ES2332982T3 - Vectores de expresion viral para plantas. - Google Patents
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Abstract
Secuencia de ácido nucleico, que comprende: (a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de movimiento viral alterado que comprende mutaciones puntuales en residuos de aminoácidos codificados por los dos codones que incluyen, respectivamente, las posiciones del nucleótido 5213 y 5203 de SEQ ID Nº 1; y (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un complejo replicasa alterado 126/183 que incluye mutaciones puntuales en residuos de aminoácidos codificados por los dos codones que incluyen, respectivamente, las posiciones del nucleótido 1138 y 2382 de SEQ ID Nº 1; en la que las alteraciones mejoran la capacidad de retener un transgen contenido en un virus que expresa el movimiento de la proteína alterada.
Description
Vectores de expresión viral para plantas.
La presente invención se refiere al campo de la
virología vegetal. Concretamente, la invención se refiere a la
síntesis de secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína
de movimiento viral alterado, y un complejo replicante alterado,
según se describe en las reivindicaciones, y a la construcción de
vectores virales que expresen dicha proteína, así como a la
generación de plantas de acogida infectadas por los vectores
virales. Los vectores virales permiten una rápida invasión local y
sistémica, y permiten la expresión estable de un interesante
transgen.
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En los últimos quince años se han conseguido
notables progresos en la expresión de genes foráneos en plantas.
Actualmente, las proteínas foráneas se producen de forma rutinaria
en muchas especies de plantas para la modificación de la planta o
para la producción de proteínas para su utilización con
posterioridad a la extracción. Se han obtenido vectores para la
manipulación genética de plantas a partir de diversos virus de
plantas generados de forma natural. Para la producción de proteínas
específicas, la expresión transitoria de genes foráneos en plantas,
utilizando vectores basados en virus, cuenta con diversas ventajas.
Los productos de virus vegetales se encuentran entre las proteínas
producidas con mayor frecuencia en plantas. Con frecuencia, un
producto de gen viral es la principal proteína producida en células
vegetales durante la replicación del virus. Muchos virus son
capaces de desplazarse de manera sistémica desde el punto inicial de
una infección hacia la práctica totalidad de las células de la
planta. Debido a estas razones, se han desarrollado virus vegetales
en vectores eficientes de expresión transitoria para genes foráneos
en plantas. Los virus de plantas multicelulares son relativamente
pequeños, lo que probablemente se debe al límite de tamaño de las
vías que permiten que los virus viajen hasta las células adyacentes
en la infección sistémica de plantas completas. Uno de dichos virus
vegetales en los que se basan los vectores de expresión vegetal es
el TMV (virus del mosaico del tabaco). El TMV es el miembro tipo
del grupo tobamovirus. El TMV tiene viriones tubulares rectos de
aproximadamente 300 x 18 nm, con un canal hueco de 4 nm de diámetro
consistente en aproximadamente 2000 unidades de una sola proteína
de la cápside dispuesta helicoidalmente en torno a una sola molécula
de ARN. Las partículas del virión consisten en un 95% en peso de
proteína y en un 5% de ARN. El genoma del TMV está compuesto por un
ARN de una sola hélice formado por 6395 nucleótidos que contienen
cinco grandes ORFs. La expresión de cada gen se regula de forma
independiente. El virión ARN sirve de mensajero ARN (mRNA) para los
genes 5', codificando la subunidad de replicasa 126 kDa y la
subunidad de replicasa solapada 183 kDa que se genera mediante la
lectura a través de un codón finalizador de ámbar aproximadamente
un 5% del tiempo. La expresión de lo genes internos está controlada
por los diferentes promotores en el sentido ARN menos que dirigen la
síntesis de 3'- mRNAs subgenómicos coterminales producidos durante
la replicación. Una descripción detallada del la expresión del gen
del tobamovirus y del ciclo vital puede encontrarse, entre otros
lugares, en Dawson and Lehto, Advances in Virus Research,
38: 307-342 (1991). El documento WO 95/21248
describe un vector viral recombinante que expresa una proteína de
movimiento alterado truncado, que se deriva en una mayor estabilidad
del transgen.
De este modo, resulta interesante desde un punto
de vista científico y comercial proporcionar vectores nuevos y
mejorados para la manipulación genética de las plantas.
\vskip1.000000\baselineskip
Un aspecto principal de la presente invención
consiste en el diseño de un vector viral recombinante que exprese
una proteína de movimiento alterado y proteínas víricas alteradas
126/183, como se describe en las reivindicaciones, que afecten a la
expresión estable de un transgen en una planta de acogida.
De este modo, la presente invención proporciona
una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica una proteína
de movimiento viral alterado con la secuencia de aminoácido que se
muestra en SEQ ID NºS 5 y 6, y proteínas víricas 126/183 alteradas.
En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico aislada es
esencialmente idéntica a la secuencia mostrada en SEQ ID NºS 3 y 4,
y contiene un residuo de Timina (T) o Uracilo (U) en la posición
5213 y un residuo de Guanina (G) en 5303, como se muestra en la
figura 1A. En otro aspecto, la secuencia aislada de ácido nucleico
es idéntica a la secuencia mostrada en SEQ ID NºS 3 y 4. La
alteración de la proteína de movimiento 30K y de las proteínas
víricas 126/183 tiene como resultado una mayor capacidad para
facilitar la estabilización de un transgen contenido en un vector
viral.
