ES2328094T3 - Composiciones y procedimientos que permiten aumentar la administracion de agentes terapeuticos a las celulas. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto potenciador de la administración de Fórmula I que tiene la siguiente estructura: ** ver fórmula** donde m y n son iguales o diferentes y cada uno es un número entero de 2 a 8; N-R tomados juntos forman un grupo trimetilamonio o un grupo amonio, o R es ** ver fórmula** X1 es seleccionado dentro del grupo consistente en: ** ver fórmula** y X2 y X3 son cada uno independientemente seleccionados entre el grupo consistente en un grupo sacárido, donde al menos uno de X2 y X3 es un grupo sacárido cuando R es ** ver fórmula**
Description
Composiciones y procedimientos que permiten
aumentar la administración de agentes terapéuticos a las
células.
\global\parskip0.880000\baselineskip
Esta invención pertenece al campo de la
administración de agentes terapéuticos y otros agentes a las
células. Genes, polipéptidos y otras moléculas están entre los
agentes que pueden ser administrados usando los compuestos y
métodos de la invención. Las células pueden estar presentes
individualmente o como un tejido u órgano biológico.
La administración de un compuesto a una célula
es una primera etapa crítica para muchos procesos diagnósticos y
terapéuticos. La terapia génica, por ejemplo, es una herramienta
altamente prometedora para usos terapéuticos y otros usos que
requiere la administración de un ácido nucleico a una célula. Por
ejemplo, se han desarrollado distintas aproximaciones para tratar
neoplasias basadas en métodos de transferencia génica. Se han
desarrollado métodos para corregir lesiones específicas en loci
genéticos definidos que dan lugar a transformación y progresión
neoplásicas (Spandidos y col., Anticancer Res. 10:
1543-1554 (1990). Banerjee y col., Cancer Res. 52:
6297-6304 (1992)). La sobreexpresión de oncogenes
dominantes puede ser abordada usando técnicas que inhiben el gen
transformante o el producto génico. La pérdida de la función génica
supresora tumoral puede ser abordada usando métodos que
reconstituyen la función génica supresora tumoral de tipo salvaje
(Goodrich y col., Cancer Res. 52: 1968-1973
(1992)). Además de estos métodos para conseguir la compensación de
la mutación, se han desarrollado técnicas genéticas para erradicar
de manera específica y selectiva las células tumorales. Estas
aproximaciones de quimioterapia molecular se basan en la expresión
específica de genes de toxinas en las células neoplásicas (Abe y
col., Proc Soc Exp Biol Med. 203: 354-359 (1993)).
Finalmente, se han usado métodos de transferencia génica para
conseguir una inmunización antitumoral. Estos métodos de
inmunopotenciación genética utilizan técnicas de inmunorregulación
genética para aumentar el reconocimiento inmune de los tumores. Por
consiguiente, se han desarrollado una variedad de aproximaciones
distintas para llevar a cabo la terapia génica del cáncer.
Se observado una alta incidencia de mutaciones
en genes supresores de tumores, tales como p53 y RB, en el caso del
carcinoma de la vejiga (Fujimoto y col., Cancer Res. 52:
1393-1398 (1992); Cairns y col., Oncogene 6:
2305-2309 (1991)). Para esas lesiones genéticas de
genes supresores de tumores, se puede demostrar la reversión del
fenotipo neoplásico con substitución del correspondiente gen
supresor tumoral de tipo salvaje (Spandidos, Íd.; Banerjee,
Íd.).
El carcinoma de la vejiga representa una fuente
significativa de morbilidad y mortalidad. El cáncer de vejiga
figura el 10º en varones y el 12º en mujeres en cuando a mortalidad
relacionada con el cáncer (Cancer Facts y Figures, Amer. Can. Soc.
5: 11 (1995)). Las terapias de las que se dispone para el
tratamiento del cáncer de vejiga incluyen la quimioterapia o
inmunoterapia adyuvante, la resección transuretral de la enfermedad
superficial, la cistectomía radical o la radioterapia, que
frecuentemente se combina con quimioterapia sistémica. A pesar de
estas opciones terapéuticas, la supervivencia global no ha cambiado
apreciablemente. (Íd.). Así, se deben desarrollar nuevas
modalidades terapéuticas para el tratamiento del cáncer de
vejiga.
Se han desarrollado estrategias de terapia
génica como aproximación terapéutica alternativa (véanse, por
ejemplo, Brewster y col., Eur Urol 25: 177-182
(1994); Takahashi y col., Proc Natl. Acad Sci USA 88:
5257-5261 (1991); Rosenberg, SA, J. Clin Oncol. 10:
180-199 (1992)). El éxito en el tratamiento del
cáncer y de otras condiciones en un humano u otro animal puede
depender de que entre una cantidad adecuada de un agente
terapéutico en las células y de que una proporción suficientemente
grande de las células diana capten el agente terapéutico.
WO 96/10038 describe el uso de cationes de
poliaminas para transferir moléculas de ácidos nucleicos a las
células diana; sin embargo, las moléculas allí descritas son
estructuralmente diferentes de las moléculas de la presente
invención.
Muchos otros agentes terapéuticos y otros
agentes moduladores son polipéptidos o, por ejemplo, pequeñas
moléculas. De nuevo, la cantidad del agente que alcanza una
población de células diana puede tener un gran impacto sobre la
eficacia del tratamiento. Por lo tanto, existe una necesidad de más
compuestos y métodos que puedan aumentar la cantidad de un agente
administrada a una célula o a una población de células.
La presente invención cumple esta y otras
necesidades.
La invención proporciona compuestos que pueden
aumentar la administración de un agente a las células. Los
compuestos que aumentan la administración de la invención tienen
típicamente una Fórmula I:
donde:
\global\parskip1.000000\baselineskip
m y n son iguales o diferentes y cada uno es un
número entero de 2 a 8; R es un grupo catiónico o
X_{1} es seleccionado dentro del grupo
consistente en:
y X_{2} y X_{3} son cada uno
independientemente seleccionados entre el grupo consistente en un
grupo
sacárido,
donde al menos uno de X_{2} y
X_{3} es un grupo sacárido cuando R
es
Algunos ejemplos de compuestos potenciadores de
la administración preferidos de la invención son los que tienen una
fórmula III, IV o V, como se muestra en la Figura 21.
En algunas realizaciones, compuestos
potenciadores de la administración tienen una Fórmula II:
\newpage
donde X_{1} y X_{2} son
seleccionados entre el grupo consistente
en:
y X_{3} es un grupo
sacárido.
La invención también proporciona métodos de
suministro de un agente a las células por administración del agente
a las células en una formulación que incluye un compuesto
potenciador de la administración de Fórmula I.
En realizaciones adicionales, la invención
proporciona composiciones para administrar un agente a las células.
Las composiciones incluyen el agente que se ha de suministrar y un
compuesto potenciador de la administración de Fórmula I.
Otro aspecto de la invención es un método de
tratamiento del cáncer, incluyendo el cáncer de vejiga, mediante
administración a una célula de una cantidad terapéuticamente
efectiva de un agente terapéutico formulado en un tampón que
contiene un compuesto de Fórmula I.
La Figura 1 representa la influencia de la
formulación sobre la transferencia génica y la expresión mediada
por adenovirus en el epitelio vesical de la rata tras administración
intravesical.
La Figura 2 representa la expresión transgénica
de adenovirus en células epiteliales de vejiga tras administración
intravesical.
La Figura 3 representa la expresión transgénica
de adenovirus dosis-dependiente en la vejiga de la
rata tras administración intravesical.
La Figura 4 representa un análisis por reacción
en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa
(RT-PCR) de la expresión transgénica de adenovirus
recombinante en la vejiga del ratón tras administración
intravesical.
La Figura 5 representa un curso temporal de la
expresión transgénica de adenovirus recombinante en tejido de
vejiga, riñón e hígado tras administración intravesical del
virus.
La Figura 6 representa el ADN transgénico de
adenovirus recombinante en homogenados de vejiga y riñón tras
administración intravesical.
La Figura 7 representa la mejora de la
transferencia génica al epitelio vesical usando una formulación
Big CHAP
(N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)colamida
(CALBIOCHEM7 Biochemicals, San Diego, California).
La Figura 8 representa la mejora de la
transferencia génica al epitelio vesical usando diferentes
concentraciones de adenovirus recombinante en una formulación de
Big CHAP 7 mM.
La Figura 9 representa el incremento de la
expresión transgénica de adenovirus recombinante en tejido vesical
usando una formulación de etanol (EtOH) o Big CHAP.
La Figura 10 representa la transferencia génica
a tumores usando una formulación Big CHAP 4 mM.
La Figura 11 representa la transferencia
transgénica a epitelio vesical porcino.
La Figura 12 representa la expresión de p53 en
tejido tumoral.
La Figura 13 representa la transferencia génica
a la mucosa del íleon de rata.
La Figura 14 es una fotografía de secciones de
vejiga de ratas, donde se comparó la capacidad de Big CHAP de dos
fuentes para aumentar la transferencia génica. La tinción más
intensa con Xgal en la fila inferior en comparación con la fila
superior demostró un mayor aumento de la transferencia génica por
Big CHAP de CALBIOCHEM7 en comparación con Big Chap de Sigma (Sigma
Chemical Company, St. Louis, Missouri).
Las Figuras 15A y B representan la cromatografía
en capa fina (TLC) de Big CHAP de CALBIOCHEM7 y Sigma. Sólo se
desarrolló una banda distinta a partir de la muestra de
BC-Sigma (Figura 15B), mientras que se hicieron
evidentes tres bandas adicionales en la muestra de
BC-CALBIOCHEM7 (Figura 15A).
La Figura 16 representa la TLC de impurezas de
Big CHAP. Las bandas están marcadas como sigue: Banda 1: Big CHAP
(CALBIOCHEM7); Banda 2: Impureza 1; Banda 3: Impureza II; Banda 4:
Mezcla de Impureza II y III; Banda 5: Impureza III; Banda 6: Big
CHAP (CALBIOCHEM7) puro; Banda 7: Big CHAP (CALBIOCHEM7).
La Figura 17 es una fotografía de secciones de
vejiga de ratas, donde se comparó la capacidad de concentraciones
crecientes de Big CHAP (Sigma) para aumentar la transferencia
génica con un patrón de Big CHAP (CALBIOCHEM7). La tinción más
intensa con Xgal indicó una mayor transferencia génica a mayores
concentraciones de Big CHAP (Sigma).
La Figura 18 es una fotografía de secciones de
vejiga de ratas, donde se evaluó la capacidad de Big CHAP
(CALBIOCHEM7) y Big CHAP (Sigma) tras la purificación para aumentar
la transferencia génica y se comparó con Big CHAP no purificado de
esas fuentes como control. La intensidad de la tinción con Xgal
indicó una capacidad reducida para aumentar la transferencia génica
después de haber purificado Big CHAP de cualquiera de las fuentes
por cromatografía en columna.
La Figura 19 es una fotografía de secciones de
vejiga de ratas, donde se evaluó la capacidad de Big CHAP
(CALBIOCHEM7) y Big CHAP (Sigma) tras la purificación para aumentar
la transferencia génica y se comparó con Big CHAP no purificado de
esas fuentes y con la Impureza I y una combinación de Impureza II e
Impureza III. La intensidad de la tinción con Xgal demostró un
aumento de la transferencia génica con 6 mg/ml de la combinación
de Impureza II e Impureza III.
La Figura 20 es una fotografía de secciones de
vejiga de ratas, donde se evaluó la capacidad de Big CHAP (Sigma)
tras la purificación para aumentar la transferencia génica y se
comparó con Big CHAP (Sigma) purificado reconstituido con la
Impureza II, la Impureza III o un análogo sintético de la Impureza
II. La intensidad de la tinción con Xgal demostró un aumento de la
transferencia génica cuando se reconstituyó el Big CHAP (Sigma)
purificado. Se incluye Big CHAP (CALBIOCHEM7) como control.
La Figura 21 muestra las estructuras de Syn3 y
dos análogos hidrosolubles de Syn3. El dominio de Syn3 que se
conserva en los dos análogos está indicado como "A". Los
análogos A-TMA y A-HCl resultaron de
la substitución con cloruro de trimetilamonio
(A-TMA) o clorhidrato (A-HCl) del
resto de lactosa de Syn3.
La Figura 22 muestra la estructura, el MALDIMS
y la ^{1}H-RMN de la Impureza 1.
La Figura 23 muestra la estructura, el MALDIMS
y la ^{1}H-RMN de la Impureza 2.
La Figura 24 muestra la estructura, el MALDIMS
y la ^{1}H-RMN de la Impureza 3.
La Figura 25 muestra una ruta para la síntesis
de la Impureza 2.
La Figura 26 muestra una ruta para la síntesis
de Syn3. En la Figura 34 se muestra una ruta alternativa para la
síntesis de Syn3.
Las Figuras 27A-27C demuestran
que I3A (Syn3) aumenta la expresión de
\beta-galactósido mediada por adenovirus. Se
obtuvieron elevados niveles de transferencia génica al utilizar I3A
a 0,5 mg/ml en Big CHAP 7,8 mM (Figura 27A). Se muestran controles
para realizar la comparación: sin I3A (Figura 27B) y, como control
positivo, Big CHAP Calbiochem Lote #o79693 7,8 mM (Figura 27C).
La Figura 28A y la Figura 28B muestran los
resultados de una titulación de la actividad potenciadora de la
transferencia génica de I3A (Syn3). La reducción de I3A a 0,25
mg/ml en Big CHAP 3,9 mM (Figura 28A) aún dio altos niveles de
actividad de transferencia génica en comparación con la actividad
de transferencia génica obtenida al usar I3A a 0,5 mg/ml en Big
CHAP 7,8 mM (Figura 28B). En el momento de la fijación, las vejigas
tratadas con 0,25 mg/ml de I3A parecían tener menos inflamación
que las tratadas con 0,5 mg/ml de I3A.
La Figura 29A y la Figura 29B muestran una
comparación de la actividad de transferencia génica de I3A y Syn3.
Se obtuvieron altos niveles de actividad
\beta-galactosidasa usando I3A a 1 mg/ml en Tween
80 al 0,1% (Figura 39A). Se obtuvieron niveles aproximadamente
iguales de transferencia génica usando Syn3 a 1 mg/ml en Tween 80
al 0,1% (Figura 29B).
Las Figuras 30A-30D muestran una
comparación de la actividad de transferencia génica de Syn3 en
Tween 80 al 0,1% frente a Big CHAP 7,8 mM. La utilización de Syn3
a 1 mg/ml en Tween 80 al 0,1% (Figura 30A) dio como resultado
niveles de transferencia génica comparables a los obtenidos al
utilizar Syn3 a 0,5 mg/ml en Big CHAP 7,8 mM (Figura 30C). También
se muestran controles negativos (sin Syn3) al utilizar o bien Tween
80 al 0,1% (Figura 30B) o bien Big CHAP 7,8 mM (Figura 30D).
Las Figuras 31A-31D muestran una
comparación de la actividad de transferencia génica de Syn3 a
concentraciones iguales en los detergentes Big CHAP y Tween 80.
Cuando se disolvió Syn3 a 0,5 mg/ml en Big CHAP 7,8 mM (Figura
31A), se obtuvieron niveles muy altos de transferencia génica.
Comparativamente, la actividad de transferencia génica de Syn3 en
Tween 80 al 0,05% (Figura 31C) estaba ligeramente reducida, con más
regiones desprovistas de actividad
\beta-galactosidasa. También se muestran
controles negativos tanto para Big CHAP 7,8 mM (Figura 31B) como
para Tween 80 al 0,05% (Figura 31D).
