ES2327914T3 - Metodo para pronosticar la sensibilidad al tratamiento con ravastigmina basado en el genotipo apoe de pacintes con demencia. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para determinar la sensibilidad de un individuo con demencia al tratamiento con Rivastigmina que comprende: a) determinar, para cada una de las dos copias del gen ApoE presente en el individuo, la naturaleza del genotipo ApoE, en donde b) si una o ambas de las dos copias del gen ApoE presente en el individuo contiene el alelo gamma4, entonces el paciente se debería colocar en un grupo de pacientes de respuesta buena; o c) si ninguna de las dos copias del gen ApoE de los pacientes contiene el alelo gamma4, entonces el paciente se coloca en un grupo de pacientes de respuesta pobre.
Description
Método para pronosticar la sensibilidad al
tratamiento con rivastigmina basado en el genotipo ApoE de pacientes
con demencia.
La presente invención pertenece al campo de la
farmacología y la medicina.
En particular, esta invención se relaciona con
el uso de análisis genómico para determinar la sensibilidad de
pacientes con demencia al tratamiento con inhibidores de la
colinesterasa (ChEls).
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La demencia es un grupo heterogéneo y
multi-causal de estados de enfermedad caracterizados
por el desarrollo de déficits cognitivos múltiples, que incluyen
deterioro de la memoria y al menos una de los siguientes transtornos
cognitivos: afasia, apraxia, agnosia o un transtorno en el
funcionamiento ejecutivo. Enfermedad de Alzheimer (AD) o DAT es la
principal causa de demencia en la vejez y es la cuarta principal
causa de muerte en las naciones desarrolladas (después de
enfermedad del corazón, cáncer y accidente cerebro vascular). Hasta
el 70% de casos de demencia se deben a AD, con enfermedad de los
vasos sanguíneos (accidente cerebro vascular, arteriosclerosis)
siendo la segunda causa más común. La frecuencia de AD entre
60-años es aproximadamente del 1%. La incidencia
duplica aproximadamente cada 5 años, llegando a ser el 2% a una edad
de 65, 4% a los 70, 8% a los 75, 16% a los 80 y 32% a los 85. Ver
Forsyth, Phys. Ther., Vol. 78, pp. 1325-1331 (1998);
Evans et al., JAMA, Vol. 262, pp. 2551-2556
(1989). Se estima que hasta dos-tercios de aquellos
en sus 90s sufren de alguna forma de demencia. Ver Merritt,
Textbook of Neurology, 6th Edition, Lea & Febiger, pp.
484-489, Philadelphia, PA (1979); y Gilroy &
Meyer, Medical Neurology, MacMillan Publishing Co., pp.
175-179 (1979). AD aflige un estimado de cuatro
millones de humanos que están en los Estados Unidos solo a un costo
de 100 billones de dolares por año. Ver Schumock, J. Health Syst.
Pharm., Vol. 55, No. 52, pp. 17-21 (1998); y Hay
& Ernst, Am. J. Public Health, Vol. 77, pp.
1169-1175
(1987).
(1987).
Además, la enfermedad se encuentra a niveles
mucho más bajos en los grupos de edad más jóvenes, ocasionalmente
iniciando a aproximadamente 30 años de edad y rara vez incluso a
finales de la infancia. Ver Adams & Victor, Principles de
Neurology, pp. 401-407 (1977).
La AD es incurable. Conduce a la muerte dentro
de una media de 8 años después de diagnóstico, los últimos 3 de los
cuales son por lo general se pasan en una institución. Por otra
parte de la pérdida de la memoria, los pacientes de AD muestran
cambios dramáticos de personalidad, desorientación, coordinación
física decadente y una incapacidad para cuidarse ellos mismos,
deterioro de las actividades de la vida diaria (ADL), transtorno
cognitivo progresivo, transtorno del comportamiento, i.e.,
divagación, agitación, agresión; y signos/síntomas psiquiátricos
incluyendo, pero no limitando a, psicosis, depresión y ansiedad. La
proporción media de la depresión mayor, psicosis y agitación en AD
es aproximadamente 8%, 20% y 20%, respectivamente. Ver Mayeux and
Sano, NEJM, Vol. 341, pp. 1670-1679 (1999).
\vskip1.000000\baselineskip
La AD es el tipo más común de demencia, que se
caracteriza por el transtorno cognitivo progresivo. Ver Bayles,
Semin. Speech Lang., Vol. 22, No. 4, pp. 251-259
(2001); y Storey et al., Front Biosci., Vol. 7, pp.
E155-E184 (2002). Durante la última década, se ha
hecho un progreso sustancial en la comprensión de la patogenesia de
AD y varios factores de riesgo han sido asociados con AD incluyendo
antecedentes genéticos y edad. Ver Tanzi et al., Neuron.,
Vol. 32, No. 2, pp. 181-184 (2001) Review; Myers
et al., Curr. Opin. Neurol., Vol. 14, No. 4, pp.
433-440 (2001) Review; and Shastry, "Molecular and
Cell Biological Aspects de Alzheimer Disease", J. Hum. Genet,
Vol. 46, No. 11, pp. 609-618 (2001) Review.
Mientras que la etiología exacta de AD se
desconoce, la evidencia de una contribución genética proviene de
varias observaciones importantes, tales como la incidencia familiar,
análisis de genealogía, estudios de gemelos mogozigótico y
dizigótico y la asociación de la enfermedad con el síndrome de Down.
Estudios de la incidencia y los patrones de transmisión en familias
de pacientes con AD muestran que parientes de individuos afectados
tienen un riesgo incrementado del desarrollo de AD cuando se compara
con miembros de la población general. Los porcentajes de
concordancia entre probandos co-gemelos de
mogozigótico con AD son de 40-60%, dando a entender
de esta manera una fuerte pero no absoluta influencia genética sobre
la enfermedad. Para una revisión general ver Baraitser, "The
Genetics of Neurological Disorders", 2nd Edition, pp.
85-88 (1990).
Cuatro genes se han unido a AD. Estos genes se
localizan en los cromosomas 1, 14, 19 y 21. El cromosoma 21
conlleva el gen que codifica el precursor de
\beta-amiloide, i.e., proteína del precursor
amiloide (APP). Este gen se clonó en 1987 después de observar que
la demencia se desarrolla en una alta proporción de individuos con
síndrome de Down (trisomía 21) que sobreviven a una edad adulta y en
quienes la patología como AD estuvo presente en la autposia. El
posterior descubrimiento de mutaciones en la proteína del gen del
precursor amiloide en familias con AD familiar de inicio temprano
sugiere que la sobreproducción de \beta-amiloide
se asoció con algunos casos de
AD.
AD.
El gen de la presenilina (PS1) en el cromosoma
14 se localizó en 1992 utilizando estrategias de enlace genético en
familias con AD de inicio temprano. Aproximadamente 25 mutaciones
diferentes en varias áreas de la proteína se han encontrado en
blancos, Judios Asquenazi, familas Hispanas y Japonesas. Otro gen,
la presenilina 2 (PS2), se localizó en el cromosoma 1 después de
evaluar varios familiares Volga-Alemán con AD de
inicio temprano de dominante autosómico. Los pacientes con
mutaciones de PS1 tienen una característica edad temprana de
aparición, entre 35 y 60 años. Las mutaciones de PS2 se encuentran
casi exclusivamente en familias de herencia
Volga-Alemán. La mayoría de pacientes encontrados
en el ambiente de clínica probablemente no son probables candidatos
para pruebas de mutaciones de la presenilina, aunque la prueba de
PS1 es comercialmente disponible. El cromosoma 12 puede albergar
una mutación causante relativa a AD de aparición tardía y está
actualmente bajo
estudio.
estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
En los últimos años, la investigación ha
sugerido que ApoE juega un papel potencial en la patogenesia de AD.