En una realización independiente, la presente
invención proporciona un vector viral que comprende la secuencia de
ácido nucleico definida en las reivindicaciones que codifica una
proteína de movimiento viral alterado que contiene la secuencia de
aminoácido mostrada en SEQ ID NºS 5 y 6 y proteínas víricas
alteradas 126/183. En un aspecto determinado, el vector viral
presenta una mayor capacidad, en comparación con un vector viral de
control, para estabilizar un transgen contenido en el vector.
Preferiblemente, el vector es un vector viral del mosaico del
tabaco. Un vector especialmente preferido se designa mediante SG1057
(depositado en la Recopilación de Cultivos Tipo Americanos, con el
número de acceso 20398, depositada el 28 de abril de 1999).
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En un aspecto independiente incluido en esta
realización, el vector viral comprende un transgen interesante.
Preferiblemente, el transgen es un gen no viral que codifica una
proteína seleccionada del grupo consistente en una proteína de
membrana, una proteína citosólica, una proteína secretada, una
proteína nuclear y una proteína chaperone.
La presente invención también proporciona una
célula vegetal transformada con un vector viral.
La figura 1 describe una comparación de las
secuencias de nucleótido que codifican una proteína de movimiento
alterado contenida en el vector BSG 1057 (SEQ ID Nº 4) y la proteína
de movimiento negativo contenida en el vector BSG 1037 (SEQ ID Nº
3). Las identidades de la secuencia se indican mediante *, y las
discrepancias se indican mediante.
La figura 2 muestra una comparación de las
secuencias de aminoácido que codifican una proteína de movimiento
alterado contenida en el vector BSG 1057 (SEQ ID Nº 6) y la proteína
de movimiento negativo contenida en el vector BSG 1037 (SEQ ID Nº
5). Las identidades de la secuencia se indican mediante *, y las
discrepancias se indican mediante.
La figura 3 es una representación esquemática de
los puntos de restricción del vector BSG 1037.
La figura 4 es una representación esquemática de
los puntos de restricción del vector BSG 1057.
La figura 5 es la secuencia completa de BSG 1037
(SEQ ID Nº 1).
La figura 6 es la secuencia completa de BSG 1057
(SEQ ID Nº 2).
La figura 7 es un mapa esquemático de los
lugares de las mutaciones en BSG 1057.
La figura 8 muestra plantas N.
benthamiana a los 20 días de la inoculación. Hay cuatro columnas
de cinco plantas. La primera columna de la izquierda muestra las
plantas inoculadas con el primer pasaje de BSG 1037. La Columna 2
es el séptimo pasaje de BSG 1037, la Columna 2 es el primer pasaje
de BSG 1057, la Columna 4 es el séptimo pasaje de BSG 1057.
En esta descripción se hace referencia a
diversas publicaciones, patentes y especificaciones de patentes
publicadas mediante una cita identificadora. Las revelaciones de
dichas publicaciones, patentes y descripciones de patentes
publicadas quedan incorporadas por referencia a la presente
descripción, a fin de describir más específicamente el estado de la
técnica a la que pertenece la invención. Por ejemplo, la enseñanza
general de construcción de vectores virales vegetales y su
utilización para la infección sistémica de plantas y proteínas
heterólogas expresas procedentes de las mismas, y se describe en
las patentes estadounidenses números 5.316.931; 5.977.438;
5.889.191; 5.889.190; 5.866.785 y 5.816.653, cuyas enseñanzas quedan
incorporadas al presente documento por referencia.
La práctica de la presente invención hará uso, a
menos que se indique en otro sentido, de técnicas convencionales de
inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología
biología celular, genómica y ADN recombinante, que se encuentran
dentro del alcance de la técnica actual. Véase, por ejemplo,
Matthews, PLANT VIROLOGY, 3rd edition (1991); Sambrook, Fritsch and
Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition
(1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel,
et al. eds., (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY
(Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J.
MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and
Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL
CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).
Según se utiliza en la especificación y en las
reivindicaciones, la forma singular "un", "una" y
"el" incluyen las referencias al plural, a menos que el
contexto lo indique claramente en otro sentido. Por ejemplo, el
término "una célula" incluye una pluralidad de células,
incluyendo mezclas de las mismas.
Una "célula vegetal" se refiere a la unidad
vegetal estructural y fisiológica, consistente en un protoplasto y
en la pared celular.
Un "protoplasto" es una célula aislada sin
paredes celulares, que puede regenerarse en el cultivo celular, en
el tejido o en la planta completa.
Un "sistema de acogida" incluye una célula,
tejido u organismo capaz de replicar un vector o ácido nucleico
viral y que es capaz de ser infectado por un virus que contenga el
vector viral o ácido nucleico viral. Este término incluye células
procarióticas y eucarióticas, órganos, tejidos, organismos o
extractos in vitro de los mismos, en su caso. Una célula de
acogida preferida es una célula vegetal.
