ES2328329A1

ES2328329A1 - Polimorfo alfa de una pirazolina sustituida, su preparacion y uso como medicamento.

Info

Publication number: ES2328329A1
Application number: ES200800110A
Authority: ES
Inventors: Helmut H. Bucshmann; Antonio Torrens Jover; Susana Yenes Minguez; Jordi Benet Buchholz; Lluis Sola Carandell
Original assignee: Laboratorios del Dr Esteve SA
Current assignee: Esteve Pharmaceuticals SA
Priority date: 2007-01-18
Filing date: 2008-01-17
Publication date: 2009-11-11
Anticipated expiration: 2028-01-17
Also published as: EP1947089A1; ES2328329B1

Abstract

Polimorfo alfa de una pirazolina sustituida, su preparación y uso como medicamentos. La presente invención se refiere al polimorfo alfa de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida, los procedimientos para su preparación, los medicamentos que comprenden este compuesto, así como su uso para la preparación de un medicamento para el tratamiento de humanos y animales.

Description

Polimorfo \alpha de una pirazolina sustituida, su preparación y uso como medicamento.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un polimorfo de una pirazolina sustituida, métodos para su preparación, medicamentos que comprenden el compuesto, así como su uso para la preparación de un medicamento para el tratamiento de humanos y animales.

Antecedentes de la invención

Los cannabinoides son compuestos que se derivan de la planta Cannabis sativa que se conoce comúnmente como marihuana. El compuesto químico más activo de los cannabinoides naturales es el tetrahidrocannabinol (THC), particularmente el \Delta^{9}-THC.

Estos cannabinoides naturales, así como sus análogos sintéticos, potencian sus efectos fisiológicos por medio de la unión a receptores acoplados a proteína G específicos, los denominados receptores de cannabinoides.

En la actualidad, se han identificado y clonado dos tipos diferenciados de receptores que se unen tanto a los cannabinoides naturales como a los sintéticos. Estos receptores, que se designan CB_{1} y CB_{2}, participan en una variedad de procesos fisiológicos o patofisiológicos en seres humanos y animales, por ejemplo, procesos relacionados con el sistema nervioso central, el sistema inmunitario, el sistema cardiovascular, el sistema endocrino, el sistema respiratorio, el tracto gastrointestinal o con la reproducción, tal como se describe por ejemplo, en Hollister, Pharm. Rev. 38, 1986, 1-20; Reny y Singha, Prog. Drug. Res., 36, 71-114, 1991; Consroe y Sandyk, en Marijuana/Cannabinoids, Neurobiology and Neurophysiology, 459, Murphy L. y Barthe A. Eds., CRC Press, 1992.

Por tanto, los compuestos que tienen una alta afinidad de unión por estos receptores de cannabinoides y que son adecuados para modular estos receptores son útiles en la prevención y/o el tratamiento de trastornos relacionados con los receptores de cannabinoides.

En particular, el receptor CB_{1} está implicado en muchos trastornos diferentes relacionados con la ingestión de alimentos, tales como bulimia u obesidad, incluyendo la obesidad asociada con la diabetes tipo II (diabetes no insulinodependiente) y, por tanto, pueden utilizarse compuestos adecuados para regular este receptor en la profilaxis y/o el tratamiento de estos trastornos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Efecto de la administración crónica de 10 mg/kg ip de Compuesto C en la insulina de plasma en ratas macho Sprague-Dawley obesas inducidas por la dieta.

Figura 2. Efecto de la administración crónica de 10 mg/kg ip de Compuesto C en un ensayo oral de tolerancia a la glucosa en ratas macho Sprague-Dawley obesas inducidas por la dieta.

Figura 3. Efecto de la administración crónica de 30 mg/kg po de Compuesto C en los niveles de insulina en plasma en ratas hembra Wistar obesas inducidas por la dieta.

Los resultados se expresan como los promedios de los grupos de tratamiento (ajustados para el orden de sangrado y para las diferencias entre los grupos en el peso corporal en la línea base (Día 1)) + SEM (calculada a partir de los residuos del modelo estadístico); n = 10. Las comparaciones múltiples contra el grupo de control tratado con vehículo se determinaron mediante un test t múltiple.

Figura 4. Efecto de la administración crónica de 10 mg/kg ip de Compuesto C en los niveles de triglicéridos y ácidos grasos libres en plasma en ratas macho Sprague-Dawley obesas inducidas por la dieta.

Figura 5. Efecto de la administración crónica de Compuesto C en los niveles de glicerol y triacilglicerol en plasma en ratas hembra Wistar obesas inducidas por la dieta.

Los resultados se expresan como los promedios de los grupos de tratamiento (ajustados para el orden de sangrado y para las diferencias entre los grupos en el peso corporal en la línea base (Día 1)) + SEM (calculada a partir de los residuos del modelo estadístico); n = 10. Las comparaciones múltiples contra el grupo de control tratado con vehículo se determinaron mediante un test t múltiple. Las diferencias significativas del grupo de control se indican mediante *p < 0,05 y **p < 0,01.

Figura 6. Efecto de 10 y 30 mg/kg po de Compuesto C en los niveles de triglicéridos en sangre en ratas macho Wistar en crecimiento después de 14 días de tratamiento.

\newpage

Figura 7. Efecto de 10 y 30 mg/kg po de Compuesto C en los niveles de colesterol total en sangre en ratas macho Wistar después de 14 días de tratamiento.

Figura 8. Patrón de difracción de rayos X en polvo estándar de la modificación \alpha.

Figura 9. Patrón de difracción de rayos X en polvo estándar de una muestra micronizada de la modificación \alpha.

Figura 10. Análisis FTIR de la modificación \alpha.

Figura 11. Efecto de 10 mg/kg ip de Compuesto C en los depósitos de almohadillas de grasa en ratas macho Sprague-Dawley obesas inducidas por la dieta.

Figura 12. Efecto de la administración crónica de 30 mg/kg po de Compuesto C en la composición corporal.

Los datos se expresan como el porcentaje del peso corporal final.

Los resultados se expresan como los promedios de los grupos de tratamiento (ajustados para las diferencias entre los grupos en el peso corporal en la línea base (Día 1)) + SEM (calculada a partir de los residuos del modelo estadístico); n = 10. Las comparaciones múltiples contra el grupo de control tratado con vehículo se determinaron mediante un test t múltiple. Las diferencias significativas del grupo de control se indican mediante ***p < 0,001.

Figura 13. Efecto de la administración crónica de 30 mg/kg po de Compuesto C en los niveles de leptina en plasma en ratas hembra Wistar obesas inducidas por la dieta.

Los resultados se expresan como los promedios de los grupos de tratamiento (ajustados para el orden de sangrado y para las diferencias entre los grupos en el peso corporal en la línea base (Día 1)) + SEM (calculada a partir de los residuos del modelo estadístico); n = 10. Las comparaciones múltiples contra el grupo de control tratado con vehículo se determinaron mediante un test t múltiple. Las diferencias significativas del grupo de control se indican mediante ***p < 0,001.

Descripción de la invención

Por tanto, un objeto de la presente invención fue proporcionar compuestos novedosos para su uso como principios activos en medicamentos. En particular, estos principios activos deben ser adecuados para la modulación de los receptores de cannabinoides, más particularmente para la modulación de los receptores de cannabinoides 1 (CB_{1}).

Dicho objeto se consiguió proporcionando el polimorfo \alpha del compuesto de piperidinil-pirazolina proporcionado a continuación.

Se ha encontrado que estos compuestos tienen un alta afinidad por los receptores de cannabinoides, particularmente por el receptor CB_{1}, y que actúan como moduladores, por ejemplo, antagonistas, agonistas inversos o agonistas de estos receptores. Por tanto, son adecuados para la profilaxis y/o el tratamiento de diversos trastornos relacionados con el sistema nervioso central, el sistema inmunitario, el sistema cardiovascular, el sistema endocrino, el sistema respiratorio, el tracto gastrointestinal o con la reproducción en seres humanos y/o animales, preferiblemente en seres humanos incluyendo lactantes, niños y personas mayores.

Por tanto, en uno de sus aspectos la presente invención se refiere al polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida.

Este polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida cristaliza muy bien y muestra una notable estabilidad bajo ciertas condiciones y/o con el tiempo, por ejemplo, sin aparentemente transformarse en cualquier otra fase cristalina o en un sólido amorfo. También parece mostrar una solubilidad relativamente buena y también una resistencia al calor. Además y especialmente, era resistente a la presión, por ejemplo, en el rango que se libera, cuando se presionan los comprimidos, permitiendo así el uso como principio activo en una formulación farmacéutica oral preferida.

La (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida y su preparación se describen en detalle en WO 2005/077911.

En otro aspecto de la presente invención, el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención cristaliza como una celda triclínica con un ángulo \alpha de 78º y/o un ángulo \beta de 74º y/o un ángulo \gamma de 88º.

En otro aspecto de la presente invención, el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida muestra una difracción de rayos X en polvo estándar según la figura 8.

En otro aspecto de la presente invención, el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida se funde

por encima de 180ºC, preferiblemente en un punto inicial de 183 \pm 1ºC, más preferiblemente en un punto inicial de 183-184ºC

y/o

con un pico de fusión a 185 \pm 2ºC, preferiblemente a 184 \pm 1ºC.

En otro aspecto de la presente invención, el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida se descompone a 280ºC o superior.

En otro aspecto de la presente invención, el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida muestra bandas en el espectro FTRaman, preferiblemente bandas intensas, a 2932 \pm 5 cm^{-1} y/o 1647 \pm 5 cm^{-1} y/o 1593 \pm 5 cm^{-1} y/o 1394 \pm 5 cm^{-1} y/o 1269 \pm 5 cm^{-1} y/o 1253 \pm 5 cm^{-1} y/o 1109 \pm 5 cm^{-1} y/o 1084 \pm 5 cm^{-1} y/o 1047 \pm 5 cm^{-1} y/o 783 \pm 5 cm^{-1} y/o 661 \pm 5 cm^{-1} y/o un desplazamiento Raman a 1253 \pm 5 cm^{-1} y/o a 1084 \pm 5 cm^{-1} y/o a 533 \pm 5 cm^{-1} y/o a 364 cm^{-1}.

Es muy preferible si el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida muestra al menos 2, preferiblemente al menos 3, más preferiblemente al menos 4, lo más preferiblemente al menos las 5 características de la siguiente lista:

\bullet: cristaliza como una celda triclínica con un ángulo \alpha de 78º y/o un ángulo \beta de 74º y/o un ángulo \gamma de 88º;

\bullet: muestra una difracción de rayos X en polvo estándar según la figura 8;

\bullet: funde

\quad: por encima de 180ºC, preferiblemente en un punto inicial de 183 \pm 1ºC, más preferiblemente en un punto inicial de 183-184ºC

\quad: y/o

\quad: con un pico de fusión a 185 \pm 2ºC, preferiblemente a 184 \pm 1ºC;

\bullet: descompone a 280ºC o superior;

\bullet: muestra bandas en el espectro FTRaman, preferiblemente bandas intensas, a 2932 \pm 5 cm^{-1} y/o 1647 \pm 5 cm^{-1} y/o 1593 \pm 5 cm^{-1} y/o 1394 \pm 5 cm^{-1} y/o 1269 \pm 5 cm^{-1} y/o 1253 \pm 5 cm^{-1} y/o 1109 \pm 5 cm^{-1} y/o 1084 \pm 5 cm^{-1} y/o 1047 \pm 5 cm^{-1} y/o 783 \pm 5 cm^{-1} y/o 661 \pm 5 cm^{-1} y/o un desplazamiento Raman a 1253 \pm 5 cm^{-1} y/o a 1084 \pm 5 cm^{-1} y/o a 533 \pm 5 cm^{-1} y/o y a 364 cm^{-1}.

En otro aspecto, la presente invención también proporciona un procedimiento para la fabricación del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención, en el que una solución de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida en un alcohol; preferiblemente etanol o metanol; se evapora a temperatura ambiente (25ºC) para producir el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida.

La (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida y su preparación se describen en detalle en WO2005/077911. Las descripciones respectivas se incorporan en la presente invención por referencia y forman parte de la presente descripción.

El polimorfo según la presente invención es adecuado como principio activo farmacéutico para la preparación de medicamentos.

Se ha encontrado que la (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida y, por tanto, naturalmente su polimorfo, tienen una alta afinidad por los receptores de cannabinoides, particularmente los receptores de cannabinoides 1 (CB_{1}), es decir, son ligandos selectivos para el receptor CB_{1} y actúan como moduladores, por ejemplo antagonistas, agonistas inversos o agonistas, en estos receptores. En particular, el compuesto muestra poco o ningún desarrollo de tolerancia durante el tratamiento, particularmente con respecto a la ingestión de alimentos, es decir, si el tratamiento se interrumpe durante un periodo de tiempo y luego se continúa posteriormente, el compuesto utilizado según la invención mostrará de nuevo el efecto deseado. Tras finalizar el tratamiento con el compuesto, se encuentra que continúa la influencia positiva sobre el peso corporal.

Además, este compuesto muestra una afinidad por el canal Herg relativamente débil, por tanto, para este compuesto se espera un riesgo bajo de prolongación del intervalo QT.

En resumen, el compuesto se distingue por un amplio espectro de efectos beneficiosos, a la vez que muestra relativamente pocos efectos no deseados, es decir, efectos que no contribuyen de manera positiva o que incluso interfieren con el bienestar del paciente.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un medicamento que comprende el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Otro aspecto de la presente invención es el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un medicamento para la modulación de receptores de cannabinoides, preferiblemente receptores de cannabinoides 1 (CB_{1}), para la profilaxis y/o el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central, trastornos del sistema inmunitario, trastornos del sistema cardiovascular, trastornos del sistema endocrino, trastornos del sistema respiratorio, trastornos del tracto gastrointestinal o trastornos reproductores.

También se prefiere el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para la profilaxis y/o el tratamiento de la psicosis.

