CN107353330A - Ptre1基因在调控植物耐热性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及PTRE1基因在调控植物耐热性中的应用。本发明首次发现PTRE1基因可以调控蛋白酶体活性，进而影响热刺激条件下变性蛋白的大量产生及降解，调控植物的耐热性。因此，可以将PTRE1基因应用于植物耐热改良育种中，选育出具有耐热能力的品种。

Description

PTRE1基因在调控植物耐热性中的应用

技术领域

本发明属于植物学和基因工程领域，更具体地，本发明涉及PTRE1基因在调控植物耐热性中的应用。

背景技术

当今世界气候变化已经成为各国政府及普通民众日益关注的热点问题。诸如两极冰川融化、卡特里娜飓风、印度洋海啸、印度热浪以及中国的南方雨雪冰冻灾害等灾害无时无刻不在提醒着我们全球气候的巨大变化。地球作为人类赖以生存的家园，不仅孕育着人类文明，更承载和维持着整个生态系统，其上的动物、植物、微生物，高山、河流、湖泊、海洋都为人类的生存与发展提供着必不可少的条件。然而全球气候变化正在严重的威胁着整个地球生态系统的稳定。许多研究表明，随着温度升高，作物中的干物质及产量会下降。

对植物尤其是稻类作物而言，温度的升高首先会影响稻穗的不育率，在开花期高温会阻止花粉囊裂开和花粉散发，致使授粉率和谷粒数量降低，不育率上升，产量下降。温度升高还会改变作物的生长速率和生育期长度，从而影响产量。温度升高延长了作物的全年生长期，这对无限生长习性或多年生作物以及热量不足的地区有利，但对生育期短的作物生长不利。温度升高使作物生长发育速度加快，生育期缩短。研究表明，作物生长期间气温每升高1℃，水稻生育期将缩短7～8天，冬小麦生育期将缩短17天，这就减少了作物光合作用积累干物质的时间。由此，夜间温度升高条件下，玉米、小麦和大豆产量的降低并不能全部归因于夜间呼吸速率的升高，水分利用效率的降低和生育期的缩短也是导致作物产量下降的原因之一。所以通过植物分子生物学结合遗传学的方法寻找具有耐热性状的基因具有重要的理论意义和现实意义。

新蛋白的合成和已有蛋白的降解控制着植物生命周期中的所有过程，每周约有50％的蛋白通过这种合成-降解循环进行更新。科学家们很早就开始对控制蛋白合成的转录和翻译过程的机制进行研究，但直到近来才开始认识到蛋白质降解的重要性。蛋白降解可有效降解细胞内不正常的蛋白从而产生自由的氨基酸供植物的生长发育及更新。泛素-蛋白酶体降解体系是已知的最重要的蛋白降解体系，在动植物发育过程中起重要的调控作用，Aaron Ciechanover，Avram Hershko和Irwin Rose也因发现泛素调节的蛋白质降解过程而获得了2004年诺贝尔化学奖。现在已发现该降解体系基本涉及到植物生命活动的每个方面，包括抵抗逆境和疾病、激素信号调控、细胞周期控制、胚胎发育及光形态建成等。

目前的研究表明，提高蛋白酶体活性可以有效清除热刺激条件下产生的垃圾蛋白，所以提高蛋白酶体活性可能是一种有效的获得具有耐热能力的植物的方法。因此，有必要寻找具有提高蛋白酶体活性的蛋白，并从这些蛋白中筛选具有提高植物耐热能力的蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供PTRE1基因在调控植物耐热性中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种提高植物耐热能力的方法，所述方法包括：上调植物中PTRE1蛋白的表达。

在一个优选两种，所述的植物是双子叶植物。

在另一优选例中，所述的植物包括：十字花科植物，禾本科植物，茄科植物，大戟科植物。

在另一优选例中，所述十字花科植物包括：拟南芥。

在另一优选例中，所述的禾本科植物包括：水稻、小麦、玉米。

在另一优选例中，所述的茄科植物包括：马铃薯、西红柿。

在另一优选例中，所述的大戟科植物包括：木薯。

在另一优选例中，所述的PTRE1蛋白选自下组：(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述上调植物中PTRE1蛋白的表达包括：将PTRE1蛋白的编码序列转入植物细胞、组织、器官或种子，从而上调植物中蛋白酶体活性，提高植物耐热能力。

在本发明的另一方面，提供一种PTRE1蛋白或其编码基因用途，用于提高植物耐热能力。

在一个优选例中，所述的PTRE1蛋白通过促进植物蛋白酶体活性，从而提高植物耐热能力。

在另一优选例中，，所述的PTRE1蛋白选自下组：(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述的植物是双子叶植物。

