CN110669776B - 一种甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆及其构建方法。该方法以甘薯湖北曲叶病毒为材料对病毒基因组通过无缝克隆技术插入植物表达载体中，得到含有2倍甘薯湖北曲叶病毒全基因组重组载体；所述重组载体即为甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆；所述甘薯湖北曲叶病毒基因组DNA序列如SEQ ID NO:8所示。本发明首次制备得到能通过农杆菌浸润法接种侵染本氏烟的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆，对进一步研究甘薯湖北曲叶病毒致病机制、甘薯病毒基因功能、病毒与寄主互作、弱毒株系创制等研究奠定基础，研究结果具有重要意义和参考价值。

Description

一种甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆及其构建方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆及其构建方法。

背景技术

甘薯双生病毒(Sweepoviruses)是甘薯上一类重要病毒，属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，世界上广泛分布，可造成甘薯产量降低和种性退化。甘薯湖北曲叶病毒(Sweet potato leaf cur Hubei virus，SPLCHbV)是Begomovirus属的一个新种。基因组大小2.8Kb左右，基因组有6个开放阅读框(openreading frames,ORF)，分别为病毒链编码的AV1和AV2，互补链编码的AC1、AC2、AC3和AC4。AV2和AC1之间含有一个非编码区，又称基因间隔区(intergenic region，IR)。

为了研究SPLCHbV基因功能和致病机制，构建SPLCHbV侵染性克隆。病毒侵染性克隆是指利用基因重组技术把含有病毒全长基因组基因序列插入特定载体中获得具有侵染寄主的功能的重组载体。双生病毒侵染性克隆的构建时通常是构建一个具有1.3～2.0个拷贝的正向重复的双生病毒基因组重组质粒(Trenado et al,2011；Bi,et al,2014)。由于IR(intergenic region,IR)区包含病毒复制所必须的调控元件，因此该正向重复序列中必须包括2个完整的IR区(Trenado et al,2011；Bi et al，2014)。由于甘薯双生病毒属于旧世界病毒，目前只发现DNA-A的组分，获得甘薯双生病毒侵染性克隆难度比较大，报道中至少有2例在试图获得侵染性克隆中失败，如Lotrakul等从环状质粒中获取甘薯乔治亚卷叶病毒(Sweet potato leaf curl Georgia virus,SPLCGoV)基因组并进行体外环化，然后利用电转化侵染27株番薯属植物，结果无一株被侵染，没能获得侵染性克隆(Lotrakul et al2003)。Paprotka等利用RCA方法从感染甘薯双生病毒的甘薯中扩增甘薯双生病毒基因组DNA多聚体，随后用基因枪接种本生烟和一些番薯属几个种的植物，结果证明获得的基因组无侵染性(Paprotka et al,2010)。

SPLCHbV是一种新发现的甘薯双生病毒种，病毒基因组与最相近甘薯圣保罗曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Sao Paulo virus,SPLCSPV)核酸(HQ393477)相似性最高为72.7％，甘薯双生病毒种的分类标准为核酸相似性小于91％，SPLCHbV核酸与属内其它种病毒核酸相似性较低，比较特异，对其基因功能、致病机制、体外蛋白互作、弱毒株系创建比较有意义，构建其侵染性克隆载体，为进一步研究基因功能、致病机制等奠定良好基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘薯湖北曲叶病毒的侵染性克隆及其构建方法。本发明构建的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆能稳定侵染本氏烟和甘薯等寄主植物。

为完成实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，包括以下步骤：将甘薯湖北曲叶病毒基因组DNA片段通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中，得到含有2倍甘薯湖北曲叶病毒全基因组DNA的重组表达载体；所述重组表达载体即为甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆；所述甘薯湖北曲叶病毒基因组DNA序列如SEQ ID NO:8所示。

进一步的，所述甘薯湖北曲叶病毒基因组DNA的克隆方法为：从甘薯湖北曲叶病毒侵染发病植株中提取甘薯总DNA，以总DNA为模板，利用滚还扩增法进行环状DNA扩增，获得病毒全基因组序列。

进一步的，所述植物表达载体为pCB301，所述重组表达载体上含有两段甘薯湖北曲叶病毒全基因组的DNA片段，分别为片段A和片段B，所述片段A位于pCB301多克隆位点的XbaI/BamHI酶切位点之间，所述片段B位于pCB301多克隆位点的BamHI/SmaI酶切位点之间。

更进一步的，用于扩增片段A的无缝克隆用引物分别为In-301-V3F1(X-B)和In-301-V3R1(X-B)，如SEQ ID NO:1～2所示，用于扩增片段B的无缝克隆用引物分别为In-301-V3F2(B-S)和In-301-V3R2(B-S)，如SEQ ID NO:3～4所示。

所述甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，具体包括以下步骤：

(1)从甘薯湖北曲叶病毒侵染发病植株中提取甘薯总DNA，以总DNA为模板，利用滚还扩增法(Rolling circle amplification，RCA)进行环状DNA扩增，获得病毒全基因组序列；

(2)利用内切酶BamHI对扩增产物进行充分酶切，回收2.8kb左右的甘薯湖北曲叶病毒(SPLCHbV)基因组片段；

(3)对PUC19载体进行BamHⅠ单酶切，随后对质粒酶切产物进行去磷酸化处理，纯化回收去磷酸化载体；

(4)将步骤(2)和步骤(3)得到的产物进行连接，获得含有一倍甘薯湖北曲叶病毒基因组的重组载体PUC19-SPLCHbV；

(5)利用载体pCB301上酶切位点结合病毒基因组序列设计了特异的用于无缝克隆引物In-301-V3F1(X-B)/In-301-V3R1(X-B)和In-301-V3F2(B-S)/In-301-V3R2(B-S)，使扩增出的序列含有病毒全基因组序列同时还含有与载体互补的16bp～18bp碱基。使用该引物进行病毒基因组克隆不受内切酶限制。