Particularmente, también se prefiere el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de trastornos de la ingestión de alimentos, preferiblemente bulimia, anorexia, caquexia, obesidad y/o diabetes mellitus tipo II (diabetes no insulinodependiente), más preferiblemente la obesidad.

También se prefiere el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de cáncer, preferiblemente para la profilaxis y/o el tratamiento de uno o más tipos de cánceres seleccionados del grupo que consiste en cáncer cerebral, cáncer óseo, cáncer de labio, cáncer de boca, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de ovarios, cáncer cervical, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de colon, cáncer intestinal y cáncer de próstata, más preferiblemente para la profilaxis y/o el tratamiento de uno o más tipos

\hbox{de cánceres seleccionados
del grupo que consiste en cáncer de colon, cáncer  intestinal y
cáncer de próstata.}

También se prefiere el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento del alcoholismo y/o la adicción al alcohol, abuso de nicotina y/o tabaquismo, abuso de drogas y/o drogadicción y/o abuso de fármacos y/o farmacodependencia, preferiblemente abuso de drogas y/o drogadicción y/o abuso de nicotina y/o tabaquismo.

Entre los medicamentos/drogas, que son frecuentemente objeto de abuso se incluyen opioides, barbitúricos, cannabis, cocaína, anfetaminas, fenciclidina, alucinógenos y benzodiazepinas.

También se prefiere el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de uno o más de los trastornos seleccionados del grupo que consiste en trastornos óseos, preferiblemente osteoporosis (por ejemplo, osteoporosis asociada con una predisposición genética, déficit de hormonas sexuales o envejecimiento), enfermedad ósea asociada a cáncer o enfermedad ósea de Paget; esquizofrenia, ansiedad, depresión, epilepsia, trastornos neurodegenerativos, trastornos cerebelosos, trastornos espinocerebelosos, trastornos cognitivos, traumatismo craneal, traumatismo craneoencefálico, accidente cerebrovascular, ataques de pánico, neuropatía periférica, inflamación, glaucoma, migraña, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Raynaud, temblores, trastornos compulsivos, demencia senil, trastornos tímicos, discinesia tardía, trastornos bipolares, trastornos de movimiento inducidos por medicamentos, distonía, choque endotoxémico, choque hemorrágico, hipotensión, insomnio, trastornos inmunológicos, placas escleróticas, vómitos, diarrea, asma, trastornos de la memoria, prurito, dolor, o para la potenciación del efecto analgésico de analgésicos narcóticos y no narcóticos, o para influir en el tránsito intestinal.

Particularmente, también se prefiere el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención, y opcionalmente en forma de uno de los estereoisómeros, preferiblemente enantiómeros o diastereómeros, un racemato o en forma de una mezcla de al menos dos de los estereoisómeros, preferiblemente enantiómeros y/o diastereómeros, en cualquier proporción de mezcla, o un solvato correspondiente de los mismos y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de uno o más de los trastornos seleccionados del grupo que consiste en demencia y trastornos relacionados, preferiblemente para la profilaxis y/o el tratamiento de uno o más tipos de demencia seleccionados del grupo que consiste en pérdida de memoria, demencia vascular, deterioro cognitivo leve, demencia frontotemporal y enfermedad de Pick; trastornos por atracones compulsivos; obesidad juvenil; obesidad inducida por fármacos; depresión atípica; adicciones de comportamiento; trastornos del déficit de atención; síndrome de Tourette; supresión de comportamientos relacionados con la recompensa; por ejemplo, evitar el condicionamiento por un lugar, tales como la supresión de la preferencia condicionadas por un lugar inducida por cocaína y morfina; impulsividad; disfunción sexual; preferiblemente, para la profilaxis y/o el tratamiento de uno o más tipos de disfunción sexual seleccionados del grupo que consiste en dificultad eréctil y disfunción sexual femenina; trastornos convulsivos; náuseas; emesis; enfermedad neuroinflamatoria, preferiblemente para la profilaxis y/o el tratamiento de uno o más tipos de enfermedades neuroinflamatorias seleccionadas del grupo que consiste en esclerosis múltiple, trastornos relacionados con la desmielinización, síndrome de Guillan-Barré, encefalitis viral y accidentes cerebrovasculares; trastornos neurológicos; espasticidad muscular; lesión traumática del cerebro; lesión de la médula espinal; trastornos de la inflamación e inmunomoduladores, preferiblemente para el tratamiento y/o la profilaxis de uno o más tipos de trastornos de inflamación e inmunomoduladores seleccionados del grupo que consiste en linfomas cutáneos de células T, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, sepsis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, displasia broncopulmonar, enfermedad retinal, escleroderma, isquemia renal, infarto de miocardio, isquemia cerebral, nefritis, hepatitis, glomerulonefritis, alveolitis fibrosante criptogénica, psoriasis, rechazo de transplantes, dermatitis atópica, vasculitis, alergia, rinitis alérgica estacional, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, obstrucción reversible de las vías respiratorias, síndrome de insuficiencia respiratoria adulta, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y bronquitis; apoplejía cerebral; traumatismo craneocerebral; trastornos de daño neuropático; úlceras gástricas; aterosclerosis, y cirrosis hepática.

La demencia es una enfermedad caracterizada por el deterioro progresivo de las funciones cognitivas y de adaptación social que finalmente puede interferir en la capacidad del paciente para vivir de forma independiente. La demencia también está constituida por una deficiencia de la memoria a corto y largo plazo más síntomas adicionales, tales como problemas con el pensamiento abstracto, la opinión y la personalidad. Se estima que en el mundo existen 18 millones de pacientes que sufren de demencia. Las formas más comunes de demencia incluyen la enfermedad de Alzheimer y la demencia vascular. Otras formas son la demencia frontotemporal y la enfermedad de Pick.

La demencia también puede ser de origen vascular. La demencia vascular (enfermedad cerebrovascular aterosclerótica) se considera que es la segunda demencia más común en la edad avanzada, afectando aproximadamente a un 10-15% de todos los casos. La enfermedad de Alzheimer (AD) y la demencia vascular pueden existir aisladas o juntas (demencia mixta). En la demencia vascular, los cambios ateroscleróticos en los vasos cerebrales pueden conducir a un menor flujo sanguíneo local que da lugar a múltiples infartos pequeños (demencia multiinfarto). La demencia vascular se trata farmacológicamente mediante profilaxis del infarto y mediante el tratamiento del déficit cognitivo.

La enfermedad de Alzheimer (AD), la forma más común e importante de demencia, es un trastorno degenerativo que se caracteriza por el deterioro progresivo de las funciones cognitivas, tales como el razonamiento abstracto y la memoria. Actualmente, se estima que existen 2 millones de personas en Estados Unidos y 12 millones a nivel mundial que están afectadas por esta enfermedad. Debido al aumento de la esperanza de vida, se prevé que en el año 2050 habrá a nivel mundial unos 100 millones de pacientes con AD. La AD es una de las enfermedades más extendidas en la vejez. La mayoría de los pacientes con AD tienen unos 60 años o más. Más de un 5% de todas las personas mayores de 70 años tienen una pérdida de memoria significativa debido a la AD.

La AD se caracteriza principalmente por un desarrollo gradual de la capacidad de olvidar. En las fases más avanzadas de la enfermedad, se observa el incremento de otros fallos en la función cerebral. Esto incluye el deterioro del habla, la escritura y las habilidades aritméticas. La orientación visioespacial, tal como el aparcar un coche, vestirse correctamente y dar y entender direcciones para una localización, pueden ser defectuosa o estar deteriorada. En la última etapa de la enfermedad, los pacientes olvidan cómo utilizar los objetos y herramientas comunes a la vez que mantienen la energía motriz y coordinación necesarias para estas actividades.

La esquizofrenia se caracteriza por una alteración profunda en la cognición y la emoción afectando a los atributos humanos más fundamentales: lenguaje, pensamiento, percepción, afecto y sentido de uno mismo. Los síntomas positivos incluyen manifestaciones psicóticas, tales como la escucha de voces internas o la experimentación de otras sensaciones no conectadas con un origen obvio (alucinaciones) y la asignación de una importancia o significado no habitual a sucesos normales o el mantenimiento de creencias personales falsas (ilusiones). Los síntomas negativos se caracterizan por un aplanamiento afectivo y una falta de iniciativa u objetivos (carencia de motivación), pérdida de intereses o placeres habituales (anhedonia), perturbaciones del sueño y la alimentación, humor disfórico (humor depresivo, ansioso, irritable o de enfado) y dificultad para concentrarse o centrar la atención.

La depresión mayor es un trastorno con múltiples facetas caracterizado principalmente por humor disfórico y pérdida de interés o placer en actividades que en algún momento fueron disfrutables. Otros síntomas físicos y psicológicos incluyen la incapacidad para concentrarse, perturbaciones motoras (retraso o agitación psicomotriz), sentimientos de inutilidad, culpa inapropiada, pensamientos de suicidio, y perturbaciones en el apetito y el sueño.

Los trastornos de ansiedad son un grupo de síndromes que incluyen un trastorno de ansiedad generalizado, trastorno del pánico, fobias, trastorno compulsivo-obsesivo y trastornos de estrés post traumático. Aunque cada trastorno tiene sus propias características distintivas, todas comparten síntomas comunes de preocupación excesiva, miedos y temores intensos, hipervigilancia y/o síntomas somáticos, en ausencia de una situación peligrosa.

La función sexual normal requiere, entre otras cosas, la capacidad de conseguir y mantener una erección del pene. Las estructuras anatómicas principales del pene que están implicadas en la función eréctil incluyen el cuerpo cavernoso, el cuerpo espinoso y la túnica albugínea (una vaina de colágeno que rodea a cada cuerpo). Los cuerpos están compuestos de una masa de músculo liso (trabécula) que contiene una red de vasos recubiertos por tejido endotelial (espacios lacunares). La tumenescencia del pene y la erección están causadas por la relajación de las arterias y músculos lisos corporales, a la vez que se cierran las venas emisaria, conduciendo a un aumento del flujo sanguíneo en la red lacunar. La inervación central y periférica contribuye a la regulación de la respuesta eréctil.

La disfunción eréctil (ED) puede resultar de una insuficiencia para iniciar, llenar o almacenar el volumen de sangre adecuado en la red lacunar del pene. Dependiendo de la disfunción subyacente, la ED puede ser vasculogénica, neurogénica, endocrinológica, diabética, psicogénica o relacionada con la medicación.

La ED afecta a un 10-25% de hombres de mediana y avanzada edad y tiene un profundo impacto en el bienestar de los hombres afectados. Actualmente se trata utilizando inhibidores de PDE5, tales como vardenafil, tadalfil y sildenafil. Se puede utilizar alpostadil intrauretral (prostaglandina EI) en pacientes a los que no les funcionan los agentes orales. Además, los dispositivos de constricción de vacío (VCC) son un terapia no invasiva bien establecida.

La disfunción sexual femenina (FSD) está altamente extendida, está relacionada con la edad y es progresiva. Afecta de un 30 a un 50% de mujeres. La FSD representa un rango de problemas médicos y se clasifica según los trastornos de (1) deseo, (2) excitación, (3) orgasmo y (4) dolor sexual, y síntomas que incluyen la disminución de la lubricación vaginal, dolor e incomodidad en el coito, disminución de la excitación, y dificultad para conseguir el orgasmo. A nivel molecular, se han sugerido que el péptido intestinal vasoactivo (VIP), óxido nítrico (NO) y hormonas sexuales, tales como estrógenos y andrógenos, son importantes en la función sexual femenina. Los enfoques de los tratamientos actuales incluyen la terapia de sustitución del estrógeno, metil testosterona, inhibidores de PDE5, tales como sildenafil, L-arginina dadora de NO, prostaglandina EI, fentolamina y agonistas de dopamina como
apomorfina.

También se prefiere el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento del síndrome metabólico, especialmente independiente del peso, enfermedades cardiovasculares, factores de riesgo cardiovascular, intolerancia a la glucosa y resistencia a la insulina; para la profilaxis y/o el tratamiento y/o la influencia de la dislipidemia; para la profilaxis y/o el tratamiento y/o la influencia de parámetros sanguíneos, especialmente parámetros lipídicos, aparentemente dismiuyendo las LDL a la vez que aumentan las HDL, incluyendo también el tratamiento de trastornos de la alimentación (obesidad) en condiciones de diabetes desarrollada, especialmente del Tipo
II.

El síndrome metabólico y las definiciones del mismo se describen en detalle por Eckel et al., The Lancet, Vol. 365 (2005), 1415-1428, incluido como referencia en el presente documento. Una de las definiciones respectivas la estableció la OMS en 1998 (tal como se describe en Alberti et al., Diabet. Med. 1998, 15, páginas 539-53, la respectiva descripción de la misma se incorpora como referencia al presente documento y forma parte de la presente descripción). La otra definición, más extendida, del síndrome metabólico la estableció el Adult Treatment Panel (panel de tratamiento de adultos) (ATP III) del US National Cholesterol Education Program (programa nacional de educación sobre colesterol de los Estados Unidos) (NCEP) en 2001, tal como se describe en JAMA 2001; 285; 2486-97, la respectiva descripción de la misma se incorpora como referencia al presente documento y forma parte de la presente descripción.

El síndrome metabólico se caracteriza por una interacción de varios parámetros fisiológicos tales como los triglicéridos, lípidos, tensión arterial, glucemia y niveles de insulina. Aun cuando la obesidad puede desempeñar un papel crítico en el desarrollo del síndrome metabólico, muchos de sus aspectos son independientes del peso, especialmente algunos parámetros lipídicos. Especialmente, la influencia positiva sobre los aspectos independientes del peso del síndrome metabólico (véase, por ejemplo, Pagotto y Pasquali, The Lancet, Vol. 365 (2005), 1363, 1364, incluido como referencia en el presente documento) como algunos parámetros sanguíneos, especialmente parámetros lipídicos, es una de las principales y sorprendentes ventajas de los compuestos de pirazolina sustituidos utilizados según la
invención.

