del TYLCSV;
las transcripciones se señalan mediante las flechas (V1 y V2 con la
misma polaridad que el genoma viral y C1, C2, C3 y C4 con polaridad
complementaria); los recuadros abiertos 1 a 9 situados debajo del
mapa del genoma viral representan los nueve fragmentos de PCR (cada
uno con una longitud de aproximadamente trescientos nucleótidos), en
los que se ha dividido el genoma y en los que se muestran la
tinción con bromuro de etidio y la hibridación con los ARNip
extraídos de plantas de tomate infectadas con el TYLCSV. La IR
representa la décima parte de un fragmento de PCR, que se
corresponde con la región intergénica no transcrita del genoma del
TYLCSV. Los números situados bajo los paneles significan el
porcentaje de señal de hibridación en relación con cada fragmento
de PCR;
la figura 7 muestra el análisis de la presencia
de ARNip en plantas de tomate de tipo natural no agroinoculadas
(muestra C) o agroinoculadas con TYLCSV (muestras 1 y 2) a las
cuatro semanas después de la inoculación; en particular, se
analizaron los ARNip correspondientes con la transcripción para
Rep-210 (sonda A) y para Rep-130
(sonda B); las columnas 100 y 50 situadas sobre los paneles de la
izquierda se corresponden, respectivamente, con 100 y 50 pg, de un
oligonucleótido homólogo a las sondas A y B;
la figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEQ ID No. 8) que codifica la Rep-130 (SEQ ID No.
9) del plásmido pTOM130. En letras mayúsculas, los nucleótidos que
no pertenecen al TYLCSV sino que proceden de clonación; las
secuencias subrayadas se corresponden con los sitios de restricción
BamHI y EcoRI usados para la clonación. Los codones de inicio y de
terminación se exponen en negrita, mientras que las mutaciones
introducidas para la eliminación de la expresión de la proteína C4
se exponen en caracteres en cursiva y negrita;
la figura 9 muestra la técnica de hibridación
tipo Southern de los extractos de ácidos nucleicos totales de
protoplastos de N. benthamiana de tipo natural
cotransfectados con el clon infeccioso de TYLCSV (pTOM6), junto con
el plásmido que expresa la proteína Rep mutada indicado encima de
cada columna;
la figura 10 muestra el análisis cuantitativo de
la replicación del TYLCSV en protoplastos de N. benthamiana
de tipo natural cotransfectados con plásmido pTOM6 junto con el
plásmido que expresa la proteína Rep mutada;
la figura 11 muestra el esquema del plásmido
pT0M130 usado para la obtención de plantas transgénicas que expresan
la Rep-130. LB y RB (por sus siglas en inglés)
significan, respectivamente, borde izquierdo y borde derecho; pE35S
representa el promotor del virus del mosaico de la coliflor
35S duplicado; Rep-130 (SEQ ID No. 8) es la
secuencia que codifica la proteína Rep-130 (SEQ ID
No. 9); t35S es el terminador del virus del mosaico de la
coliflor 35S; tNOS es el terminador del gen que codifica la
nopalina sintasa; nptII es la secuencia que codifica la neomicina
fosfotransferasa; pNOS es el promotor del gen para la nopalina
sintasa; Kan es el gen para la resistencia a la kanamicina;
la figura 12 muestra el análisis de la expresión
de la proteína Rep-130 (SEQ ID No. 9) en plantas
transgénicas de N. benthamiana transformadas con pT0M130
(líneas 300-309);
la figura 13 muestra el análisis de la
replicación del TYLCSV en protoplastos de N. benthamiana de
tipo natural (wt, por sus siglas en inglés) y transgénicos que
expresan la proteína Rep-130 (SEQ ID No. 9) (líneas
300, 301, 303) o la proteína Rep-210 (102.22).
la figura 14 muestra el análisis de la expresión
de la proteína Rep-130 (SEQ ID No. 9) en plantas
transgénicas de L. esculentum transformadas con pT0M130
(líneas 402, 403, 406, 411, 413, 416, 417). Como control positivo
se usó un extracto de proteína de una Rep-130
transgénica que expresaba N. benthamiana (línea 303);
la figura 15 muestra la comparación entre una
planta transgénica de L. esculentum transformada con pT0M130
(línea 406) que expresa Rep-130 y una planta de tipo
natural no transformada;
la figura 16A y B muestra dos ejemplos de
secuencias sintéticas que codifican la Rep-210 (SEQ
ID No. 2, SEQ ID No. 4). Se muestra el alineamiento entre la
secuencia de nucleótidos de tipo natural que codifica la proteína
Rep-210 del TYLCSV (Sec_cod_Rep210_de_tipo_natural,
en la parte superior; SEQ ID No. 1) y la secuencia sintética de
nucleótidos modificada de forma que sea una diana ineficaz del
silenciamiento post-transcripcional inducido por el
virus (Sec_cod_Rep210_desprovista_de_silenciamiento, en la parte
inferior; SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4). En las secuencias
sintéticas, los nucleótidos mutados en relación con la secuencia de
tipo natural se muestran sombreados;
la figura 17 muestra el análisis de la expresión
transitoria, mediante agroinfiltración dentro de hojas de N.
benthamiana, de la proteína Rep-210 codificada
por el gen pTOM102 (C4 -) de tipo natural del plásmido y por el gen
sintético de la Rep-210 desprovista de
silenciamiento B (SEQ ID No. 4), (plásmido pTOM102 Syn);
la figura 18 muestra un ensayo transitorio para
la inhibición de la replicación viral a través de la
co-agroinfiltración de una cepa de A.
tumefaciens que contiene el clon infeccioso del TYLCSV junto con
cepas de A. tumefaciens que contienen: a) el plásmido
pTOM102(C4-) que expresa el gen de tipo natural de la
Rep-210 SEQ ID No. 1 (Brunetti y col., 2001),
líneas 1-3; b) el plásmido pTOM102Syn que expresa el
gen sintético, para la Rep-210
(Rep-210 desprovista de silenciamiento B; SEQ ID
No. 4) líneas 4-6; c) plásmido de clonación vacío
pBIN19 líneas 7-9;
la figura 19 muestra el análisis de la expresión
de la proteína Rep-210 en plantas transgénicas de
N. benthamiana transformadas con plásmido pTOM102Syn que
contiene el gen sintético para Rep-210,
Rep-210 desprovista de silenciamiento B, SEQ ID No.