ApoE desarrolla varias funciones como un constituyente de proteína
de lipoproteínas en plasma, incluyendo su papel en el metabolismo
del colesterol. En primer lugar, se identificó como un constituyente
de las lipoproteínas de muy baja densidad sintetizadas del hígado
(VLDL) que transportan los triglicéridos a partir del hígado a los
tejidos
periféricos.
periféricos.
La más importante información genética en
pacientes con AD de aparición tardía proviene del análisis de
polimorfismo del gen ApoE. Ver Scarmeas et al., Neurology,
Vol. 58, No. 8, pp. 1182-1188 (2002). El gen ApoE
contiene tres isoformas principales, ApoE2, ApoE3 y ApoE4, que
difieren entre sí solamente por sustituciones de un solo
aminoácido. Ver Rosenberg, "The Molecular and Genetic Basis of
Alzheimer's Disease: The End of the Beginning: The 2000 Wartenberg
Lecture", Neurology, Vol. 54, No. 11, pp.
2045-2054 (2000).
ApoE es una proteína plasmática que participa en
el transporte del colesterol y está codificado por un gen en el
cromosoma 19. Se sintetiza principalmente en el hígado y se cree que
está implicada en la reparación de los sistemas de nervios después
de la lesión. El genotipo ApoE es un importante contribuyente a la
susceptibilidad a AD pero se encuentra en varias otras enfermedades
neurodegenerativas, tales como demencia puglistica. Tres alelos
comunes, E2, E3 y E4, corresponden a seis fenotipos. El alelo
\varepsilon4 ha sido identificado como un factor de riesgo para
AD, con el atribuible riesgo estimado que es de
45-60%. Los homocigotos E4 están en un riesgo mayor
que los heterocigotos E4. ApoE4 está presente en placas y puede
facilitar la acumulación amiloide en el cerebro.
La asociación del alelo ApoE4 con un riesgo
mayor y un inicio de AD más temprano es probablemente debido a su
mayor afinidad por la proteína \beta-amiloide en
comparación con otras isoformas, que resulta en la eliminación
reducida de la proteína \beta-amiloide. Ver
Selkoe, "Translating Cell Biology into Therapeutic Advances in
Alzheimer's Disease", Nature, Vol. 399, Suppl. 6738, pp.
A23-A31 (1999) Review.
ApoE es fundamental en el metabolismo de la
lipoproteína de varias maneras. Ver Mahley et al., J. Lipid
Res., Vol. 25, pp. 1277-1294 (1984). Es un sitio de
reconocimiento para varios receptores de lipoproteína celular,
incluyendo receptores de hepatocitos para el quilomicron y
remanentes VLDL. Ver Hui et al., J. Biol. Chem., Vol. 259,
pp. 860-869 (1984); y Shelburne et al., J.
Clin. Invest., Vol. 65, pp. 652-658 (1980).
Las lipoproteínas enriquecidas de ApoE también
han sido descritas por tener una función en el sistema inmune,
mediante la inhibición de proliferación de linfocito
mitógeno-estimulada o
antígeno-estimulada in vitro e in
vivo. En el ovario, ApoE inhibe la producción de andrógenos por
las células teca e intersticial cultivadas
LH-estimuladas. Ver Dyer et al., J. Biol.
Chem., Vol. 263, p. 10965 (1988).
Adicionalmente la justificación que las
lipoproteínas que contienen ApoE- y ApoB- son reguladores
importantes de la función de linfocito, proviene de estudios de las
propiedades inhibitorias del lipoproteínas en plasma sangre del
cordón fetal. Ver Curtiss et al., J. Immunol., Vol. 133, p.
1379 (1984). En estos estudios, se estableció una correlación
directa entre ApoE y la inhibición.
Existen tres isoformas principales de ApoE,
refiriéndose como ApoE2, ApoE3 y ApoE4 que son productos de tres
alelos en un locus del gen único. Tres fenotipos homozigóticos
(ApoE2/2, E3/3 y E4/4) y tres fenotipos heterozigóticos (ApoE3/2,
E4/3 y E4/2), surgen de la expresión de cualquiera de dos de los
tres alelos. El fenotipo más común es ApoE3/3 y el alelo más común
es E3. Ver Mahley, Science, Vol. 240, pp. 622-630
(1988).
Las secuencias de aminoácido de los tres tipos
difieren solo levemente. ApoE4 difiere del ApoE3 en que en la
arginina del ApoE4 se sustituye por la cisteina de origen natural en
el residuo 112 del aminoácido. La forma más común de ApoE2 difiere
de ApoE3 en el residuo 158, donde la cisteina se sustituye por la
arginina de origen natural. Ver Mahley (1988), supra. Los
fenotipos y genotipos de ApoE se describen y conocen bien en el
oficio, como se ha descrito anteriormente. El sistema de
nomenclatura establecido, así como los fenotipos y genotipos por
ApoE, se describen, por ejemplo, en Zannis et al., J. Lipid
Res., Vol. 23, p. 911 et seq. (1982), que se incorpora por
referencia en este documento.
Los sujetos con el genotipo ApoE4/4 son tanto
como ocho veces más probables de ser afectados por AD que los
sujetos con los genotipos ApoE2/3 o ApoE3/3. Además, la edad media
de aparición de AD y la edad media de supervivencia es inferior
para aquellos que tienen un alelo ApoE4, y más baja para aquellos
que tienen dos alelos ApoE4 (ver U.S. Patent No.5,508,167). De esta
manera, un pronóstico de AD para un sujeto es más probable que sea
negativo si el sujeto tiene un alelo ApoE4 y más negativo si el
sujeto tiene más de uno alelo ApoE4. El pronóstico negativo se
puede ver en términos de aumento de la probabilidad de desarrollar
la enfermedad, o antes de la edad de aparición.
Otras enfermedades ligadas a ApoE incluyen
hiperlipidemia Tipo III y arteriosclerosis. Otra evidencia indica
que los polimorfismos en el promotor ApoE también se asocian con
riesgo incrementado de AD. Ver Lambert et al., Human Mol.
Gen., Vol. 7, p. 533 (1998); y Lambert et al., Human Mol.
Gen., Vol. 7, p. 1511 (1998).
Los estudios han mostrado que los fragmentos de
ApoE que oscilan de 5-22 kDa están presentes en el
fluido espinal cerebral pos-muerte a partir de
tanto pacientes control como pacientes con AD. La única banda
principal inmunoprecipitada por un anticuerpo monoclonal que
reconoce el dominio tóxico putativo funciona con un peso molecular
aparente de aproximadamente 22 kDa. Este fragmento probablemente
corresponde al principal producto de división de la trombina ApoE,
la cual se ha demostrado que es resistente a la proteasa. Ver
Weisgraber et al., J. Biol. Chem., Vol. 258, pp.
12348-54 (1983).
Los aminoácidos 130-169 en ApoE
humana abarcan un dominio inmunoregulador con ambas actividades
citostáticas y citotóxicas contra las células T
interleucina-2-dependientes. Este
hallazgo es consistente con los resultados de estudios previos que
implican los residuos 141-155 en el efecto
anti-proliferativo de la ApoE en células T activas
de mitógeno naive. Ver Cardin et al. (1988); and Dyer et
al. (1991).
