ES2336451T3

ES2336451T3 - Metodo para evaluar un estado canceroso.

Info

Publication number: ES2336451T3
Application number: ES04773354T
Authority: ES
Inventors: Toshikazu Ushijima; Atsushi Hagihara
Original assignee: JAPAN GOVERNMENT; Sumitomo Chemical Co Ltd; National Cancer Center Japan
Current assignee: JAPAN GOVERNMENT; Sumitomo Chemical Co Ltd; National Cancer Center Japan
Priority date: 2003-09-16
Filing date: 2004-09-15
Publication date: 2010-04-13
Anticipated expiration: 2024-09-15
Also published as: ATE451458T1; EP1679370A4; JP2005087046A; EP1679370B1; EP1679370A1; DE602004024569D1; US20070135366A1; WO2005026350A1; JP5116936B2; US7763422B2

Abstract

Un método para evaluar un estado canceroso de un espécimen derivado de mamífero, que comprende: (1) una primera etapa de medición de la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en el espécimen derivado de mamífero o un valor de un índice correlacionado con ella, y (2) una segunda etapa de determinación del estado canceroso del espécimen basado en la diferencia obtenida comparando la frecuencia de metilación medida o el valor del índice que tiene correlación con la misma, con un control; donde el valor del índice es la cantidad de un producto de expresión del gen de la Fibrilina

Description

Método para evaluar un estado canceroso.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para evaluar un estado canceroso de un espécimen derivado de mamífero, y similares.

Antecedentes de la invención

Aunque se ha revelado gradualmente que un cáncer es una enfermedad, cuya causa es una anomalía génica, la mortalidad de los pacientes con cáncer todavía es elevada, demostrando que los métodos de diagnóstico y los métodos tratamiento que se encuentran disponibles en la actualidad no son necesariamente completamente satisfactorios. Es clínicamente significativo detectar temprano el cáncer y elegir un tratamiento eficaz para el cáncer detectado y adicionalmente proporcionar una recuperación para verificar la recurrencia del cáncer y similares después del tratamiento.

Se desea, en ese caso, el desarrollo de un método para evaluar un estado canceroso de un espécimen derivado de mamífero basándose en la detección de una anomalía génica, que es adecuado para un método de diagnóstico para detectar temprano un cáncer, una valoración de la eficacia del tratamiento del cáncer y una verificación de la recurrencia del cáncer y similares.

Descripción de la invención

En tales circunstancias, los autores de la presente invención estudiaron intensamente y, como resultado, han descubierto que el gen de la Fibrilina 2 (en adelante, referido como gen FBN2 en algunos casos) está metilado en una línea celular de cáncer y un espécimen de un tejido canceroso con una frecuencia significativamente mayor en comparación con una linea celular normal inmortalizada y un espécimen de un tejido normal y, en esta línea de células cancerosas, el nivel de expresión del gen de la Fibrilina 2 en una línea de células cancerosas es significativamente menor en comparación con una línea celular normal inmortalizada, y adicionalmente, han descubierto que el nivel de expresión de semejante gen puede ser incrementado mediante la acción de un inhibidor de la metilación del ADN sobre la línea de células cancerosas, lo que dio como resultado la conclusión de la presente invención.

Esto es, la presente invención proporciona:

1.: un método para evaluar un estado canceroso de un espécimen derivado de mamífero, que comprende:

(1): una primera etapa de medición de la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen derivado de mamífero o un valor de un índice que tenga correlación con la misma, y

(2): una segunda etapa de determinación de un estado canceroso del espécimen basado en la diferencia obtenida comparando la frecuencia de metilación medida o el valor del índice que tiene correlación con la misma, con un control en el que el valor del índice es la cantidad de producto de expresión del gen de la fibrilina 2 (en adelante, referido como presente método de evaluación en algunos casos);

2.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 1 anterior, donde el espécimen derivado de mamífero son células;

3.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 1 anterior, donde el espécimen derivado de mamífero es un tejido;

4.: un método de evaluación de un estado canceroso de un espécimen derivado de mamífero, que comprende:

(1): una primera etapa de medición de la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en el espécimen derivado de mamífero, y

(2): una segunda etapa de determinación de un estado canceroso del espécimen basado en la diferencia obtenida comparando la frecuencia de metilación medida con un control;

5.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 1 anterior, donde el espécimen derivado de mamífero son células, y el estado canceroso del espécimen es una malignidad de las células derivadas de mamífero;

6.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 4 anterior, donde el espécimen derivado de mamífero son células, y el estado canceroso del espécimen es una malignidad de una célula derivada de mamífero;

7.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 1 anterior, donde el espécimen derivado de mamífero es un tejido, y el estado canceroso del espécimen es una cantidad de células cancerosas existente en un tejido derivado de mamífero;

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8.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 4 anterior, donde el espécimen derivado de mamífero es un tejido, y el estado canceroso del espécimen es una cantidad de células cancerosas existente en un tejido derivado de mamífero;

9.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 8 anterior, donde el tejido es un tejido pancreático, y el cáncer es cáncer pancreático;

10.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 1 o 4 anteriores, donde la frecuencia de metilación de un gen es la frecuencia de metilación de la citosina en una o más secuencias de nucleótidos representadas por 5'-CG-3' presente en una secuencia de nucleótidos de una región promotora, una región no traducida o una región traducida del gen;

11.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 12 anterior, donde el tejido es un tejido pancreático, y el cáncer es cáncer pancreático;

12.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 1 o 4 anteriores, donde la frecuencia de metilación de un gen es la frecuencia de metilación de la citosina en una o más secuencias de nucleótidos representada por 5'-CG-3' presente en una secuencia de nucleótidos de una región promotora del gen;

13.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 1 o 4 anteriores, donde la frecuencia de metilación de un gen es la frecuencia de metilación de la citosina en una o más secuencias de nucleótidos representada por 5'-CG-3' presente en una secuencia de nucleótidos de una región no traducida o una región traducida del gen;

14.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 1 anterior, donde la frecuencia de metilación de un gen es la frecuencia de metilación de la citosina en una o más secuencias de nucleótidos representada por 5'-CG-3' presente en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID No: 1;

15.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 16 anterior, donde el tejido es una tejido pancreático, y el cáncer es cáncer pancreático;

16.: un método de evaluación de un estado canceroso de un espécimen derivado de mamífero, que comprende:

(1): una primera etapa de medición de la cantidad de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 contenido en el espécimen derivado de mamífero, y

(2): una segunda etapa para determinar un estado canceroso del espécimen basándose en una diferencia obtenida comparando la cantidad medida de producto de expresión con un control;

17.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 16 anterior, donde la cantidad de un producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 es una cantidad de un producto de transcripción del gen;

18.: el método de evaluación de acuerdo con el apartado 16 anterior, donde la cantidad de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 es una cantidad de producto de la traducción del gen;

19.: un método de identificación de una sustancia que tiene la capacidad de reducir la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 y promover la expresión del gen, que comprende:

(1): una primera etapa para poner en contacto una sustancia de ensayo con una célula cancerosa,

(2): una segunda etapa para medir la cantidad de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 contenido en la célula cancerosa después de la primera etapa (1), y

(3): una tercera etapa para determinar la capacidad de la sustancia de ensayo para promover la expresión del gen de la Fibrilina 2 poseída por, basándose en una diferencia obtenida comparando la cantidad medida de producto de expresión con un control (en adelante, referido como presente método de búsqueda en algunos casos);

20.: el método de búsqueda de acuerdo con el apartado 14 anterior, donde la célula cancerosa es una célula de cáncer pancreático;

21.: una composición para su uso en el tratamiento del cáncer, que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de la Fibrilina 2 como ingrediente activo, donde el ingrediente activo se formula en un portador farmacéuticamente aceptable;

22.: el uso, ex vivo, del gen de la Fibrilina 2 metilado como marcador canceroso;

23.: el uso de acuerdo con el apartado 22 anterior, donde el marcador canceroso es un marcador de cáncer pancreático.

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Breves descripciones de los dibujos

La Figura 1 es una vista que muestra los resultados obtenidos realizando una PCR utilizando, como molde, ADN genómicos preparados a partir de líneas de células epiteliales ductales pancreáticas (normales) inmortales derivadas de ser humano (HPDE-4/E6E7 y HPDE6-E6E7c7) y siete clases de líneas de células de cáncer pancreático (BXPc3, HPAF-II, Capan-2, MiaPaCa-2, Hs766T, PANC-1 y HPAC) y tratadas con bisulfito de sodio, respectivamente, y analizando las soluciones de reacción de PCR después de la PCR con electroforesis en gel de agarosa. Los nombres de las células utilizadas se muestran en la parte superior de la vista. La vista indicada como HPDE4/SssI muestra el ADN obtenido mediante tratamiento de los ADN genómicos de HPDE-4/E6E7 con metilasa SssI. Calle U, solución de reacción de PCR utilizando un cebador específico de no metilación; calle M, solución de reacción de PCR utilizando un cebador específico de metilación.

La Figura 2 es una vista que muestra los resultados obtenidos realizando una PCR utilizando, como molde, ADN genómicos preparados a partir de 12 especímenes de tejidos de cáncer pancreático y los tejidos normales pancreáticos circundantes (obtenidos de pacientes con su consentimiento por escrito) y tratados con bisulfito de sodio, respectivamente, y analizando las soluciones de reacción de PCR después de la reacción de PCR con electroforesis en gel de agarosa. Los casos 1 a 12 representan los especímenes. Cáncer representa tejido de cáncer pancreático y Normal representa el tejido normal pancreático circundante. Calle U, la solución de reacción de PCR de la PCR utilizando un cebador específico de no metilación; calle M, la solución de reacción de PCR de la PCR utilizando un cebador específico de metilación.

La Figura 3 es una vista que muestra la dosificación del gen de la Fibrilina 2 obtenida amplificando con ADN de PCR en Tiempo Real derivado de ARNm del gen de la Fibrilina 2 en siete clases de líneas de células de cáncer pancreático derivadas de ser humano (BXPc3, HPAF-II, Capan-2, MiaPaCa-2, Hs766T, PANC-1 y HPAC) y líneas de células epiteliales ductales pancreáticas (normales) inmortales (HPDE-4/E6E7 y HPDE6-E6E7c7). Los nombres de las células utilizadas se muestran en la parte inferior de la vista. El eje vertical representa la dosificación del gen de Fibrilina 2 dividida por la dosificación del gen GAPDH.

La Figura 4 es una vista que muestra la dosificación del gen de la Fibrilina 2 obtenida amplificando con ADN de PCR en Tiempo Real derivado de ARNm del gen de la Fibrilina 2 en 2 clases de líneas de células de cáncer pancreático (PANC-1 y HPAC) a las cuales se ha aplicado un inhibidor de la metilación 5Aza-dC a una concentración de 0,05 \muM o 1 \muM, y en células epiteliales ductales pancreáticas (normales) inmortales (HPDE-4/E6E7). Los nombres de las células utilizadas se muestran en la parte inferior de la vista. El eje vertical representa la dosificación del gen de la Fibrilina 2 dividida por la dosificación del gen GAPDH.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención se explicará con detalle más abajo.

La presente invención hace referencia al uso del gen de la Fibrilina 2 metilado como un marcador canceroso (p. ej. marcador de cáncer pancreático o similares), y similares.

