ES2328722T3 - Moleculas de union para proteinas de factor humano viii y de tipo factor viii. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido que une factor VIII y/o un polipéptido de tipo factor VIII que tiene una secuencia de aminoácidos la cual incluye la siguiente secuencia: (**Ver secuencia)**
Description
Moléculas de unión para proteínas de factor
humano VIII y de tipo de factor VIII.
La presente invención se refiere al campo del
aislamiento y purificación de proteínas. En concreto, la presente
invención se refiere a la identificación, aislamiento y síntesis de
moléculas de unión que se adhieren a polipéptidos de factor VIII y/o
de tipo factor VIII. Tales moléculas de unión son útiles para
detectar y purificar los polipéptidos de factor VIII y de tipo
factor VIII a partir de soluciones que los contienen.
La hemofilia clásica A es el resultado de una
deficiencia ligada a un cromosoma X del factor VIII de coagulación
del plasma sanguíneo y afecta casi exclusivamente a los machos con
una frecuencia de aproximadamente 1 caso de cada 10.000. El defecto
del cromosoma X se transmite a través de los portadores hembra que
no tienen la enfermedad en sí mismas. El factor VIII también se
conoce como factor antihemofílico (AHF), factor hemofílico A,
cofactor plaquetario, tromboplastinógeno, trombocitolisina, y
globulina antihemofílica (AHG). La designación de "factor
VIII:C" se utiliza para indicar que éste es el compuesto que
afecta a la coagulación. El factor VIII es una proteína de peso
molecular alto de 280 kDa y: está compuesto por dos cadenas de
polipéptidos de 200 kDa y 80 kDa, respectivamente. Andersson et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U.,
83:2979-2973 (1986). Estas cadenas se mantienen
juntas con un puente de ión metálico.
El principal síntoma de la hemofilia A es el
sangrado sin formación de coágulos o coagulación. Antes de
descubrir que la administración de concentrados de factor VIII
podría aliviar los síntomas de un individuo diagnosticado con la
enfermedad, la esperanza media de vida de un enfermo era de
aproximadamente 20 años.
Hasta hace unos años, la fuente más importante
de factor VIII con fines terapéuticos era el plasma sanguíneo
normal; no obstante el factor VIII aislado mediante este método,
aunque tiene algún uso, tiene algunas desventajas importantes. Por
ejemplo, el factor VIII aislado de plasma sanguíneo es
suficientemente impuro, teniendo normalmente una actividad
específica inferior a 2 unidades de factor VIII/mg de proteína y un
contenido global de factor VIII inferior a un 1%. Adicionalmente, el
proceso de purificación es caro ya que la materia prima, es decir,
el plasma humano, es caro. Se deben tomar también muchas
precauciones para reducir el riesgo de transmitir agentes
infecciosos al paciente. Por ejemplo, en sangre donada se detectan
comúnmente el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus
de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C y otros agentes
patógenos. Otra desventaja de usar factor VIII obtenido mediante
éste método es que aproximadamente una décima parte de los pacientes
con hemofilia A severa desarrollan anticuerpos contra el factor
VIII, haciendo difícil de tratar la enfermedad.
Los esfuerzos de la investigación se han
centrado en el desarrollo de métodos para crear y aislar factor
VIII biológicamente activo y altamente purificado completo y en sus
formas derivadas. Las ventajas de una proteína altamente purificada
incluyen niveles reducidos de proteínas extrañas en la mezcla
terapéutica al igual que una menor probabilidad de presencia de
agentes infecciosos. Una forma más purificada de factor VIII
también se puede administrar en dosis más pequeñas, posiblemente
reduciendo el riesgo de desarrollar anticuerpos
anti-factor VIII, ya que dosis más bajas serían
menos agresivas para el sistema inmunitario.
Se han dado pasos significativos con respecto a
la producción recombinante de factor VIII empezando por el
aislamiento de fragmentos de factor VIII biológicamente activos.
Véase Andersson et al., U.S. Pat. Nº. 4.749.780; Andersson
et al., U.S. Pat. Nº. 4.877.614. El gen que codifica la
proteína humana completa de factor VIII se aisló para sacar
provecho de su homología secuencial con el factor VIII porcino.
Véase Toole et al., U.S. Pat. Nº. 4.757.006. Toole et
al. también informa sobre la expresión de la proteína humana y
porcina que tiene actividad procoagulante de factor VIII:C.
No obstante, todavía existen efectos secundarios
severos que implican la producción de anticuerpos
anti-factor VIII con la administración de la
proteína aislada a partir de ambas fuentes humanas y no humanas. Se
sabe que los anticuerpos que reaccionan con el factor VIII:C humano
también reaccionan, con un determinado alcance, con el factor
VIII:C de otras especies, y el mismo factor VIII porcino es
antigénico en seres humanos. Además, los no hemofílicos pueden
desarrollar o adquirir la enfermedad si sus sistemas inmunológicos
se hacen sensibles al factor VIII:C.
Como posible solución para este problema, se ha
diseñado una proteína de peso molecular truncado e inferior que
muestra actividad procoagulante. Véase Toole, U.S. Pat. Nº.
4.868.112. Toole proporcionó un método alternativo de tratamiento
con factor VIII porcino de peso molecular inferior de
aproximadamente 2000 aminoácidos exhibiendo una actividad
procoagulante similar en forma de factor VIII completo.
Evidentemente, la eliminación de ciertos aminoácidos y de hasta 19
de los 25 sitios de glicosilación posibles, redujo la antigenicidad
de la proteína y de ese modo la probabilidad de desarrollar
anticuerpos anti-factor VIII. No obstante, una
dificultad con el desarrollo del factor VIII recombinante reside en
alcanzar niveles de producción con rendimientos suficientemente
altos.
Recientemente se han desarrollado moléculas de
ADNc de factor VIII delecionadas que codifican derivados del factor
VIII recombinante, las cuales pudieron ofrecer rendimientos
suficientemente altos de una proteína de factor VIII recombinante
biológicamente activa para su uso en un proceso industrial para una
preparación farmacéutica. Véase Almstedt et al., U.S. Pat.
Nº. 5.661.008. Almstedt et al. diseñó un derivado de factor
VIII modificado a partir de un ADNc de factor VIII completo, el
cual, al expresarse en células animales, produjo niveles altos de
una proteína de tipo factor VIII con actividad de factor VIII. La
proteína consistía esencialmente en dos cadenas de polipéptidos
derivadas de factor VIII humano, teniendo las cadenas pesos
moleculares de 90 kDa y 80 kDa, respectivamente. Según el proceso
de Almstedt et al., los ADNcs del factor VIII se agrupan en
unidades de transcripción y se introducen en un sistema huésped
adecuado para la expresión. Las líneas celulares se pueden aumentar
en una gran escala en un cultivo en suspensión o en un soporte
sólido. La proteína producida en el medio de cultivo se concentra y
purifica entonces. La proteína activa final se compone de los
aminoácidos 1 a 743 y 1638 a 2332 del factor VIII humano. Esta
secuencia polipeptídica se conoce comercialmente como
rFVIII-SQ o REFACTO® Véase también, Lind et
al., Euro. J. Biochem., 232:19-27 (1995). Otras
formas de FVIII truncado también se pueden crear donde generalmente
se deleciona el dominio B. En tales formas de realización, los
aminoácidos de la cadena pesada, los cuales consisten esencialmente
en los aminoácidos 1 a 740 del factor VIII humano y tienen un peso
molecular de aproximadamente 90 kD se conectan a los aminoácidos de
la cadena ligera, los cuales consisten esencialmente en los
aminoácidos 1649 a 2332 del factor VIII humano y tienen un peso
molecular de aproximadamente 80 kD. Las cadenas pesadas y ligeras se
pueden conectar mediante un péptido de enlace de entre los
aminoácidos 2 y 15, por ejemplo un enlazador que comprenda residuos
de lisina o arginina, o de forma alternativa, enlazar mediante un
enlace de ión metálico.
Habitualmente, existe una necesidad en el campo
de métodos eficientes y rentables de obtener factor VIII activo
purificado directamente a partir de diversas soluciones tales como
sangre o sobrenadantes de cultivo celular.
La presente invención proporciona materiales y
métodos nuevos para identificar, aislar, y purificar factor VIII y
proteínas de tipo factor VIII, incluyendo el REFACTO®, a partir de
una solución que contiene tales proteínas, en una forma activa. Las
moléculas de unión de tipo factor VIII de la presente invención
muestran una afinidad alta con el factor VIII y los péptidos de
tipo factor VIII. La presente invención proporciona de este modo
unos medios rentables para purificar rápidamente cantidades
comerciales de proteínas útiles en el tratamiento de la hemofilia
A.
Por consiguiente, es un objetivo de la presente
invención proporcionar moléculas de unión nuevas para el factor
VIII y las proteínas de tipo factor VIII. Las moléculas de unión
preferidas de la presente invención muestran no sólo características
diferentes a la hora de unir los polipéptidos del factor VIII
objetivo sino también características específicas y deseables a la
hora de liberar (elución) los polipéptidos objetivo. Las moléculas
de unión especialmente preferidas según la invención son secuencias
polipéptidas cortas, caracterizadas por una estructura de bucle
estable.
Se describe aquí un método preferido para aislar
moléculas de unión según la invención utilizando tecnología de
exposición en fago. El método de exposición en fago de la presente
invención es útil para identificar familias de moléculas de unión de
polipéptidos, y usando esta técnica se han identificado y aislado
algunos péptidos de enlace que muestran una afinidad alta con el
factor VIII y los péptidos de tipo factor VIII. Tales péptidos de
unión son útiles para identificar, aislar y purificar el factor VIII
y los polipéptidos de tipo factor VIII a partir de una
solución.