4 (líneas 506, 508A y 508B). Como control positivo se usó un
extracto de proteína de planta trasngénica de tomate que expresaba
la Rep-210;
la figura 20 muestra el análisis de la expresión
de la proteína Rep-210 en plantas transgénicas de
N. benthamiana transformadas con pTOM 102 (línea 102.22,
Noris y col., 1996) o con pTOM 102Syn (línea 506) después de la
agroinoculación con el TYLCSV. El análisis se ha llevado a cabo
antes (0 spi) y cinco semanas después (5 spi) de la agroinoculación
con el TYLCSV;
la figura 21 muestra el análisis de la infección
mediante el ensayo de "transferencia puntual"
("dot-blot" assay) a las 2, 3, 4, 5 spi (en
las que spi significa el número de semanas después de la
agroinoculación) en plantas de tipo natural (WT) o transgénicas de
N. benthamiana transformadas con pTOM 102 (línea 102.22,
Noris y col., 1996) o con pTOM 102Syn (línea 506);
la figura 22 muestra un ejemplo de secuencia
sintética que codifica la CP. Se muestra el alineamiento entre la
secuencia de nucleótidos de tipo natural que codifica la CP del
TYLCSV (TYLCSV CP, en la parte superior; SEQ ID No. 12) y la
secuencia sintética de nucleótidos modificada de forma que sea una
diana extremadamente ineficaz o que no sea una diana de la
degradación post-transcripcional inducida por el
virus (TYLCSV desprovisto_de_silenciamiento_de_la_CP, en la parte
inferior; SEQ ID No. 6). En la secuencia sintética, los nucleótidos
mutados en relación con la secuencia de tipo natural se muestran
sombreados.
\vskip1.000000\baselineskip
En una infección natural por el TYLCSV de
plantas de tipo natural, las secuencias virales transcritas por las
dos cadenas del genoma del TYLCSV son la diana del silenciamiento
génico post-transcripcional tal como se pone de
manifiesto por la presencia de ARNip homólogos en distintas partes
del genoma (figura 5). En la figura 5 se muestran los resultados de
la técnica de hibridación tipo Northern de los ARNs totales
extraídos de plantas de tomate de tipo natural infectadas por el
TYLCSV (muestras 1-4) y del control no infectado
(muestra C). La sonda y los sitios de restricción usados se indican
al lado de cada panel. También se exponen los tamaños estimados de
los ARNip.
Para evaluar si algunas regiones del genoma del
TYLCSV constituyen una diana de silenciamiento génico
post-transcripcional menos eficaces que otras, se
llevó a cabo un estudio sistemático de la distribución de ARNip en
relación con su posición en el genoma viral. Por consiguiente, el
genoma del TYLCSV se ha dividido en nueve fragmentos contiguos,
cada uno de aproximadamente trescientos pares de bases (tal como se
dibuja en la figura 6), obtenidos mediante PCR con oligonucleótidos
específicos. Se ha transferido la misma cantidad de dichos
fragmentos en un filtro de nylon después de la electroforesis en
gel de agarosa. La cuantificación de los fragmentos de PCR cargados
en el gel de agarosa se ha llevado a cabo mediante el software Aida.
Los ARNip producidos por una planta de tomate infectada con el
TYLCSV se han purificado partiendo de los ARNs totales, marcados
terminalmente y utilizados como sonda (Szittya y col., 2002) en el
filtro que contiene varias regiones del genoma del TYLCSV. La
distinta intensidad de las señales de hibridación, referidas a la
misma cantidad de fragmento cargado, se ha evaluado a través del
aparato TYPHOON (Amersham-Pharmacia). Así se ha
detectado una distribución distinta de los ARNip en relación con
las distintas regiones del genoma viral (figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de identificar una región del gen C1 del
TYLCSV insuficientemente representada en la población de ARNip, se
han extraído los ARNs totales (Brunetti y col., 1997) tanto de
plantas de tomate sanas, como infectadas con el TYLCSV.
Treinta microgramos de dichos ARNs se sometieron
a una desnaturalización del 8% mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida y se transfirieron por capilaridad en un filtro de
nylon a través de la técnica de hibridación tipo Northern. Se han
producido dos réplicas idénticas y para cada una se ha llevado a
cabo una hibridación con sondas correspondientes a diferentes
partes de la región 5' del gen C1, tal como se muestra en la figura
7. Se ha hibridado un filtro con una sonda procedente de la parte 5'
del gen C1 que comprende 42 nt (42 nucleótidos) de la secuencia
líder no traducida y los primeros 630 nucleótidos del gen C1
(aproximadamente 3/5 del gen C1) (sonda A) y el otro filtro se ha
hibridado con una sonda procedente de la parte 5' del gen C1 que
comprende 42 nt de la secuencia líder no traducida y los primeros
390 nucleótidos del gen C1 (sonda B).
A fin de comparar de forma cuantitativa los
resultados obtenidos mediante las dos sondas diferentes (que
proceden de dos marcajes independientes), en ambas réplicas se han
cargado cantidades escalares de un mismo oligonucleótido de 40 mer
complementario para ambas sondas. Las columnas 100 y 50 se
corresponden con 100 y 50 picogramos de dicho oligonucleótido,
respectivamente. Los paneles que muestran la migración de
oligonucleótidos se han situado cerca de los paneles respectivos
que contienen los ARNip, aunque su posición en la figura no se
corresponde con la posición en el gel debido a que el
oligonucleótido y los ARNip tienen pesos moleculares diferentes.