Los ejemplos del gen de la Fibrilina 2 utilizado como gen marcador en la presente invención incluyen un gen derivado de ser humano que contiene una región no traducida (región no codificante) y una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2 y una región promotora localizada en uno de sus sitios aguas arriba 5'. Se describen una secuencia de nucleótidos del gen derivado de ser humano de la Fibrilina 2 y una secuencia de aminoácidos codificada por ella, por ejemplo, con el Núm. de Acceso Genbank NM_001999 y similares. Una secuencia de nucleótidos de un ADN genómico, que contiene un exón localizado en el lado más aguas arriba 5' (en adelante, referido como exón 1) entre los exones que comprenden una región no traducida y una región traducida (región codificante) del gen derivado de ser humano de la Fibrilina 2, se describen, por ejemplo, con el Núm. de Acceso Genbank AC113387 y similares. En una secuencia de nucleótidos descrita con el Núm. de Acceso Genbank AC113387, por ejemplo, se muestra una secuencia de nucleótidos del exón 1 del gen derivado de ser humano de la Fibrilina 2 por medio de los números de nucleótidos 119656 a 119910. El gen de la Fibrilina 2 utilizado en la presente invención incluye, además de un gen que tiene la secuencia de nucleótidos conocida mencionada antes, un gen que tiene una secuencia de nucleótidos tal como una deleción, sustitución o adición de un nucleótido que ha aparecido en semejante secuencia de nucleótidos, que deriva de una mutación de origen natural debida a una diferencia en la especie de organismo, una diferencia entre individuos, o una diferencia entre órganos o tejidos, o similares.

Existe el fenómeno de que, entre las cuatro clases de bases que constituyen un gen (ADN genómico), solamente la citosina está metilada en mamíferos. Por ejemplo, en el gen derivado de ser humano de la Fibrilina 2, algunas de las citosinas de un ADN genómico del gen están metiladas. Y, la modificación por metilación del ADN se limita a las citosinas en una secuencia de nucleótidos representada por 5'-CG-3' (C representa citosina, y G representa guanina; en adelante, la secuencia de nucleótidos es referida como CpG en algunos casos). En la citosina, un sitio que va a ser metilado es una posición 5 de la misma. Tras la replicación del ADN antes de la división celular, solamente la citosina de CpG de una cadena molde está metilada inmediatamente después de la replicación, pero la citosina de CpG de una cadena recién producida también es rápidamente metilada por la acción de la metiltransferasa. Por lo tanto, el estado de metilación del ADN es heredado tal cual por los dos nuevos grupos de ADN también después de la replicación del ADN.

En la primera etapa del presente método de evaluación, la "frecuencia de metilación" es representada por ejemplo, por una razón de haploides en los cuales la citosina está metilada, cuando la presencia o ausencia de metilación de la citosina en CpG va a ser investigada, se investiga para haploides plurales.

Adicionalmente, en la primera etapa del presente método de evaluación, los ejemplos del "valor del índice que tiene la correlación con una (frecuencia de metilación)" incluyen una cantidad de un producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 (más específicamente, una cantidad de un producto de transcripción del gen, y una cantidad de un producto de traducción del gen) y similares. En el caso de semejante cantidad de producto expresión, existe tal correlación negativa tal que a medida que la frecuencia de metilación se hace mayor, la cantidad disminuye de acuerdo con
esto.

Los ejemplos del espécimen derivado de mamífero en la primera etapa del presente método de evaluación incluyen muestras de organismos vivos tales como células cancerosas tales como células de cáncer pancreático o un tejido que las contenga, y células que contienen potencialmente un ADN derivado de células cancerosas tales como células de cáncer pancreático, un tejido que las contenga (en la presente memoria, un tejido representa en sentido amplio fluidos corporales tales como sangre, plasma, suero, linfa y similares; nódulos linfáticos y similares) o sustancias secretadas por un organismo vivo (orina, leche y similares). Específicamente, por ejemplo, cuando el cáncer es cáncer pancreático, los ejemplos incluyen tejido pancreático (incluyendo fluido pancreático) tomado de un animal
sujeto.

Estas muestras de organismo vivo se pueden utilizar tal cual en forma de espécimen, o se pueden utilizar como espécimen muestras de organismos vivos preparadas mediante diversos procedimientos tales como separación, fraccionamiento, de tales muestras del organismo vivo.

Cuando el espécimen derivado de mamífero es la sangre, se puede esperar que el presente método de evaluación sea utilizado en la verificación física periódica, el ensayo simple, y similares.

En la primera etapa del presente método de evaluación, se puede realizar, por ejemplo, un método para medir la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen derivado de mamífero o un valor de un índice que tenga correlación con ella como sigue.

En cuanto al primer método, existe un método en el que, el ADN derivado del espécimen se pone en contacto con un reactivo que modifica la citosina no metilada y, después de eso, se realiza una reacción en cadena de la polimerasa (en adelante, referida como PCR) utilizando el ADN como molde y utilizando cebadores que pueden reconocer la presencia o ausencia de metilación de la citosina que se va a analizar, y se investiga la cantidad de producto de amplificación resultante.

Primero se extrae ADN de un espécimen derivado de mamífero, por ejemplo, utilizando un kit de extracción de ADN disponible en el mercado o similar.

Cuando se utiliza sangre como espécimen, se prepara plasma o suero a partir de la sangre de acuerdo con el método convencional, y se analiza el ADN libre (incluyendo ADN derivado de células cancerosas tales como células de cáncer pancreático y similares) contenido en el plasma o suero preparado como espécimen, por medio de lo cual, se puede analizar el ADN derivado de células cancerosas tales como células de cáncer pancreático a la vez que se evita un ADN derivado de hemocitos, y se puede mejorar la sensibilidad para detectar células cancerosas tales como células de cáncer pancreático, o un tejido que las contenga.

Después, tras poner en contacto el ADN extraído con un reactivo que modifica la citosina no metilada, se realiza la PCR utilizando el ADN como molde y utilizando cebadores que pueden reconocer la presencia o ausencia de metilación de la citosina que se va a analizar, y se investiga la cantidad de producto de amplificación resultante. La citosina que se va a analizar puede ser seleccionada entre las citosinas de una o más secuencias de nucleótidos representadas por 5'-CG-3' que está presente en una secuencia de nucleótidos de una región promotora, una región no traducida o una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2.

En la presente memoria, por ejemplo, los ejemplos de una o más secuencias de nucleótidos representadas por CpG que está presente en una secuencia de nucleótidos de una región promotora o una región no traducida o una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2 incluyen una secuencia de nucleótidos de un ADN genómico que contiene un exón 1 del gen de la Fibrilina 2 derivado de ser humano y una región promotora localizada en un lado aguas arriba 5' del mismo, más específicamente, la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1 (correspondiente a una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos representada por los números de nucleótidos 118801 a 121000 de una secuencia de nucleótidos descrita por el Núm. de Acceso Genbank AC113387). En la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, la secuencia de nucleótidos del exón 1 se muestra por los números de nucleótidos 1091 a 1345. La citosina de la secuencia de nucleótidos representada por CpG que está presente en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, muestra una elevada frecuencia de metilación (esto es hipermetilación), por ejemplo, en células cancerosas tales como células de cáncer pancreático. Más específicamente, los ejemplos de las citosinas que tienen una elevada frecuencia de metilación en una célula de cáncer pancreático incluyen las citosinas representadas por los números de nucleótidos 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777, 783, 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843 y similares de la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1.

En cuanto al reactivo para modificar la citosina no metilada, por ejemplo, se puede utilizar un bisulfito tal como bisulfito de sodio. A propósito, en principio, también se puede utilizar un reactivo que modifique específicamente sólo la citosina metilada.

Con el fin de que el ADN extraído se ponga en contacto con un reactivo para modificar la citosina no metilada, por ejemplo, después de desnaturalizar primero el ADN en una solución alcalina (pH 9 a 14), el ADN se trata con un bisulfito tal como bisulfito de sodio (concentración en una solución: p. ej. concentración final 3M) a 55ºC durante alrededor de aproximadamente 10 a 16 horas (durante la noche). La desnaturalización a 95ºC y la reacción a 50ºC se pueden repetir de 10 a 20 veces para acelerar la reacción. En este caso, la citosina no metilada se convierte en uracilo y, por otra parte, la citosina metilada no se convierte en uracilo, pero permanece aún en forma de citosina.

Después, se realizan una PCR utilizando ADN tratado con bisulfito o similar como molde, y utilizando un par de cebadores específicos de metilación, seleccionado cada uno entre una secuencia de nucleótidos cuando la citosina metilada está contenida en la secuencia de nucleótidos en la cual la citosina de la posición que va a ser metilada (citosina en CpG) todavía permanece como citosina, y la citosina no metilada (citosina no contenida en CpG) es convertida en uracilo y una secuencia de nucleótidos complementaria a semejante secuencia de nucleótidos (en adelante, también referida como PCR específica de metilación en algunos casos), y una PCR utilizando ADN tratado con bisulfito como molde, y utilizando un par de cebadores específicos de no metilación, seleccionado cada uno entre una secuencia de nucleótidos cuando la citosina no está metilada (secuencia de nucleótidos en la que todas las citosinas se convierten en uracilo) y una secuencia de nucleótidos complementaria a semejante secuencia de nucleótidos (en adelante, también referida como PCR específica de no metilación en algunos casos).

En las PCR mencionadas antes, en el caso de la PCR que utiliza el cebador específico de metilación (primero), se amplifica un ADN en el que la citosina que se va a analizar está metilada y, por otra parte, en el caso de la PCR que utiliza el cebador específico de no metilación (último), se amplifica un ADN en el que la citosina que se va a analizar no está metilada. Comparando las cantidades de estos productos de amplificación, se investiga la presencia o ausencia de metilación de la citosina que se va a analizar. De este modo, se puede medir la frecuencia de metilación.

En la presente memoria, a la vista de que, en el cebador específico de metilación, la citosina que no ha experimentado metilación se convierte en uracilo, y la citosina que ha experimentado metilación no se convierte en uracilo, se diseña, como cebador, un cebador de PCR específico de una secuencia de nucleótidos que contiene citosina que ha experimentado metilación (cebador específico de metilación), y se diseña un cebador de PCR específico de una secuencia de nucleótidos que contiene citosina que no ha experimentado metilación (cebador específico de no metilación). Puesto que el diseño se realiza basándose en una cadena de ADN que ha sido convertida químicamente mediante tratamiento con sulfito y se ha vuelto no complementaria, basándose en las respectivas cadenas de ADN que originalmente fueron de doble hebra, el cebador específico de metilación y el cebador específico de no metilación también se pueden preparar a partir de las respectivas cadenas. Con el fin de aumentar la especificidad para metilo y no metilo, tales cebadores se diseñan preferiblemente de manera que los cebadores contengan citosina en CpG cerca del extremo 3' de los cebadores. Por otra parte, con el fin de facilitar el análisis, se puede marcar uno de los ceba-
dores.

Más específicamente, se puede diseñar un cebador para medir una frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 con una PCR específica de metilación como se ha descrito antes, por ejemplo, basándose en una secuencia de nucleótidos que contiene una o más citosinas en CpG presentes en una secuencia de nucleótidos en una región promotora, una región no traducida o una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2. Por ejemplo, el diseño se puede realizar basándose en una secuencia de nucleótidos que contiene una o más citosinas en CpG presentes en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, más específicamente, una o más citosinas representadas por los números de nucleótidos 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777, 783, 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843 y similares en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1. Los ejemplos de tales cebadores se muestran más abajo.

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Cebador específico de no metilación

U1:	5'-TATGGGAATTTGTTGAGTTTTGT-3'	(SEQ ID No: 2)

U2:	5'-AACCAACAACCCCAAACA-3'	(SEQ ID No: 3)

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Cebador específico de metilación

M1:	5'-GGGAATTCGTCGAGTTTTGC-3'	(SEQ ID No: 4)

M2:	5'-AACCGACAACCCCGAACG-3'	(SEQ ID No: 5)

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Los ejemplos de una solución de reacción en la PCR específica de metilación incluyen una solución de reacción obtenida mezclando 50 ng de un ADN que va a ser el molde, 1 \mul de cada una de las soluciones de 10 pmol/\mul de cada cebador, 4 \mul de dNTP 2,5 mM, 2,5 \mul de 10 \times tampón (Tris-HCl 100 mM pH 8,3, KCl 500 mM, MgCl_{2} 20 mM), y 0,2 \mul de ADN polimerasa termoestable de 5 U/\mul, y adición de agua ultrapura esterilizada hasta una cantidad de 25 \mul. Los ejemplos de las condiciones de reacción incluyen las condiciones en las cuales la solución de reacción anteriormente mencionada es conservada a 95ºC durante 10 minutos y, después de eso, se realizan de 30 a 40 ciclos de mantenimiento de la temperatura, siendo cada ciclo de 30 segundos a 95ºC, después 30 segundos de 55 a 65ºC y 30 segundos a 72ºC.