Las moléculas de unión preferidas específicas
para el factor VIII y los péptidos de tipo factor VIII aislados
mediante el método de exposición en fago de la presente invención
son polipéptidos caracterizados por una estructura de bucle formada
como resultado de un enlace de bisulfuro entre dos residuos de
cisteína localizados en las posiciones descritas en la SEC ID No:
2. Las moléculas de unión de polipéptidos específicas según la
presente invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias
de aminoácidos de la siguiente fórmula general:
Además, también se prevé que el método de
exposición en fago de la presente invención también se pueda usar
para aislar familias adicionales de moléculas de unión específicas
para el factor VIII y los polipéptidos de tipo factor VIII.
Las moléculas de unión preferidas para aislar
y/o purificar factor VIII y polipéptidos de tipo factor VIII,
incluyendo en especial el REFATO®, mencionado anteriormente, a
partir de una solución, incluyen los siguientes polipéptidos:
- His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-Arg-Pro-Cys-Leu-His
- (SEC ID No: 10);
- Arg-Gly-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-Arg-Pro-Cys-Leu-Asp
- (SEC ID No: 11);
- His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-His-Pro-Cys-Ala-Ala
- (SEC ID No: 12);
- His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Asn-Pro-Cys-Ala-His
- (SEC ID No: 13);
- His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Phe-His
- (SEC ID No: 14);
- His-Ala-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-His-Ala
- (SEC ID No: 15);
- His-Leu-Cys-Gly-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Asp-Ala
- (SEC ID No: 16);
- His-Leu-Cys-Phe-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Asp-Ala
- (SEC ID No: 17);
- His-Gly-Cys-Gly-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-His-Ala
- (SEC ID No: 18);
- His-Pro-Cys-Gly-Ala-Trp-Phe-Asn-Pro-Cys-Pro-Arg
- (SEC ID No: 19);
- His-Pro-Cys-Gly-Ala-Trp-lu-Arg-Pro-Cys-Tyr-Asn
- (SEC ID No: 20);
- His-Arg-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-His-Pro-Cys-Leu-Ala
- (SEC ID No: 21).
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Soluciones a partir de las cuales se puede
aislar y purificar factor VIII y polipéptidos de tipo factor VIII
incluyen, pero no se limitan a sangre, fracciones de sangre, y
sobrenadantes de cultivo celular recombinante que contienen factor
VIII o un polipéptido de tipo factor VIII producido y segregado por
la célula huésped recombinante.
También se describe un método para identificar y
aislar moléculas de unión de factor VIII mediante tecnología de
exposición en fago. Más específicamente, el factor VIII y las
moléculas de unión de tipo factor VIII que tienen características de
unión y elución específicas y predeterminadas se pueden seleccionar
de una biblioteca de moléculas de unión, tal como una biblioteca de
exposición en fago, mediante un método que comprende:
- (a)
- seleccionar una primera condición de solución (es decir, las condiciones de unión) en las cuales se desea que una molécula de unión deba exhibir una afinidad con el factor VIII o un polipéptido de tipo factor VIII, formando un complejo de afinidad;
- (b)
- seleccionar una segunda condición de solución (es decir, las condiciones de liberación) en las cuales se desea que la molécula de unión se disocie del factor VIII o del polipéptido de tipo factor VIII, donde la segunda condición de solución sea diferente en algún aspecto (p. ej., temperatura, pH, concentración de solvente, etc.) de la primera condición de solución;
- (c)
- Suministrar una biblioteca de análogos de un dominio de unión de factor VIII parental, donde cada análogo difiere de dicho dominio de unión parental en cuanto a la variación de la secuencia de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácidos dentro del dominio;
- (d)
- poner en contacto dicha biblioteca de análogos con factor VIII o un polipéptido de tipo factor VIII en la primera condición de solución bajo condiciones adecuadas para formar un complejo entre la molécula de unión y un factor VIII o polipéptido de tipo factor VIII;
- (e)
- eliminar de la solución los elementos no enlazados (análogos) de la biblioteca de dominios de unión;
- (f)
- someter el factor VIII o los complejos de polipéptidos de tipo factor VIII que quedan de la fase (e) a la segunda condición de solución para disociar algunos de los complejos de moléculas de unión/factor VIII (o el polipéptido de tipo factor VIII);
- (g)
- recuperar los análogos de unión liberados bajo la segunda condición de solución, donde los análogos recuperados identifican factor VIII aislado o moléculas de unión de tipo factor VIII.
Opcionalmente, el procedimiento anterior puede
incluir fases de condición de liberación adicionales, es decir,
opcionalmente sometiendo el factor VIII o los complejos de
polipéptido de tipo factor VIII que quedan de la fase (f) a una
tercera condición de solución para disociar otros complejos
restantes, los cuales se pueden recoger en una fracción separada de
las moléculas de unión de factor VIII liberadas bajo las segundas
condiciones de solución. Una fase de este tipo, si las condiciones
son suficientemente rigurosas para disociar todos los complejos
formados en la fase (d), identificará condiciones de solución
adecuadas para regenerar matrices de unión utilizando las moléculas
de unión aisladas en base a este proceso.
También se describen moléculas de unión no
peptídicas y polipéptidos modificados que enlazan factor VIII y/o
polipéptidos de tipo factor VIII. Un ejemplo de estas
modificaciones es un péptido de bucle forzado que tiene residuos de
cisteína pareados los cuales forman enlaces de bisulfuro,
modificado en los residuos de cisteína mediante sustitución de una
de las cisteínas por aminoácidos no naturales capaces de condensarse
con la otra cadena lateral de cisteína para formar un puente de
tioéter estable. Tales análogos de tioéter cíclicos de péptidos
sintéticos están descritos en la publicación PCT WO 97/46251,
incorporada aquí como referencia. Otras modificaciones
específicamente contempladas incluyen sustituciones de aminoácidos
específicas para aportar estabilidad u otras propiedades sin afectar
significativamente a la unión de factor VIII, p. ej., la
sustitución de Glu-Pro por Asp-Pro
para reducir la labilidad del ácido); modificaciones de
N-terminal o C-terminal para
incorporar enlaces tales como segmentos de
poli-glicina y alteraciones para incluir grupos
funcionales, sobre todo funcionalidades de hidracida
(-NH-NH_{2}), p. ej., para ayudar a la
inmovilización de polipéptidos de unión según esta invención en
soportes sólidos.
En otra forma de realización, la presente
invención abarca una composición de materia que comprende ácidos
nucleicos aislados, preferiblemente ADN, que codifica moléculas de
unión de la presente invención.
También se describe un método para detectar un
factor VIII o un péptido de tipo factor VIII en una solución en la
que se sospecha que está contenido, que comprende poner en contacto
la solución con una molécula de unión según la invención y
determinar si se ha formado un complejo de unión.
Otra descripción es un método para purificar
factor VIII o un polipéptido de tipo factor VIII a partir de una
solución que lo contenga, que incluye las fases de:
- (a)
- poner en contacto una solución que contiene factor VIII o un polipéptido de tipo factor VIII con una molécula de unión según esta invención bajo condiciones de solución conductivas para formar un complejo de unión comprendido de factor VIII o un polipéptido de tipo factor VIII y la molécula de unión;
- (b)
- separar los complejos de los componentes no vinculantes de la solución;
- (c)
- disociar el factor VIII o el polipéptido de tipo factor VIII de la molécula de unión; (d) recoger el factor VIII purificado y disociado o el polipéptido de tipo factor VIII.
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También se describe un método para aislar factor
VIII y péptidos de tipo factor VIII que comprende:
- (a)
- inmovilizar una molécula de unión según la invención en un soporte sólido,
- (b)
- poner en contacto una solución que contiene factor VIII o una solución que contiene polipéptido de tipo factor VIII con el soporte sólido,
- (c)
- eliminar los componentes no vinculantes de la solución, y
- (d)
- eluir el factor VIII o el polipéptido de tipo factor VIII del soporte sólido.
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Tal y como se usa aquí, el término
"recombinante" se utiliza para describir ácidos nucleicos
alterados o manipulados de forma no natural, células huéspedes
modificadas con ácidos nucleicos exógenos, o polipéptidos
expresados de forma no natural, mediante la manipulación de ADN
aislado y la transformación de células huéspedes. Recombinante es un
término que se refiere específicamente a moléculas de ADN que se han
creado in vitro usando técnicas de ingeniería genética, y el
uso del término "recombinante" como adjetivo para describir
una molécula, constructo, vector, célula, polipéptido o
polinucleótido excluye específicamente tales moléculas, constructos,
vectores, células, polipéptidos o polinucleótidos de origen
natural.
El término "bacteriófago" se define como un
virus bacteriano que contiene un núcleo de ADN y una cubierta
protectora desarrollada mediante la agregación de varias moléculas
de proteína diferentes. Los términos "bacteriófago" y
"fago" se usan aquí de forma intercambiable.
El término "polipéptido de tipo factor
VIII" se utiliza para referirse a una forma modificada o
truncada de factor VIII natural o factor VIII recombinante completo,
cuyo polipéptido de tipo factor VIII retiene las propiedades
procoagulantes del factor VIII. Ejemplos de polipéptidos de tipo
factor VIII son aquellos fragmentos de factor VIII activo y
derivados de factor VIII descritos en las patentes de Andersson
et al., Toole, y Almsted et al. citadas arriba, todas
las cuales son incorporadas aquí como referencia. El término
"factor VIII objetivo" se usa a veces más adelante para hacer
referencia de forma colectiva al factor VIII y/o a los polipéptidos
de tipo factor VIII contenidos en una solución o corriente de
alimentación de producción.