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El tratamiento de demencia, incluyendo la AD es
multimodal, adaptado a cada individuo y modificado con la
progresión de la enfermedad. El tratamiento se puede dividir en tres
áreas: intervenciones farmacológicas dirigidas a la fisiopatología
específica de la demencia, si es posible, y agentes farmacológicos
que mejoran los síntomas específicos, tales como delirios y
anormalidades del sueño, e intervenciones del comportamiento, que
pueden mejorar síntomas específicos y mejorar las actividades de
vida diaria del paciente.
Los objetivos del tratamiento para AD son: (1)
sintomático - mejorar el grado de transtorno cognitivo,
incluyendo déficit de atención y disfunción ejecutiva, síntomas del
comportamiento, y cumplimiento de actividades de la vida diaria;
y/o (2) modificar la enfermedad - desacelerar la progresión de la
enfermedad y por consiguiente mantener la función independiente por
el mayor tiempo posible.
El único tratamiento farmacológico exitoso del
transtorno cognitivo de AD hasta la fecha ha sido con los fármacos
ChEI. Estos incluyen; tacrina, donepezil, rivastigmina y
galantamina. Ver Jacobsen, "Alzheimer's Disease: An Overview of
Current and Emerging Therapeutic Strategies", Curr. Top. Med.
Chem., Vol. 2, No. 4, pp. 343-352 (2002); and
Giacobini, Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 920, pp.
321-327 (2000) Review.
ChEls empleados para el tratamiento de AD se
muestran en la Tabla 1 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los ChEls son la única clase de agentes
efectivos conocidos para dirigir la fisiopatología de la enfermedad
y trabajan mediante el aumento de los niveles de acetilcolina
encontrados que se disminuye en los cerebros de pacientes con AD.
Estos fármacos pueden inhibir la acetilcolinesterasa sola o puede
inhibir tanto la acetil- como la butiril-ChE. La
rivastigmina efectivamente inhibe tanto la acetil- como la
butiril-ChE y esta doble inhibición puede contar
para estas propiedades especiales de los fármacos.
Algunos de estos fármacos de ChEl han sido
encontrados por ser efectivos tanto en la mejora del alcance del
déficit cognitivo en pacientes con AD, como se mide, por ejemplo,
por las puntuaciones de la Escala de Valoración de la Enfermedad de
Alzheimer (ADAS), como en la mejora de los transtornos
neurosiquiátricos de pacientes con AD, tales como agitación,
divagación, agresividad, apatía y ansiedad. Además, algunos de los
fármacos inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChEl) son capaces
de retrasar el proceso de deterioro y así estabilizar el proceso de
la enfermedad por ciertos periodos de tiempo. El mecanismo preciso
por los cuales este fármaco produce todos los beneficios observados
en AD, no es completamente conocido, parece claro que hace algo más
que producir un aumento temporal en la
neuro-transmisión colinérgica.
En general, los fármacos ChEI son efectivos en
pacientes que tienen demencia con déficit colinérgico, esta
incluye, pero no se limita a, AD, demencia con cuerpos de Lewy y
enfermedad de Parkinson y demencia. En general, estos fármacos se
deberían utilizar al inicio del curso de la demencia, especialmente
de AD.
El cerebro humano contiene dos tipos principales
de ChE, AChE y butirilcolinesterasa (BuChE). El principal papel de
AChE es terminar la transmisión del impulso en la sinapsis
colinérgica, mediante la hidrólisis rápida de la acetilcolina
(ACh). Ver Giacobini, supra.
Hasta hace poco, AChE ha sido considerada como
un objetivo principal para el diseño del fármaco y la contribución
relativa de BuChE a la regulación de los niveles de ACh se ha
ignorado en gran medida. Sin embargo, una línea creciente de
evidencia indica que ambas AChE y BuChE tienen papeles en la
regulación de niveles de ACh y también puede ser importante en el
desarrollo y progresión de AD. Ver Greig et al., Curr. Med.
Res. Opin., Vol. 17, No. 3, pp. 159-165 (2001).
Mientras que todos los ChEls comparten el efecto
común de la inhibición de la AChE, la rivastigmina es un doble
inhibidor de ambas AChE y BuChE y ha demostrado beneficios
significantes y clínicamente relevantes para los pacientes con AD.
Ver Bar-On et al., "Kinetic and Structural
Studies on the Interaction of Cholinesterases with the
Anti-Alzheimer Drug Rivastigmine", Biochem.,Vol.
41, No. 11, pp. 3555-3564 (2002). Además, se ha
encontrado que los pacientes que no responden a o no pueden tolerar
el donepezil (ARICEPT^{TM}) a menudo responderán y/o toleraran el
tratamiento, cuando se cambia a rivastigmina. Ver, Auriacombe et
al., Current Medical Research Opinion, Vol. 18, pp.
129-138 (2002).
Aunque los ChEIs han sido fármacos exitosos,
solo un subgrupo de los pacientes de AD se beneficia de ellos. Ver
Bums et al., Dement. Geriatr. Cogn. Disord., Vol. 10, No. 3,
pp. 237-244 (1999); y Rosler et al., BMJ,
Vol. 318, No. 7184, pp. 633-638 (1999). En general,
al menos un tercio de los pacientes no responden al tratamiento con
ChEIs en absoluto. De esta manera existe una gran necesidad de
establecer un método para predecir de antemano a los pacientes con
una respuesta probable a esta clase de fármacos con el fin de evitar
la exposición de los pacientes a un tratamiento farmacológico si no
se beneficiaran de este. Sería de gran valor clínico si un perfil
genético del paciente pudiera ser utilizado para proporcionar
predictores de respuesta a la terapia de ChEI. Sin embargo, en los
estudios pasados del efecto del genotipo ApoE sobre la respuesta a
ChEIs han entregado resultados conflictivos. Se ha demostrado que
el fenotipo ApoE4 es tanto un predictor negativo como que no tiene
efecto sobre la eficacia del tratamiento de tacrina en pacientes con
AD. Ver Sjogren et al., J. Neural. Transm. Vol. 108, No. 4,
pp. 451-458 (2001); Farlow et al., Ann. N.Y.
Acad. Sci., Vol. 802, pp. 101-110 (1996); Farlow
et al., Neurology, Vol. 50, No. 3, pp.
669-677 (1998); Rigaud et al., Eur. J.
Neurol., Vol. 7, No. 3, pp. 255-258 (2000); Poirier
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, No. 26, pp.
12260-12264 (1995); y MacGowan et al., Int.
J. Geriatr. Psychiatry, Vol. 13, No. 9, pp.
625-630
(1998).
(1998).
También se ha demostrado que el fenotipo ApoE4
no tiene influencia en la eficacia del tratamiento de galantamina
en AD. Ver Aerssens et al., Geriatr. Cogn. Disord., Vol. 12,
No. 2, pp. 69-77 (2001); y Wilcock et al.,
BMJ, Vol. 321, No. 7274, pp. 1445-1449 (2000).
\newpage
Nobili et al, J. Nucl. Med., vol.
43(8), p. 983-990 (2002) revela que los
genotipos ApoE son comparables en pacientes estabilizados y
no-estabilizados tratados con rivastigmina o
donepezil.
Todos los ChEls pueden causar efectos
secundarios, tales como nausea, vómito, diarrea, insomnio, calambres
musculares, fatiga y anorexia. Estos efectos secundarios que pueden
oscilar de leve a severo. Además, no todos los pacientes con AD
mostraron mejora o incluso una reducción en la proporción de
deterioro cuando se toman estos fármacos. De esta manera existe una
necesidad de métodos para determinar cuáles pacientes responderán a
un ChEI y cual paciente desarrollará efectos secundarios adversos
durante el tratamiento.