Las Figuras 32A-32F muestran una
comparación de la infiltración tras la administración de Syn3. A
dosis inferiores de Syn3, se observó una infiltración
proporcionalmente menor en la vejiga. Se usaron concentraciones
decrecientes de Syn3 para la infección por rAd de vejigas al
utilizar o bien Big CHAP (Figura 32A, B) o bien Tween 80 (Figura
32D, E). También se muestran vejigas tratadas sólo con detergente
(sin Syn3) con Big CHAP (Figura 32C) o con Tween 80 (Figura
32F).
Las Figuras 33A-33D muestran que
la administración de Syn3 da como resultado la inducción de
infiltrados celulares. Cuando se comparó el nivel de infiltración
que resulta de la administración de virus y Syn3 (Figura 33A) con
el nivel obtenido a partir de Syn3 solo (Figura 33B), se vio que la
administración de Syn3 da lugar a una inducción significativa de
infiltrados. También se muestran vejigas de animales tratados sólo
con virus (Figura 33C) o de un control sin virus/sin Syn3 (Figura
33D).
La Figura 34 muestra una ruta para la síntesis
de Syn3. Después de conducir la Reacción 3 en DMF durante 24 horas,
se evaporó el producto a sequedad y se purificó sobre SiO2 con
DCM/MeOH/H_{2}O (60:35:5).
La Figura 35 muestra un protocolo utilizado
para sintetizar A-tma y A-HCl, que
son análogos de Syn3 que exhiben una mayor solubilidad en solución
acuosa.
La presente invención proporciona compuestos y
formulaciones potenciadoras de la administración que aumentan el
transporte de agentes a las células, tales como las células
presentes en los tejidos epiteliales. Los compuestos y
formulaciones pueden aumentar la cantidad de un agente, tal como un
agente que puede modular un proceso celular asociado a, por
ejemplo, la proliferación o a un estado morboso, que entra en una
célula y/o aumentar la proporción de células en un tejido u órgano
que captan el agente. También se proporcionan métodos de
administración de agentes a las células usando los compuestos
potenciadores de la administración de la invención.
Los compuestos y métodos potenciadores de la
administración de la invención son útiles para muchas aplicaciones
que requieren la administración de una molécula a una célula. Por
ejemplo, el diagnóstico y/o tratamiento de muchos estados morbosos
requieren con frecuencia la entrada de un agente en una célula que
está implicada en el proceso morboso. Otro ejemplo es el uso de
tecnología de ADN recombinante para producir proteínas de interés,
ya sea en cultivo celular o en un organismo recombinante. Muchos
ejemplos adicionales de situaciones en las que es deseable
introducir un compuesto en una célula son conocidos para los
expertos en la materia. Los compuestos y métodos de la invención
pueden mejorar la efectividad de cada una de estas aplicaciones
debido al mayor suministro de un agente de interés a una célula o
tejido diana.
La invención proporciona compuestos
potenciadores de la administración que, cuando se formulan con un
agente de interés, aumentan la administración del agente a una
célula. En algunas realizaciones, las células están presentes en un
tejido u órgano. "Un compuesto potenciador de la
administración" se refiere a cualquier compuesto que aumente la
administración de un agente a una célula, tejido u órgano. Aunque
no es esencial un entendimiento del mecanismo mediante el cual se
produce el aumento de la administración para la práctica de la
invención, se hace notar que el aumento de la administración se
puede producir por cualquiera de diversos mecanismos. Uno de esos
mecanismos puede conllevar la alteración de la capa protectora de
glicosaminoglicano (GAG) sobre la superficie epitelial del tejido u
órgano por el compuesto potenciador de la administración.
La administración de un agente a las células en
una formulación que incluye un compuesto potenciador de la
administración da lugar a un aumento en la cantidad de agente que
se suministra a las células en relación a la cantidad de agente
suministrado a las células cuando se administra en ausencia del
compuesto potenciador de la administración. "Aumento de la
administración", tal como se usa aquí, se refiere a un aumento
en el número de copias de un agente que entran en cada célula o a
un aumento en la proporción de células en, por ejemplo, un tejido
u órgano que captan el agente, o ambas cosas. En realizaciones
preferidas, el compuesto potenciador de la administración da lugar
a un aumento de al menos aproximadamente un 20%, más
preferiblemente un aumento de al menos aproximadamente un 50% y más
preferiblemente un aumento de al menos aproximadamente un 100% en
el suministro de un agente a una célula o una población de células
en comparación con la cantidad del agente suministrado cuando se
administra a las células en ausencia del compuesto potenciador de
la administración.
Se puede medir si un compuesto o formulación
particular es efectivo en el aumento de la administración de un
agente, tal como un agente terapéutico o diagnóstico, a las células
por diversos medios conocidos para los expertos en la materia. Por
ejemplo, se puede incluir un reactivo de detección en una
formulación potenciadora de la administración que se suministra a
las células diana. Se compara la cantidad de reactivo de detección
presente en las células tratadas con la formulación potenciadora
de la administración con la detectada en las células tratadas con
una formulación que no incluye un compuesto potenciados de la
administración. Como ejemplo, cuando el agente de interés es un gen
o un vector que incluye un gen, se puede incluir en la formulación
un gen indicador para el cual es fácilmente detectable la
expresión. Cuando el agente modulador es un polipéptido, se pueden
estudiar los compuestos potenciadores de la administración, por
ejemplo, uniendo un marcaje al polipéptido que está presente en la
formulación potenciadora de la administración y detectando la
presencia y la cantidad de marcaje que se encuentra en las células
diana tras la administración de la formulación. De forma similar,
cuando se han de usar moléculas distintas de polipéptidos y
polinucleótidos como agente modulador, se pueden marcar las
moléculas y detectar la cantidad de marcaje que entra en la
población de células diana.
Como ejemplos de compuestos potenciadores de la
administración, se incluyen, aunque sin limitación, detergentes,
alcoholes, glicoles, surfactantes, sales biliares, antagonistas de
la heparina, inhibidores de la ciclooxigenasa, soluciones salinas
hipertónicas y acetatos. Como alcoholes, se incluyen, por ejemplo,
los alcoholes alifáticos tales como etanol,
n-propanol, isopropanol, alcohol butílico y alcohol
acetílico. Como glicoles, se incluyen por ejemplo, la glicerina, el
propilenglicol, el polietilenglicol y otros glicoles de bajo peso
molecular, tales como el glicerol y el tioglicerol. Los acetatos,
tales como el ácido acético, el ácido glucónico y el acetato de
sodio, son otros ejemplos de compuestos potenciadores de la
administración. Las soluciones salinas hipertónicas, tales como el
NaCl 1M, son también ejemplos de compuestos potenciadores de la
administración. Como ejemplos de surfactantes, se incluyen el
dodecilsulfato de sodio (SDS) y la lisolecitina, el polisorbato 80,
el nonilfenoxipolioxietileno, la lisofosfatidilcolina, el
polietilenglicol 400, el polisorbato 80, los éteres de
polioxietileno, los surfactantes de éter de poliglicol y el DMSO.
También se pueden usar sales biliares, tales como el taurocolato,
el taurodesoxicolato de sodio, el desoxicolato, el
quenodesoxicolato, el ácido glicocólico, el ácido
glicoquenodesoxicólico y otros astringentes, como el nitrato de
plata, al igual que antagonistas de la heparina, como aminas
cuaternarias tales como el sulfato de protamina. Son también
adecuados los inhibidores de la ciclooxigenasa, tales como, por
ejemplo, el salicilato de sodio, el ácido salicílico y fármacos
antiinflamatorios no esteroideos (FAINE) tales como la
indometacina, el naproxeno y el diclofenaco.
Como detergentes que pueden funcionar como
compuestos potenciadores de la administración, se incluyen, por
ejemplo, detergentes aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos y no
iónicos. Como ejemplos de detergentes, se incluyen, aunque sin
limitación, taurocolato, desoxicolato, taurodesoxicolato,
cetilpiridio, cloruro de benzalconio, detergente
ZWITTERGENT73-14, CHAPS
(3-{(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato
hidrato. Aldrich), Big CHAP, Desoxi Big CHAP, detergente
TRITON7-X-100, C12E8,
octil-B-D-glucopiranósido,
detergente PLURONIC7-F68, detergente TWEEN7 20 y
detergente TWEEN7 80 (CALBIOCHEM7 Biochemical).
Un ejemplo de un compuesto potenciador de la
administración preferido para formulaciones en las que el agente
es, por ejemplo, un ácido nucleico es Big CHAP, que es un derivado
de colato (véase, v.g., Helenius y col. (1979), "Properties of
Detergents", en: Methods in Enzymology, Vol. 66,
734-749). Con objeto de facilitar la mejor
transferencia génica para formulaciones de ácidos nucleicos que
contienen preparaciones comerciales de Big-CHAP, la
concentración de Big CHAP variará en base a su fuente comercial.
Cuando el Big CHAP procede de CALBIOCHEM7, se prefiere que la
concentración sea de 2 a 10 milimolar. Más preferido es que sea de
4 a 8 milimolar. Lo más preferido es que sea aproximadamente 7
milimolar. Cuando el Big CHAP procede de Sigma, se prefiere que la
concentración de Big CHAP sea de 15 a 35 milimolar. Más preferido
es que sea de 20 a 30 milimolar. Lo más preferido es que sea
aproximadamente 25 milimolar.
En realizaciones adicionales, la invención
proporciona compuestos potenciadores de la administración que
tienen la Fórmula I:
En la Fórmula I, m y n pueden ser iguales o
diferentes y cada uno es un número entero de 2 a 8. En
realizaciones preferidas, m y n son cada uno independientemente 2 ó
3.
\newpage
R en la Fórmula I es preferiblemente un grupo
catiónico o una estructura de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como grupos catiónicos adecuados, se puede
incluir cualquier resto que proporcione una carga positiva al
compuesto. Como ejemplos de grupos catiónicos adecuados, se
incluyen, aunque sin limitación, trimetilamonio y cationes de
amonio.
X_{1} en la Fórmula I es generalmente
seleccionado entre el grupo consistente en
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y X_{2} y X_{3} son cada uno
independientemente seleccionados entre el grupo consistente en un
grupo
sacárido,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando está presente X_{3} en la molécula, al
menos uno de X_{2} y X_{3} es un grupo sacárido.
Los grupos sacáridos utilizables en los
compuestos potenciadores de la administración de la invención
pueden ser monosacáridos o pueden incluir más de un monosacárido
unido en homooligosacáridos o heterooligosacáridos. Los
monosacáridos preferidos incluyen residuos de pentosa y/o hexosa.
Por ejemplo, los grupos sacáridos pueden ser seleccionados entre el
grupo consistente en grupos monosacáridos pentosa, grupos
monosacáridos hexosa, grupos disacáridos
pentosa-pentosa, grupos disacáridos
hexosa-hexosa, grupos disacáridos
pentosa-hexosa y grupos disacáridos
hexosa-pentosa. Un ejemplo de un grupo sacárido
preferido para X_{3} es la lactosa.
En algunas realizaciones, los compuestos
potenciadores de la administración de fórmula I tienen X_{2} y/o
X_{3} como grupos sacáridos que están compuestos por tres o más
monosacáridos. Preferiblemente, el grupo sacárido tiene entre uno y
ocho monosacáridos, más preferiblemente entre uno y cuatro
monosacáridos y más preferiblemente entre aproximadamente dos y
tres monosacáridos. El uso de un trisacárido, por ejemplo, puede
proporcionar un compuesto con mayor solubilidad.
Como ejemplos de compuestos potenciadores de la
administración adecuados de la invención, se incluyen, aunque sin
limitación, compuestos de Fórmula I en los cuales X_{1} y X_{2}
son ambos
y X_{3} es un
sacárido.
Otras realizaciones tienen, por ejemplo, tanto
X_{1} como X_{2} como
y X_{3} como un grupo sacárido.
Los compuestos preferidos incluyen también aquéllos en los que n es
2 ó 3, X_{1} y X_{2} son
ambos
y X_{3} es un grupo monosacárido
hexosa; aquéllos en los que n es 2 ó 3, X_{1} y X_{3} son
ambos
y X_{2} es un grupo monosacárido
hexosa; y compuestos en los que n es 2 ó 3, X_{1} y X_{2} son
ambos
y X_{3} es un grupo disacárido
hexosa-hexosa. También son adecuados los compuestos
en los que n es 2 ó 3, X_{1} y X_{3} son
ambos
y X_{2} es un grupo disacárido
hexosa-hexosa, o compuestos en los que n es 2 ó 3,
X_{1} y X_{2} son
ambos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y X_{3} es un grupo disacárido
hexosa-pentosa. Los compuestos de Fórmula I que
tienen grupos trisacáridos, en particular en la posición X_{3},
también resultan
preferidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de un compuesto potenciador de la
administración preferido de la invención es Syn3, que tiene la
Fórmula III mostrada en la Figura 21. Syn3 es un análogo sintético
de una impureza que se encontró en preparaciones comerciales de Big
CHAP (véanse los Ejemplos). Las Impurezas 2 y 3 de Big CHAP son
también adecuadas para uso como compuestos potenciadores de la
administración, particularmente cuando se formulan en un tampón
solubilizador que contiene, por ejemplo, un detergente tal como
Big CHAP.
Para algunas aplicaciones, es deseable usar
compuestos potenciadores de la administración que exhiban una mayor
solubilidad en agua y/o actividad potenciadora de la administración
en comparación con otros compuestos. Dichos compuestos son
proporcionados por la invención. Por ejemplo, la invención
proporciona compuestos que tienen la Fórmula I en la cual R es un
grupo catiónico. Como grupos catiónicos adecuados, se incluyen, por
ejemplo, restos de tetrametilo y amonio y sales de los mismos. Como
ejemplos de dichos compuestos, se incluyen A-tma
(Fórmula IV) y A-HCl (Fórmula V), como se muestra en
la Figura 21. Otros compuestos con mejor solubilidad y/o actividad
potenciadora de la administración incluyen aquéllos en los que el
grupo o grupos sacáridos en los compuestos de Fórmula I son
trisacáridos o mayores.
En algunas realizaciones, los agentes
potenciadores de la administración de la presente invención tienen
la Fórmula II:
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donde X_{1} y X_{2} son
seleccionados entre el grupo consistente
en
\newpage
y X_{3} es un grupo sacárido.
Como grupos sacáridos adecuados, se incluyen los discutidos
anteriormente para los compuestos de Fórmula I. En un ejemplo de un
compuesto adecuado, tanto X_{1} como X_{2}
son
y X_{3} es un grupo
glucosa.
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Como ejemplos adicionales de compuestos
adecuados, se incluyen, aunque sin limitación, aquéllos en los
cuales tanto X_{1} como X_{2} son seleccionados entre el grupo
consistente en
y X_{3} es un grupo
lactosa.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona también formulaciones
que contienen un agente que se ha de administrar a una célula y un
compuesto potenciador de la administración. La concentración del
compuesto potenciador de la administración en una formulación
dependerá de una serie de factores, tales como el compuesto
potenciador de la administración particular que se esté utilizando,
el tampón, el pH, el tejido u órgano diana y el modo de
administración. La concentración del compuesto potenciador de la
administración estará frecuentemente en el rango de un 1% a un 50%
(v/v), preferiblemente de un 10% a un 40% (v/v) y más
preferiblemente de un 15% a un 30% (v/v). Los compuestos
potenciadores de la administración de la invención son
preferiblemente utilizados en el rango de aproximadamente 0,002 a 2
mg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 0,02 a 2 mg/ml, más
preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 1 mg/ml, en las
formulaciones de la invención.