El término "molécula de unión" según se
utiliza en este caso se refiere a cualquier molécula, polipéptido,
peptidomimético o célula transformada ("transformante") capaz
de formar un complejo de unión con otra molécula, polipéptido,
peptidomimético o transformante. Una "molécula de unión de factor
VIII" es una molécula de unión que forma un complejo con factor
VIII. Ejemplos específicos de moléculas de unión de factor VIII son
los polipéptidos descritos aquí (por ej., SEC ID Nos:
1-32) y los bacteriófagos que exhiben cualquiera de
estos polipéptidos. También se incluyen dentro de la definición de
moléculas de unión de factor VIII los polipéptidos derivados de o
que incluyen un polipéptido el cual tiene una secuencia de
aminoácidos según la fórmula I, II o III, anteriores, y aquellos
polipéptidos que se han modificado con fines particulares. Ejemplos
específicos de modificaciones contempladas son las sustituciones de
aminoácidos de C-terminal o
N-terminal o los alargamientos de cadenas de
polipéptidos para conectar la fracción de unión con un soporte
cromatográfico u otro sustrato, y las sustituciones de parejas de
residuos de cisteína que normalmente forman enlaces de bisulfuro,
por ejemplo con residuos de aminoácidos de origen no natural que
tienen cadenas laterales reactivas, para formar un enlace más
estable entre aquellas posiciones de aminoácidos que el enlace de
bisulfuro formador. Todas estas moléculas de unión modificadas
también se consideran moléculas de unión según esta invención
mientras que éstas retengan la capacidad de unir factor VIII y/o
polipéptidos de tipo factor VIII.
La presente invención hace posible la detección
altamente selectiva o la purificación de factor VIII y/o de
polipéptidos de tipo factor VIII en o de soluciones que las
contienen.
El factor VIII y los péptidos de tipo factor
VIII se pueden producir de cualquier modo conocido, incluyendo la
síntesis química; la producción en células huéspedes transformadas;
la secreción en medio de cultivo mediante células de origen natural
o bacterias, levaduras, hongos, células de insecto, y células
mamíferas transformados por recombinación; la secreción a partir de
organismos creados mediante ingeniería genética (por ej., mamíferos
transgénicos); o en fluidos biológicos o tejidos tales como sangre,
plasma, etc. La solución que contiene el factor VIII crudo como se
ha producido inicialmente (es decir, la solución de producción) se
denominará a veces "corriente de alimentación".
Todos los métodos para producir factor VIII (o
un polipéptido de tipo factor VIII) dan como resultado factor VIII
en una corriente de alimentación que contiene adicionalmente varias
impurezas (con respecto al factor VIII). Un objetivo de la presente
invención es producir ligandos de afinidad y preparaciones (tales
como medios cromatográficos) que comprenden estos ligandos los
cuales permiten la purificación rápida y altamente específica de
factor VIII de una corriente de alimentación en particular. Los
ligandos de afinidad de factor VIII obtenidos aquí se pueden
confeccionar para el aislamiento de factor VIII de una corriente de
alimentación en particular, bajo condiciones específicas
preseleccionadas. Si se usa un método de producción alternativa para
el factor VIII, produciendo una corriente de alimentación
diferente, puede ser necesario una colección diferente de ligandos
de afinidad para conseguir el mismo nivel de purificación. La nueva
colección de ligandos se puede obtener fácilmente siguiendo los
procedimientos perfilados aquí.
Las moléculas de unión de factor VIII de la
invención enlazan el factor VIII con una afinidad alta, comparable
a o superior a otras proteínas tales como anticuerpos conocidos por
enlazar factor VIII. Además, los ligandos de afinidad preferidos
descritos aquí liberan el factor VIII intacto y en forma activa
bajo condiciones de liberación específicas.
Las moléculas de unión de polipéptidos según la
presente invención se aislaron usando tecnología de exposición en
fago, de forma determinada para identificar péptidos de unión de
factor VIII que exhiben propiedades de unión y liberación
preseleccionadas particulares. Según esta metodología, se pueden
preseleccionar dos condiciones de solución, es decir, condiciones
de unión y condiciones de liberación. Las condiciones de unión son
un grupo de condiciones de solución bajo las cuales se desea que un
polipéptido de unión descubierto enlace el factor VIII objetivo (o
polipéptido de tipo factor VIII); las condiciones de liberación son
un grupo de condiciones de solución bajo las cuales se desea que un
polipéptido de unión descubierto no enlace el factor VIII (es decir,
se disocie del factor VIII). Las dos condiciones se pueden
seleccionar para satisfacer cualquier criterio del profesional, tal
como la facilidad de lograr las condiciones, la compatibilidad con
otras fases de purificación, costes reducidos a la hora de cambiar
de condiciones en comparación con otros medios de afinidad, etc.
Preferiblemente, las dos condiciones de solución se seleccionan de
manera que no afecte contrariamente a la estabilidad o actividad de
la proteína objetivo (factor VIII o polipéptido de tipo factor VIII)
y que no difiera significativamente con respecto a al menos un
parámetro de solución. Por ejemplo, a la hora de guiar la selección
de los péptidos de unión adecuados descritos aquí, se seleccionaron
ligantes que disociaban del objetivo en presencia de un tampón con
contenido de etilenoglicol, o condiciones a pH inferior (es decir, a
pH 2), o combinaciones de estas condiciones, que diferían de las
condiciones empleadas para la unión. Otro parámetro que podría
variarse de forma ventajosa es la concentración de una sal, por
ejemplo NaCl, en los tampones de unión y elución.
Conjuntamente con la selección de condiciones de
solución específicas para la unión y liberación deseadas del factor
VIII, se selecciona un dominio de unión parental para servir como
molde estructural para las moléculas de unión creadas mediante
ingeniería genética que muestre las capacidades de unión y
liberación deseadas. El dominio de unión puede ser una proteína de
origen natural o sintético, o una región o dominio de una proteína.
El dominio de unión parental se puede seleccionar en base al
conocimiento de una interacción conocida entre el dominio de unión
parental y el factor VIII, pero éste no es critico. De hecho, no es
en absoluto esencial que el dominio de unión parental tenga alguna
afinidad con el factor VIII: su objetivo es proporcionar una
estructura a partir de la cual se puedan generar una pluralidad de
análogos (una "biblioteca"), incluyendo esta pluralidad de
análogos uno o más análogos que muestren la unión y las propiedades
de liberación deseadas (y cualquier otra propiedad seleccionada).
Las condiciones de unión y las condiciones de liberación discutidas
anteriormente se pueden seleccionar con conocimiento del
polipéptido exacto que servirá como dominio de unión parental, o
con conocimiento de una clase de proteínas o dominios a los cuales
pertenece el dominio de unión parental, o de forma completamente
independiente de la elección del dominio de unión parental. De
forma similar, las condiciones de unión y/o de liberación se pueden
seleccionar teniendo en cuenta las interacciones conocidas entre un
dominio de unión y el factor VIII, por ej., para favorecer la
interacción bajo una o ambas condiciones de solución, o éstas se
pueden seleccionar sin tomar en consideración estas interacciones
conocidas. Asimismo, el dominio de unión parental se puede
seleccionar teniendo en cuenta o no las condiciones de unión y/o
liberación, aunque se debe reconocer que si los análogos de dominio
de unión son inestables bajo las condiciones de unión o liberación,
no se pueden obtener moléculas de unión útiles.
La parte madura del dominio de unión parental
influye inmensamente en las propiedades de los péptidos derivados
(análogos) que se analizarán en contra de la molécula de factor
VIII. A la hora de seleccionar el dominio de unión parental, la
consideración más importante es cómo se presentarán los dominios
análogos al factor VIII, es decir, en qué conformación entrarán en
contacto el factor VIII y los análogos. En las formas de
realización preferidas, por ejemplo, los análogos se generarán
mediante la inserción de codificación de ADN sintético que codifica
el análogo en un paquete replicable genético, dando como resultado
una muestra del dominio en la superficie de un microorganismo, tal
como el fago M13, usando técnicas como se describe, por ej., en Kay
et al., Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory
Manual, (Academic Press, Inc.; San Diego 1996) y en la patente
estadounidense U.S. Nº. 5.123.409 (Ladner et al.).
Para la formación de bibliotecas de exposición
en serie, se prefiere usar polipéptidos estructurados como molde de
dominio de unión, en contraposición a péptidos lineales no
estructurados. La mutación de residuos de superficie en una proteína
tendrá normalmente poco efecto en la estructura global o las
propiedades generales (tales como el tamaño, la estabilidad, y la
temperatura de desnaturalización) de la proteína; aunque al mismo
tiempo la mutación de residuos de superficie puede afectar
profundamente a las propiedades ligantes de la proteína. Cuanto más
fuertemente se constriña un segmento peptídico, menos
probabilidades habrá de que se una con cualquier objetivo en
particular. Si se une, no obstante, la unión será probablemente más
correcta y más específica. De este modo, se prefiere seleccionar un
dominio de unión parental y, sucesivamente, una estructura para los
análogos de polipéptido, la cual se constriñe dentro de una
estructura que tiene algún grado de rigidez.