以重组质粒PUC19-SPLCHbV为模板分别用引物In-301-V3F1(X-B)/In-301-V3R1(X-B)和In-301-V3F2(B-S)/In-301-V3R2(B-S)进行扩增，分别获得用于In-fusion连接的产物A和产物B。

表1无缝克隆引物

引物名称	引物碱基序列(5'-3')
		In-301-V3F1(X-B)	GCAGGTCGACTCTAGATTCACATTATTGTTGGCCCAGTC
In-301-V3R1(X-B)	GCCGACCCGGGGATCCGGATCCCGCTGCGCGGCC
		In-301-V3F2(B-S)	CGACTCTAGAGGATCCGGATCCTTCACATTATTGTTGGCCCAGTC
In-301-V3R2(B-S)	ATGCCATGCCGACCCGGGCGCTGCGCGGCCGGAGAGGC

(6)对载体pCB301分别进行XbaI/BamHI和BamHI/SmaI双酶切，回收纯化双酶切产物，利用无缝克隆技术(In-fusion Cloning)分别与产物A和产物B连接，构建重组质粒pCB301-SPLCHbV-1.0A(X-B)和pCB301-SPLCHbV-1.0A(B-S)。

(7)对重组质粒pCB301-SPLCHbV-1.0A(X-B)进行XbaI/BamHI双酶切，回收2.8kb大小片段备用；对pCB301-SPLCHbV-1.0A(B-S)质粒进行BamHⅠ和SmaⅠ双酶切，回收7.4kb大小片段备用。

(8)连接步骤(7)中得到的构建2.8kb大小片段和7.4kb大小片段，构建含有2倍SPLCHbV全基因组的重组载体pCB301-SPLCHbV-2.0A(X-S)。

本发明的第二个方面，提供了利用上述方法制备得到的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆。

进一步的，所述甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆的核酸序列如SEQ ID.7所示。

本发明第三方面，提供含有上述的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆的重组菌。

本发明第四方面，提供上述的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆或重组菌在研究甘薯湖北曲叶病毒生物学特性和/或致病机理和/或甘薯湖北曲叶病毒基因功能中的应用。

本发明第五方面，提供上述的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆或重组菌在研究甘薯湖北曲叶病毒与宿主植物互作中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次制备得到能通过农杆菌浸润法接种侵染本氏烟的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆，对进一步研究甘薯湖北曲叶病毒致病机制、病毒基因功能和弱毒株系的构建奠定基础，其结果具有重要意义。

本发明构建的侵染性克隆为首个甘薯湖北曲叶病毒的侵染性克隆。如背景技术所述，病毒侵染性克隆构建设计的技术性较强，过程存在构建的重组质粒载体无侵染性、以及载体不稳定等难题。如王艳娇PCR方法获得柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)，随后把病毒基因组插入双元表达载体pXT1(同载体pCB301)，验证构建方法、载体都有效，但构建重组质粒(载体)转化农杆菌获得4个阳性克隆，接种后分子检测仍未筛选到侵染性克隆(王艳娇，2017)。甘薯双生病毒侵染性克隆更难已获得，甘薯双生病毒方面至少已报到有2例失败的侵染性克隆研究实验。如Lotrakul等从环状质粒中获取甘薯乔治亚卷叶病毒(Sweet potato leaf curl Georgia virus,SPLCGoV)基因组并进行体外环化，然后利用电转化侵染27株番薯属植物，结果无一株被侵染，没能获得侵染性克隆(Lotrakul et al2003)。Paprotka等利用RCA方法从感染甘薯双生病毒的甘薯中扩增甘薯双生病毒基因组DNA多聚体，随后用基因枪接种本生烟和一些番薯属几个种的植物，结果证明获得的基因组无侵染性(Paprotka et al,2010)。

由于甘薯湖北曲叶病毒是甘薯双生病毒的一个新种，相关研究没有开展，本发明首次构建的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆载体，为病毒深入研究提供重要的工具。

附图说明

图1为pCB301-SPLCHbV-2.0A侵染性克隆载体构建策略图。

图2为pCB301-SPLCHbV-2.0A侵染性克隆载体酶切鉴定结果。1：DNA marker(15000bp)，2：质粒XbaⅠ酶切产物，3：质粒XbalⅠ和SmaⅠ酶切产物，4：质粒XbaⅠ/BamHⅠ酶切产物，5：质粒BamHⅠ/SmaⅠ酶切产物。

图3为pCB301-SPLCHbV-2.0A侵染性克隆的侵染性鉴定。

图4为pCB301-SPLCHbV-2.0A侵染性克隆侵染本生烟PCR检测结果。1：DNAmarker(5000bp)，2～3：SPLCHbV侵染植株，4：未侵染植株(-CK)，5:含有SPLCHbV质粒(+CK)。

图5为Southern Blot检测结果。M:DNA molecular-weight MarkerⅡ(125、564、2027、2322、4361、6557、9416、23130bp)1：烟草叶片DNA酶切产物；2～5:处理接种病毒烟草叶片DNA酶切产物。OC表示open circular double-stranded，SC表示supercoiled double-stranded，SS表示Single-standed。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料和试剂来源如下：

PUC19载体购自大连宝生物，去磷酸化处理用的是去磷酸化试剂盒，购自大连宝生物，pCB301载体由南京农业大学陶小荣老师惠赠，引物在上海生工公司合成，农杆菌菌株LB4404和GV3101上海英俊公司购买。

甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，具体如下：

1、甘薯湖北曲叶病毒的全基因组提取和酶切

(1)利用CTAB法，从甘薯湖北曲叶病毒侵染发病植株叶片中提取甘薯总DNA，以总DNA为模板，利用滚还扩增法(RCA)进行环状DNA扩增，获得甘薯湖北曲叶病毒的全基因组DNA。

(2)随后，利用内切酶BamHI对扩增产物进行充分酶切(16℃过夜酶切)，50μL反应体系中包含RCA产物10μL、10×buffer 5μL、BamH I 2μL、DdH₂O 33μL。37℃，酶切16小时。1％琼脂糖电泳内切酶消化产物，切胶回收2.8kb左右的SPLCHbV基因组片段。

2、含甘薯湖北曲叶病毒基因组的重组载体PUC19-SPLCHbV的制备

将步骤1得到的产物连接到载体PUC19中，具体方法：20μL连接体系中分别添加PUC19胶回收载体4.5μL、T4连接酶5U、10×T4 buffer 2μL、SPLCHbV DNA片段12μL，16℃反应16小时。转化大肠杆菌感受态细胞TG1，涂布于含有氨苄青霉素(100mg/L)的固体LB平板上，37℃倒置培养12～16小时，待长出单斑菌落，挑起单斑菌落(单克隆)于10mL含有抗生素氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16小时，提取质粒。获得含有一倍甘薯湖北曲叶病毒基因组的重组载体PUC19-SPLCHbV。

3、设计无缝克隆引物并扩增重组质粒PUC19-SPLCHbV

根据载体pCB301多克隆位点序列和甘薯湖北曲叶病毒全基因组序列和内切酶位点设计无缝克隆引物(病毒引物和载体引物复合体，引物包含载体上多克隆相应酶切位点和与载体互补的16～18个碱基序列，见表1：In-301-V3F1(X-B)/In-301-V3R1(X-B)和In-301-V3F2(B-S)/In-301-V3R2(B-S)，以重组质粒PUC19-SPLCHbV为模板分别用引物In-301-V3F1(X-B)/In-301-V3R1(X-B)和In-301-V3F2(B-S)/In-301-V3R2(B-S)进行扩增，纯化PCR扩增产物，分别获得用于In-fusion连接的产物A(插入载体pCB301多克隆位点区域XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点之间)和产物B(插入载体pCB301多克隆位点区域BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点之间)，产物A和产物B的大小均为2.8kb。无缝克隆PCR反应体系和反应程序按照试剂盒说明书操作。无缝克隆试剂盒为购自大连TAKARA公司的Clontech In-Fusion HD cloning kit。

4、重组质粒pCB301-SPLCHbV-1.0A(X-B)和pCB301-SPLCHbV-1.0A(B-S)的构建对载体pCB301分别进行XbaI/BamHI和BamHI/SmaI双酶切：50μL的反应体系中添加10×T4buffer 5μL、内切酶1(XbaI或BamHI)2μL(5U)、内切酶2(BamHI/SmaI)，回收纯化双酶切产物，利用无缝克隆技术(In-fusion Cloning)分别与上步产物A和产物B连接，构建重组质粒pCB301-SPLCHbV-1.0A(X-B)和pCB301-SPLCHbV-1.0A(B-S)。

In-fusion反应程序：50℃反应20分钟，随后放置冰上，用于转化大肠杆菌感受态细胞TG1，挑取单斑检测，提取目的质粒。

5、双酶切重组质粒pCB301-SPLCHbV-1.0A(X-B)

对重组质粒pCB301-SPLCHbV-1.0A(X-B)进行XbaI/BamHI双酶切，酶切体系如下表，酶切产物1％琼脂糖检测、切胶、回收2.8kb大小片段备用。

表2酶切体系

成分	体积(μL)
		10×buffer	5
XbaⅠ(2U/μL)	3
		BamHⅠ(2U/μL)	3
重组质粒(pCB301-SPLCHbV-1.0A(X-B))	30
		ddH<sub>2</sub>O	9
总体积	50

6、双酶切pCB301-SPLCHbV-1.0A(B-S)质粒

对pCB301-SPLCHbV-1.0B(B-S)质粒进行BamHⅠ和SmaⅠ双酶切，方法同步骤5，切胶。

7、含有2倍SPLCHbV全基因组的重组载体pCB301-SPLCHbV-2.0A(X-S)的构建连接步骤5和步骤6的酶切产物：分别添加步骤6和步骤7的酶切产物4μL、10×T4Buffer 1μL、T4连接酶1μL，16℃，过夜连接(12～16小时)，转化大肠杆菌细胞，挑取单斑菌落，检测摇菌，提取质粒，方法同步骤3。构建含有2倍SPLCHbV全基因组的重组载体pCB301-SPLCHbV-2.0A(X-S)。得到的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

9、对重组质粒pCB301-SPLCHbV-2.0A(X-S)进行XbaⅠ单酶切，XbalⅠ和SmaⅠ、XbaⅠ和BamHⅠ、BamHⅠ和SmaⅠ等双酶切，鉴定重组质粒，如图2所示，确定重组质粒与预期结果一致。

10、农杆菌转化

采用液氮冷冻法转化农杆菌菌株LB4404和GV3101，具体方法为，取200μL感受态细胞，加入1μg质粒DNA(2μL)，混匀后冰上放置30分钟，液氮速冻1分钟；迅速置于37℃水浴5分钟；然后置于冰上2分钟，加入1ml LB液体培养基，28℃慢速振荡培养4～6小时后(150rpm)，培养菌液涂布于含有卡那霉素50mg/mL和利福平20mg/mL的LB固体培养基平板上，28℃培养约48小时。挑取单斑菌斑PCR检测，筛选含有质粒pCB301-SPLCHbV-2.0A(X-S)的农杆菌菌斑。

