ES2336428T3 - Preparacion de celulasa que contiene agentes tensioactivos no ionicos y procedimiento para tratar fibras. - Google Patents

Preparacion de celulasa que contiene agentes tensioactivos no ionicos y procedimiento para tratar fibras. Download PDF

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Abstract

Preparación de celulasa que comprende uno o más agentes tensioactivos no iónicos junto con la(s) proteína(s) (a) y/o (b) tal como se describe a continuación: a)una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 6, y b)una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos tal como se muestran en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 6, y que tiene actividad endoglucanasa, caracterizada porque el o los agentes tensioactivos no iónicos son los únicos agentes tensioactivos presentes.

Description

Preparación de celulasa que contiene agentes tensioactivos no iónicos y procedimiento para tratar fibras.
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a una preparación de celulasa que comprende uno o más agentes tensioactivos no iónicos mediante los cuales se mejora la actividad de la endoglucanasa, a un detergente que comprende la preparación de celulasa, así como a un procedimiento para tratar tejidos donde se emplea la preparación de celulasa.
Antecedentes de la técnica
La celulasa posee tres tipos de actividades enzimáticas: la actividad de la celobiohidrolasa, que hidroliza las regiones cristalinas sólidas de la celulosa a partir del extremo no reducido de una forma exo para generar la celobiosa; la actividad endoglucanasa, que hidroliza las regiones amorfas de la celulosa de forma endo para convertir las moléculas de celulosa en moléculas de bajo peso molecular y para generar diversos tipos de celooligosacáridos; y la actividad \beta-glucosidasa, que descompone la celobiosa o el celooligosacárido en glucosa. De entre las enzimas, cuando la endoglucanasa ejerce una gran actividad, la celulasa se utiliza ventajosamente para tratar tejidos.
Para conferir ciertas propiedades deseadas a un tejido que contiene celulosa, convencionalmente el tejido se trata con celulasa. Por ejemplo, en la industria textil, se lleva a cabo el tratamiento con celulasa para mejorar el tacto y el aspecto del tejido que contiene celulosa o para conferir un aspecto de "lavado a la piedra" al tejido de color que contiene celulosa, proporcionando así al tejido una variación localizada de colores (Patente EP Nº 307.564).
Es conocido que, debido al lavado repetido, en los tejidos de color que contienen celulosa se forman pelusas y esto difumina el color del tejido coloreado. Un detergente que contiene celulosa elimina estas pelusas y hace que el color del tejido sea nítido (clarificación del color) (Patente EP Nº 220.016) y, por tanto, en el mercado, principalmente en Europa y Estados Unidos, actualmente se pueden encontrar detergentes que contienen celulasa.
En dicho procesamiento textil se utiliza esencialmente celulasa procedente de hongos de la putrefacción de la madera, tales como Trichoderma y Humicola. Tal celulasa se utiliza en forma de una mezcla que comprende múltiples componentes de celulasa y que se obtiene mediante el procesamiento de un filtrado de un cultivo de microorganismos que tienen actividad celulolítica. Recientemente, sin embargo, con el fin de mejorar el coste, se ha utilizado una preparación de celulasa obtenida mediante aislamiento de los componentes de la celulasa, solamente la endoglucanasa que actúa en gran medida en el tratamiento de los tejidos, y que la mejora genéticamente. Ejemplos de dicha endoglucanasa de alta actividad incluyen: EGV (Publicación de Patente JP (Traducción PCT) Nº 5-509223) y NCE4 (WO 98/03640), procedente de Humicola insolens, que actúa rotundamente sobre los tejidos de algodón; RCE I, RCE II y RCE III derivadas de Rhizopus oryzae, que actúa fuertemente sobre los tejidos de lyocell; MCE I y MCE II procedentes de Mucor circinelloides; y PCE I procedente de Phycomyces nitens (WO 00/24879).
Con el fin de mejorar los efectos de la celulasa, también se ha intentado utilizar de forma combinada aditivos. Por ejemplo, la Publicación de Patente JP (Traducción PCT) Nº 5-507615 describe un polímero soluble en agua, tal como polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico y poliacrilamida, que intensifica los efectos de la celulasa procedente de Humicola insolens y mejora su actividad de eliminar pelusas en tejidos coloreados. Además, se sabe que la actividad CMCasa en la solución de cultivo de Trichoderma viride mejora con la adición de Tween 20 (Ooshima, H., y col., Biotechnology and Bioengineering).
Sin embargo, las celulasas utilizadas con los propósitos descritos anteriormente son todas muy caras. Por tanto, con el fin de lograr su aplicación en el ámbito industrial, se desea otra mejora de la actividad endoglucanasa de modo que los efectos anteriores de la celulasa puedan ejercerse de forma más eficaz.