Después de la transcripción in vitro las
dos sondas se han sometido a hidrólisis alcalina (Cox y col., 1984)
a fin de obtener de ellas fragmentos con una longitud media de 75
nucleótidos.
Las hibridaciones se han llevado a cabo durante
16 horas a 39ºC en el tampón descrito por Dalmay y col., 2000.
Después de la hibridación los filtros se han lavado en 2X SSC, SDS
al 0,2% durante 10 minutos a 40ºC, dos veces durante 10 minutos a
45ºC y una vez durante 10 minutos a 50ºC.
Es importante cuán insuficientemente
representada se encuentra la región 5' del gen C1 en la población de
ARNip. En particular, el análisis cuantitativo de los resultados
llevado a cabo a través del aparato TYPHOON
(Amersham-Pharmacia) reveló que los ARNip
correspondientes a esta región 5' son aproximadamente el 25% (sonda
B) en relación con aquellos que se corresponden con la región que se
extiende hasta los nucleótidos que codifican el aminoácido 210
(sonda A). Por consiguiente, la citada región 5' constituye una
diana ineficaz para el silenciamiento génico
post-transcripcional inducido por el virus.
Estos resultados se han confirmado mediante la
utilización del procedimiento descrito en el ejemplo 1, es decir,
el procedimiento en el que los fragmentos de PCR correspondientes
con las dos regiones diferentes del gen C1 se hibridaron con la
población de ARNip extraída de plantas de tomate infectadas por el
TYLCSV.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se señaló anteriormente (Brunetti y
col., 1997), las plantas transgénicas Rep-210
muestran una resistencia que no es de larga duración y un fenotipo
alterado.
Tal como se puede observar en la figura 1, el
gen C4 se encuentra anidado en el gen C1 truncado en un marco de
lectura distinto.
Se pone de manifiesto que la expresión
transgénica del gen C4 de los geminivirus induce alteraciones del
fenotipo (Krake y col., 1998).
Por consiguiente, se han diseñado varias
construcciones de C1 truncado que no son capaces de expresar el ORF
(marco de lectura abierto) de C4.
A fin de obtener mutantes C4 (-), se ha
introducido un codón de terminación en la secuencia de C4 a través
de la introducción de dos mutaciones puntuales. En particular, en
relación con la secuencia del pTOM130 expuesta en la figura 8 (SEQ
ID No. 8), la mutación en el nucleótido 233 consiste en una
transversión de C a G que convierte el codón TCA del marco de
lectura que codifica el C4 en TGA (ópalo). Además, la mutación en el
nucleótido 231 consiste en una transición desde C hasta T que
restaura en el marco de lectura que codifica C1 un codón de leucina
(CTC se transforma en TTG, más representado en plantas).
De ese modo, la traducción de la proteína C4 se
interrumpe después de solo 10 aminoácidos, mientras que la
secuencia de aminoácidos de la proteína C1 permanece sin cambios.
Las dos mutaciones introducidas se han escogido entre muchas
mutaciones posibles en base al criterio de generar un codón de
terminación "fuerte" en el marco de lectura
C4, manteniendo en el marco de lectura C1 un codón de leucina compatible con el uso del codón en las plantas.
C4, manteniendo en el marco de lectura C1 un codón de leucina compatible con el uso del codón en las plantas.
\vskip1.000000\baselineskip
La mutagénesis se ha llevado a cabo mediante PCR
con los siguientes oligonucleótidos mutados:
C4 más cebador (SEQ ID No. 10):
5'-CT CAT CTC CAT ATT
T T G ATC CAA TTC GAA
G-3'
C4 menos cebador (SEQ ID No. 11):
5'-C TTC GAA TTG GAT C A A
AAT ATG GAG ATG AG-3' (2419-2448 en
TYLCV - Kheyr-Pour y col., 1991).
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de los dos cebadores mutados se ha
utilizado junto con un cebador externo en dos reacciones PCR por
separado mediante la utilización de pGEM102 como cadena de ADN molde
(Brunetti y col., 2001).
En particular, los oligonucleótidos externos son
Rev y Univ (cebador de secuenciación M13/pUC n.1233 y 1224). A
partir de la reacción llevada a cabo con Univ/C4más se ha obtenido
un fragmento de 537 pb (pb = pares de bases), mientras que a partir
de la reacción con Rev/C4menos se ha obtenido un fragmento de 351
pb.
Los productos obtenidos se han utilizado como
cadenas de ADN molde para una reacción de amplificación ulterior
llevada a cabo mediante la utilización de dos cebadores
externos.
El producto de PCR obtenido se ha digerido con
enzimas de restricción EcoRI y BamHI y se clonó dentro de los
sitios correspondientes de pJIT60, obteniendo de ese modo pJITR210.
En ambos casos se ha llevado a cabo la secuenciación para verificar
los clones.
\vskip1.000000\baselineskip
A efectos de definir la región terminal 5'
mínima del gen C1 capaz de conferir resistencia contra el TYLCSV,
se clonaron una serie de mutantes de deleción del extremo terminal
3' del gen C1 en el vector de expresión pJIT60, lo que dio como
resultado una serie de pJTR.
Las secuencias virales se han amplificado
mediante PCR con Pfu ADN polimerasa (Stratagene), mediante la
utilización de cebadores específicos que contenían sitios de
restricción en los extremos.
Como cadena de ADN molde se ha usado el plásmido
pJITR210 descrito anteriormente, que codifica la
Rep-210 y contiene un codón de terminación para la
proteína C4 interna. Los fragmentos obtenidos mediante las
reacciones de amplificación se han digerido con enzimas BamHI y
EcoRI y se han clonado en los sitios correspondientes de pJIT60
dando como resultado la serie pJTR.
Todos los clones finales se han secuenciado para
confirmar la fidelidad de la amplificación y las uniones
vector-inserto. La longitud y las posiciones
precisas de cada secuencia amplificada se exponen en la Tabla
6.