Dado que el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención también tiene un efecto beneficioso en la proporción de lipoproteínas de baja densidad (LDL) con respecto a lipoproteínas de alta densidad (HDL), es decir, disminuyen los niveles de LDL y/o elevan los niveles de HDL; también son útiles como material de recubrimiento o como material de corecubrimiento en "stents" a fin de evitar la restenosis.

El término "tratamiento" tal y como se usa en la presente solicitud comprende la prevención, mejora y/o completa recuperación de la enfermedad. Dicho término también incluye la prevención, mejora y/o completa recuperación de uno o más síntomas asociados con la enfermedad.

Además, el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención está conectado con una afinidad por el canal Herg relativamente débil, por tanto, para este compuesto se espera un riesgo bajo de prolongación del intervalo QT.

En resumen, el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención se distingue por un amplio espectro de efectos beneficiosos, a la vez que muestra relativamente pocos efectos no deseados, es decir, efectos que no contribuyen de manera positiva o que incluso interfieren con el bienestar del paciente.

\newpage

Otro aspecto de la presente invención es el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención para la fabricación de un medicamento para la mejora de factores de riesgo cardiovascular y/o metabólicos, tales como uno o más de los siguientes factores:

\bullet Triglicéridos elevados, en los que los niveles elevados de triglicéridos se entiende preferiblemente que son > 150 mg/dl,

\bullet Colesterol de las HDL bajo, en el que los niveles bajos de colesterol de las HDL se entiende preferiblemente que son < 40 mg/dl en hombres y < 50 mg/dl en mujeres,

\bullet Hipertensión, en la que hipertensión se entiende preferiblemente que es > 130/85 mmHg,

\bullet Alteración de la glucosa en ayunas, en la que la alteración de la glucemia en ayunas se entiende preferiblemente que es > 110 mg/dl,

\bullet Resistencia a la insulina

\bullet Dislipidemia.

Otro aspecto de la invención es el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de los aspectos independientes del peso del síndrome metabólico.

Otro aspecto muy preferido de la invención es también el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la dislipidemia.

Otro aspecto muy preferido de la invención es también el uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la dislipidemia o el síndrome metabólico.

Otro aspecto de la invención es un método para mejorar los factores de riesgo cardiovasculares y/o metabólicos, tales como uno o más de los siguientes factores:

\bullet Resistencia a la insulina

\bullet Dislipidemia,

en un sujeto, preferiblemente un ser humano.

Otro aspecto preferido de la invención es un método de tratamiento que comprende todos los usos mencionados anteriormente, en los que el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la presente invención se aplica a una persona con necesidad del mismo, para el tratamiento del síndrome metabólico, especialmente independiente del peso, enfermedades cardiovasculares, especialmente la lucha contra los factores de riesgo cardiovascular, la influencia de los parámetros sanguíneos, especialmente los parámetros lipídicos, diabetes, especialmente del tipo II, la intolerancia a la glucosa y la resistencia a la insulina, trastornos óseos, preferiblemente osteoporosis (por ejemplo, osteoporosis asociada con una predisposición genética, déficit de hormonas sexuales o envejecimiento), enfermedad ósea asociada a cáncer o enfermedad ósea de Paget; esquizofrenia, ansiedad, depresión, epilepsia, trastornos neurodegenerativos, trastornos cerebelosos, trastornos espinocerebelosos, trastornos cognitivos, traumatismo craneal, traumatismo craneoencefálico, accidente cerebrovascular, ataques de pánico, neuropatía periférica, inflamación, glaucoma, migraña, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Raynaud, temblores, trastornos compulsivos, demencia senil, trastornos tímicos, discinesia tardía, trastornos bipolares, trastornos de movimiento inducidos por medicamentos, distonía, choque endotoxémico, choque hemorrágico, hipotensión, insomnio, trastornos inmunológicos, placas escleróticas, vómitos, diarrea, asma, trastornos de la memoria, prurito, dolor, o para la potenciación del efecto analgésico de analgésicos narcóticos y no narcóticos, o para influir en el tránsito intestinal; alcoholismo y/o la adicción al alcohol, abuso de nicotina y/o tabaquismo, abuso de drogas y/o drogadicción y/o abuso de fármacos y/o farmacodependencia, preferiblemente abuso de drogas y/o drogadicción y/o abuso de nicotina y/o tabaquismo; cáncer, preferiblemente para la profilaxis y/o el tratamiento de uno o más tipos de cánceres seleccionados del grupo que consiste en cáncer cerebral, cáncer óseo, cáncer de labio, cáncer de boca, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de ovarios, cáncer cervical, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de colon, cáncer intestinal y cáncer de próstata, más preferiblemente para la profilaxis y/o el tratamiento de uno o más tipos de cánceres seleccionados del grupo que consiste en cáncer de colon, cáncer intestinal y cáncer de próstata; tratamiento de trastornos de la ingestión de alimentos, preferiblemente bulimia, anorexia, caquexia, obesidad y/o diabetes mellitus tipo II (diabetes no insulinodependiente), más preferiblemente la obesidad; psicosis; trastornos del sistema nervioso central, trastornos del sistema inmunitario, trastornos del sistema cardiovascular, trastornos del sistema endocrino, trastornos del sistema respiratorio, trastornos del tracto gastrointestinal o trastornos con la reproducción.

El medicamento según la presente invención puede estar en cualquier forma adecuada para la aplicación a seres humanos y/o animales, preferiblemente seres humanos incluyendo lactantes, niños y adultos y puede producirse mediante procedimientos habituales conocidos por los expertos en la materia. La composición del medicamento puede variar dependiendo de la vía de administración.

El medicamento de la presente invención puede administrarse, por ejemplo, por vía parenteral en combinación con vehículos líquidos inyectables convencionales, tales como agua o alcoholes adecuados. Los excipientes farmacéuticos convencionales para inyección, tales como agentes estabilizantes, agentes solubilizantes y tampones, pueden incluirse en tales composiciones inyectables. Estos medicamentos pueden inyectarse, por ejemplo, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal o por vía intravenosa.

Los medicamentos según la presente invención también pueden formularse en composiciones que pueden administrarse por vía oral, que contienen uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente compatibles, en forma sólida o líquida. Estas composiciones pueden contener componentes convencionales, tales como agentes aglutinantes, cargas, lubricantes y agentes humectantes aceptables. Las composiciones pueden tomar cualquier forma conveniente, tal como comprimidos, gránulos, cápsulas, pastillas para chupar, disoluciones acuosas u oleosas, suspensiones, emulsiones, o formas en polvo secas adecuadas para la reconstitución con agua u otro medio líquido adecuado antes de su uso, para la liberación inmediata o sostenida.

Las formas orales líquidas para administración también pueden contener diversos aditivos tales como agentes edulcorantes, aromatizantes, conservantes y emulsionantes. También pueden formularse composiciones líquidas no acuosas para la administración oral que contienen aceites comestibles. Tales composiciones líquidas pueden encapsularse convenientemente en, por ejemplo, cápsulas de gelatina en una cantidad de dosis unitaria.

Las composiciones de la presente invención también pueden administrarse por vía tópica o por medio de un supositorio.

La dosificación diaria para seres humanos y animales puede variar dependiendo de factores que tienen su base en las especies respectivas u otros factores, tales como la edad, el sexo, el peso o el grado de enfermedad, etcétera. La dosificación diaria para seres humanos puede estar preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 2000, preferiblemente de 1 a 1500, más preferiblemente de 1 a 1000 miligramos o también de 20 a 200 mg de principio activo que va a administrarse durante una o varias ingestas por día.

Métodos farmacológicos I. Determinación in vitro de la afinidad por los receptores CB_{1}/CB_{2}

a) La determinación in-vitro de la afinidad de las sales de amonio cuaternario de la invención por los receptores CB_{1}/CB_{2} se lleva a cabo tal como se describió en la publicación de Ruth A. Ross, Heather C. Brockie et al., "Agonist-inverse agonist characterization at CB_{1} and CB_{2} cannabinoid receptors of L-759633, L759656 y AM630", British Journal of Pharmacology, 126, 665-672, (1999), en la que se utilizan los receptores CB_{1} y CB_{2} humanos transfectados de Receptor Biology, Inc. El radioligando utilizado para ambos receptores es [^{3}H]-CP55940. Las partes respectivas se incorporan como referencia al presente documento y forman parte de la presente descripción.

b) Unión a CB1 de cerebelo de ratón

Se evaluó la afinidad de unión a receptor CB1 según una modificación del método descrito por Govaerts et al., Eur. J. Pharmac. Sci. 23, 233-243 (2004). Las partes respectivas de la descripción se incorporan por referencia en la presente y forman parte de la presente descripción.

Brevemente, se diseccionaron con cuidado cerebelos de ratas Wistar macho (250-300 g) sobre hielo y se prepararon homogenatos con Potter-Helveheim en una solución fría de Tris-HCl 50 mM que contenía 5 mM de MgCl_{2}, 1 mM de EDTA y 0,25 M de sacarosa, pH 7,4. La suspensión se centrifugó a 1.000 x g durante 5 minutos. Se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron a 50.000 x g durante 15 minutos. Los pélets resultantes se resuspendieron a continuación en tampón Tris-HCl sin sacarosa, se homogeneizaron y se incubaron durante 15 minutos a 37ºC en un baño de agitación orbital y se centrifugaron de nuevo a 50.000 x g durante 15 minutos. Los pélets se pesaron, se resuspendieron en el tampón Tris-HCl sin sacarosa, se homogeneizaron con Ultraturrax a 13.500 rpm durante 3 x 5 segundos y se pusieron en alícuotas en volúmenes de 0,9 ml en tubos Eppendorf. Las alícuotas se cetrifugaron a 20.800 x g durante 5 minutos, se descartaron los sobrenadantes y se congelaron los pélets a -80ºC hasta su utilización. La concentración total de proteína se determinó utilizando un kit basado en el método de Bio-Rad
Lowry.

Se realizaron experimentos de unión competitiva en presencia de [^{3}H]-CP 55,940 1 nM en tubos de vidrio siliconados que contenían 100 \mug proteína/tubo resuspendidos en un volumen final de 1 ml de Tris-HCl 50 mM, 5 mM de MgCl_{2}, 1 mM de EDTA, 0,5% (p/v) de albúmina de suero bovino, pH 7,4. Los compuestos estaban presentes en varias concentraciones y se determinó la unión no específica en presencia de 10 \muM de HU-210. Después de 1 hora de incubación a 30ºC, la suspensión se filtró rápidamente a través de filtros de fibra GF/B tratados previamente con PEI al 0,5% en una placa de recogida de 96 pocillos y se lavaron 3 veces con 3 ml de tampón de unión enfriado en hielo sin albúmina de suero bovino. Se midió la radioactividad en los filtros con un contador Wallac Winspectral 1414 mediante centelleo líquido en 6 ml de Ecoscint H (Natinal Diagnostics, UK). Los ensayos se realizaron por
triplicado.

Los datos de unión se analizaron mediante regresión no lineal con el software GraphPad Prism Versión 3.03.

II. Sistema de bioensayo in vivo para determinar la actividad cannabinoide Modelo de tétrada de ratón

Se sabe que las sustancias con afinidad por los receptores de cannabinoides producen un amplio intervalo de efectos farmacológicos. También se sabe que la administración intravenosa de una sustancia con afinidad por los receptores de cannabinoides en ratones produce analgesia, hipotermia, sedación y catalepsia. Individualmente, ninguno de estos efectos puede considerarse como una prueba de que una sustancia probada tenga afinidad por los receptores de cannabinoides, ya que todos estos efectos son comunes para diversas clases de agentes activos en el sistema nervioso central. Sin embargo, las sustancias que muestran todos estos efectos, es decir, las sustancias que son activas en este modelo denominado de tétrada, se considera que tienen afinidad por los receptores de cannabinoides. Se ha mostrado además que los antagonistas del receptor de cannabinoides son sumamente eficaces en el bloqueo de los efectos de un agonista de cannabinoides en el modelo de tétrada de ratón.

El modelo de tétrada se describe, por ejemplo, en la publicación de A. C. Howlett et al, International Union of Pharmacology XXVII. Classification of Cannabinoid Receptors, Pharmacol Rev 54, 161-202, 2002 y David R. Compton et al., "In-vivo Characterization of a Specific Cannabinoid Receptor Antagonist (SR141716A): Inhibition of Tetrahidrocannbinol- induced Responses and Apparent Agonist Activity", J. Pharmacol. Exp. Ther. 277, 2, 586-594, 1996. Las partes correspondientes de la descripción se incorporan como referencia al presente documento.

Material y métodos

En todos los experimentos siguientes se utilizan ratones NMRI macho con un peso de 20-30 g (Harlan, Barcelona, España).

Antes de las pruebas en los procedimientos conductuales facilitados a continuación, los ratones se aclimatan al entorno experimental. Los valores de control de previos al tratamiento se determinaron para medir la analgesia mediante latencia en placa caliente (en segundos), la temperatura rectal, la sedación y la catalepsia.

Con el fin de determinar la actividad agonista de la sustancia que va a probarse, se inyecta a los ratones por vía intravenosa la sustancia que va a probarse o el vehículo solo. 15 minutos después de la inyección, se mide la latencia de analgesia en placa caliente. 20 minutos después de la inyección se mide la temperatura rectal, la sedación y la catalepsia.

Con el fin de determinar la actividad antagonista, se utiliza el procedimiento idéntico que para la determinación de los efectos agonistas, pero con la diferencia de que la sustancia que va a evaluarse para determinar su actividad antagonista se inyecta 5 minutos antes de la inyección intravenosa de 1,25 mg/kg de Win-55,212, un conocido agonista del receptor de cannabinoides.

Analgesia en placa caliente

La analgesia en placa caliente se determina según el método descrito en Woolfe D. et al. "The evaluation of analgesic action of pethidine hydrochloride (Demerol)", J. Pharmacol. Exp. Ther. 80, 300-307, 1944. La descripción respectiva se incorpora como referencia al presente documento y forma parte de la presente descripción.