El término "infección" se refiere al
proceso de transferencia o la capacidad de un virus para transferir
su ácido nucleico a un sistema de acogida, en el que el ácido
nucleico viral se replica, se sintetizan las proteínas víricas o se
acoplan nuevas partículas víricas.
La "proteína de movimiento" del virus del
mosaico del tabaco es una proteína sin cápside necesaria para el
movimiento de célula a célula de las réplicas del ARN o virus de las
plantas.
Los términos "secuencia de ácido nucleico",
"polinucleótido", "nucleótidos" y "oligonucleótidos"
se utilizan indistintamente. Hacen referencia a una forma
polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, tanto
desoxirribonucleótidos como ribonucleótidos, o análogos. Los
polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y
pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. A
continuación se facilitan ejemplos no limitativos de
polinucleótidos. Regiones de codificación o no codificación de un
gen o fragmento de gen, loci (locus) definidos a partir del
análisis de ligamiento, exones, intrones, ARN mensajero (mRNA), ARN
de transferencia, ARN ribosomal, ribozimas, cADN, polinucleótidos
recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN
aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia,
sondas de ácido nucleico e imprimadores. Un polinucleótido puede
incluir nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y
análogos nucleótidos. En caso de existir, pueden realizarse
modificaciones de la estructura del nucleótido antes o después del
ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar
interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede
también modificarse tras la polimerización, por ejemplo, a través
de la conjugación con un componente de etiquetado.
Un "gen" hace referencia a un
polinucleótido que contiene al menos un marco de lectura abierto
capaz de codificar una proteína en particular, después de haberse
transcrito y traducido.
Según se utiliza en este documento,
"expresión" se refiere al proceso mediante el cual un
polinucleótido se transcribe en mARN y/o el proceso mediante el
cual el mARN transcrito (también denominado "transcripción")
se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Las
transcripciones y los polipéptidos codificados se denominan
colectivamente producto de gen. Si el polinucleótido se obtiene a
partir del ADN genómico, la expresión puede incluir la división del
mARN en una célula eucariótica.
En el contexto de los polinucleótidos, una
"secuencia lineal" o "secuencia" es un orden de
nucleótidos en un polinucleótido en una dirección 5' a 3' en la
cual los residuos adyacentes en la secuencia se encuentran
contiguos en la estructura primaria del polinucleótido.
Los términos "citosólico", "nuclear" y
"secretado", aplicados a las proteínas celulares especifican el
emplazamiento extracelular y/o subcelular en la que se encuentra
localizada en su mayor parte la proteína celular. Ciertas proteínas
son proteínas chaperones, capaces de desplazarse entre el citosol y
el núcleo de una célula.
Un "control" es un sujeto o muestra
alternativos utilizados en un experimento con fines de comparación.
Por ejemplo, cuando la finalidad del experimento consiste en
comprobar si un vector viral que transporta una proteína de
movimiento alterado posee una mayor capacidad para la invasión
sistémica de una planta de acogida, suele ser preferible utilizar
un vector de control viral (por ejemplo, BSG 1037, que se muestra en
las figuras 1-2) que expresa la proteína de
movimiento natural (wildtype) alterada (por ejemplo, la secuencia
1037 mostrada en la figura 2).
Una "línea celular" o "cultivo
celular" designa células bacterianas, vegetales, de insectos o
eucarióticas superiores cultivadas o mantenidas in vitro.
Los descendientes de una célula pueden no ser completamente
idénticos (bien morfológicamente, genotípicamente o
fenotípicamente) a la célula madre.
Un "vector" se refiere a un virus o
plásmido recombinante que comprende un polinucleótido para su
incorporación a una célula de acogida, bien in vitro o in
vivo. El polinucleótido a incorporar puede comprender una
secuencia de codificación interesante para la terapia genética, una
molécula de ácido nucleico, preferiblemente
auto-replicante, que transfiere una molécula de
ácido nucleico insertada en y/o entre células de acogida. El término
incluye vectores que funcionan básicamente para la inserción de ADN
o ARN en una célula, la replicación de vectores que funcionan
básicamente para la replicación de ADN o ARN, y vectores de
expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del
ADN o ARN. También se incluyen los vectores que realizan más de una
de las funciones que anteceden.
Una "réplica" se refiere a un
polinucleótido que incluye un origen de replicación (por lo general,
denominado una secuencia ori) que permite la replicación del
polinucleótido en una célula de acogida adecuada. Entre los
ejemplos de réplicas se incluyen los plásmidos, así como los
cromosomas como los cromosomas nucleares o mitocondriales).
Una "unidad de transcripción" es un
segmento de ADN capaz de dirigir la transcripción de un gen o de un
fragmento del mismo. Normalmente, una unidad de transcripción
comprende un promotor enlazado operativamente a un gen o fragmento
de ADN que debe transcribirse, y opcionalmente, secuencias
regulatorias situadas bien antes o después del punto de inicio o
del punto de finalización del gen o fragmento transcrito.