Los compuestos potenciadores de la
administración de la invención son típicamente formulados en un
solvente en el que los compuestos son solubles, aunque son también
adecuadas formulaciones en las que los compuestos están sólo
parcialmente solubilizados. La solución salina tamponada con
fosfatos (PBS) es un ejemplo de un agente solubilizador adecuado
para estos compuestos y otros son conocidos para los expertos en la
técnica. Se reconocerá que pueden ser deseables ciertos excipientes
y aditivos adicionales para conseguir características de
solubilidad de estos agentes para diversas formulaciones
farmacéuticas. Por ejemplo, se pueden añadir agentes solubilizadores
bien conocidos, tales como detergentes, ésteres de ácidos grasos y
surfactantes, en concentraciones apropiadas para facilitar la
solubilización de los compuestos en los diversos solventes que se
hayan de emplear. Cuando la formulación incluye un detergente, la
concentración de detergente en la formulación final administrada a
un paciente es preferiblemente aproximadamente
0,5-2X la concentración de micelización crítica
(CMC). Como detergentes adecuados, se incluyen los indicados
anteriormente. Se pueden determinar la identificación de
detergentes adecuados y las concentraciones apropiadas para su uso
como aquí se describe.
Un ejemplo de un agente solubilizador preferido
para compuestos tales como Syn3 y compuestos relacionados es el
Tween 80 a una concentración de aproximadamente un 0,05% a
aproximadamente un 0,3%, más preferiblemente a una concentración de
aproximadamente un 0,10% a aproximadamente un 0,15%. Big CHAP es
también un agente solubilizador preferido para Syn3 y compuestos
relacionados.
Los compuestos de la invención pueden ser
usados solos, en combinación entre sí o en combinación con otro
agente potenciador de la administración.
Los compuestos potenciadores de la
administración de la invención son útiles para aumentar la
administración de agentes, incluyendo proteínas, ácidos nucleicos,
ARN antisentido, pequeñas moléculas y similares, a las células. Por
ejemplo, los compuestos potenciadores de la administración son
útiles para administrar agentes a células que forman parte de
cualquier tejido u órgano, incluyendo los que tienen una membrana
epitelial.
Entre los agentes que son adecuados para
administración usando los compuestos potenciadores de la
administración están los "agentes moduladores", lo que, tal
como se utiliza aquí, se refiere a agentes que pueden modular
procesos biológicos. Dichos procesos incluyen, por ejemplo, el
crecimiento, la diferenciación y la proliferación celular
(incluyendo trastornos neoplásicos tales como el cáncer), la
regulación, las rutas metabólicas o biosintéticas, la expresión
génica y similares. Los agentes moduladores pueden influir también,
por ejemplo, en las respuestas inmunes (incluyendo los trastornos
autoinmunes), la infección por patógenos bacterianos y fúngicos y
cualquier otro proceso biológico que sea regulable mediante la
introducción de un agente modulador.
Los agentes terapéuticos son un ejemplo de
agentes moduladores que se pueden administrar usando los agentes
potenciadores de la administración. Dichos agentes son útiles para
modular procesos celulares asociados a enfermedad. El término
"agente terapéutico", tal como se utiliza aquí, incluye,
aunque sin limitación, proteínas terapéuticas, genes terapéuticos,
vectores (vectores plasmídicos o víricos) que contienen un gen
terapéutico, ácidos nucleicos antisentido u otras secuencias
terapéuticas de ácidos nucleicos (v.g., ácidos nucleicos triplex).
Para los fines de la presente invención, el término "gen
terapéutico" se refiere a una secuencia de ácido nucleico
introducida en una célula para conseguir un efecto terapéutico.
Como ejemplos de dichos genes terapéuticos, se incluyen, aunque sin
limitación, genes supresores tumorales, genes suicidas, moléculas
de ácido nucleico antisentido, moléculas de ácido nucleico
formadoras de triplex, genes codificantes de citokinas (tales
como, aunque sin limitación, los interferones \alpha, \beta,
\delta, y \gamma), genes codificantes de interleukinas (v.g.,
IL-1, IL-2, IL-4,
IL-6, IL-7 e IL-10)
y factores estimulantes de colonias tales como
GM-CSF. En algunos casos, el gen terapéutico puede
estar presente en un virus natural o recombinantemente
modificado.
Un gen suicida es una secuencia de ácido
nucleico cuya expresión hace a la célula susceptible de morir por
factores externos o provoca una condición tóxica en la célula. Un
ejemplo bien conocido de un gen suicida es el gen de la timidina
kinasa (TK) (véanse, v.g., Woo y col., Patente Estadounidense Nº
5.631.236, concedida el 20 de Mayo de 1997; Freeman y col., Patente
Estadounidense Nº 5.601.818, concedida el 11 de Febrero de 1997),
donde las células que expresan el producto del gen TK son
susceptibles de morir selectivamente por la administración de
ganciclovir.
Las moléculas de ácido nucleico antisentido son
hebras oligonucleotídicas complementarias de ácidos nucleicos
diseñadas para unirse a una secuencia específica de nucleótidos
para inhibir la producción de proteínas, incluyendo proteínas
causantes de enfermedad. Con frecuencia se usan moléculas
antisentido que se unen a oncogenes específicos para inhibir la
transcripción de estos agentes causantes de cáncer. Estos agentes
pueden ser usados solos o en combinación con otros genes
terapéuticos.
Los ácidos nucleicos formadores de triplex son
moléculas diseñadas para inhibir la transcripción de genes,
incluyendo, por ejemplo, genes causantes de enfermedad. En general,
esto se consigue por la unión del ácido nucleico formador de
triplex a la secuencia de control de la transcripción del gen
diana, evitando la transcripción del gen diana. Los
oligonucleótidos formadores de triplex reconocen y se unen al surco
mayor del ADN de doble hebra en virtud de las uniones de hidrógeno
de Hoogsteen. Como ejemplos del uso de tecnología triplex, se
incluyen el abordaje de los genes del receptor de andrógenos o del
factor de crecimiento de tipo insulina con tecnología triplex en
células de cáncer de próstata. Boulikas, T., Anticancer Res.
17(3A): 1471-1505 (1997). Se ha demostrado
que los ácidos nucleicos triplex son mutagénicos en algunos casos y
dichas moléculas pueden ser utilizadas para inducir respuestas de
mecanismos de reparación del ADN endógeno que dan lugar a una
inducción de genes supresores tumorales de un modo terapéutico y
pueden contribuir a una inestabilidad genómica que induce apoptosis
en la célula diana. Actualmente, se están investigando una
variedad de compuestos nucleicos triplex y éstos están bien
documentados en la literatura científica.
"Gen supresor tumoral" se refiere a un gen
que codifica un polipéptido que suprime la formación de tumores.
Los genes supresores tumorales son genes naturales en células de
mamíferos, cuya deleción o inactivación se cree que son un
prerrequisito necesario para el desarrollo de tumores. La terapia
con genes supresores de tumores intenta generalmente reintroducir
el gen supresor de tumores en células en las que el gen está
ausente o inactivo. Como ejemplos de genes supresores tumorales
útiles en la práctica de la presente invención, se incluyen p53,
p110Rb y miembros de la familia INK4 de genes supresores tumorales,
incluyendo p16 y p21 y fragmentos terapéuticamente efectivos de los
mismos tales como p56Rb, p94Rb, etc. En la práctica preferida de la
invención, el gen supresor tumoral es seleccionado entre el gen Rb
y el gen p53 y secuencias de ácidos nucleicos codificantes de
variantes funcionales de los mismos, tales como Rb56. En la
práctica más preferida de la invención, el gen supresor tumoral es
p53.
En algunas realizaciones, las composiciones de
la invención contienen una cantidad "terapéuticamente
efectiva" de un agente terapéutico en un tampón que contiene un
compuesto potenciador de la administración. "Terapéuticamente
efectivo", tal como se usa aquí, se refiere a la prevención,
reducción o curación de los síntomas asociados a un estado
morboso.
\newpage
Los agentes y formulaciones potenciadoras de la
administración que contienen estos agentes pueden ser usados
también para facilitar la administración de genes de interés a las
células, en particular a las células de órganos y tejidos. Estos
genes pueden codificar, por ejemplo, proteínas de interés para
fines comerciales. Como ejemplo, se pueden usar los agentes y
formulaciones para administrar al tejido mamario de un mamífero un
gen que codifica una proteína nutricionalmente importante, que se
segrega después a la leche producida por el mamífero. Otros usos de
dichos agentes y formulaciones resultarán evidentes para los
expertos en la técnica.
Los agentes y formulaciones potenciadoras de la
administración que incluyen dichos agentes son también útiles para
administrar agentes diagnósticos a las células, órganos y tejidos.
Como ejemplos de agentes diagnósticos, se incluyen genes marcadores
que codifican proteínas que son fácilmente detectables cuando se
expresan en una célula (incluyendo, aunque sin limitación,
\beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde,
luciferasa y similares) y sondas de ácidos nucleicos marcadas
(v.g., sondas radiomarcadas).
En la situación en que un agente que se ha de
administrar a una célula es un gen, se puede incorporar el gen a un
vector. Como ejemplos de vectores usados para esos fines se
incluyen plásmidos de expresión capaces de dirigir la expresión del
gen de interés en la célula diana. En otros casos, el vector es un
sistema vectorial vírico donde se incorpora el gen de interés a un
genoma vírico capaz de transfectar la célula diana. Cuando el gen
de interés está diseñado para su expresión en una célula diana, el
gen puede estar unido de un modo operable a secuencias de expresión
y control que pueden dirigir la expresión del gen en las células
huésped diana deseadas. Así, se puede conseguir la expresión del
gen en condiciones apropiadas en la célula diana.
Como sistemas vectoriales víricos útiles en la
práctica de la presente invención, se incluyen, por ejemplo,
sistemas vectoriales víricos naturales o recombinantes. Dependiendo
de la aplicación particular, como vectores víricos adecuados se
incluyen vectores víricos competentes en cuanto a replicación,
deficientes en cuanto a replicación y de replicación condicional.
Por ejemplo, los vectores víricos pueden derivar del genoma de
adenovirus humanos o bovinos, del virus vaccinia, del virus herpes,
de virus adenoasociados, del virus diminuto de los ratones (MVM),
del VIH, del virus de Sindbis y de retrovirus (incluyendo, aunque
sin limitación, el virus del sarcoma de Rous) y del MoMLV.
Típicamente, los genes de interés son insertados en dichos vectores
para permitir el empaquetamiento de la construcción génica,
típicamente con ADN vírico acompañante, infección de una célula
huésped sensible y expresión del gen de interés. Un vector vírico
recombinante preferido es el sistema de administración de vectores
adenovíricos, que tiene una deleción del gen de la proteína IX
(véase la Solicitud de Patente Internacional WO 95/11984).
"Recombinante", tal como se usa aquí, se
refiere a ácidos nucleicos y a las proteínas codificadas por
ellos, donde los ácidos nucleicos son construidos por métodos de
tecnología de ADN recombinante, también llamada "ingeniería
genética".
Se administrarán cantidades terapéuticamente
efectivas de la composición farmacéutica que contiene un gen
modulador, tal como un gen p53 o un gen supresor tumoral para el
retinoblastoma, en un sistema de administración de vectores víricos
recombinantes formulado en un tampón que contiene un agente
potenciador de la administración, de acuerdo con la enseñanza de
esta invención. Por ejemplo, las cantidades terapéuticamente
efectivas de un gen terapéutico en el sistema de administración de
vectores adenovíricos recombinantes formulado en un tampón que
contiene un agente potenciador de la administración están en el
rango de aproximadamente 1x10^{8} partículas/ml a 1x10^{12}
partículas/ml, más típicamente de aproximadamente 1x10^{8}
partículas/ml a 5x10^{11} partículas/ml, más típicamente de
1x10^{9} partículas/ml a 1x10^{11} partículas/ml (NP/ml).
Tal como se usa aquí, "sistema de
administración de genes" se refiere a cualquier medio para la
administración de un agente a una célula diana. El agente puede
asociarse a un sistema de administración de genes que es luego
suministrado a la célula usando una formulación que contiene un
compuesto potenciador de la administración.
En algunas realizaciones de la invención, se
conjugan construcciones génicas u otros agentes a un ligando de
receptor celular para una captación facilitada (v.g., invaginación
de hoyos revestidos e internalización del endosoma) a través de un
resto de unión apropiado, tal como un resto de unión de ADN (Wu y
col., J. Biol. Chem. 263: 14621-14624 (1988); WO
92/06180). Por ejemplo, se pueden unir construcciones génicas a
través de un resto de polilisina al asialoorosomucoide, que es un
ligando para el receptor de asialoglicoproteína de los
hepatocitos.
De forma similar, se pueden modificar las
envueltas víricas usadas para empaquetar construcciones génicas
por adición de ligandos de receptores o de anticuerpos específicos
para un receptor, para permitir la endocitosis mediada por
receptores en células específicas (véanse, v.g., WO 93/20221, WO
93/14188 y WO 9406923). En algunas realizaciones de la invención,
las construcciones de ADN de la invención se unen a proteínas
víricas, tales como partículas de adenovirus, para facilitar la
endocitosis (Curiel y col., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 88:
8850-8854 (1991)). En otras realizaciones, los
conjugados moleculares de la presente invención pueden incluir
inhibidores de los microtúbulos (WO/9406922), péptidos sintéticos
que imitan la hemaglutinina del virus de la influenza (Plank y
col., J. Biol. Chem. 269: 12918-12934 (1994)) y
señales de localización nuclear tales como el antígeno T de SV40
(WO93/19768).
En algunas realizaciones de la invención, el
agente modulador es un ácido nucleico antisentido. El ácido
nucleico antisentido puede ser aportado como un oligonucleótido
antisentido (véase, v.g., Murayama y col., Antisense Nucleic Acid
Drug Dev. 7: 109-114 (1997)). También se pueden
proporcionar genes codificantes de un ácido nucleico antisentido;
dichos genes pueden ser formulados con un compuesto potenciador de
la administración e introducidos en células por métodos conocidos
para los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede introducir
un gen que codifique un ácido nucleico antisentido en un vector
vírico, tal como, por ejemplo, en el virus de la hepatitis B
(véase, v.g., Ji y col., J. Viral Hepar, 4: 167-173
(1997)), en virus adenoasociados (véase, v.g., Xiao y col., Brain
Res. 756: 76-83 (1997)) o en otros sistemas,
incluyendo, aunque sin limitación, un sistema de administración de
genes de HVJ (virus Sendai)-liposoma (véase, v.g.,
Kaneda y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 811: 299-308
(1997)); un "vector peptídico" (véase, v.g., Vidal y col., CR
Acad. Sci III 32: 279-287 (1997)); como gen en un
vector episómico o plasmídico (véanse, v.g., Cooper y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 6450-6455 (1997); Yew y
col., Hum Gene Ther. 8: 575-584 (1997)); como gen
en un agregado de péptido-ADN (véase, v.g., Niidome
y col., J. Biol. Chem. 272: 15307-15312 (1997));
como "ADN desnudo" (véase, v.g., EE.UU. 5.580.859 y EE.UU.
5.589.466); en sistemas vectoriales lipídicos (véase, v.g., Lee y
col., Crit Rev The, Drug Carrier Syst. 14: 173-206
(1997)); liposomas revestidos de polímero (Marín y col., Patente
Estadounidense Nº 5.213.804, concedida el 25 de Mayo de 1993;
Woodle y col., Patente Estadounidense Nº 5.013.556, concedida el 7
de Mayo de 1991); liposomas catiónicos (Epand y col., Patente
Estadounidense Nº 5.283.185, concedida el 1 de Febrero de 1994;
Jessee, J.A., Patente Estadounidense Nº 5.578.475, concedida el 26
de Noviembre de 1996; Rose y col., Patente Estadounidense Nº
5.279.833, concedida el 18 de Enero de 1994; Gebeyehu y col.,
Patente Estadounidense Nº 5.334.761, concedida el 2 de Agosto de
1994); microesferas rellenas de gas (Unger y col., Patente
Estadounidense Nº 5.542.935, concedida el 6 de Agosto de 1996); y
macromoléculas encapsuladas dirigidas a ligando (Low y col.,
Patente Estadounidense Nº 5.108.921, concedida el 28 de Abril de
1992; Curiel y col., Patente Estadounidense Nº 5.521.291, concedida
el 28 de Mayo de 1996; Groman y col., Patente Estadounidense Nº
5.554.386, concedida el 10 de Septiembre de 1996; Wu y col.,
Patente Estadounidense Nº 5.166.320, concedida el 24 de Noviembre
de 1992).