Preferiblemente el dominio de proteína que se
usa como molde o dominio parental para generar la biblioteca de
análogos de dominio será una proteína pequeña o un polipéptido. Las
proteínas pequeñas o los polipéptidos ofrecen varias ventajas sobre
las proteínas grandes: En primer lugar, la masa por sitio de unión
se reduce. Los dominios de proteína altamente estables que tienen
pesos moleculares bajos, por ej., los dominios Kumitz (\sim7
kDa), los dominios Kazal (\sim7 kDa), los dominios del inhibidor
de tripsina de Cucurbita máxima (CMTI) (\sim3.5 kDa), y la
endotelina (\sim2 kDa), pueden mostrar una unión mucho mayor por
gramo que los anticuerpos (150 kDa) o los anticuerpos monocatenarios
(30 kDa). En segundo lugar, la posibilidad de unión no específica
se reduce porque hay menos superficie disponible. En tercer lugar,
las proteínas pequeñas o los polipéptidos se pueden crear mediante
ingeniería genética con el fin de tener sitios de enlace únicos de
una manera impracticable para las proteínas más grandes o los
anticuerpos. Por ejemplo, las proteínas pequeñas se pueden crear
mediante ingeniería genética con el fin de tener lisinas solamente
en sitios adecuados para el enlace (por ej., en una matriz
cromatográfica), pero esto no lo pueden hacer los anticuerpos. En
cuarto lugar, es más posible que una estructura de polipéptido
constreñida retenga su funcionalidad al transferirse junto con el
dominio estructural intacto de una estructura a otra. Por ejemplo,
es probable que la estructura de dominio de unión se transfiera de
la estructura usada para la presentación en una biblioteca (por
ej., visualizada en un fago) a una proteína aislada eliminada de la
estructura de presentación o inmovilizada en un sustrato
cromatográfico.
Se considera que la inmovilización de los
polipéptidos según la invención, por ej., sobre matrices
cromatográficas, forma medios de separación de factor VIII eficaces
para soluciones tales como la sangre total o medios de cultivo
acondicionados que contienen factor VIII segregado de una célula
huésped transformante. Seleccionando moldes de dominio de unión
apropiados, se pueden aislar los polipéptidos de unión que tienen
una única cisteína libre (no transmitida con otra cisteína que
normalmente forma un enlace de bisulfuro). Tales polipéptidos
tio-funcionales se pueden usar para inmovilizar
sustratos de forma altamente estable mediante la formación de un
tioéter con yodoacetamida, ácido yodoacético, o grupos de ácido
carboxílico similares al \alpha-yodo.
De forma similar, el grupo carboxilo
C-terminal del dominio de polipéptido se puede
convertir en una hidracida (-NH-NH_{2}), para la
reacción con un sustrato aldehído-funcional u otro
sustrato amino-reactivo. Esta técnica se
prefiere.
Hay muchos dominios de proteína pequeños y
estables adecuados para su uso como dominios de unión parentales y
para los cuales está disponible la siguiente información útil: (1)
secuencia de aminoácidos, (2) secuencias de varios dominios
homólogos, (3) estructura tridimensional, y/o (4) datos de
estabilidad sobre un rango de pH, temperatura, salinidad, solvente
orgánico, concentración oxidante. Algunos ejemplos son: dominios
Kunitz (58 aminoácidos, 3 enlaces bisulfuro), dominios del inhibidor
de tripsina de Cucurbita máxima (31 aminoácidos, 3 enlaces
bisulfuro), dominios relacionados con la guanilina (14 aminoácidos,
2 enlaces bisulfuro), dominios relacionados con el IA de
enterotoxina termoestable de bacterias gram negativas (18
aminoácidos, 3 enlaces bisulfuro), dominios EGF (50 aminoácidos, 3
bandas bisulfuro), dominios Kringle (60 aminoácidos, 3 enlaces
bisulfuro), dominios de unión de carbohidrato fúngico (35
aminoácidos, 2 enlaces bisulfuro), dominios de endotelina (18
aminoácidos, 2 enlaces bisulfuro), y el dominio de unión de IgG
Estreptocócico G (35 aminoácidos, ningún enlace bisulfuro). Muchos,
pero no la totalidad de estos, contienen enlaces bisulfuro que
mantienen y estabilizan la estructura. El dominio de unión parental
también puede basarse en un bucle único (un bisulfuro) de una
microproteína homóloga o no a un dominio de proteína conocido. Por
ejemplo, los bucles constreñidos de los aminoácidos del 7 al 9 se
usaron para formar bibliotecas con el fin de aislar factor VIII y
moléculas de unión de polipéptidos de tipo factor VIII, como se
describe más adelante. Las bibliotecas basadas en estos dominios,
preferiblemente visualizados en fago, se pueden construir
fácilmente y usar para la selección de moléculas de unión según esta
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez se ha seleccionado un dominio de unión
parental, se crea una biblioteca de moléculas de unión potenciales
para seleccionar en contra de un objetivo, en este caso factor VIII
y/o proteínas de tipo factor VIII, bajo las condiciones de unión
deseadas y (opcionalmente) las condiciones de elución (liberación)
deseadas. La biblioteca se crea haciendo una serie de análogos,
correspondiendo cada análogo con el dominio de unión parental
excepto por tener una o más sustituciones de aminoácidos en la
secuencia de aminoácidos del dominio. Se prevé que las
sustituciones de aminoácidos alteren las propiedades de unión del
dominio sin alterar significativamente su estructura, al menos para
la mayoría de sustituciones. Se prefiere que las posiciones de
aminoácidos que se seleccionan para la variación (posiciones de
aminoácidos variables) sean posiciones de aminoácidos
superficiales, es decir, posiciones en la secuencia de aminoácidos
de los dominios que, cuando el dominio es una conformación estable
en su mayor parte, aparecen en la superficie externa del dominio
(es decir, la superficie expuesta a la solución). De la forma más
preferible las posiciones de aminoácidos que se van a variar serán
contiguas o cercanas, para maximizar el efecto de las sustituciones.
Además, se pueden añadir aminoácidos extra en la estructura del
dominio de unión parental. En formas de realización preferidas,
especialmente donde está disponible una gran cantidad de
información en lo que se refiere a las interacciones de factor VIII
con otras moléculas, en particular el dominio de unión parental,
las posiciones de aminoácidos esenciales para las interacciones de
unión se determinarán y conservarán en el proceso de construcción
de la biblioteca análoga (es decir, no se variarán los aminoácidos
esenciales para la unión).
El objetivo de crear la biblioteca análoga es
proporcionar un número muy grande de moléculas de unión potenciales
para la reacción con la molécula de factor VIII, y en general
cuanto mayor sea el número de análogos en la biblioteca, mayor será
la probabilidad de que al menos un elemento de la biblioteca se
enlace con el factor VIII y se libere bajo condiciones
preseleccionadas o deseables para la liberación. Las bibliotecas
diseñadas siguiendo una estructura de molde en particular y
limitándose a la diversificación de aminoácidos en posiciones
particulares son muy preferidas, puesto que una única biblioteca
puede abarcar todos los análogos diseñados y las secuencias
incluidas se conocerán y presentarán en números más o menos iguales.
En contraste, la sustitución aleatoria en sólo seis posiciones en
una secuencia de aminoácidos proporciona alrededor de 60 millones
de análogos, lo cual es un tamaño de biblioteca que empieza a
presentar limitaciones prácticas incluso al utilizar técnicas de
selección tan fiables como la exposición en fago. Bibliotecas más
grandes que ésta plantearán problemas en su manipulación, por ej.,
los vasos de fermentación necesitarían tener un tamaño
extraordinario, y más importante aún, la probabilidad de contener
todas las variaciones de secuencia polipeptídica planificadas
representadas en la biblioteca preparada se reducirían enormemente.
En consecuencia se prefiere crear una biblioteca diseñada o
parcial, en la cual las posiciones de aminoácidos designadas para la
variación estén consideradas de tal manera que maximicen el efecto
de la sustitución en las características de unión del análogo, y
los residuos de aminoácidos asignados o planificados para su uso en
sustituciones estén limitados, por ej., basándose en que es probable
que estos causen una unión del análogo bajo las condiciones de
solución en las cuales se seleccionarán ligantes en la
biblioteca.
Como se ha indicado previamente, las técnicas
expuestas en Kay et al., supra, y Ladner et
al. U.S. 5.223.409 son particularmente útiles en la preparación
de una biblioteca de análogos correspondiente a un dominio de unión
parental seleccionado, cuyos análogos se presentarán en una forma
adecuada para la selección a gran escala de grandes números de
análogos con respecto a una molécula de factor VIII objetivo. El uso
de paquetes genéticos replicables, y de la forma más preferible
bacteriófagos, es un método fiable para generar nuevas entidades de
unión de polipéptidos que implica introducir un segmento de ADN
exógeno nuevo en el genoma de un bacteriófago (u otro paquete
genético amplificable) de manera que el polipéptido codificado por
el ADN no nativo aparece en la superficie del fago. Cuando el ADN
insertado contiene diversidad de secuencia, cada fago receptor
muestra una variante de la secuencia de aminoácidos del molde
(parental) codificada por el ADN, y la población (biblioteca) del
fago muestra un gran número de secuencias de aminoácidos diferentes
pero relacionadas.