La presente invención incluye un vector viral
recombinante, de acuerdo con lo definido en las reivindicaciones,
que expresa una proteína de movimiento alterado y proteínas víricas
alteradas 126/183 para llevar a cabo la expresión estable de un
transgen en un organismo de acogida vegetal. La proteína alterada,
que debe distinguirse de la proteína de movimiento previamente
descrita, contiene dos aminoácidos sustitutos (sustituyendo el
residuo de treonina de la posición 104 por isoleucina, y
sustituyendo el residuo de lisina de la posición 1334 por arginina,
véase la figura 2). El vector viral alterado presenta una mayor
capacidad para facilitar la estabilización de un transgen contenido
en un virus que expresa la proteína de movimiento alterado.
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En una realización, la presente invención
proporciona una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica
una proteína vírica de movimiento alterado que dispone de la
secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NºS 5 y 6, y proteínas
víricas 126/183 alteradas. En un aspecto de esta realización, la
secuencia de ácido nucleico aislada es esencialmente idéntica a la
secuencia mostrada en SEQ ID Nº 3, y contiene un residuo de Timina
(T) o Uracilo (U) en la posición 5213 y un residuo de Guanina (G) en
5303, como se muestra en la figura 1A.
La modificación de los polipéptidos mediante la
alteración de sus correspondientes secuencias de ácido nucleico es
una práctica rutinaria en la técnica actual. Los residuos de
aminoácido que pueden sustituirse entre sí de forma conservadora
incluyen, sin limitación, glicina/alanina;
valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido
aspártico/ácido glutámico; serina/treonina; lisina/arginina; y
fenilalanina/triosina.
La realización de un vector viral recombinante
de esta invención comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica la proteína vírica de movimiento descrita
anteriormente.
En una realización, se introduce un ácido
nucleico en una planta de acogida. Preferiblemente, el ácido
nucleico puede introducirse mediante un ácido nucleico viral,
utilizando técnicas bien conocidas, y preferiblemente las técnicas
descritas en las patentes estadounidenses números 5.316.931;
5.977.438; 5.889.191; 5.889.190; 5.866.785 y 5.816.653, quedando
dichas descripciones incorporadas al presente documento por
referencia. Dichos ácidos nucleicos virales recombinantes son
estables para el mantenimiento y la transcripción de dichas
secuencias no nativas de la planta de acogida.
BSG1057 (SEQ ID Nº: 2) es una versión mutante de
BSG1037 (SEQ ID Nº: 1). Las secuencias completas de BSG1057 y
BSG1037 se muestran en las figuras 5 y 6. BSG1037 presenta unas
mejores propiedades de retención de la inserción.
La diferencia entre ambos vectores virales se
demuestra mejor mediante el reporter genético PVF, o proteína verde
fluorescente. Tanto BSG1037 como BSG1057 expresan una PVF que puede
verse a la luz UV de onda larga por su fluorescencia verde. La
presencia de la actividad de la PVF identifica aquellas células en
las que el virus recombinante está expresando genes.
Las plantas de Nicotiana benthamiana
inoculadas con BSG1037 y BSG1057 se observaron a la luz ultravioleta
de onda larga aproximadamente de 4 a 5 días con posterioridad a la
inoculación. Los puntos de PVF de las hojas de las plantas
inoculadas con el virus BSG1057 eran notablemente mayores que los
puntos de PVF de las hojas de las plantas inoculadas con el virus
BSG1037, lo que indica que el virus 1057 se desplaza de una célula
a otra con mayor rapidez que el BSG1037.
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Los cambios específicos del nucleótido entre
1037 y 1057 se indican en la tabla siguiente. En aquellos casos en
los que el cambio del nucleótido tuvo como resultado un cambio del
aminoácido, se percibe dicho cambio (utilizando el código de una
sola letra).
126/183 se refiere a las proteínas víricas
126/183.
MP se refiere a la proteína de movimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
El transgen transcrito por el vector de la
presente invención puede ser cualquier gen expresado en una entidad
biológica. La selección del transgen está determinada en gran medida
por la finalidad pretendida del vector. Preferiblemente, el
transgen es un gen no viral seleccionado a partir del grupo
consistente en una proteína de membrana, una proteína citosólica,
una proteína secretada, una proteína nuclear y una proteína
chaperone.
Los vectores incorporados a la presente
invención pueden obtenerse utilizando métodos de clonación
recombinante y/o mediante síntesis química. Se conocen
perfectamente diversas técnicas de clonación recombinante, como
PCR, restricción, digestión de endonucleasa y ligado, por lo que no
es necesario describirlas en detalle en el presente documento.
Cualquier persona versada en la materia también podrá utilizar los
datos de la secuencia facilitada en este documento, o aquellas
incluidas en bases de datos públicas o privadas, para obtener un
vector deseado mediante cualquier medio de síntesis disponible en la
técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona células vegetales de
acogida con los vectores virales descritos anteriormente. Los
vectores virales que contienen un transgen de interés pueden
introducirse en una célula eucariótica adecuada mediante cualquier
medio perteneciente a una diversidad de medios, incluyendo
electroporación, transfección, utilizando cloruro cálcico, cloruro
de rubidio, fosfato cálcico, DEAE-dextrano u otras
sustancias; bombardeo con microproyectiles, lipofección e infección
(cuando el vector se encuentra acoplado a un agente infeccioso). La
opción de introducción de los vectores dependerá frecuentemente de
las características de la célula de acogida.