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Cuando se usan con fines farmacéuticos, las
formulaciones de la invención incluyen un tampón que contiene el
compuesto potenciador de la administración. El tampón puede ser
cualquier tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución
salina tamponada con fosfatos o fosfato de sodio/sulfato de sodio,
tampón Tris, tampón glicina, agua estéril y otros tampones
conocidos para quien tiene conocimientos ordinarios en la técnica,
tales como los descritos por Good y col. (1966), Biochemistry 5:
467. El pH del tampón en la composición farmacéutica que incluye un
gen modulador contenido en un sistema de administración de vector
adenovírico, por ejemplo, está típicamente comprendido entre 6,4 y
8,4, preferiblemente entre 7 y 7,5 y más preferiblemente entre 7,2
y 7,4.
Las composiciones de esta invención pueden
incluir adicionalmente un estabilizador, potenciador u otros
soportes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Un soporte
farmacéuticamente aceptable puede contener un compuesto
fisiológicamente aceptable que actúe, por ejemplo, estabilizando el
sistema de administración de vector adenovírico recombinante que
contiene el gen supresor tumoral. Un compuesto fisiológicamente
aceptable puede incluir, por ejemplo, carbohidratos, tales como
glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido
ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso
molecular u otros estabilizadores o excipientes. Otros compuestos
fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes
emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes, que son
particularmente útiles para evitar el crecimiento o la acción de
microorganismos. Son conocidos diversos conservantes y éstos
incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. Un experto en la
materia sabrá que la elección de un soporte farmacéuticamente
aceptable depende de la vía de administración y de las
características fisicoquímicas particulares del sistema de
administración de vector adenovírico recombinante y del gen
supresor tumoral particular en él contenido. Se pueden encontrar
ejemplos de soportes, estabilizadores o adyuvantes en Martin,
Remington's Pharm. Sci., 15ª Ed. (Mack Publ. Co.. Easton, PA
1975).
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En algunas realizaciones, el compuesto
potenciador de la administración está incluido en el tampón en el
que se formula el agente modulador. El compuesto potenciador de la
administración puede ser suministrado antes del agente modulador o
concomitantemente con el agente modulador. En algunas
realizaciones, el compuesto potenciador de la administración es
aportado con el agente modulador mezclando una preparación de
agente modulador con una formulación de compuesto potenciador de la
administración justo antes de la administración al paciente. En
otras realizaciones, el compuesto potenciador de la administración
y el agente modulador son proporcionados en un solo vial al
cuidador para su administración.
En el caso de una composición farmacéutica que
incluya un gen supresor tumoral contenido en un sistema de
administración de vector adenovírico recombinante formulado en un
tampón que además incluye un agente potenciador de la
administración, la composición farmacéutica puede ser administrada
a lo largo de un tiempo comprendido entre aproximadamente 5 minutos
y 3 horas, preferiblemente entre aproximadamente 10 minutos y 120
minutos y más preferiblemente entre aproximadamente 15 minutos y
90 minutos. En otra realización, el agente potenciador de la
administración puede administrado antes de la administración del
sistema de administración de vector adenovírico recombinante que
contiene el gen supresor tumoral. La administración previa del
agente potenciador de la administración puede ser de
aproximadamente 30 segundos a 1 hora, preferiblemente de
aproximadamente 1 minuto a 10 minutos y más preferiblemente de
aproximadamente 1 minuto a 5 minutos antes de la administración del
sistema de administración de vector adenovírico que contiene el
gen supresor tumoral.
El agente modulador formulado en un tampón que
contiene un agente potenciador de la administración puede ser
suministrado a cualquier tejido u órgano, incluyendo tejidos
neoplásicos tales como tejido canceroso, usando cualquier método de
administración conocido para quien tiene un conocimiento ordinario
en la materia, por ejemplo administración intratumoral o
intravesical. Como tejidos y órganos, se incluyen cualquier tejido
u órgano que tenga una membrana epitelial, tal como el tracto
gastrointestinal, la vejiga, el tracto respiratorio y el pulmón.
Como ejemplos, se incluyen, aunque sin limitación, el carcinoma de
la vejiga y del tracto respiratorio superior, la vulva, el cérvix,
la vagina o los bronquios; los tumores metastáticos locales del
peritoneo; el carcinoma broncoalveolar; el carcinoma metastático
pleural; el carcinoma de la boca y las amígdalas: el carcinoma de
la nasofaringe, la nariz, la laringe, el esófago, el estómago, el
colon y el recto, la vesícula biliar o la piel; o el melanoma.
En algunas realizaciones de la invención, el
agente terapéutico está formulado en formulaciones mucosales,
tópicas y/o bucales, particularmente formulaciones en gel
mucoadhesivo y en gel tópico. Se describen ejemplos de
composiciones potenciadoras de la permeación, matrices poliméricas
y preparaciones de gel mucoadhesivo para administración
transdérmica en EE.UU. 5.346.701. Dichas formulaciones son
especialmente útiles para el tratamiento de cánceres de la boca, la
cabeza y el cuello (v.g., cánceres del epitelio traqueobronquial),
cánceres de piel (v.g., melanoma, carcinomas de células basales y
escamosas), cánceres de la mucosa intestinal y de la mucosa vaginal
y cáncer cervical.
En algunas realizaciones de la invención, se
formula un agente terapéutico en formulaciones oftálmicas para
administración al ojo. Dichas formulaciones resultan útiles en la
administración del gen del retinoblastoma (RB) al ojo,
eventualmente junto con la administración de p53.
Las formulaciones de la invención son
típicamente administradas para aumentar la transferencia de un
agente a una célula. La célula puede ser aportada como parte de un
tejido, tal como una membrana epitelial, o como una célula aislada,
tal como en cultivo de tejidos. La célula puede ser aportada in
vivo, ex vivo, o in vitro.
Las formulaciones que contienen compuestos
potenciadores de la administración y agentes moduladores pueden ser
introducidas en el tejido de interés in vivo o ex
vivo por una variedad de métodos. En algunas realizaciones de
la invención, el agente modulador es introducido en las células por
métodos tales como la microinyección, la precipitación con fosfato
de calcio, la fusión de liposomas o la biolística. En otras
realizaciones, el agente terapéutico es captado directamente por el
tejido de interés.
En algunas realizaciones de la invención, las
composiciones de la invención son administradas ex vivo a
células o tejidos explantados de un paciente y luego devueltos al
paciente. Como ejemplos de administración ex vivo de
construcciones génicas terapéuticas, se incluyen Arteaga y col.,
Cancer Research 56(5): 1098-1103 (1996);
Nolta y col., Proc Natl. Acad Sci. USA 93(6):
2414-9 (1996); Koc y col., Seminars in Oncology 23
(1): 46-65 (1996); Raper y col., Annals of Surgery
223(2): 116-26 (1996); Dalesandro y col., J.
Thorac. Cardi. Surg., 11(2): 416-22 (1996);
y Makarov y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1):
402-6 (1996).
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, y
no limitar, el alcance de esta invención. En los siguientes
ejemplos, "g" significa gramos, "ml" significa mililitros,
"mol" significa moles, "ºC" significa grados
Centígrados, "min." significa minutos, "DMF" significa
dimetilformamida y "NP" especifica el número de partículas.
Todas las temperaturas están en grados Centígrados a menos que se
especifique en contrario.
Experimentos iniciales han mostrado que diversos
factores, incluyendo la concentración del virus, el tiempo de
administración y el volumen de dosificación, pueden influir en la
transferencia génica al epitelio de la vejiga tras administración
intravesical a ratas. Dado que se pueden conseguir una mayor
penetración de tintes por administración intravesical de diferentes
solventes, se investigó también la modificación de la formulación
de adenovirus como estrategia alternativa para aumentar la
expresión transgénica de adenovirus en la vejiga (Monson y col.,
Urology 145: 842-845 (1991)). Los presentes
experimentos se centraron en el uso de etanol para aumentar la
expresión transgénica de adenovirus en la vejiga.
Se anestesiaron nueve ratas hembras de tipo
Buffalo (Sprague Dawley Harlan) con isoflurano y se les dio una
sola administración intravesical de un adenovirus recombinante
humano codificante del gen lacZ
(rAd-\betagal). El vector adenovírico
recombinante humano que contiene el gen lacZ
(rAd-\betagal) está descrito en Wills y col.,
Human Gene Therapy 5: 1079-1088 (1994). Antes de la
instilación, se perfundieron las vejigas con PBS y se vaciaron. Se
diluyó entonces rAd-\betagal para obtener una
concentración final de 1,7x10^{11} NP/mL en 1) VPBS (sacarosa al
2% (p/v) y MgCl 2 mM, en PBS), 2) etanol al 30% (v/v), o 3) DMSO
al 50% (v/v), y se instiló en un volumen de 250 \muL (N=3
animales/grupo). Se retuvo el material administrado en la vejiga
durante 45 minutos. Se perfundieron entonces las vejigas con PBS y
se permitió a los animales recuperarse del procedimiento. A los dos
días de la administración, se sacrificaron las ratas, se recogieron
las vejigas y se fijaron y se tiñeron los órganos enteros con una
solución de Xgal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido)
para evaluar la transferencia del gen indicador. Los tejidos
teñidos con Xgal fueron entonces embebidos en parafina, seccionados
y contrateñidos con hematoxilina y eosina. La hidrólisis de Xgal
por \beta-galactosidasa da lugar a un color azul
que se localiza en el epitelio vesical luminal superficial.
Se detectó la expresión transgénica como
consecuencia de la administración por el vector adenovírico en las
vejigas de todos los animales tratados con
rAd-\betagal, pero no en un control no tratado.
La expresión transgénica era similar a los resultados previamente
publicados usando la formulación de PBS/sacarosa (Bass y col.,
Cancer Gene Therapy 2:2: 97-104 (1995)). En marcado
contraste, la expresión de la \beta-galactosidasa
en la superficie epitelial luminal estaba muy aumentada en animales
que recibieron rAd-\betagal diluido en etanol al
30% (Figura 1). Se embebieron los especímenes de vejiga descritos
en la Figura 1, se seccionaron y se contratiñeron con hematoxilina
y eosina. La evaluación histológica del tejido de la vejiga
demostró una mayor expresión de la
\beta-galactosidasa del epitelio vesical de
transición cuando se añadió etanol a la formulación de adenovirus
(Figura 2). La interacción del etanol con la capa protectora de
glicosaminoglicano (GAG) sobre la superficie del epitelio
proporciona un mecanismo para el aumento observado en la expresión
transgénica. La alteración de esta capa puede facilitar la
interacción virus-célula en la superficie y
potencialmente aumentar la penetración en la submucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro experimento, se anestesiaron 18 ratas
Sprague-Dawley hembras con isoflurano y se les dio
un solo bolo intravesical de 0,5 ml de
rAd-\betagal a concentraciones de 2x10^{7},
2x10^{8}, 2x10^{9}, 2x10^{10} y 2x10^{11} NP/mL en una
formulación de etanol al 33,5% (v/v). Después de 45 minutos de
incubación, se perfundieron las vejigas con PBS y se permitió a los
animales recuperarse de la anestesia. Dos días más tarde, los
animales fueron sacrificados y se recogieron las vejigas y se
fijaron y se tiñeron los órganos enteros con una solución de Xgal
para evaluar la expresión transgénica adenovírica. La expresión de
la \beta-galactosidasa en el epitelio vesical
luminal guardaba correlación con la concentración del adenovirus
recombinante administrado (Figura 3). No se observaron diferencias
notables entre los animales que recibieron 2x10^{10} ó 2x10^{11}
NP/mL, lo que sugiere una saturación de la expresión transgénica
en este modelo. El análisis del volumen evacuado tras la
instilación indicó sólo una reducción mínima en el título
infeccioso del material de dosificación a estas dosis elevadas; la
expresión de la \beta-galactosidasa disminuyó a
concentraciones menores. No se detectó evidencia de expresión de la
\beta-galactosidasa en animales dosificados a una
concentración de 1x10^{7} NP/mL o en un animal control no
tratado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un estudio piloto para evaluar
específicamente la expresión del transgén RB usando un ensayo de
RT-PCR. El adenovirus recombinante usado en este
estudio se basaba en el adenovirus humano del serotipo 5, del que
se había suprimido la región temprana vírica 1 codificante de las
proteínas E1a, E1b, y pIX. Este adenovirus se limita a propagarse
en células 293, que producen los productos génicos Ad5 El
necesarios para la replicación. Se generaron plásmidos de
transferencia codificantes de Rb de longitud completa o truncado a
partir de pACN (Wills y col., Cancer Gene Therapy 2:
191-197 (1995)) y se utilizaron a su vez para
construir los adenovirus recombinantes. Se puso un ADNc RB de
longitud completa (1-928 aminoácidos), subclonado
como un fragmento Xba I-Bam HI de 2,8 Kb a partir
de los plásmidos pETRbc (Huang y col., Nature 330:
160-182 (1991), o un fragmento truncado
(aminoácidos 381-928), subclonado como un fragmento
de ADNc Xba I-Bam HI de 1,7 Kb, secuencia abajo del
promotor/potenciador de CMV y del ADNc líder tripartito Ad 2 del
plásmido pACN. Se linealizaron estos plásmidos a continuación con
Eco RI y se cotransfectaron (CaPO_{4}, Stratagene) con el
fragmento grande digerido Cla I aislado de H5ilE4 (Hemstrom y col.,
J. Virol. 62: 3258-3264 (1988)) para preparar
Ad-RB56 (ACN56), que contenía una deleción E4
parcial, o con el fragmento grande de un virus híbrido de d1327
(Ginsberg et al. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 86:
3823-3827 (1989)) y H5ilE4 para crear
Ad-Rb110 (ACNRB), que contenía deleciones en las
regiones tanto E3 como E4 del vector.
Se anestesiaron ocho ratones ICR hembras
(Charles River Laboratories) con avertina y cada uno recibió una
sola administración intravesical de 80 \mul de (ACNRB). Se diluyó
el ACNRB (4x10^{11} NP/mL) y se preparó en una solución de PBS o
una solución de etanol al 30% (v/v). Después de que el virus
quedara retenido en la vejiga durante 45 minutos, se dejó que los
animales se recuperaran y orinaran. Los ratones fueron sacrificados
2 días o 14 días después de la administración de ACNRB y se
recogieron las vejigas, los hígados y los riñones de cada animal,
se homogeneizaron y se procesaron para su análisis (N=2
animales/grupo). Se determinó la expresión transgénica usando
RT-PCR con un cebador específico para ACNRB. Más
específicamente, se generaron cebadores para identificar ACNRB y
amplificar la región desde el extremo 3' de la secuencia de CMV y
hasta el extremo 5' de la secuencia de RB. Después de la
amplificación (30 ciclos), se separaron los productos de la
RT-PCR en un gel de poliacrilamida al 10%, se
tiñeron con bromuro de etidio y se fotografiaron. Se detectó la
mayor expresión de ACNRB tras tratamiento con ACNRB en etanol al
30% (v/v) en comparación con la muy baja expresión tras tratamiento
con ACNRB en VPBS. Los controles positivos para el ensayo incluían
muestras procedentes de células de cáncer humano de vejiga 5637
infectadas con ACNRB (CONTROL). Muestras de ARN de vejiga de
animales infectados con ACNRB que fueron amplificadas con cebadores
específicos para la beta-actina proporcionaron un
control interno para la calidad del ARN. Muestras no tratadas y
muestras de vejiga sin la transcriptasa inversa (RT) proporcionaron
controles para el ADN contaminante. Dos días después de la
dosificación, se detectaron niveles de expresión de ACNRB en los
homogenados de vejiga de animales que recibieron ACNRB preparado en
etanol al 30% (Figura 4). No se detectó evidencia de expresión en
tejido no vesical o en cualquier muestra recogida 14 días después
de la dosificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar el curso temporal de la
expresión tras administración intravesical, se anestesiaron 40
ratones hembras (Charles River Laboratories) con avertina y se les
dio un solo bolo de 80 \muL de ACNRB (4x10^{10} NP/mL en
etanol al 22% (v/v)). Se retuvo el material instilado en la vejiga
durante aproximadamente 45 minutos y se permitió a los animales
recuperarse del procedimiento. Los ratones fueron sacrificados 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7 y 14 días tras la administración (N=4/tiempo) para
el análisis. Se recogieron las vejigas, los hígados y los riñones
y congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido para su
posterior análisis. Para la detección de la expresión de ACNRB, se
homogeneizaron las muestras de tejidos y se extrajo el ARN total
usando TRI-Reagent7. Se amplificó una alícuota de
ARN total en un ensayo de RT-PCR usando cebadores
específicos para ACNRB para distinguir la expresión transgénica de
la expresión endógena de RB. Para la detección del ADN ACNRB, se
usó un kit de extracción de ADN (Stratagene) sobre homogenados de
tejidos. Se llevó a cabo una PCR con los cebadores específicos para
ACNRB, según se ha descrito anteriormente para el análisis de
RT-PCR.