Una vez realizada semejante PCR, se comparan las cantidades de los productos de amplificación resultantes. Por ejemplo, en el caso de un método de análisis que pueda comparar cantidades de los respectivos productos de amplificación obtenidos mediante PCR utilizando el cebador específico de metilación y PCR utilizando el cebador específico de no metilación (electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizado o electroforesis en gel de agarosa), se coloca un gel tras la electroforesis sobre la mancha de ADN para detectar las bandas de los productos de amplificación, y se compara la densidad de las bandas detectadas. En la presente memoria, utilizando cebadores marcados previamente en lugar de la tinción de ADN, se puede comparar la densidad de las bandas empleando la marca como índice. En los casos en los que se requiere la determinación cuantitativa, se pueden comparar cantidades de los respectivos productos utilizando la PCR en Tiempo Real que es un método de PCR capaz de una cuantificación muy exacta de manera que se pueda detectar una ligera diferencia en la dosificación del gen de aproximadamente dos veces por medio del control en tiempo real del producto de reacción de PCR y analizando la cinética. Los métodos para realizar la PCR en tiempo real incluyen, por ejemplo, un método en el que se utiliza una sonda tal como una sonda de polimerasa de ácido nucleico dirigida por un molde y un método en el que se utiliza un intercalador tal como SYBR Green. En cuanto a los aparatos y reactivos para la PCR en Tiempo Real, se pueden utilizar aparatos y reactivos disponibles en el mercado.

Semejante método es el método que se denomina generalmente PCR específica de metilación y fue referido por Herman (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93, 9821-9826, 1996), y este método utiliza una diferencia en las propiedades químicas entre la citosina y la 5-metilcitosina.

Como segundo método, existe un método en el que, el ADN derivado del espécimen se pone en contacto con un reactivo que modifica la citosina no metilada y, después de eso, utilizando el ADN como molde, se amplifica mediante PCR el ADN que contiene citosina que se va a analizar y se analiza directamente una secuencia de nucleótidos del producto de amplificación resultante.

Primero se extrae un ADN de un espécimen derivado de mamífero, por ejemplo, utilizando un kit de extracción de ADN disponible en el mercado o similar.

Cuando se utiliza sangre como espécimen, se prepara plasma o suero a partir de la sangre de acuerdo con el método convencional, y se analiza un ADN libre (incluyendo un ADN derivado de células cancerosas tales como células de cáncer pancreático) contenido en el plasma o suero preparado como espécimen, de ese modo, se puede analizar un ADN derivado de células cancerosas tales como células de cáncer pancreático a la vez que se evita un ADN derivado de hemocitos, y se puede mejorar la sensibilidad para detectar células cancerosas tales como células de cáncer pancreático, o un tejido o similar que las contenga.

Después, el ADN extraído se pone en contacto con un reactivo para modificar la citosina no metilada, y utilizando el ADN como molde, se amplifica el ADN que contiene citosina que se va a analizar realizando una PCR utilizando cebadores que se diseñan como se describe más abajo basándose en la secuencia de nucleótidos que contiene citosina en una o más de las secuencias de nucleótidos representadas por CpG que está presente en una secuencia de nucleótidos de una región promotora, una región no traducida o una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2, y se analiza directamente la secuencia de nucleótidos del producto resultante de la amplificación.

En la presente memoria, los ejemplos de una o más secuencias de nucleótidos representadas por CpG presentes en una secuencia de nucleótidos de una región promotora, una región no traducida o una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2 incluyen una secuencia de nucleótidos de un ADN genómico que contiene un exón 1 del gen de la Fibrilina 2 derivado de ser humano y una región promotora localizada en el lado aguas arriba 5' de la misma, más específicamente, la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1 (correspondiente a una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos representada por los números de nucleótidos 118801 a 121000 de una secuencia de nucleótidos descrita con el Núm. de Acceso Genbank AC113387). En la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, la secuencia de nucleótidos del exón 1 es mostrada por los números de nucleótidos 1091 a 1345. La citosina de una secuencia de nucleótidos representada por CpG presente en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, entre otras, la citosina en CpG presente en una región en la que se encuentran presentes CpG con una elevada densidad en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1 muestra una elevada frecuencia de metilación (esto es un estado de hipermetilación) en células cancerosas tales como células de cáncer pancreático. Más específicamente, los ejemplos de citosina que tiene una elevada frecuencia de metilación en una célula cancerosa pancreática incluyen citosinas representadas por los números de nucleótidos 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777, 783, 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843 y similares en la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1.

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En cuanto al cebador utilizado en la PCR, es mejor diseñar un par de cebadores que puedan amplificar un ADN que tenga una secuencia de nucleótidos que contenga la citosina, basándose en una secuencia de nucleótidos de un lado aguas arriba 5' de la citosina que se vaya a analizar y una secuencia de nucleótidos del lado aguas abajo 3' de la misma. Se selecciona una secuencia de nucleótidos para el diseño del cebador de manera que no contenga citosina en la CpG que se va a analizar. Y, cuando la secuencia de nucleótidos seleccionada para el diseño del cebador no contenga citosina en absoluto, se pueden utilizar como cebador una secuencia de nucleótidos seleccionada y una secuencia de nucleótidos complementaria a semejante secuencia de nucleótidos tal cual, respectivamente. Además, cuando la secuencia de nucleótidos seleccionada para el diseño del cebador contiene citosina distinta de la que se va a analizar, pero la citosina no es citosina en CpG, se diseña un cebador a la vista de que estas citosinas se convierten en uracilo. Esto es, se diseña un par de cebadores, que tienen cada uno una secuencia de nucleótidos en la cual todas las citosinas se convierten en uracilo y se diseña una secuencia de nucleótidos complementaria a esta secuencia de nucleótidos. Adicionalmente, cuando una secuencia de nucleótidos seleccionada para el diseño del cebador contiene citosina distinta de la que se va a analizar, y la citosina es citosina en CpG, se diseñan los cebadores a la vista de que la citosina que no ha experimentado metilación es convertida en uracilo, y la citosina que ha experimentado metilación no es convertida en uracilo. Esto es, se diseñan un par de cebadores específicos de metilación, respectivamente, seleccionados entre una secuencia de nucleótidos que contiene citosina metilada [una secuencia de nucleótidos en la cual la citosina de una posición que va a ser metilada (citosina en CpG) todavía permanece como citosina, y la citosina no metilada (citosina no contenida en CpG) es convertida en uracilo] y una secuencia de nucleótidos complementaria a semejante secuencia de nucleótidos, y un par de cebadores específicos de no metilación, teniendo cada uno una secuencia de nucleótidos en la cual la citosina no es metilada (una secuencia de nucleótidos en la cual todas las citosinas se convierten en uracilos) y una secuencia de nucleótidos complementaria a semejante secuencia de nucleótidos. En este caso, se utilizan cantidades equivalentes del par de cebadores específicos de metilación y el par de cebadores específicos de no metilación en la PCR mencionada antes, mezclándolos.

En cuanto al reactivo para modificar la citosina no metilada, por ejemplo, se puede utilizar un bisulfito tal como bisulfito sódico. Incidentemente, en principio, también se puede utilizar un reactivo que modifique específicamente sólo la citosina metilada.

Con el fin de que el ADN extraído esté en contacto con un reactivo para modificar la citosina no metilada, por ejemplo, se trata primero el ADN con un bisulfito tal como bisulfito de sodio (concentración en solución: por ejemplo, concentración final 3M) a 55ºC durante alrededor de aproximadamente 10 a 16 horas (durante la noche) en una solución alcalina (pH 9 a 14). La desnaturalización a 95ºC y la reacción a 50ºC se pueden repetir de 10 a 20 veces para acelerar la reacción. En este caso, la citosina no metilada se convierte en uracilo y, por otra parte, la citosina metilada no se convierte en uracilo y permanece aún como citosina.

Después, se lleva a cabo la PCR utilizando un ADN tratado con bisulfito o similar como molde, y utilizando cebadores que se diseñan como se ha descrito antes. Las secuencias de nucleótidos de los productos resultantes de la amplificación se comparan, y se puede medir la frecuencia de metilación por medio de la comparación.

Más específicamente, los cebadores para medir la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 mediante análisis directo de una secuencia de nucleótidos se pueden diseñar como se ha descrito antes, por ejemplo, basándose en una secuencia de nucleótidos que contiene una o más citosinas en CpG presentes en una secuencia de nucleótidos que está en una región promotora, una región no traducida o una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2. Por ejemplo, se pueden diseñar cebadores para analizar una o varias citosinas en CpG presentes en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, específicamente, una o más citosinas representadas por los números de nucleótidos 1499, 1501, 1525, 1535, 1539, 1555, 1566, 1569, 1595, 1599, 1606, 1619, 1621, 1626, 1647, 1650, 1657, y 1669 de la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, utilizando los cebadores B1 y B2 mostrados más abajo, se amplifica el ADN (251 pb), comprendiendo dicho ADN una secuencia de nucleótidos que surge del tratamiento con bisulfito del ADN que comprendía la secuencia de nucleótidos representada por los números de nucleótidos 1442 a 1692 de la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1. El par de cebadores se puede utilizar para investigar la frecuencia de metilación de una o varias citosinas representadas por los números de nucleótidos 1499, 1501, 1525, 1535, 1539, 1555, 1566, 1569, 1595, 1599, 1606, 1619, 1621, 1626, 1647, 1650, 1657, y 1669 de la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1.

Cebador

B1:	5'-TAGTTGGAGTTTAGAGTTGTA-3'	(SEQ ID No: 6)

B2:	5'-CTTCTCTAACCCCTACAAC-3'	(SEQ ID No: 7)

Los ejemplos de la solución de reacción en la PCR incluyen una solución de reacción obtenida mezclando 25 ng de ADN como molde, 1 \mul de cada una de las cuatro clases de soluciones de 20 pmol/\mul de los cebadores respectivos, 3 \mul de dNTP 2 mM, 2,5 \mul de 10 x tampón (Tris-HCl 100 mM pH 8,3, KCl 500 mM, MgCl_{2} 20 mM) y 0,2 \mul de ADN polimerasa termoestable de 5U/\mul, y añadiendo agua ultrapura esterilizada a esto en una cantidad de 25 \mul. Los ejemplos de las condiciones de reacción incluyen las condiciones en las que la solución de reacción mencionada antes se conserva a 95ºC durante 10 minutos y, después de eso, se realizan de 30 a 40 ciclos de mantenimiento de la tempe-
ratura, siendo un ciclo de 30 segundos a 95ºC, después 30 segundos a 51ºC, y adicionalmente 30 segundos a 72ºC.

Después de realizar semejante PCR, se comparan las secuencias de nucleótidos de los productos resultantes de la amplificación, y se mide la frecuencia de metilación a partir de la comparación.

Esto es, analizando directamente las secuencias de nucleótidos de los productos de la amplificación, se determina si una base en una posición correspondiente a la citosina que se va a analizar es citosina o timina (uracilo). Comparando una zona de un pico que muestra citosina y una zona de un pico que muestra timina (uracilo) detectados ambos en una posición correspondiente a la citosina que se va a analizar en un diagrama de picos que muestra los nucleótidos de los productos resultantes de la amplificación, se puede medir la frecuencia de metilación de la citosina que se va a analizar. Alternativamente, como método para analizar directamente una secuencia de nucleótidos, una vez que los productos de amplificación obtenidos mediante la PCR son clonados una vez utilizando Escherichia coli o similar como anfitrión, se preparan los ADN que están clonados respectivamente en clones plurales, y se pueden analizar las secuencias de nucleótidos de los ADN. Obteniendo una razón de las muestras en las cuales la base detectada en una posición correspondiente a la citosina que se va a analizar es citosina entre las muestras que se van a analizar, también se puede medir la frecuencia de metilación de la citosina que se va a analizar.