Una de las variables de mayor interés práctico
para el cuidador de pacientes con demencia es estimar el nivel de
cuidado que el paciente necesitará en el futuro. Por "nivel de
cuidado" se entiende la amplitud e intensidad de asistencia
externa y monitoreo del paciente que será necesario para permanecer
seguros, y maximizar la calidad de vida y salud.
La variación del nivel de cuidado para pacientes
con demencia es enorme. El gasto de los niveles de cuidado más
altos puede ser muy grande también. El nivel puede variar de; mínimo
para pacientes con enfermedad muy leve y temprana, que puede
incluso ser completamente autónomo y vivir independientemente, al
cuidado casero de aumentar la intensidad, a la institucionalización
en niveles de variación de restricción personal y la intensidad de
asistencia de enfermería. En los casos más severos, además al
transtorno cognitivo progresivo, problemas de comportamiento severo
a menudo ocurren. Estos problemas de comportamiento incluyen, pero
no se limitan a, depresión, agresión o comportamiento de divagación
repetido y estos problemas de comportamiento, así como los
problemas médicos concurrentes que frecuentemente desarrolla en
estos pacientes, puede necesitar extremadamente costoso
hospitalización de un paciente en unidades médicas y/o
psiquiátricas.
Se espera que para cualquier paciente que sufre
de demencia, el nivel necesario de cuidado progresivamente
incrementará durante el tiempo. El curso temporal para estos cambios
se mide en meses a años. Sin embargo, la velocidad y naturaleza de
este aumento progresivo no se puede predecir con exactitud, debido a
las variaciones en el proceso de la enfermedad en sí y lo que es
más importante debido a variación en la respuesta de los pacientes
al tratamiento, especialmente al tratamiento con ChEls. De esta
manera, existe una necesidad, además de lo anterior, los métodos
para predecir o estimar en un futuro próximo, el nivel necesario de
cuidado que un paciente necesitará, por ejemplo, en 6 meses, 1 año,
3 años o más. Dicha predicción ayudaría en la planificación para
maximizar la calidad y minimizar el gasto de dicho cuidado.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención supera los problemas
descritos anteriormente, proporcionando un método, tal como se
define en las reivindicaciones, para predecir la sensibilidad de los
pacientes con demencia incluyendo, pero no limitando a, DAT al
tratamiento con fármacos ChEI basados en una determinación del
genotipo ApoE.
Otro aspecto de la invención es un método para
determinar la sensibilidad de un individuo con demencia, al
tratamiento con Rivastigmina que comprende: determinar, para cada
una de las dos copias del gen ApoE presente en el individuo, la
naturaleza del genotipo ApoE, en donde si una o ambas de las dos
copias del gen ApoE presente en el individuo contiene el alelo
\varepsilon4, entonces el paciente se debería colocar en un buen
grupo de respuesta; o si ninguna de las dos copias del gen ApoE de
los pacientes contiene el alelo \varepsilon4 entonces el paciente
se coloca en un grupo de pacientes de respuesta pobre. En este
aspecto la demencia se selecciona a partir del grupo que consiste
de; DAT, demencia vascular, demencia de cuerpos de Lewy, demencia
de la enfermedad de Parkinson, demencia del Síndrome de Down y
transtorno cognitivo leve.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona métodos para
determinar qué pacientes con demencia incluyendo, pero no limitando
a, AD serán más propensos a responder al tratamiento con
rivastigmina con mejora de las funciones cognitivas, mejora en
problemas de comportamiento o estabilización del deterioro clínico
en uno o ambos grupos de síntomas. El término "responder al
tratamiento" tal como se utiliza aquí, se pretende para incluir
tanto un efecto profiláctico o de protección, por lo cual los
síntomas de la enfermedad se previenen desde que ocurren o
impidiendo el empeoramiento por un periodo de tiempo y, además, un
efecto por lo cual los síntomas que ya se han manifestado se
mejoran o reducen en intensidad, severidad o duración.
Otro aspecto de la invención es un método para
determinar, de ante mano, cuan sensible será un paciente al
tratamiento con rivastigmina, que comprende la determinación de las
dos copias del gen ApoE presente en el paciente la naturaleza de
los dos alelos. Sí uno o ambos genes conllevan el alelo de la
isoforma \varepsilon4, entonces el paciente se colocará en un
grupo de pacientes de respuesta buena y se esperaría que responda al
tratamiento con ChEIs, incluyendo el tratamiento con rivastigmina a
dosis de 6 mg/día o más. Si el alelo \varepsilon4 no está
presente en ninguna copia del gen ApoE, entonces el paciente se
debería colocar en el grupo de pacientes de respuesta pobre. La
determinación de la sensibilidad de un paciente al tratamiento con
ChEIs antes de que el tratamiento actual tuviera un valor para
ayudar al médico interno a proporcionar el régimen de tratamiento
óptimo para un paciente y minimizar los efectos secundarios
adversos.
Como se utiliza aquí, el término "tratamiento
con 6 mg/día o más de rivastigmina" se entenderá la
administración a un paciente, por cualquier medio, el equivalente
molar de 6 mg o más de rivastigmina tartrato (EXELON^{TM})
durante un periodo de 24-horas. La rivastigmina
tartrato (EXELON^{TM}) está comercialmente disponible de Novartis
Pharmaceutical Corporation, East Hanover, NJ. La rivastigmina se
puede administrar como una dosis única o se puede subdividir en
cualquier número de dosis menores separadas que se administran
durante el periodo de 24-horas. La rivastigmina
puede ser en cualquier forma farmacéuticamente aceptable, que
permitirá la absorción por el cuerpo, incluyendo como la sal de un
ácido mineral u orgánico y se puede combinar o formular con
cualquier excipiente aceptable farmacéuticamente. La administración
puede ser por cualquier ruta incluyendo, pero no limitando a, oral,
como una solución acuosa o ya sea por liberación inmediata o
liberación controlada, o liberación retardada; formulación
farmacéutica oral; parenteral, incluyendo por vía intramuscular,
intravenosa o intratecal; intranasal; rectal; vaginal o por
difusión o absorción trans-cutánea, incluso mediante
parches transdérmicos incluyendo, pero no limitando a, el TRANS
DERMAL SYSTEM PATCH^{TM}.
\vskip1.000000\baselineskip
En un paciente con hallazgos clínicos sugieren
cualquier proceso como demencia, incluyendo AD, todas las otras
causas de los síntomas deberían ser excluidos por la historia, el
examen y los estudios de laboratorio apropiados. En ciertos tipos
de estudios de laboratorio de demencia puede ser muy útil. Por
ejemplo, la evaluación del fluido espinal cerebral (CSF) para la
proteína amiloide y proteína tau puede incrementar la probabilidad
de un diagnóstico de AD, pero no son suficientemente específicas
por ser de valor rutinario en detección o diagnóstico temprano de
AD. Las mejoras en estas pruebas en combinación con imágenes de
resonancia magnética cuantitativa (MRI) pueden finalmente permitir
una prueba específica, con anticipación. La presencia del alelo
ApoE4 hace muy probable que la demencia del paciente se produzca
por AD. La presencia de ApoE4 también se asocia con demencia
vascular.
vascular.
Tal como se utilizan aquí, los términos "AD y
DAT" se entienden como la misma enfermedad y se utilizan de
forma intercambiable.