En el caso de las células vegetales, se dispone
de diversas técnicas obtenidas a partir de estos métodos generales.
Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5.316.931;
5.977.438; 5.889.191; 5.889.190; 5.866.785 y 5.816.653. Las células
de acogida pueden ser plantas completas, células aisladas o
protoplastos. Entre los procedimientos ilustrativos para la
introducción de vectores en células vegetales destacan la
transformación de la planta a través del Agrobacterium, la
transformación del protoplasto, la transferencia del gen en polen,
la inyección en órganos reproductores y su inyección en embriones no
maduros, abrasión de la hoja, abrasión en solución, rociado con
agua a alta velocidad, y otras lesiones del organismo de acogida,
así como la inmersión de semillas de acogida en agua que contenga
el ARN viral recombinante o un virus vegetal recombinante. Como
resultará evidente para cualquier persona versada en la materia,
cada uno de estos métodos presenta distintas ventajas y
desventajas. De este modo, un método concreto de introducción de
genes en una especie vegetal específica puede no ser necesariamente
el más efectivo con otras especies vegetales.
La transferencia regulada por el
Agrobacterium tumefaciens es un sistema muy extendido para la
introducción de genes en células vegetales, ya que el ADN puede
introducirse en tejidos vegetales completos, evitando la necesidad
de regeneración de una planta intacta a partir de un protoplasto. La
utilización de vectores de expresión regulados mediante el
Agrobacterium tumefaciens para la introducción del ADN en las
células de la planta es bien conocida en la técnica. Esta técnica
utiliza una característica común del Agrobacterium que coloniza las
plantas transfiriendo una porción de su ADN El
T-ADN) en una célula de acogida, en la que se
integra en el ADN nuclear. El T-ADN se define por
secuencias de borde que tienen una longitud de 25 pares de base, y
cualquier ADN situado entre estas secuencias de borde se transfiere
también a las células de la planta. La inserción de un ácido
nucleico viral recombinante vegetal entre las secuencias de borde
del T-ADN tiene como resultado la transferencia del
ácido nucleico viral recombinante vegetal a las células de la
planta, en las que se produce la replicación del ácido nucleico
viral recombinante vegetal, distribuyéndose de forma sistémica a
través de la planta. Se ha conseguido la
agro-infección con el viroide de la deformación
fusiforme del tubérculo de la patata (PSTV) (Gardner et al.,
Plant Mol. Biol. 6: 221 (1986); CaV (Grimsley et al., and
Lazarowitz, S., Nucl. Acids Res. 16: 229 (1988)) con el virus del
mosaico estriado (Donson et al., Virology 162: 248 (1988)),
el virus del enanismo del trigo y el virus del mosaico dorado del
tomate (TGMV). Por lo tanto, la agro-infección de
una planta susceptible se pudo conseguir con un virión que contiene
un ácido nucleico viral vegetal recombinante basado en la secuencia
del nucleótido de cualquiera de los virus que anteceden. También
pueden utilizarse el bombardeo con partículas, la electroporación o
cualquier otro método conocido en la
técnica.
técnica.
Teniendo en cuenta que no todas las plantas son
organismos de acogida naturales para el Agrobacterium, pueden
utilizarse métodos alternativos, como la transformación de los
protoplastos, para introducir los vectores en las células de
acogida. En el caso de algunas monocotiledóneas, la transformación
de los protoplastos de la planta puede lograrse utilizando métodos
basados en la precipitación del fosfato cálcico, el tratamiento con
polietileno glicol, la electroporación y combinaciones de estos
tratamientos. Véase, por ejemplo, Potrykus et al., Mol. Gen.
Genet., 199: 169-177 (1985); Fromm et al.,
Nature, 319: 791 (1986); y Callis et al., Genes and
Development, 1: 1183 (1987).
La posibilidad de aplicar estas técnicas a
diferentes especies de plantas puede depender de la viabilidad de
regeneración de dichas especies de planta específica a partir de
protoplastos. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para
la regeneración de los cereales a partir de protoplastos.
Además de la transformación del protoplasto, el
bombardeo con partículas es una técnica alternativa y conveniente
para introducir los vectores de la invención en una célula vegetal
de acogida. Específicamente, las células de la planta pueden
bombardearse con micropartículas revestidas con una pluralidad de
los vectores de referencia. El bombardeo con microproyectiles
revestidos con ADN se ha utilizado con éxito para generar
transformantes estables tanto en plantas como en animales (véase,
por ejemplo, Sanford et al. (1993), Methods in Enzymology,
217: 483-509). Las micropartículas adecuadas para la
introducción de vectores en una célula vegetal suelen estar hechas
de metal, preferiblemente oro o tungsteno. Estas micropartículas
están disponibles, por ejemplo, en BioRad (por ejemplo,
PDS-1000/He de Bio-Rad). Las
personas versadas en la materia sabrán que el protocolo del
bombardeo con partículas puede optimizarse para cualquier planta,
variando parámetros como la presión del He, la cantidad de
partículas revestidas, la distancia entre la macroportadora y la
pantalla de retención y la distancia de vuelo desde la pantalla de
retención hasta el objetivo.
