ES2333847T3

ES2333847T3 - Sistema para la validacion cuantitativa y cualitativa interna de indices de marcadores.

Info

Publication number: ES2333847T3
Application number: ES01946890T
Authority: ES
Inventors: Johannes Gerdes
Original assignee: Dako Denmark ApS
Current assignee: Dako Denmark ApS
Priority date: 2000-01-24
Filing date: 2001-01-23
Publication date: 2010-03-02
Anticipated expiration: 2021-01-23
Also published as: JP5039264B2; WO2001055346A3; DE60140346D1; US7560282B2; JP2003520600A; ATE447711T1; WO2001055346A2; EP1250599B1; DE10002803A1; US20030124563A1; EP1250599A2

Abstract

Un pseudo-tejido que comprende una mezcla sustancialmente homogénea de dos o más poblaciones de células de células fijas incluidas en una matriz, estando dicha matriz construida a partir de un material seleccionado del grupo que consiste en plásticos, parafina o derivados de parafina, agarosa, suero sin heparina, colágeno, derivados de celulosa, derivados de quitina, derivados de quitosano y mezclas de los mismos, en el que cada una de dichas poblaciones de células se obtiene a partir de una única línea de células y comprende células que son sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de uno o más marcador(es) seleccionados del grupo que consiste en marcadores de la proliferación, receptores de hormonas, compuestos del citoesqueleto, marcadores hematológicos, productos oncógenos, receptores nucleares, aberraciones cromosómicas y agentes infecciosos, y en el que dichas dos o más poblaciones de células difieren una de otra en que las células de una población no son sustancialmente idénticas a las células de otra población con respecto al número de dicho uno o más marcador(es) específicos, en el que dichas células de dicha una o más poblaciones de células están fijas con anterioridad a su incorporación en la matriz.

Description

Sistema para la validación cuantitativa y cualitativa interna de índices de marcadores.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a una herramienta para su uso en la validación cualitativa y cuantitativa de índices de marcadores, especialmente para la diagnosis médica, la prognosis y de relevancia terapéutica tales como para la determinación de la fracción de crecimiento en una muestra con anticuerpos frente a la proteína K-67.

Técnica anterior

La determinación de marcadores y de índices de marcadores es un componente integral de la diagnosis médica moderna en los más variados campos médicos. Por consiguiente, por ejemplo, la determinación de la relación de la lipoproteína de alta densidad (HDL) a la lipoproteína de baja densidad (LDL) es parte de la rutina de los análisis de sangre; la determinación de la relación de células sanguíneas positivas CD4 a CD8 es uno de los parámetros más importantes en la diagnosis del SIDA; en la diagnosis de tumores, por ejemplo en el cáncer de pecho, la determinación del estado del receptor de la hormona se considera que es un indicador para el tratamiento que sigue a una operación. Debido a que las más variadas estructuras sirven como marcadores, los métodos de determinación son también diversos: ELISA, RIA, valoraciones químicas y/o bioquímicas, FACS, análisis luminométricos, nefelométricos, densitométricos, etc., los cuales son bien conocidos por las personas especializadas.

En la diagnosis de tumores, el examen de una sección de tejido fina y/o el examen citológico de una muestra es todavía el método de elección. Para este propósito, el patólogo experimentado aplica métodos histoquímicos, e inmunohistoquímicos y/o citoquímicos e inmunocitoquímicos en un grado creciente. Así, el estado del receptor de la hormona mencionado anteriormente se determina inmunohistológicamente y/o inmunocitológicamente en el cáncer de pecho. (En lo sucesivo, el término inmunohistoquímico abarca el inmunohistológico así como también el inmunocitológico). En todas las determinaciones del marcador, la persona especializada se debe asegurar de que los sistemas de ensayo sean capaces de ser validados cualitativa y cuantitativamente. La validación de algunos marcadores se puede efectuar mediante su calibrado frente a un patrón interno o externo y la generación de curvas de calibrado a través de medidas paralelas frente a controles positivos y negativos. Sin embargo, generalmente estos métodos de validación son muy caros y de larga duración.

En inmunohistoquímica, una validación tal, y especialmente una validación cuantitativa, no es un asunto trivial, debido a que los estuches (kits) comerciales para la representación del marcador inmunohistoquímico bien no contienen en modo alguno un control interno o, por ejemplo como sucede con el receptor de la hormona, contienen preparaciones celulares que son bien positivas o bien negativas, es decir sólo permiten una decisión de sí/no y por lo tanto sólo se pueden considerar en el mejor de los casos como una validación semi-cuantitativa.

En un estuche HercpTest^{TM} Code Nº K 5204 de tinción inmunocitoquímica comercializado por DAKO, se conoce que dispone de un portaobjetos de control para la validación de una operación de tinción para un cáncer de pecho. Este portaobjetos de control comprende tres grupos discretos y no mezclados de células de línea de células (tipos de células específicas) con una puntuación de intensidad conocida. Mediante el control de si los grupos de células de línea de células proporcionan los resultados previamente conocidos en un procedimiento de tinción, se puede validar el procedimiento de tinción.

Así, en la práctica, el patólogo experimentado realiza una determinación paralela del marcador a examinar sobre casos bien caracterizados y ensayados previamente procedentes de su archivo. Este método es, por una parte, técnicamente incierto o al menos sujeto a controversia como consecuencia de la conocida heterogeneidad de los tejidos y, por otra parte, éticamente cuestionable, lo que hace imposible una realización comercial de este procedimiento.