Las demencias de todos los tipos incluyendo,
pero no limitando a, AD dan lugar al deterioro progresivo en el
funcionamiento del paciente y resultan en el empeoramiento a
velocidad constante de los problemas de comportamiento, que
coinciden con el deterioro en funcionamiento cognitivo y son parte
del mismo proceso de la enfermedad. Los problemas de comportamiento
típicos, mostrados por los pacientes con demencia incluyen, pero no
se limitan a, depresión, psicosis, delirios, transtorno del sueño,
divagación, acceso de ira, agresión, agitación, apatía, ansiedad,
desconfianza, horror y paranoia. En las etapas finales de la mayoría
de las formas de demencia, incluyendo AD, las víctimas están en
cama, pierden el control de la orina y las deposiciones y sufren de
ataques epilépticos. La muerte es por lo general debida a neumonía
o infección del tracto urinario.
Mientras que un diagnóstico definitivo de, por
ejemplo, AD requiere el examen del tejido en la autposia o biopsia,
el diagnóstico se puede hacer con gran precisión utilizando criterio
clínico. Las manifestaciones clínicas de AD son bastante
características, el transtorno de memoria se produce a principios de
la enfermedad; los pacientes tienen dificultad para aprender y
recordar nuevo material. La desorientación parcial y temporal
también puede ocurrir temprano, con pacientes que se sienten
perdidos en el ambiente familiar. La afasia, apraxia y acalculia se
desarrollan como la enfermedad progresa, y la apatía o paranoia
pueden ocurrir. Los pacientes a menudo tienen delirios de robo y de
infidelidad conyugal. Los pacientes pueden deambular, andar, abrir
y cerrar cajones repetidamente, y repetir las mismas preguntas. Las
anormalidades del ciclo sueño-vigilia pueden llegar
a ser evidentes; por ejemplo, un paciente puede estar despierto en
la noche pero cree que es de día. Las actividades de la vida diaria
declinan a lo largo de la enfermedad. Los pacientes pierden la
capacidad para comer y asearse ellos mismos y tienen dificultad
para vestirse. En las etapas terminales de la enfermedad, los
pacientes muestran transtorno cognitivo en virtualmente todas las
esferas cognitivas, las anormalidades motoras se hacen evidentes y
tanto la incontinencia urinaria como fecal se
desarrolla.
desarrolla.
La característica esencial de cualquier demencia
es el desarrollo de múltiples déficits cognitivos que incluyen
deterioro de memoria y al menos uno de los siguientes transtornos
cognitivos: afasia, apraxia, agnosia o un transtorno en el
funcionamiento ejecutivo. Los déficits cognitivos deben ser
suficientemente severos a causa de deterioro en el funcionamiento
ocupacional o social y deben representar una disminución de un nivel
de funcionamiento previamente superior.
Un diagnóstico de una demencia se debería hacer
si los déficits cognitivos ocurren exclusivamente durante el
transcurso de un delirio. Sin embargo, tanto la demencia como el
delirio se pueden diagnosticar, si la demencia está presente en
momentos cuando el delirio no está presente. La demencia
etiológicamente se puede relacionar con una condición médica
general, a la persistencia de los efectos del uso de sustancias
(incluyendo la exposición a toxinas), o a una combinación de estos
factores.
El deterioro de la memoria es necesario para
hacer el diagnóstico de una demencia y es un síntoma precoz notable
(Criterio A1). Los individuos con demencia se vuelven discapacitados
en su capacidad para aprender nuevo material, u olvidan previamente
el material aprendido. La mayoría de los individuos con demencia
tienen ambas formas de deterioro de memoria, aunque algunas veces
es difícil demostrar la pérdida del material aprendido previamente
inicialmente en el curso del desorden. Pueden perder objetos de
valor como carteras y llaves, olvidar cocinar los alimentos en la
estufa, y perderse en vecindarios desconocidos. En las etapas de
demencia avanzadas, el deterioro de memoria es tan severo que la
persona olvida su ocupación, educación, cumpleaños, miembros de la
familia y algunas veces incluso el nombre.
La memoria se puede probar formalmente, pidiendo
a la persona que registre, conserve, recuerde y reconozca la
información. La capacidad para aprender nueva información se puede
evaluar, pidiendo al individuo que aprenda una lista de palabras.
Se le pide al individuo que repita las palabras (registro), que
recuerde la información después de un retraso de varios minutos
(retención, recuerdo), y que reconozca las palabras de una lista
múltiple (reconocimiento). Los individuos con dificultad de
aprendizaje de nueva información no se ayudan por pistas o
indicaciones, por ejemplo, preguntas de
elección-múltiple, porque no aprendieron el material
inicialmente. En contraste, los individuos con principalmente
déficits de recuperación se pueden ayudar por pistas e indicaciones
porque su deterioro está en la capacidad de acceder a sus recuerdos.
La memoria lejana, se puede probar pidiendo al individuo que
recuerde información personal o material pasado, que el individuo
encuentre de interés, por ejemplo, política, deportes,
entretenimiento. También es útil determinar el impacto (del
individuo y de los informantes) de los transtornos de memoria en el
funcionamiento del individuo, por ejemplo, capacidad para trabajar,
comprar, cocinar, pagar las facturas, volver a casa sin
perderse.
El deterioro de la función del lenguaje (afasia)
se puede manifestar por la dificultad para producir los nombres de
individuos y objetos (Criterio A2a). El discurso de los individuos
con afasia puede ser vago o vacío, con largas frases
circunlocutorias y uso excesivo de términos de referencia
indefinida, tal como "cosa" y "esto". La comprensión del
lenguaje hablado y escrito y la repetición de lenguaje, también
pueden estar comprometidos. En las etapas de demencia avanzada, los
individuos pueden ser mudos o tener un patrón de discurso
deteriorado caracterizado por la ecolalia, i.e., imitando lo que se
escucha; o palilalia, i.e., repitiendo sonidos o palabras una y
otra vez. El lenguaje se prueba pidiendo al individuo que nombre los
objetos en el cuarto, por ejemplo, corbata, vestido, escritorio,
lámpara; o partes del cuerpo, por ejemplo, nariz, barbilla, hombro;
seguir los comandos, por ejemplo, "punto en la puerta y luego, en
la mesa"; o repetir frases, por ejemplo, "no si, y o
pero".
Los individuos con demencia pueden mostrar
apraxia, i.e., capacidad deteriorada para ejecutar actividades
motoras a pesar de tener habilidades motrices intactas, función
sensorial y comprensión de la tarea necesaria (Criterio A2b). Serán
incapaces de hacer mímica del uso de objetos, por ejemplo, cepillar
el cabello; o ejecutar actos motores conocidos, por ejemplo, agitar
las manos para decir adiós. La apraxia puede contribuir a déficits
en la cocina, vestirse y dibujar. Los transtornos de habilidades
motoras se pueden probar pidiendo al individuo que ejecute
funciones motoras, por ejemplo, que muestren como se cepillan los
dientes, que copien los pentágonos que se intersectan, que
ensamblen bloques o que arreglen palos en diseños específicos.
Los individuos con demencia pueden mostrar
agnosia, i.e., fracaso para reconocer o identificar objetos a pesar
de tener la función sensorial intacta (Criterio A2c). Por ejemplo,
el individuo puede tener agudeza visual normal pero pierden la
capacidad de reconocer objetos, tales como sillas o lápices.
Eventualmente pueden ser incapaces de reconocer los miembros de la
familia o aún su propia reflexión en el espejo. De manera similar,
pueden tener sensación táctil normal, pero son incapaces de
identificar objetos colocados en sus manos, por solo tacto, por
ejemplo, una moneda o llaves.