Descripción de la invención
Es por tanto el objeto de la presente invención proporcionar una preparación de celulasa que tenga una actividad mejorada de la endoglucanasa, que se pueda utilizar con el propósito de poder llevar a cabo de manera eficaz y económica un tratamiento de los tejidos para mejorar los tejidos que contienen celulosa, tal como la eliminación de pelusas.
Como resultado de profundos estudios dirigidos al objeto anteriormente mencionado, los presentes inventores han descubierto que un agente tensioactivo no iónico intensifica los efectos de las endoglucanasas derivadas de Zigomicetos tales como RCE I, MCE I y PCE I, a velocidades mucho más altas que las endoglucanasas derivadas de Trichoderma o Humicola, llegando así a la presente invención.
Esto es, la presente invención se refiere a los siguientes puntos (1) a (3):
1)
Una preparación de celulasa tal como se define en la reivindicación 1, que comprende uno o más agentes tensioactivos no iónicos junto con endoglucanasa(s) procedentes de Zigomicetos,
2)
Una composición detergente tal como se define en la reivindicación 8, que se puede obtener mezclando dicha preparación de celulasa con componentes detergentes.
3)
Un procedimiento para tratar tejidos que comprende el tratamiento de tejidos que contienen celulosa con dicha preparación de celulasa para mejorar las propiedades de los tejidos.
[1] Preparación de celulasa
La preparación de celulasa de la presente invención comprende endoglucanasa(s) procedente(s) de Zigomicetos y uno o más agentes tensioactivos no iónicos.
En la presente invención, se utiliza el término "endoglucanasa" en el sentido de endo-1,4-\beta-glucanasa EC3.2.1.4, y ésta posee la actividad de hidrolizar los enlaces \beta-1,4-glucopiranosil del \beta-1,4-glucano.
Las endoglucanasas procedentes de Zigomicetos utilizadas en la presente invención incluyen endoglucanasas derivadas de Rhizopus sp., Phycomyces sp. o Mucor sp., específicamente proteínas RCE I, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II y PCE I que tienen las secuencias de aminoácidos tal como se muestran en las SEQ ID NOS: 1 a 6, respectivamente, que se describen en la WO 00/24879.
RCE I, II y III proceden de la cepa CP96001 de Rhizopus oryzae depositada bajo los términos del Tratado de Budapest con el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Institución Administrativa Independiente del Ministerio de Economía, Comercio e Industria, en AIST Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón (código postal 305-8566) [antiguo nombre: Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, antigua dirección: Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japón], con el nº de acceso FERM BP-6889, 21 de abril de 1997. MCE I y II proceden de la cepa CP99001 de Mucor circinelloides, depositada con la misma autoridad depositaria internacional, es decir el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Institución Administrativa Independiente del Ministerio de Economía, Comercio e Industria, en AIST Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón (código postal 305-8566) [antiguo nombre: Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, antigua dirección: Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japón], con el nº de acceso FERM BP-6890, 2 de julio de 1999. Además, PCE I procede de la cepa CP99002 de Phycomyces nitens, depositada con la misma autoridad depositaria internacional, con el nº de acceso FERM BP-6891, 2 de julio de 1999.
En la presente invención, las proteínas RCE I, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II y PCE I indicadas anteriormente incluyen proteínas modificadas y homólogos de las mismas. El término "proteína modificada" utilizado aquí se refiere a una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que comprende una adición, inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos (por ejemplo, de uno a varias decenas, específicamente de uno a aproximadamente cincuenta, preferentemente de uno a aproximadamente treinta y especialmente de uno a aproximadamente nueve aminoácidos) con respecto a la secuencia de aminoácidos de cada una de las RCE I, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II y PCE I mencionadas anteriormente, y que tienen actividad endogluconasa. El término "homólogos" empleado aquí se refiere a una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos codificada por un gen (secuencia de nucleótidos) complementario a un gen (secuencia de nucleótidos) que "se hibridiza en condiciones rigurosas" con un gen (secuencia de nucleótidos) que codifica la secuencia de aminoácidos de cada una de las RCE I, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II y PCE I mencionadas anteriormente y que tiene actividad endoglucanasa. Aquí, el término "en condiciones rigurosas" se refiere a aquellas condiciones bajo las que una sonda que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica todas o parte de las secuencias de aminoácidos de RCE I, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II o PCE I, o las secuencias de aminoácidos de las proteínas modificadas de las mismas, se hibridizarían con un gen que codifica un homólogo, pero la misma sonda no se hibridiza con un gen NCE4 de la endoglucanasa (SEQ ID NO: 7) tal como se describe en la WO 98/03640 o el gen SCE 3 de la endogluconasa (SEQ ID NO: 8) tal como se describe en la WO 98/54322 (se debe observar que la cantidad de ADN utilizado aquí es equivalente a la cantidad de cada gen NCE 4, gen SCE 3 y un gen que codifica el homólogo). De forma más específica, se refiere a aquellas condiciones bajo las que, utilizando como sonda una secuencia de ADN de longitud total que codifica la secuencia de aminoácidos de RCE I etiquetada, se lleva a cabo una prehibridación a 42ºC durante 1 hora de acuerdo con el método ECL directo de detección y etiquetado de ADN/ARN (Amersham), después se añade la sonda mencionada anteriormente y se continúa con la hibridación a 42ºC durante 15 horas y, a continuación, el producto resultante se lava dos veces con una solución que contiene un 0,4% de SDS, urea 6M y 0,5 x SSC (SSC; 15 mM citrato trisódico, 150 mM cloruro sódico) a 42ºC durante 20 minutos y finalmente se prosigue con el lavado del producto dos veces con 5 x SSC a temperatura ambiente durante 10
minutos.