Como tercer método, existe un método en el que, el ADN derivado del espécimen se pone en contacto con un reactivo que modifica la citosina no metilada y, después de eso, el ADN y una sonda que puede distinguir la presencia o ausencia de metilación de la citosina que se va a analizar se hibridan y, de este modo, se investiga la presencia o ausencia de unión de la sonda.

Cuando se utiliza sangre como espécimen, se prepara plasma o suero a partir de la sangre de acuerdo con el método convencional, y el ADN libre (incluyendo el ADN derivado de células cancerosas tales como células de cáncer pancreático y similares) contenido en el plasma o suero preparado como espécimen se analiza, por medio de lo cual, se puede analizar un ADN derivado de células cancerosas tales como células de cáncer pancreático a la vez que se evita un ADN derivado de hemocitos, y se puede mejorar la sensibilidad para detectar células cancerosas tales como células de cáncer pancreático, o un tejido que las contenga.

Después, una vez que el ADN extraído se pone en contacto con un reactivo para modificar la citosina no metilada, el ADN y una sonda que puede distinguir la presencia o ausencia de metilación de la citosina que se va a analizar se hibridan y, de este modo, se investiga la presencia o ausencia de unión del ADN con la sonda. La citosina que se va a analizar se puede seleccionar entre las citosinas de una o más secuencias de nucleótidos representadas por 5'-CG-3' que está presente en una secuencia de nucleótidos de una región promotora, una región no traducida o una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2.

En la presente memoria, los ejemplos de una o más secuencias de nucleótidos representadas por CpG presente en una secuencia de nucleótidos de una región promotora, una región no traducida o una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2 incluyen una secuencia de nucleótidos de un ADN genómico que contiene un exón 1 del gen de la Fibrilina 2 derivado de ser humano y una región promotora localizada en el lado aguas arriba 5' del mismo, más específicamente, la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1 (correspondiente a una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos representada por los números de nucleótidos 118801 a 121000 de una secuencia de nucleótidos descrita con el Núm. de Acceso Genbank AC113387). En la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, la secuencia de nucleótidos del exón 1 es mostrada por los números de nucleótidos 1091 a 1345. La citosina de la secuencia de nucleótidos representada por CpG presente en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, entre otros, citosina en CpG presente en una región en la que se encuentran presentes CpG con una elevada densidad en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1 muestra una elevada frecuencia de metilación (esto es un estado de hipermetilación) en células cancerosas tales como células de cáncer pancreático. Más específicamente, los ejemplos de las citosinas que tienen una elevada frecuencia de metilación en una célula de cáncer pancreático incluyen las citosinas representadas por los números de nucleótidos 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777, 783, 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843 y similares en la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1.

Es mejor diseñar una sonda utilizada en la hibridación basada en una secuencia de nucleótidos que contiene la citosina que se va a analizar a la vista de que la citosina que no ha experimentado metilación se convierte en uracilo, y la citosina que ha experimentado metilación no se convierte en uracilo. Esto es, se diseñan una sonda específica de metilación que tiene una secuencia de nucleótidos cuando está contenida la citosina metilada [una secuencia de nucleótidos en la que la citosina de la posición que va a ser metilada (citosina en CpG) todavía permanece como citosina, y la citosina no metilada (citosina no contenida en CpG) es convertida en uracilo] o una secuencia de nucleótidos complementaria a semejante secuencia de nucleótidos, y una sonda específica de no metilación que tiene una secuencia de nucleótidos cuando la citosina no está metilada (una secuencia de nucleótidos en la que todas las citosinas son convertidas en uracilo) o una secuencia de nucleótidos complementaria a semejante secuencia de nucleótidos. Semejante sonda puede ser utilizada una vez marcada, con el fin de facilitar el análisis de la presencia o ausencia de unión de un ADN con la sonda. Alternativamente, se puede utilizar una sonda mediante su inmovilización sobre un portador de acuerdo con un método convencional. En este caso, es mejor marcar previamente un ADN extraído de un espécimen derivado de mamífero.

En cuanto al reactivo para modificar la citosina no metilada, se puede utilizar un bisulfito tal como bisulfito de sodio y similares. Incidentemente, en principio, también se puede utilizar un reactivo que modifique específicamente sólo la citosina metilada.

Con el fin de que el ADN extraído esté en contacto con un reactivo para modificar la citosina no metilada, por ejemplo, una vez que el ADN es desnaturalizado primero en una solución alcalina (pH 9 a 14), se trata el ADN con bisulfito tal como bisulfito de sodio (concentración en solución: p. ej. concentración final 3M) a 55ºC durante alrededor de aproximadamente 10 a 16 horas (durante la noche). La desnaturalización a 95ºC y la reacción a 50ºC se pueden repetir de 10 a 20 veces para acelerar la reacción. En este caso, la citosina no metilada se convierte en uracilo y, por otra parte, la citosina metilada no se convierte en uracilo, si no que permanece como citosina.

Si fuera necesario, se puede amplificar de antemano el ADN realizando una PCR utilizando un ADN tratado con bisulfito o similar como molde de la misma manera que en segundo método.

Después, el ADN tratado con bisulfito o similar o el ADN previamente amplificado mediante PCR se hibridan con una sonda que puede distinguir la presencia o ausencia de metilación de la citosina que se va a analizar. Comparando la cantidad de ADN que se une con la sonda específica de metilación, y la cantidad de ADN que se une con una sonda específica de no metilación, se puede medir la frecuencia de metilación de la citosina que se va a analizar.

Más específicamente, se puede diseñar una sonda para medir la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 como se ha descrito antes, por ejemplo, basándose en una secuencia de nucleótidos que contiene una o más citosinas en CpG presentes en una secuencia de nucleótidos en una región promotora, una región no traducida o una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2. Por ejemplo, el diseño se puede realizar basándose en una secuencia de nucleótidos que contiene una o más citosinas en CpG presentes en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, más específicamente, las citosinas representadas por los números de nucleótidos 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777, 783, 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843 y similares en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1. Los ejemplos de tales sondas se muestran más abajo.

Grupo 1

Sonda específica de no metilación:

5'-TTGTTTTTGGAGTGTATGGGAATTTGTTGAGTTTTGT-3'

(SEQ ID NO: 8)

\vskip1.000000\baselineskip

Sonda específica de metilación:

5'-TCGTTTTCGGAGCGTACGGGAATTCGTCGAGTTTTGC-3'

(SEQ ID NO: 9)

Grupo 2

Sonda específica de no metilación:

5'-TTGGTTATGTAATGTGTATTGTTTGGGGTTGTTGGTT-3'

(SEQ ID NO: 10)

\vskip1.000000\baselineskip

Sonda específica de metilación:

5'-TCGGTTATGTAACGTGTATCGTTCGGGGTTGTCGGTT-3'

(SEQ ID NO: 11)

La hibridación se puede realizar de acuerdo con el método convencional, por ejemplo, descrito por Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T., Molecular Cloning 2ª edición, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory press, y similares. La hibridación se realiza normalmente en condiciones restrictivas. En la presente memoria, los ejemplos de las "condiciones restrictivas" incluyen las condiciones en las cuales se forma un híbrido a 45ºC en una solución que contiene 6 \times SSC (una solución que contiene NaCl 1,5 M y citrato trisódico 0,15 M es 10 \times SSC) y, después de eso, el híbrido se lava con 2 \times SSC a 50ºC (Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6), y similares. La concentración de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar, por ejemplo, entre las condiciones de 2 \times SSC y 50ºC (condiciones poco restrictivas) y las condiciones de 0,2 \times SSC y 50ºC (condiciones muy restrictivas). La temperatura de lavado se puede seleccionar, por ejemplo, desde la temperatura ambiente (condiciones poco restrictivas) a 65ºC (condiciones muy restrictivas). Alternativamente, tanto la concentración de sal como la temperatura se pueden cambiar.

Una vez realizada semejante hibridación, se puede medir la frecuencia de metilación de la citosina que se va a analizar (p. ej. citosina en CpG contenida en una secuencia de nucleótidos que es la base para el diseño de la sonda) comparando la cantidad de ADN que se une con la sonda específica de metilación, y la cantidad de ADN que se une con la sonda específica de no metilación.

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En cuanto al cuarto método, existe un método en el que, el ADN derivado del espécimen se hace reaccionar con una enzima de restricción que puede distinguir la presencia o ausencia de metilación de la citosina que se va a analizar y, después de eso, se investiga la presencia o ausencia de digestión con la enzima de restricción.

Cuando se utiliza sangre como espécimen, se prepara plasma o suero a partir de la sangre de acuerdo con el método convencional, y el ADN libre (incluyendo un ADN derivado de células cancerosas tales como células de cáncer pancreático y similares) contenido en el plasma o suero preparado como espécimen se analiza, por medio de lo cual, se puede analizar el ADN derivado células cancerosas tales como células de cáncer pancreático a la vez que se evita un ADN derivado de hemocitos, y se puede mejorar la sensibilidad para detectar células cancerosas tales como células de cáncer pancreático, o un tejido que las contenga.

Después, el ADN extraído se hace reaccionar con una enzima de restricción que puede distinguir la presencia o ausencia de metilación de la citosina que se va a analizar y, después de eso, se investiga la presencia o ausencia de digestión con la enzima de restricción. La citosina que se va a analizar se puede seleccionar entre las citosinas de una o más secuencias de nucleótidos representadas por 5'-CG-3' que están presentes en una secuencia de nucleótidos de una región promotora, una región no traducida o una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2.

En la presente memoria, los ejemplos de una o más secuencias de nucleótidos representadas por CpG presente en una secuencia de nucleótidos de una región promotora, una región no traducida o una región traducida (región codificante) del gen de la Fibrilina 2 incluyen una secuencia de nucleótidos de un ADN genómico que contiene un exón 1 del gen de la Fibrilina 2 derivado de ser humano y una región promotora localizada en el lado aguas arriba 5' del mismo, más específicamente, la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1 (correspondiente a una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos representada por los números de nucleótidos 118801 a 121000 de una secuencia de nucleótidos descrita con el Núm. de Acceso Genbank AC113387). En la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, la secuencia de nucleótidos del exón 1 se muestra por medio de los números de nucleótidos 1091 a 1345. La citosina de una secuencia de nucleótidos representada por CpG presente en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, entre otras, la citosina en CpG presente en una región en la que se encuentran presentes las CpG con elevada densidad en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, muestra una elevada frecuencia de metilación (esto es, estado de hipermetilación) en células cancerosas tales como células de cáncer pancreático. Más específicamente, los ejemplos de citosina que tiene una elevada frecuencia de metilación en células de cáncer pancreático incluyen las citosinas representadas por los números de nucleótidos 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777, 783, 795, 799, 812, 823, 830, 834, 843 y similares en la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1.

La "enzima de restricción" que puede distinguir la presencia o ausencia de metilación de citosina'' (en adelante, referida como enzima de restricción sensible a la metilación en algunos casos) utilizada en el método representa una enzima de restricción que no digiere una secuencia de reconocimiento que contiene citosina metilada, y puede digerir una secuencia de reconocimiento que contiene citosina no metilada. En el caso de un ADN en el que la citosina contenida en una secuencia de reconocimiento está metilada, el ADN no se corta ni siquiera cuando se hace actuar sobre él una enzima de restricción sensible a la metilación y, por otra parte, en el caso de un ADN en el que la citosina contenida en una secuencia de reconocimiento no está metilada, el ADN se corta cuando se hace actuar sobre él una enzima de restricción sensible a la metilación. Los ejemplos de la enzima sensible a la metilación incluyen HpaII, BstUI, NarI, SacII y similares.