Los transtornos en el funcionamiento ejecutivo
son una manifestación común de demencia (Criterio A2d) y se pueden
relacionar especialmente con desórdenes del lóbulo frontal o asociar
con rutas subcorticales. El funcionamiento ejecutivo involucra la
capacidad de pensar en abstracto y planificar, iniciar, seguir una
secuencia, controlar y detener el comportamiento complejo. El
deterioro en el pensamiento abstracto se puede manifestar por el
individuo que tiene dificultad de hacer frente a nuevas tareas y
evita situaciones que necesitan el procesamiento de información
nueva y compleja. La capacidad de abstraer se puede evaluar
formalmente pidiendo a la persona que encuentre similitudes o
diferencias entre palabras relacionadas. La disfunción ejecutiva,
también es evidente en una capacidad reducida para cambiar jugos
mentales, para generar nueva información verbal o
no-verbal, y ejecutar actividades motoras en
serie.
serie.
Las pruebas para función ejecutiva incluyen
pedir al individuo que cuente hasta 10, que recite el alfabeto, que
reste series de 7, enunciar tantos animales como sea posible en 1
minuto, o dibujar una línea continua que consiste de la alternancia
de m y n. También es útil determinar (a partir del individuo y de
los informantes) el impacto de los transtornos en el funcionamiento
ejecutivo en la vida diaria de la persona, por ejemplo, capacidad
para trabajar, plan de actividades, presupuesto.
Los datos en ambos Criterio A1 (deterioro de
memoria) y Criterio A2 (afasia, apraxia, agnosia o transtorno en el
funcionamiento ejecutivo) deben ser suficientemente severos a causa
del deterioro significante en el funcionamiento social u
ocupacional, por ejemplo, ir a la escuela, trabajar, comprar,
vestirse, bañarse, manejo de las finanzas y otras actividades de la
vida diaria; y pueden representar una disminución de un nivel de
funcionamiento previo (Criterio B). La naturaleza y grado de
deterioro son variables y a menudo dependen del particular ambiente
social del individuo. El mismo nivel de transtorno cognitivo puede
deteriorar significantemente la capacidad del individuo para
desarrollar un trabajo complejo, pero no un trabajo que es menos
exigente. Las escalas estandarizadas de evaluación publicadas que
miden el mantenimiento físico, por ejemplo, higiene personal;
funcionamiento intelectual, y la capacidad de utilizar implementos o
herramientas, por ejemplo, teléfono, lavadora; se puede utilizar
para medir la severidad del
deterioro.
deterioro.
La demencia no se diagnostica si estos síntomas
ocurren exclusivamente durante el curso de un delirio. Sin embargo,
un delirio puede ser sobrepuesto en una demencia
pre-existente, en cuyo caso ambos diagnósticos se
deben dar.
\vskip1.000000\baselineskip
Los individuos con demencia pueden ser
parcialmente desorientados y tener dificultad con tareas espaciales.
El funcionamiento visuoespacial se puede evaluar pidiendo al
individuo que copie los dibujos, tales como un círculo, pentágonos
superpuestos y un cubo. En la demencia son comunes, el juicio y
entendimiento pobre. Los individuos pueden mostrar poca o ninguna
conciencia de la pérdida de la memoria u otras anormalidades
cognitivas. Pueden hacer valoraciones poco realistas de sus
habilidades y hacer planes que no son congruentes con sus déficits
y el pronóstico, por ejemplo, la planificación para iniciar un nuevo
negocio. Pueden subestimar los riesgos asociados en actividades,
por ejemplo, conducción. Ocasionalmente, pueden dañar a otros,
llegando a ser violentos. El comportamiento suicida puede ocurrir,
particularmente en etapas primarias cuando el individuo es más
capaz de llevar a cabo un plan de acción. La demencia algunas veces
se acompaña por transtornos motores del modo de andar que conduce
a
caídas.
caídas.
Algunos individuos con demencia muestran
comportamiento desinhibido, incluyendo hacer chistes inapropiados,
descuidar de la higiene personal, mostrar familiaridad indebida con
extraños, o hacer caso omiso de reglas convencionales de conducta
social. Los problemas de dicción pueden ocurrir en la demencia que
se asocia con la patología subcortical, tales como enfermedad de
Parkinson, enfermedad de Huntington y algunos casos de demencia
vascular. Los problemas cognitivos múltiples de demencia a menudo se
asocian con ansiedad, estado de ánimo y transtornos del sueño. Los
delirios son comunes, especialmente aquellos relacionados con temas
de persecución, por ejemplo, que las pertenencias fuera de lugar han
sido robadas. Las alucinaciones pueden ocurrir en todas las
modalidades sensoriales, pero las alucinaciones visuales son más
comunes. El delirio frecuentemente se superpone en la demencia
porque la enfermedad cerebral subyacente puede incrementar la
susceptibilidad a estados confusos que se pueden producir por las
medicaciones u otras condiciones médicas generales concurrentes.
Los individuos con demencia pueden ser especialmente vulnerables a
factores estresantes físicos, por ejemplo, enfermedad o cirugía
menor; y factores estresantes sicosociales, por ejemplo, ir al
hospital, pérdida de un pariente; que pueden exacerbar sus déficits
intelectuales y otros problemas asociados.
\vskip1.000000\baselineskip
Una discusión de hallazgos de laboratorio
asociados que son específicos a los tipos de demencia se incluyen
en el texto para cada demencia. Regularmente existen anormalidades
en el funcionamiento cognitivo y memoria, que se pueden evaluar
utilizando análisis y pruebas neurosicológicas. La neuroimagen puede
ayudar en el diagnóstico de demencia diferencial. La tomografía
computarizada (CT) o MRI puede revelar atrofia cerebral, lesiones
cerebrales focales (accidentes cerebro-vasculares
corticales, tumores, hematomas subdurales), lesión cerebral
isquémica periventricular o hidrocefalia. El diagnóstico por
imágenes funcional, tal como tomografía por emisión de positrones
(PET) o tomografía computarizada por emisión de fotones simple
(SPECT), no se utiliza rutinariamente en la evaluación de la
demencia, pero puede proporcionar información de diagnóstico
diferencial útil, por ejemplo, cambios de lóbulo parietal en AD o
alteraciones del lóbulo frontal en degeneraciones del lóbulo
frontal; en individuos sin evidencia de cambios estructurales en
barridos de CT o MRI.
\vskip1.000000\baselineskip
Los hallazgos de examen físico de demencia
asociados, dependen de la naturaleza, localización y etapa de
progresión de la patología subyacente. La causa más común de
demencia es AD, seguido por la enfermedad vascular y luego por
etiologías múltiples. Otras causas de demencia incluyen enfermedad
de Pick, hidrocefalia de presión normal, enfermedad de Parkinson,
enfermedad de Huntington, lesión cerebral traumático, tumores
cerebrales, anoxia, desórdenes infecciosos, por ejemplo, virus de
inmunodeficiencia humana (HIV), sífilis; enfermedades de prion, por
ejemplo, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob;
condiciones de endocrino, por ejemplo, hipotiroidismo,
hipercalcemia, hipoglicemia; deficiencias de vitaminas, por
ejemplo, deficiencias de tiamina, niacina, vitamina B12; desórdenes
inmunes, por ejemplo, polimialgia reumática, lupus eritematoso
sistémico; condiciones hepáticas, condiciones metabólicas, por
ejemplo, enfermedad de Kufs, adrenoleucodistrofia, leucodistrofia
metacromática y otras enfermedades por almacenamiento en la adultez
y la infancia; y otras condiciones neurológicas, por ejemplo,
esclerosis múltiple.