Un ejemplo de dicha proteína modificada o su homólogo incluye una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene preferentemente un 80% o más de homología, con especial preferencia un 90% o más de homología, en particular un 95% o más de homología y específicamente un 98% o más de homología con la secuencia de aminoácidos de RCE I, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II o PCE I. Los valores de homología indicados anteriormente se pueden calcular mediante un programa de búsqueda de homologías bien conocido por un especialista en la técnica, pero los valores se calculan preferentemente por medio de un parámetro por defecto (inicializado) de FASTA3 [Science, 227, 1435-1441 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1998); http://www.dd-bj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html].
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El agente tensioactivo no iónico incluido en la preparación de celulasa de la presente invención se refiere a un agente tensioactivo cuyo grupo hidrofílico es un grupo no iónico. Ejemplos de tales agentes tensioactivos no iónicos incluyen alquil éteres de polioxietileno, alquilfenil éteres de polioxietileno, polioxietilen ésteres de ácidos monograsos, sorbitan-polioxietilen ésteres de ácidos monograsos, sorbitano ésteres de ácidos monograsos, polietilenglicol, glicerol ésteres de ácidos monograsos, pliglicerol ésteres de ácidos grasos, alquilglicósidos, ésteres de alquilglicósidos polietoxilados, óxido de alquil dimetil amina, dietanolamidas de ácidos grasos, polioxietilen alquilamina, polímero de tetraetilenglicol con ácido tereftálico, alquil polietilenglicol éter, nonilfenol polietilenglicol éter y ésteres de ácidos grasos de sacarosa o glucosa. Estos agentes tensioactivos no iónicos se pueden utilizar solos o en combinación con otros agentes tensioactivos no iónicos.
Además, la preparación de celulasa de la presente invención puede comprender otros componentes contenidos convencionalmente en preparaciones de celulasa, tales como excipientes y conservantes. La forma de la preparación de celulasa puede ser sólida o líquida y ejemplos específicos de la forma incluyen polvo, particulado, gránulo, gránulo no pulverulento y formulación líquida.
Un gránulo no pulverulento, que es una forma de preparación de la celulasa, se puede producir de acuerdo con el método habitual de granulación en seco. Es decir, la enzima celulasa en polvo se mezcla con uno o varios tipos seleccionados de entre un grupo que comprende sales inorgánicas tales como sulfato sódico y cloruro sódico, que son neutras y no tienen ningún efecto sobre la actividad endoglucanasa; minerales tales como bentonita y montmorillonita, que no tienen ningún efecto sobre la actividad endoglucanasa; y materias orgánicas neutras tales como almidón y celulosa en polvo. A continuación, los polvos o la suspensión finamente suspendida de uno o varios tipos de los agentes tensioactivos no iónicos descritos anteriormente, que mejoran los efectos de la endoglucanasa, se añaden a la mezcla y el producto así obtenido se mezcla o amasa por completo. Dependiendo de la situación, opcionalmente se añade a la mezcla un polímero sintético, tal como polietilenglicol, y un polímero natural, como almidón, que se une a los sólidos y después se amasa. A continuación, se lleva a cabo la granulación por moldeo por extrusión, utilizando por ejemplo un granulador de disco, y el material moldeado obtenido se convierte entonces en una forma esférica mediante un marumerizador, seguido de secado, de modo tal que se puedan producir gránulos no pulverulentos. Naturalmente, también es posible recubrir la superficie de los gránulos con un polímero o similar para controlar la permeabilidad del oxígeno o del agua. En este caso, se añaden a la preparación de celulasa anterior uno o más agentes tensioactivos no iónicos que mejoran el efecto de la endoglucanasa, en una relación de entre el 0,1 al 50% en peso, preferentemente del 0,1 al 30% en peso y en especial del 1 al 20% en peso.