在另一优选例中，所述的植物包括：十字花科植物，禾本科植物，茄科植物，大戟科植物。

在本发明的另一方面，提供一种PTRE1蛋白或其编码基因用途，用于作为鉴定植物耐热能力的分子标记。

在一个优选例中，若经检测植物组织中PTRE1蛋白表达高于一个特定值，则相对而言，所述植物的耐热能力增强；若经检测植物组织中PTRE1蛋白表达低于一个特定值，则相对而言，所述植物的耐热能力减弱。其中，除非另外说明，所述的“特定值”是指植物中PTRE1蛋白表达量的平均值。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、PTRE1基因过量表达拟南芥植株、ptre1突变体以及野生型Col在不同温度下进行处理后的表型分析。标尺＝1cm。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种新的可以调节植物耐热能力的基因，其是PTRE1基因。PTRE1基因可以提高植物蛋白酶体活性，实现植物品种改良。PTRE1基因还可以被应用于植物的培育中，选育出具有特定耐热性状的品种。

如本文所用，所述的“植物(作物)”包括农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物可以是：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。所述的“植物”包括：十字花科植物，禾本科植物、茄科植物、大戟科植物等。比如，可以包括但不限于：水稻、小麦、玉米、马铃薯、木薯等。较佳的，所述的植物是十字花科植物。

本发明所述的PTRE1蛋白还包括PTRE1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的SEQ ID NO:3序列的蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种PTRE1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，PTRE1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种蛋白，其仍然能保持全长的PTRE1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长PTRE1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长PTRE1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“PTRE1蛋白”指具有PTRE1蛋白活性的SEQ ID NO:3序列的蛋白。该术语还包括具有与PTRE1蛋白相同功能的、SEQ ID NO:3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括PTRE1蛋白的活性片段和活性衍生物。

编码PTRE1蛋白或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。编码成熟PTRE1蛋白的编码区序列可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列基本上相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:3的蛋白质，但与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

术语“编码基因”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

上述多核苷酸的变异体也是可用的，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

应理解，虽然本发明的PTRE1基因优选获自十字花科植物，但是获自其它植物的与该PTRE1基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的PTRE1蛋白的编码序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。

包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或PTRE1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含PTRE1蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。包含上述的适当编码序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

蛋白酶体是在真核生物普遍存在的一种巨型蛋白质复合物。本发明人发现，PTRE1蛋白参与了对于植物体内蛋白酶体的调控作用，并且，其能够显著地提高植物的耐热能力。

因此，PTRE1可用于制备具有增强的耐热能力的转基因植物。

基于本发明人的新发现，本发明提供了所述的PTRE1蛋白或其编码基因的用途，用于增强植物的耐热能力，或用于制备具有增强的耐热能力的转基因植物。

本发明还涉及PTRE1蛋白或其编码基因的上调剂及其用途。由于PTRE1的上调剂可提高PTRE1的表达和/或提高PTRE1的活性等，因此，所述的PTRE1的上调剂也可通过对PTRE1的影响来调节植物性状，从而达到改良植物的目的。

任何可提高PTRE1蛋白的活性、提高PTRE1蛋白的稳定性、促进PTRE1蛋白的表达、延长PTRE1蛋白有效作用时间、或促进PTRE1基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于增强植物的耐热能力的有效物质。

本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括提高所述植物中PTRE1蛋白的表达或活性。

在得知了所述的PTRE1蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的PTRE1蛋白的表达。比如可通过一定的途径将携带PTRE1编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的PTRE1蛋白。

作为本发明的一种实施方式，将PTRE1蛋白的编码基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述PTRE1蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达PTRE1蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达PTRE1蛋白的植物。优选的，利用农杆菌转化法将PTRE1蛋白的编码基因转入植物中。

如本文所用，所述的正向连接是指：PTRE1的编码基因与表达载体的连接是正义的连接，即编码基因按照5’→3’的方向连接于载体上。通常，PTRE1的编码基因位于表达载体中启动子的下游，也即启动子的3’端下游连接该编码基因的5’端。所述的编码基因是可操作性地连接到表达载体上的。所述的“操作性连接”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。其它增加PTRE1表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强PTRE1的表达。或者通过增强子来增强该PTRE1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。

此外，本发明还涉及利用PTRE1蛋白或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用PTRE1蛋白或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中PTRE1蛋白的表达情况，鉴定植物的耐热能力等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、PTRE1基因的分离和表型分析

本发明人在蛋白酶体活性调节的研究中，发现了PTRE1基因可以调控植物耐热能力。

通过构建PTRE1过量表达载体转入拟南芥植物获得PTRE1过量表达的植物。

1、构建PTRE1过量表达载体

载体构建方法如下：以拟南芥Col的基因组为扩增模板，通过引物P1和引物P2扩增PTRE1cDNA基因，通过酶切连接的方法插入到载体pCAMBIA1302(该质粒自带GFP编码序列)的多克隆位点中，获得PTRE1过量表达载体，称为pCAMBIA1302-PTRE1，其可以表达35S驱动的PTRE1-GFP(p35S::PTRE1-GFP)。