En un procedimiento de selección para obtener de
factor VIII según esta invención, una biblioteca de fago se pone en
contacto con y se le asigna unirse a una molécula de factor VIII
objetivo, normalmente inmovilizada en un soporte sólido. Los no
ligantes se separan de los ligantes. De diferentes maneras, los
fagos enlazados se liberan del factor VIII, se recogen y se
amplifican. Como el fago se puede amplificar a través de la
infección de células bacterianas, incluso unos pocos fagos de unión
son suficientes para revelar la secuencia genética que codifica una
entidad de unión. Usando estas técnicas es posible recuperar un
fago de unión que sea aproximadamente 1 de 20 millones en la
población. Una o más bibliotecas, mostrando cada una
10-20 millones o más de polipéptidos de unión
potenciales, se pueden seleccionar rápidamente para encontrar
ligantes de factor VIII de alta afinidad. Cuando funciona el
proceso de selección, la diversidad de la población cae con cada
ronda hasta que sólo quedan ligantes buenos, es decir, el proceso
converge. Normalmente, una biblioteca de exposición en fago contiene
algunos ligantes estrechamente relacionados (de 10 a 50 ligantes
entre 10 millones). Las indicaciones de convergencia incluyen una
mayor unión (medida mediante títulos de fago) y una recuperación de
secuencias estrechamente relacionadas. Después de identificar una
primera serie de péptidos de unión, la información de secuencia se
puede usar para diseñar otras bibliotecas parciales para elementos
que tienen propiedades deseadas adicionales; por ej.,
discriminación entre factor VIII y fragmentos particulares o
impurezas estrechamente relacionadas en una corriente de
alimentación en particular.
Tales técnicas hacen posible no sólo seleccionar
un gran número de moléculas de unión potenciales sino que hacen
práctico repetir los ciclos de unión/elución y construir
bibliotecas parciales secundarias para seleccionar paquetes que se
muestren análogos que cumplan los criterios iniciales. Usando estas
técnicas, se puede seleccionar una biblioteca parcial análoga para
revelar elementos que enlacen con fuerza (es decir, con afinidad
alta) bajo las condiciones de selección.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo los procedimientos perfilados
anteriormente, se pueden aislar moléculas de unión adicionales para
el factor VIII y/o los polipéptidos de tipo factor VIII de las
bibliotecas de exposición en fago descritas aquí en otras
bibliotecas de exposición en fago o colecciones de moléculas de
unión potenciales (por ej., bibliotecas combinatorias de compuestos
orgánicos, bibliotecas péptidas aleatorias, etc.). Una vez aisladas,
se puede analizar la secuencia de cualquier péptido de unión
individual o la estructura de cualquier molécula de unión, y se
puede producir el ligante en cualquier cantidad deseada usando
métodos conocidos. Por ejemplo, las moléculas de unión de
polipéptidos descritas aquí, puesto que se conocen sus secuencias,
se pueden producir ventajosamente mediante síntesis química seguida
del tratamiento bajo condiciones oxidantes apropiadas para obtener
la conformación nativa, es decir, los enlaces de uniones de
bisulfuro correctos. La síntesis se puede realizar mediante
metodologías bien conocidas por los expertos en la técnica (véase,
Kelley et al. en Genetic Engineering Principles and Methods,
(Setlow, J.K., ed.), Plenum Press, NY., (1990) vol. 12, pp.
1-19; Stewart et al.,
Solid-Phase Peptide Synthesis (1989), W.H. Freeman
Co., San Francisco). Las moléculas de unión de la presente
invención se puede obtener bien por síntesis química o por
semisíntesis. La síntesis química o los métodos de semisíntesis
permiten la posibilidad de incorporar residuos aminoácidos de
origen no natural.
Las moléculas de unión de polipéptidos de la
presente invención se preparan preferiblemente usando la síntesis
péptida de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149
(1963); Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5132 (1985)). La
síntesis de fase sólida comienza en el
carboxi-terminal del polipéptido putativo acoplando
un aminoácido protegido a una resina adecuada, la cual reacciona
con el grupo carboxi del aminoácido C-terminal para
formar un enlace que se dividirá fácilmente más tarde, tal como una
resina de halometilo, p. ej., resina de clorometilo y resina de
bromometilo, resina de hidroximetilo, resina de aminometilo, resina
de benzhidrilamina, o resina de
t-alquiloxicarbanil-hidracida.
Después de eliminar el grupo de protección de
\alpha-amino con, por ejemplo, ácido
trifluoroacético (TFA) en cloruro de metileno y neutralizarlo en,
por ejemplo, TEA, está todo preparado para proceder con el
siguiente ciclo en la síntesis. El \alpha-amino
restante y, si es necesario, los aminoácidos protegidos de la cadena
lateral, se acoplan entonces en secuencia en el orden deseado
mediante condensación para obtener un compuesto intermedio
conectado a la resina. De forma alternativa, algunos aminoácidos se
puede acoplar a otro formando un oligopéptido antes de añadir el
oligopéptido a la cadena de polipéptido de fase sólida en
crecimiento.
La condensación entre dos aminoácidos, o un
aminoácido y un péptido, o un péptido y un péptido se puede llevar
a cabo según los métodos de condensación usuales tales como el
método de azida, el método de anhídrido de ácido mezclado, el método
de DCC (diciclohexilcarbodiimida), el método de éster activo
(método de éster de p-nitrofenilo, el método de BOP
[hexafluorofosfato de fosfonio de
benzotriazol-1-il-oxi-tris
(dimetilamino)], el método de éster de imido de ácido
N-hidroxisuccínico), y el método K reactivo de
Woodward.
Es común en la síntesis química de péptidos la
protección de los grupos reactivos de cadenas laterales de las
diferentes fracciones de aminoácidos con grupos de protección
adecuados en el sitio hasta que el grupo se elimine en última
instancia después de haberse unido la cadena completamente. También
es común la protección del grupo de \alpha-amino
en un aminoácido o un fragmento mientras que esta entidad reacciona
en el grupo carboxilo seguido de la eliminación selectiva del grupo
\alpha-amino protector para permitir a una
reacción posterior tener lugar en esta ubicación. Por consiguiente,
es común que, como una de las fases en la síntesis, se produzca un
compuesto intermedio que incluya cada uno de los residuos de
aminoácidos localizados en la secuencia deseada en la cadena de
polipéptidos con varios de estos residuos que tienen grupos de
protección de cadena lateral. Normalmente estos grupos de protección
se eliminan después de forma sustancial al mismo tiempo para
producir el producto deseado resultante de la siguiente
purificación.
Los grupos protectores típicos para proteger los
grupos de cadena lateral de \alpha- y
\varepsilon-amino se ejemplifican mediante
benciloxicarbonilo (Z), isonicotiniloxicarbonilo (iNOC),
O-clorobenziloxicarbonilo [Z(NO_{2})], p-
metoxibenziloxicarbonilo [Z(OMe)],
t-butoxicarbonilo (Boc),
t-amiioxicarbonilo (Aoc), isobomiloxicarbanilo,
adamatiloxicarbonilo,
2-(4-bifenilo)-2-prapiloxicarbonilo
(Bpoc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc),
metilsulfoniietboxicarbonilo (Msc), trifluoroadetilo, ftalilo,
formilo, 2-nitrofeailsulfenilo (NPS),
difenilfosfinotioilo (Ppt), dimetilofosfinotioilo (Mpt), y
similares.
Como grupos protectores para el grupo carboxi se
pueden ejemplificar, por ejemplo, el éster de bencilo (OBzl), el
éster de ciclohexilo (Chx), el éster de
4-nitrobenzilo (ONb), el éster de
t-butilo (Obut), el éster de 4 piridilmetilo (OPic),
y similares. Es deseable que aminoácidos específicos tales como
arginina, cisteína, y serina que poseen un grupo funcional
diferente de los grupos amino y carboxilo se protejan mediante un
grupo protector adecuado según requiera la ocasión. Por ejemplo, el
grupo de guanidino en arginina se puede proteger con nitro,
p-toluenesulfonilo, benciloxicarbonilo,
adamantiloxicarbonilo, p- metoxibencenosulfonilo,
4-metoxi-2,6-dimetilbenzenosulfonilo
(Mds), 1,3,5-trimetilfenisulfonilo (Mts), y
similares. El grupo de tiol en cisteína se puede proteger con
p-metoxibenzilo, trifenilmetilo, etilcarbamoilo de
acetilaminometilo, 4-metilbenzilo,
2,4,6-trimeti-benzilo (Tmb), etc., y
el grupo hidroxilo en la serina se puede proteger con bencilo, t-
butilo, acetilo, tetrahidropiranilo, etc.
Después de haberse completado la secuencia de
aminoácidos deseada, el polipéptido intermedio se elimina del
soporte de resina mediante un tratamiento con un reactivo, tal como
líquido HF y uno o más destructores que contengan tio, los cuales no
sólo separan el polipéptido de la resina, sino que también separan
todos los grupos protectores de cadena lateral restantes. Tras la
ruptura de HF, se lava la secuencia de proteínas con éter, se
transfiere a un volumen grande de ácido acético diluido, y se agita
a un pH ajustado a aproximadamente 8.0 con hidróxido amónico. En el
ajuste de pH, el polipéptido toma su disposición conformacional
deseada.
Los polipéptidos según la invención también los
pueden preparar a nivel comercial compañías que proporcionen
síntesis de polipéptidos como servicio (por ej., BACHEM Bioscience,
Inc., King of Prussia, PA; Quality Controlled Biochemicals, Inc.,
Hopkinton, MA).