Por otra parte, la preparación líquida se puede obtener mediante mezcla de un estabilizador de endoglucanasa, tal como un polímero sintético y natural, con una solución de celulasa y adición de sales inorgánicas o de un conservante sintético, según sea necesario. En este caso, se pueden añadir también uno o más agentes tensioactivos no iónicos que mejoran el efecto de la endoglucanasa. Como en el caso del gránulo no pulverulento, a la preparación de celulasa anterior se añade uno o más agentes tensioactivos no iónicos que mejoran el efecto de la endoglucanasa, en una relación de entre el 0,01 al 50% en peso, preferentemente del 0,1 al 30% en peso y en especial del 1 al 20% en peso.
[2] Composición detergente
La preparación de celulasa de la presente invención descrita anteriormente se mezcla con componentes detergentes conocidos, tales como adyuvantes, blanqueadores, activadores de blanqueo, inhibidores de la corrosión, agentes secuestrantes, polímeros disociadores de tintes, agentes aromáticos, otras enzimas, estabilizadores enzimáticos, asistentes de formulación, agentes fluorescentes blanqueadores y activadores de agentes espumantes, de modo que se pueda producir una composición detergente.
La presente composición detergente se refiere a eliminadores de suciedad granulares, clarificación del color, eliminación de pelusas, eliminación de bolitas y reducción de la rigidez, y éstos pueden mejorarse por la composición de la presente invención.
[3] Procedimiento para tratar tejidos
El procedimiento para tratar tejidos de la presente invención comprende el tratamiento de tejidos que contienen celulosa con la preparación de celulasa anterior.
Las siguientes propiedades de tejidos que contienen celulosa se pueden mejorar por medio del presente método de tratamiento de tejidos:
1)
Eliminación de pelusas (reducción de la velocidad de formación de pelusas y reducción de las pelusas);
2)
Clarificación del color en tejidos coloreados que contienen celulosa;
3)
Provisión de una variación localizada del color en tejidos coloreados que contienen celulosa, es decir proporciona un aspecto y textura de tipo lavado a la piedra a tejidos coloreados que contienen celulosa, típicamente vaqueros;
4)
Mejora del tacto y del aspecto del tejido mediante la reducción del peso, y
5)
Suaviza los tejidos (reducción de la rigidez).
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El método para tratar tejidos mencionado anteriormente se puede llevar a cabo típicamente durante el lavado, pero también se puede realizar durante el remojo o enjuague. Específicamente, el método para tratar tejidos de la presente invención se puede llevar a cabo mediante la adición de la preparación de celulasa de la presente invención al agua en la que se remoja o remojará el tejido.
Condiciones tales como la temperatura de contacto y la cantidad de endoglucanasa se pueden determinar adecuadamente teniendo en cuenta varias otras condiciones. Por ejemplo, en el caso de reducir la velocidad de formación de pelusas o reducir la pelusa del tejido que contiene celulosa, se puede tratar el tejido a una temperatura de aproximadamente 30ºC a 60ºC utilizando de 10 a 10.000 mg/l de agentes tensioactivos no iónicos y endoglucanasas en una concentración proteica de 0,05 a 20 mg/l.
En caso de proporcionar al tejido coloreado que contiene celulosa variaciones de color localizadas, se puede tratar el tejido a una temperatura de aproximadamente 30ºC a 60ºC utilizando de 10 a 10.000 mg/l de agentes tensioactivos no iónicos y endoglucanasas en una concentración proteica de 0,1 a 30 mg/l.
En un procesamiento de reducción del peso, cuyo objetivo es mejorar el tacto y aspecto del tejido que contiene celulosa, se puede tratar el tejido a una temperatura de aproximadamente 30ºC a 60ºC utilizando de 10 a 10.000 mg/l de agentes tensioactivos no iónicos y endoglucanasas en una concentración proteica de 0,2 a 50 mg/l.
En cualquiera de los casos anteriores, el agente tensioactivo no iónico se puede disolver o suspender en agua.