Los vectores también pueden introducirse en las
plantas mediante transferencia directa de ADN en el polen, como se
describe eb Zhou et al., Methods in Enzymology, 101: 433
(1983). Otras técnicas para la introducción de ácidos nucleicos en
una célula vegetal incluyen:
(a) Inoculación manual. La inoculación manual se
lleva a cabo utilizando una solución tampón de fosfato de baja
molaridad y pH neutro, a la que se ha añadido celita o carborundum
(normalmente, en torno a un 1%). Se ponen de una a cuatro gotas de
la solución en el haz de una hoja, y se frota suavemente.
(b) Inoculación mecánica de huertos. Las
inoculaciones en huertos se llevan a cabo rociando (mediante
propulsión por gas) la solución del vector en una podadora
accionada mediante un tractor, al mismo tiempo que se cortan las
hojas. Alternativamente, el huerto se siega y se rocía
inmediatamente la solución vector en las hojas
cortadas.
cortadas.
(c) Rociado a alta presión de hojas
individuales. También puede realizarse la inoculación de hojas
individuales rociando las hojas con un rociado focalizado y
orientado (50 psi, 6-12 pulgadas de distancia a la
hoja) que contenga aproximadamente un 1% de carborundum en la
solución tampón vector.
(d) Infiltración en vacío. Las inoculaciones
pueden llevarse a cabo sometiendo a un organismo de acogida a un
entorno de vacío, a fin de facilitar la infección.
Una vez introducido en una célula vegetal de
acogida adecuada, puede determinarse la expresión del transgen
utilizando cualquier ensayo conocido en la técnica. Por ejemplo, la
presencia de cepas transcritas sense o anti-sense
del transgen puede detectarse y/o cuantificarse mediante ensayos de
hibridación convencionales (por ejemplo, análisis Northern blot),
procedimientos de amplificación (por ejemplo,
RT-PCR), SAGE (patente estadounidense Nº 5.695.937)
y tecnologías basadas en matrices (Véanse, por ejemplo, las patentes
estadounidenses Nº 5.405.783. 5.412.087 y 5.445.934).
La expresión del transgen también puede
determinarse mediante el examen del producto proteínico. Se dispone
de diversas técnicas para el análisis de proteínas. Estas incluyen,
sin limitación, radio-inmunoensayos, ELISA
(inmunoensayos radiométricos enzimáticos, inmunoensayos
"sandwich" (utilizando, por ejemplo, oro coloidal, enzimas o
etiquetas radioisotópicas), análisis western blot, ensayos de
inmunoprecipitación, ensayos de inmunofluorescencia y
PAGE-SDS.
En general, la determinación del nivel de
proteína implica (a) proporcionar una muestra biológica que contenga
polipéptidos; y (b) la medición de la cantidad de cualquier enlace
inmunoespecífico que se produzca entre un anticuerpo que reaccione
al producto transgénico y un componente de la muestra, en el que la
cantidad de enlaces inmunoespecíficos indica el nivel de las
proteínas expresadas. Los anticuerpos que reconocen específicamente
y se enlazan a los productos proteínicos del transgen son necesarios
para los inmunoensayos. Estos pueden adquirirse en vendedores
comerciales o generarse y filtrarse utilizando métodos bien
conocidos en la técnica. Véase más arriba Harlow and Lane (1988) y
Sambrook et al. (1989). La muestra de proteínas de prueba
puede prepararse homogeneizando los transformantes eucarióticos
(por ejemplo, células vegetales) o las progenies generadas a
partir de los mismos, y opcionalmente, solubilizando la proteína de
prueba mediante detergentes, preferiblemente detergentes no
reductores, como tritón y digitonina. La reacción de enlace en la
que las proteínas de prueba pueden interactuar con los anticuerpos
detectores puede efectuarse en una solución o en una muestra de
tejido sólido, por ejemplo, utilizando secciones de tejido o un
soporte sólido inmovilizado con las proteínas de prueba. La
formación del complejo puede detectarse mediante diversas técnicas
conocidas en el sector. Por ejemplo, los anticuerpos pueden
suministrarse con una etiqueta y los anticuerpos que no hayan
reaccionado pueden eliminarse del complejo; la cantidad de
etiquetas restantes indicará, por lo tanto, la cantidad de complejo
generado. Los resultados obtenidos utilizando cualquiera de dichas
pruebas en una muestra procedente de un transformante vegetal o una
progenie del mismo se comparan con los procedentes de una fuente no
transformada utilizada como control.
Las células vegetales de la presente invención
se cultivan en condiciones favorables para efectuar la transcripción
del transgen. Las células de acogida también pueden utilizarse para
generar organismos transgénicos, como plantas transgénicas que
incluyan los vectores de ADN recombinante de la presente invención.
Las células de acogida preferidas son aquellas que tienen
propensión a regenerarse como un tejido o como organismos completos.
Entre los ejemplos de estas células de acogida preferidas se
encuentran ciertas células vegetales mostradas como ejemplo en este
documento.