\vskip1.000000\baselineskip
Para detectar factor VIII y/o polipéptidos de
tipo factor VIII en una solución tal como sangre o medios
acondicionados donde se crea que los contengan, se puede marcar una
molécula de unión según la invención de forma detectable, por ej.,
por radiomarcación o marcación enzimática, después ponerla en
contacto con la solución, y después de eso se puede detectar la
formación de un complejo entre la molécula de unión y el factor VIII
objetivo. Una molécula de unión de fago según la invención, es
decir, un fago recombinante que muestra un polipéptido ligante de
factor VIII en su superficie, puede formar un complejo con factor
VIII y/o polipéptidos de tipo factor VIII detectable como un
sedimento en un tubo de reacción, el cual se puede detectar
visualmente después de precipitarse o centrifugarse.
De forma alternativa, se puede usar un ensayo de
tipo sándwich, donde se inmoviliza una molécula de unión de factor
VIII en un soporte sólido tal como un tubo de plástico o un
pocillo, o una matriz cromatográfica tal como perlas de sefarosa,
después se pone en contacto la solución que se cree contiene el
factor VIII objetivo con la molécula de unión inmovilizada, se
lavan y se retiran los materiales no vinculantes, y se detecta el
factor VIII o los polipéptidos de tipo factor VIII del complejo
usando un reactivo de detección adecuado, tal como un anticuerpo
monoclonal, reconociendo el factor VIII objetivo, siendo detectable
el reactivo mediante algunos medios convencionales conocidos en la
técnica, incluyendo marcarlos de forma detectable, por ej., por
radiomarcado o marcado enzimático, como por ejemplo con peroxidasa
de rábano y similares.
Las moléculas de unión según esta invención
serán extremadamente útiles para aislar el factor VIII y/o los
polipéptidos de tipo factor VIII mediante métodos de cromatografía
de afinidad. Se puede emplear cualquier método convencional de
cromatografía. Preferiblemente, se inmovilizará un ligando de
afinidad de la invención en un soporte sólido adecuado, por ej.,
para embalar una columna de cromatografía. El ligando de afinidad
inmovilizado se puede cargar o poner en contacto entonces con una
corriente de alimentación bajo condiciones favorables para la
formación de la molécula de unión/complejos de factor VIII (o
polipéptido de tipo factor VIII). Los materiales no vinculantes se
pueden lavar y retirar, después se puede eluir el factor VIII (o
polipéptido de tipo factor VIII) introduciendo condiciones de
solución que favorezcan la disociación del complejo de unión.
De forma alternativa, la cromatografía por lotes
se puede llevar a cabo mezclando una solución que contiene el
factor VIII objetivo y la molécula de unión, y después aislando
complejos del factor VIII objetivo y de las moléculas de unión. Para
este tipo de separación, se conocen muchos métodos. Por ejemplo, se
puede inmovilizar la molécula de unión en un soporte sólido, y
después separarla de la corriente de alimentación con el factor
VIII objetivo mediante filtración. O se puede modificar la molécula
de unión con su propia marca de afinidad, tal como una cola de
poliHis, la cual se puede usar para enlazar el ligante después de
que los complejos se hayan formado usando una cromatografía de
afinidad por metal inmovilizado. Una vez separado, el factor VIII
objetivo se puede liberar de la molécula de unión bajo condiciones
de elución y recuperarlo en forma pura.
Se debe observar que aunque se preseleccionaron
condiciones de unión precisas a la hora de obtener los polipéptidos
de unión de factor VIII descritos aquí, el uso posterior en la
purificación de afinidad puede revelar una unión más óptima y
condiciones de liberación bajo las cuales operará el mismo ligando
de afinidad aislado. De este modo, no es fundamental que la
molécula de unión, después del aislamiento según esta invención, se
emplee siempre solamente en las condiciones de unión y de liberación
que llevan a su separación de la biblioteca.
El aislamiento de moléculas de unión de factor
VIII conforme a esta invención se ilustrará adicionalmente más
adelante. Los parámetros específicos incluidos en los siguientes
ejemplos se destinan a ilustrar la práctica de la invención, y de
ninguna manera se presentan con el fin de limitar el alcance de la
invención.
Las técnicas anteriormente descritas se
emplearon para aislar moléculas de unión de afinidad alta para
ligandos para polipéptidos de tipo factor VIII producidos de forma
recombinante que consisten en dos segmentos de factor VIII humano,
es decir, los aminoácidos 1- 743 y 1638 a 2332 del factor VIII
humano, como se describe en la patente estadounidense U.S. Nº.
5.661.008 (Almstedt et al.), obtenidos según la designación
comercial de REFACTO® del Genetics Institute, Inc. (Cambridge, MA).
El REFACTO® objeto se proporcionó en una concentración de
aproximadamente 530 \mug/ml (7800 IU/ml) en 19.4 mM de His, 300
mM de NaCl, 3.4 mM de CaCl_{2} y 0.1% de Tween 80, a pH 7.0.
Tres bibliotecas, designadas TN7 (5 x 10^{9}
de diversidad de secuencia de aminoácidos), TN8 (6 x 10^{9} de
diversidad de secuencia de aminoácidos), y TN9 (5 x 10^{9} de
diversidad de secuencia de aminoácidos), se construyeron para la
expresión de polipéptidos diversificados en el fago M13. Se
seleccionaron los ligantes de cada biblioteca para el REFACTO®
purificado. Cada una de las bibliotecas se construyó para exponer
una microproteína basada en un molde de 11 o 12 aminoácidos. La
biblioteca TN7 utilizó una secuencia de molde de Xaa-
Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa
(SEC ID No: 33); la biblioteca TN8 utilizó una secuencia de molde de
Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa
(SEC ID No: 34); la biblioteca TN9 utilizó una secuencia de molde
de Xaa-Cys-
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa
(SEC ID No: 35).
Para cada biblioteca se realizaron tres ciclos
de selección. En la conclusión de la tercera ronda de selección se
propagaron los fagos eluidos, y cada uno de los aislados de cada
biblioteca (96 por condición de elución) se seleccionaron
aleatoriamente y evaluaron mediante técnicas ELISA estándar para la
unión al factor VIII objetivo. Los fagos unidos se detectaron con
el anticuerpo policlonal anti-M13 conjugado con HRP
(Pharmacia). El sustrato de peroxidasa TMB se usó para el HRP en el
mecanismo de detección ELISA. El sustrato de TMB produce un color
azul después de la digestión de peroxidasa. El color se cuantifica
mediante absorbencia en OD_{630}. Los aislados de fago que
proporcionaron una señal significante (OD_{630}> 0.25) de los
antecedentes anteriores se consideraron clones positivos. Se
realizó la secuenciación del ADN de estos aislados para identificar
el péptido visualizado.
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos
visualizados se dedujeron de las secuencias de ADN obtenidas. Los
datos de secuencia de los aislados de fago fueron reagrupados por
la biblioteca y clasificados según el grado de similitud. La
frecuencia en la cual se obtuvo cualquier secuencia dada se anotó
ya que ésta indica la selección de un ligante específico. Los
aislados de fago que tienen el mismo péptido de visualización se
encontraron presentes en las poblaciones de fago obtenidas mediante
ambos métodos de elución.
\newpage
En base a los datos presentados anteriormente,
se seleccionaron y sintetizaron nueve péptidos para su
inmovilización en un material matricial de afinidad. Los péptidos
sintetizados se exponen en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos de afinidad de la Tabla 4 se
identifican, en el orden de arriba, con las SEC ID Nos:
36-44.
Los nueve péptidos de afinidad ejemplificados se
produjeron mediante métodos sintéticos de fase sólida tradicionales
como se ha descrito anteriormente. Para facilitar la inmovilización
en un soporte sólido, se incorporó una región enlazadora corta
funcional de siete aminoácidos de hidracida
(-PGPEGGGS-NHNH_{2}; SEC ID No: 45) en el
carboxi-terminal de siete de los péptidos (véase la
Tabla 4). Se usó un enlazador de inmovilización alternativo con dos
de los péptidos (GI-1 y GI-2 en la
Tabla 4), es decir, -PEGGGSK; (SEC ID No: 46), exponiendo un
C-terminal de lysinc para la inmovilización y un
amino-término acetilado.
\newpage
Los ligandos candidatos se inmovilizaron sobre
una resina cromatográfica de
etilenoglicol-metacilato sustituido con formilo
(Toyopearl Formyl 650-M, tamaño de poro de
\sim1000\ring{A}; TosoHaas, Montgomeryville, PA). Los péptidos
que contienen hidracida se inmovilizaron facilitando la formación
de enlace de hidrazono, los péptidos GI-1 y -2 se
inmovilizaron mediante aminación reductiva usando NaCNBH_{3}. La
cantidad de polipéptidos inmovilizados en el soporte sólido se
determinó cuantificando la cantidad de polipéptidos libres restante
en la solución. La cantidad de ligandos inmovilizados por ml de
resina estuvo en el rango de 0.7-1.5 \mumol para
los péptidos inmovilizados de hidracina.
Los nueve péptidos se evaluaron mediante
cromatografía de afinidad por su capacidad para capturar el
REFACTO® descrito en el Ejemplo I, bajo un enlace específico y
condiciones de liberación. Los tampones usados en estas evaluaciones
se exponen en la Tabla 5.
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\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido enlazante de factor VIII
(REFACTO®) se diluyó en el Tampón SP en una concentración de 150
\mug/ml. Las resinas de afinidad (-350 \mul) se embalaron cada
una en columnas de vidrio, y aproximadamente 150 \mug del factor
VIII objetivo se aplicó a las columnas de afinidad preparadas a una
velocidad de flujo de 200 \mul/minuto (velocidad lineal de 170
cm/hora). El material unido se eluyó consecutivamente con los
tampones tal y como se muestra en la Tabla 5, y la elución de
proteínas se supervisó mediante absorbencia UV a 280 nm. Las
fracciones se recogieron y la masa y la actividad del polipéptido
de tipo factor VIII recuperado se determinó mediante HPLC de fase
inversa y mediante ensayo enzimático.