表3侵染后病毒菌斑PCR检测用引物

引物名称	引物碱基序列(5'-3')
		V3F1	TTCACATTATTGTTGGCCCAGTC(如SEQ ID NO:5所示)
V3R1	GGATCCCGCTGCGCGGCC(如SEQ ID NO:6所示)

11、农杆菌接种本氏烟

挑取筛选到的含有目的质粒的单斑菌斑接种于含有50mL液体LB培养液中，其中培养液含有卡那霉素50mg/mL、利福平20mg/mL。28℃220rpm条件下振荡培养对数生长期(12～16小时)。5000rpm离心收集菌体并重新悬浮于农杆菌菌体悬浮液中(10mmol/L MgCl₂、10mmol/L MES、0.15μmol/L AS)，使溶液OD值0.8左右。随后采用农杆菌侵润法接种本氏烟，接种2天后观察植株生长情况，接种5天后，接种叶片产生皱缩花叶等症状，2周后接种植株新叶产生皱缩、花叶等症状，如图3所示。

12、接种植株的PCR检测

提取接种和未接种(-CK)植株的新叶DNA，利用特异性检测引物V3F1/V3R1进行PCR检测(见表4)。确认接种植株新叶中是否存在SPLCHbV，确认重组质粒是否具有侵染性。

表4植株PCR反应体系

成分	体积(μL)
		2×Mix buffer	12.5
上游引物V3F1(10μM)	1
		下游引物VR1(10μM)	1
Taq酶(5U/μL)	0.5
		DNA溶液	0.5
ddH<sub>2</sub>O	9.5
		总体积	25

表5植株PCR检测反应程序

结果如图4所示，SPLCHbV侵染植株中在约3000bp处有扩增条带(泳道2～3)，未侵染植株无此条带，这表明，接种植株新叶中存在SPLCHbV，重组质粒具有侵染性。

13、Southern Blot检测

利用地高辛标记探针进行杂交，具体方法参照地高辛探针标记试剂盒(罗氏地高辛试剂盒)进行。杂交按杂交试剂盒(罗氏地高辛试剂盒)说明书进行。

其中探针制备为：首先根据重组质粒核酸序列设计引物SF(TGGTACTGGTCTTACTCATCGTCT)/SR(CTGATTCTCATACTTCGCCTCC)，然后采用PCR制备探针，结果如图5表明，本发明构建的pCB-SPLCHbV-2.0A具有侵染性，能成功侵染本氏烟，并在植株体内进行复制、侵染。

对比实施例

构建含有2倍甘薯四川卷叶病毒1基因组DNA的重组载体pCB301-SPLCScV1-2.0a，以及含有1.5倍甘薯四川卷叶病毒2基因组DNA的重组载体，均没有侵染性。

甘薯双生病毒方面至少已报到有2例失败的侵染性克隆研究实验。如Lotrakul等从环状质粒中获取甘薯乔治亚卷叶病毒(Sweet potato leaf curl Georgia virus,SPLCGoV)基因组并进行体外环化，然后利用电转化侵染27株番薯属植物，结果无一株被侵染，没能获得侵染性克隆(Lotrakul et al 2003)。Paprotka等利用RCA方法从感染甘薯双生病毒的甘薯中扩增甘薯双生病毒基因组DNA多聚体，随后用基因枪接种本生烟和一些番薯属几个种的植物，结果证明获得的基因组无侵染性(Paprotka et al,2010)。

以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆及其构建方法

<130> 无

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

gcaggtcgac tctagattca cattattgtt ggcccagtc 39

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

gccgacccgg ggatccggat cccgctgcgc ggcc 34

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

cgactctaga ggatccggat ccttcacatt attgttggcc cagtc 45

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

atgccatgcc gacccgggcg ctgcgcggcc ggagaggc 38

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

ttcacattat tgttggccca gtc 23

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

ggatcccgct gcgcggcc 18

<210> 7

<211> 10165

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

aagcttgcat gcctgcagtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 60

tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 120

cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa aggacagtag 180

aaaaggaaga tggcttctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaaa 240

gaatgcctct accgacagtg gtcccaaaga tggacccccc acccacgagg aacatcgtgg 300

aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg 360

agcacgacac tctcgtctac tccaagaata tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg 420

ctattgagac tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc 480

tatctgtcac ttcatcgaaa ggacagtaga aaaggaagat ggcttctaca aatgccatca 540

ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga atgcctctac cgacagtggt cccaaagatg 600

gacccccacc cacgaggaac atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc 660

aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt 720

cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagaggcct gacctgcagg 780

tcgactctag attcacatta ttgttggccc agtccaacaa cacacgaggt aaaacaaacg 840

aagaagaagg gaaaggatgt acatatgttt ctgggggagg agcaaaaatg cgttcataat 900

ttgcactcaa attatgaaat tgaagagtaa aatcccttgg tgctaactcc cgtataattc 960

tgagagcctc tgacttactg cctgcgttaa gagctgcggc gtaagcgtca ttggctgatt 1020

gttgtcctcc ccttgcagat cgtccatcaa tctggaattc gccccattca attgtgtctc 1080

catccttatc gatgtaggac ttgacgtcgg aactggattt agctccctga atgtttggat 1140

ggaaatgtgc tgacctggta ggggagacca gatcgaagaa tctgttattt ttgcattgga 1200

atttcccctc gaactgaaga agcacgtgga gatgagggct cccatcttcg tgaagctctc 1260

tacagatttt gatgaatttt ttattaactg gggtttggat gttttggatt tgctgtagtg 1320

cttcttcttt ggatagagaa cactgaggat atgtaagaaa ataattctta gcatttatgc 1380

gaaaacgatt aggtgtaggc attttgactt ggtcaatcgg tgtctctcgc tcacctttgc 1440

tctggcaatt ggtgtctggt gtcccattta tactcgttgt gtctaaaatt cgaaattcga 1500

atttgagctc caaaagcggc catccgtata atattaccgg atggccgcgc ccgcttttat 1560

gtgggcccca accacgtgaa aaaagaaaaa gaatgaataa ttgtggaccc cacaatttgg 1620

agataaggtt aaaagcatcc attcagattg caatccttgg tcatcaagga tggagcagtc 1680

attgtgggac cctctcactc atcctttacc agaaaccctt cacgggttta ggtgtatgct 1740

ttcgttaaag tatatgtcca atatacgtga caaatacgag ccgggtacgt tagggcacga 1800

attagccgtt ctgctaattc gatctcttag gggaaagaat tatgtcagat cgacttcgag 1860

ttacgaggag gtatgcgcct tactctcgga gaccgcaggc agctcgccgt ctaaacttca 1920

cgacagacat cgtcccgtat gtggggaatg ctgccccgct tgctgcagca acgtacgttc 1980

cagttcctgt gaaggcaagg aagcggacct ctcgaaagag aggcgattgg attcctaggg 2040

gctgtgttgg cccctgtaag gttcaggatt atgagttcaa gatggatgtt cctcacgggg 2100

ggacctttgt ttgtgtttct gattttactc gtggtactgg tcttactcat cgtctgggca 2160

agcgtgtttg tattaagtct atggggtttt ctggaaaggt ttggatggat gacaacatcg 2220

ctaagaagga tcatacgaat ataattacgt tttggttagt tagggatcgg cgtcctaaca 2280

aggacccgct cacgtttagt cagttgtttc acatgtttga taacgaaccc ttgacagcca 2340

aggttcgtac cgatcttcgt gatcggtttc aggtgttgcg tacgttttct gttacggtta 2400

gtggtggtcc ttatgcccat aaggagcagg ctcaggttag gcgtttcttc aagggtctta 2460

acaaccatgt gatttacaat cacaaggagg aggcgaagta tgagaatcag ttagagaatg 2520

ctatgcttgt gtactctgct agcagtcatg ctagcaatcc tgtgtatcaa tctttaagag 2580

ttcgagcata tttttatgac tcgcatatga attaatataa aagtgtttgt attgaatcct 2640

tacaatctat tacatcaatg tcatgtatcc agcttacatt tttcaattgc cagattgcca 2700

tgactaaagt actcaaactt aaaaaaccta tgctagctaa gttatcacaa attcgccatt 2760

taaggcgaga aatcaagctg tgaataacaa aattgggatg cccatgaata atccggaatt 2820

ggagaaagat cttctggtac cctatgctcc tccttgggct gtggttcagt tgaagctgaa 2880

ccttcatgat ctgtttcccg ctgcttgacg tgtgtatgta catcacacgc aggtggaatg 2940

gtgcagtccg acccgcactc atgggattgc tgtcgaattc gacagctctc ccagtctgta 3000

caagacttag taacgcccct gtgcgtgaat ccatggatga acttgcagtc tgggctaatg 3060

aaggctgtgc acccgcagcc gaaccaggtt atcctagtcc tcggttccct gtacttcctc 3120

ttctggggtg ctggtggagg ggacagactc ctttctgtac aggttctctt caatggagta 3180

gaatattgca ttcttatgtg tccactggta gagaccgaag ttctctgcct tctcaagata 3240

agacttataa gaagcgcctt ctcctggatt gcagagtacg attgctggga ttccgccttt 3300

aatttgaact ggctttccgt atttacagtt agattgccag tccttctggg cccctattag 3360

ctccttaaag tgctttaggt aatgcgggtt gacgtcatca atgacgttat accacgcatc 3420

attactgtac accttaggag aaagatccag atgaccgcat aagtaattat gcggtcccaa 3480

agagcgagcc caaactgttt tgcccaatct acttgggcct tctaatatca agctcatggg 3540

cctctccggc cgcgcagcgg gatccttcac attattgttg gcccagtcca acaacacacg 3600

aggtaaaaca aacgaagaag aagggaaagg atgtacatat gtttctgggg gaggagcaaa 3660