Se detectó la expresión transgénica ACNRB en
los homogenados de vejiga sólo en muestras recogidas los días
1-6, disminuyendo la expresión relativa al p53
endógeno con el tiempo (Figura 5, panel superior). No se detectó
expresión procedente de las muestras recogidas 7 y 14 días después
de la administración. Es interesante el hecho de que se detectara
algo de expresión de ACNRB en los riñones los días 1, 2 y 3, pero
no se observara expresión en el hígado (Figura 5, paneles
inferiores).
Se detectó ADN ACNRB en el tejido de vejiga de
todos los animales que recibieron ACNRB, incluyendo los recogidos
14 días después de la administración (Figura 6 (panel izquierdo)).
También se recuperó ADN de los homogenados de riñón, hecho
consistente con la expresión de ACNRB detectada en este tejido
(Figura 6, panel derecho). No se detectó evidencia de ADN ACNRB en
muestras de hígado recogidas durante el estudio (datos no
mostrados). Se usaron muestras de un animal sin tratar (U) y ADN
ACNRB purificado (PC) como control negativo y 25 controles
positivos, respectivamente.
Como la administración sistémica de adenovirus
recombinante da lugar primariamente a expresión transgénica en el
hígado (Li y col., Human Gene Therapy 4: 403-409
(1993)), la ausencia de ADN y de expresión de ACNRB en las muestras
de hígado (Figura 5 y Figura 6) sugiere una exposición sistémica
insignificante de ACNRB tras administración intravesical. El flujo
retrógrado por los uréteres puede haber contribuido a la detección
de ACNRB en el riñón.
Los datos presentados anteriormente demuestran
la expresión transgénica en la vejiga de roedores tras
administración intravesical de ACNRB. Estos estudios indican además
que la transferencia de genes mediada por adenovirus al epitelio de
la vejiga puede estar potenciada por la presencia de un agente
potenciador de la administración, tal como el etanol, en la
formulación. Un mecanismo para la mayor transferencia génica puede
ser la alteración de la capa protectora de glicosaminoglicano
sobre la superficie epitelial de la vejiga. Una sola administración
intravesical de ACNRB en una formulación de etanol al
20-30% (v/v) da lugar a expresión transgénica en la
vejiga, que persiste durante aproximadamente una semana. El flujo
ureteral retrógrado proporciona una explicación probable de la
expresión transitoria de ACNRB detectada en el riñón. La ausencia
de expresión de ACNRB y de ADN ACNRB en el hígado indica una
exposición sistémica limitada tras la administración
intravesical.
\vskip1.000000\baselineskip
Para minimizar los efectos colaterales sin
perder eficiencia en la transferencia génica, se estudiaron otros
excipientes. Se sabe que los detergentes interaccionan con las
membranas celulares y forman grandes poros sin más daños en las
células. Se estudió la eficiencia del adenovirus recombinante
formulado en detergentes menos tóxicos en modelos de transferencia
génica en ratas y ratones.
Se formuló rAd-\betagal en
diferentes detergentes a su concentración crítica de micelización
para evaluar la eficiencia de la transferencia génica al epitelio
vesical. Se anestesiaron ratas hembras (aproximadamente 200 g de
peso corporal, Sprague Dawley Harlan) con isoflurano y se les dio
una sola administración intravesical de
rAd-\betagal (1x10^{11} NP/ml) en diferentes
formulaciones detergentes (véase la Tabla I). Antes de la
instilación, se perfundieron las vejigas con PBS y se vaciaron
después. Se instiló entonces rAd-\betagal en un
volumen de 0,5 ml. Se retuvo la solución instilada en la vejiga
durante 45 minutos. Se perfundieron entonces las vejigas con PBS y
se dejó que los animales se recuperaran del procedimiento. A las
48 horas de la administración, se sacrificaron las ratas, se
recogieron las vejigas y se fijaron en formalina. Después de la
fijación, abrieron las vejigas longitudinalmente para exponer el
urotelio al cromógeno (Xgal), que se convierte en un color azul si
hay presencia de expresión del gen indicador
(\beta-galactosidasa). Se fotografió la
superficie del epitelio luminal de la totalidad de la vejiga y se
puntuó la tinción azul: + (tinción mínima), ++ (tinción moderada),
+++ (tinción intensa que cubre la totalidad de la superficie
epitelial de la vejiga). Los resultados son mostrados en la Tabla
I. Algunos de los detergentes aniónicos (taurodesoxicolato), de los
detergentes zwitteriónicos (CHAPS, ZWITTERGENT7) y de los
detergentes no iónicos (Big CHAP (CALBIOCHEM7), TRITON7
X-100) aumentaron la transferencia génica de un modo
dramático. Los detergentes catiónicos y algunos de los detergentes
no iónicos (PLURONIC7 F68, TWEEN7) no tuvieron efectos similares.
Las mejoras en la transferencia génica iban frecuentemente
acompañadas de cistitis. Los detergentes zwitteriónicos facilitaron
la formación de cálculos vesicales.
Se evaluaron las posibles manifestaciones de
cistitis observadas con etanol en ratones usando una formulación
detergente de Big CHAP 7 mM (CALBIOCHEM7) (CMC 2X) o
TRITON7-X-100 0,05 mM (CMC). Se
administraron las formulaciones intravesicalmente en un volumen de
80 uL y se observó a los animales a lo largo de un intervalo de 7
días. Tras el sacrificio, se embebieron las vejigas en parafina, se
seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina para la
evaluación patológica. Sólo se observó una ligera infiltración de
macrófagos en el tejido de la vejiga en ratones tratados con Big
CHAP (CALBIOCHEM7). La infiltración de macrófagos era más
prominente (de ligera a leve) si estaba inducida por detergente
TRITON7-X-100. En marcado
contraste, se detectó una cistitis significativa en animales
tratados con etanol al 22%.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de los experimentos con el gen indicador,
se realizó un grupo de estudios diferente para evaluar
específicamente la transferencia génica de ACNRB. Se anestesiaron
ratones ICR hembras con avertina y cada ratón recibió una sola
administración intravesical de 80 \muL de ACNRB. Se formuló el
ACNRB (4x10^{10} NP/mL) en VPBS, etanol al 22% (v/v) o Big CHAP 3
mM (CALBIOCHEM7). Después de que el virus quedara retenido en la
vejiga durante 45 minutos, se dejó que los animales se recuperaran.
Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la
administración de ACNRB y se congelaron las vejigas instantáneamente
en nitrógeno líquido. Se determinó la expresión transgénica usando
RT-PCR. Se aclararon los tejidos en agua libre de
ARNasa, se homogeneizaron y se digirieron en
Tri-Reagent (Molecular Research Center) y se
extrajo el ARN celular total. Se sondeó el ACNRB usando un cebador
5' localizado en la región CMV del vector ACNRB y un cebador 3'
situado en el extremo 5' del genoma de Rb. Se realizó la
RT-PCR en el Perkin Elmer 9600
Gene-Amp PCR System. Las condiciones de ciclación
fueron 10 min a 65ºC, 8 min a 50ºC, 5 min a 95ºC. Se realizaron 32
ciclos de PCR, consistiendo cada ciclo en 30 seg a 94ºC, 30 seg a
58ºC y 30 seg a 72ºC. El 32º ciclo incluía una etapa de alargamiento
de 10 min a 72ºC para asegurar la extensión total de los fragmentos
de ADN incompletos. Se tiñeron las bandas de
ACNRB-ARN con bromuro de etidio. Los resultados,
mayor expresión usando una formulación de etanol o Big CHAP
(CALBIOCHEM7), son mostrados en la Figura 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que Big CHAP (CALBIOCHEM7) potenciaba la
transferencia génica con mínima cistitis, se seleccionó esta
formulación para una mayor evaluación, incluyendo la concentración
y la dependencia de la dosis, en estudios similares a los antes
descritos. Brevemente, se administró rAd-\betagal
(1x10^{11} NP/ml) en la vejiga de ratas anestesiadas a través de
un catéter intravesical; se formuló rAd-\betagal
en diferentes concentraciones de Big CHAP (CALBIOCHEM7). Se inyectó
un volumen de 0,5 ml, que permaneció instilado en la vejiga durante
45 minutos. Se sacrificaron los animales 48 horas después, se fijó
la vejiga en formalina al 4%/glutaraldehído, se abrió
longitudinalmente y se midió la actividad enzimática
\beta-galactosidasa usando substrato Xgal. La
intensidad de la tinción azul guarda correlación con la expresión
del transgén \betagal. La Figura 7 muestra la superficie
epitelial de las vejigas teñidas con Xgal. Los resultados indican
un aumento dependiente de concentración de la transferencia génica
al epitelio. Las concentraciones 3,5-7 mM de Big
CHAP (CALBIOCHEM7) mejoraron significativamente la transferencia
génica. La formulación por sí sola (Figura 7, panel inferior) no
indujo un color azul procedente del substrato Xgal. Una
concentración superior (17,5 mM) no mejoró notablemente la
transferencia o la expresión génica, pero indujo cistitis en
algunos de los animales estudiados.
También se estudiaron los efectos de
concentraciones superiores de adenovirus recombinante. Brevemente,
se administraron a la vejiga de ratas hembras anestesiadas
diferentes concentraciones de rAd-\betagal,
formulado en Big CHAP 7 mM (CALBIOCHEM7) a través de un catéter
intravesical. Se sacrificaron los animales 48 horas después, se
fijó la vejiga en formalina al 4%/glutaraldehído, se abrieron
longitudinalmente y se tiñeron con Xgal. La Figura 8 muestra un
aumento dependiente de la concentración de la transferencia génica
al epitelio. Una concentración de 1,3x10^{11} NP/ml indujo una
máxima transferencia génica. Una concentración superior
(6,5x10^{11} NP/ml) no mejoró notablemente la tinción azul. A
concentraciones inferiores de rAd-\betagal, de
1,3x10^{10} NP/ml o de 1,3x10^{9} NP/ml, la expresión
transgénica se redujo de un modo dependiente de dosis. Cuando se
compararon las formulaciones 3,5 mM y 7 mM, la expresión de
\beta-galactosidasa era similar, aunque el efecto
potenciado parecía más reproducible en animales tratados con la
formulación de Big CHAP 7 mM (CALBIOCHEM7).
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que las investigaciones iniciales se
centraron en animales con un epitelio vesical intacto, se estudió
también la transferencia génica mediada por adenovirus evaluada en
un modelo animal de carcinoma de células de transición. Se
indujeron tumores en ratas Fisher machos por adición de un 0,05% de
BBN al agua de bebida durante seis meses. Se instiló
rAd-\betagal (1x10^{11} NP/ml), formulado en
Big CHAP 4 mM (CALBIOCHEM7) o VPBS, en la vejiga durante 45 minutos
por inyección directa. Se evaluó la expresión de
\beta-gal 48 h después del tratamiento.
Consistentemente con experimentos previos que utilizaron animales
no portadores de tumores, la transferencia génica al tejido tumoral
mejoró con la formulación de Big CHAP (CALBIOCHEM7) en comparación
con la formulación de VPBS (Figura 10).
También se estudió la transferencia génica de
rAd portador del gen p53 (rAd-p53) (Wills y col.,
Human Gene Therapy 5: 1079-1088 (1994)) en este
modelo animal de cáncer de vejiga. Brevemente, se indujeron tumores
de vejiga en ratas Fisher hembras (Charles River) por adición de
un 0,05% de BBN
(N-butil-N-N(4-hidroxibutil)nitrosamina)
al agua de bebida durante tres meses; se formuló
rAd-p53 (1x10^{11} NP/ml) en Big CHAP 7 mM
(CALBIOCHEM7). Bajo anestesia con isoflurano, se insertó un
catéter (24G) en la vejiga con fines de administración y se instiló
rAd-p53 en la vejiga durante 45 minutos. Se dejó
entonces que los animales se recuperaran de la anestesia. A las 24
horas, se sacrificaron los animales y se fijó la vejiga en
formalina. Después de embeber en parafina y de seccionar, se
estudió la expresión de p53 por inmunohistoquímica usando el
p53ES-kit (Oncogene), utilizando AEC
(AEC-kit, Vector Labs) como substrato. Se hizo una
contratinción de los tejidos con hematoxilina. La Figura 12 muestra
expresión génica p53 en el área superficial del epitelio
proliferativo (panel de la izquierda) y tinción nuclear para la
expresión de p53 a mayor aumento (panel de la derecha). No se
detectó tinción en tejido tumoral de animales no tratados.
\vskip1.000000\baselineskip
Para simular los volúmenes esperados para
investigación clínica, se estudió la formulación Big CHAP 7 mM
(CALBIOCHEM7) en un modelo de cerdo adulto crónicamente
cateterizado en colaboración con SPRI Drug Safety and Metabolism;
se formuló rad-\betagal (1x10^{11} NP/ml) en
VPBS o en Big CHAP 7 mM (CALBIOCHEM7). Se inyectó un volumen de 50
ml mediante el catéter en la vejiga de los animales conscientes. Se
retuvo el material instilado durante 2 h. Los animales fueron
sacrificados 48 h después y se recogió una sección central de la
vejiga y se tiñó para la expresión de
\beta-galactosidasa. Se observó un aumento en la
intensidad de la expresión génica en el cerdo tratado con Big CHAP
7 mM (CALBIOCHEM7) en comparación con el cerdo tratado con VPBS
(Figura 11). La evaluación histológica demostró transducción de
varias capas epiteliales usando Big CHAP (CALBIOCHEM7) (panel de la
izquierda), pero sólo transducción superficial con el tampón VPBS
(panel de la derecha).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó una ligera modificación del método de
Sandberg y col. (Human Gene Therapy 5: 323-329
(1994)) para preparar segmentos de íleon de rata para los estudios
de transferencia génica. Brevemente, se anestesiaron ratas
Sprague-Dawley hembras con isoflurano. Se abrió la
cavidad abdominal y se aisló un segmento de íleon rostral con
respecto a la última placa de Peyer. Se limpió cuidadosamente el
segmento (aproximadamente 3 cm) de restos de alimentos y se
cerraron ambos lados con clamps vasculares atraumáticos. Se inyectó
rAd-\betagal (1x10^{11} NP/ml), en un volumen
de 0,5 ml, directamente en el segmento con una aguja 24 G y se dejó
incubar durante 45 minutos. Se formuló
rAd-\betagal en ácido taurodesoxicólico 10 mM (en
agua destilada, esterilizado por filtración) (Grupo de tratamiento
1) o VPBS (Grupo de tratamiento 2). Un tercer grupo de tratamiento
consistía en animales tratados con ácido taurodesoxicólico 10 mM. A
continuación, se retiraron los clamps y se ancló una sutura de seda
laxa en ambos lados para el reconocimiento en el momento de la
necropsia. Se cerró la incisión abdominal y se dejó que los
animales se recuperaran en sus jaulas. Los animales fueron
sacrificados 48 h después. Se recogieron el segmento infectado y un
segmento control en fijador para la tinción de órgano entero con
Xgal.