Los ejemplos del método para investigar la presencia o ausencia de digestión con la enzima de restricción incluyen un método para investigar la presencia o ausencia de amplificación de un ADN (producto de amplificación) realizando una PCR, utilizando como molde un ADN que había reaccionado con una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción que contiene la citosina que se va a analizar, y utilizando un par de cebadores que puede amplificar un ADN que contiene la secuencia de reconocimiento que contiene la citosina que se va a analizar y que no contiene una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción además de esa secuencia de reconocimiento. Cuando la citosina que se va a analizar está metilada, se obtiene un producto de amplificación. Por otra parte, cuando la citosina que se va a analizar no está metilada, no se obtiene producto de amplificación. De este modo, comparando con la cantidad de ADN amplificado, se puede medir la frecuencia de metilación de la citosina que se va a analizar. En los casos en los que se requiere una determinación cuantitativa, se pueden comparar las cantidades de los respectivos productos utilizando la PCR en Tiempo Real que es un método de PCR susceptible de una cuantificación muy exacta de manera que se puede detectar una ligera diferencia en la dosificación del gen de aproximadamente dos veces mediante control en tiempo real del producto de la reacción de PCR y análisis de la cinética. Los métodos para realizar la PCR en Tiempo real incluyen, por ejemplo, un método en el que se utiliza una sonda tal como una sonda de polimerasa de ácido nucleico dirigida por un molde y un método en el que se utiliza un intercalador tal como SYBR Green. Como aparato y reactivos para la PCR en Tiempo Real, se pueden utilizar aparatos y reactivos disponibles en el mercado.

Por ejemplo, en el caso de la citosina representada por el número de nucleótido 42, 889 o 1083 en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1, la citosina está contenida en una secuencia de reconocimiento para NarI, y se puede medir la frecuencia de metilación de la citosina mediante el método mencionado antes.

Adicionalmente, los ejemplos de otros métodos para investigar la presencia o ausencia de digestión de la enzima de restricción incluyen un método en el que se realiza una hibridación de Southern en un ADN que contiene citosina que se va a analizar en una secuencia de reconocimiento y se ha hecho reaccionar con una enzima de restricción sensible a la metilación, utilizando, como sonda, un ADN que deriva del gen de la Fibrilina 2 y no contiene una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción, y se investiga la longitud del ADN hibridado. Cuando la citosina que se va a analizar está metilada, se detecta un ADN más largo, en comparación con el caso en el que la citosina no está metilada. Comparando la cantidad de ADN más largo detectado y la cantidad de ADN más corto, se puede medir la frecuencia de metilación de la citosina que se va a analizar.

Utilizando los diferentes métodos mencionados antes, se mide la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen derivado de mamífero. Comparando la frecuencia de metilación medida, y por ejemplo la frecuencia de metilación (control) del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen sano derivado de mamífero que se puede diagnosticar que no tiene células cancerosas tales como células de cáncer pancreático, se determina un estado canceroso del espécimen basándose en la diferencia obtenida mediante la comparación. Si la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen derivado de mamífero es mayor en comparación con un control (si el gen de la Fibrilina 2 está en un estado de hipermetilación en comparación con un control), se puede determinar que el estado canceroso del espécimen es mayor en comparación con un control.

En la presente memoria, el "estado canceroso" tiene el mismo significado utilizado generalmente en la técnica, específicamente, por ejemplo, el estado canceroso representa una malignidad de la célula cuando el espécimen derivado de mamífero es una célula, y representa una cantidad de células cancerosas existentes en el tejido cuando el espécimen derivado de mamífero es un tejido.

La expresión del gen de la Fibrilina 2 es menor en células cancerosas tales como células de cáncer pancreático que en un espécimen tal como una célula y un tejido derivados de un mamífero sano. Puesto que la frecuencia de metilación del gen es mayor en células cancerosas tales como células de cáncer pancreático, el gen no puede ser expresado normalmente y, como resultado, la cantidad de producto de expresión del gen (más específicamente, la cantidad de un producto de la transcripción o la cantidad de un producto de la traducción) disminuye. Del mismo modo, el presente método de evaluación y similares, pueden medir, en lugar de la frecuencia de metilación, el valor del índice que tiene correlación con ella (en el caso anterior, el valor es una cantidad de un producto de expresión y un valor del índice que tiene una correlación negativa).

Esto es, en el presente método de evaluación, se puede determinar un estado canceroso de un espécimen basándose en la diferencia obtenida midiendo un valor del índice (p. ej. una cantidad de un producto de expresión) que tiene correlación con una frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen derivado de mamífero, y comparando con un control el valor de índice medido (p. ej. la cantidad de un producto de expresión) que tiene correlación con la frecuencia de metilación mencionada anteriormente.

Los ejemplos del método para medir un valor del índice que tiene correlación con una frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen derivado de mamífero en la primera etapa del presente método de evaluación incluyen un método para medir una cantidad de ARNm que es un producto de transcripción del gen de la Fibrilina 2. Para la medida, se pueden utilizar métodos conocidos tales como el método RT-PCR, el método de transferencia Northern [Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)], el método de RT-PCR in situ [Nucleic acids Res., 21, 3159, 3166 (1993)], el método de hibridación in situ, y el método NASBA [Amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico, Nature, 350, 91-92 (1991)].

Se puede preparar una muestra que contiene un ARNm que es un producto de transcripción del gen de la Fibrilina 2 que está contenido en un espécimen derivado de mamífero a partir del espécimen mediante extracción, purificación o similar de acuerdo con un método convencional.

Cuando se utiliza el método de transferencia Northern para medir la cantidad de ARNm contenido en la muestra preparada, es suficiente que la sonda de detección contenga el gen de la Fibrilina 2 o una de sus porciones (alrededor de aproximadamente 100 pb a aproximadamente 1.000 pb de oligonucleótidos obtenidos cortando el gen de la Fibrilina 2 con una enzima de restricción, o sintetizándolos químicamente basándose en la secuencia de nucleótidos del gen de la Fibrilina 2), y no está particularmente limitada con tal que confiera una especificidad que pueda ser detectada en las condiciones de detección utilizadas en la hibridación con un ARNm contenido en la muestra.

Cuando se utiliza el método de RT-PCR para medir la cantidad de ARNm contenida en la muestra preparada, es suficiente que el cebador utilizado pueda amplificar específicamente solamente el gen de la Fibrilina 2, y la región que se va a amplificar y el número de nucleótidos no están particularmente limitados. Los ejemplos de semejante cebador incluyen los cebadores (S: efectores, A: antisentido) y similares mostrados más abajo. Utilizando estos cebadores, también se puede medir la cantidad de producto de la transcripción mediante el método RT-PCR como se muestra en los Ejemplos más adelante. En los casos en los que se requiere la determinación cuantitativa, se pueden comparar las cantidades de los respectivos productos utilizando la PCR en Tiempo Real que es un método de PCR capaz de una cuantificación muy exacta de manera que se puede detectar una ligera diferencia en la dosificación del gen de aproximadamente dos veces mediante control en tiempo real del producto de reacción de la PCR y análisis de la cinética. Los métodos para realizar la PCR en Tiempo real incluyen, por ejemplo, un método que utiliza una sonda tal como una sonda de polimerasa de ácido nucleico dirigida por un molde y un método en el que se utiliza un intercalador tal como SYBR Green. Como aparato y reactivos para la PCR en Tiempo real, se pueden utilizar aparatos y reactivos disponibles en el mercado.

S:	5'-GGCGAGGACAGCAGGAC-3'	(SEQ ID NO: 12)

A;	5'-TGATATTTGCCCACTGGAACA-3'	(SEQ ID NO: 13)

Los ejemplos de otro método para medir un valor del índice que tiene correlación con la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 que está contenido en un espécimen derivado de mamífero en la primera etapa del presente método de evaluación incluyen un método para medir la cantidad de proteína Fibrilina 2 que es un producto de traducción del gen de la Fibrilina 2. Para la medida, se pueden utilizar métodos conocidos tales como el método de tinción inmunológica, el método de separación mediante inmunoprecipitación, y el método de inhibición competitiva indirecta (método ELISA) descrito en Cell Technology Handbook, Yodosha, 207 (1992), y similares, utilizando un anticuerpo específico (anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal) contra la proteína Fibrilina 2.

Incidentemente, se puede preparar un anticuerpo específico contra una proteína Fibrilina 2 de acuerdo con el método inmunológico convencional utilizando la proteína como antígeno inmunitario.

Utilizando los diferentes métodos mencionados antes, se mide el valor de índice que tiene correlación con la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen derivado de mamífero. Comparando el valor de índice que tiene correlación con la frecuencia de metilación medida, por ejemplo con un valor del índice (control) que tiene correlación con la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen sano derivado de mamífero que se puede diagnosticar que no tiene células cancerosas tales como células de cáncer pancreático, basándose en la diferencia obtenida mediante comparación, se determina el estado canceroso del espécimen. Si el valor del índice que tiene una correlación positiva con la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen derivado de mamífero es mayor en comparación con un control, o si el valor del índice que tiene correlación negativa con él es menor en comparación con el control (si el gen de Fibrilina 2 está en estado de hipermetilación en comparación con el control), se puede determinar que el estado canceroso del espécimen es mayor en comparación con el control.

Un cebador, una sonda y un anticuerpo específico que se pueden utilizar en los diferentes métodos de medición de la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 o u valor del índice que tiene correlación con él en el presente método de evaluación son útiles como reactivos de un kit para detectar células cancerosas tales como células de cáncer pancreático. La presente invención también proporciona un kit para detectar células cancerosas tales como células de cáncer pancreático que contiene estos cebador, sonda o anticuerpo específico como reactivos, y un chip para detectar células cancerosas tales como células de cáncer pancreático que comprende el cebador, la sonda, el anticuerpo específico o similares inmovilizados sobre un portador, y el alcance directo del presente método de evaluación incluye el uso en forma del kit de detección y el chip de detección mencionados antes que utilizan el principio esencial del método.

La expresión del gen es menor en células cancerosas tales como células de cáncer pancreático que en un espécimen tal como una célula y un tejido derivados de un mamífero sano. Por otra parte, como se muestra también en los Ejemplos más adelante, haciendo actuar una sustancia que inhibe la metilación del ADN referente al gen de la Fibrilina 2 sobre células cancerosas tales como células de cáncer pancreático y similares, se puede incrementar la cantidad de producto de expresión del gen. Esto significa que una sustancia que puede compensar la reducción del nivel de expresión del gen de la Fibrilina 2 en células cancerosas tales como células de cáncer pancreático o la reducción de la función que la acompaña - por ejemplo, un gen de Fibrilina 2 no metilado (o en el que la anomalía de la metilación reconocida en el cáncer no se ha producido), un producto de expresión del gen, una sustancia que tiene la capacidad de promover la expresión del gen (p. ej. una sustancia que inhibe la metilación del ADN referente al gen de la Fibrilina 2, una sustancia que reduce la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2) y similares son útiles en el tratamiento del cáncer tal como un cáncer pancreático y similares, y en la inhibición de la canceración de un tejido normal tal como el tejido pancreático.

Por ejemplo, la canceración se inhibiría administrando una sustancia que reduzca la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 a las células de un organismo de un mamífero que puede ser diagnosticado de cáncer. Adicionalmente, por ejemplo, introduciendo en las células cancerosas tales como células de cáncer pancreático el gen de la Fibrilina 2 o un ADNc que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína de Fibrilina 2, se podía incrementar la cantidad de expresión de una proteína de Fibrilina 2 y similares en células cancerosas tales como células de cáncer pancreático.