La capacidad de cada mutante de deleción Rep
para conferir resistencia contra el TYLCSV se ha evaluado a través
de ensayos de co-transfección de protoplastos de
N. benthamiana de tipo natural con un clon infeccioso de
TYLCSV (pTOM6) junto con cada mutante y después se analizó el nivel
de replicación del genoma viral a través de la técnica de
hibridación tipo Southern. Los resultados obtenidos se exponen en
las figuras 9 y 10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cotransfección de protoplasto, la extracción
del ácido nucleico total y el análisis Southern se han llevado a
cabo de acuerdo con procedimientos ya descritos (Brunetti y col.
2001).
Los extractos de ácidos nucleicos totales de
cada muestra de protoplasto se han analizado a través de la técnica
de hibridación tipo Southern con una sonda de ADN marcada con
digoxigenina que se corresponde con la secuencia que codifica la
Rep-210 y como control se ha usado el plásmido
pGEM-P. En particular, la figura 9 representa un
análisis obtenido mediante la técnica de hibridación tipo Southern
de ácidos nucleicos totales, en el que ADNsc y ADNmc significan ADN
superenrollado y ADN monocatenario de TYLCSV, respectivamente.
Para un análisis cuantitativo preciso del efecto
de la expresión de varias formas truncadas de la Rep en la
replicación del genoma del TYLCSV, se ha llevado a cabo un análisis
Southern con una sonda de ADN marcada con ^{32}P que se
corresponde con la región que codifica los primeros 54 aminoácidos
N-terminales de la Rep y se ha evaluado el nivel de
radioactividad correspondiente a cada banda detectada en el filtro,
a través de un análisis realizado con un aparato Istant Imager
(Canberra, Packard).
Cada construcción mutada se ha ensayado por
duplicado, en tres experimentos independientes y el valor expuesto
en la figura 10 representa la media de dos o tres cotransfecciones
de tres experimentos independientes.
El nivel de replicación del TYLCSV en los
experimentos de cotransfección llevados a cabo con pTOM6 junto con
plásmido de control pGEM-P se consideró igual al
100%.
En particular, la figura 10 muestra un análisis
cuantitativo, las barras blancas y negras de los histogramas
representan las cantidades de ADN superenrollado y de ADN
monocatenario, respectivamente; las barras de error indican la
desviación típica de la media.
Tal como se pone de manifiesto mediante la
observación de las figuras 9 y 10, los primeros 130 aminoácidos
N-terminales de la proteína Rep son suficientes para
inhibir casi por completo la replicación viral, mientras que la
expresión de los primeros 120 aminoácidos
N-terminales no tiene influencia.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de la capacidad para inhibir la
replicación del TYLCSV por las Rep mutantes evaluado a través de la
expresión transitoria en protoplasmas, ha revelado que el mutante
más corto aún codifica de forma eficaz la Rep-130
(SEQ ID No. 9) tal como se describió en el ejemplo precedente.
También se ha revelado anteriormente en otros
ejemplos que la parte 5' proximal del gen C1 que codifica la
Rep-130 es una diana menos eficaz del silenciamiento
génico post-transcripcional en comparación con la
secuencia que codifica la Rep-210.
Por consiguiente, se han obtenido plantas
transgénicas de N. benthamiana que expresan la
Rep-130. Para este propósito, se ha obtenido el
plásmido pTOM130 representado en la figura 11 mediante la clonación
del fragmento KpnI-BglII de pJTR130 dentro de los
sitios KpnI-BamHI de pBIN19. La N.
benthamiana se ha transformado con la cepa pGV2260 C58 de A.
tumefaciens que contiene plásmido pTOM130 y se han regenerado
plantas resistentes a la kanamicina plantas tal como se describe
(Noris y col. 1996).
Los transformantes primarios se han analizado
para determinar la presencia de transgen mediante análisis PCR y
para determinar la expresión de la proteína Rep-130
a través de una técnica de hibridación tipo Western, tal como se
muestra en la figura 12.
Los extractos de proteína obtenidos de plantas
transgénicas (300-309) o de plantas de control de
tipo natural (wt) se han analizado mediante la técnica de
hibridación tipo Western utilizando un anticuerpo primario
policlonal de conejo Rep anti-TYLCSV tal como se
describió (Noris y col., 1996).
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de llevar a cabo la evaluación temprana de
la resistencia conferida por la Rep-130, se
transfectaron protoplastos aislados de varias plantas transgénicas
de N. benthamiana que expresaban la Rep-130
con un clon infeccioso del TYLCSV (pTOM6).
Las líneas transgénicas se han escogido por su
elevada expresión de la Rep-130, tal como se reveló
mediante el análisis de la técnica de hibridación tipo Western
(figura 12).
El nivel de replicación del TYLCSV en dichos
protoplastos transgénicos se ha comparado con el observado en N.
benthamiana de tipo natural y en protoplastos transgénicos que
expresan la Rep-210 (línea 102.22).
En particular, la figura 13 muestra el análisis
de la replicación del TYLCSV en protoplastos de N.
benthamiana de tipo natural (wt, por sus siglas en inglés) y
transgénicos que expresan la proteína Rep-130 (SEQ
ID No. 9) (líneas 300, 301, 303) o la proteína
Rep-210 (102.22). Los extractos de ácidos nucleicos
totales procedentes de varias muestras de protoplastos se han
analizado mediante la técnica de hibridación tipo Southern
utilizando una sonda de ARN marcada con digoxigenina que se
corresponde con la transcripción de la Rep-210.
A fin de comparar el nivel de replicación del
TYLCSV en los protoplastos transgénicos de la
Rep-130 con el observado en protoplastos de tipo
natural, también se han cargado los ácidos nucleicos totales
extraídos de protoplastos de tipo natural siguiendo diluciones 1:10
y 1:50, tal como se muestran en la figura 13.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de la capacidad para inhibir la
replicación del TYLCSV por las Rep mutantes, evaluado a través de
la expresión transitoria en protoplasmas, ha revelado que el mutante
más corto aún codifica de forma eficaz la Rep-130,
tal como se describió en el ejemplo anterior.