Los ratones se sitúan sobre una placa caliente (analgesímetro Harvard) a 55 \pm 0,5ºC hasta que muestran una sensación dolorosa, lamiéndose sus patas o saltando, y se registra el tiempo para que se produzcan estas sensaciones. Esta lectura se considera como el valor basal (B). El límite de tiempo máximo que se permite que los ratones permanezcan sobre la placa caliente en ausencia de cualquier respuesta dolorosa es de 40 segundos con el fin de evitar lesiones cutáneas. Este periodo se denomina tiempo límite (PC).

Quince minutos después de la administración de la sustancia que va a probarse, los ratones se sitúan de nuevo sobre la placa caliente y se repite el procedimiento anteriormente descrito. Este periodo se denomina lectura posterior al tratamiento (PT).

El grado de analgesia se calcula a partir de la fórmula:

%\ de\ MPE\ de\ analgesia = (PT- B)/(PC-B)\ x\ 100

MPE = máximo efecto posible.

Determinación de la sedación y la ataxia

La sedación y la ataxia se determinan según el método descrito en Desmet L. K. C. et al. "Anticonvulsive properties of Cinarizine and Flunarizine in Rats and Mice", Arzneim. -Forsch. (Frug Res) 25, 9, 1975. La descripción respectiva se incorpora como referencia al presente documento y forma parte de la presente descripción.

El sistema de puntuación elegido es

0: sin ataxia;

1: dudoso;

2: tranquilidad y silencio obvios;

3 ataxia pronunciada;

antes de, además de después del tratamiento.

El porcentaje de sedación se determina según la fórmula:

%\ de\ sedación = media\ aritmética/3\ X\ 100

Hipotermia

La hipotermia se determina según el método descrito en David R. Compton et al. "In-vivo Characterization of a Specific Cannabinoid Receptor Antagonist (SR141716A) Inhibition of Tetrahidrocannbinol- induced Responses and Apparent Agonist Activity", J. Pharmacol Exp Ther. 277, 2, 586-594, 1996. La descripción respectiva se incorpora como referencia al presente documento y forma parte de la presente descripción.

Se determinan las temperaturas rectales iniciales con un termómetro (Yello Springs Instruments Co., Panlabs) y una sonda de termistor insertada a 25 mm antes de la administración de la sustancia que va a probarse. La temperatura rectal se mide de nuevo 20 minutos después de la administración de las sustancias que van a probarse. La diferencia de temperatura se calcula para cada animal, de modo que las diferencias \geq -2ºC se consideran que representan actividad.

Catalepsia

La catalepsia se determina según el método descrito en Alpermann H. G. et al. "Pharmacological effects of Hoe 249: A new potential antidepressant", Drugs Dev. Res. 25, 267-282. 1992. La descripción respectiva se incorpora como referencia al presente documento y forma parte de la presente descripción.

El efecto cataléptico de la sustancia que va a probarse se evalúa según la duración de la catalepsia, poniéndose los animales cabeza abajo con sus patas sobre la parte superior del bloque de madera.

El sistema de puntuación elegido es:

Catalepsia durante:

más de 60 segundos = 6; 50 -60 segundos = 5, 40-50 segundos = 4, 30-40 segundos = 3, 20-30 segundos = 2, 5-10 segundos = 1, y menos de 5 segundos = 0.

El porcentaje de catalepsia se determina según la fórmula siguiente:

%\ de\ catalepsia = media\ aritmética/6\ X\ 100

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III. Pruebas in vivo para determinar la actividad contra la obesidad a) Tratamiento agudo

Se habituaron ratas normalmente tratadas a un ciclo inverso 12/12 h, y el compuesto candidato, así como la solución salina, se administraron oralmente de forma aguda. Después de la administración, se midieron a las 6 h y 24 h la ingesta de alimentos acumulada (g). Después de esto, se midió la diferencia en el peso corporal entre los animales de control y los animales tratados con el compuesto. Esta es una variación del test según Colombo et al. tal y como se describe a continuación.

B) Tratamiento a largo plazo

Las pruebas in vivo para determinar la actividad contra la obesidad de los compuestos de pirazolina de la invención se llevan a cabo tal como se describió en la publicación de G. Colombo et al., "Appetite Suppression and Weight Loss after the Cannabinoid Antagonist SR 141716"; Life Sciences, 63 (8), 113-117, (1998). La parte respectiva de la descripción se incorpora como referencia al presente documento y forma parte de la presente descripción.

IV. Pruebas in vivo para determinar la actividad antidepresora

Las pruebas in vivo para determinar la actividad antidepresora de los compuestos de pirazolina de la invención en la prueba de natación forzada se llevan a cabo tal como se describió en la publicación de E.T. Tzavara et al., "The CB1 receptor antagonist SR141716A selectively increases monoaminargic neurotransmission in the medial prefrontal cortex: implications for therapeutic actions"; Br. J. Pharmacol. 2003, 138(4):544:53. La parte respectiva de la descripción se incorpora como referencia al presente documento y forma parte de la presente descripción.

V. Determinación del efecto de la administración continuada de los compuestos de la invención en el peso corporal de las ratas

El peso de los animales se midió durante 36 días y los datos se agruparon en 3 periodos para el análisis: Periodo 1, días 1-8 (periodo para la adaptación de los animales a las condiciones ambientales: una semana sin tratamiento más el primer día del tratamiento); Periodo 2, días 9-22 (periodo de tratamiento: dos semanas); Periodo 3, días 23-36 (periodo de tratamiento de salida: dos semanas). La administración de los fármacos se inició el día 8, se pesó el animal inmediatamente después, y se acabó el día 21. El periodo de tratamiento varía entre el día uno después de la primera administración y un día después de la última administración. Los fármacos se administraron i.p. una vez al día. Para fines comparativos, los pesos absolutos se transformaron en porcentajes relativos (cada peso se dividió por el del día 8 y se multiplicó por 100). Se construyeron tres grupos de tratamiento: vehículo, N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (10 mg/kg) racémico y (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (10 mg/kg).

VI. Determinación in vitro del antagonismo para el receptor CB1 Preparación de la membrana

Se cultivaron células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan de forma estable el receptor de cannabinoide humano 1 recombinante en una mezcla de nutrientes F12 de Ham suplementado con un 10% de suero bovino fetal inactivado con el calor, 2 mM de L-glutamina, 50 U/ml de penicilina, 50 U/ml de estreptomicina y 0,5 mg/ml de geneticina. Con el fin de obtener células, se lavaron los matraces de cultivo dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se rascaron. A continuación, se recogieron las células mediante centrifugación (200 x g, 10 minutos) y se guardaron en seco a -80ºC. Las células se homogeneizaron en HEPES 20 mM enfriado con hielo, EDTA 10 mM (pH 7,5) y se centrifugaron a 40.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. El pélet se resuspendió en HEPES 20 mM, EDTA 0,1 mM (pH 7,5) y se centrifugó durante 15 minutos a 4ºC. El pélet final se resuspendió en HEPES 20 mM, EDTA 0,1 mM (pH 7,5) y se dividió en partes alícuotas y se guardaron a -80ºC hasta su uso.

Ensayo de unión a [^{35}S]GTP\gammaS

La reacción se realizó en placas de 96 pocillos. Las membranas se incubaron (15 \mug/pocillo) durante 60 minutos a 30ºC en tampón (HEPES 50 mM, KCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM, EDTA 1 mM, albúmina de suero bovino al 0,1% p/v, GDP 5 \muM, saponina (10 \mug/ml), [^{35}S]GTP\gammaS 0,5 nM, pH 7,4) con un compuesto a una concentración final de 1 \muM en ausencia o presencia de una curva dosis-respuesta de agonista WIN 55,212-2 entre 3 nM y 3 \muM. La incubación se terminó mediante filtración rápida a través de fibra de vidrio FB Millipore Multiscreen y se enjuagó dos veces con tampón de ensayo enfriado en hielo. Las placas de filtrado se secaron y se añadieron 30 \mul de líquido de centelleo. La radioactividad se determinó utilizando Wallac Microbeta Trilux. Cada experimento se realizó al menos por duplicado. Se realizó

\hbox{sistemáticamente un
experimento  de dosis-respuesta de WIN
55,212-2 sola o en presencia de Rimonabant (1
 \mu M).}

Cálculos

El promedio de unión de [^{35}S]GTP\gammaS basal se sustrajo se todos los datos de unión. Con el fin de comparar los resultados de antagonismo de un grupo de cribado con respecto a otro, la diferencia entre el efecto agonista máximo de Win 55,212-2 solo y el efecto de antagonismo máximo debido a WIN 55,212-2 más Rimonabant (1 \muM) se definió como el 100%.

Métodos adicionales Ingesta de alcohol

Se puede utilizar el siguiente protocolo para evaluar los efectos de la ingesta de alcohol en ratas hembra (por ejemplo, criadas en la Universidad de Indiana) que prefieren alcohol con un historial extenso de bebida. La siguiente referencia proporciona una descripción detallada de ratas P: Lumeng, L. et al., "Different sensivities to etanol in alcohol-preferring and non-prefering rats," Pharmacol, Biochem Behav., 16, 125-130 (1982).

A las ratas hembra se les proporcionó dos horas de acceso a alcohol (10% v/v y agua, elección de dos botellas) diariamente al inicio del ciclo oscuro. Las ratas se mantienen en un ciclo inverso para facilitar interacciones experimentales. A los animales se les asignó inicialmente cuatro grupos equiparados para las ingestas de alcohol: Grupo 1- vehículo; Grupo2 - control positivo (por ejemplo, 5,6 mg/kg AM251; Grupo 3 - dosis baja de compuesto candidato; y Grupo 4 - dosis alta de compuesto candidato. Los compuestos de prueba se mezclan generalmente en un vehículo de ciclodextrina al 30% (p/v) en agua destilada a un volumen de 1-2 ml/kg. Las inyecciones de vehículo se proporcionan a todos los grupos durante los primeros dos días del experimento. A continuación durante 2 días se proporcionan inyecciones de fármaco (a los grupos apropiados) y un día final de inyecciones de vehículo. En los días de inyección de fármacos, los fármacos se proporcionan sc 30 minutos antes de un periodo de acceso al alcohol de 2 horas. La ingesta de alcohol para todos los animales se mide durante el periodo de prueba y se realiza una comparación entre los animales tratados con fármaco y los animales tratados con vehículo para determinar los efectos de los compuestos en el comportamiento en la bebida de alcohol.

Se pueden realizar estudios de bebida adicionales utilizando ratones C57BI/6 hembra (Charles River). Varios estudios han demostrado que esta raza de ratones consumirá fácilmente alcohol requiriendo poca o ninguna manipulación (Middaugh et al., "Etanol Consumption by C57BU6 Mice: Influence of Gender and Procedural Variables" Alcohol, 17 (3), 175-183, 1999; Le et al., "Alcohol Consumption by C57BL/6, BALA/c y DBA/2 Mice in a Limited Access Paradigm" Pharmacology Biochemistry and Behaviour, 47, 375-378, 1994).

Por ejemplo, tras su llegada, los ratones se colocan individualmente y se les proporciona un acceso ilimitado a comida para rata en polvo, agua y una solución de alcohol al 10% (p/v). Después de 2-3 semanas de acceso ilimitado, el agua se limita durante 20 horas y el alcohol se limita a sólo 2 horas de acceso diario. Esto se realiza en una manera en que el periodo de acceso fueron las 2 últimas horas de la parte oscura del ciclo de luz.

Una vez se estabiliza el comportamiento con la bebida, pueden comenzar las pruebas. Los ratones se consideran estables cuando el consumo promedio de alcohol durante 3 días es del 20% del promedio para los 3 días. El día 1 de prueba consiste en que todos los ratones reciben la inyección del vehículo (sc o ip). De treinta a 120 minutos después de la inyección se proporciona acceso al alcohol y el agua. Se calcula el consumo de alcohol para ese día (g/kg) y se asignan a un grupo, de manera que todos los grupos tienen una ingesta de alcohol ambiguo. En los días 2 y 3, se inyectan a los ratones vehículo o fármaco y se sigue el mismo protocolo que el día anterior. El día 4 se enjuagan y no se proporcionan inyecciones. Los datos se analizan utilizando mediciones ANOVA repetidas. El cambio en el consumo de agua o alcohol se compara con el vehículo para cada día de la prueba. Los resultados positivos se interpretarían como un compuesto que era capaz de reducir significativamente el consumo de alcohol sin tener efectos en el agua.

Métodos del consumo de oxígeno

El consumo total de oxígeno en el cuerpo se mide utilizando un calorímetro indirecto (Oxymax de Columbus Instruments, Columbus, OH) en ratas Sprague Dawley macho (si se utilizan otra raza de ratas o ratas hembra, se especificará). Las ratas (por ejemplo 300-380 g de peso corporal) se colocan en cámaras de calorímetro y las cámaras se colocan en monitores de actividad. Estos estudios se realizan durante el ciclo de luz. Antes de la medición del consumo de oxígeno, las ratas se alimentan con comida estándar ad libitum. Durante la medición del consumo de oxígeno, el alimento no está disponible. El consumo de oxígeno pre-dosis basal y la actividad móvil se miden cada 10 minutos de 2,5 a 3 horas. Al final del periodo de pre-dosificación basal, las cámaras se abren y se les administra a los animales una dosis única de compuesto (el intervalo normal de dosificación es de 0,001 a 10 mg/kg) mediante sonda oral (u otra ruta de administración según se especifique, es decir, sc, ip, iv). Los fármacos se preparan en metilcelulosa, agua u otro vehículo especificado (entre los ejemplos se incluyen PEG400, beta-ciclo dextrano al 30% y propilenglicol). El consumo de oxígeno y la actividad móvil se miden cada 10 minutos durante un periodo adicional posterior a la dosificación de 1 a 6 horas.

El software del calorímetro Oxymax calcula el consumo de oxígeno (ml/kg/h) en base a la velocidad de flujo de aire a través de las cámaras y la diferencia en el contenido de oxígeno en los puertos de entrada y salida. Los monitores de actividad tienen 15 haces de luz infrarroja espaciadas en cada eje por una pulgada, la actividad móvil se registra cuando dos haces consecutivos se rompen y se registran los resultados como recuentos.