La presente invención también proporciona una composición para su uso en el tratamiento del cáncer, que comprende un ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos del gen de la Fibrilina 2 como ingrediente activo, donde el ingrediente activo se formula en un portador farmacéuticamente aceptable (en adelante, referido como presente composición anti-cancerosa en algún caso).

La forma de dosificación de la presente composición anti-cancerosa no está particularmente limitada con tal que ésta sea una preparación convencional, y semejante preparación se pueda elaborar, por ejemplo incorporando un ingrediente activo a un portador farmacéuticamente aceptable tal como un disolvente soluble en agua, un disolvente no soluble en agua, un tampón, un solubilizante, un agente isotónico, y un estabilizador. Si fuera necesario, se puede añadir un agente suplementador tal como un antiséptico, un agente suspensor, y un agente emulsionante. Además, cuando se administra parenteralmente (generalmente, preferiblemente mediante inyección y similares), se puede utilizar la composición anti-cancerosa en forma de una preparación líquida convencional tal como una solución y similares.

Se puede administrar parenteralmente una cantidad eficaz de la presente composición anti-cancerosa a mamíferos tales como un ser humano (p. ej. una célula de un organismo de un mamífero que puede estar diagnosticado de cáncer). Los ejemplos del método para administrar parenteralmente el agente incluyen un inyectable (subcutáneamente, intravenosamente, y localmente) y similares.

La dosis difiere dependiendo de la edad, el sexo y el peso del mamífero al que se vaya a administrar, el grado de la enfermedad, la clase y la forma de administración del presente agente anti-canceroso y similares y, normalmente, se puede administrar en una cantidad que produce un equivalente a nivel intracelular a un nivel de concentración tal que el ingrediente activo funciona eficazmente en una célula del paciente. Además, se puede administrar la dosis por día anteriormente mencionada de una vez o dividida en pocas veces.

En la presente memoria, los ejemplos del método para introducir un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de la Fibrilina 2 en una célula incluyen un método de introducción de un gen en el que se utiliza un vector distinto de virus (Nikkei Science, 1994, Abril, p 20-45, Experimental Medicine, Edición Extra, 12(15) (1994), Experimental Medicine Separate Volume "Fundamental Technique of Gene Therapy", Yodosha (1996)) y similares.

Los ejemplos del método anterior para introducir el gen incluyen un método para producir el gen que incorpora un ADN que codifica TR4 o TR4 mutante en un virus con ADN o un virus con ARN tal como retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociado, herpesvirus, virus vaccinia, poxvirus, poliovirus, cinbisvirus y similares. Además, los ejemplos del método de introducción del gen utilizando un vector distinto de un virus incluyen un método para administrar un plásmido de expresión directamente en el músculo (método de vacuna de ADN), un método con liposomas, un método con lipofectina, un método de microinyección, un método con fosfato de calcio, un método de electroporación y similares.

Además, los ejemplos del método que utiliza un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de Fibrilina 2 como ingrediente activo de una terapia génica como agente anti-canceroso incluyen un método in vivo para introducir el ácido nucleico directamente en un organismo, un método ex vivo para sacar una célula concreta de un ser humano, introduciendo el ácido nucleico en la célula fuera del organismo, y devolviendo la célula al organismo (Nikkei Science, 1994, Abril, p 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36(1), 23-48 (1994), Experimental Medicine, Edición Extra, 12(15)(1994)) y similares.

En el caso del primer método in vivo, se puede administrar un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de Fibrilina 2 por una ruta de administración adecuada dependiendo de la enfermedad, los síntomas y similares. Por ejemplo, se puede administrar el ADN a células de cáncer pancreático, o intravenosamente, intra-arterialmente, subcutáneamente, intradérmicamente o intramuscularmente mediante inyección.

Una forma de dosificación del agente de terapia génica como agente anti-canceroso puede ser una suspensión, o una preparación de liposomas tal como un agente congelado, un agente congelado de concentración por centrifugación y similares además de un inyectable. Semejante preparación se puede elaborar incorporando el gen (incluyendo una forma del gen de un tipo de vector o un tipo de virus, o un tipo de plásmido) a un portador farmacéuticamente aceptable tal como un disolvente soluble en agua, un disolvente no soluble en agua, un tampón, un solubilizante, u agente isotónico, y un estabilizador. Si fuera necesario, se puede añadir un agente suplementador tal como un antiséptico, un agente suspensor, un agente emulsionante. Además, cuando se administra parenteralmente (generalmente, preferiblemente mediante inyección o similar), se puede utilizar el agente anti-canceroso en forma de una preparación líquida convencional tal como una solución y similares.

El presente método de búsqueda es un método para buscar una sustancia que tenga la capacidad de promover la expresión del gen de la Fibrilina 2, y tiene (1) una primera etapa de puesta en contacto de la sustancia de ensayo con células cancerosas, (2) una segunda etapa de medición de un producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 contenido en las células cancerosas después de la primera etapa (1), y (3) una tercera etapa de determinación de la capacidad para promover la expresión del gen de la Fibrilina 2 poseída por la sustancia de ensayo basándose en la diferencia obtenida comparando la cantidad medida de un producto de expresión con un control.

Las células cancerosas de la primera etapa del presente método de búsqueda no están particularmente limitadas, y pueden ser células cancerosas separadas de un tejido canceroso derivado de mamífero, o líneas de células cancerosas derivadas de mamífero que están establecidas como línea celular. Los ejemplos del mamífero incluyen seres humanos, monos, ratones, ratas, hámsters y similares. Los ejemplos preferibles del cáncer incluyen cáncer pancreático y similares. Específicamente, las realizaciones de los mismos incluyen las células de las líneas de cáncer pancreático derivadas de ser humano conocidas tales como BXPc3, HPAF-II, Capan-2, MiaPaCa-2, Hs766T, PANC-1, HPAC (todas asequibles de la ATCC).

La cantidad de células cancerosas para poner en contacto una sustancia de ensayo con células cancerosas en la primera etapa del presente método de búsqueda es normalmente de aproximadamente 10^{4} a 10^{8} células, preferiblemente de aproximadamente 10^{5} a 10^{7} células. La concentración de sustancia de ensayo es normalmente de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 100 \mug/ml, preferiblemente de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 50 \mug/ml. El período de tiempo para poner en contacto la sustancia de ensayo con las células cancerosas es normalmente de 1 hora a alrededor de 5 días, preferiblemente de unas pocas horas a 2 días. El número de veces que se pone en contacto una sustancia de ensayo con las células cancerosas puede ser de una vez a varias veces.

El entorno en el cual se pone en contacto la sustancia de ensayo con las células cancerosas es preferiblemente el entorno en el que se mantiene la actividad vital de las células cancerosas, por ejemplo, el entorno en el que coexiste la fuente de energía de las células cancerosas. Específicamente, resulta ventajoso que la primera etapa se realice en un medio.

Para medir la cantidad de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 contenido en las células cancerosas en la segunda etapa del presente método de búsqueda, se puede medir la cantidad de acuerdo con el "método para medir el valor del índice que tiene correlación con una frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen derivado de mamífero en la primera etapa del presente método de evaluación" anteriormente mencionado y similares.

Para determinar la capacidad de promover la expresión del gen de la Fibrilina 2 poseída por una sustancia de ensayo basándose en la diferencia obtenida comparando la cantidad de producto de expresión medida en la segunda etapa del presente método de búsqueda con un control, como se ha descrito antes, se compara la cantidad medida de un producto de expresión, por ejemplo, con la cantidad (control) de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 cuando la concentración de sustancia de ensayo para poner en contacto la sustancia de ensayo con las células cancerosas en la primer etapa del presente método de búsqueda es cero (esto es, cuando la sustancia de ensayo no está en contacto con las células cancerosas), por medio de lo cual, se determina la capacidad para promover la expresión del gen de la Fibrilina 2 poseída por la sustancia de ensayo basándose en la diferencia obtenida por medio de la comparación. Si la cantidad de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 contenido en las células cancerosas que se ha puesto en contacto con la sustancia de ensayo es mayor cuando se compara con un control (en este caso, una cantidad de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 contenido en las células cancerosas que no se ha puesto en contacto con la sustancia de ensayo), se puede determinar que la sustancia de ensayo tiene la capacidad de promover la expresión del gen de la Fibrilina 2. Por supuesto se puede utilizar como control una cantidad de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 cuando otra sustancia de ensayo está en contacto con las células cancerosas y, en este caso, es preferible que la capacidad para promover la expresión del gen de la Fibrilina 2 poseída por la otra sustancia de ensayo sea conocida de antemano.

De este modo, es posible buscar una sustancia que tenga la capacidad de promover la expresión del gen de la Fibrilina 2. Además, es preferible que la cantidad de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 contenido en un espécimen derivado de una línea celular normal tal como una línea celular gástrica normal, o un mamífero sano que se puede diagnosticar que no tiene células cancerosas tales como células de cáncer pancreático se mida como fondo o control tanto en el caso en el que la sustancia de ensayo se pone en contacto como en el caso en el que la sustancia de ensayo no se pone en contacto.

Ejemplos

La presente invención se explicará con detalle más abajo por medio de Ejemplos, pero la presente invención no está limitada por ellos.

Ejemplo 1 Ensayo de confirmación del estado de metilación del gen de la Fibrilina 2 en líneas de células de cáncer pancreático

Se cultivaron siete clases de líneas celulares de cáncer pancreático derivadas de ser humano [BXPc3, HPAF-II, Capan-2, MiaPaCa-2, Hs766T, PANC-1 y HPAC (obtenidas todas de la ATCC)] hasta la subconf luencia en un medio utilizado exclusivamente para cada línea celular descrita en los catálogos de la ATCC (Colección de Cultivos Tipo Americana), y después de eso se recogieron aproximadamente 1 \times 10^{7} células, respectivamente. Se cultivaron dos clases de células epiteliales ductales pancreáticas (normales) inmortales (HPDE-4/E6E7 y HPDE6-E6E7c7) [estas son mantenidas y gestionadas por el Dr. Tsao (Ontario Cancer Institute and Department of Pathology, Unversidad de Toronto) y asequibles del investigador] hasta la subconfluencia en Keratinocyte SFM, medio líquido (Invitrogen) que contenía 50 U/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina, y después de eso se recogieron aproximadamente 1 \times 10^{7} células, respectivamente. Se añadió 10 veces el volumen de tampón SEDTA [Tris/HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM] a las células recogidas, y estas se homogeneizaron. A la mezcla resultante se le añadieron proteinasa K (Sigma) de 200 \mug/ml y dodecilsulfato de sodio en una cantidad que diera una concentración del 1% (p/v), y esto se sacudió a 55ºC durante aproximadamente 16 horas. Una vez completado el sacudimiento, la mezcla se trató mediante extracción con fenol [saturado con Tris/HCl 1M (pH 8,0)]-cloroformo. La capa acuosa se recuperó, y a esto se le añadió NaCl para dar una concentración 0,5 N, y esto se hizo precipitar con etanol para recuperar los productos precipitados. Los productos precipitados recuperados se disolvieron en tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), y a esto se le añadió ARNasa A (Sigma) para dar una concentración de 40 \mug/ml, seguido de incubación a 37ºC durante 1 hora. La mezcla incubada se trató mediante extracción con fenol-cloroformo. La capa acuosa se recuperó, a esto se le añadió NaCl para dar una concentración 0,5N, y esto se precipitó con etanol-cloroformo para recuperar los productos precipitados (ADN genómico). Los productos precipitados recuperados se enjuagaron con etanol del 70% para obtener un ADN genómico.