Desde el principio del siglo 20, los parámetros para la determinación de la actividad de proliferación han sido ya un componente integral en la diagnosis histopatológica de tumores. Inmunohistológicamente, el retrato de las estructuras que controlan el ciclo de división celular se usa como marcadores de la proliferación. Muchas de las proteínas asociadas al ciclo celular participantes se expresan momentáneamente en fases de ciclo celular único. En contraste con esto, la proteína nuclear Ki-67 (Gerdes, J., y colaboradores., Int. J. Cancer, 1983, 31: 13-20) es detectable en todas las fases activas del ciclo celular, es decir G1, S, G2 y en la mitosis, mientras que las células de la fase restante (GO) son consistentemente negativas para esta proteína (Gerdes, J., y colaboradores., J. Immunol., 1984, 133: 1710-1715). Esto significa que la expresión de la proteína Ki-67 (índice marcador Ki-67) puede servir como una medida para la fracción de crecimiento de una población celular dada. Por esto, los anticuerpos frente a la proteína Ki-67 han encontrado un amplio uso en histopatología, especialmente en numerosos estudios sobre el uso como un marcador para la evaluación de la malignidad en las neoplasias humanas (Sawhney, N. y Hall, P. A., J. Pathol, 1992, 168:161-162; Schwarting, R., Lab. Invest., 1993, 68:579-599; Lelle, R. J., y colaboradores., Cancer, 1987, 59:83-88; Lokhorst, H. M., y colaboradores.,
J. Clin. Invest, 1987, 79:1401-1411; Gerdes, J. y colaboradores., Am. J. Path., 1987, 128:330-334 y 129:486-492).

En estudios retrospectivos sobre diversas entidades de tumos, el papel del índice de marcador de la Ki-67 como un marcador de la prognosis se trata de una manera diferente. Mientras que se describió una unánime correlación entre el tiempo de supervivencia de los pacientes y el índice del marcador Ki-67 para los linfomas del tipo no de Hodgkinn malignos (Gerdes, J. y colaboradores., 1987, Lancet, ii 448-449; Grogan, T. M. y colaboradores., 1988 Blood, 71:-1157-1160; Hall, P. A. y colaboradores., J. Pathol. 1988, 154:223-235), esto se ha tratado de forma controvertida en parte para el cáncer de pecho: Harberg y colaboradores (Prognostic and relevant therapy factors in breast cancer, Novartis Pharma Publishers, Nürnberg, 1997) no encontraron correlación en un análisis multivariante, mientras que Querzoli, P. y colaboradores., J. Clin. Pathol. Noviembre de 1996, 49(11): 926-930; Veronese, S. M. y colaboradores., Anicancer Res. Noviembre de 1995, 15(6B): 2717-2722; Clahsen, P. C. y colaboradores., J. Clin. Oncol.. Febrero de 1998, 16(2): 470-479; Rozan, S. y colaboradores., Int. J. Cancer Febrero de 1998, 79(1):27-33; Jansen R. L. y colaboradores., Br. J. Cancer Agosto de 1998, 78(4):433-437; probaron de un modo concluyente que el retrato de la proteína Ki-67 en secciones de parafina con el anti-cuerpo monoclonal MIB-1 en el análisis estadístico multivariante es un parámetro de pronostico independiente en el cáncer de pecho. Aaltoma y colaboradores., 1997, Eur. Urol. 32: 410-415 y Borre y colaboradores., 1998, J. Urol. 159. 1609-1614, demostraron que el índice del marcador Ki-67 es también un parámetro de pronostico independiente para el carcinoma de próstata, mientras que Coetze y colaboradores., 1997, J. Urol. 157: 214-218, cuestionaron el valor del índice de marcador Ki-67 como un indicador para el pronóstico, y Uzoaru y colaboradores., 1998, J. Surg. Oncol. 67: 33-37, incluso concluyeron que el índice de marcador Ki-67 no permite cualquier prognosis significativa en lo que respecta a la supervivencia de los pacientes.

Como se demostró anteriormente por medio del ejemplo sobre los receptores de la hormona, una normalización de las técnicas de inmunotinción así como también una validación interna del análisis cuantitativo no ha sido posible hasta ahora incluso con la promoción del índice de marcador Ki-67.

Sumario de la Invención

Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar una herramienta para su uso en la validación cualitativa y/o cuantitativa de los índices de marcador, especialmente en la prognosis médica, la diagnosis, tal como en la diagnosis inmunohistoquímica, y especialmente para la validación de un índice marcador Ki-67, y en la determinación de la relevancia terapéutica.

Un objetivo adicional de la invención es proporcionar una herramienta para la validación de índices marcadores, la cual herramienta es relativamente rápida y fácil de usar y puede proporcionar un resultado fiable.

Otro objetivo de la invención es proporcionar una herramienta para la validación de índices marcadores, la cual herramienta tiene un período de duración prolongado desde su producción hasta sus usos.

Estos y otros objetivos se consiguen mediante la invención como se define en las reivindicaciones.

Específicamente, la invención proporciona un pseudo-tejido que comprende una mezcla sustancialmente homogénea de dos o más poblaciones de células incluidas en una matriz, estando fabricada dicha matriz de un material seleccionado del grupo que consiste en plásticos, parafina o derivados de la parafina, agarosa, suero sin heparina, colágeno, derivados de la celulosa, derivados de quitina, derivados de quitosano y mezclas de los mismos, en el cual cada una de dichas poblaciones de células se deriva de una única línea de célula y comprende células que son sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de uno o más marcador(es) específicos seleccionados del grupo que consiste en marcadores de la proliferación, receptores de hormonas, compuestos del citoesqueleto, marcadores hematológicos, productos oncogénicos, receptores nucleares, aberraciones en los cromosomas, y agentes de infecciones, y en el que dichas dos o más poblaciones de células difieren unas de otras en que las células de una población no son sustancialmente idénticas a las células de la otra población con respecto al número de dichos uno o más marcador(es)
específicos, y en el que dichas células o dichas una o más poblaciones de células se fijan con anterioridad a su incorporación a la matriz.

En una realización, el uno o más marcador(es) se selecciona(n) del grupo que consiste en lípidos, lipopolisacáridos, azúcares, proteínas, estructuras de la membrana celular con y sin caracterización CD, nucleótidos citoplásmicos, y ácidos nucleicos.

En una realización, los marcadores son detectables, preferiblemente mediante el uso de técnicas inmunohistológicas, inmunocitológicas, de hibridación, enzimáticas, de inmunofluorescencia y/o inmunoenzimáticas.

En realizaciones específicas, el uno o más marcadores se seleccionan del grupo que consiste en Ki-67, receptor del estrógeno, receptor de la progesterona, receptor del andrógeno, y c-myc.

En una realización, la relación de células procedentes de dos diferentes poblaciones de células está en el intervalo de 1:10^{9}-10^{9}:1, y preferiblemente en el intervalo de 1:20-20:1.