El consumo de oxígeno en reposo, durante el periodo de antes y después de la dosificación, se calcula haciendo el promedio de los valores de consumo 0_{2} en 10 minutos, excluyendo los periodos de actividad móvil elevada (recuento de la actividad móvil > 100) y excluyendo los 5 primeros valores del periodo de pre-dosificación y el primer valor del periodo posterior a la dosificación. El cambio en el consumo de oxígeno se indica como un porcentaje y se calcula dividiendo el consumo de oxígeno en reposo posterior a la dosificación entre el consumo de oxígeno de pre-dosificación * 100.

\hbox{Los experimentos se realizarán habitualmente con n =
4-6 ratas  y los resultados se indican como media
+/- SEM.}

Interpretación

Un aumento en el consumo de oxígeno superior a un 10% se considera como un resultado positivo. Históricamente, las ratas tratadas con vehículo no sufren cambios en el consumo de oxígeno respecto a la pre-dosis basal.

Dependencia de la nicotina

Se puede utilizar un modelo de la preferencia del modelo o lugar para la auto-administración de nicotina intravenosa para evaluar los efectos de un compuesto candidato sobre la dependencia con la nicotina (véase, por ejemplo, Vastola, et al., Physiol. Beba. 77: 107-114, 2002; Brower, et al., Brain Res. 930: 12-20, 2002).

Preferencia del lugar

Se utilizan en estudio ratas de Sprague-Dawley (Vastola, et al., 2002). Los animales se ubican en un ciclo de iluminación 12 h/12 h con la temperatura controlada con un acceso ad libitum a la comida y el agua. El acondicionamiento y las pruebas se realizan en una cámara dividida en dos compartimentos con una puerta separando los dos compartimentos. El comportamiento de los animales se registra mediante videocámara.

Se habitúan los animales al proceso de inyección durante varios días. A continuación, los animales se colocan en la cámara de prueba con libre acceso a ambos compartimentos. Se determina la preferencia inicial por un compartimento concreto. Para las pruebas de acondicionamiento, se inyecta nicotina a los animales y se restringen al compartimento no preferido, o se inyecta solución salina a los animales y se restringen al compartimento preferido. En el día de la prueba, se elimina la puerta que separa los compartimentos, el animal se coloca en el centro de la cámara y se deja que se mueva libremente entre los compartimentos. Se anota el tiempo empleado en cada compartimento. La ocupación preferencial del compartimento de nicotina sigue los efectos de refuerzo acondicionados de la nicotina.

Auto-administración

La autoadministración en animales es un vaticinador de un abuso potencial de un compuesto en humanos. Las modificaciones para este procedimiento también pueden utilizarse para identificar compuestos que previenen o bloquean las propiedades de refuerzo de drogas que tienen un abuso potencial. Un compuesto que elimina la auto-administración de una droga puede evitar el abuso de la droga o su dependencia.

En este estudio se utilizan ratas Sprague-Dawley. Inicialmente, los animales se sitúan en un ciclo de iluminación de 12 h/12 h con la temperatura controlada y acceso ad libitum a alimentos y comida. A continuación, se implantan en los animales catéteres yugulares que salen a través de la espalda del animal, y cada animal se coloca en una cámara operante individual (Brower, et al., 2002). Los catéteres están conectados a una bomba de jeringa dirigida por ordenador que está localizada fuera de la cámara. La cámara contiene dos palancas con una luz verde situada sobre cada palanca. La luz se ilumina cuando la nicotina está disponible.

En una prueba de autoadministración, los animales se colocan en las cámaras operantes y las palancas se designan aleatoriamente como una palanca activa e inactiva. Cada respuesta en la palanca activa produce una infusión de nicotina. La presión sobre la palanca inactiva no tiene efecto, pero también se registra. A continuación, se entrenan los animales para la autoadministración de nicotina durante un periodo establecido de tiempo mediante el acceso a una droga durante cada sesión diaria. La iluminación de la luz de la carcasa de la cámara señala el inicio de la sesión y la disponibilidad de la nicotina. Cuando la sesión finaliza se apaga. Inicialmente, tiene lugar una infusión de nicotina con cada presión de la palanca activa. Una vez se ha establecido el comportamiento de presión sobre la palanca, se aumenta el número de presiones para producir una infusión de nicotina. Después de obtenerse una autoadministración estable de nicotina, se puede evaluar el efecto de un compuesto candidato sobre el comportamiento de refuerzo de nicotina. La administración de este compuesto candidato antes de la sesión pude potenciar, extinguir o producir ningún cambio en el comportamiento de la autoadministración. Las pruebas se realizan cada dos días y se controla el orden de administración del compuesto candidato.

Experimentos de Alzheimer/demencia Tarea del Laberinto de agua de Morris

El laberinto de agua de Morris es una prueba de comportamiento in vivo para medir el aprendizaje y la memoria de la orientación espacial a través de una tarea de aprendizaje compleja. Es muy adecuado para compuestos de prueba que aumentan el aprendizaje y la memoria. Se llena con agua un tanque o piscina circular (diámetro 2 m, altura 0,7 m) y se coloca una plataforma de 10 cm^{2} 1-1,5 cm por debajo de la superficie del agua en una posición definida dentro de la piscina. La plataforma de escape no es viable para un animal que nada en el tanque de agua. Para el experimento, se coloca una rata o un ratón en la piscina para que nade libremente.

Los animales tienen la tarea de localizar la plataforma sumergida y se miden el tiempo y la distancia requerida para su recuperación satisfactoria. Se disponen múltiples indicadores externos al laberinto mediante el mobiliario de la habitación, incluyendo mesas, equipo informático, un segundo tanque de agua, la presencia del experimentador y mediante una radio sobre una estantería que suena bajito.

Antes de la administración del compuesto candidato, los animales se entrenan en la tarea 4 veces al día durante 5 días. Los compuestos de prueba se administran oral o intraperitonealmente en el día del experimento en un tiempo definido (por ejemplo, 30 minutos antes de la primera prueba de nado). Los animales de control se dosifican con el correspondiente vehículo que no contiene compuesto candidato. Los compuestos activos producen tiempos y distancias más cortas para localizar la plataforma (es decir, cuanto mejor recuerda el animal la localización de la plataforma, menor es la distancia cubierta y más rápidamente alcanza la plataforma).

La prueba también se puede llevar a cabo utilizando animales transgénicos o deteriorados cognitivamente. El deterioro cognitivo está inducido por la edad avanzada o experimentalmente mediante lesiones cerebrales, tales como lesiones bilaterales del córtex entorrinal en ratas. Dichas lesiones se pueden inducir mediante inyecciones intracerebrales del ácido iboténico de la excitotoxina.

Tarea de reconocimiento del objeto

La tarea de reconocimiento del objeto se utiliza para evaluar los efectos de los compuestos en el rendimiento cognitivo de los roedores. Se coloca una rata en un campo abierto, en el que se sitúan dos objetos idénticos. Las ratas inspeccionan ambos objetos durante la prueba inicial del ensayo. Después de cierto intervalo de retención (por ejemplo, 24 horas), se realiza una segunda prueba. Aquí, uno de los dos objetos utilizados en la primera prueba (el objeto "familiar") y un objeto nuevo se colocan en el campo abierto y se mide el tiempo de inspección en cada uno de los objetos. Una buena retención se refleja mediante tiempos de exploración superiores hacia el objeto nuevo en comparación con el objeto "familiar".

La administración del potenciador cognitivo putativo anterior a la primera prueba permite predominantemente la evaluación de los efectos de adquisición y en los procesos de consolidación. La administración del compuesto candidato después de la primera prueba permite la evaluación de los efectos en los procesos de consolidación, mientras que la administración antes de la segunda prueba permite medir los efectos en procesos de recuperación.

Tarea de evitamiento pasivo

La tarea de evitamiento pasivo evalúa el rendimiento de la memoria en ratas y ratones. El evitamiento inhibidor utiliza un aparato que consiste en una caja con dos compartimentos separados por una puerta con guillotina que puede ser manipulada por el experimentador. Un compartimento está iluminado con luz brillante y el otro compartimento está oscuro. Un umbral de 2 cm separa los dos compartimentos cuando la puerta con guillotina se eleva 15 cm. Cuando se abre la puerta, la iluminación en el compartimento oscuro es de aproximadamente 2 lux. La intensidad de la luz es de aproximadamente 500 lux en el centro del suelo del compartimento con luz.

Se proporcionan dos sesiones de habituación, una sesión de shock y una sesión de retención, separados por intervalos entre sesiones de 24 horas. Durante las sesiones de habituación y la sesión de retención, se deja que la rata explore el aparato durante 300 segundos. La rata se coloca en el compartimento con luz, de cara a la pared opuesta a la puerta en forma de guillotina. Después de un periodo de alojamiento de 15 segundos, se abre la puerta con guillotina, de manera que todas las partes del aparato se pueden visitar libremente. Las ratas normalmente evitan las áreas iluminadas de forma brillante y entrarán en el compartimento oscuro en pocos segundos.

En la sesión de shock, la puerta con guillotina entre los compartimentos se baja tan pronto como la rata haya entrado en el compartimento oscuro con todas las patas y se administra un shock en las patas de 1 mA durante 2 segundos. A continuación, la rata se extrae del aparato y se devuelve a su jaula. El procedimiento durante la sesión de retención es idéntico al de las sesiones de habituación.

La latencia de evitación inhibitoria ("step-through"), es decir, la primera latencia de entrada en el compartimento oscuro (en segundos) durante la sesión de retención es un índice del rendimiento de la memoria del animal: se presume una mejor retención si la latencia para entrar en el compartimento oscuro es mayor. Se proporciona un compuesto candidato 30 minutos antes de la sesión de shock junto con 1 mg/kg de escopolamina. La escopolamina perjudica el rendimiento de la memoria durante la sesión de retención 24 horas después. Si el compuesto candidato aumenta la latencia de entrada en comparación con los controles tratados con escopolamina, se considera que posee una actividad potenciadora de la cognición.

Tarea de alternancia espontánea en el laberinto T

La tarea de alternancia espontánea en el laberinto en forma de T (TeMCAT) valora el rendimiento de la memoria espacial en ratones. El brazo de partida y los dos brazos objetivos del laberinto en forma de T se disponen con puertas con guillotinas que se pueden manipular manualmente por el experimentador. Se coloca un ratón en el brazo de partida al inicio del entrenamiento. En la primera prueba, el brazo objetivo izquierdo o derecho se bloquean bajando la respectiva puerta con guillotina (prueba forzada).

Después de que el ratón se haya liberado del brazo de partida, explorará el laberinto, entrando finalmente en el brazo objetivo abierto, y volverá a la posición de partida, donde estará confinado durante 5 segundos al bajar la puerta con guillotina. A continuación, el animal puede elegir libremente entre el brazo objetivo izquierdo y derecho (todas las puertas con guillotina abiertas) durante 14 pruebas adicionales (pruebas de libre elección). Tan pronto como un ratón haya entrado en un brazo objetivo, el otro brazo se cierra. El ratón vuelve finalmente al brazo de partida y es libre de visitar cualquier brazo que quiera después de haber sido confinado al brazo de partida durante 5 segundos. Después de completar las 14 pruebas de libre elección en una sesión, el animal se extrae del laberinto.

Se calculan las alternancias en porcentaje de las 14 pruebas. Se analiza este porcentaje y el tiempo total necesario para completar la primera prueba forzada y las posteriores 14 pruebas de elección libre (en segundos). Además, los déficits cognitivos se pueden inducir mediante la inyección de escopolamina 30 minutos antes del inicio de la sesión de entrenamiento. Un potenciador de la cognición, administrado antes del inicio de la sesión de entrenamiento, antagonizará, al menos parcialmente, la reducción inducida por escopolamina en la tasa de alternancia espontánea.

Modelo de depresión

Se puede utilizar un modelo de nado forzado o suspensión por la cola para valorar la eficacia de los compuestos antidepresivos (véase, por ejemplo, Prosolt et al., Nature 266: 730-732, 1977; Stem et al., Psychopharmacology 85: 367-370, 1985).

Prueba de nado forzado

Las ratas o ratones se colocan en un cilindro lleno de agua a 23-25ºC del que no es posible escapar. Inicialmente, los animales luchan y tratan de escapar, pero finalmente adoptan una postura inmóvil característica y no hacen más intentos de escapar a excepción de pequeños movimientos necesarios de sus cabezas por encima del agua. Se dosifican los animales con un compuesto y un observador mide la actividad (natación o escalada) o la inmovilidad. La inmovilidad es considerada por algunos como el reflejo de una "desesperación del comportamiento" en la que los animales cesan de luchar para escapar de la situación adversa. Una gran variedad de antidepresivos clínicamente utilizados (TCAs, MAOIs, SSRIs, atípicos) disminuyen la movilidad en esta prueba y presenta una buena validez predictiva en el hecho de que detecta antidepresivos con diferentes mecanismos de acción, pero su validez teórica es débil. Los fármacos antidepresivos farmacológicamente selectivos producen al menos dos patrones de comportamiento activos diferentes. Los inhibidores de recaptación selectivos de serotonina aumentan el comportamiento de natación, mientras que los fármacos que actúan principalmente para aumentar los niveles extracelulares de norpinefrina o dopamina aumentan el comportamiento de escalada. Existen falsos positivos (psicoestimulantes), pero relativamente pocos falsos negativos (agonistas [beta]-adrenérgicos). La prueba es sensible relajantes musculares (benzodiazepinas) y efectos sedativos (neurolépticos) conduciendo a una mayor inmovilidad. Los falsos positivos y los falsos negativos se pueden cribar frecuentemente mediante la medición de si el compuesto produce estimulación o sedación
locomotora.