El ADN genómico resultante se digirió con la enzima de restricción BamHI y después de eso se trató con bisulfito de sodio de acuerdo con el método descrito por Clark et al., Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9821-9826, 1996. Esto es, el ADN genómico (0,2-1 \mug) tras el tratamiento con la enzima de restricción se disolvió en agua destilada para preparar 20 \mul de una solución de ADN genómico, a esto se añadieron aproximadamente 2 \mul de hidróxido de sodio 6M y, después de eso, la mezcla se incubó a 37ºC durante 15 minutos. A la mezcla se añadieron hidroquinona 0,6 mM (Sigma) para dar una concentración de 0,5 mM y bisulfito de sodio (Sigma) para dar una concentración de 3,1 M, y esto se incubó con 15 ciclos de mantenimiento de la temperatura, siendo cada ciclo de 30 segundos a 95ºC, después 15 minutos a 50ºC. Se purificó el ADN de la solución incubada utilizando un sistema de limpieza de ADN Wizard (Promega). El ADN purificado se disolvió en 50 \mul de tampón TE, y a esto se le añadió hidróxido de sodio para dar una concentración de 0,3 M, después de lo cual, la mezcla se dejó reposar a la temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, la mezcla reposada se precipitó con etanol para recuperar los productos precipitados (ADN). Los productos precipitados se suspendieron en 20 \mul de tampón TE.

El ADN resultante se utilizó como molde y se realizó la PCR utilizando los cebadores específicos de no metilación U1 y U2, o los cebadores específicos de metilación M1 y M2 mostrados más abajo. Cuando se utilizan los cebadores específicos de no metilación U1 y U2, se amplifica un ADN de 171 pb, comprendiendo dicho ADN una secuencia de nucleótidos que surge del tratamiento con bisulfito del ADN que comprendía la secuencia de nucleótidos representada por los números de nucleótidos 677 a 847 de la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1. Entretanto, cuando se utilizan los cebadores específicos de metilación M1 y M2, se amplifica un ADN de 168 pb, comprendiendo dicho ADN una secuencia de nucleótidos que surge del tratamiento con bisulfito del ADN que comprendía la secuencia de nucleótidos representada por los números de nucleótidos 680 a 847 de la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1.

Cebador específico de no metilación

Cebador específico de metilación

Para verificar la especificidad del cebador específico de no metilación y del cebador específico de metilación, se extrajo primero el ADN genómico (ADN1) de células epiteliales ductales pancreáticas inmortales (normales) (HPDE-4/E6E7) mediante un método convencional, y parte del ADN se trató con metilasa SssI (NEB) para metilar todos los 5'-CG-3' contenidos en el ADN genómico (ADN2). Respecto a ADN1 y ADN 2, se realizaron la PCR específica de no metilación y la PCR específica de metilación.

Se utilizó una solución de reacción para PCR que se había obtenido mezclando 25 ng de un ADN como molde, 1 \mul de cada una de las soluciones de 20 pmol/\mul de cebador mencionadas anteriormente, 2,5 \mul de dNTP 2 mM, 2,5 \mul de 10 \times tampón (100 mL de Tris-HCl pH 8,3, KCl 500 mM, MgCl_{2} 20 mM) y 0,2 \mul de una ADN polimerasa termoestable de 5U/\mul, y añadiendo agua ultrapura esterilizada a esto en una cantidad de solución de 25 \mul. Cuando se utilizó el cebador específico de no metilación mencionado antes, se realizó la PCR en condiciones en las que la solución de reacción se mantuvo a 95ºC durante 10 minutos, y se realizaron 32 ciclos de mantenimiento de la temperatura, cada ciclo consistió en 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 59ºC y 30 segundos a 72ºC. Además, cuando se utilizó el cebador específico de metilación mencionado antes, se realizó la PCR en condiciones en las que la solución de reacción se mantuvo a 95ºC durante 10 minutos, y se realizaron 32 ciclos de mantenimiento de la temperatura, cada ciclo consistió en 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 62ºC y 30 segundos a 72ºC. En cualquier caso, una vez realizada la PCR, la solución de reacción de PCR que contenía el producto de amplificación se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Los resultados se muestran en la Figura 1. En el caso de las líneas de células epiteliales ductales pancreáticas inmortales (normales) derivadas de ser humano (HPDE-4/E6E7 y HPDE6-E6E7c7), cuando se utilizó un cebador específico de no metilación (calle U), se reconoció una banda del ADN amplificado, cuando se utilizó el cebador específico de metilación (calle M), no se detectó una banda del ADN amplificado. Por lo tanto, en el caso de las líneas de células epiteliales ductales pancreáticas inmortales (normales) derivadas de ser humano (HPDE-4/E6E7 y HPDE6-E6E7c7), se determinó que al menos las citosinas representadas por los números de nucleótidos 679, 687, 690, 699, 830, 834 y 843, respectivamente, de la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1 no estaban metiladas.

Por otra parte, en el caso de las siete clases de líneas de células de cáncer pancreático (BXPc3, HPAF-II, Capan-2, MiaPaCa-2, Hs766T, PANC-1 y HPAC), cuando se utilizó un cebador específico de no metilación (calle U), no se detectó una banda de ADN amplificado, y cuando se utilizó un cebador específico de metilación (calle M), se reconoció una banda de ADN. Por lo tanto, en esas condiciones, se determinó que las citosinas representadas por los números de nucleótidos 687, 690, 699, 830, 834 y 843, respectivamente, de la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1 estaban metiladas.

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Ejemplo 2 Ensayo de confirmación del estado de metilación del gen de la Fibrilina 2 en tejidos de cáncer pancreático

A cada uno de los 12 especímenes (Caso 1 a Caso 12) de tejidos de cáncer pancreático y los tejidos normales pancreáticos circundantes (obtenidos de pacientes con su consentimiento por escrito), se añadió 10 veces el volumen de tampón SEDTA [Tris/HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM], y esto se homogeneizó. A la mezcla resultante se le añadieron proteinasa K (Sigma) de 200 \mug/ml y dodecilsulfato de sodio en una cantidad para dar una concentración del 1% (p/v), y esto se sacudió a 55ºC durante aproximadamente 16 horas. Una vez completado el sacudimiento, la mezcla se trató mediante extracción con fenol [saturado con Tris/HCl 1M (pH 8,0)] - cloroformo. Se recuperó la capa acuosa, y a esto se le añadió NaCl para dar una concentración de 0,5N, y esto se precipitó con etanol para recuperar los productos precipitados. Los productos precipitados recuperados se disolvieron en tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), y a esto se le añadió ARNasa A (Sigma) para dar una concentración de 40 \mug/ml, seguido de incubación a 37ºC durante 1 hora. La mezcla incubada se trató mediante extracción con fenol-cloroformo. La capa acuosa se recuperó, a esto se le añadió NaCl para dar una concentración 0,5N, y esto se precipitó con etanol para recuperar los productos precipitados (ADN genómico). Los productos precipitados se enjuagaron con etanol del 70% para obtener el ADN genómico.

El ADN genómico resultante se digirió con la enzima de restricción BamHI y después de eso se trató con bisulfito de sodio de acuerdo con el método descrito por Clark et al., Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9821-9826, 1996. Esto es, tras el tratamiento con la enzima de restricción, el ADN genómico (0,2-1 \mug) se disolvió en agua destilada para preparar 20 \mul de una solución de ADN genómico, a esto se le añadieron aproximadamente 2 \mul de hidróxido de sodio 6M y, después de eso, la mezcla se incubó a 37ºC durante 15 minutos. A la mezcla se le añadieron hidroquinona 0,6 mM (Sigma) para dar una concentración de 0,5 mM y bisulfito de sodio (Sigma) para da runa concentración de 3,1 M, y esto se incubó con 15 ciclos de mantenimiento de la temperatura, consistiendo cada ciclo en 30 segundos a 95ºC, después 15 minutos a 50ºC. Se purificó un ADN de la solución incubada utilizando un sistema de limpieza de ADN Wizard (Promega). El ADN purificado se disolvió en 50 \mul de tampón TE, y a esto se le añadió hidróxido de sodio para dar una concentración de 0,3 M, después de eso, la mezcla se dejó reposar a la temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, la mezcla reposada se precipitó con etanol para recuperar los productos precipitados (ADN). Los productos precipitados recuperados se suspendieron en 2 0 \mul de tampón TE.

El ADN resultante se utilizó como molde y se realizó la PCR utilizando los cebadores específicos de no metilación U1 y U2, o los cebadores específicos de metilación M1 y M2 mostrados más abajo. Cuando se utilizaron los cebadores específicos de no metilación U1 y U2, se amplificó un ADN de 171 pb, comprendiendo dicho ADN una secuencia de nucleótidos que surge del tratamiento con bisulfito del ADN que comprendía la secuencia de nucleótidos representada por los números de nucleótidos 677 a 847 de la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1. Entretanto, cuando se utilizaban los cebadores específicos de metilación M1 y M2, se amplifica un ADN de 168 pb, comprendiendo dicho ADN una secuencia de nucleótidos que surge del tratamiento con bisulfito del ADN que comprendía la secuencia de nucleótidos representada por los números de nucleótidos 680 a 847 de la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1.

Cebador específico de no metilación

Cebador específico de metilación

Se verificó la especificidad del cebador específico de no metilación y del cebador específico de metilación, como se ha descrito en el Ejemplo 1, en ADN genómico (ADN1) de células epiteliales ductales pancreáticas inmortales (normales) (HPDE-4/E6E7) y en parte del ADN tratado con metilasa SssI (NEB) dando como resultado el ADN genómico (ADN2).

Se utilizó una solución de reacción para PCR que se había obtenido mezclando 25 ng de un ADN como molde, 1 \mul de cada una de las soluciones de cebador anteriormente mencionadas de 20 pmol/\mul, 2,5 \mul de dNTP 2 mM, 2,5 \mul de 10 \times tampón (Tris-HCl 100 mL pH 8,3, KCl 500 mM, MgCl_{2} 20 mM) y 0,2 \mul de ADN polimerasa termoestable de 5U/\mul, y añadiendo a esto agua ultrapura esterilizada en una cantidad de solución de 25 \mul. Cuando se utilizó un cebador específico de no metilación anteriormente mencionado, se realizó la PCR en condiciones en las que la solución de reacción se mantuvo a 95ºC durante 10 minutos, y se realizaron 32 ciclos de temperatura, cada ciclo consistió en 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 59ºC y 30 segundos a 72ºC. Además, cuando se utilizó el cebador específico de metilación mencionado antes, se realizó la PCR en condiciones en las que la solución de reacción se conservó a 95ºC durante 10 minutos, y se realizaron 32 ciclos de mantenimiento de la temperatura, cada ciclo consistió en 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 62ºC y 30 segundos a 72ºC. En cualquier caso, una vez realizada la PCR, se sometió la solución de reacción de PCR que contenía el producto de amplificación a electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Los resultados se muestran en la Figura 2. En el caso de los 12 especímenes de tejidos normales pancreáticos derivados de ser humano, cuando se utilizó un cebador específico de no metilación (calle U), se reconoció una banda de ADN amplificado, y cuando se utilizó un cebador específico de metilación (calle M), no se detectó una banda del ADN amplificado. Por lo tanto, en el caso de los tejidos normales pancreáticos derivados de ser humano, se determinó que al menos las citosinas representadas por los números de nucleótidos 679, 687, 690, 699, 830, 834 y 843, respectivamente, de la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1 no estaban metiladas. En el caso de los 9 especímenes de tejidos de cáncer pancreático, además de una banda amplificada cuando se utilizaba un cebador específico de no metilación (calle U), también se reconoció una banda de ADN cuando se utilizaba un cebador específico de metilación (calle M). Por lo tanto, en esas condiciones, se determinó que al menos las citosinas representadas por los números de nucleótidos 687, 690, 699, 830, 834 y 843, respectivamente, de la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO: 1 estaban metiladas debido a la canceración de parte del tejido.