aatgcgttca taatttgcac tcaaattatg aaattgaaga gtaaaatccc ttggtgctaa 3720

ctcccgtata attctgagag cctctgactt actgcctgcg ttaagagctg cggcgtaagc 3780

gtcattggct gattgttgtc ctccccttgc agatcgtcca tcaatctgga attcgcccca 3840

ttcaattgtg tctccatcct tatcgatgta ggacttgacg tcggaactgg atttagctcc 3900

ctgaatgttt ggatggaaat gtgctgacct ggtaggggag accagatcga agaatctgtt 3960

atttttgcat tggaatttcc cctcgaactg aagaagcacg tggagatgag ggctcccatc 4020

ttcgtgaagc tctctacaga ttttgatgaa ttttttatta actggggttt ggatgttttg 4080

gatttgctgt agtgcttctt ctttggatag agaacactga ggatatgtaa gaaaataatt 4140

cttagcattt atgcgaaaac gattaggtgt aggcattttg acttggtcaa tcggtgtctc 4200

tcgctcacct ttgctctggc aattggtgtc tggtgtccca tttatactcg ttgtgtctaa 4260

aattcgaaat tcgaatttga gctccaaaag cggccatccg tataatatta ccggatggcc 4320

gcgcccgctt ttatgtgggc cccaaccacg tgaaaaaaga aaaagaatga ataattgtgg 4380

accccacaat ttggagataa ggttaaaagc atccattcag attgcaatcc ttggtcatca 4440

aggatggagc agtcattgtg ggaccctctc actcatcctt taccagaaac ccttcacggg 4500

tttaggtgta tgctttcgtt aaagtatatg tccaatatac gtgacaaata cgagccgggt 4560

acgttagggc acgaattagc cgttctgcta attcgatctc ttaggggaaa gaattatgtc 4620

agatcgactt cgagttacga ggaggtatgc gccttactct cggagaccgc aggcagctcg 4680

ccgtctaaac ttcacgacag acatcgtccc gtatgtgggg aatgctgccc cgcttgctgc 4740

agcaacgtac gttccagttc ctgtgaaggc aaggaagcgg acctctcgaa agagaggcga 4800

ttggattcct aggggctgtg ttggcccctg taaggttcag gattatgagt tcaagatgga 4860

tgttcctcac ggggggacct ttgtttgtgt ttctgatttt actcgtggta ctggtcttac 4920

tcatcgtctg ggcaagcgtg tttgtattaa gtctatgggg ttttctggaa aggtttggat 4980

ggatgacaac atcgctaaga aggatcatac gaatataatt acgttttggt tagttaggga 5040

tcggcgtcct aacaaggacc cgctcacgtt tagtcagttg tttcacatgt ttgataacga 5100

acccttgaca gccaaggttc gtaccgatct tcgtgatcgg tttcaggtgt tgcgtacgtt 5160

ttctgttacg gttagtggtg gtccttatgc ccataaggag caggctcagg ttaggcgttt 5220

cttcaagggt cttaacaacc atgtgattta caatcacaag gaggaggcga agtatgagaa 5280

tcagttagag aatgctatgc ttgtgtactc tgctagcagt catgctagca atcctgtgta 5340

tcaatcttta agagttcgag catattttta tgactcgcat atgaattaat ataaaagtgt 5400

ttgtattgaa tccttacaat ctattacatc aatgtcatgt atccagctta catttttcaa 5460

ttgccagatt gccatgacta aagtactcaa acttaaaaaa cctatgctag ctaagttatc 5520

acaaattcgc catttaaggc gagaaatcaa gctgtgaata acaaaattgg gatgcccatg 5580

aataatccgg aattggagaa agatcttctg gtaccctatg ctcctccttg ggctgtggtt 5640

cagttgaagc tgaaccttca tgatctgttt cccgctgctt gacgtgtgta tgtacatcac 5700

acgcaggtgg aatggtgcag tccgacccgc actcatggga ttgctgtcga attcgacagc 5760

tctcccagtc tgtacaagac ttagtaacgc ccctgtgcgt gaatccatgg atgaacttgc 5820

agtctgggct aatgaaggct gtgcacccgc agccgaacca ggttatccta gtcctcggtt 5880

ccctgtactt cctcttctgg ggtgctggtg gaggggacag actcctttct gtacaggttc 5940

tcttcaatgg agtagaatat tgcattctta tgtgtccact ggtagagacc gaagttctct 6000

gccttctcaa gataagactt ataagaagcg ccttctcctg gattgcagag tacgattgct 6060

gggattccgc ctttaatttg aactggcttt ccgtatttac agttagattg ccagtccttc 6120

tgggccccta ttagctcctt aaagtgcttt aggtaatgcg ggttgacgtc atcaatgacg 6180

ttataccacg catcattact gtacacctta ggagaaagat ccagatgacc gcataagtaa 6240

ttatgcggtc ccaaagagcg agcccaaact gttttgccca atctacttgg gccttctaat 6300

atcaagctca tgggcctctc cggccgcgca gcgggatccc cgggtcggca tggcatctcc 6360

acctcctcgc ggtccgacct gggcatccga aggaggacgt cgtccactcg gatggctaag 6420

ggagagctcg aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa 6480

tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt 6540

aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc 6600

gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt 6660

atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcggaattca gattgtcgtt tcccgccttc 6720

agtttaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg 6780

tttattagaa taatcggata tttaaaaggg cgtgaaaagg tttatccgtt cgtccatttg 6840

tatgtgcatg ccaaccacag gagatctcag taaagcgctg gctgaacccc cagccggaac 6900

tgaccccaca aggccctagc gtttgcaatg caccaggtca tcattgaccc aggcgtgttc 6960

caccaggccg ctgcctcgca actcttcgca ggcttcgccg acctgctcgc gccacttctt 7020

cacgcgggtg gaatccgatc cgcacatgag gcggaaggtt tccagcttga gcgggtacgg 7080

ctcccggtgc gagctgaaat agtcgaacat ccgtcgggcc gtcggcgaca gcttgcggta 7140

cttctcccat atgaatttcg tgtagtggtc gccagcaaac agcacgacga tttcctcgtc 7200

gatcaggacc tggcaacggg acgttttctt gccacggtcc aggacgcgga agcggtgcag 7260

cagcgacacc gattccaggt gcccaacgcg gtcggacgtg aagcccatcg ccgtcgcctg 7320

taggcgcgac aggcattcct cggccttcgt gtaataccgg ccattgatcg accagcccag 7380

gtcctggcaa agctcgtaga acgtgaaggt gatcggctcg ccgatagggg tgcgcttcgc 7440

gtactccaac acctgctgcc acaccagttc gtcatcgtcg gcccgcagct cgacgccggt 7500

gtaggtgatc ttcacgtcct tgttgacgtg gaaaatgacc ttgttttgca gcgcctcgcg 7560

cgggattttc ttgttgcgcg tggtgaacag ggcagagcgg gccgtgtcgt ttggcatcgc 7620

tcgcatcgtg tccggccacg gcgcaatatc gaacaaggaa agctgcattt ccttgatctg 7680

ctgcttcgtg tgtttcagca acgcggcctg cttggcctcg ctgacctgtt ttgccaggtc 7740

ctcgccggcg gtttttcgct tcttggtcgt catagttcct cgcgtgtcga tggtcatcga 7800

cttcgccaaa cctgccgcct cctgttcgag acgacgcgaa cgctccacgg cggccgatgg 7860

cgcgggcagg gcagggggag ccagttgcac gctgtcgcgc tcgatcttgg ccgtagcttg 7920

ctggaccatc gagccgacgg actggaaggt ttcgcggggc gcacgcatga cggtgcggct 7980

tgcgatggtt tcggcatcct cggcggaaaa ccccgcgtcg atcagttctt gcctgtatgc 8040

cttccggtca aacgtccgat tcattcaccc tccttgcggg attgccccga ctcacgccgg 8100

ggcaatgtgc ccttattcct gatttgaccc gcctggtgcc ttggtgtcca gataatccac 8160

cttatcggca atgaagtcgg tcccgtagac cgtctggccg tccttctcgt acttggtatt 8220

ccgaatcttg ccctgcacga ataccagcga ccccttgccc aaatacttgc cgtgggcctc 8280

ggcctgagag ccaaaacact tgatgcggaa gaagtcggtg cgctcctgct tgtcgccggc 8340

atcgttgcgc cacatctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa tattttattt 8400

tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac tgttcttccc 8460

cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga aggcaatgtc ataccacttg tccgccctgc 8520

cgcttctccc aagatcaata aagccactta ctttgccatc tttcacaaag atgttgctgt 8580

ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt cctcttcggg cttttccgtc tttaaaaaat 8640

catacagctc gcgcggatct ttaaatggag tgtcttcttc ccagttttcg caatccacat 8700

cggccagatc gttattcagt aagtaatcca attcggctaa gcggctgtct aagctattcg 8760

tatagggaca atccgatatg tcgatggagt gaaagagcct gatgcactcc gcatacagct 8820

cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt catactcttc cgagcaaagg acgccatcgg 8880

cctcactcat gagcagattg ctccagccat catgccgttc aaagtgcagg acctttggaa 8940

caggcagctt tccttccagc catagcatca tgtccttttc ccgttccaca tcataggtgg 9000

tccctttata ccggctgtcc gtcattttta aatataggtt ttcattttct cccaccagct 9060

tatatacctt agcaggagac attccttccg tatcttttac gcagcggtat ttttcgatca 9120

gttttttcaa ttccggtgat attctcattt tagccattta ttatttcctt cctcttttct 9180

acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca attcactgtt 9240

ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt tttcaaagtt 9300

ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaacca caattatggg tgatgctgcc 9360

aactcgagag cgggccggga gggttcgaga agggggggca ccccccttcg gcgtgcgcgg 9420

tcacgcgcac agggcgcagc cctggttaaa aacaaggttt ataaatattg gtttaaaagc 9480

aggttaaaag acaggttagc ggtggccgaa aaacgggcgg aaacccttgc aaatgctgga 9540

ttttctgcct gtggacagcc cctcaaatgt caataggtgc gcccctcatc tgtcagcact 9600

ctgcccctca agtgtcaagg atcgcgcccc tcatctgtca gtagtcgcgc ccctcaagtg 9660

tcaataccgc agggcactta tccccaggct tgtccacatc atctgtggga aactcgcgta 9720

aaatcaggcg ttttcgccga tttgcgaggc tggccagctc cacgtcgccg gccgaaatcg 9780

agcctgcccc tcatctgtca acgccgcgcc gggtgagtcg gcccctcaag tgtcaacgtc 9840

cgcccctcat ctgtcagtga gggccaagtt ttccgcgagg tatccacaac gccggcggcc 9900

gcggtgtctc gcacacggct tcgacggcgt ttctggcgcg tttgcagggc catagacggc 9960

cgccagccca gcggcgaggg caaccagccc ggtgagcgtc tagtggactg atgggctgcc 10020

tgtatcgagt ggtgattttg tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg 10080

caggatatat tgtggtgtaa acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac 10140