Prueba de suspensión por la cola

Cuando se suspenden por la cola, los ratones inicialmente lucharán e intentarán escapar y, a continuación, alternarán entre intentos activos por escapar y la inmovilidad. En esta prueba, se dosifican los animales con un compuesto y un observador mide la inmovilidad durante 6 minutos. Porsolt describe el comportamiento inmóvil como la "desesperación del comportamiento" en la que los animales cesan de luchar para escapar de la situación adversa. Una gran variedad de antidepresivos clínicamente utilizados (tricíclicos, MAOIs, SSRIs y atípicos) reducen la inmovilidad en este modelo. La prueba tiene una buena validez predictiva para la actividad antidepresiva y funciona para la mayoría de las clases de antidepresivos pero incluyendo algunos falsos positivos (psicoestimulantes). La prueba es sensible relajantes musculares (benzodiazepinas) y efectos sedativos (neurolépticos) conduciendo a una mayor inmovilidad. Los falsos positivos y los falsos negativos se pueden cribar frecuentemente mediante la medición de si el compuesto produce estimulación o sedación locomotora. En los ratones se han observado diferencias entre razas en la suspensión por la cola. La prueba de suspensión por la cola tiene cierta validez aparente pero su validez teórica es bastante
débil.

Modelo de esquizofrenia

Se puede utilizar un modelo de inhibición por prepulso para valorar la eficacia de compuestos antipsicóticos (véase Swerdlow y Geyer, Schizophrenia Bulletin 24: 285-301, 1998).

Inhibición por prepulso

La inhibición por prepulso es el proceso mediante el cual un estímulo relativamente suave, el prepulso, suprime la respuesta a un estímulo fuerte para la obtención de sobresaltos cuando el prepulso precede al estímulo del susto durante una duración breve (aproximadamente de 10 a 50 milisegundos). La inhibición por prepulso es un fenómeno de especies cruzadas (es decir, está presente en mamíferos que varían desde ratones a humanos), aunque está relativamente ausente entre pacientes esquizofrénicos. Se cree que el déficit de PPI en pacientes esquizofrénicos refleja la pérdida de sobresalto sensoromotriz que puede conducir a una inundación sensorial y fragmentación cognitiva. En esta prueba, a los ratones o ratas se les administran compuestos y se colocan individualmente en un recipiente sobre una plataforma transductora para medir el sobresalto de todo el cuerpo. El recipiente está situado en una cámara de sobresalto con un ruido blanco de fondo. Ras un breve periodo de habituación, los animales se someten a múltiples pruebas de un estímulo de prepulso auditivo débil, seguido de un estímulo de sobresalto auditivo fuerte. Se aplican cuatro tipos de prueba: prepulso más sobresalto, prepulso solo, sobresalto solo, y sin estimulación. Se mide el PPI como la cantidad de inhibición de sobresalto después del prepulso y se expresa como el porcentaje de sobresalto básico. Como control, se toman mediciones en las pruebas sin estimulación y prepulso solo. El PPI se considera que es una prueba con una buena validez predictiva, aparente y teórica para la esquizofrenia. Se pueden ensayar antipsicóticos putativos solos para determinar si aumentan el PPI. Alternativamente, se pueden cribar antipsicóticos para determinar si bloquean varios agentes que interrumpen el PPI (apomorfina, d-anfetamina, PCP, quetamina, DOI). Finalmente, los ratones mutantes con o sin fármacos se pueden cribar utilizando el procedimiento PPI.

Modelo de ansiedad

Se puede utilizar un modelo de laberinto elevado en cruz para valorar la eficacia de compuestos ansiolíticos (véase Pellow y File, Pharm. Biochem. Beba. 24, 525-529, 1986).

Laberinto elevado en cruz

El laberinto elevado en cruz se utiliza ampliamente como un paradigma de la ansiedad que examina el conflicto entre el impulso para explorar y la aversión a las alturas y los espacios abiertos de ratas y ratones. El laberinto es una cruz formada de dos brazos abiertos y dos brazos cerrados que se elevan sobre la base. Se cree que la combinación de luz, los brazos abiertos y la altura producen respuestas de miedo o ansiedad no condicionados en ratones y ratas. El aparato de ensayo es un laberinto con la parte superior abierta de plástico opaco con brazos abiertos y cerrados alternados. Para las ratas, cada brazo tiene 45-55 cm de longitud y 8-12 cm de ancho, con las caras de los brazos cerrados de 35-45 cm de altura, la junta de aproximadamente 10 x 10 cm, y el laberinto se eleva 45-55 cm por encima del suelo. El laberinto elevado en cruz para ratón consiste en dos brazos cerrados (15 x 6 x 30 cm) y dos brazos abiertos (1 x 6 x 30 cm) formando una cruz, con un centro cuadrangular (6 x 6 cm). El laberinto se sitúa 50 cm por encima del suelo. El ensayo se realiza en una habituación sin ruido ni distracciones. En los días de ensayo, se les administra a los animales fármaco o vehículo. Si es necesario un periodo de pretratamiento, los animales se devuelven a la jaula durante la duración del tiempo de pretratamiento; en caso contrario, los animales se colocan en una cámara que contiene un plástico claro de manera individual o con otros compañeros de jaula durante 1-10 minutos antes del momento del ensayo. A continuación, las ratas se colocan en el centro del laberinto siempre orientadas en la misma dirección, encarando constantemente un brazo abierto o un brazo cerrado. Durante 5-10 minutos, las entradas en cada brazo y el tiempo empleado en cada brazo son registradas por el observador u observadores o mediante cinta de vídeo o un ordenador que recibe datos de una videocámara montada sobre el laberinto. Para que cuente como entrada, las cuatro patas deben estar dentro del brazo. Si es necesario, se registrarán mediciones adicionales de comportamiento relacionados con la ansiedad, es decir, el tiempo que pasan sin movimiento, tiempo que pasan en el centro, tiempo que pasan tocándose y el número de puestas en pie ("rears"), posturas de estiramiento o heces producidas. Después del ensayo, los animales se devuelven a las jaulas. Cuando los animales se colocan en el centro del laberinto, pasan la mayor parte del tiempo en los brazos cerrados evitando los brazos abiertos. Los fármacos ansiolíticos, tales como benzodiazepinas, aumentarán la cantidad de tiempo que los animales pasan en los brazos abiertos. El ensayo también es sensible a fármacos ansiogénicos que prestan un gran soporte para su validez
predictiva.

Disfunción eréctil

Los fármacos que afectan a la función eréctil se pueden ensayar midiendo el efecto sobre el aumento en la presión cavernosa provocada por la apomorfina en la rata despierta, tal y como describe Anderson, et al., (J. Urol. 161: 1707-1712, 1999). Se implanta un extremo de un tubo de polietileno en el espacio cavernoso del pene de ratas Sprague-Dawley macho. Después de la recuperación de la cirugía, se registra la presión intracavernosa utilizando un transductor de presión conectado a un registrador en forma de bolígrafo multicanal. Las erecciones se inducen mediante la administración de apomorfina (100-250 \mug/kg s.c.) con o sin compuesto candidato, y los resultados se comparan para el grupo tratado y el grupo no tratado.

Disfunción sexual femenina

Entre los sistemas para ensayar compuestos para el tratamiento de la disfunción sexual femenina se incluyen modelos in vitro e in situ que utilizan preparaciones del músculo liso vaginal o clitoriano, evaluación histológica y evaluación del flujo sanguíneo vaginal. Los estudios in vivo de las respuestas sexuales se centran en paradigmas de comportamiento que implican una postura y receptividad lordóticas, así como índices de motivación utilizando un método por etapas ("pacing") en cámaras duales. (véase, por ejemplo, Hale, et al., Int. J. Impot. Res. 15 Suppl 5: S75-79, 2003).

La presente invención se ilustra a continuación con la ayuda de ejemplos. Estas ilustraciones se facilitan solamente a modo de ejemplo y no limitan el espíritu general de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida a) Ácido 4-(4-clorofenil)-2-oxo-3-butenoico

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1

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En un matraz de tres bocas se disolvieron p-clorobenzaldehído (13,3 g, 95 mmoles) y piruvato de etilo (10 g, 86 mmoles) en 150 ml de etanol absoluto. La disolución se enfrió con hielo hasta 0ºC y se añadió gota a gota una disolución acuosa de NaOH (3,8 g en 45 mL de agua), manteniéndose la temperatura inferior o igual a 10ºC, mediante lo cual se formó un precipitado de color amarillo anaranjado. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a 0ºC y adicionalmente durante 1,5 horas a temperatura ambiente (aproximadamente a 25ºC). Después, la mezcla de reacción se enfrió hasta aproximadamente 5ºC y se aisló la sal sódica insoluble del ácido 4-(4-clorofenil)-2-oxo-3-butenoico mediante filtración.

El filtrado se dejó en la nevera durante la noche, mediante lo cual se formó más precipitado, que se separó por filtración, se combinó con la primera fracción de la sal y se lavó con dietil éter. La sal sódica del ácido 4-(4-clorofenil)-2-oxo-3-butenoico se trató entonces con una disolución de HCl 2N, se agitó durante algunos minutos y se separó mediante filtración ácido 4-(4-clorofenil)-2-oxo-3-butenoico sólido y se secó para dar 12,7 g del producto deseado (70% del rendimiento teórico).

IR (KBr, cm^{-1}): 3500-2500, 1719,3, 1686,5, 1603,4, 1587,8, 1081,9.

^{1}H-RMN (CDCl_{3}, \delta): 7,4 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,5 (d, J=16,1Hz, 1H), 7,6 (d, J=8,4 Hz, 2H), 8,1(d, J=16,1 Hz, 1H).

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b) Ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidropirazol-3-carboxílico

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2

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Se mezclaron el ácido 4-(4-clorofenil)-2-oxo-3-butenoico obtenido según la etapa a) (12,6 g, 60 mmoles), clorhidrato de 2,4-diclorofenilhidrazina (12,8 g, 60 mmoles) y ácido acético glacial (200 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno y se calentaron a reflujo durante 4 horas, se enfrió hasta la temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC) y se añadió a agua con hielo, mediante lo cual se obtuvo una masa pegajosa que se extrajo con cloruro de metileno. Las fracciones de cloruro de metileno combinadas se lavaron con agua, se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron hasta sequedad para dar un sólido amarillo pálido (12,7 g, 57% del rendimiento teórico).

IR (KBr, cm^{-1}): 3200-2200, 1668,4, 1458, 1251,4, 1104,8.

^{1}H-RMN (CDCl_{3}, \delta): 3,3 (dd, 1H), 3,7 (dd, 1H), 5,9 (dd, 1H), 7,09-7,25 (m, 7H).

(c) Cloruro del ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidropirazol-3-carboxílico

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3

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Bajo atmósfera de nitrógeno, se disolvió el ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidropirazol-3-carboxílico (2,5 g, 6,8 mmoles) obtenido según la etapa (b) en 4 mL de y se calentó a reflujo durante 2,5 horas. El cloruro de tionilo en exceso se elimina de la mezcla de reacción a presión reducida y el residuo bruto resultante (2,6 g) se utiliza sin purificación adicional.

IR (KBr, cm^{-1}): 1732,3, 1700, 1533,3, 1478,1, 1212,9, 826,6.

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d) N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidropirazol-3-carboxamida [este compuesto también puede denominarse como piperidin-1-ilamida del ácido 5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxílico o como 1-(2,4-diclorofenil)-5-(4-clorofenil)-4,5-dihidro-N-(piperidin-1-il)-1H-pirazol-3-carboxamida]

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4

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Bajo atmósfera de nitrógeno, se disolvieron N-aminopiperidina (0,6 mL, 5,6 mmoles) y trietilamina (4 mL) en cloruro de metileno (25 mL). La mezcla resultante se enfrió con hielo hasta 0ºC y se añadió gota a gota una disolución del cloruro del ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico obtenido en la etapa (c) en cloruro de metileno (15 mL). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC) durante la noche. Después, la mezcla de reacción se lavó con agua, seguido por una disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio, entonces de nuevo con agua, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó hasta sequedad en un rotavapor. El sólido bruto resultante se cristalizó en etanol. El sólido cristalizado se separó mediante filtración y las aguas madres se concentraron para dar una segunda fracción de producto cristalizado. La dos fracciones se combinaron para dar una cantidad total de 1,7 g (57% del rendimiento teórico) de N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidropirazol-3-carboxamida que tiene un punto de fusión de 183-
186ºC.

IR (KBr, cm^{-1}): 3222,9, 2934,9, 1647,4, 1474,7, 1268,3, 815,6.

^{1}H-RMN (CDCl_{3}, \delta): 1,4 (m, 2H), 1,7 (m, 4H), 2,8 (m, 4H), 3,3 (dd, J=6,1 y 18,3Hz, 1H), 3,7 (dd, J=12,5 y 18,3 Hz, 1H), 5,7 (dd, J=6,1 y 12,5 Hz, 1H), 7,0-7,2 (m, 6H), 7,4 (s, 1H).

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Ejemplo 2-1

Polimorfo \alpha de N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida

El polimorfo \alpha se obtuvo por evaporación de una solución del compuesto según el ejemplo 1 (N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida) en etanol a temperatura ambiente (25ºC).

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Ejemplo 2-2

El polimorfo \alpha se obtuvo por evaporación de una solución del compuesto según el ejemplo 1 (N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida) en metanol a temperatura ambiente (25ºC).

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Ejemplo 2a

Estructura cristalina del polimorfo \alpha de N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida

Los cristales adecuados para la determinación de cristales individuales por rayos X se pudieron obtener a partir de metanol y etanol (también dimetilformamida) mediante evaporación lenta a temperatura ambiente. Habitualmente, la modificación \alpha (polimorfo \alpha) crece en forma de agujas iguales.

Se ensayó un cristal seleccionado utilizando una determinación de estructura cristalina individual por rayos X.

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Procedimiento

Los cristales medidos se seleccionaron utilizando un estereomicroscopio Zeiss que utiliza luz polarizada y se prepararon en condiciones inertes sumergidos en perfluoropoliéter como aceite protector para la manipulación. La determinación de la estructura cristalina se llevó a cabo utilizando un difractómetro Bruker-Nonius equipado con un detector de área APPEX 2 4K CCD, un ánodo rotatorio FR591 con radiación Mo_{\kappa\alpha}, espejos Montel como monocromador y un dispositivo de baja temperatura Kyroflex (T = 1000 K). Recogida de datos de toda la esfera (fullsphere) por rastreo omega y phi. El análisis se realizó con software.