Tal como se mostró anteriormente, la parte 5'
proximal del gen C1 que codifica la Rep-130 es una
diana ineficaz del silenciamiento génico
post-transcripcional comparada con la secuencia que
codifica la Rep-210.
Por consiguiente, se ha llevado a cabo la
producción de plantas transgénicas de tomate (Lycopersicon
esculentum cv. Moneymaker) que expresan la
Rep-130.
El tomate se ha transformado mediante la
utilización de la cepa pGV2260 C58 de A. tumefaciens que
contiene plásmido pTOM130 (figura 11) y se regeneraron plantas
resistentes a la kanamicina tal como se describió (Brunetti y col.
1997).
Los transformantes primarios se han analizado
para determinar la presencia del transgen mediante análisis PCR y
para determinar la expresión de la proteína Rep-130
a través de la técnica de hibridación tipo Western (figura 14).
Los extractos de proteína obtenidos de plantas
transgénicas (líneas 400) o de plantas de control de tipo natural
(wt) se han analizado mediante la técnica de hibridación tipo
Western utilizando un anticuerpo primario policlonal de conejo Rep
anti-TYLCSV tal como se describió (Noris y col.,
1996).
Todas las plantas transgénicas de tomate que
expresan la proteína Rep-130 son imposibles de
distinguir fenotípicamente de las plantas de tipo natural (figura
15).
\vskip1.000000\baselineskip
A efectos de evaluar la duración de la
resistencia contra el TYLCSV conferida por la expresión de la
Rep-130, se han agroinoculado plantas transgénicas
N. benthamiana R1 que expresan la Rep-130 con
la cepa LBA4404 de A. tumefaciens que contiene el clon
infeccioso del TYLCSV.
Tal como se informó anteriormente, la
administración viral a través de agroinoculación, utilizada para
evaluar la resistencia y para evaluar la estabilidad con el
transcurso del tiempo, se corresponde con condiciones de presión
viral altas o muy altas.
La infección de plantas se ha evaluado a
intervalos semanales mediante un ensayo de "impresión de
tejidos", utilizando una sonda marcada con digoxigenina
específica para el gen de la proteína de la cubierta.
Los resultados de la Tabla 7 muestran que, a
diferencia de los resultados descritos en la Tabla 2 en lo que se
refiere a plantas transgénicas que expresan la
Rep-210, las plantas transgénicas de N.
benthamiana que expresan la proteína Rep-130
muestran una resistencia de larga duración cuando se agroinoculan
con el TYLCSV. Esto se puede deducir mediante la comparación de las
plantas resistentes a las 2 y a las 6 semanas después de la
inocula-
ción.
ción.
Además, se ha evaluado la estabilidad de la
resistencia contra el TYLCSV conferida por la expresión de la
Rep-130 en plantas transgénicas R2 de tomate.
Las plantas se han agroinoculado con la cepa
C58C1+pCH32 de A. tumefaciens que contiene el clon infeccioso
del TYLCSV. Las condiciones de agroinoculación usadas para la
evaluación de la resistencia y para la evaluación de la estabilidad
de la misma con el transcurso del tiempo, se corresponden con
condiciones de presión viral altas o muy altas.
La infección se ha evaluado a intervalos de una
o dos semanas a través de un ensayo de transferencia puntual,
mediante la utilización de una sonda marcada radioactivamente
específica para el gen de la proteína de la cubierta.
Los resultados mostrados en la Tabla 8 ponen de
manifiesto que las plantas transgénicas de tomate que expresan la
Rep-130 muestran una resistencia de larga duración
cuando se agroinoculan con un clon infeccioso del TYLCSV. Esto se
puede deducir de la comparación de las plantas resistentes a las 3 y
a las 12 semanas después de la inoculación.
Por consiguiente, la resistencia se asocia a la
presencia de la proteína Rep-130 (SEQ ID No. 9) y a
la capacidad de la planta transgénica inoculada con el TYLCSV para
expresar de forma estable la Rep-130, ya que la
secuencia que codifica ésta es una diana ineficaz del
silenciamiento génico post-transcripcional inducido
por el virus y la Rep, incluso si además se muta, mantiene su
capacidad para conferir resistencia al virus.
\vskip1.000000\baselineskip
A efectos de lograr la expresión de larga
duración de la proteína Rep-210 del TYLCSV en
plantas transgénicas, se ha producido, empleando el procedimiento
según la presente invención, una secuencia de polinucleótidos
sintéticos capaz de codificar para la proteína
Rep-210, que no es o que es una diana ineficaz del
silenciamiento génico post-transcripcional inducido
por el virus infectante.
Además, se han seguido los siguientes
criterios:
- -
- la secuencia de polinucleótidos sintéticos no es capaz de codificar la proteína C4, teniendo en las posiciones 231 y 233 las mismas mutaciones que las mostradas en la figura 8, tal como se describió para la Rep-130 (SEQ ID No. 8; SEQ ID No. 9);
- -
- todas las mutaciones introducidas son silenciosas, es decir, el producto de proteína codificado por la secuencia de polinucleótidos sintéticos se empareja con el producto de proteína codificado por la secuencia viral de tipo natural;
- -
- las mutaciones se introdujeron de acuerdo con la frecuencia del uso del codón en los genes de tomate; en particular, siempre que fue posible se seleccionó el codón usado más frecuentemente en el tomate;
- -
- se han comprobado todas las mutaciones introducidas para excluir la posible formación de secuencias que tuviesen una función en particular, tal como por ejemplo señales de poliadenilación o de corte y empalme, también crípticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo los criterios descritos anteriormente,
se han diseñado dos secuencias sintéticas que codifican la
Rep-210 (figura 16A y B, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3,
SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5).