En una realización, la fijación se efectúa preferiblemente mediante el uso de uno o más agentes de fijación seleccionados del grupo que consiste en formalina, aldehído glutárico, tetra-óxido de osmio, ácido acético, etanol, acetona, ácido pícrico, cloroformo, dicromato de potasio, y cloruro mercúrico y/o mediante el uso de la fijación térmica o la fijación por congelación.

La invención proporciona un estuche para el diagnóstico que comprende un pseudo-tejido tal como se definió anteriormente.

En una realización, el estuche comprende un componente o un conjunto de componentes para la detección del marcador, dicho componente o conjunto de componentes incluye preferiblemente uno o más anticuerpos y/o derivados activos de los mismos, sondas de DNA o de RNA, oligo-nucleótidos sintéticos, PNA, LNA, dicho componente puede estar unido preferiblemente a una o más enzimas y/o compuestos fluorescentes, siendo dicho conjunto de componentes preferiblemente una enzima y un reactivo para la detección de una enzima.

En una realización específica, el marcador es la proteína Ki-67, y el componente para la detección del marcador es un anticuerpo dirigido contra la proteína Ki-67, siendo dicho anticuerpo preferiblemente un miembro de la familia MIB, y más preferiblemente MIB-1.

En una realización, el estuche comprende dos o más pseudo-tejidos como se definió anteriormente, teniendo dichos dos o más pseudo-tejidos diferentes índices de marcador para uno o más de los marcadores específicos, definido como el número de células positivas de marcador para dicho marcador específico en porcentaje.

La invención proporciona un método de análisis para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de los índices de marcador de una fracción de células marcadas con dicho marcador para la diagnosis in vitro, comprendiendo dicho método las etapas de:

i) proporcionar un pseudo-tejido como se definió anteriormente, teniendo dicho pseudo-tejido una calidad y/o cantidad de marcadores determinada previamente;

ii) someter la fracción de células y el pseudo-tejido a un componente o un conjunto de componentes para la detección de las reacciones del marcador;

iii) determinar la calidad y/o la cantidad de marcadores de la fracción de célula mediante el uso de las reacciones del marcador detectadas del pseudo-tejido.

En una realización dicho método de análisis se realiza mediante el uso de un estuche de diagnóstico tal como se definió anteriormente.

En una realización, dicho método de análisis comprende además la etapa de la determinación cualitativa o cuantitativamente de uno o más marcadores adicionales, siendo determinados dicho uno o más marcadores adicionales mediante el uso de uno o más pseudo-tejidos que comprenden al menos una población de células que tienen diferentes índices de marcador para dichos uno o más marcadores adicionales.

La invención proporciona un método para la producción de un pseudo-tejido tal como se definió anteriormente que comprende las etapas de:

i) selección de una primera población de células que comprende células las cuales células son sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de uno o más marcador(es) específicos;

ii) selección de una segunda población que comprende células las cuales células son sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de dicho uno o más marcador-(es) específicos, dichas células de dichas segunda población de células difieren de las células de dicha primera población de células con respecto al número de dicho uno o más marcado(es) específicos.

iii) incorporación de dicha primera y segunda población de células dentro de una matriz.

En una realización el número de células en el primer grupo de células con respecto al número de células en el segundo grupo de células se determina previamente, y preferiblemente está en el intervalo de 1:10^{9}-10^{9}:1, y preferiblemente en el intervalo de 1:20-20:1.

En una realización, el método comprende además la etapa de cortar la matriz con las células en láminas, preferiblemente que tengan un espesor de hasta aproximadamente 100 \mum, más preferiblemente entre 50 nm y 100 \mum, e incluso más preferiblemente en láminas finas entre 80 y 120 nm o en láminas gruesas entre 2 y 5 \mum.

La invención proporciona el uso del estuche de diagnóstico tal como se definió anteriormente para la cuantificación y/o calificación de uno o más marcador(es) en una muestra, para la determinación del índice de proliferación, o para la diagnosis in vitro en la diagnosis y tratamiento del cáncer.

La invención proporciona también el uso del pseudo-tejido tal como se definió anteriormente para las validaciones de un índice de marcador de una muestra de ensayo.

La invención proporciona además un sistema de detección para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de una molécula, comprendiendo dicho sistema un pseudo-tejido tal como se definió anteriormente y una sustancia de detección para la detección específica de la molécula a determinar.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona así una herramienta diseñada como un pseudo-tejido. El pseudo-tejido de acuerdo con la invención comprende dos o más poblaciones de células incorporadas en una matriz.

El rasgo que caracteriza a cada una de las poblaciones de células es que ellas incluyen dos o más células las cuales células son sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de uno o más marcador(es) específicos, a saber, el marcador(es) de los índices de marcador que se pueden validar usando el pseudo-tejido específico. La expresión "dos o más células, las cuales son sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de un marcador específico" significa que el número de marcadores de las dos o más células preferiblemente no deberían variar uno de otro en más de aproximadamente 20%, y preferiblemente en no más del 10%. Las dos o más poblaciones de células diferirán una de otra con respecto al uno o más marcadores de tal manera que las células de una población difieran de las células de la otra población del pseudo-tejido con respecto al número de uno o más de dichos marcador(es)
específicos. Se prefiere generalmente que el numero de los marcadores específicos sobre las dos o más células en unas poblaciones de células no debería variar en más de 10% de la diferencia del número medio de marcadores sobre la célula en esta población comparado con el número medio de los marcadores específicos en otra población de células en el pseudo-tejido.

Se prefiere que las células de al menos dos poblaciones de células estén mezcladas unas con otras en la matriz, de tal manera que se produce una estructura con puntos o zonas que tienen más o menos marcadores. Se prefiere particularmente que las células de al menos dos poblaciones de células se mezclen en una mezcla sustancialmente homogénea para de este modo proporcionar una estructura sustancialmente homogénea de marcadores.