El polimorfo \alpha cristaliza en una celda triclínica.

En la tabla 1 siguiente se proporciona un resumen de las constantes de celda:

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5

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Ejemplo 2b

Análisis por DSC del polimorfo \alpha de N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida

Los análisis con calorimetría diferencial de barrido (DSC) se registraron en Mettler Toledo DSC822e. Se pesaron muestras de aproximadamente 2 mg en crisoles de aluminio de 40 \mul con una tapa de orificio pequeño y se sometieron, bajo nitrógeno (50 ml/min) al programa de temperaturas.

El análisis por DSC del polimorfo \alpha presenta un pico de fusión estrecho con un inicio de 183-184ºC y un máximo a 184-186ºC. La entalpía de fusión es -87 \pm 4 J/g, aunque esto es ligeramente variante entre muestras.

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La siguiente tabla muestra los diferentes picos de fusión:

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Ejemplo 2c

Análisis TG del polimorfo \alpha de N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida

Los análisis termogravimétricos (TGA) se registraron en un Mettler Toledo SDTA851e. Se pesaron muestras den aproximadamente 2 mg en crisoles abiertos de 40 \mul de alúmina y se calentaron a 10ºC/min entre 30 y 600ºC, bajo nitrógeno (80 ml/min).

El análisis TG del polimorfo \alpha presenta una pérdida de peso que se observa a temperaturas superiores a 280ºC debido a la descomposición y no se observó pérdida de peso a temperaturas más bajas.

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Ejemplo 2d

Espectro FTIR del polimorfo \alpha de N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida

Los espectros de FTIR se registraron utilizando un Bruker Tensor 27, equipado con un sistema ATR de reflexión única de puerta dorada MKII, una fuente de infrarrojo medio como fuente de excitación y un detector DTGS. Todos los espectros se obtuvieron a una resolución de 2 cm^{-1} y 64 rastreos. No se requirió la preparación de la muestra para realizar el análisis.

Un ejemplo representativo del espectro FTIR del polimorfo \alpha se muestra en la figura 10.

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Ejemplo 2e

Espectro FTRaman del polimorfo \alpha de N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida

Los espectros FTRaman se registraron utilizando un espectrómetro FTRaman Termo Nicolet NXR con un láser de infrarrojo próximo Nd-YVO4 (1064 nm) a 200 mW como fuente de excitación y un detector de germanio. Todos los espectros se obtuvieron a una resolución de 4 cm^{-1} y 32 rastreos, y se utilizó un modo de recogida "backscattering" (por retorno) de 180º. La muestra se colocó en un tubo capilar de vidrio con un diámetro externo de 1,6 mm y se analizó sin manipulación adicional.

El espectro de FTRaman del polimorfo \alpha muestra bandas intensas a 2932, 1647, 1593, 1394, 1269, 1253, 1109, 1084, 1047, 783 y 661 cm^{-1}. El espectro presenta desplazamientos Raman alrededor de 1253, 1084, 533 y 364
cm^{-1}.

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Ejemplo 2f

Patrón de difracción de rayos X en polvo estándar del polimorfo \alpha de N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida

Con el fin de obtener patrones de difracción en polvo de los sólidos obtenidos, se prepararon aproximadamente 20 mg de las muestras no manipuladas en recipientes para muestras estándar utilizando papel de poliacetato.

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Los patrones de difracción en polvo se obtuvieron en un sistema de difracción en polvo D8 Advance Series 2 Theta/Theta utilizando radiación Cu_{K\alpha} en geometría de transmisión. El sistema está equipado con un contador de Centelleo (NaI), un monocromador de Germanio, una plataforma de muestras en la posición nueve, ranuras de divergencia fijadas y una ranura "soller" secundaria. Programas utilizados: recogida de datos con DIFFRAC más XRD Commander V.2.4.1 y evaluación con EVA V.9.0.0.2.

Para una muestra representativa, véase la figura 8. La muestra también se midió utilizando un una muestra micronizada del polimorfo \alpha (figura 9)

La tabla siguiente proporciona una lista de los picos seleccionados obtenidos (valores d en \ring{A})

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7

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Ejemplo 2g

Comportamiento del polimorfo \alpha de N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida bajo presión

Las muestras del polimorfo \alpha se sometieron a una tensión por presión durante varios periodos de tiempo (1, 5 y 30 minutos) para investigar el efecto de presión en la forma sólida. La presión utilizada (98 kN) se escogió para corresponder con la presión a la que se fabrican los comprimidos planos de un diámetro entre 10 y 15 mm. La aplicación de presión en las muestras no indujo ningún cambio de fase. No se observaron diferencias para tiempos en el experimento entre 1 y 30 minutos.

De forma concreta, se sometieron muestras del polimorfo con un diámetro de 13 mm a una presión de 98,07 kN utilizando una prensa Specac durante 1, 5 y 30 minutos y se analizó sin diferencias.

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Datos farmacológicos

Ejemplo farmacéutico

Efecto del Compuesto C (Ejemplo 1/(rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida) en el control glicérico y en otras alteraciones metabólicas asociadas con la etiología de la tolerancia a la glucosa/resistencia a la insulina alteradas y/o la diabetes tipo 2 Métodos Experimento en ratas Sprague-Dawley macho inducidas por la dieta (DIO)

El experimento se realizó sobre ratas Sprague-Dawley macho, criadas selectivamente, que se evaluaron a las 3-5 semanas de edad que tienen una predisposición para convertirse en obesas. Estos animales se mantuvieron en un ciclo normal de luz (Luces encendidas entre las 06.00 h y 18.00 h) en condiciones controladas de temperatura. A continuación, se dio acceso libre a estas ratas a una dieta comercial, rica en grasas y con gran energía. Los animales para el estudio tenían 24 semanas de vida al inicio del experimento.

Se inyectó por vía intraperitoneal a grupos de ratas el Compuesto C (10 mg/kg en Tween al 0,1% en solución salina; n = 15) o vehículo (Tween al 0,1% en solución salina; n = 10). Se inyectó diariamente a los animales entre 09.00 h y 11.00 h y se midieron diariamente la ingesta de alimento y el peso corporal en el momento de la inyección desde el Día-0.

Ensayo oral de tolerancia a la glucosa

En el Día 21, se administró a grupos de ratas ligeramente en ayunas tratadas con compuesto y vehículo 2 g/kg de glucosa (en forma de una solución de 2 g/ml) mediante un tubo gástrico colocado en el estómago. Se tomaron muestras de sangre para las determinaciones de insulina en plasma a -30 min, 0, 15, 30, 60 y 120 min.

Muestreo de sangre

Se tomaron muestras de sangre de las venas de la cola de ratas ligeramente en ayunas (restringidas al 50% de su ingesta de alimento normal en el periodo de 20 h antes del muestreo) para la determinación de concentraciones en plasma de triglicéridos FFA e insulina en el Día 1 y el Día 21.

Determinación de las concentraciones de lípidos e insulina en plasma

Las concentraciones de triacilglicerol en plasma se determinaron usando un ensayo enzimático automatizado convencional y los FFA se cuantificaron usando un ensayo colorimétrico basado en la acil-CoA oxidasa. El nivel de insulina en plasma se determinó por un procedimiento de ELISA ultra-sensible.

Análisis de depósitos de grasa

En el día de la terminación del experimento, se retiraron y pesaron los depósitos de grasa inguinal, del epidídimo, del mesenterio y retroperitoneal.

Análisis estadísticos

Los cálculos y análisis estadísticos se realizaron usando los paquetes de software GraphPad y Statview. Se usó un ANOVA de una vía seguido de ensayo post hoc de Fischer para analizar los datos experimentales. Se ajustó P < 0,05 como el nivel de aceptación para una diferencia significativa entre grupos.

Experimento en ratas Wister hembra inducidas por la dieta (DIO) Procedimientos Animales

El experimento se realizó en ratas Wistar hembra (originalmente en el intervalo de peso de 250-300 g). Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de fase inversa (las luces apagadas durante 8 horas de 09.30 a 17.30 h) tiempo durante el cual la habitación se iluminó con luz roja. Los animales tuvieron acceso libre a dieta rica en grasas en polvo (VRF1 más 20% de manteca), chocolate molido, cacahuetes molidos y agua corriente en todo momento. Las tres diferentes dietas estaban contenidas en diferentes tarros de alimentación de vidrio con tapas de aluminio con un corte hueco de 3-4 cm en el mismo para permitir el acceso al alimento. Los animales se colocaron en parejas durante doce semanas para la inducción de la obesidad. A continuación, los animales se colocaron individualmente en jaulas de polipropileno con suelos con rejilla de alambre para posibilitar el registro de la ingesta de alimento de cada rata. Se colocaron bandejas de polipropileno con almohadillas de jaula por debajo de cada jaula para detectar cualquier vertido de alimento. Los animales se acostumbraron a estas nuevas condiciones (alojamiento individual y las jaulas de suelo con rejilla de alambre) durante al menos 14 días antes del comienzo de las lecturas de medida
inicial.

Procedimientos experimentales para el estudio de alimentación

Aproximadamente una semana antes del inicio del estudio, se pesaron los animales (al 0,1 g más cercano usando una balanza electrónica top-pan) y se asignaron en 2 grupos de tratamiento de peso coincidente, conteniendo cada uno 10 animales. Después de un periodo previo de medida inicial de 7 días, durante el que se dosificó a los animales por la vía apropiada (por ejemplo por vía oral) una vez al día con vehículo (metilcelulosa al 1%; 1 ml/kg) o el fármaco de ensayo, es decir, el Compuesto C (30 mg/kg po) una vez al día durante 28 días.

Se midió la ingesta de alimento y el peso corporal una vez al día.

Análisis del plasma

Se tomaron muestras de sangre terminales por punción cardíaca de los animales inmediatamente después de la muerte en tubos de litio-heparina de 4,5 ml Sarstedt (Nº Cat. 32.331). A continuación, los tubos se centrifugaron a 1.500 g durante 5 minutos a 4ºC y el plasma se extrajo y se congeló inmediatamente en hielo seco (como 3 alícuotas por muestra en tubos Eppendorf sellados). Las muestras de plasma se almacenaron a -75ºC hasta que fueron necesarias para el análisis. Todas las determinaciones se realizaron sobre las muestras de plasma que se habían descongelado solamente una vez.

Ensayo de insulina

Se determinó la concentración de insulina en plasma usando kits de ELISA de insulina de rata ultrasensibles Mercodia según el protocolo de muestras de 50 \mul de los fabricantes. Se diluyeron 20 veces muestras desconocidas usando el patrón cero antes del ensayo por duplicado. Se determinó la densidad óptica a 450 nm usando un lector de microplaca ajustable Molecular Devices VERSAmax y las lecturas se transfirieron a GraphPad Prism. Se ajustó una curva spline cúbica a los datos de calibrado y se extrapolaron los valores desconocidos a partir de este ajuste de curva.

Ensayo de glicerol y triacilglicerol

Se determinó el nivel de triacilglicerol en plasma por modificación de un kit de ensayo específico (kit de determinación de triglicéridos Sigma, Nº Cat. TR0100) a un formato de 96 pocillos. El kit determina en realidad el glicerol liberado después de la hidrólisis enzimática de triacilglicerol en ácidos grasos libres y glicerol (1 mol de glicerol por mol de triacilglicerol). Por esta razón, es necesaria la corrección de la concentración de glicerol originalmente presente en el plasma. Las muestras de plasma, por lo tanto, se ensayaron en ausencia (glicerol plasmático libre) o presencia (triacilglicerol total) de lipoproteína lipasa. La resta de la concentración de glicerol libre de la concentración de triacilglicerol total da entonces la verdadera concentración de triacilglicerol.

Se obtuvo un patrón de glicerol equivalente a 2,5 mg/ml de trioleína de Sigma. El factor de conversión mM de Sigma suministrado para este lote fue 1,13 (es decir 2,83 mM de glicerol). Se preparó una solución madre de 10 mg/ml de glicerol en solución salina y, a continuación, se diluyó en solución salina para crear una serie de concentraciones patrón de 0,218 a 4,34 mM. Los patrones y las muestras de ensayo (no diluidas) se pipetearon en las placas de 96 pocillos como adiciones de 10 \mul por duplicado. Las placas de ensayo y los reactivos se precalentaron a 37ºC y la reacción comenzó añadiendo 200 \mul del reactivo de glicerol o triacilglicerol total (reconstituido según el protocolo del fabricante) seguido de incubación a 37ºC durante 5 minutos, después de lo cual se determinó la densidad óptica a 540 nm usando un lector de microplaca ajustable Molecular Devices VERSAmax. A continuación, se transfirieron las lecturas de densidad óptica a GraphPad Prism y se extrapolaron los valores desconocidos a partir de un ajuste de regresión lineal a la curva patrón. El ensayo era lineal hasta el patrón de glicerol más alto empleado (4,34 mM). La resta de la concentración de glicerol en las muestras de ensayo de la concentración de triacilglicerol total produjo la verdadera concentración de triacilglicerol.

Ensayo de leptina

La concentración de leptina en plasma se determinó usando kits de ensayo inmunométrico de leptina de rata con enzima Assay Designs (Nº Cat. 900-015) según el protocolo habitual del fabricante. Se diluyeron 100 veces muestras desconocidas usando tampón de ensayo de leptina antes del ensayo por duplicado. Se determinó la densidad óptica a 450 nm usando un lector de microplaca ajustable Molecular Devices VERSAmax y las lecturas se transfirieron a GraphPad Prism. Se ajustó una curva polinomial de segundo orden a los datos de calibrado y se extrapolaron los valores desconocidos a partir de este ajuste de curva.

Determinación del contenido de grasa en el cuerpo

Se estimó la grasa total extraíble con éter en las muestras liofilizadas por el principio de Soxhlet usando un sistema Foss Soxtec HT2. El protocolo empleado se basó en las recomendaciones del fabricante para muestras de carne, aunque las muestras liofilizadas obviaron la necesidad de una etapa de hidrólisis de grasas o mezclar la muestra con arena para asegurar una extracción eficaz.