引物P1：CATGCCATGGCGAATTCTCAGACGGTGA(SEQ ID NO:4)；

引物P2：GGACTAGTTATAAAATCTGAACCGCCG(SEQ ID NO:5)。

2、制备转基因植物

采用常规方法转化pCAMBIA1302-PTRE1到GV3101农杆菌中，通过花浸染法将基因转入植物中。

转化植物的方法具体如下：根据Clough and Bent(1998)的Floral Dipping方法进行拟南芥转化。取生长1个月左右的拟南芥植株，去除已经开放的花朵和结实的果荚，转化前1天浇足水。将含有转基因载体pCAMBIA1302-PTRE1的农杆菌GV3101于28℃培养过夜至OD600≈2.0，4500rpm离心10min，菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液中，至终浓度OD600≈0.8。转化时将拟南芥地上部分浸泡于菌液中30-40s，确保全部花苞都被浸没。用吸水纸吸去多余的液体，将植物平放并用保鲜膜保持湿度，避光过夜。第2天将植物取出，竖直并转移到正常条件下生长收种。

通过潮霉素抗性筛选，获得PTRE1基因过量表达的阳性转基因拟南芥，称为35S::PTRE1-GFP。

实施例2、PTRE1基因过量表达的植株的表型分析

本实施例中，检测ptre1突变体和PTRE1基因过量表达转基因植物的表型性状。

1、拟南芥突变体的建立

为了研究PTRE1的生理功能，本发明人检索了拟南芥T-DNA插入突变体库(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress)，得到一个可能的T-DNA插入突变体Salk_034353。经种子扩繁、筛选及鉴定，证明插入位置在第一个内含子上。后代群体约300株经T-DNA插入验证，发现在含T-DNA插入杂合的植株成苗中，除果荚中胚胎发育异常外其他生长发育状态和野生型没有明显差异，但T-DNA插入纯合植株的发育明显异常。

用于鉴定突变体的引物如下：

LBa1：TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG(SEQ ID NO:6)；

PTRE1-RP：AACGTAGGCCCAAATTTGATC(SEQ ID NO:7)；

PTRE1-LP：CTCCACAAAACGAAGTTCCAC(SEQ ID NO:8)。

2、表型分析

将PTRE1基因过量表达拟南芥植株、ptre1突变体以及野生型Col在不同温度下进行培育，观察生长情况。

具体培养方法如下：用75％的酒精清洗种子后，播种在1/2MS培养基上面，在4℃春化2天后，取出放置于22℃，16小时光照/8小时黑暗的植物培养箱中，2周后，取出培养皿放于42℃或者45℃水浴锅进行热刺激处理，2小时或者45分钟后取出继续放置于22℃生长9天，进行拍照分析。

具体表型分析结果见图1。可见，在正常条件下，PTRE1基因过量表达拟南芥植株的生长状况与野生型基本接近，而ptre1突变体生长状况相对较差。在42℃条件下处理2小时后，野生型与ptre1突变体产生较多黄叶，而PTRE1基因过量表达拟南芥植株相对而言产生的黄叶较少。在45℃条件下处理45分钟后，ptre1突变体枯萎，野生型接近枯萎；而PTRE1基因过量表达拟南芥植株产生较多黄叶、仍有部分未发生枯萎的叶子。

因此，PTRE1基因过量表达拟南芥植株具有良好的耐热能力，而其缺失表达后，植物耐热能力显著差。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种提高植物耐热能力的方法，其特征在于，所述方法包括：上调植物中PTRE1蛋白的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物是双子叶植物；较佳地，所述的植物包括：十字花科植物，禾本科植物，茄科植物，大戟科植物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述十字花科植物包括：拟南芥；或者

所述的禾本科植物包括：水稻、小麦、玉米；或者

所述的茄科植物包括：马铃薯、西红柿；或者

所述的大戟科植物包括：木薯。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PTRE1蛋白选自下组：

(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上调植物中PTRE1蛋白的表达包括：

将PTRE1蛋白的编码序列转入植物细胞、组织、器官或种子，从而上调植物中蛋白酶体活性，提高植物耐热能力。

6.一种PTRE1蛋白或其编码基因用途，用于提高植物耐热能力。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的PTRE1蛋白通过促进植物蛋白酶体活性，从而提高植物耐热能力。

8.如权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述的PTRE1蛋白选自下组：

(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

9.如权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述的植物是双子叶植物；较佳地，所述的植物包括：十字花科植物，禾本科植物，茄科植物，大戟科植物。

10.一种PTRE1蛋白或其编码基因用途，用于作为鉴定植物耐热能力的分子标记。