Para la determinación de la masa, se generó una
curva estándar con REFACTO® (0-200 \mug) y la
cantidad presente en cada fracción se calculó según técnicas bien
conocidas en la materia. Se usó HPLC de fase inversa en presencia de
20 mM de EDTA para disgregar la molécula de REFACTO® en sus
subunidades de componente, las cuales se eluyeron con un gradiente
de acetonitrilo/0.01% de TFA. El ensayo de actividad fue un ensayo
basado en los Factores IX y X. Los resultados para cada resina de
afinidad se exponen abajo (Tabla 6).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En general, la cantidad total de factor VIII
objetivo recuperado después de la cromatografía sobre los nueve
ligandos estuvo en el rango de 40-67%. Los ligandos
de polipéptidos CS-453; CS-454;
CS-456, y CS-459 capturaron
prácticamente todo el factor VIII objetivo aplicado, con material
ligante eluido en presencia de etilenoglicol. No se encontró
actividad en el eluyente de pH 2, en consecuencia se asumió que
ninguno de los objetivos restantes se unió al ligando. La
incapacidad de las resinas CS-455 y GI- 1 de
capturar el objetivo se puede deber a la degradación o inestabilidad
del péptido o a la baja densidad del ligando en el soporte.
Los experimentos se llevaron a cabo con el fin
de demostrar que los ligandos de polipéptido inmovilizados del
Ejemplo II enlazan y liberan factor VIII humano nativo (nhfVIII)
bajo condiciones similares y con rendimientos similares a los
observados con el polipéptido de tipo factor VIII REFACTO®.
Para estos experimentos, el nhfVIII se obtuvo
del American Diagnostica, Inc. (Greenwich, CT; product #408 nat) en
forma de un polvo liofilizado con agentes estabilizantes. El
nhfVIII se reconstruyó según las instrucciones del fabricante en un
tampón reconstituyente (72 mM de NH4 OAc, a pH 6.3, 360 mM de NaCl,
0.04% de Tween 80 (Tampón 1).
Un kit comercial ELISA (IMUBIM) fVIII ELISA kit,
Product #884, American, Inc., (Greenwich, CT) desarrollado para
detectar factor VIII se usó según las especificaciones del
fabricante con el fin de detectar los objetivos tanto del REFACTO®
como de nhfVIII. El kit utiliza un ensayo de sándwich ELISA en el
cual el objetivo se captura con un anticuerpo monoclonal
inmovilizado y el objetivo capturado se detecta con un segundo
conjugado de peroxidasa monoclonal de anticuerpo de rábano (HRP). La
adición del sustrato de peroxidasa y su reacción posterior con el
HRP produce un color azul (detectado a 630 nm) que cambia a
amarillo (detectado a 450 nm) al añadir los 0.5N de solución de
parada
de ácido sulfúrico. La respuesta de color se calibra con estándares de factor VIII proporcionados por el fabricante.
de ácido sulfúrico. La respuesta de color se calibra con estándares de factor VIII proporcionados por el fabricante.
La unión de REFACTO® se evaluó en el Tampón 1.
La unión de ambos RFFACTO® y nfhVIII se evaluó usando tres resinas
de afinidad preparadas como en el Ejemplo II, usando los péptidos
de afinidad CS-454, CS-456, y
CS-458 inmovilizados en un medio de Toyopearl
Formil 650-M. La densidad de ligando para cada
polipéptido fue de 1.79 mg/ml (0.67 \mumol/ml), 3.69 mg/ml (1.43
\mumol/ml) y 3.15 mg/ml (1.17 \mumol/ml) respectivamente.
Para cada uno de los tres péptidos inmovilizados
evaluados, las perlas de péptido de 200 ml de una pasta al 50% de
una suspensión de polipéptido acoplado con Toyopcarl se
centrifugaron brevemente (30 segundos a 2000 x g a temperatura
ambiente), el fluido sobrenadante se eliminó, y las perlas
(granulados) se lavaron dos veces. En cada lavado, las perlas se
resuspendieron en 500 \mul del Tampón 1 y se centrifugaron como
antes.
La solución madre de REFACTO® se diluyó a una
concentración final de 200 U/ml en el Tampón 1 y se añadieron 250
\mul de la solución diluida (\sim50 U total) a un granulado
lavado de cada una de las perlas de péptido. La suspensión se incubó
en un mezclador
extremo-sobre-extremo a RT durante
una hora, después de este periodo de unión se granularon las perlas
mediante centrifugado (30 segundos, 2000 x g) y las soluciones
sobrenadantes, que representaban la fracción no unida ("No
unido" en la Tabla 7, abajo), se apartaron y retuvieron para un
ensayo de actividad de factor VIII no enlazado.
Las perlas granuladas se lavaron una vez
añadiendo 250 \mul del Tampón 1, se mezclaron brevemente y la
suspensión se centrifugó como antes. Las soluciones sobrenadantes
("Lavado" en la Tabla 7) se eliminaron y retuvieron para un
ensayo de actividad de factor VIII.
Los granulados lavados se resuspendieron en 250
\mul del Tampón A (20 mM de
L-Histidina-HCl, 250 mM de NaCl, 20
mM de CaCl_{2}, 0.01% de Tween 80, 50% de etilenoglicol, pH 6.3) y
se incubaron en un mezclador
extremo-sobre-extremo durante 15
minutos a temperatura ambiente. Al final del periodo de elución, las
suspensiones se centrifugaron corno se describe arriba. Las
soluciones sobrenadantes ("Eluato" en la tabla 7) se
eliminaron y retuvieron para un ensayo de actividad de factor VIII
eluido.
La solución inicial (diluida) de REFACTO®
(Insumo) y cada muestra (No unido, Lavado y Eluato) tomada como se
ha descrito anteriormente se diluyeron a 1:1400 en Diluyente de
Ensayo (proporcionado en el kit), después se sometieron a ELISA
usando el kit de ensayo comercial de factor VIII. La Tabla 7 resume
los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada polipéptido inmovilizado evaluado,
casi todo el REFACTO® (> 75%) añadido a la reacción de unión se
recuperó en las fracciones de No enlazado, Lavado, y Eluato. Una
pequeña cantidad de material (10%-25%) puede haber quedado retenida
en las perlas después de la elución.
Después se regeneraron las perlas de afinidad
mediante un lavado en etilienoglicol al 50%, 20 mM de His, 0.25M de
NaCl, 20 mM de CaCl_{2}, 0.01% de Tween 80, pH 7, y dos lavados
con 250 \mul de 30 mM H_{3}PO_{4}, 1M de NaCl, pH 2 (15
minutos para cada lavado). Tras los lavados a pH 2, se lavaron las
perlas una vez en PBS con un 0.05% de azida y se almacenaron a
4ºC.
Una muestra de nhfVII se diluyó a una
concentración final de 100 U/ml mediante la adición de 2.32 ml de
H_{2}O, 180 \mul de 1M NH_{4}OAc, pH 6.3 (a 72 mM), y 1
\mul de Tween 80 (al 0.04%). La solución madre REFACTO® se diluyó
a 100 U/ml en un Tampón 1 modificado, en el cual la concentración
de NaC se redujo de 660 mM a 330 mM.
Se evaluó la unión de los péptidos inmovilizados
con nhfVIII en comparación con REFACTO®. Como control no
vinculante, un polipéptido de la biblioteca TN9 (B10), el cual se
enlaza a un objetivo no relacionado y no se enlaza con un factor
VIII objetivo, se inmovilizó en las mismas perlas de metacrilato,
como se ha descrito anteriormente. Después, el nhfVIII y las
soluciones de REFACTO® se mezclaron con perlas de afinidad
regeneradas que llevaban los ligandos CS-454,
CS-456, y CS-458 en un procedimiento
comparativo de purificación en lotes. Las condiciones de reacción
se exponen en la Tabla 8.
Los resultados de estos procesos se exponen en
la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Unión y Elución por Lotes de
nhfVIII y REFACTO® con Ligandos de Polipéptido
Inmovilizados
En conclusión, los ligandos de polipéptido
inmovilizados, CS-458, CS-454, y
CS-456 enlazan y liberan nbfVIII bajo condiciones
similares y con rendimientos similares según se observó previamente
con un polipéptido de tipo factor VIII.
Después de la descripción precedente, se pueden
apreciar las características importantes para las moléculas de
unión de afinidad que permiten detectar o separar factor VIII o
polipéptidos de tipo factor VIII en o de cualquier solución. Serán
evidentes formas de realización de moléculas de unión adicionales de
la invención y métodos alternativos adaptados a una solución
particular o corriente de alimentación tras estudiar la descripción
precedente. Todas estas formas de realización y alternativas obvias
están destinadas a estar dentro del campo de esta invención, tal y
como se define por las reivindicaciones que siguen.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet US 4749780 A, Andersson [0006]
\bullet US 4877614 A, Andersson [0006]
\bullet US 4757006 A, Toole [0006]
\bullet US 4868112 A, Toole [0008]
\bullet US 5661008 A, Almstedt [0009]
[0060]
\bullet WO 9746251 A [0020]
\bullet US 5123409 A, Ladner [0035]
\bullet US 5223409 A, Ladner [0043]
\bullet US 0000043 W, 2000 [0088]
\bullet US 09224785 B, 1999 [0088]
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletAndersson et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, vol. 83,
2979-2973 [0002]
\bulletLind et al. Euro. J.