gtttttaatg tactggggtg gtttt 10165

<210> 8

<211> 2774

<212> DNA

<213> 甘薯湖北卷叶病毒（Sweet potato leaf cur Hubei virus，SPLCHbV）

<400> 8

accggatggc cgcgcccgct tttatgtggg ccccaaccac gtgaaaaaag aaaaagaatg 60

aataattgtg gaccccacaa tttggagata aggttaaaag catccattca gattgcaatc 120

cttggtcatc aaggatggag cagtcattgt gggaccctct cactcatcct ttaccagaaa 180

cccttcacgg gtttaggtgt atgctttcgt taaagtatat gtccaatata cgtgacaaat 240

acgagccggg tacgttaggg cacgaattag ccgttctgct aattcgatct cttaggggaa 300

agaattatgt cagatcgact tcgagttacg aggaggtatg cgccttactc tcggagaccg 360

caggcagctc gccgtctaaa cttcacgaca gacatcgtcc cgtatgtggg gaatgctgcc 420

ccgcttgctg cagcaacgta cgttccagtt cctgtgaagg caaggaagcg gacctctcga 480

aagagaggcg attggattcc taggggctgt gttggcccct gtaaggttca ggattatgag 540

ttcaagatgg atgttcctca cggggggacc tttgtttgtg tttctgattt tactcgtggt 600

actggtctta ctcatcgtct gggcaagcgt gtttgtatta agtctatggg gttttctgga 660

aaggtttgga tggatgacaa catcgctaag aaggatcata cgaatataat tacgttttgg 720

ttagttaggg atcggcgtcc taacaaggac ccgctcacgt ttagtcagtt gtttcacatg 780

tttgataacg aacccttgac agccaaggtt cgtaccgatc ttcgtgatcg gtttcaggtg 840

ttgcgtacgt tttctgttac ggttagtggt ggtccttatg cccataagga gcaggctcag 900

gttaggcgtt tcttcaaggg tcttaacaac catgtgattt acaatcacaa ggaggaggcg 960

aagtatgaga atcagttaga gaatgctatg cttgtgtact ctgctagcag tcatgctagc 1020

aatcctgtgt atcaatcttt aagagttcga gcatattttt atgactcgca tatgaattaa 1080

tataaaagtg tttgtattga atccttacaa tctattacat caatgtcatg tatccagctt 1140

acatttttca attgccagat tgccatgact aaagtactca aacttaaaaa acctatgcta 1200

gctaagttat cacaaattcg ccatttaagg cgagaaatca agctgtgaat aacaaaattg 1260

ggatgcccat gaataatccg gaattggaga aagatcttct ggtaccctat gctcctcctt 1320

gggctgtggt tcagttgaag ctgaaccttc atgatctgtt tcccgctgct tgacgtgtgt 1380

atgtacatca cacgcaggtg gaatggtgca gtccgacccg cactcatggg attgctgtcg 1440

aattcgacag ctctcccagt ctgtacaaga cttagtaacg cccctgtgcg tgaatccatg 1500

gatgaacttg cagtctgggc taatgaaggc tgtgcacccg cagccgaacc aggttatcct 1560

agtcctcggt tccctgtact tcctcttctg gggtgctggt ggaggggaca gactcctttc 1620

tgtacaggtt ctcttcaatg gagtagaata ttgcattctt atgtgtccac tggtagagac 1680

cgaagttctc tgccttctca agataagact tataagaagc gccttctcct ggattgcaga 1740

gtacgattgc tgggattccg cctttaattt gaactggctt tccgtattta cagttagatt 1800

gccagtcctt ctgggcccct attagctcct taaagtgctt taggtaatgc gggttgacgt 1860

catcaatgac gttataccac gcatcattac tgtacacctt aggagaaaga tccagatgac 1920

cgcataagta attatgcggt cccaaagagc gagcccaaac tgttttgccc aatctacttg 1980

ggccttctaa tatcaagctc atgggcctct ccggccgcgc agcgggatcc ttcacattat 2040

tgttggccca gtccaacaac acacgaggta aaacaaacga agaagaaggg aaaggatgta 2100

catatgtttc tgggggagga gcaaaaatgc gttcataatt tgcactcaaa ttatgaaatt 2160

gaagagtaaa atcccttggt gctaactccc gtataattct gagagcctct gacttactgc 2220

ctgcgttaag agctgcggcg taagcgtcat tggctgattg ttgtcctccc cttgcagatc 2280

gtccatcaat ctggaattcg ccccattcaa ttgtgtctcc atccttatcg atgtaggact 2340

tgacgtcgga actggattta gctccctgaa tgtttggatg gaaatgtgct gacctggtag 2400

gggagaccag atcgaagaat ctgttatttt tgcattggaa tttcccctcg aactgaagaa 2460

gcacgtggag atgagggctc ccatcttcgt gaagctctct acagattttg atgaattttt 2520

tattaactgg ggtttggatg ttttggattt gctgtagtgc ttcttctttg gatagagaac 2580

actgaggata tgtaagaaaa taattcttag catttatgcg aaaacgatta ggtgtaggca 2640

ttttgacttg gtcaatcggt gtctctcgct cacctttgct ctggcaattg gtgtctggtg 2700

tcccatttat actcgttgtg tctaaaattc gaaattcgaa tttgagctcc aaaagcggcc 2760

atccgtataa tatt 2774

Claims (7)

1.一种甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将甘薯湖北曲叶病毒基因组DNA片段通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中，得到含有2倍甘薯湖北曲叶病毒基因组DNA的重组表达载体；所述重组表达载体即为甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆；所述甘薯湖北曲叶病毒基因组DNA序列如SEQ ID NO:8所示；所述植物表达载体为pCB301，所述重组表达载体上含有两段甘薯湖北曲叶病毒全基因组DNA片段，分别为片段A和片段B；用于扩增片段A的无缝克隆用引物分别为In-301-V3F1(X-B)和In-301-V3R1(X-B)，如SEQ ID NO:1～2所示，用于扩增片段B的无缝克隆用引物分别为In-301-V3F2(B-S)和In-301-V3R2(B-S)，如SEQ ID NO:3～4所示。

2.根据权利要求1所述的一种甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，所述甘薯湖北曲叶病毒基因组DNA的克隆方法为：从甘薯湖北曲叶病毒侵染发病植株中提取甘薯总DNA，以总DNA为模板，利用滚环 扩增法进行环状DNA扩增，获得病毒全基因组序列。

3.利用权利要求1～2任一所述方法制备得到的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆。

4.根据权利要求3所述的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆，其特征在于，所述甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆的核酸序列如SEQ ID.7所示。

5.含有权利要求3所述的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆的重组菌。

6.权利要求3所述的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆或权利要求5所述的重组菌在研究甘薯湖北曲叶病毒生物学特性和/或致病机理和/或甘薯湖北曲叶病毒基因功能中的应用。

7.权利要求3所述的甘薯湖北曲叶病毒侵染性克隆或权利要求5所述的重组菌在研究甘薯湖北曲叶病毒与宿主植物互作中的应用。

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