Se han añadido una secuencia líder no traducida
en el extremo 5' y un codón de terminación en el extremo 3' a la
secuencia del gen sintético de la Rep-210
desprovista de silenciamiento B (SEQ ID No. 4).
En particular, la secuencia de polinucleótidos
contenida en el orden 5'-3' de la secuencia líder no
traducida, la secuencia sintética que codifica la
Rep-210 (figura 16B; SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5) y
el codón de terminación, se han ensamblado mediante PCR partiendo
de oligonucleótidos (Prodromou y Laurence, 1992; Stemmer y col.,
1995), mediante la utilización de una ADN polimerasa termoestable
con actividad de "corrección" (Pfu ADN polimerasa, Stratagene
y/o Pfx ADN polimerasa, Invitrogen).
Posteriormente se ha clonado el gen sintético en
plásmido pJIT60 bajo el control transcripcional del promotor 35S
del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y de las
secuencias de terminación de la transcripción del CaMV 35S, lo que
produjo el pJT60Syn. A continuación el casete que contiene en el
orden 5'-3': promotor 35S, gen sintético de la
Rep-210, terminador 35S, se ha eliminado del
plásmido pJT60Syn mediante restricción con KpnI-BglII
y se clonó en los sitios KpnI-BamHI del plásmido
binario pBIN19 generando pTOM102Syn.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión correcta de la proteína
Rep-210, codificada por el gen sintético, se ha
comprobado a través de la agroinfiltración de hojas de N.
benthamiana, con C58C1/pCH32 de A. tumefaciens
transformada con pTOM102Syn. Como control positivo se ha usado la
cepa C58C1/pCH32 transformada con pTOM10 2 (C4 -), mientras que como
control negativo se usó la cepa C58C1/pCH32 transformada con el
plásmido binario pBIN19. El análisis realizado mediante la técnica
de hibridación tipo Western (figura 17) muestra la expresión de la
proteína Rep-210 codificada por el gen
sintético.
A efectos de evaluar la capacidad de la proteína
Rep-210, codificada por pTOM102Syn, para inhibir la
replicación del TYLCSV, se ha llevado a cabo un ensayo de
co-agroinfiltración transitoria. Las hojas de N.
benthamiana se han co-agroinfiltrado con la
cepa C58C1/pCH32 de A. tumefaciens que contiene el clon
infeccioso (pTOM6) del TYLCSV junto con la cepa C58C1/pCH32 de
A. tumefaciens que contiene: a) plásmido pTOM10 2Syn; b)
plásmido pTOM10 2 (C4-); c) plásmido binario pBIN19. La replicación
del TYLCSV se ha evaluado a través de un análisis mediante la
técnica de hibridación de tipo Southern de los ácidos nucleicos
totales extraídos de los tejidos co-agroinfiltrados
72 horas después de la infiltración. Este análisis ha puesto de
manifiesto que la proteína Rep-210 expresada por el
gen sintético (pTOM102Syn) y por el gen de tipo natural
pTOM102(C4 -), inhibe la replicación del TYLCSV de una forma
similar (figura 18).
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de obtener plantas transgénicas de N.
benthamiana que expresen el gen sintético para la
Rep-210, se han transformado discos de hojas de
N. benthamiana mediante la utilización de la cepa LBA 4404 de
A. tumefaciens que contiene el plásmido pTOM 102Syn y las
plantas resistentes a la kanamicina se han regenerado tal como se
describió (Noris y col. 1996).
Los transformantes primarios se han analizado
para determinar la expresión de la proteína Rep-210
mediante el análisis de la técnica de hibridación tipo Western.
Para llevar a cabo estudios adicionales se han seleccionado cuatro
transformantes primarios, líneas 506, 508, 517 y 537 que acumulan
niveles intermedios de la Rep-210. La figura 19
muestra el análisis realizado mediante la técnica de hibridación
tipo Western de proteínas extraídas de las plantas 506, 508A y
508B.
\vskip1.000000\baselineskip
Los autores han mostrado anteriormente (Noris y
col. 1996; Brunetti y col. 1997) que hay una correlación directa
entre las cantidades de la proteína Rep-210
producidas por las plantas transgénicas y la resistencia contra el
TYLCSV. Las plantas transgénicas transformadas con la construcción
pTOM102 que acumulan niveles intermedios de la proteína
Rep-210 son susceptibles a la infección viral, como
las plantas no transformadas (Noris y col. 1996 y datos sin
publicar). El bajo nivel de la proteína Rep-210
presente en estas plantas no es suficiente para inhibir por
completo la replicación viral, permitiendo de ese modo el
establecimiento de un silenciamiento
post-transcripcional temprano inducido por virus que
conduce a una reducción drástica en la acumulación de la proteína
Rep-210, lo que causa falta de resistencia.
Para evaluar si la proteína
Rep-210 codificada por el gen sintético no es o es
una diana ineficaz del silenciamiento génico
post-transcripcional inducido por virus y, por
consiguiente, para controlar la infección viral con el transcurso
del tiempo, se han agroinoculado con el TYLCSV plantas transgénicas
(R3) de la línea 102.22 y plantas transgénicas (R0) de la línea 506
que expresan una cantidad similar de la Rep-210
(figura 20, 0 spi) y se han analizado mediante el ensayo de
transferencia puntual a intervalos semanales para determinar la
acumulación del TYLCSV. Tal como se esperaba (Noris y col., 1996)
las plantas transgénicas R3 de la línea 102.22 (figura 21,
5-8) que acumulan niveles intermedios de la proteína
Rep-210 son tan susceptibles como las plantas no
transformadas (figura 21, 1-4). Según se muestra
mediante el análisis del ensayo de transferencia puntual (figura
21, 9-12) las plantas transgénicas para la
construcción sintética (R0 línea 506) son resistentes a la
infección viral, acumulando solo cantidades limitadas de virus.