El marcador o los marcadores pueden ser en principio de cualquier tipo de marcador que se pueda detectar mediante cualquier medio, por ejemplo mediante el uso de técnicas inmunohistológicas, inmunocitológicas, de hibridación, mediante el uso de inmunofluorescencia y/o inmunoenzimáticas. Dichos marcadores pueden ser sustancias orgánicas así como también inorgánicas, por ejemplo seleccionadas del grupo que consiste en lípidos, liposacáridos, azúcares, proteínas, enzimas endógenas tales como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina, estructuras de membrana celular con y sin caracterización CD, citoplásmicas, nucleótidos, y ácidos nucleicos. Los marcadores incluyen particularmente cualesquiera marcadores de interés diagnóstico y especialmente marcadores de la proliferación tales como la Ki-67; receptores de hormonas tales como los receptores del estrógeno, receptores de la progesterona o los receptores de andrógenos; compuestos del citoesqueleto; marcadores hematológicos; productos oncogénicos tales como el c-myc; constituyentes de la membrana celular; receptores asociados al núcleo; aberraciones cromosómicas tales como las amplificaciones de genes, las deleciones de genes, mutaciones y translocaciones puntuales; y agentes infecciosos.

Como todos los marcadores descritos anteriormente y sus métodos de detección son generalmente conocidos en la técnica no se describirán por lo tanto con detalles adicionales.

Las células en una población de células del pseudo-tejido pueden ser de cualquier tipo de células, y preferiblemente células eucarióticas cultivadas in vivo o in vitro. Las células pueden estar en cualquier fase de crecimiento. Las células de línea de células, y más preferiblemente las mezclas de dos o más células de línea de células, incluidas en una matriz son consideradas como pseudo-tejidos. Dichos pseudo-tejidos deberían permitir un examen histológico, y más preferiblemente uno inmunohistológico.

Se prefiere que las células en al menos una de las poblaciones de células sean células de cultivo que son cultivadas, coleccionadas y/o recolectadas in vitro. Las células pueden ser transferidas o transformadas por ejemplo usando genomas de ADN viral aislado. Las células de una población de células pueden ser preferiblemente sustancialmente iguales unas a otras, y más preferiblemente dichas células sustancialmente iguales son de una única línea de células.

Para obtener una determinación altamente fiable usando el pseudo-tejido de acuerdo con la invención se debe conocer la relación de células o de marcadores en la respectiva población de células.

Dependiendo de la sensibilidad de la detección del marcador, puede variar la relación de células de las dos o más diferentes poblaciones de células en un pseudo-tejido. En general, para la mayor parte de los marcadores la relación preferida de células de dos poblaciones de células diferentes está en el intervalo de 1:10^{9} a 10^{9}:1, y preferiblemente en el intervalo de1:20 a 20:1.

El material para la matriz puede ser cualquier material que no interfiera con los marcadores o con la detección de los marcadores y dentro del cual las células se puedan incorporar en una matriz sin que de ese modo se interfiera con los marcadores o con la detección de los marcadores. Además se prefiere que el material para la matriz sea dimensionalmente estable a 20ºC, y que sea posible preferiblemente ser cortado en secciones finas de por ejemplo 50 nm y 100 \mum. Preferiblemente el material para la matriz se selecciona del grupo que consiste en plásticos, parafina y derivados de parafina, agarosa, suero sin heparina, colágeno, derivados de la celulosa, derivados de quitina, derivados de quitosano, biopolímeros, coágulos de fibrina y mezclas de los mismos.

El pseudo-tejido se puede proporcionar preferiblemente en la forma de secciones finas que tienen un espesor de hasta aproximadamente 100 \mum, y más preferiblemente entre 50 nm y 100 \mum, e incluso más preferiblemente secciones entre 80 y 120 nm o secciones entre 2 y 5 \mum.

Con anterioridad o después de la incorporación de las células en la matriza, las células preferiblemente se pueden fijar. Se puede usar en principio cualquier método común de fijación de las células tal como la fijación efectuada mediante el uso de uno o más agentes de fijación seleccionados del grupo que consiste en formalina, aldehído glutárico, tetra-óxido de osmio, ácido acético, etanol, acetona, ácido pícrico, cloroformo, dicromato de potasio, y cloruro mercúrico y/o su estabilización mediante el uso de calentamiento en microondas o por congelación. Como se conoce generalmente, el tratamiento con el agente de fijación se debe efectuar durante un tiempo suficiente para la estabilización de las células pero que a la vez el tiempo se mantenga preferiblemente suficientemente corto de tal manera que se preserve la estructura de las células y de los marcadores específicos.

La invención se refiere también a un estuche de diagnóstico que comprende un pseudo-tejido para la normalización de los intra- e inter-ensayos.

El estuche de diagnóstico de acuerdo con la invención para la cuantificación y la calificación de una fracción de células que comprenden un marcador, comprende un pseudo-tejido que comprende dos o más poblaciones de células que comprenden células que difieren de una población de células a la otra con respecto al número y/o la eficacia de reactividad de uno o más marcador(es) específicos. Preferiblemente la una o más poblaciones de células se incorporan en una matriz como se describió anteriormente.

El estuche de diagnóstico puede comprender además preferiblemente un componente o un conjunto de componentes para la detección del marcador o de los marcadores. El componente para la detección del marcador o de los marcadores depende naturalmente del marcador o de los marcadores a detectar, pero para la mayor parte de los propósitos de diagnóstico y de pronóstico así como también para la determinación de la relevancia terapéutica los medios de detección incluyen un componente o un conjunto de componentes que incluyen uno o más anticuerpos y/o derivados activos de los mismos, sondas de DNA o de RNA, oligonucleótidos, PNA, LNA, dicho componente puede estar unido preferiblemente a una o más enzimas y/o compuesto fluorescente, y siendo dicho conjunto de componentes preferiblemente una enzima y un reactivo para la detección de una enzima.

En una realización preferida de la invención el estuche es un estuche para la detección y la validación de un índice de proliferación, y el estuche de diagnóstico incluye un pseudo-tejido tal como se definió anteriormente en el cual el marcador específico incluye la proteína Ki-67, y el componente para la detección del marcador es un anticuerpo dirigido contra la proteína Ki-67, siendo dicho anticuerpo preferiblemente un elemento de la familia MIB®, y más preferiblemente MIB®-1.