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Ejemplo 3 Ensayo de confirmación del estado de expresión del gen de la Fibrilina 2 en líneas de células de cáncer pancreático y efecto del inhibidor de la metilación sobre la expresión del gen

Se cultivaron siete clases de líneas de células de cáncer pancreático derivadas de ser humano (BXPc3, HPAF-II, Capan-2, MiaPaCa-2, Hs766T, PANC-1 y HPAC) y líneas de células epiteliales ductales pancreáticas inmortales (normales) (HPDE-4/E6E7 y HPDE6-E6E7c7) hasta una confluencia del 70% en un medio utilizado exclusivamente, y después de eso, se corrigió cada célula. Se mezcló 1 ml de solución de ISOGEN (Nippon Gene) con cada una de las células recogidas (peso húmedo aproximado 100 mg), esto se homogeneizó, y a esto se le añadieron 0,2 ml de cloroformo para suspenderlas. Una vez suspendidas, la mezcla se centrifugó (4ºC, 15000 \times g, 15 minutos) para recuperar el sobrenadante. Se añadieron 0,5 ml de isopropanol al sobrenadante recuperado para suspenderlas, y la suspensión se centrifugó (4ºC, 15000 \times g, 15 minutos) para recuperar los productos precipitados (ARN). Los productos precipitados se enjuagaron con etanol del 75%, y se disolvieron en agua tratada con DEPC (pirocarbonato de dietilo).

Se sembraron dos clases de líneas de células de cáncer derivadas de ser humano (PANC-1 y HPAC) a una densidad de aproximadamente 6 \times 10^{5} células/placa de 10 cm, y se cultivaron utilizando un medio empleado exclusivamente. El primer día después de la siembra, se añadió al medio 5-aza-2'-desoxitidina (fabricada por Sigma) (en adelante referida como 5Aza-dC) que es un inhibidor de la metilación para dar una concentración de 0,5 o 1 \muM. Veinticuatro horas después de la adición de 5Aza-Dc, se cambió el medio por el medio mencionado antes al que no se había añadido 5Aza-dC, y se continuó el cultivo. Después, el tercer día después de la siembra, se añadió 5Aza-dC al medio de un modo similar. El cuarto día después de la siembra, las células se recuperaron, y se extrajo el ARN y se recuperó de las células recuperadas de la misma manera descrita antes.

Los 3 \mug de ARN así obtenidos se trataron con ADNasa I (Ambion), y esto se utilizó como molde y se empleó Superscript II (Invitrogen) para sintetizar un ADNc de acuerdo con el protocolo adjuntado a la enzima. Realizando una PCR en Tiempo Real empleando el ADNc sintetizado como molde y utilizando Fibrilina 2 S y Fibrilina 2 A mostrados más abajo como par de cebadores, se amplificó el ADN derivado de ARNm del gen de la Fibrilina 2. Después de eso, como control realizando la PCR utilizando el ADNc mencionado anteriormente como molde y utilizando la solución de GAPDH S y GAPDH A de más abajo como par de cebadores, se amplificó un ADN derivado de un ARNm de un gen de Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

Cebador (S: efector, A: antisentido)

Fibrilina 2 S:	5'-GGCGAGGACAGCAGGAC-3'	(SEQ ID NO: 12)

Fibrilina 2 A:	5'-TGATATTTGCCCACTGGAACA-3'	(SEQ ID NO: 13)

GAPDH S:	5'-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'	(SEQ ID NO: 14)

GAPDH A:	5'-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3'	(SEQ ID NO: 15)

Se utilizó una solución de reacción de PCR que se había obtenido mezclando 50 ng de ADNc como molde, 1 \mul de cada una de las dos clases de solución de cebador de 10 pmol/\mul mencionada antes, 4 \mul de dNTP 2,5 mM, 4 \mul de dUTP 5 mM, 5 \mul de 10 \times SYBR Green PCR Buffer, 6 \mul de MgCl_{2} 25 mM y 0,3 \mul de una ADN polimerasa termoestable de 5U/\mul (AmpliTaq Gold), 0,5 \mul de AmpEraseUNG y añadiendo agua ultrapura esterilizada a esto a una cantidad de solución de 50 \mul. Se realizó la PCR en Tiempo Real utilizando un Ciclador Térmico iCycler (Bio-Rad Laboratories). Cuando se hubo amplificado el ADN derivado del ARNm del gen de la Fibrilina 2 y el gen GAPDH, después de conservar la solución de reacción a 95ºC durante 10 minutos, se realizó la PCR en Tiempo Real en las condiciones en las que cada ciclo consistía en 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 59ºC y 30 segundos a 72ºC para cuantificar el gen de la Fibrilina 2 y el gen GAPDH.

Los resultados se muestran en la Figura 3 y la Figura 4. En el caso de las líneas de células epiteliales ductales pancreáticas inmortales (normales) derivadas de ser humano (HPDE-4/E6E7 y HPDE6-E6E7c7), se detectó un ADN derivado de un ARNm del gen de la Fibrilina 2, mientras en cualquiera de los casos de las siete clases de líneas de células de cáncer pancreático, no se detectó el ADN. Esto es, en las líneas de células epiteliales ductales pancreáticas inmortales (normales) derivadas de ser humano (HPDE-4/E6E7 y HPDE6-E6E7c7), se confirmó la expresión del gen de la Fibrilina 2, mientras en ninguna de las siete líneas de células de cáncer pancreático, se reconoció la expresión del gen de la Fibrilina 2.

En el caso de PANC-1 y HPAC cultivadas en presencia de 5Aza-dC 0,5 \muM o 1 \muM, se detectó un ADN derivado de ARNm del gen de la Fibrilina 2. Mientras, se detectó un ADN derivado de ARNm del gen GAPDH de un modo similar, en el caso de las líneas de células epiteliales ductales pancreáticas inmortales (normales) (HPDE-4/E6E7 y HPDE6-E6E7c7), en el caso de las líneas de células de cáncer pancreático PANC-1 y HPAC cultivadas en ausencia de 5Aza-dC, y en el caso de PANC-1 y HPAC cultivadas en presencia de 5Aza-dC 0,5 \muM o 1 \muM. Esto es, en el caso de las líneas de células de cáncer pancreático PANC-1 y HPAC, se reconoció la expresión del gen de la Fibrilina 2 en presencia de un inhibidor de la metilación.

A partir de los resultados anteriores, quedó claro que la metilación anteriormente mencionada en una línea de células de cáncer pancreático es inhibida por un inhibidor de la metilación, y el gen de la Fibrilina 2 es expresado en presencia del inhibidor de la metilación.

Aplicabilidad industrial

La presente invención puede proporcionar un método para evaluar el estado canceroso de un espécimen derivado de mamífero.

Texto libre de la lista de secuencias

SEQ ID NO: 2

Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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SEQ ID NO: 3

Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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SEQ ID NO: 4

Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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SEQ ID NO: 5

Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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SEQ ID NO: 6

Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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SEQ ID NO: 7

Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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SEQ ID NO: 8

Oligonucleotídico diseñado para la sonda

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SEQ ID NO: 9

Oligonucleotídico diseñado para la sonda

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SEQ ID NO: 10

Oligonucleotídico diseñado para la sonda

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SEQ ID NO: 11

Oligonucleotídico diseñado para la sonda

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SEQ ID NO: 12

Cebador oligonucleotídico diseñado la para la PCR

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SEQ ID NO: 13

Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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SEQ ID NO: 14

Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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SEQ ID NO: 15

Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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<110> JAPÓN representado por el PRESIDENTE DEL CENTRO NACIONAL DEL CÁNCER

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<110> SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED

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<120> Método para evaluar el grado canceroso

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<130> S10807WO01

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<150> JP 2003/322822

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<151> 2003-09-16

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<160> 15

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<210> 1

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<211> 2200

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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1

2

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<210> 2

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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<400> 2

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tatgggaatt tgttgagttt tgt

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23

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<210> 3

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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<400> 3

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aaccaacaac cccaaaca

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18

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<210> 4

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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<400> 4

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gggaattcgt cgagttttgc

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20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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<400> 5

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aaccgacaac cccgaacg

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18

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<210> 6

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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<400> 6

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tagttggagt ttagagttgt a

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21

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<210> 7

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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<400> 7

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cttctctaac ccctacaac

\hfill

19

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<210> 8

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado para la sonda

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<400> 8

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ttgtttttgg agtgtatggg aatttgttga gttttgt

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37

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<210> 9

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<400> 9

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tcgttttcgg agcgtacggg aattcgtcga gttttgc

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37

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<210> 10

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<400> 10

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ttggttatgt aatgtgtatt gtttggggtt gttggtt

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37

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<210> 11

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado para la sonda

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<400> 11

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tcggttatgt aacgtgtatc gttcggggtt gtcggtt

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37

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<210> 12

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<400> 12

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ggcgaggaca gcaggac

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17

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<210> 13

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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<400> 13

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tgatatttgc ccactggaac a

\hfill

21

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<210> 14

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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aggtgaaggt cggagtcaac g

\hfill

21

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<210> 15

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<211> 20

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<212> ADN

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<223> Cebador oligonucleotídico diseñado para la PCR

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<400> 15

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aggggtcatt gatggcaaca

\hfill

20

Claims

1. Un método para evaluar un estado canceroso de un espécimen derivado de mamífero, que comprende:

(1): una primera etapa de medición de la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 contenido en el espécimen derivado de mamífero o un valor de un índice correlacionado con ella, y

(2): una segunda etapa de determinación del estado canceroso del espécimen basado en la diferencia obtenida comparando la frecuencia de metilación medida o el valor del índice que tiene correlación con la misma, con un control;

donde el valor del índice es la cantidad de un producto de expresión del gen de la Fibrilina 2.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el espécimen derivado de mamífero es un espécimen celular.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, donde el estado canceroso del espécimen es una malignidad de una célula derivada de mamífero.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el espécimen derivado de mamífero es un espécimen de tejido.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, donde el estado canceroso del espécimen es una cantidad de células cancerosas existente en un tejido derivado de mamífero.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, donde el tejido es un tejido pancreático, y el cáncer es cáncer pancreático.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la primera etapa comprende la medición de la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 y la segunda etapa comprende la determinación de un estado canceroso del espécimen basado en la diferencia obtenida comparando la frecuencia de metilación medida con un control.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la frecuencia de metilación de un gen es la frecuencia de metilación de la citosina en una o más secuencias de nucleótidos representadas por 5'-CG-3' presente en una secuencia de nucleótidos de una región promotora, una región no traducida o una región traducida del gen.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la frecuencia de metilación de un gen es la frecuencia de metilación de la citosina en una o más secuencias de nucleótidos representadas por 5'-CG-3' presente en la secuencia de nucleótidos representada por el SEQ ID NO. 1.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende:

(1): una primera etapa de medición de la cantidad de un producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 contenido en el espécimen derivado de mamífero, y

(2): una segunda etapa de determinación de un estado canceroso del espécimen basada en la diferencia obtenida comparando la cantidad medida del producto de expresión con un control.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, donde la cantidad de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 es la cantidad de producto de la transcripción del gen.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, donde la cantidad de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 es la cantidad de producto de la traducción del gen.

13. Un método in vitro para identificar una sustancia que tiene la capacidad de reducir la frecuencia de metilación del gen de la Fibrilina 2 y promover la expresión del gen, que comprende:

(1): una primera etapa para poner en contacto una sustancia de ensayo con células cancerosas,

(2): una segunda etapa para medir la cantidad de producto de expresión del gen de la Fibrilina 2 contenido en las células cancerosas después de la primera etapa (1), y

(3): una tercera etapa para determinar la capacidad de la sustancia de ensayo para promover la expresión del gen de la Fibrilina 2 basada en la diferencia obtenida comparando la cantidad de producto de expresión medida con un control.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde las células cancerosas son células de cáncer pancreático.

15. Una composición para su uso en el tratamiento del cáncer, que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de la Fibrilina 2 como ingrediente activo, donde el ingrediente activo se formula en un portador farmacéuticamente aceptable.

16. El uso, ex vivo, del gen metilado de la Fibrilina 2 como marcador del cáncer.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, donde el marcador del cáncer es un marcador del cáncer pancreático.