\vskip1.000000\baselineskip
A. El desarrollo de déficits cognitivos
múltiples manifestados por:
- (1)
- El deterioro de la memoria (capacidad deteriorada para aprender nueva información o recordar información aprendida previamente); y
- (2)
- uno (o más) de los siguientes transtornos cognitivos:
- (a)
- afasia (transtorno del lenguaje);
- (b)
- apraxia (capacidad deteriorada para llevar a cabo las actividades motoras a pesar de tener función motor intacta);
- (c)
- agnosia (falla para reconocer o identificar objetos a pesar de tener función sensorial intacta); y/o
- (d)
- transtorno en el funcionamiento ejecutivo, i.e., planificación, organización, realizar una secuencia, abstracción.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Los déficits cognitivos en el Criterio A1 y
A2, cada uno causa deterioro significante en el funcionamiento
social u ocupacional y representa una disminución significante a
partir de un nivel de funcionamiento previo.
C. El curso se caracteriza por un inicio gradual
y que continúa con el transtorno cognitivo.
D. Los déficits cognitivos en el Criterio A1 y
A2 no se deben a ninguna de las siguientes:
- (1)
- otras condiciones del sistema nervioso central que causan déficits progresivos en memoria y cognición, por ejemplo, enfermedad cerebro-vascular, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, hematoma subdural, hidrocefalia de presión normal, tumor cerebral;
- (2)
- condiciones sistémicas que son conocidas por causas demencia, por ejemplo, hipotiroidismo, vitamina B12 o deficiencia de ácido fólico, deficiencia de niacina, hipercalcemia, neurosífilis, infección de HIV; o
- (3)
- condiciones inducidas por sustancias.
\vskip1.000000\baselineskip
E. Los déficits no ocurren exclusivamente
durante el curso de un delirio.
F. El transtorno no se responsabiliza mejor por
otro transtorno del Eje I, por ejemplo, transtorno depresivo
principal o esquizofrenia.
\vskip1.000000\baselineskip
Con Inicio Prematuro - si el inicio es a
una edad de 65 años o menos:
290.11 Con Delirio: si el delirio es
sobrepuesto en la demencia.
290.12 Con Delirios: si los delirios son
la característica predominante.
290.13 Con Estado de ánimo Depresivo: si
el estado de ánimo depresivo (incluyendo presentaciones que
encuentran criterio de síntoma completo para un Episodio Depresivo
Principal) es la característica predominante. Un diagnóstico
separado del Desorden de Estado de ánimo Debido a una Condición
Médica General, no se da.
290.10 No complicado: si ninguno de los
anteriores predomina en la presentación clínica actual.
\vskip1.000000\baselineskip
Con Inicio Tardío - si el inicio es
después de los 65 años:
290.3 Con Delirio: si el delirio es
sobrepuesto en la demencia.
290.20 Con Delirios: si los delirios son
la característica predominante.
\newpage
290.21 Con Estado de ánimo Depresivo: si
el estado de ánimo depresivo (incluyendo presentaciones que
encuentran criterio de síntoma completo por un Episodio Depresivo
Principal), es la característica predominante. Un diagnóstico
separado de Desorden de Estado de ánimo Debido a una Condición
Médica General, no se da.
290.0 No complicado: si ninguno de los
anteriores predomina en la presentación clínica actual.
\vskip1.000000\baselineskip
Especificar si:
Ver "Diagnostic and Statistical Manual of
Mental Disorders", 4th Edition (DSM-IV), American
Psychiatric Association, Washington, DC (1994).
\vskip1.000000\baselineskip
El grado de severidad de los síntomas en
demencia se puede evaluar por un médico entrenado, mediante un
examen clínico. Para ayudar a esta evaluación y permitir una
puntuación estandarizada y medible, se puede utilizar una variedad
de escalas de evaluación clínica. Las escalas utilizadas comúnmente
por los médicos para evaluar la cognición incluyen, pero no se
limitan a, el Estado Mini-Mental, la Escala de
Valoración del Síntoma de la Demencia y el ADAS. La PDS - Escala de
Deterioro progresivo, ADCS-ADL, y DAD evalúan el
cumplimiento de actividades de vida diaria. El Inventario
Neurosiquiátrico (NPI) y BEHAVE-AD evalúan el
comportamiento. El CIBIC - PLUS y CGIC son las valoraciones de
funcionamiento global.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la investigación de AD y las potenciales
intervenciones terapéuticas y evaluaciones clínicas, una evaluación
estandarizada utilizada comúnmente que se puede utilizar para medir
específicamente la severidad de las disfunciones principales en
comportamientos cognitivo y no-cognitivo
característicos de víctimas de AD es la ADAS.
La ADAS dato-21 es una escala
basada en el cumplimiento, que incluye 11 datos para evaluar la
función cognitiva, por ejemplo, memoria y orientación
(ADAS-Cog), y 10 datos para evaluar función
no-cognitiva, por ejemplo, cambios del estado de
ánimo y del comportamiento (ADAS-Noncog) (Tabla 2).
Una puntuación entre 0 y 70 es posible en la parte cognitiva de la
escala, donde 0 significa que el paciente no hace ningún error en
absoluto y 70 significa el paciente tiene demencia profunda. En la
práctica, sin embargo, un individuo saludable probablemente
puntuará entre 5 y 10. La escala por consiguiente abarca claramente
el rango completo de cognitivo de normal a demente terminal. Ver
Rosen et al., Amer. J. Psych., Vol. 141, pp.
1356-1364 (1984).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los 11 datos cognitivos incluyen capacidad de
lenguaje hablado, comprensión de lenguaje hablado, recordar las
instrucciones de la prueba, dificultad para encontrar las palabras
en el discurso espontáneo, seguir los comandos, nombrar los objetos
y dedos, praxis construccional, praxis ideacional, orientación,
tareas para recordar palabras y tareas para el reconocimiento de
las palabras. Las tareas para recordar palabras se administran
primero y a continuación los siguientes 10 minutos se pasan en una
conversación abierta con el fin de evaluar los distintos aspectos
del lenguaje. A continuación se imparten las tareas cognitivas
restantes.
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Ejemplo
1
Se realizó, un estudio farmacogenético del
efecto de un genotipo ApoE \varepsilon4 de pacientes en la
respuesta a ChEI, rivastigmina. La rivastigmina tartrato es un
inhibidor de ambas AChE y BuChE y está comercialmente disponible
bajo la marca EXELON^{TM} de Novartis Pharmaceuticals Corporation,
East Hanover, NJ. Los individuos en la prueba se dividieron en
grupos de tratamiento dependiendo de la dosis que recibieron, a
saber <6 mg/día de rivastigmina, 6-12 mg/día de
rivastigmina y placebo. Cada grupo de tratamiento se analizó por
separado. Los individuos en cada grupo de tratamiento, luego se
clasificaron como portadores o no-portadores de ApoE
\varepsilon4 basados en los datos del genotipo. Una asociación
significante (P = 0.0071) entre los portadores de ApoE
\varepsilon4 y la mejora más grande de 4 puntos se encontró en el
grupo de 6-12 mg. En contraste, la asociación del
alelo \varepsilon4 de ApoE con no-deterioro en el
estudio no fue significante (P = 0.1172) en el mismo grupo. Una
respuesta al tratamiento se observó para el 65% de los portadores de
ApoE \varepsilon4, en comparación con el 48.7% de los
no-portadores de ApoE \varepsilon4 cuando se
tratan con una dosis de rivastigmina que es mayor de o igual a 6 mg
(Tabla 7).