En una realización preferida adicional el estuche de diagnóstico comprende anticuerpos contra la proteína Ki-67 con una reactividad cruzada entre especies limitada, así como también un pseudo-tejido incluido en parafina y fijado, que comprende mezclas de línea de células con índices de marcador definidos previamente, preferiblemente índice de marcador Ki-67, o secciones microscópicas de pseudo-tejido así como también reactivos de detección.

El estuche de diagnóstico preferido como se definió anteriormente es particularmente adecuado para la validación del índice de marcador Ki-67. Como resulta claro para una persona especializada, sin embargo, el estuche y el pseudo-tejido se puede variar de muchas maneras. Mediante el uso de células de línea de células del receptor de hormonas positivas y negativas para la producción de un pseudo-tejido para su uso en el estuche correspondiente, la invención es también susceptible de uso para la validación de la determinación inmunohistoquímica del estado del receptor. Por analogía, esto es también verdad para la determinación del gen HER-2/neu (c-erb-B2) y la expresión de proteína en el cáncer de pecho. Mediante el uso de CD4 positivas, CD8 negativas y CD4 negativas, las células de líneas de células CD8 positivas para la producción de un pseudo-tejido para su uso en el estuche correspondiente, la invención es también adecuada para la validación de la determinación del cociente T4/T8. Consecuentemente, la presente invención es capaz de ser usada para la validación de la mayor parte de los variados índices de marcador.

El estuche de diagnóstico de acuerdo con la invención puede comprender preferiblemente dos o más pseudo-tejidos tal como se definió anteriormente, en el que los dos o más pseudo-tejidos tienen diferentes índices de marcador para uno o más de los marcadores específicos definidos como el número de células de marcador positivas para dicho marcador específico en porcentaje. Mediante la inclusión de dos o más pseudo-tejidos en un estuche se puede obtener una validación incluso más fiable.

La invención se refiere además a un método analítico para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de los índices de marcador de una fracción de células marcadas mediante dicho marcador para la diagnosis in vitro. El método incluye el uso de un pseudo-tejido de acuerdo con la invención y puede incluir preferiblemente el uso del estuche de diagnóstico de acuerdo con la invención. El método comprende las etapas de:

i): Proporcionar un pseudo-tejido de la invención, en el que el pseudo-tejido tiene una calidad y/o cantidad de marcadores previamente determinada;

ii): someter la fracción de células y el pseudo-tejido a un componente o un conjunto de componentes para la detección de las reacciones del marcador;

iii): determinar la calidad y/o la cantidad de marcadores de la fracción de células mediante el uso de las reacciones del marcador detectadas del pseudo-tejido.

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El método analítico de acuerdo con la invención puede incluir la determinación cualitativa y/o cuantitativa de uno o más marcadores adicionales, en el que el uno o más marcadores adicionales se determinan mediante el uso de uno o más pseudo-tejidos que comprenden al menos una población de células que tienen diferentes índices de marcador para dichos uno o más marcadores adicionales.

Usando el método analítico de la invención, cada serie de detecciones para el retrato de un marcador con la ayuda de un estuche de acuerdo con la invención incluye el retrato del marcador en el pseudo-tejido de adaptación. Así, el patólogo experimentado puede juzgar cualitativamente el retrato del marcador (la reacción se efectuó satisfactoriamente) así como también validar cuantitativamente el retrato del marcador (se obtuvo el índice de marcador definido previamente en esta serie de detección, y es por lo tanto válido, o la detección no es válida bien por quedar por debajo o por exceder el umbral de desviación del índice de marcador definido previamente, como regla general más/-menos una desviación estándar).

De acuerdo con la invención, muestras de tejido, preparaciones citológicas y exudados de células/sangre están incluidas como los materiales a ser examinados mediante el uso del método analítico.

Los índices de marcador son en parte promovidos diferencialmente. Como se mencionó anteriormente, la relación de células CD4 positivas a CD8 positivas se representa gráficamente como el denominado cociente T4/T8 en la diagnosis del SIDA. Sin embargo, generalmente el índice de marcador significa el número de células positivas del marcador de una cierta población en por ciento. La última definición es también válida para el índice de marcador de la Ki-67.

También la invención se refiere al método para la producción de un pseudo-tejido que comprende las etapas de:

i): seleccionar una primera población de células que comprende células las cuales células son sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de uno o más marcador(es) específicos como se definió anteriormente;

ii): seleccionar una segunda población que comprende células las cuales células son sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de dicho uno o más marcador(es) específicos definido anteriormente, las células de la segunda población de células difieren de las células de dicha primer población de células con respecto al número de uno o más de dicho marcador(es) específicos descrito anteriormente;

iii): incorporar la primera y segunda población de células dentro de una matriz como se definió anteriormente.

Los números de células en las poblaciones de células son como se definieron anteriormente. Con anterioridad a o después de su incorporación dentro de la matriz, las células se pueden fijar preferiblemente como se describió anteriormente.

La matriz con las células se puede proporcionar inicialmente en la forma de un resalte, por ejemplo un resalte en forma de tubo, el cual resalte se corta posteriormente en secciones que tienen preferiblemente un espesor de hasta aproximadamente 100 \mum, y más preferiblemente entre 50 nm y 100 \mum, e incluso más preferiblemente en secciones finas de entre 80 y 120 nm o en secciones gruesas de entre 2 y 5 \mum. El espesor deseado de las secciones depende en gran medida del método de detección que se desea usar, y la persona especializada será capaz de encontrar fácilmente el espesor óptimo para un método de detección específico.

Como se reivindica también, el estuche de diagnóstico y el pseudo-tejido de la invención se pueden usar para la medida cuantitativa y/o cualitativa de uno o más marcador-(es) en una muestra, para la determinación del índice de proliferación y en una realización preferida para la diagnosis in vitro en la diagnosis y tratamiento del cáncer.

Descripción de las figuras

Figura 1: variabilidad intra-observador, serie 1.

Figura 2: variabilidad intra-observador, serie 2.

Figura 3: variabilidad entre ensayos.

Ejemplos

La invención se ilustra de un modo más estrecho en lo que sigue por medio de una realización preferida, pero la invención no está limitada en modo alguno por esto.