Las plantas de tabaco a las que se ha inoculado
los virus BSG1037 o BSG1057 expresan el reporter genético (PVF) en
células infectadas con cualquiera de los virus. La actividad del
reporter genético (indicativa de la presencia del virus) se observa
fácilmente iluminando las plantas con luz ultravioleta de onda
larga. Los virus que pierden la expresión del gen PVF insertado
dejan de acumular la proteína PVF y no presentan la fluorescencia
PVF bajo la iluminación ultravioleta.
Para poder evaluar la estabilidad de la
expresión de un gen foráneo en el nuevo vector, se introdujo el gen
PVF en el vector estándar (obteniéndose BSG1037) y en el vector
mejorado (obteniéndose BSG1057). Se generaron transcripciones de
ARN de estos constructos y se utilizaron para inocular plantas de
Nicotiana benthamiana. Al cabo de unos 7 días desde la
inoculación, se observó una amplia expresión sistémica de PVF. Se
recolectó el tejido que expresaba la PVF, se molió en una solución
tampón de fosfato, y se eliminaron los residuos celulares mediante
centrifugado a baja velocidad, y el "jugo verde" resultante,
una solución que sobrenadaba, se utilizó para inocular una nueva
serie de plantas de N. benthamiana. Se volvió nuevamente a
recolectar el tejido sistémico al cabo de unos 7 días, y el jugo
verde resultante se utilizó para el pasaje seriado del virus. El
procedimiento se utilizó para el pasaje seriado de los virus un
total de 7 veces. Se inició entonces una comparación en las que se
inocularon las plantas de N. benthamiana paralelamente con el
jugo verde del primer pasaje y con el jugo verde del séptimo pasaje
correspondientes al BSG1037 y al BSG1057. El virus del primer pasaje
ofreció una excelente expresión sistémica de la PVF, que comenzó a
los 4 días de la inoculación. El virus del séptimo pasaje del
BSG1037 ofreció una reducida expresión sistémica de la PVF y unos
fuertes síntomas visuales del mosaico TMV, característicos de un
vector que ha perdido la mayor parte de la secuencia insertada. Por
el contrario, el virus del BSG1057 correspondiente al séptimo
pasaje ofreció una excelente expresión sistémica de la PVF y los
síntomas virales visuales moderados característicos de un vector que
ha conservado el gen insertado.
A los 20 días de la inoculación, las plantas se
cortaron a 2 pulgadas por encima de la línea del terreno, dejándose
que volviesen a crecer. Se supervisó la acumulación de proteína PFV
en el nuevo tejido sistémico hasta 3 semanas con posterioridad a la
siega. Las plantas que contenían el virus BSG 1037 (tanto en el
primer como en el séptimo pasaje) mostraron muy poca PFV en los
tejidos de rebrote, al mismo tiempo que mostraban amplios síntomas
virales. Este resultado indica que la población de virus estaba
dominada por virus que habían perdido por recombinación la
inserción genética. Las plantas que contenían BSG 1057 (tanto del
primer como del séptimo pasaje) mostraban una buena invasión
sistémica en el tejido de rebrote. Esto indica una mayor
estabilidad genética de la inserción del gen foráneo, el gen PVF, en
BSG 1057, comparado con el BSG 1037.
Esta mayor estabilidad genética de los genes
foráneos también se ha apreciado utilizando inserciones de dos
genes adicionales: interferón gamma procedente de pollos y
galactosidasa A humana alfa. Los experimentos de pasaje en serie de
cualquiera de los genes de las preparaciones de virus BSG 1037
mostraron una producción variable del producto en plantas, mientras
que experimentos comparables llevados a cabo en BSG 1057 mostraron
una acumulación más uniforme del producto en plantas. Estos
experimentos indican que el BSG 1057 retiene en mayor medida
inserciones de genes foráneos a través de múltiples pasajes.
La invención y la forma y el proceso en el que
se llevan a cabo y se utilizan se describirán ahora en unos
términos tan completos, claros, concisos y exactos que permitan a
cualquier persona versada en la materia a la que se refiere
fabricar y utilizar los mismos. Para destacar y reivindicar el
objeto de la invención, esta especificación concluye con las
siguientes reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de referencias citada por el
solicitante lo es solamente para utilidad del lector, no formando
parte de los documentos de patente europeos. Aún cuando las
referencias han sido cuidadosamente recopiladas, no pueden
excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad
a este respecto.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet WO 9521248 A [0002]
- \bullet US 5816653 A [0010] [0031] [0039]
- \bullet US 5316931 A [0010] [0031] [0039]
- \bullet US 5695937 A [0044]
- \bullet US 5977438 A [0010] [0031] [0039]
- \bullet US 5405783 A [0044]
- \bullet US 5889191 A [0010] [0031] [0039]
- \bullet US 5412087 A [0044]
- \bullet US 5889190 A [0010] [0031] [0039]
- \bullet US 5445934 A [0044]
- \bullet US 5866785 A [0010] [0031] [0039]
- \bullet US 60132697 B [0053]
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletDawson; Lehto.
Advances in Virus Research, 1991, vol. 38,
307-342 [0002]
\bulletMatthews. PLANT
VIROLOGY. 1991 [0011]
\bulletSambrook; Fritsch;
Maniatis. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL.