Los resultados están mostrados en la Figura 13.
El grado de tinción azul con Xgal demostró evidencia de expresión
transgénica en las secciones ileales. Era evidente una mayor
transferencia génica en la formulación de detergente (panel
medio).
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudiaron fuentes comerciales alternativas
de Big CHAP (BC) en cuanto a su capacidad para potenciar la
transferencia y expresión génicas mediadas por rAd (adenovirus
recombinante), esencialmente según el método antes descrito en el
Ejemplo 8. Se determinó que el BC más "puro" - Sigma (98%
puro; Sigma Catalog: Biochemicals y Reagents for Life Science
Research, 1997, página 182, #B 9518), a una concentración de 6
mg/ml, no mejoraba marcadamente la transferencia génica mediada por
rAd (Figura 14, fila superior). Por el contrario, el BC
(CALBIOCHEM7; CALBIOCHEM7 Biochemical & Immunochemical Catalog
1996/97, página 43, #200965, 95% puro), sí aumentaba
substancialmente la transferencia y expresión génicas a la misma
concentración (Figura 14, fila inferior).
Los BC de CALBIOCHEM7 y Sigma fueron además
analizados por TLC y purificados por cromatografía en columna. Se
estudiaron el BC purificado y las impurezas aisladas en cuanto a su
capacidad para potenciar la transferencia y expresión génicas
mediadas por rAd en el epitelio de la vejiga.
Como se discute más adelante con más detalle,
se aislaron tres impurezas de BC. Dos de las impurezas demostraron
mejorar la transferencia y expresión génicas mediadas por rAd.
Además del BC comercial, se prefieren ambas impurezas para el
tampón de la formulación de rAd con objeto de mejorar la
administración génica local.
Se disolvió BC (Sigma o CALBIOCHEM7) en
metanol/agua, 3/1 y se realizó una TLC en Silica gel 60, 0,25 mm
(EM Industries); la fase móvil consistía en:
1-butanol/agua/ácido acético glacial, 6/2,5/1,5. Se
visualizaron los cromatogramas con O,S g de timol en ácido
sulfúrico/etanol, 5/95, y calor. Como se muestra en la Figura 15,
sólo se desarrolló una banda definida de la muestra de BC - Sigma
(B), mientras que se hicieron evidentes tres bandas adicionales en
la muestra de BC-CALBIOCHEM7 (A).
Se aislaron además las impurezas de BC
(CALBIOCHEM7) por cromatografía en columna y se analizaron por
cromatografía en capa fina (Silica Gel 60) usando una fase móvil de
cloroformo/metanol/agua, 6/5/1. Los resultados están representados
en la Figura 16. (Banda 1: BC (CALBIOCHEM7); Banda 2: Impureza I;
Banda 3: Impureza II; Banda 4: Mezcla de Impurezas II y III; Banda
5: Impureza III; Banda 6: BC (CALBIOCHEM7) puro; Banda 7: BC
(CALBIOCHEM7).
Para estudiar las impurezas de BC en cuanto a
la potenciación de la transferencia génica, se formuló
rAd-\betagal (1x10'' NP/ml) en concentraciones
crecientes de BC (Sigma) y se estudió en animales como se ha
descrito anteriormente. Los resultados están representados en la
Figura 17. Una mayor concentración, es decir, 20 mg/ml, del BC de
Sigma mejoró la expresión génica epitelial (panel superior y
medio). Comparativamente, se indujo una expresión génica similar
mediante BC (CALBIOCHEM7) a una concentración menor (6 mg/ml,
Figura 17, panel inferior).
Se formuló rAd-\betagal en 30
mg/ml del material purificado por cromatografía en columna de ambos
BC y se estudió la transferencia génica al epitelio vesical como se
ha descrito anteriormente. A una concentración de 30 mg/ml, la
transferencia y expresión génicas estaban sólo ligeramente
aumentadas en la muestra de CALBIOCHEM7 (Figura 18, panel superior,
derecha). El BC de Sigma purificado no tenía ningún efecto (Figura
18, panel inferior, izquierda). La purificación de ambos BC (Sigma
o CALBIOCHEM7) dio lugar a una menor transferencia y expresión
génicas.
Se detectaron tres impurezas de BC (CALBIOCHEM7)
por TLC (Figura 15) y se aislaron por cromatografía en columna
para los estudios de transferencia génica. Se diluyeron la Impureza
I y una mezcla de Impureza II e Impureza III en VPBS (0,6 mg/ml o 6
mg/ml) para estudiar su eficiencia en la mejora de la transferencia
génica mediada por rAd al epitelio vesical. La Impureza I no dio
lugar a una mayor expresión génica de la
\beta-galactosidasa en el epitelio vesical, sino
que más bien causó cistitis (Figura 19, panel inferior, derecha).
En marcado contraste, la mezcla de Impurezas II y III potenció la
transferencia y expresión génicas de un modo dependiente de dosis
(Figura 19, panel inferior, izquierda). Se usaron una formulación
de control positivo (BC, CALBIOCHEM7, panel superior, izquierda) y
las formulaciones de control negativo
(BC-CALBIOCHEM7, purificado por cromatografía en
columna, y BC-Sigma) a una concentración de 6 mg/ml
(panel superior, derecha).
En este experimento, se reconstituyeron 10
mg/ml de BC (Sigma, Figura 20, panel superior medio) con la
Impureza III (panel superior derecho), la Impureza II (panel
inferior izquierdo) o el análogo sintetizado de la Impureza III
(panel inferior derecho). Se preparó rAd-\betagal,
1x10^{11} NP/ml, en las formulaciones contaminadas y se
administró intravesicalmente como se ha descrito anteriormente. Tal
como se muestra en la Figura 20, se observó una mejor expresión del
gen indicador (\beta-galactosidasa) en el
epitelio vesical de los animales que recibieron rAd disuelto en las
formulaciones de BC (Sigma) contaminadas a una concentración de 10
mg/ml de Big CHAP (Sigma).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añade
glucono-\delta-lactona (0,1 mol,
17,8 g) en pequeñas porciones a una solución de 0,1 mol (13,1 g)
de iminobispropilamina en 400 ml de metanol absoluto a reflujo.
Después de someter a reflujo durante 2 horas, se deja que la
solución se enfríe sobre hielo durante 1 hora. Se evapora el
solvente a sequedad.
Se añade trietilamina (0,2 mol, 28 ml) a una
solución de 0,2 mol (81,6 g) de ácido cólico disuelto en 500 ml de
DMF seca en un matraz de 1 litro. Se enfría la solución a 0ºC en un
baño de hielo-sal, después de lo cual se añaden 0,2
mol (20 g) de cloroformiato de isobutilo. Se deja reposar a la
mezcla en el baño de hielo-sal durante 5 min,
después de lo cual el precipitado de clorhidrato de trietilamina
resulta visible. La reacción da un anhídrido mixto
intermediario.
En un matraz independiente de 2 litros, se
disuelve 0,1 mol (30,9 g) de
3'-N-gluconamidopropil-3''-N-colamidopropil-N-colamida
en 500 ml de DMF con calentamiento suave a
40-60ºC. Se enfría esta solución rápidamente en un
baño de hielo-sal justo hasta que se produce
turbidez, a aproximadamente 10ºC. Se filtra el anhídrido mixto
intermediario a la solución de
3'-N-gluconamidopropil-3''-N-colamidopropil-N-colamida
en DMF. Se elimina el precipitado de clorhidrato de trietilamina
por filtración. A continuación, se agita la solución con
enfriamiento durante 24 horas. Se elimina la DMF por evaporación a
vacío y calor y se somete la mezcla bruta a cromatografía en
columna de gel de sílice con cloroformo/metanol/agua, 65/5/1, como
fase móvil. Se recogen las fracciones puras y se evapora el
solvente a vacío. La reacción da aproximadamente 27 g (25%) de
producto.
El análisis de espectro de masas del producto
dio los siguientes picos: 337,2, 394,2, 412,2, 503,8, 682,4, 700,5,
755,1, 801,1, 823,1, 912,3, 1054,8, 1074,7, 1090,6, 1112,4,
1119,3.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha demostrado en el Ejemplo 11, las
impurezas presentes en Big CHAP funcionan potenciando la
transferencia génica. Este Ejemplo describe una mayor
caracterización y síntesis de estos compuestos.
Se fraccionó el Big CHAP de Calbiochem por
cromatografía en columna para obtener impurezas esencialmente puras
"1", "2" y "3" para las pruebas biológicas, así como
para el análisis estructural. No se estudió la Impureza 1 en cuanto
a la actividad biológica debido a la irritación de la vejiga que se
observó en los experimentos iniciales. Como las Impurezas 2 y 3 no
eran muy solubles en agua, se las mezcló con 6 mg/ml de Big CHAP de
Sigma a niveles de 0,12 y 1,2 mg/ml y se vio que potenciaban la
transferencia génica (el Big CHAP de Sigma por sí solo a 6 mg/ml no
potencia la transferencia génica).
Las estructuras de las Impurezas 1, 2 y 3
fueron determinadas por MALDI-MS y análisis de RMN.
La Figura 22 muestra la estructura y los espectros de
MALDI-MS y ^{1}H-RMN de la
Impureza 1. En la Figura 23 se muestran la estructura y los
espectros de MALDI-MS y ^{1}H-RMN
de la Impureza 2 y en la Figura 24 los de la Impureza 3. La
comparación de los espectros con los de Big CHAP demuestra que las
impurezas surgieron del proceso usado para sintetizar Big CHAP, más
que como productos de degradación de Big CHAP.
Se vio que el Big CHAP de Sigma bruto potenciaba
la transferencia génica cuando se usa a una concentración de 26
mg/ml. Para determinar si había presencia de niveles traza de
impurezas en el Big CHAP de Sigma, se aplicó 1 mg a una placa de
gel de sílice. Se observó una impureza que comigraba con la
Impureza 2 en el Big CHAP de Calbiochem. El
MALDI-MS y la RMN confirmaron que esta impureza
tenía la misma estructura que la Impureza 2 en el Big CHAP de
Calbiochem. Se fraccionaron varios gramos de Big CHAP de Sigma por
cromatografía instantánea en gel de sílice y se consolidaron,
concentraron y analizaron por TLC las fracciones que contenían
impurezas. Varias impurezas, incluyendo las Impurezas 2 y 3, eran
evidentes en esta fracción enriquecida en impurezas traza.
Se sintetizó la Impureza 2 como sigue (véase la
Figura 25). En primer lugar, se sintetizó el Compuesto III mostrado
en la Figura 25 disolviendo 1,78 g (10 mmol) de gluconolactona en
200 ml de metanol a reflujo y añadiendo 4,2 ml (30 mmol) de
N-(3-aminopropil)-1,3-propano-diamina.
Se continuó con el reflujo durante dos horas. Se evaporó entonces
el metanol en un evaporador rotatorio y se trituró el aceite
resultante con cloroformo hasta formarse un sólido blanco. Se
filtró el sólido blanco, se lavó con cloroformo y se secó por
succión para obtener 2,1 g de producto (Compuesto III impuro).
Se sintetizó el Compuesto IV disolviendo 0,65 g
(1,6 mmol) de ácido cólico en 40 ml de
N,N-dimetilformamida con calentamiento y agitación.
Se enfrió entonces la solución en un baño de hielo mientras se
mantenía la agitación. Se añadió luego trietilamina (0,223 ml (1,6
mmol)), seguido de 0,208 ml (1,6 mmol) de cloroformiato de
isobutilo. Se formó un precipitado blanco a medida que se
continuaba agitando durante diez minutos, permaneciendo el
Compuesto IV en solución.
Para sintetizar la Impureza 2 (Compuesto V en
la Figura 25), se disolvieron 0,5 g (1,6 mmol) de Compuesto III en
100 ml de sulfóxido de dimetilo por agitación a 55ºC. Se filtró la
suspensión que contenía el Compuesto IV a esta solución y se agitó
la solución resultante a temperatura ambiente durante la noche. El
intento de separación del sulfóxido de dimetilo del producto
(usando la mitad de la mezcla de reacción) por adición de agua y
extracción con cloruro de metileno o cloruro de metileno/metanol
resultó infructuoso. Se destiló la otra mitad de la mezcla de
reacción a vacío para eliminar la mayor parte del sulfóxido de
dimetilo. Se purificó el residuo por cromatografía instantánea en
gel de sílice usando metanol/cloroformo (40/60) como eluyente. El
análisis de las fracciones que eluyeron de la columna fue
realizado por cromatografía en capa fina en gel de sílice usando una
fase móvil consistente en clorofomo/metanol/agua (6/5/1) y
visualización por carbonización después de pulverizar con ácido
sulfúrico etanólico. Se consolidaron las fracciones que contenían
el producto más puro, se evaporaron a sequedad y se trituraron con
hexano para producir un sólido de color canela claro, que fue
filtrado y lavado con hexano. La ^{1}H-RMN y el
análisis espectrométrico de masas MALDI del producto eran
consistentes con la estructura mostrada.
La evaluación biológica de este compuesto se
vio algo obstaculizada por su falta de solubilidad en agua. Sin
embargo, incluso cuando el compuesto no se disolvía por completo la
transferencia génica a la vejiga resultó potenciada por el
compuesto incompletamente disuelto. La formulación de la Impureza 2
en Big CHAP, por ejemplo, sí dio como resultado una formulación
efectiva para potenciar la transferencia génica a las células.
Como la Impureza 3 es más polar, y por ello más
hidrosoluble, que la Impureza 2, se intentó la síntesis de este
compuesto. Se hizo reaccionar el Big CHAP purificado con el
anhídrido mixto del ácido cólico (formado por reacción de ácido
cólico con cloroformiato de isobutilo). La reacción dio un pobre
rendimiento y muchos productos, por lo que se sintetizó un análogo
de la Impureza 3. Se denominó a este análogo, que tiene una
polaridad similar a la de la Impureza 3, "Syn3".
Parte
1
En la Figura 26, se muestra el esquema sintético
para Syn3. Se sintetizó la lactona del ácido lactobiónico (II)
disolviendo 1 g (2,8 mmol) de ácido lactobiónico (I) en 50 ml de
metanol, evaporando a sequedad en un evaporador rotatorio y
repitiendo este procedimiento seis veces. Para obtener el Compuesto
III. Se disolvió el residuo resultante (II) en 50 ml de isopropanol
por calentamiento hasta 50ºC. Se añadieron a esta solución 1,2 ml
(8,4 mmol) de
N-(3-aminopropil)-1,3-propanodiamina.
Se aumentó la temperatura hasta 100ºC y se agitó la solución
durante tres horas. Se eliminó el solvente por evaporación
rotatoria y se lavó el residuo resultante varias veces con
cloroformo para eliminar el exceso de
N-(3-aminopropil)-1,3-propanodiamina
no reaccionada. Se usó el residuo restante (III) como en la Parte
3 más adelante.
Parte
2
Se sintetizó el Compuesto IV disolviendo 2,28 g
de ácido cólico (5,6 mmol) en N,N-dimetilformamida
por calentamiento hasta 60ºC. Se añadió trietilamina (0,78 ml (5,6
mmol)) y se enfrió la solución en un baño de hielo. Se añadió
entonces cloroformiato de isobutilo (0,73 ml (5,6 mmol)) y se formó
un precipitado blanco a medida que se continuaba agitando durante
diez minutos.