Se pesaron de forma precisa muestras de aproximadamente 1 g en dedales de extracción de celulosa de 26 mm x 60 mm que a continuación se taponaron con aproximadamente 0,8 g lana de algodón. Se extrajo la grasa de la muestra en recipientes metálicos de extracción convencionales pre-pesados (incluyendo unas pocas pastillas de ebullición) usando 70 ml de éter de petróleo a 40-60ºC, una temperatura del circulador de 115ºC y un caudal de refrigeración de 2 l/min. Se empleó una fase de ebullición de 25 min, seguido de una fase de lavado de 40 min. Una fase de secado de 10 min fue suficiente para extraer el éter de los recipientes de extracción.

El porcentaje de grasa en la muestra liofilizada se calculó del siguiente modo:

%\ de\ grasa = [100\ x\ (\text{peso final del recipiente - peso inicial del recipiente})]/peso\ de\ la\ muestra

El porcentaje de grasa en la muestra original se calculó usando el % de agua del siguiente modo:

%\ de\ grasa\ en\ la\ muestra\ original = %\ de\ grasa\ x\ [(100\ -%\ de\ agua)/100]

Determinación del contenido de proteínas en el cuerpo

Se estimó la cantidad total de proteínas en las muestras liofilizadas usando el principio de Kjeldahl. Se realizó un micro-procedimiento de Kjeldahl usando un bloque de digestión Foss 2012 y una unidad de destilación Foss 2200. El protocolo usado se basó en las recomendaciones del fabricante para muestras de carne.

Se pesaron aproximadamente 0,3 g de muestra liofilizada en tubos de digestión de 100 ml (Foss UK Ltd) en gradillas de 12 tubos. Cada gradilla incluía al menos un tubo blanco para determinar un blanco de reactivo. A cada tubo se le añadió dos comprimidos Kjeltabs CQ y un comprimido Antifoam S seguido de 10 ml de ácido sulfúrico al 98%. Las muestras se digirieron a 420ºC durante 1 h para convertir la proteína en sulfato de amonio. Una vez se enfriaron los tubos, se liberó el amoniaco libre mediante la adición de un exceso de NaOH al 40% y se destiló por vapor en 30 ml de solución indicadora de ácido bórico al 4%. A continuación, se determinó el amoniaco por valoración frente a HCl 0,1 M de calidad volumétrica usando una bureta digital de 25 ml de Brand. Se calculó el contenido de nitrógeno y proteínas de las muestras del siguiente modo:

\text{% de nitrógeno = [(valoración de la muestra - valoración del blanco)}\ x\ 0.1401]/peso\ de\ la\ muestra\ (g)

\text{% de proteínas} = \text{% de nitrógeno}\ x\ 6.25

Determinación del contenido de ceniza en el cuerpo

Se estimó el contenido total de ceniza en las muestras liofilizadas determinando la ceniza no combustible restante después de quemar las muestras a elevadas temperaturas usando un horno enfundado Carbolite OAF 11/1.

Se prequemaron crisoles de sílice de forma achaparrada (600ºC) durante al menos 2 h para estabilizar los pesos. Se dejaron enfriar los crisoles (<300ºC) y se transfirieron a armarios de secado de gel de sílice. A continuación, se pesaron los crisoles, se añadió aproximadamente 1 g de muestra y se volvió a pesar el crisol. También se incluyeron varios crisoles vacíos. Los crisoles se quemaron a 600ºC durante 4 h para convertir las muestras en ceniza y después se dejaron enfriar (<300ºC) antes de transferirlos a armarios de secado de gel de sílice. Los pesos finales se determinaron cuando los crisoles se unieron enfriado completamente.

El porcentaje de ceniza se determinó expresando el peso residual de la muestra después de quemarla como un porcentaje del peso original de la muestra. La variación promedio en el peso del crisol blanco fue -0,02 \pm 0,04 mg (media \pm SEM, n=14) y los pesos individuales variaron en 0,5 mg o menos.

Experimento en ratas Wistar macho en crecimiento

En el experimento se utilizaron ratas Wistar macho adultas con una edad entre 11 y 12 semanas de vida y que pesaban de 250 a 280 g. Después de 5 días de cuarentena, se colocaron inicialmente en grupos de 5, pero se pusieron individualmente para su uso en el experimento. A los animales se dio acceso libre a comida normal de rata de laboratorio. Las ratas se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad normal de 12 h-12 h y se mantuvieron en un vivero a 18-24ºC y una humedad del 37 al 70%.

Después de 2 semanas de aclimatación en que la ingestión de comida y agua y los pesos corporales se midieron en una base diaria, se administró a los grupos de ratas Compuesto C (10 mg/kg o 30 mg/kg como una suspensión en goma arábiga al 5% en solución salina; n = 15) o vehículo (goma arábiga al 5% en solución salina; n = 15) mediante una sonda gástrica. A los animales se les administró fármaco o vehículo una vez diaria durante 14 días y se midieron la ingesta de alimentos y los pesos corporales diariamente en el momento de la inyección.

Muestreo de sangre

En el Día 15, se tomaron muestras de sangre terminal de 5 ratas de cada grupo para la determinación de concentraciones en plasma de colesterol total y triglicéridos.

Determinación de lípidos y concentraciones en plasma

Las concentraciones en plasma del colesterol y triacilglicerol totales se determinaron utilizando un análisis estándar realizado en un fotómetro de reflectancia Cardio Cardio Check^{TM}.

Análisis estadístico

Los cálculos y análisis estadísticos se realizaron usando los paquetes de software GraphPad y Statview. Se usó un ANOVA de dos vías para analizar los datos del peso corporal. Los resultados de la concentración total de colesterol, triglicéridos y glucosa se analizaron mediante ANOVA RM seguido de un test de Dunnett. Se ajustó P < 0,05 como el nivel de aceptación para una diferencia significativa entre grupos.

Resultados Efectos del Compuesto C en el control glicémico Efectos de Compuesto C (10 mg/kg ip) en las concentraciones de insulina en plasma y la respuesta a un estímulo oral de glucosa en ratas macho Sprague-Dawley DIO

La administración crónica de Compuesto C mejoró los perfiles glicémicos de estas ratas obesas mediante la reducción significativamente estadística (p < 0,001) de los niveles de insulina en plasma en comparación con el grupo de control tratado con vehículo (figura 1).

Cuando estas ratas se sometieron a una prueba de estimulación oral de glucosa, el área por debajo de la curva (AUC) para la salida de insulina fue significativamente inferior en las ratas obesas a las que se administró repetitivamente Compuesto C que aquéllas a las que se les administró vehículo (figura 2).

Efectos del compuesto C (30 mg/kg po) en las concentraciones de insulina en plasma en ratas Wistar hembra DIO

La administración crónica de Compuesto C mejoró los perfiles glicéricos de estas ratas obesas mediante la reducción de los niveles de insulina en plasma (figura 3).

Efectos del Compuesto C en las concentraciones de lípidos en plasma Efectos del Compuesto C (10 mg/kg ip) en las concentraciones de triglicéridos y ácidos grasos (FFA) en plasma en ratas Sprague-Dawley macho DIO

La administración crónica de Compuesto C mejoró los perfiles de lípidos de estas ratas obesas de estadísticamente significativa (p < 0,05) mediante la reducción de los niveles de triglicéridos y los niveles de FFA en sangre en comparación con el grupo de control tratado con vehículo (figura 4).

Efectos del Compuesto C (30 mg/kg po) en las concentraciones de glicerol y triacilglicerol en plasma en ratas Wistar hembra DIO

La administración crónica de Compuesto C mejoró significativamente los perfiles de lípidos de estas ratas obesas mediante la reducción de los niveles de glicerol (en un 23,4%) y los niveles de triacilglicerol (en un 37,2% en sangre) en comparación con el grupo de control tratado con vehículo (figura 5).

Efectos crónicos del Compuesto C (10 y 30 mg/kg po) en las concentraciones de triglicéridos y colesterol en plasma en ratas Wistar macho en crecimiento

La administración crónica de Compuesto C (10 y 30 mg/kg po) mejoró de manera dependiente con la dosis los perfiles de lípidos de ratas Sprague-Dawley en crecimiento mediante la reducción de los niveles de triglicéridos en plasma en comparación con el grupo de control tratado con vehículo (Figura 6). La reducción fue estadísticamente significativa (p < 0,05) en las dosis más elevadas de Compuesto C (Figura 6). El Compuesto C también redujo de manera dependiente de la dosis los niveles de colesterol en plasma en comparación con el grupo de control tratado con vehículo (Figura 7). La reducción fue estadísticamente significativa (p < 0,05) en las dosis más elevadas de Compuesto C (Figura 7).

Efecto del Compuesto C (10 mg/kg ip) en el peso de la almohadilla grasa visceral de ratas Sprague-Dawley macho DIO

En concordancia con una notable reducción en la adiposidad global tal y como se muestra en la reducción del peso corporal (Figura 8), la medición de los pesos de las almohadillas grasas viscerales principales, es decir, inguinal, del epidídimo, retroperitoneal y del mesenterio, mostró de forma similar grandes reducciones (Figura 11). Estas reducciones fueron estadísticamente significativas para todos los depósitos de grasa visceral, a excepción de las almohadillas del epidídimo (Figura 11).

Efectos del Compuesto C (30 mg/kg po) en la composición corporal de ratas Wistar hembra DIO

La composición corporal del grupo de animales tratado con vehículo fue 49,0 \pm 1,0% de agua, 31,9 \pm 1,3% de grasa, 15,5 \pm 0,3% de proteína y 2,77 \pm 0,09% de ceniza (total de 99,2%). El peso corporal promedio final del grupo de control tratado con vehículo fue de 473,0 \pm 8,1 g. El Compuesto C redujo significativamente el peso corporal final en 72,8 g.

La administración crónica de Compuesto C redujo significativamente el agua corporal total en 11,8 g cuando se comparó con el control tratado con vehículo. Dado que el contenido de agua corporal se redujo (en proporción) mucho menos que la reducción en el peso corporal, el contenido de agua en porcentaje de los cuerpos de hecho aumentó significativamente en los animales tratados con el compuesto C (de un 49,0% a un 54,3%, Figura 12). El Compuesto C redujo de manera significativa y sustancial la grasa corporal total y el porcentaje en grasa. La masa grasa corporal promedio se redujo significativamente desde 156,3 g en el grupo con vehículo a 98,6 g tras el tratamiento con el Compuesto C. Expresado como un porcentaje del peso corporal, el contenido en grasa se redujo significativamente desde un 31,9% en el grupo de control con vehículo a un 24,2% en el grupo tratado con Compuesto C (Figura 12). De este modo, el Compuesto C produjo un descenso en la grasa corporal absoluta de 57,7 g en comparación con el grupo de control tratado con vehículo, representando un 79,3% de la pérdida de peso total observada. Esto fue equivalente a un descenso notable del 36,9% en masa grasa en comparación con el grupo de control tratado con vehículo. El contenido de proteínas en porcentaje aumentó significativamente desde un 15,5% en el grupo tratado con vehículo hasta un 17,1% en el grupo tratado con Compuesto C (Figura 12). El Compuesto C no alteró significativamente el contenido de ceniza total, pero aumentó significativamente el contenido de ceniza en porcentaje desde un 2,77% hasta un 3,26% (Figura 12).

Efectos del Compuesto C (30 mg/kg po) en las concentraciones de leptina en plasma en ratas Wistar hembra DIO

En concordancia con una notable reducción en la masa de tejido adiposo blanco, las concentraciones de leptina en plasma se redujeron de manera notable y significativa tras el tratamiento con el Compuesto C (-48,2%) en comparación con el grupo de control tratado con vehículo (Figura 13).

Claims

1. Polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida.

2. Polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida, caracterizado porque cristaliza como una celda triclínica con un ángulo \alpha de 78º y/o un ángulo \beta de 74º y/o un ángulo \gamma de 88º.

3. Polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida, caracterizado porque muestra una difracción de rayos X en polvo estándar según la figura 8.

4. Polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la reivindicación 1, caracterizado porque el polimorfo \alpha se funde

y/o

con un pico de fusión a 185 \pm 2ºC, preferiblemente a 184 \pm 1ºC.

5. Polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la reivindicación 1, caracterizado porque se descompone a 280ºC o superior.

6. Polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según la reivindicación 1, caracterizado porque el polimorfo \alpha muestra bandas en el espectro FTRaman, preferiblemente bandas intensas, a 2932 \pm 5 cm^{-1} y/o 1647 \pm 5 cm^{-1} y/o 1593 \pm 5 cm^{-1} y/o 1394 \pm 5 cm^{-1} y/o 1269 \pm 5 cm^{-1} y/o 1253 \pm 5 cm^{-1} y/o 1109 \pm 5 cm^{-1} y/o 1084 \pm 5 cm^{-1} y/o 1047 \pm 5 cm^{-1} y/o 783 \pm 5 cm^{-1} y/o 661 \pm 5 cm^{-1} y/o un desplazamiento Raman a 1253 \pm 5 cm^{-1} y/o a 1084 \pm 5 cm^{-1} y/o a 533 \pm 5 cm^{-1} y/o a 364 cm^{-1}.

7. Procedimiento para la fabricación del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque una solución de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida en un alcohol; preferiblemente etanol o metanol; se evapora a temperatura ambiente (25ºC) para producir el polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida.

8. Medicamento que comprende al menos un polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

9. Uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de un medicamento para la modulación de receptores de cannabinoides, preferiblemente receptores de cannabinoides 1 (CB_{1}), para la profilaxis y/o el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central, trastornos del sistema inmunitario, trastornos del sistema cardiovascular, trastornos del sistema endocrino, trastornos del sistema respiratorio, trastornos del tracto gastrointestinal o trastornos reproductores.

10. Uso del polimorfo \alpha de (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la dislipidemia o el síndrome metabólico.