Curiosamente y de acuerdo con la incapacidad del virus para
silenciar post-transcripcionalmente de forma eficaz
el gen sintético, la Rep-210 aún se estaba
acumulando 5 semanas después de la inoculación (figura 20, 5 spi) e
inhibiendo con el transcurso del tiempo la replicación del TYLCSV
(figura 21, 9-12).
Los resultados descritos en los ejemplos ponen
de manifiesto que es posible obtener una resistencia de larga
duración contra los geminivirus mediante la expresión en la planta
de un transgen compuesto de una secuencia de polinucleótidos
procedente de patógeno, si la última se selecciona o se modifica de
forma adecuada a efectos de no ser una diana o de ser una diana
ineficaz del silenciamiento génico
post-transcripcional por el virus infectante.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como se indicó anteriormente, la expresión
transgénica de la proteína de la cápside del TYLCV en un híbrido
interespecífico de tomate (Lycopersicon esculentum X L.
pennellii) confiere una resistencia parcial contra la infección
viral (Kunik y col., 1994). Además, en este caso, la resistencia
mediada por la expresión de la proteína de la cápside no es
duradera.
A efectos de obtener una expresión estable de la
proteína de la cápside (CP, por sus siglas en inglés) por plantas
transgénicas, se ha producido una secuencia de polinucleótidos
sintéticos capaz de codificar la CP, lo que da como resultado una
diana ineficaz del silenciamiento génico
post-transcripcional inducido por el virus.
La secuencia de polinucleótidos sintéticos se ha
diseñado de manera que satisfaga el requisito de no ser o de ser
una diana extremadamente ineficaz del silenciamiento génico
post-transcripcional inducido por el virus
empleando el procedimiento según la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se han seguido los siguientes
criterios:
- -
- todas las mutaciones introducidas son silenciosas, es decir, el producto de proteína codificado por la secuencia de polinucleótidos sintéticos se empareja de forma exacta con la codificada por la secuencia viral de tipo natural;
- -
- las mutaciones introducidas tienen en cuenta la frecuencia del uso del codón en los genes de tomate; en particular, siempre que es posible se selecciona el codón usado más frecuentemente en el tomate;
- -
- se han comprobado todas las mutaciones introducidas para excluir la posible formación de secuencias que tuviesen una función en particular, tal como por ejemplo señales de poliadenilación o de corte y empalme, también crípticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo los criterios descritos anteriormente,
se ha diseñado una secuencia sintética que codifica la CP (SEQ ID
No. 12) (figura 22, TYLCSV desprovisto de silenciamiento de la CP,
SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7).
\vskip1.000000\baselineskip
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plantas transgénicas caracterizadas por resistencia duradera a los
Geminivirus
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCT25622
\vskip0.400000\baselineskip
<140> RM2003A000242
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-05-19
\vskip0.400000\baselineskip
<150> RM2003A000242
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-05-19
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 630
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Geminivirus TYLCSV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 630
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia modificada de la
Rep-210 del TYLCSV
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(630)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 630
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia modificada de la
Rep-210 del TYLCSV
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(630)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 774
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia modificada de la proteína
de la cubierta del TYLCSV
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(774)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 447
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la Rep 130 del
TYLCSV
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51)..(443)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (231)..(231)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutación puntual desde C
(Rep-210 de tipo natural) hasta T
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (233)..(233)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutación puntual desde C (Rep 210 de
tipo natural) hasta G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para mutagénesis de C4
mediante PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcatctcca tattttgatc caattcgaag
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para mutagénesis de C4
mediante PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcgaattg gatcaaaata tggagatgag
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 774
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Geminivirus TYLCSV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (28)
1. Secuencia de genes V1/AR1/AV1 o C1/AL1/AC1
mutados de un geminivirus que infecta al tomate, en la que las
mutaciones consisten en mutaciones puntuales distribuidas a lo largo
de la secuencia de tal modo que la homología continua entre la
secuencia mutada y la secuencia de genes virales correspondiente se
encuentra por debajo de o es igual a 8 nucleótidos, preferentemente
por debajo de o igual a 5 nucleótidos, codificando la citada
secuencia mutada para una proteína de la cápside de tipo natural o
para una proteína Rep truncada, respectivamente.
2. Secuencia de genes V1/AR1/AV1 mutados, según
la reivindicación 1, que codifica para una proteína de la cápside,
teniendo la citada proteína la secuencia con el SEQ ID No. 7.
3. Secuencia de genes V1/AR1/AV1 mutados, según
la reivindicación 2, teniendo la citada secuencia de genes la
secuencia con el SEQ ID No. 6.
4. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según
la reivindicación 1, que codifica proteínas Rep truncadas que
constan de entre 130 aminoácidos (Rep 130) y 210 aminoácidos (Rep
210), teniendo lugar el citado truncamiento en el extremo terminal
3'.
5. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según
la reivindicación 4, que codifica para la proteína Rep 210 que
tiene la secuencia de proteína con el SEQ ID No. 3.
6. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según
la reivindicación 5, teniendo la citada secuencia de genes la
secuencia con el SEQ ID No. 2.
7. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según
la reivindicación 4, que codifica para la proteína Rep 210 que
tiene la secuencia de proteína con el SEQ ID No. 5.
8. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según
la reivindicación 7, teniendo la citada secuencia de genes la
secuencia con el SEQ ID No. 4.
9. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados que
codifica para la proteína Rep 130 que tiene la secuencia de proteína
con el SEQ ID No. 9.
10. Secuencia de genes C1/AL1/AC1 mutados, según
la reivindicación 9, teniendo la citada secuencia de genes la
secuencia con el SEQ ID No. 8.
11. Secuencia de genes mutados, según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el geminivirus
que infecta el tomate es el TYLCSV.