La concentración proteica de cada tipo de endoglucanasa se mide por análisis HPLC utilizando gel TSK, columna TMS-250 (4,6 mm D.I. x 75 cm) (TOSOH Corporation). El análisis HPCL implica cargar acetonitrilo en TFA al 0,05% (ácido trifluoroacético) con un gradiente de concentración lineal del 0% al 80% a un caudal de 1,0 ml/min para eluir cada tipo de endoglucanasa y calcular la concentración proteica a partir del área del pico a 280 nm en UV. Se somete un NCE4 purificado, cuya concentración proteica se determina previamente por medio de un Kit de Ensayo de Proteínas (BioRad Laboratories), a análisis HPLC de la misma forma que anteriormente, de modo tal que se utiliza como estándar. De acuerdo con el método descrito en la Publicación Internacional Nº WO 98/03640, el NCE4 purificado se obtiene mediante el cultivo de Humicola insolens [Humicola insolens MN200-1, depositada bajo el nº de acceso FERM BP-5977 (nº de acceso original FERM-15736, fecha de acceso original: 15 de julio de 1996) con el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Institución Administrativa Independiente del Ministerio de Economía, Comercio e Industria, en AIST Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón (código postal 305-8566), antiguo nombre: Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial], y purificando el cultivo obtenido. Como estándar para la determinación de una concentración proteica en el Kit de Ensayo de Proteínas se utiliza el Estándar de Albúmina (seroalbúmina bovina, fracción V, PIERCE).
Esta especificación incluye el contenido tal como se describe en la especificación de la Solicitud de Patente Japonesa Nº 2000-343921, que es un documento de prioridad de la presente solicitud.
Mejor forma de realización de la presente invención
La presente invención se describe además en los siguientes ejemplos. Sin embargo, se proporcionan estos ejemplos solamente a modo ilustrativo y no pretenden limitar el alcance de la invención.
En lo que sigue, el término "actividad endoglucanasa" significa actividad CMCasa. Además, con respecto a la "actividad CMCasa", cuando una solución que comprende la enzima celulasa y carboximetilcelulosa (CMC, Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) se incuba durante cierto período de tiempo y se mide la cantidad de azúcar reductor liberada, la cantidad de enzima que produce el azúcar reductor correspondiente a 1 \mumol de glucosa por minuto se define como 1 unidad.
Ejemplo 1
Comparación entre los coeficientes de mejora de la actividad de eliminación de pelusas de varios tipos de celulasas mediante la adición de un agente tensioactivo no iónico
Se llevaron a cabo el cultivo de Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides y Phycomyces nitens, así como la purificación de las endoglucanasas RCE I, MCE I y PCE I a partir de los cultivos por medio del método descrito en la Publicación Internacional Nº WO 00/24879.
El cultivo de Humicola insolens [Humicola insolens MN200-1 que se depositó bajo el nº de acceso FERM BP-5977 (nº de acceso original FERM P-15736, fecha de acceso original: 15 de julio de 1996) con el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Institución Administrativa Independiente del Ministerio de Economía, Comercio e Industria, antiguo nombre: Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial], así como la purificación de la endogluconasa NCE4 a partir del cultivo se llevaron a cabo por medio del método descrito en la Publicación Internacional WO 98/03640.
El cultivo de Trichoderma viride [Trichoderma viride MC300-1 que se depositó bajo el nº de acceso FERM BP-6047 (nº de acceso original FERM P-15842, fecha de acceso original: 9 de septiembre de 1996) con el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Institución Administrativa Independiente del Ministerio de Economía, Comercio e Industria, AIST Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón (código postal 305-8566), antiguo nombre: Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial], se llevó a cabo por medio del método descrito en la Publicación Internacional WO 98/54332.
El tratamiento de eliminación de pelusas de un tejido de punto de algodón con pelusas formadas en una gran lavadora (tejido de 6 cm x 8 cm de Cotton Smooth Knit No. 3900, Nitto Boseki Co., Ltd., se tiñó de color marrón mediante un tinte reactivo en Tsuyatomo-Senko) se llevó a cabo utilizando el sobrenadante del cultivo obtenido y varias endoglucanasas uniformemente purificadas en las siguientes condiciones.
Condiciones de ensayo
Máquina de ensayo: Lavadora Meter L-20 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japón).
Temperatura: 40ºC
Tiempo: 120 minutos
Cantidad de solución de reacción: 40 ml
pH de reacción: se ajustó solamente el sobrenadante del cultivo de Trichoderma viride a un pH de 4 (20 mM tampón de acetato), todas las demás soluciones enzimáticas se ajustaron a un pH de 6 (5 mM tampón de fosfato) para la reacción. Todos los tampones se prepararon con agua desionizada.
Tipo y cantidad de agente tensioactivo no iónico: 100 \mug/ml de polioxietilen lauril éter (NOF Corporation, nombre del producto: NissanNonion K-220, número de unidades de oxietileno añadidas: 20, HLB: 16,2).