Biochem., 1995, vol. 232, 19-27
[0009]
\bulletKay et al. Phage
Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Academic
Press, Inc. 1996. [0035]
\bulletKelley et al. Genetic
Engineering Principles and Methods Plenum Press 1990.
vol. 12, 1-19 [0046]
\bulletStewart et al.
Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman
Co. 1989. [0046]
\bulletMerrifield J. Am. Chem.
Soc., 1963, vol. 85, 2149- [0047]
\bulletHoughten Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1985, vol. 82, 5132- [0047]
<110> Potter, M. Daniel
\hskip1cm Yu, Jinan
\hskip1cm Kelley, Brian D
\hskip1cm Deetz, Jeffrey S
\hskip1cm Booth, James E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Moléculas de Unión para Factor VIII
Humano y Proteínas de Tipo Factor VIII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DYX-008.0 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US00/00043
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-01-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/224,785
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-01-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xaa1 es Arg, Phe, His o Pro; xaa2 es
Ser, Gly, Leu o His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa3 es Gly, Asn, Ile o Ser; Xaa4 es
Ser, Trp o Gly; Xaa5 es Trp, Ile, Leu o Val; Xaa6 es Phe, Trp o
Ser; Xaa7 es Pro o Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa8 es Ser, Leu, Pro o Phe; Xaa9 es
Ala, Phe, Leu o His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa1 es Arg o His; Xaa2 es Ala, Arg,
Gly, Leu o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa4 es Gly o Phe; Xaa5 es Ala o
Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa7 es Leu o Phe; Xaa8 es Arg, Asn
o His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa11 es Ala, Asp, His, Leu, Phe,
Pro o Tyr; Xaa12 es Ala, Arg, Asn, Asp o His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa3 es His o Trp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa5 es His o Phe; Xaa6 es Ala, Asn,
His o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa8 es Ala, Asn, Asp, Gln, His,
Leu, Ser o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa11 es Ala, Asp, His, Leu, Phe o
Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
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<210> 12
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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Péptido de Bucle de Unión Sintética
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 12
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial.
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido de Bucle de Unión Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
molde para el péptido de bucle de unión sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> las posiciones de aminoácido 3 y 9
no varían en Cys; todas las demás posiciones Xaa son variadas menos
Cys, para proporcionar una biblioteca de 5x10(9) péptidos
diferentes basados en la secuencia del molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
molde para péptido de bucle de unión sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> las posiciones de aminoácido 3 y 10
no varían en Cys; todas las demás posiciones Xaa son variadas menos
Cys, para proporcionar una biblioteca de 6x10(9) péptidos
diferentes basados en la secuencia del molde
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
molde para péptido de bucle de unión sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> las posiciones de aminoácido 2 y 10
no varían en Cys; todas las demás posiciones xaa son variadas menos
Cys, para proporcionar una biblioteca de 5x10(9) péptidos
diferentes basados en la secuencia del molde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ligando de afinidad de Factor VIII sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ligando de afinidad de Factor VIII sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ligando de afinidad de Factor VIII sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ligando de afinidad de Factor VIII sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ligando de afinidad de Factor VIII sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ligando de afinidad de Factor VIII sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
factor sintético VIII afinidad ligando
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ligando de afinidad de Factor VIII sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ligando de afinidad de Factor VIII sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
enlazador de inmovilización sintética para el
C-terminal peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm55
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
enlazador de inmovilización sintética para el
C-terminal peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm56
Claims (16)
1. Polipéptido que une factor VIII y/o un
polipéptido de tipo factor VIII que tiene una secuencia de
aminoácidos la cual incluye la siguiente secuencia:
2. Polipéptido según la reivindicación 1, donde
el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que incluye una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste
en:
- His-Arg-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-His-Pro-Cys-Leu-Ala;
- His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-Arg-Pro-Cys-Leu-His;
- Arg-Gly-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-Arg-Pro-Cys-Leu-Asp;
- His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-His-Pro-Cys-Ala-Ala;
- His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Asn-Pro-Cys-Ala-His;
- His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Phe-His;
- His-Ala-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-His-Ala;
- His-Leu-Cys-Gly-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Asp-Ala;
- His-Leu-Cys-Phe-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Asp-Ala;
- His-Gly-Cys-Gly-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-His-Ala;
- His-Pro-Cys-Gly-Ala-Trp-Phe-Asn-Pro-Cys-Pro-Arg;
- His-Pro-Cys-Gly-Ala-Trp-Leu-Arg-Pro-Cys-Tyr-Asn.
3. Polipéptido según la reivindicación 1, donde
el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que incluye una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en
- AEGTGDHPCGSWLRPCLHDPGPEGGGS-NHNH2;
- AEGTGDHLCGAWFRPCDADPGPEGGGS-NHNH2;
- Acetil-AEGTGDRLCSWVSPCSADPGEGGGSK; y
- Acetil-AEGTGDHRCGSWLHPCLADPGEGGGSK.
4. Polipéptido según la reivindicación 1, donde
el polipéptido es capaz de unir factor VIII humano y/o un
polipéptido de tipo factor VIII en una solución que comprende 100 mM
de NH_{4}OAC, 0.8M de NaCl, 1M de Sorbitol, 0.02% de Tween 80, 3
mM de EDTA, 5 mM de CaCl_{2} a pH 6.3 y de disociar de dicho
factor VIII humano y/o polipéptido de tipo factor VIII una solución
que contiene un 50% de etilienoglicol.
5. Polipéptido según la reivindicación 4, que
disocia de dicho factor VIII y/o del polipéptido de tipo factor
VIII al ponerse en contacto con una solución que comprende un 50% de
etilienoglicol, 20 mM de His, 0.25 M de NaCl, 20 mM de CaCl_{2},
0.01% de Tween 80, a pH 7.
6. Polipéptido según la reivindicación 4, donde
el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que incluye una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste
en:
- His-Arg-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-His-Pro-Cys-Leu-Ala;
- His-Pro-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-Arg-Pro-Cys-Leu-His;
- Arg-G ly-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-Arg-Pro-Cys-Leu-Asp;
- His-Prc-Cys-Gly-Ser-Trp-Leu-His-Pro-Cys-Ala-Ala;
- His-Prc-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Asn-Pro-Cys-Ala-His;
- His-Prc-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Phe-His;
- His-Ala-Cys-Gly-Ser-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-His-Ala;
- His-Leu-Cys-Gly-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Asp-Ala;
- His-Leu-Cys-Phe-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-Asp-Ala;
- His-Gly-Cys-Gly-Ala-Trp-Phe-Arg-Pro-Cys-His-Ala; y
- His-Pro-Cys-Gly-Ala-Trp-Leu-Arg-Pro-Cys-Tyr-Asn.
7. Polipéptido según la reivindicación 6, donde
el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que incluye una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste
en:
- AEGTGDHPCGSWLRPCLHDPGPEGGGS-NHNH2;
- AEGTGDHLCGAWFRPCDADPGPEGGGS-NHNH2; y
- Acetil-AEGTGDHRCGSWLHPCLADPGEGGGSK.
8. Método para detectar factor VIII humano y/o
un polipéptido de tipo factor VIII en una solución en la que se
sospecha que esté contenido comprendiendo:
- (a)
- poner en contacto tal solución con un polipéptido según cualquiera de los de las reivindicaciones 1-7, y
- (b)
- determinar si la unión ha tenido lugar entre dicho polipéptido y dicho factor VIII humano y/o polipéptido de tipo factor VIII.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Método para purificar factor VIII humano y/o
polipéptidos de tipo factor VIII que comprende:
- (a)
- inmovilizar una molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en un soporte sólido;
- (b)
- poner en contacto una solución que contenga factor VIII humano y/o polipéptidos de tipo factor VIII con dicho soporte; y, después,
- (c)
- separar la solución de dicho soporte.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Bacteriófago recombinante aislado el cual
expresa ADN exógeno que codifica un polipéptido según cualquiera de
las reivindicaciones 1-7 donde dicho polipéptido se
muestra en la superficie de dicho bacteriófago.
11. Método para detectar factor VIII o un
polipéptido de tipo factor VIII en una muestra, el cual comprende
poner en contacto dicha muestra con un bacteriófago según la
reivindicación 10 y detectar si la unión ha tenido lugar entre dicho
bacteriófago y factor VIII o un polipéptido de tipo factor
VIII.
12. Medios de separación que comprenden:
- (a)
- un material matricial poroso cromatográfico, e, inmovilizado sobre el mismo,
- (b)
- un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Medios de separación que comprenden el
producto de reacción de:
- (a)
- un material matricial amino-reactivo cromatográfico, y
- (b)
- un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Medios de separación según la reivindicación
13, donde dicho material matricial es una resina cromatográfica de
metacrilato aldehído-funcional.
15. Medios de separación según la reivindicación
14, donde dicha resina es un soporte de copolímero de
etilenoglicol-metacrilato sustituido con
formilo.
16. Método para separar factor VIII o un
polipéptido de tipo factor VIII de una solución que lo contenga que
comprende:
- (a)
- poner en contacto dicha solución con medios de separación tal y como se define en la reivindicación 12 bajo condiciones de unión,
- (b)
- eliminar el material no unido, y
- (c)
- eluir el factor VIII unido o los polipéptidos de tipo factor VIII de dichos medios de separación.
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