Parte
3
Se disolvió el Compuesto III en
N,N-dimetil-formamida, se enfrió en
un baño de hielo y se agitó. Se filtró la suspensión resultante de
la síntesis del Compuesto IV a la solución que contenía el
Compuesto III. Se agitó la solución resultante a temperatura
ambiente durante 6 h. Se eliminó el solvente usando evaporación
rotatoria de alto vacío y se disolvió el residuo en 100 ml de
cloroformo/metanol (50/50). Se purificaron 25 ml de esta solución
por cromatografía instantánea en gel de sílice usando
cloroformo/metanol (60/40) como solvente de elución. El análisis de
las fracciones que eluyeron de la columna fue realizado por
cromatografía en capa fina de gel de sílice usando una fase móvil
consistente en cloroformo/metanol/agua/hidróxido de amonio
concentrado (100/80/10/5). Se visualizaron los compuestos por
carbonización tras pulverización con ácido sulfúrico etanólico. Se
consolidaron las fracciones que contenían producto y se volvieron a
purificar usando cromatografía instantánea y
cloroformo/metanol/agua/hidróxido de amonio concentrado
(100/80/10/5) como solvente de elución. Se consolidaron las
fracciones que contenían producto y se evaporaron a un polvo blanco
(300 mg de Compuesto V). La ^{1}H-RMN y el
análisis de espectrometría de masas MALDI del producto eran
consistentes con la estructura mostrada.
Syn3 formó un gel cuando se intentó la
disolución a 10 mg/ml en agua y parecía formar vesículas a 1
mg/ml. sin embargo, a 1 mg/ml en Tween 80 al 0,1% se produjo una
solución transparente de Syn3. Se vio que esta formulación
potenciaba la transferencia génica. El Tween 80 por sí solo, cuando
se estudió, no tuvo efecto sobre la transferencia génica.
El Big CHAP purificado contaminado con las
Impurezas 2 ó 3 es un potenciador efectivo de la transferencia
génica. La Impureza sintética 2 sola y un análogo sintético de la
Impureza 3 (Syn3) solo pueden potenciar la transferencia génica.
Por lo tanto, no se requiere una relación sinérgica entre Big CHAP
y las impurezas para la potenciación de la transferencia génica.
Big CHAP es altamente hidrosoluble y es efectivo para disolver las
impurezas y sus análogos, probablemente como micelas mixtas,
sirviendo así como vehículo para las impurezas y/o análogos
activos.
Mientras que la Impureza 2 es efectiva en la
potenciación de la transferencia génica, ésta tiene una solubilidad
limitada en soluciones acuosas, aunque es útil cuando se formula en
un agente solubilizador adecuado, tal como Big CHAP. Contrariamente
a la Impureza 2, Syn3 se solubiliza fácilmente a, por ejemplo, 1
mg/ml en Tween 80 al 0,1% y otras soluciones acuosas como aquí se
describe. Así, este compuesto es particularmente útil como agente
potenciador de la transferencia génica.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo demuestra que el análogo Syn3 de
la Impureza 3 es efectivo en la potenciación de la transferencia
génica a la vejiga.
Las pruebas iniciales de Syn3 indicaron que
éste no es altamente soluble en solución salina tamponada o en
dH_{2}O. Sin embargo, se vio que Syn3 se disolvía con bastante
facilidad en el detergente Big CHAP, así como en el detergente
Tween-80 (aunque con algo más de dificultad en
comparación con la disolución en Big CHAP). Cuanto mayor era la
concentración de la solución de Big CHAP usada para la disolución,
mayor era la cantidad de Syn3 que podía disolverse. Se vio que se
disolvían hasta 5 mg/ml de Syn3 en Big CHAP 15 mM.
Para los siguientes estudios que utilizaban
Syn3 en Tween-80, se preparó una solución de 100
mg/ml de Syn3 en Tween-80 al 10%. Se diluyó esta
solución madre en dH_{2}O (1:100) para obtener una concentración
final de 1 mg/ml de Syn3 en Tween-80 al 0,1%.
La Tabla II resume las concentraciones de Syn3
que se escogieron para las pruebas in vivo:
Se estudió la actividad de transferencia génica
de Syn3 in vivo determinando el nivel de expresión de
\beta-galactosidasa encontrado tras la
administración de adenovirus que contenía el gen de la
\beta-galactosidasa suministrado en una de las
soluciones detergentes anteriores. En este procedimiento, se
cateterizaron ratas Sprague-Dawley Harlan hembras y
se les administró adenovirus diluido a 1:10 en Big CHAP o en
Tween-80 que contenía Syn3 a una de las
concentraciones anteriores durante 45 minutos. Después de la
eliminación del virus y de la perfusión de la vejiga, se dejó que
los animales se recuperaran. A las 48 horas, los animales fueron
sacrificados y sus vejigas fueron fijadas y teñidas para la
expresión de \beta-gal. Tras los registros
fotográficos, se embebieron las vejigas en parafina para su
seccionamiento y examen histológico.
Se estudió Syn3 a 0,5 mg/ml en Big CHAP 7,8 mM.
A esta concentración, se disolvió con relativa facilidad y
esterilizable por filtración (filtro de jeringa y acrodisco de 0,2
\Phim; Gelman Sciences). Los experimentos iniciales utilizaron
Big CHAP de Calbiochem, lote # B19546, mientras que los
experimentos posteriores utilizaron Big CHAP de Sigma, lote #
37HS023. Ningún stock de Big CHAP tiene actividad de transferencia
génica por sí solo a la concentración empleada. Como control
positivo, se utilizó el lote # 679793 de Calbiochem como
formulación para la administración de rAd. Se identificó que este
lote particular de Big CHAP contenía las impurezas activas, que
fueron identificadas y a partir de las cuales se modeló Syn3. Como
se ve en la Figura 27, Syn3 (I3A) resultó potenciar en gran medida
la transferencia génica y la expresión de
\beta-gal en comparación con la administración
del virus solo en Big CHAP 7,8 mM.
Para determinar si concentraciones inferiores
de Syn3 podrían resultar tan eficaces en la potenciación de la
transferencia génica como concentraciones superiores, se administró
Syn3 a 0,25 mg/ml en Big CHAP 3,9 mM (Figura 28A). Se obtuvieron
niveles muy altos de transferencia génica, pero no tan
consistentemente altos como lo observado con Syn3 a 0,5 mg/ml
(Figura 28B).
Las pruebas iniciales de I3A en
Tween-80 comenzaron usando I3A a 1 mg/ml en
Tween-80 al 0,4%. Sin embargo, apenas se obtuvo
transferencia génica cuando se usó esta concentración de Tween
(datos no mostrados). Como se hipotetizó que la alta concentración
de Tween-80 podría haber secuestrado el I3A para
impedir su reparto en la membrana y permitir la penetración vírica,
se redujo la concentración de Tween-80 al 0,1%,
manteniendo la concentración de I3A a 1 mg/ml. Se estudiaron dos
preparaciones diferentes de Syn3 en cuanto a su actividad de
transferencia génica a 1 mg/ml en Tween-80 al 0,1%.
A esta concentración, se observaron niveles muy altos de
transferencia génica cuando se usó el primer lote (I3A) (Figura
29A) o el segundo lote de Syn3 (Figura 29B). El segundo lote de
Syn3 había demostrado también niveles muy altos de actividad de
transferencia génica a 0,5 mg/ml en Big CHAP 7,8 mM, por lo que
todos los experimentos futuros fueron realizados usando Syn3 en
lugar de I3A.
La actividad de transferencia génica de Syn3 en
Big CHAP (0,5 mg/ml en 7,8 mM) fue comparada con su actividad en
Tween-80 (1 mg/ml en Tween-80 al
0,1%). Se vio que ambas formulaciones tenían niveles
aproximadamente iguales de potenciación de la transferencia génica,
observándose quizá una transferencia ligeramente mayor con el Syn3
en Big CHAP (Figura 30A y Figura 30C, respectivamente). Dado que el
ensayo de \beta-galactosidasa no es altamente
cuantitativo, son difíciles de discernir pequeñas diferencias. Sin
embargo, las vejigas tratadas con Syn3 a 0,5 mg/ml en Big CHAP 7,8
mM tenían consistentemente los niveles más altos de expresión de
\beta-galactosidasa. Syn3 aumenta la
transferencia génica en cualquiera de los detergentes, aunque no se
disuelve tan fácilmente en el Tween-80.
Como la concentración de Syn3 en Big CHAP era
el doble que en Tween, se estudió Syn3 a continuación en cuanto a
su actividad de transferencia génica a la misma concentración en
estos dos detergentes. A 0,5 mg/ml, Syn3 parecía dar una mejor
transferencia génica en Big CHAP 7,8 mM (Figura 31A) que lo que se
obtuvo usando Syn3 en Tween-80 al 0,05%. Cuando se
usó Syn3 a 0,5 mg/ml en Tween-80 al 0,05%, parecía
haber más regiones carentes de expresión de
\beta-galactosidasa, de forma similar a lo
observado cuando se redujo la concentración de Syn3/(I3A) a 0,25
mg/ml en Big CHAP 3,9 mM (Figura 28A). Esto sugiere que algunas de
las diferencias en la actividad de transferencia génica de Syn3 en
Big CHAP frente a Tween-80 son probablemente
debidas, en parte, a los efectos del detergente en el que se
disolvió Syn3.
Se prepararon las vejigas de los animales
tratados con Syn3-rAd (\beta-Gal)
para su examen histológico con objeto de determinar los niveles de
infección vírica, así como el grado de penetración vírica en el
urotelio vesical. La reducción de la concentración de Syn3 en
cualquiera de los detergentes dio lugar a una reducción
concomitante en la expresión de \beta-Gal (Figuras
32A-F). Aunque la expresión de la
\beta-galactosidasa resultante de la
administración de Syn3 a 0,5 mg/ml en Big CHAP 7,8 mM era
ligeramente mayor que con Tween-80 (Figura 32A
frente a Figura 32D), se observó que esta concentración de Syn3 da
lugar típicamente a un reclutamiento masivo de infiltrados en la
vejiga (Figura 32A).
Dado que la expresión de la
\beta-galactosidasa y el nivel de infiltrados
eran mayores en las vejigas en las que se usó Syn3 a 0,5 mg/ml en
Big CHAP que en las vejigas en las que Syn3 estaba a 1 mg/ml en
Tween-80, esto sugiere que la infiltración se debía
al aumento en la penetración y expresión del virus que se produce
cuando se administra rAd en el Big CHAP. Con objeto de discernir
la contribución que Syn3 puede tener en el reclutamiento de
infiltrados, se compararon secciones de vejigas que fueron
expuestas a Syn3 y virus con las que habían sido expuestas a Syn3
solo (Figura 33A y Figura 33B, respectivamente). Cuando se
administra Syn3 solo, se observa una cantidad significativa de
infiltración, sólo ligeramente menor que la observada con Syn3 y
virus conjuntamente. El virus administrado sin Syn3 dio lugar a
niveles extremadamente bajos de infección y de infiltrados (Figura
33C), mientras que el control negativo (sin virus, sin Syn3) no
muestra infiltración (Figura 33D).
Syn3 es muy estable cuando se disuelve en
detergente Big CHAP. Cuando se disolvió Syn3 en Big CHAP a 0,25
mg/ml o a 0,5 mg/ml, conservó su actividad de transferencia génica
durante períodos prolongados (30 días o más), incluso cuando se
guardó a temperatura ambiente. Cuando se disolvió Syn3 a 100 mg/ml
en Tween-80 al 10%, era estable durante al menos
una semana cuando se mantuvo a 4ºC. Sin embargo, si se deja a
temperatura ambiente a esta alta concentración (100 mg/ml), se
solidificará en 24 horas. El Syn3 que ha sido diluido a 1 mg/ml en
Tween-80 al 0,1% es estable durante al menos 30
días (período más largo estudiado).
La actividad de transferencia génica de Syn3
parece ser extremadamente alta a 0,5 mg/ml en Big CHAP 7,8 mM. Sin
embargo, se prefieren concentraciones inferiores de Syn3 (v.g.,
0,25 mg/ml en Big CHAP 3,9 mM) debido a la posibilidad de efectos
colaterales a concentraciones superiores. Syn3 ha demostrado
también niveles consistentemente altos de transferencia génica a 1
mg/ml en Tween-80 al 0,1%. En base a los resultados
de estos estudios, una formulación particularmente adecuada de
Syn3 para uso como agente de transferencia génica es a 1 mg/ml en
Tween-80 al 0,1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo proporciona, con fines
ilustrativos, un ejemplo de una formulación de Syn3 que resulta
adecuada para uso como formulación clínica para la administración
de un vector vírico. Esta formulación puede ser también usada para
otros compuestos potenciadores de la administración; otras muchas
formulaciones, tales como las aquí descritas, son también adecuadas
para uso con Syn3 y otros compuestos.
Se preparó una solución madre de Syn3
disolviendo Syn3 a 100 mg/ml en Tween 80 al 10%. Se diluyó entonces
esta solución madre hasta una concentración de Syn3 de 6 mg/ml
usando un tampón acuoso que contenía Tris (1,7 mg/ml), fosfato de
sodio (monosódico, dihidrato, 1,7 mg/ml), sacarosa (20 mg/ml),
cloruro de magnesio (hexahidrato. 0,4 mg/ml) y glicerol (100 mg/ml)
en agua.
Se diluyó esta solución con una solución que
contenía el vector vírico para obtener una solución de virus que
contenía 1 mg/ml de Syn3 en Tween 80 al 0,1%. Esta solución era
efectiva en la potenciación de la transferencia génica.
\vskip1.000000\baselineskip
Syn3 ha demostrado una elevada actividad
potenciadora de la transferencia génica in vivo, pero es
relativamente insoluble en soluciones acuosas y requiere la
presencia de detergente para su completa disolución. Además, Syn3
requiere varias horas para disolverse por completo en
Tween-80 al 10%, complicando aún más el uso clínico
de este reactivo. Para resolver estas dificultades, se sintetizaron
dos análogos de Syn3 que tienen mayor solubilidad en solución
acuosa. Eliminando el resto de lactosa de Syn3 y metilando o
reduciendo a continuación la amina resultante, se sintetizaron dos
nuevos compuestos que se conocen como A-cloruro de
trimetilamonio (A-tma) y
A-clorhidrato (A-HCl),
respectivamente, donde A representa la región conservada de Syn3
común a ambas moléculas (véase la Figura 21). Estos dos compuestos
catiónicos fueron además neutralizados a su sal cloruro para
facilidad de disolución.
Se sintetizó A-TMA como se
muestra en la Figura 35. Brevemente, se trató ácido cólico (CA)
(2,0 g, 5 mmol) en DMF (30 mL, 0ºC) con Et3N (0,72 mL, 5,1 mmol) y
luego, con cuidado, con cloroformiato de isobutilo (0,67 mL, 5,1
mmol). Se agitó la mezcla durante tres días y se obtuvo como
resultado un compuesto. Se purificó éste fácilmente sobre
SiO_{2}, eluyendo con DCM/MeOH (6:1 a 4:1). Después de 30 min. a
temperatura ambiente, se añadió una solución de la amina
(J-2/55) (522 mg, 2,26 mmol) en DMF (4 mL). Se
sintetizó la amina según Han, Y-P y Hang,
H-S, Bull. Korean Chem. Soc. (1994) 15:
1025-1027. Se obtuvieron 1,8 g del compuesto
resultante, J-2/5C (BOC-A), con un
resultado del 72% de rendimiento.
Se trató la amina (250 mg, 61/11, 0,27 mmol) en
DMF (10 mL) con base de Hungs (diisopropiletilamina) (200 \muL,
1,15 mmol) y Mel (75 \muL, 1,2 mmol). La TLC mostró
principalmente un compuesto, más unas cuantas impurezas. Se
concentró la mezcla de reacción a vacío y se aplicó a una columna
de sílice eluida con MeCN/ACOH/H_{2}O) (4:1:1). Se combinaron las
fracciones medias y se sometieron a cromatografía de intercambio
iónico en la forma Na^{+} de una resina de intercambio catiónico
Dowex 50W-X8-200, eluida con NaCl
0,5 M/MeOH 1:1. Se desalaron las fracciones más puras en Sephadex
lipofílico LH-20 y se liofilizaron para obtener el
cloruro de trimetilamonio puro (J-2/90
(A-tma)). Se obtuvieron 82 mg del compuesto
resultante, con un rendimiento del 32%.