Algunos anticuerpos frente a la proteína humana Ki-67 muestran una reacción cruzada limitada con las proteínas Ki-67 de otras especies. Así, el anticuerpo monoclonal MIB-1, por ejemplo, es excelentemente adecuado para el retrato de la proteína humana Ki-67 en secciones de parafina. Sin embargo, la detección de equivalentes de murina sobre secciones de parafina no se puede efectuar con éxito con el anticuerpo MIB-1. Esta limitada reactividad cruzada entre especies se usa para la preparación de pseudo-tejidos con índice de marcador Ki-67 definido previamente.

Producción del pseudo-tejido

Una línea de células humanas, preferiblemente IM-9, y una línea de células no humanas, preferentemente de murina, y particularmente preferidas Ag8 se sembraron bajo condiciones estándar y se cosecharon en la fase de crecimiento logarítmico y las células muertas y el detritus de células se separaron por medio de una centrifugación por densidad. Después de un único lavado en un medio de cultivo, se determina el número de células con un Sysmex Platelet Counter PL-100 (Sysmex TOA Medical Elektronics GmBH, Tarpen 15 A, D-22419, Hamburgo). Para esto, una suspensión de células de 10 \mum se mezcla bien en 5 ml de un tampón (Sysmex Cellpack PK-30 L 20 litros, número de orden 834-0011-6) y la cuenta se realiza como una determinación doble. (Fijación del contador: selector: sangre 10, plaquetas 6; sensibilidad: 1; tiempo de alarma: 11). Basado en este contador, se usaron 1 x 10^{7} células para la producción del pseudo-tejido.

Reactivos usados: fibrinógeno: F 4753, Sigma; Carga: 60 mg en un vaso de precipitados de ensayo y adición lentamente de 10 ml de disolución al 9% de NaCl. Dejar reposar durante 10 minutos a 37ºC, después de esto se vuelve a suspender con una pipeta hasta que la disolución es transparente. La disolución preparada de esta manera es estable durante 24 horas.

Trombina: T 9010, Sigma; carga: disolver 1 vial en 500 \mul de agua destilada tres veces, volver a suspender bien. Las partes alícuotas que se almacenan en disolución a -20ºC son estables durante 6 meses. Centrifugar 1 x 10^{7} células en un tubo de rosca a 1200 rpm, y decantar el material sobrenadante. Volver a suspender la fuente de gránulos (aproximadamente 500-100 \mul). Añadir 200 \mul de la disolución de fibrinógeno a las células y volver a suspender bien. A continuación, añadir 100 \mul de la disolución de trombina a esto, mezclar brevemente e incubar sobre hielo durante 30 minutos. Cuando se hace esto, se forma un coágulo de fibrina que incluye las células el cual, de una manera de rutina, se fija posteriormente mediante formalina y se incluye en parafina (4% de formalina, al menos 30 minutos, máximo 60 horas; La operación de la inclusión en parafina se efectúa en una máquina automatizada disponible comercialmente, por ejemplo Hypercenter TM de la compañía Shandon). Las secciones de parafina producidas mediante métodos estándar se sometieron a continuación a tinción de manera inmunocitoquímica como en los ejemplos.

Como se explica en el Ejemplo 1, las secciones de parafina de los pseudo-tejidos de la línea de células de murina Ag8 eran completamente negativas para el MIB-1 como cabía esperar. Las secciones de parafina de los pseudo-tejidos de la línea de células humanas IM9, preparadas como se describió anteriormente, eran casi 100% positivas para el MIB-1. Esto significa que, mediante la simple mezcla de estas líneas de células a diferentes porcentajes, los pseudo-tejidos deben ser capaces de ser preparados con cada uno el porcentaje deseado de células MIB-1 positivas. El Ejemplo 2 muestra que este es el caso. Mediante el uso de preparaciones de pseudo-tejidos en un estuche de detección de MIB-1 para el control de la determinación de la fracción de crecimiento con anticuerpos frente a la proteína humana Ki-67, ha llegado a ser posible por primera vez una validación interna cualitativa así como también cuantitativa de esta determinación.

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Ejemplo 1 Inmunotinción del MIB-1 de los pseudo-tejidos cuyas células consisten en 100% de células de línea de células IM9 ó Ag8

Se sometieron a tinción secciones de 1-3 \mum de grueso con los reactivos siguientes de la compañía Manotec, de Hamburgo, de acuerdo con la fórmula siguiente.

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Reactivos del estuche de detección de MIB-1 Instrucciones de la tinción Desparafinado y rehidratación

Antes de la inmunotinción, las secciones de parafina aplicadas al portaobjetos se deben desparafinar con el fin de separar el medio de inclusión. Posteriormente, las secciones se deben volver a hidratar. Un desparafinado insuficiente y una insuficiente rehidratación se tienen que evitar por todos los medios, debido a que esto puede dar lugar a una tinción no específica incrementada y a una tinción específica disminuida.

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Etapa 1: Se incubaron secciones en un baño de xileno durante 5 (+/-1) minutos. Se repite una vez un cambio de baño y de incubación.

Etapa 2: Permitir que se vierta el exceso de líquido y a continuación incubar las secciones en un baño de alcohol del 100% durante 5 (+/-1) minutos. Se repite una vez un cambio de baño y de incubación.

Etapa 3: Permitir que se vierta el exceso de líquido y a continuación incubar las secciones en un baño de alcohol del 70% durante 5 (+/-1) minutos. Se repite una vez un cambio de baño y de incubación.

Etapa 4: Permitir que se vierta el exceso de líquido y a continuación incubar las secciones en un baño de alcohol del 40% durante 5 (+/-1) minutos. Se repite una vez un cambio de baño y de incubación.

Etapa 5: Permitir que se vierta el exceso de líquido y a continuación incubar las secciones en un baño de agua destilada durante 5 (+/-1) minutos. Se repite una vez un cambio de baño y de incubación.

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Los baños de xileno, alcohol y agua se deben cambiar cada uno después de 40 secciones.

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Protocolo de inmunotinción

Etapa 1

Agente de bloqueo de peroxidasa

Permitir que se vierta bien el exceso de agua destilada. Secar totalmente y cuidadosamente alrededor del porta-objetos con un paño que no de deshilache con el fin de asegurar que los reactivos cubren la sección. A continuación colocar las secciones en una cámara húmeda y llevar 100 \mul de agente de bloqueo de peroxidasa (vial 1) sobre la sección. (Si fuera necesario, se debe aplicar más de 100 \mul).