12. Construcción sintética que comprende una
secuencia de polinucleótidos heterólogos que contiene en la
dirección 5'-3':
- a)
- una secuencia de polinucleótidos que actúa como promotor en la citada planta o tejido o células transformadas;
- b)
- una secuencia de polinucleótidos no traducida situada en la posición 5' de la región que codifica;
- c)
- una secuencia de genes mutados según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11;
- d)
- una secuencia que actúa como terminador de la trascripción, situada en la posición 3' en relación con la secuencia de genes mutados.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Vector de expresión que comprende la
construcción definida según la reivindicación 12.
14. Planta transgénica, tejido o células de
planta de la misma, que comprende en su genoma una secuencia de
genes mutados según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
11.
15. Semilla que comprende en su genoma una
secuencia de genes mutados según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11.
16. Procedimiento para la preparación de plantas
transgénicas, tejido de plantas o células de las mismas que tienen
resistencia de larga duración contra los geminivirus, que incluye
las siguientes etapas:
- a)
- identificación o selección de una secuencia de genes virales que codifique una secuencia de aminoácidos capaz de conferir resistencia contra los geminivirus;
- b)
- mutagénesis de la secuencia de genes virales de manera que se genere una diana ineficaz del silenciamiento génico post-transcripcional inducido por el geminivirus infectante en la que las mutaciones consisten en:
- i)
- mutaciones puntuales distribuidas a lo largo de la secuencia de tal manera que la homología continua entre la secuencia mutada y la secuencia de genes virales correspondiente de la etapa a) se encuentra por debajo de o es igual a 8 nucleótidos y/o
- ii)
- deleciones de las regiones 5' ó 3' de la secuencia de genes virales de la etapa a) hasta la identificación de la región mínima de la citada secuencia de genes que es una diana ineficaz del silenciamiento génico post-transcripcional inducido por el geminivirus infectante comparada con la secuencia viral original de la etapa a) y en la que la citada proteína truncada mantiene la capacidad de conferir resistencia contra los geminivirus;
- c)
- inserción en la planta, tejido de la planta o célula de la misma, de la secuencia de genes de geminivirus mutada en la etapa b), mediante la utilización de una construcción que comprende una secuencia de polinucleótidos heterólogos que contiene en la dirección 5'-3':
- i)
- una secuencia de polinucleótidos que actúa como promotor en la citada planta o tejido o células transformadas;
- ii)
- una secuencia de polinucleótidos no traducida situada en la posición 5' de la región que codifica;
- iii)
- una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos procedentes de geminivirus, mutagenizados de forma adecuada para ser una diana ineficaz del silenciamiento génico post-transcripcional inducido por el geminivirus infectante;
- iv)
- una secuencia que actúa como terminador de la trascripción situada en la posición 3' en relación con la citada secuencia de polinucleótidos.
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17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que la citada homología continua entre la secuencia mutada y la
secuencia de genes virales correspondiente de la etapa a) está por
debajo o es igual a 5 nucleótidos.
18. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 17, en el que los geminivirus se seleccionan
entre el grupo constituido por las especies de Mastrevirus,
Curtovirus, Begomovirus y Topocuvirus y aislados de los
mismos.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que las especies de Begomovirus son TYLCCNV, TYLCGV,
TYLCMalV, TYLCSV, TYLCTHV, TYLCV, ACMV, BGMV, CaLCuV, ToCMoV, TGMV,
ToGMoV, ToMHV, ToMoTV, ToMoV, ToRMV, ToSLCV, ToSRV, virus del
arrugamiento de las hojas de algodón (CLCrV, CLCuAV, ClCuGV, CLCuKV,
CLCuMV, CLCuRV), virus del mosaico del ñame del Este de África
(EACMCV, EACMMV, EACMV, EACMZV), virus del mosaico amarillo de la
patata (PYMPV, PYMTV, PYMV), virus de la rizadura de la calabaza
(SLCCNV, SLCV, SLCYV), virus de la rizadura de la batata (SPLCGV,
SPLCV), virus de la rizadura del tabaco (TbLCJV, TbLCKoV, TbLCYNV,
TbLCZV), virus de la rizadura del tomate (ToLCBV, ToLCBDV, ToLCGV,
ToLCKV, ToLCLV, ToLCMV, ToLCNDV, ToLCSLV, ToLCTWV, ToLCVV, ToLCV) y
aislados de los mismos.
20. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que las especies que pertenecen al género Mastrevirus,
Curtovirus, Topocuvirus se seleccionan entre el grupo
constituido por WDV, MSV, SSV, BYDV, TYDV, BCTV y aislados de los
mismos.
21. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, en el que la secuencia de genes se
selecciona entre el grupo constituido por C1/AL1/AC1, C2/AL2/AC2,
C3/AL3/AC3, C4/AL4/AC4, V1/AR1/AV1, V2/AR2/AV2, BC1/BL1 y BV1/BR1,
que pertenecen a los geminivirus.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que la secuencia de genes C1/AL1/AC1 pertenece al TYLCSV.
23. Procedimiento según las reivindicaciones 16
y 22, en el que la secuencia de aminoácidos es una proteína
truncada en relación con la proteína viral de tipo natural.
24. Procedimiento según las reivindicaciones 16
a 19 y 23, en el que las secuencias de genes virales hechas dianas
ineficaces del silenciamiento génico
post-transcripcional inducido por virus son el SEQ
ID No. 8, SEQ ID No. 2 e SEQ ID No. 4.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, en
el que las proteínas truncadas son el SEQ ID No. 9 ó el SEQ ID No.
3 ó el SEQ ID No. 5.
26. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que la secuencia de genes V1/AR1/AV1 pertenece al TYLCSV.
27. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, 21 y 26, en el que la secuencia de genes
virales hecha una diana ineficaz del silenciamiento génico
post-transcripcional inducido por virus es el SEQ
ID No. 6 que codifica para el SEQ ID No. 7 de la proteína de la
cápside.
28. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 27, en el que las plantas, tejidos o células
de las mismas pertenecen al grupo constituido por tomate, pimiento,
tabaco, calabaza, ñame, batata, algodón, melón, patata, soja, maíz,
trigo, caña de azúcar, judías, remolacha.
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