A la solución de tratamiento se añadieron cuatro bolas de goma de aproximadamente 16 g junto con la solución enzimática.
La cantidad de solución enzimática necesaria para eliminar aproximadamente el 50% de las pelusas formadas en base a la evaluación visual se determinó en cada uno de ambos casos, con adición y no adición de agente tensioactivo no iónico. A continuación, se obtuvo un valor dividiendo la cantidad de solución enzimática necesaria para eliminar aproximadamente un 50% de pelusa en el caso de no adición de agente tensioactivo no iónico entre la cantidad en el caso de adición de agente tensioactivo no iónico, y el valor obtenido se definió como coeficiente de mejora de la actividad eliminadora de pelusa por la adición de agente tensioactivo no iónico. Se muestran los resultados en la Tabla 1.
TABLA 1
1
A partir de los resultados de la Tabla 1 se deduce que la actividad eliminadora de pelusa de RCE I, MCE I y PCE I, que son endoglucanasas procedentes de Zigomicetos, mejora mediante la adición del agente tensioactivo no iónico a un nivel mucho más alto que otras enzimas, incluida la celulasa procedente de Humicola insolens o Trichoderma viride, que representan los descubrimientos anteriores.
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Ejemplo 2
Efecto de mejora de la actividad eliminadora de pelusa de RCE I expresada en Humicola mediante la adición de varios agentes tensioactivos no iónicos
La endoglucanasa RCE I se expresó en Humicola insolens de acuerdo con el método descrito en los Ejemplos D3 y 4 de la Publicación Internacional WO 00/24879. El tratamiento de eliminación de pelusa de un tejido de punto de algodón con pelusa formada en una lavadora grande (un tejido de 6 cm x 8 cm de Cotton Smooth Knit No. 3900, Nitto Boseki Co., Ltd., se tiñó de color marrón mediante un tinte reactivo en Tsuyatomo-Senko) se llevó a cabo utilizando el sobrenadante de cultivo obtenido en las siguientes condiciones.
Condiciones de ensayo
Máquina de ensato: Lavadora Meter L-20 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japón).
Temperatura: 40ºC
Tiempo: 120 minutos
Cantidad de solución de reacción: 40 ml
pH de reacción: pH de 6 (5 mM tampón fosfato preparado con agua desionizada). Cantidad de agentes tensioactivos no iónicos: 100 \mug/ml.
Tipo de agentes tensioactivos no iónicos: remitirse a la Tabla 2 tal como se describe a continuación.
A la solución de tratamiento se añadieron cuatro bolas de goma de aproximadamente 16 g de junto con la solución enzimática.
TABLA 2
2
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La cantidad de solución enzimática necesaria para eliminar aproximadamente el 50% de la pelusa formada en base a la evaluación visual se determinó en cada uno de ambos casos de adición y no adición de cada agente tensioactivo no iónico. A continuación, se obtuvo un valor dividiendo la cantidad de solución enzimática necesaria para eliminar aproximadamente un 50% de la pelusa en caso de no añadir el agente tensioactivo no iónico entre la cantidad en caso de añadir el agente tensioactivo no iónico, y el valor obtenido se definió como coeficiente de mejora de la actividad eliminadora de pelusa mediante la adición del agente tensioactivo no iónico. Se muestran los resultados en la
Tabla 3.
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TABLA 3
3
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A partir de los resultados de la Tabla 3 se deduce que la actividad eliminadora de pelusa del sobrenadante del cultivo obtenido mediante la expresión y secreción de RCE I en Humicola insolens se mejoró mediante cualquiera de los agentes tensioactivos no iónicos anteriores.
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Ejemplo 3
Efecto de mejora de la actividad eliminadora de pelusa de RCE I expresada en Humicola mediante la adición de agentes tensioactivos no iónicos con varias concentraciones
La endoglucanasa RCE I se expresó en Humicola insolens de acuerdo con el método descrito en los Ejemplos D3 y 4 de la Publicación Internacional WO 00/24879. El tratamiento de eliminación de pelusa de un tejido de punto de algodón con pelusa formada en una lavadora grande (un tejido de 6 cm x 8 cm de Cotton Smooth Knit No. 3900, Nitto Boseki Co., Ltd., se tiñó de color marrón mediante un tinte reactivo en Tsuyatomo-Senko) se llevó a cabo utilizando el sobrenadante de cultivo obtenido en las siguientes condiciones.
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Condiciones de ensayo
Máquina de prueba: Lavcadora Meter L-20 (Daiei Kagaku Seiki MFG., Japón).
Temperatura: 40ºC
Tiempo: 120 minutos
Cantidad de solución de reacción: 40 ml
pH de reacción: pH de 6 (5 mM tampón fosfato preparado con agua desionizada).