Para obtener A-HCl, se trató
BOC-A (1,0 g, 1 mmol) en MeOH (60 mL) con una
solución de AcCl en MeOH (2 mL en 20 mL) a 0ºC. Se dejó que la
reacción alcanzara lentamente la temperatura ambiente. La TLC
después de 3 h no mostró material de partida. Tras la evaporación
(con EtOH/tolueno), se aplicó el residuo a la forma Na+ de una
columna de intercambio iónico Dowex
50W-X8-300. Sin embargo, el
producto pasó directamente a su través. La elución con NaCl 0,5 M
no produjo ningún otro material. La cromatografía instantánea en
SiO_{2} tuvo éxito (DCM/MeOH/H_{2}O; 60:35:5), aunque el
producto parecía eluir en dos bandas. La RMN mostró que las
fracciones tardía y precoz eran las mismas. Se obtuvieron 650 mg
del compuesto resultante, A-HCl, con un rendimiento
del 65%. Se observó que el tratamiento con base (-Ome o resina)
puede cambiar el comportamiento de TLC del producto.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo demuestra que los compuestos
A-tma y A-HCl tienen actividad de
transferencia génica in vivo.
Se eligió una concentración de 1 mg/ml para las
pruebas iniciales de ambos compuestos. Para la determinación de la
actividad de transferencia génica para cada uno de estos
compuestos, se comparó el nivel de actividad
\beta-galactosidasa obtenido tras la
administración de análogo de Syn3/virus/tampón con la actividad
cuando se usan solos el virus/tampón.
Se preparó la solución de A-TMA
por disolución de 10 mg de A-TMA en 10 ml de PBS de
Dulbecco. Se añadió glicerol para obtener una concentración final
de 10 mg/ml. Todas las soluciones fueron esterilizadas por
filtración antes de su uso (filtro de jeringa y acrodisco 0,2
\Phim). Se diluyó el virus (BGCG 70AAB) a 1:10 en esta solución
de A-TMA o en PBS de
Dulbecco-glicerol antes de su administración.
Como A-HCl no es completamente
soluble en solución salina, y como la disolución en dH_{2}O daba
lugar a una solución cuyo pH era de 4,7, se escogió una solución
tamponada con Tris para la disolución de A-HCl cuya
composición era la siguiente:
- Tampón de disolución (Tampón D)
- Tris 2,8 mM, pH 7,5
- NaH_{2}PO_{4} 1,2 mM
- MgCl_{2} 2 mM
- Sacarosa al 0,2%
- 10 mg/ml de glicerol
- pH final 6,5
Se disolvieron 10 mg de A-HCl en
este tampón y se esterilizaron por filtración antes de su uso
(filtro de jeringa y acrodisco de 0,2 \mum). Se diluyó el virus
(BGCG 70AAB) a 1:10 en esta solución antes de su administración.
Con fines comparativos, también se estudió el virus diluido en este
tampón sin A-HCl.
Se anestesiaron ratas HSD hembras usando
isofluorano. Se cateterizaron las ratas transureteralmente al
interior de la vejiga usando un tubo de PE50 lubricado con gelatina
K-Y. Se colocó una ligadura sobre la uretra externa
pera evitar el flujo retrógrado. Se extrajo la orina, de haberla, y
se perfundió la vejiga con 0,5 ml de PBS y se vació, se diluyó el
rAd a la concentración deseada (1:10) y se instiló durante 45
minutos. Se retiró el material de la dosificación, observando el
volumen de retorno. Se perfundió la vejiga con 0,5 ml de PBS y se
vació. Se retiraron la ligadura y el catéter y se dejó que los
animales se recuperaran en jaulas.
Después de 48 horas, los animales fueron
sacrificados y se fijaron sus vejigas por inflamiento con 0,5 ml
de fijador durante 1 hora. Se aclararon entonces las vejigas
durante la noche y se realizó una tinción con X-gal
de la totalidad del órgano.
Los dos compuestos dieron una potenciación de la
actividad de transferencia génica en comparación con los controles.
Los niveles de actividad de transferencia génica están resumidos en
la Tabla III. Se muestran los niveles relativos de actividad de
transferencia génica; los niveles más altos de actividad de
transferencia génica están indicados mediante "++++" y los
niveles bajos están indicados mediante "+" (la ausencia de
actividad de transferencia está indicada mediante 0).
Los dos compuestos A-tma y
A-HCl demostraron actividad de transferencia génica
significativamente por encima de los niveles obtenidos por los
controles. Aunque estos niveles son inferiores a los obtenidos
usando Syn3 en Tween-80, ciertamente indican que la
potenciación de la transferencia génica es posible usando un agente
potenciador de la transfección de base acuosa tal como
A-tma y A-HCl. El compuesto
A-SC, en el que el resto de lactosa de Syn3 está
substituido con un resto de anhídrido succínico, no era efectivo
como compuesto potenciador de la transferencia génica. Este
compuesto dio actividad de transferencia génica a niveles iguales a
los controles (datos no mostrados). La Tabla IV resume los
resultados de transferencia génica usando estos compuestos en
comparación con la actividad de transferencia génica de Syn3 a 1
mg/ml.
Dado que ambos compuestos han resultado tener
una solubilidad mucho mayor en dH_{2}O (hasta 5 mg/ml), es
probable que el aumento de la concentración de estos análogos dé
lugar a una actividad incluso mayor de transferencia génica in
vivo.
Claims (74)
1. Un compuesto potenciador de la administración
de Fórmula I que tiene la siguiente estructura:
donde:
m y n son iguales o diferentes y cada uno es un
número entero de 2 a 8; N-R tomados juntos forman un
grupo trimetilamonio o un grupo amonio, o R es
X_{1} es seleccionado dentro del grupo
consistente en:
y X_{2} y X_{3} son cada uno
independientemente seleccionados entre el grupo consistente en un
grupo
sacárido,
donde al menos uno de X_{2} y
X_{3} es un grupo sacárido cuando R
es
2. El compuesto de la reivindicación 1, donde
el grupo sacárido incluye uno o más residuos de pentosa o
hexosa.
3. El compuesto de la reivindicación 2, donde
el grupo sacárido es seleccionado dentro del grupo consistente en
grupos monosacáridos pentosa, grupos monosacáridos hexosa, grupos
disacáridos pentosa-pentosa, grupos disacáridos
hexosa-hexosa, grupos disacáridos
pentosa-hexosa y grupos disacáridos
hexosa-pentosa.
4. El compuesto de la reivindicación 3, donde
el grupo sacárido es un grupo pentosa-hexosa.
5. El compuesto de la reivindicación 3, donde
el grupo sacárido es un grupo hexosa-pentosa.
6. El compuesto de la reivindicación 3, donde
el grupo sacárido es un grupo disacárido
hexosa-hexosa.
7. El compuesto de la reivindicación 1, donde
el grupo sacárido comprende entre tres y ocho residuos de
monosacáridos.
8. El compuesto de la reivindicación 7, donde
el grupo sacárido es un trisacárido.
9. El compuesto de la reivindicación 1, donde
al menos uno de X_{2} y X_{3} es un grupo sacárido.
10. El compuesto de la reivindicación 1, donde
m y n son cada uno independientemente 2 ó 3.
11. El compuesto de la reivindicación 1, donde
X_{1} y X_{2} son ambos
y X_{3} es un grupo
sacárido.
\vskip1.000000\baselineskip
12. El compuesto de la reivindicación 1, donde
m y n son cada uno 3, X_{1} y X_{2} son ambos
y X_{3} es un grupo monosacárido
hexosa.
\vskip1.000000\baselineskip
13. El compuesto de la reivindicación 1, donde
m y n son cada uno 3, X_{1} y X_{3} son ambos
y X_{2} es un grupo monosacárido
hexosa.
\newpage
14. El compuesto de la reivindicación 1, donde
m y n son cada uno 3, X_{1} y X_{2} son ambos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y X_{3} es un grupo disacárido
hexosa-hexosa.
\vskip1.000000\baselineskip
15. El compuesto de la reivindicación 1, donde
m y n son cada uno 3, X_{1} y X_{3} son ambos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y X_{2} es un grupo disacárido
hexosa-hexosa.
\vskip1.000000\baselineskip
16. El compuesto de la reivindicación 1, donde
el compuesto es un compuesto de Fórmula III que tiene la siguiente
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
17. El compuesto de la reivindicación 1, donde
el compuesto es un compuesto de Fórmula IV que tiene la siguiente
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
18. El compuesto de la reivindicación 1, donde
el compuesto es un compuesto de Fórmula V que tiene la siguiente
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
19. El compuesto de la reivindicación 1, donde
m y n son cada uno 3, X_{1} y X_{2} son seleccionados entre el
grupo consistente en
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y X_{3} es un grupo
sacárido.
\newpage
20. El compuesto de la reivindicación 19, donde
tanto X_{1} como X_{2} son
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y X_{3} es un grupo
glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Una composición para administración de un
agente a las células, cuya composición contiene el agente y un
compuesto potenciador de la administración según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20.
22. La composición según la reivindicación 21,
donde la concentración del compuesto potenciador de la
administración es de 0,002 a 2 mg/ml.
23. La composición según la reivindicación 22,
donde la concentración del compuesto potenciador de la
administración es de 0,02 a 2 mg/ml.
24. La composición según la reivindicación 23,
donde la concentración del compuesto potenciador de la
administración es de 0,2 a 2 mg/ml.
25. La composición según la reivindicación 24,
donde la concentración del compuesto potenciador de la
administración es de 0,1 a 1 mg/ml.
26. La composición según la reivindicación 21 a
25, donde la composición incluye además una matriz polimérica.
27. La composición según la reivindicación 21 a
26, donde la composición incluye además un mucoadhesivo.
28. La composición según la reivindicación 21 a
27, donde la composición incluye además un tampón.
29. La composición según la reivindicación 21 a
28, donde el agente es un modulador de un proceso biológico en una
célula cuando el agente está presente en la célula.
30. La composición según la reivindicación 29,
donde el proceso biológico es seleccionado dentro del grupo
consistente en el crecimiento, la diferenciación y la proliferación
celular, una ruta metabólica o biosintética, la expresión génica,
un proceso asociado a enfermedad y una respuesta inmune.
31. La composición según la reivindicación 30,
donde la proliferación es un trastorno neoplásico.
32. La composición según la reivindicación 31,
donde el trastorno neoplásico es el cáncer.
33. La composición según la reivindicación 21 a
32, donde el agente incluye un polinucleótido.
34. La composición según la reivindicación 33,
donde el polinucleótido es seleccionado dentro del grupo
consistente en un ácido nucleico antisentido, un ácido nucleico
formador de triplex y un ácido nucleico que comprende un gen que
codifica un polipéptido.
35. La composición según la reivindicación 34,
donde el gen es un gen terapéutico.
36. La composición según la reivindicación 35,
donde el gen es un gen supresor tumoral.
37. La composición según la reivindicación 36,
donde el gen supresor tumoral es un gen p53.
38. La composición según la reivindicación 36,
donde el gen supresor tumoral es un gen de retinoblastoma.
39. La composición según la reivindicación 38,
donde el gen supresor tumoral del retinoblastoma codifica la
proteína RB de longitud completa.
40. La composición según la reivindicación 38,
donde el gen supresor tumoral del retinoblastoma codifica
p56RB.
41. La composición según la reivindicación 35,
donde el gen codifica una citokina.
42. La composición según la reivindicación 41,
donde la citokina es un interferón.
43. La composición según la reivindicación 42,
donde el interferón es un miembro del grupo seleccionado entre
\alpha-interferón,
\beta-interferón,
\delta-interferón y
\gamma-interferón.
44. La composición según la reivindicación 43,
donde el interferón es el \alpha-interferón.
45. La composición según la reivindicación 35,
donde el gen codifica una interleukina.
46. La composición según la reivindicación 45,
donde el gen que codifica una interleukina es seleccionado dentro
del grupo consistente en IL-1, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-7 e
IL-10.
47. La composición según la reivindicación 35,
donde el gen codifica un factor estimulante de colonias.
48. La composición según la reivindicación 35,
donde el gen es un gen suicida.
49. La composición según la reivindicación 21 a
32, donde el agente es una proteína, en particular una proteína
terapéutica.
50. La composición según la reivindicación 34 a
48, donde el gen es incorporado en un vector.
51. La composición según la reivindicación 50,
donde el vector es un vector vírico recombinante.
52. La composición según la reivindicación 51,
donde el vector vírico recombinante es seleccionado dentro del
grupo consistente en un vector vírico herpes, un vector
retrovírico, un vector vírico vaccinia, un vector vírico
adenoasociado y un vector adenovírico.
53. La composición según la reivindicación 52,
donde el vector vírico recombinante es un vector adenovírico.
54. La composición según la reivindicación 53,
donde el vector adenovírico tiene una deleción del gen de la
proteína IX.
55. La composición según la reivindicación 54,
donde el vector adenovírico incluye un promotor de CMV.
56. La composición según la reivindicación 50 a
55, donde el vector vírico es formulado como una suspensión que
contiene de 1x10^{8} partículas/ml a 5x10^{11} partículas/ml
del vector vírico.
57. La composición según la reivindicación 56,
donde la suspensión contiene de 1x10^{9} partículas/ml a
1x10^{11} partículas/ml del vector vírico.
58. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 57, donde el compuesto potenciador de la
administración es un compuesto de fórmula III:
59. Uso de un compuesto potenciador de la
administración según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 en
la fabricación de una composición para potenciar la administración
in vivo o ex vivo de un agente terapéutico a las
células de un sujeto que lo necesite.
60. El uso de la reivindicación 59, donde la
composición es capaz de aumentar in vivo la cantidad del
agente terapéutico suministrada a las células en relación a la
cantidad del agente terapéutico que se suministraría a las células
cuando el agente terapéutico es administrado en ausencia del
compuesto potenciador de la administración.
61. El uso de la reivindicación 59 ó 60, donde
la concentración del compuesto potenciador de la administración en
la composición es como se indica en las reivindicaciones 22 a
25.
62. El uso de la reivindicación 59 a 61, donde
el agente terapéutico es un agente indicado en las reivindicaciones
29 a 57.
63. El uso de la reivindicación 59 a 62, donde
la composición es formulada para administración intravesical.
64. El uso de la reivindicación 63, donde la
composición es formulada para administración intravesical a la
vejiga.
65. El uso de la reivindicación 59 a 64, donde
la composición es para el tratamiento del carcinoma de vejiga.
66. El uso de la reivindicación 59 a 65, donde
las células son células cancerosas.
67. El uso de la reivindicación 66, donde las
células cancerosas son células de cáncer de vejiga.
68. El uso de la reivindicación 59 a 67, donde
el compuesto potenciador de la administración está coformulado con
el agente en la composición.
69. El uso de la reivindicación 59 a 67, donde
la composición no contiene el agente.
70. El uso de la reivindicación 59 a 69, donde
el compuesto potenciador de la administración es un compuesto de
fórmula III:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
71. Uso de un compuesto potenciador de la
administración según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y
de un agente terapéutico en la fabricación de un medicamento para
potenciar la administración in vivo o ex vivo del
agente terapéutico a las células de un sujeto que lo necesite.
\newpage
72. El uso de la reivindicación 71, donde el
compuesto potenciador de la administración es un compuesto de
fórmula III:
73. Un método de suministro de un agente a las
células in vitro, cuyo método consiste en administrar el
agente a las células en una composición que contiene un compuesto
potenciador de la administración según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20.
74. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20 para potenciar la administración de un
agente terapéutico a una célula para tratar el cáncer.
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