Incubar durante 10 (+/- 1) minutos a la temperatura ambiente.

A continuación, enjuagar cuidadosamente las secciones con agua destilada o disolución tampón de lavado con la ayuda de una botella de lavado, a pesar de lo cual se debe tener cuidado para que el chorro de líquido no toque la sección.

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Etapa 2

Recuperación del antígeno

Colocar la cubeta del portaobjetos en un baño de agua y llenar la misma con la disolución para la recuperación del antígeno (vial 7) diluida 1:50 en agua destilada. Calentar el baño de agua, y del mismo modo la disolución de recuperación del antígeno, a 95-99ºC. Posteriormente, colocar las secciones bloqueadas con peroxidasa en estas cubetas y llevar la temperatura a 95-99ºC de nuevo y a continuación incubar durante 60 (+/-1) minutos a 95-99ºC.

Sacar la cubeta del portaobjetos fuera del baño de agua caliente y transferir las secciones dentro de una disolución tampón de lavado de nuevo aporte a la temperatura ambiente, incubar durante 3 (+/-1) minutos, a continuación repetir dos veces el ciclo de cambio de la disolución tampón de lavado y de lavado con la misma.

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Etapa 3

Anticuerpo primario MIB-1 y/o reactivo de control negativo

Permitir que se vierta el exceso de disolución tampón de lavado y secar alrededor de la sección como se describió anteriormente.

Cubrir las secciones con 100 \mul de anticuerpo primario del vial 2 ó cubrir las secciones con 100 \mul de reactivo de control negativo del vial 4.

Incubar durante 30 (+/- 1) minutos a la temperatura ambiente.

A continuación, enjuagar cuidadosamente las secciones con agua destilada o con disolución tampón de lavado con la ayuda de una botella de lavado, a pesar de lo cual se debe tener cuidado para que el chorro de líquido no toque la sección, y transferir las secciones dentro de una disolución tampón de lavado de nuevo aporte, incubar durante 3 (+/-1) minutos, a continuación repetir dos veces el ciclo de cambio de la disolución tampón de lavado y de lavado con la misma como en la etapa 2.

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Etapa 4

Reactivo de detección

Cubrir las secciones con 100 \mul de reactivo de detección del vial 3.

Incubar durante 30 (+/-1) minutos a la temperatura ambiente.

A continuación, enjuagar cuidadosamente las secciones con agua destilada o con disolución tampón de lavado con la ayuda de una botella de lavado, a pesar de lo cual se debe tener cuidado para que el chorro de líquido no toque la sección y transferir las secciones dentro de una disolución tampón de lavado de nuevo aporte, incubar durante 3 (+/-1) minutos, a continuación repetir dos veces el ciclo de cambio de la disolución tampón de lavado y de lavado con la misma como en la etapa 2.

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Etapa 5

Reacción de desarrollo

Añadir 1 ml de substrato DAB del vial 5 dentro del vaso de reactivo y añadir 10 \mul de cromógeno DAB para esto. Añadir 100 \mul de esta disolución a las secciones.

Incubar durante 10 (+/-1) minutos a la temperatura ambiente.

Posteriormente, lavar como se describió anteriormente.

Efectuar una tinción de contraste con hematoxilina de Mayer y a continuación cubrir con gelatina de glicerina de Kaiser (medios de inclusión tales como Faramount® o Depex®).

La evaluación de la tinción se efectúa al microscopio mediante el conteo de 200 células cada uno por 3 personas diferentes y determinar el porcentaje de células positivas en el material tintado.

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Pseudo-tejido Ad AG8

Todas las tinciones con el reactivo de control negativo así como también con el anticuerpo MIB-1 eran negativas, es decir estaban presentes un 0% de células positivas. La desviación intra-ensayo así como también la desviación inter-ensayo así como también las desviaciones intra-observadores y las inter-observadores eran igual a 0.

Pseudo-tejido Ad IM9

Todas las tinciones con el reactivo de control negativo eran negativas como cabía esperar. 0% de células positivas.

La desviación intra-ensayo así como también la desviación inter-ensayo así como también las desviaciones intra-observadores y las inter-observadores para el reactivo de control negativo eran igual a 0.

Las secciones tintadas con MB-1 del pseudo-tejido IM9 casi siempre mostraron un 100% de células positivas (valor medio 99,833%). En la serie de los ensayos representados en las tablas 1a y 1b, las desviaciones intra e inter-observadores así como también las desviaciones entre-ensayos eran muy pequeñas.

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Ejemplo 2 Inmunotinción de pseudo-tejidos con cantidades definidas de células de AG8 e IM9

Como se indicó anteriormente se produjeron bloques de parafina de pseudo-tejidos con cantidades definidas de células AG8 y/o IM9, respectivamente, (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 y 100%).

A continuación secciones de parafina se inmunotintaron como se indicó en el Ejemplo 1.

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Todas las tinciones con el reactivo de control negativo eran negativas para todos los bloques como cabía esperar. 0% de células positivas. La desviación intra-ensayo así como también la inter-ensayo así como también las desviaciones intra- e inter-observador para el reactivo de control negativo eran igual a 0.

Se efectuaron dos series.

Los resultados para el MIB-1. Las tinciones intra-observador para las dos series se resumen en las Tablas 1a y 1b y se muestran en la Figura 1 y 2, respectivamente. Como se puede observar todos los valores elevados estaban muy próximos al de referencia y de este modo dentro del intervalo de confianza.

En la Tabla 2 se calcula el valor medio del ensayo de intra-observador y se muestra el resultado en la Figura 3 como la variabilidad entre-ensayos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 3 Inmunotinción de pseudo-tejidos

Se produjeron también pseudo-tejidos cada uno con una cantidad de 50% de las líneas de células Raji (humanas) y Ag8 (murina) o Jurkat y Ag8. Los resultados de la tinción con MIB-1 de secciones de estos pseudo-tejidos estaban en el mismo intervalo que se indicó en el Ejemplo 2 para el pseudo-tejido del 50% de IM9 y Ag8. Así, el pseudo-tejido se puede preparar también de manera fiable con otras combinaciones de células de líneas de células.