Cantidad de agente tensioactivo no iónico: 10 a 10.000 \mug/ml.
Tipo de agente tensioactivo no iónico: polioxietilen lauril éter (NOF Corporation, nombre del producto: NissanNonion K-220, número de unidades de oxietileno añadidas: 20, HLB: 16,2).
A la solución de tratamiento se añadieron cuatro bolas de goma de aproximadamente 16 g de junto con la solución enzimática.
La cantidad de solución enzimática necesaria para eliminar aproximadamente el 50% de la pelusa formada en base a la evaluación visual se determinó en el caso de adición del agente tensioactivo no iónico en cada concentración. A continuación, se obtuvo un valor dividiendo la cantidad de solución enzimática necesaria para eliminar aproximadamente un 50% de la pelusa en el caso de no añadir el agente tensioactivo no iónico entre la cantidad en el caso de añadir el agente tensioactivo no iónico en cada concentración, y el valor obtenido se definió como coeficiente de mejora de la actividad eliminadora de pelusa mediante la adición del agente tensioactivo no iónico en cada concentración. Se muestran los resultados en la Tabla 4.
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TABLA 4
4
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A partir de los resultados de la Tabla 4 se deduce que la actividad eliminadora de pelusa del sobrenadante de cultivo obtenido mediante la expresión y secreción de RCE I en Humicola insolens mejoró por la adición del agente tensioactivo no iónico en un amplio rango de concentración de 10 a 10.000 \mug/ml.
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Ejemplo 4
Producción de la preparación de celulasa RCE I incluyendo el agente tensioactivo no iónico
Tras mezclar las siguientes materias primas, se añadió a dicha mezcla la cantidad adecuada de agua y se amasó la mezcla. El producto obtenido se sometió a un granulador de disco para moldeo y el producto obtenido mediante moldeo por inyección se convirtió en una forma particulada utilizando un marumerizador (Fuji Paudal Co., Ltd.), seguidamente se secó y cribó el producto con el fin de obtener un producto granulado.
6
El producto de celulasa RCE I en polvo se preparó mediante concentración del sobrenadante de cultivo de RCE I expresado en Humicola insolens utilizando ultrafiltración de acuerdo con el método descrito en los Ejemplos D3 y 4 de la Publicación Internacional WO 00/24879, seguido de secado por aspersión.
Aplicación industrial
La presente invención proporciona una preparación de celulasa que posee una actividad endoglucanasa procedente de Zigomicetos drásticamente mejorada mediante la adición de un agente tensioactivo no iónico en la preparación. Cuando la presente preparación de celulasa se utiliza en el tratamiento de tejidos, tal como para reducir las pelusas del tejido que contiene celulosa, la mejora del tacto y del aspecto, la clarificación del color, la variación localizada de los colores, la suavización, cada uno de los tratamientos mencionados anteriormente se puede llevar a cabo con una cantidad menor de enzima, reduciendo así notablemente el coste.
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<110> MEIJI SEIKA KAISHA, LTD.
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<120> Preparaciones de celulasa que contienen detergente no iónico y método para tratar tejidos
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<130> PH-1442-PCT
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2000-343921
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 10-11-2000
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 328
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<212> PRT
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<213> Rhizopus oryzae CP96001
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> sig_péptido
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<222> (-23)... (-1)
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> péptido maduro
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<222> (1)... (315)
\newpage
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
7
\hskip0,8cm
8
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 366
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Rhizopus oryzae CP96001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> sig_péptido
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<222> (-23)... (-1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido maduro
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<222> (1)... (343)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
9
\hskip0,8cm
10
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 360
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhizopus oryzae CP96001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> sig_péptido
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<222> (-23)... (-1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido maduro
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\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)... (337)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
11
\hskip0,8cm
12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mucor circinelloides CP99001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (-22)... (-1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> péptido maduro
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<222> (1)... (316)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
13
\hskip0,8cm
14
\hskip0,5cm
15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mucor circinelloides CP99001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_péptido
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<222> (-22)... (-1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido maduro
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<222> (1)... (365)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
16
\hskip0,8cm
17
\hskip0,8cm
18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 346
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phycomyces nitens CP99002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_péptido
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<222> (-19)... (-1)
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido maduro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)... (327)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
19
\hskip0,8cm
20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola insolens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (453)... (509)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
21
\hskip0,6cm
22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1720
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma viride
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (500)... (682)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
23

Claims (16)

1. Preparación de celulasa que comprende uno o más agentes tensioactivos no iónicos junto con la(s) proteína(s) (a) y/o (b) tal como se describe a continuación:
a)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 6, y
b)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos tal como se muestran en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 6, y que tiene actividad endoglucanasa,
caracterizada porque el o los agentes tensioactivos no iónicos son los únicos agentes tensioactivos presentes.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Preparación de celulasa que comprende uno o más agentes tensioactivos no iónicos junto con proteína(s) codificada(s) por un gen que comprende el ADN (a) o (b) tal como se describe a continuación:
a)
un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 6, y
b)
un ADN complementario de un ADN que se hibridiza con un ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 6 en condiciones rigurosas, donde se lleva a cabo una prehibridación a 42ºC durante 1 hora de acuerdo con el método del sistema ECL directo de detección y etiquetado de ADN/ARN (Amersham), seguido de hibridación a 42ºC durante 15 horas y, a continuación, el producto resultante se lava dos veces con una solución que contiene un 0,4% de SDS, urea 6M y 0,5 x SSC (SSC; 15 mM citrato trisódico, 150 mM cloruro sódico) a 42ºC durante 20 minutos y finalmente se prosigue con el lavado del producto dos veces con 5 x SSC a temperatura ambiente durante 10 minutos, y que codifica una proteína que tiene actividad endoglucanasa.