1989 [0011]
\bulletCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR
BIOLOGY. 1987 [0011]
\bullet METHODS IN ENZYMOLOGY. Academic
Press, Inc, [0011]
\bulletPCR 2: A PRACTICAL APPROACH.
1995 [0011]
\bulletANTIBODIES, A LABORATORY
MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE. 1987 [0011]
\bulletGardner y otros. Plant Mol.
Biol., 1986, vol. 6, 221 [0040]
\bulletGrimsley; Lazarowitz, S.
y otros. Nucl. Acids Res., 1988, vol. 16, 229
[0040]
\bulletDonson y otros.
Virology, 1988, vol. 162, 248 [0040]
\bulletPotrykus y otros. Mol.
Gen. Genet., 1985, vol. 199, 169-177
[0041]
\bulletFromm y otros. Nature, 1986, vol. 319, 791 [0041]
\bulletCallis y otros. Genes and
Development, 1987, vol. 1, 1183 [0041]
\bulletSanford y otros. Methods
in Enzymology, 1993, vol. 217, 483-509
[0042]
\bulletZhou y otros. Methods in
Enzymology, 1983, vol. 101, 433 [0043]
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> LARLE SCALE BIOLOGY CORPORATION
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vectores de expresión viral
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 008010165USPC01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/132,697
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-05-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7685
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7686
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 857
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 267
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 268
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Secuencia de ácido nucleico, que
comprende:
(a) una primera secuencia de ácido nucleico que
codifica una proteína de movimiento viral alterado que comprende
mutaciones puntuales en residuos de aminoácidos codificados por los
dos codones que incluyen, respectivamente, las posiciones del
nucleótido 5213 y 5203 de SEQ ID Nº 1; y
(b) una segunda secuencia de ácido nucleico que
codifica un complejo replicasa alterado 126/183 que incluye
mutaciones puntuales en residuos de aminoácidos codificados por los
dos codones que incluyen, respectivamente, las posiciones del
nucleótido 1138 y 2382 de SEQ ID Nº 1;
en la que las alteraciones mejoran la capacidad
de retener un transgen contenido en un virus que expresa el
movimiento de la proteína alterada.
2. Vector viral que comprende la secuencia de
ácido nucleico de la reivindicación 1.
3. Vector viral de la reivindicación 2, en el
que dichas mutaciones puntuales del nucleótido tienen como
resultado las siguientes sustituciones de aminoácido:
- \quad
- Thr a Ile en el residuo codificado por el codón que incluye la posición del nucleótido 5213 de SEQ ID Nº 1;
- \quad
- Lys a Arg en el residuo codificado por el codón que incluye la posición del nucleótido 5303 de SEQ ID Nº 1;
- \quad
- Glu a Gly en el residuo codificado por el codón que incluye la posición del nucleótido 1138 de SEQ ID Nº 1; y
- \quad
- Lys a Glu en el residuo codificado por el codón que incluye la posición del nucleótido 2382 de SEQ ID Nº 1.
4. Vector viral de las reivindicaciones 2 o 3,
en el que la proteína de movimiento viral alterado comprende
mutaciones puntuales T104I y K134R.
5. Vector viral de la reivindicación 2, en el
que dichas mutaciones puntuales del nucleótido comprenden:
- \quad
- - C a T en el nucleótido correspondiente a la posición 5213 de SEQ ID Nº 1;
- \quad
- - A a G en el nucleótido correspondiente a la posición 5303 de SEQ ID Nº 1;
- \quad
- - A a G en el nucleótido correspondiente a la posición 1138 de SEQ ID Nº 1; y
- \quad
- - A a G en el nucleótido correspondiente a la posición 2382 de SEQ ID Nº 1.
6. Vector viral de la reivindicación 5, que
comprende adicionalmente las mutaciones puntuales:
- \quad
- - T a C en el nucleótido correspondiente a la posición 1268 de SEQ ID Nº 1;
- \quad
- - G a A en el nucleótido correspondiente a la posición 3632 de SEQ ID Nº 1; y
- \quad
- - C a A en el nucleótido correspondiente a la posición 5896 de SEQ ID Nº 1.
7. Vector viral de cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6, que comprende el ácido nucleico de SEQ ID Nº
2.
8. Vector viral de cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 7, designada con la referencia BSG 1057,
depositada en la Recopilación de Cultivos Tipo Americanos, con el
número de acceso 20398.
9. Vector viral de cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 8, en la que el transgen es un gen no
viral.
10. Vector viral de la reivindicación 9, en el
que el transgen no viral codifica una proteína seleccionada del
grupo consistente en una proteína de membrana, una proteína
citosólica, una proteína secretada, una proteína nuclear y una
proteína chaperone.
11. Vector viral de cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 10, en el que el vector es un vector del virus
del mosaico del tabaco.
12. Célula vegetal transformada con el vector
viral de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11.
13. Secuencia de ácido nucleico de SEQ ID Nº
2.
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|---|---|---|---|
| ES00930426T Expired - Lifetime ES2332982T3 (es) | 1999-05-04 | 2000-05-04 | Vectores de expresion viral para plantas. |
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