Claims

1. Un pseudo-tejido que comprende una mezcla sustancialmente homogénea de dos o más poblaciones de células de células fijas incluidas en una matriz, estando dicha matriz construida a partir de un material seleccionado del grupo que consiste en plásticos, parafina o derivados de parafina, agarosa, suero sin heparina, colágeno, derivados de celulosa, derivados de quitina, derivados de quitosano y mezclas de los mismos, en el que cada una de dichas poblaciones de células se obtiene a partir de una única línea de células y comprende células que son sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de uno o más marcador(es) seleccionados del grupo que consiste en marcadores de la proliferación, receptores de hormonas, compuestos del citoesqueleto, marcadores hematológicos, productos oncógenos, receptores nucleares, aberraciones cromosómicas y agentes infecciosos, y en el que dichas dos o más poblaciones de células difieren una de otra en que las células de una población no son sustancialmente idénticas a las células de otra población con respecto al número de dicho uno o más marcador(es) específicos, en el que dichas células de dicha una o más poblaciones de células están fijas con anterioridad a su incorporación en la matriz.

2. Un pseudo-tejido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el uno o más marcador(es) se selecciona(n) del grupo que consiste en lípidos, liposacáridos, azúcares, proteínas, estructuras de la membrana celular con y sin caracterización CD, nucleótidos citoplásmicos, y ácidos nucleicos.

3. Un pseudo-tejido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que los marcadores son detectables, preferiblemente mediante el uso de técnicas inmunohistológicas, inmunocitológicas, de hibridación, enzimáticas, inmunofluorescencia, y/o inmunoenzimáticas.

4. Un pseudo-tejido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el uno o más marcadores se selecciona del grupo que consiste en Ki-67, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de andrógeno, y c-myc.

5. Un pseudo-tejido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la relación de células de dos poblaciones de células diferentes está en el intervalo de 1:10^{9}-10^{9}:1, y preferiblemente en el intervalo de
1:20-20:1.

6. Un pseudo-tejido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, efectuándose dicha fijación preferiblemente mediante el uso de uno o más agentes de fijación seleccionados del grupo que consiste en formalina, aldehído glutárico, tetra-óxido de osmio, ácido acético, etanol, acetona, ácido pícrico, cloroformo, dicromato de potasio y cloruro mercúrico y/o usando la fijación térmica o la fijación por congelación.

7. Un estuche de diagnóstico que comprende un pseudo-tejido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Un estuche de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el estuche comprende además un componente o un conjunto de componentes para la detección del marcador, dicho componente o conjunto de componentes incluye preferiblemente uno o más anticuerpos y/o derivados activos de los mismos, sondas de DNA o RNA, oligonucleótidos sintéticos, PNA, LNA, dicho componente puede estar unido preferiblemente a una o más enzimas y/o compuesto fluorescente, siendo preferiblemente dicho conjunto de componentes una enzima y un reactivo para la detección de una enzima.

9. Un estuche de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el marcador es la proteína Ki 67 y el componente para la detección del marcador es un anti-cuerpo dirigido contra la proteína Ki 67, y siendo dicho anticuerpo preferiblemente un elemento de la familia MIB®, y más preferiblemente MIB®-1.

10. Un estuche de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que el estuche comprende dos o más pseudo-tejidos según se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, teniendo dichos dos o más pseudo-tejidos índices de marcador diferentes para uno o más de los marcadores específicos, definidos como el número de células positivas de marcador para dicho marcador específico en porcentaje.

11. Un método de análisis parra la determinación cualitativa y/o cuantitativa de índices de marcador de una fracción de células marcadas mediante dicho marcador para la diagnosis in vitro, comprendiendo dicho método las etapas de:

i): proporcionar un pseudo-tejido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, teniendo dicho pseudo-tejido una calidad y/o cantidad previamente determinada de marcadores;

iii): determinar la calidad y/o cantidad de marcadores de la fracción de células mediante el uso de las reacciones del marcador detectadas del pseudo-tejido.

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12. Un método de análisis de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho método se realiza mediante el uso de un estuche de diagnóstico según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7-10.

13. Un método de análisis de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, comprendiendo dicho método además la etapa de la determinación cuantitativamente y/o cualitativamente de uno o más marcadores adicionales, determinándose dichos uno o más marcadores adicionales mediante el uso de uno o más pseudo-tejidos que comprenden al menos una población de células que tienen diferentes índices de marcador para dichos uno o más marcadores adicionales.

14. Un método para la producción de un pseudo-tejido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende las etapas siguientes de:

i): selección de una primera población de células que comprende células que son células sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de uno o más marcador(es) específicos;

ii): selección de una segunda población que comprende células que son células sustancialmente idénticas unas a otras con respecto al número de dicho uno o más marcador(es) específicos, dichas células de dicha segunda población de células difieren de las células de dicha primera población de células con respecto al número de uno o más marcador(es) específicos,

iii): incorporar la primera y la segunda población de células dentro de una matriz.

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15. Un método para la producción de un pseudo-tejido de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el número de células en el primer grupo de células con respecto al número de células en el segundo grupo de células está determinado previamente, y está preferiblemente en el intervalo de 1:10^{9}-10^{9}:1, y preferiblemente en el intervalo de 1:20-20:1.

16. Un método para la producción de un pseudo-tejido de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15, que comprende además la etapa de cortar la matriz con las células en láminas, que tienen preferiblemente un espesor de hasta aproximadamente 100 \mum, más preferiblemente entre 50 nm y 100 \mum, e incluso más preferiblemente laminas finas entre 80 y 120 nm o láminas gruesas entre 2 y 5 \mum.

17. Uso del estuche de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-10 para la cuantificación y/o cualificación de uno o más marcador(es) en una muestra.

18. Uso del estuche de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-10 para la determinación del índice de proliferación.

19. Uso del estuche de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-10 para la diagnosis in vitro en la diagnosis y tratamiento del cáncer.

20. Uso del pseudo-tejido según se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para las validaciones de un índice de marcador de una muestra de ensayo.

21. Sistema de detección para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de una molécula, comprendiendo dicho sistema un pseudo-tejido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y una sustancia de detección para la detección específica de la molécula a determinar.