caracterizada porque el o los agentes tensioactivos no iónicos son los únicos agentes tensioactivos presentes.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Preparación de celulasa según la reivindicación 1 que consiste en no o más agentes tensioactivos no iónicos junto con la(s) proteína(s) (a) y/o (b) tal como se describe a continuación:
a)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 6, y
b)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 6, y que posee actividad endogluconasa,
y opcionalmente excipiente(s) y/o conservante(s).
\vskip1.000000\baselineskip
4. Preparación de celulasa según la reivindicación 2 que consiste en agente(s) tensioactivo(s) no iónico(s) junto con proteína(s) codificadas por un gen que comprende el ADN (a) o (b) tal como se describe a continuación:
a)
un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 6, y
b)
un ADN complementario de un ADN que se hibridiza con un ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 6 en condiciones rigurosas, donde se lleva a cabo una prehibridación a 42ºC durante 1 hora de acuerdo con el método del sistema ECL directo de detección y etiquetado de ADN/ARN (Amersham), seguido de la hibridación a 42ºC durante 15 horas y, a continuación, el producto resultante se lava dos veces con una solución que contiene un 0,4% de SDS, urea 6M y 0,5 x SSC (SSC; 15 mM citrato trisódico, 150 mM cloruro sódico) a 42ºC durante 20 minutos y finalmente se prosigue con el lavado del producto dos veces con 5 x SSC a temperatura ambiente durante 10 minutos, y que codifica una proteína que tiene actividad endoglucanasa,
y opcionalmente excipiente(s) y/o conservante(s).
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5. Preparación de celulasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el agente tensioactivo noiónico es alquil éter de polioxietileno, alquilfenil éter de polioxietileno, polioxietilen éster de ácido monograso, polioxietilensorbitan éster de ácido monograso, sorbitan éster de ácido monograso, polietilenglicol, glicerol éster de ácido monograso, poligicerol éster de ácido graso, alquilglicósido, alquilglicósido ésteres polietoxilados, óxido de alquil dimetil amina, dietanolamidas de ácidos grasos, polioxietilen alquilamina, polímero de tetraetilenglicol con ácido tereftálico, alquil polietilenglicol éter, nonilfenol polietilenglicol éter o éster de ácidos grasos de sacarosa o glucosa.
6. Preparación de celulasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende del 0,1 al 50% en peso de agente(s) tensioactivo(s) no iónico(s).
7. Preparación de celulasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es un gránulo no pulverulento o un líquido estabilizado.
8. Composición detergente que comprende la preparación de celulasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con componentes detergentes.
9. Procedimiento para tratar tejidos que comprende el tratamiento de tejidos que contienen celulosa con la preparación de celulasa o con la composición detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para mejorar las propiedades de los tejidos.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la mejora de las propiedades del tejido es la clarificación del color.
11. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la mejora de las propiedades del tejido es la eliminación de pelusas.
12. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la mejora de las propiedades del tejido consiste en proporcionar un aspecto y una textura del tipo lavado a la piedra.
13. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la mejora de las propiedades del tejido es la mejora del tacto y del aspecto.
14. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la mejora de las propiedades del tejido es la suavización del tejido.
15. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque el(los) agente(s) tensioactivo(s) no iónico(s) está(n) presentes en una concentración de 10 a 10.000 mg/l en un sistema de reacción.
16. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque se lleva a cabo por medio de una etapa de remojo, lavado o enjuague del tejido.
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