El dato también se analizó para determinar si
existieron diferencias significantes entre los diferentes
tratamientos entre los portadores y no-portadores
de ApoE s4. Se encontraron, diferencias altamente significantes
entre los tres grupos de tratamiento en los portadores de ApoE
\varepsilon4 (ningún-deterioro P = 0.00000151,
4-puntos mejora P = 0.00000175), pero en los
no-portadores de ApoE \varepsilon4
(ningún-deterioro P = 0.1137,
4-puntos mejora P = 0.7916). Entre los
no-portadores de ApoE \varepsilon4 existe una
diferencia significante estadísticamente (P= 0.0434) indicando que
los no-portadores de ApoE \varepsilon4 responden
al tratamiento con rivastigmina, pero las velocidades de respuesta
no son tan dramáticas como en los portadores de ApoE \varepsilon4
(Tabla 6). No hubo tendencia (P = 0.7106) en la respuesta con el
criterio de mejora de 4-puntos para los
no-portadores de ApoE.
\newpage
La asociación del cambio a partir de la
puntuación referencia de ADAS-Cog con el alelo
\varepsilon4 de ApoE es significante (P = 0.0357) en el grupo de
6-12 mg. No se encontró asociación significante en
los otros grupos de tratamiento. El cambio promedio de la
referencia en la puntuación ADAS-Cog de los
individuos que llevan el alelo \varepsilon4 de ApoE es -1.72 en
comparación con 0.335 para los no-portadores de
\varepsilon4 cuando se tratan con \geq6 mg/día de rivastigmina.
Esto indica que los portadores de \varepsilon4 responden mejor al
tratamiento con rivastigmina.
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Las pruebas clínicas de Fase III ENA 713 B352 y
ENA 713 B351 son multicéntricas, doble-ciego,
placebo-controlado, estudio de grupo paralelo para
examinar el efecto de la rivastigmina en paciente no hospitalizado
con AD probable. Ambas pruebas se llevan a cabo durante un periodo
de 26 semanas. ENA 713 B351 tiene 4 grupos de tratamiento,
compuestos de 3 mg/día de rivastigmina, 6 mg/día de rivastigmina, 9
mg/día de rivastigmina o placebo. La fase inicial
dosis-titulación (semanas 1-12) se
continuo por una fase de dosis fija (Semanas 13-26),
para un periodo de tratamiento doble-ciego
aleatorio total de 26 semanas. ENA 713 B352 tiene 3 grupos de
tratamiento compuestos de 1-4 mg/día de
rivastigmina, 6-12 mg/día de rivastigmina, y
placebo. La fase inicial de dosis-titulación
(semanas 1-7) se continuo por una fase de dosis fija
(Semanas 8-26), por una periodo de tratamiento
doble-ciego, aleatorio total de 26 semanas. Las
muestras de sangre se trataron por el Roskamp Institute, University
of South
Florida.
Florida.
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El genotipado para los polimorfismos de ApoE se
llevó a cabo por el Roskamp Institute, University of South Florida.
El método de genotipado utilizado empleó PCR de una etapa, como se
describe en; Wenham PR, et al., Lancet. 1991 May 11;337
(8750):1158-9. Los polimorfismos de ApoE se resumen
en la Tabla 4.
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Los individuos en la prueba se clasificaron como
pacientes que responden si el cambio el final de sus puntuaciones
referencia de ADAS-COG es menor de o igual a -4
puntos. Un test Exacto de Fisher se utilizó, para encontrar una
asociación entre el genotipo ApoE y la respuesta.
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Los individuos en la prueba se clasificaron como
pacientes que responden si el cambio final de sus puntuaciones
referencia de ADAS-Cog es menor de o igual a 0
puntos. Un test Exacto de Fisher se utilizó para encontrar una
asociación entre el genotipo ApoE y la respuesta.
Las diferencias de tratamiento en los portadores
y no-portadores de ApoE \varepsilon4 también se
analizaron. Las diferencias de tratamiento se determinan como la
disminución de 4-puntos y las clases
sin-deterioro. Una prueba exacta
Cochran-Armitage para la tendencia se utiliza para
determinar si el número de pacientes que responde al tratamiento
incrementa con la dosis de rivastigmina entre cada grupo de
genotipo.
\newpage
La población de prueba se dividió en tres grupos
basándose en el tratamiento que reciben. Los tres grupos son
placebo, rivastigmina <6 mg/día y rivastigmina \geq6 mg/día.
Todos los análisis se llevaron a cabo dentro de cada grupo por
separado. Los datos del genotipo para ApoE se volvieron a codificar
para la presencia o ausencia del alelo \varepsilon4. Los datos
re-codificados del genotipo se utilizaron como la
variable categórica. Los valores re-codificados se
dan en la Tabla 5.
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Un modelo de análisis de varianza
no-paramétrico (ANOVA) se utilizó para el análisis.
El cambio de la referencia en la puntuación de
ADAS-Cog se utiliza como la variable
dependiente.
Como se utiliza aquí los términos
"\varepsilon2, \varepsilon3, y \varepsilon4" y "E2, E3,
y E4" respectivamente, se utilizan de forma intercambiable.
Además de los estudios de asociación realizados,
la representación demográfica (edad, sexo y raza) en la población
genotipo se analizó para comprobar si hay algún exceso o
representación baja de la población en los diferentes genotipos y
grupos de tratamiento, ver Tabla 11. También, se comprobaron las
diferencias, si las hubiere, en la demografía entre la población
genotipo y no-genotipo, ver Tabla 12.
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El resultado es altamente significante (P =
0.0071) en el grupo de mejora de 4-puntos, en el
grupo de tratamiento con una dosis de \geq6 mg/día de
rivastigmina, como se puede observar en la Tabla 6. No se observó
efecto significante del genotipo para el placebo o la rivastigmina
<6 mg/día de los grupos como se puede observar en la Tabla
6.
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\newpage
En el estudio sin-deterioro, el
genotipo (ApoE \varepsilon4 vs. sin-ApoE
\varepsilon4) no parece tener un efecto significante (P = 0.1172)
en la respuesta al tratamiento. No se observan efectos del genotipo
en la rivastigmina <6 mg/día y pacientes tratados con placebo,
como se observa en la Tabla 7.
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A partir de las Tablas 8 y 9, es evidente que
los portadores del alelo \varepsilon4 de ApoE muestran
velocidades de respuesta mucho más altas, especialmente cuando se
administra al menos 6 mg/día de rivastigmina. Esto es especialmente
verdadero en el criterio sin-deterioro. Por otra
parte, entre los no-portadores de ApoE
\varepsilon4 no tienen diferencias significantes entre los tres
grupos de tratamiento.
Una diferencia en la respuesta al tratamiento
como se mide por la mejora de 4-puntos en el
criterio de la escala ADAS-Cog, entre los
portadores de ApoE \varepsilon4, se encontró que es significante
(P = 0.00000175), como se muestra en la Tabla 8.
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Una diferencia en respuesta al tratamiento,
según se mide por el criterio sin-deterioro, entre
los portadores de ApoE\varepsilon4, también se encontró que es
muy significante (P = 0.00000151) como se muestra en la Tabla
9.
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El modelo ANOVA no-paramétrico
produjo un resultado significante (P = 0.0357) indicando que los
portadores del \varepsilon4 de ApoE responden mejor al
tratamiento con rivastigmina en comparación con los
no-portadores del alelo \varepsilon4 de ApoE,
cuando se tratan con una dosis diaria que es 6 mg/día o más alta.
Los resultados a partir del modelo ANOVA
no-paramétrico se dan en la Tabla 10.
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Como se puede observar a partir de la Tabla 10,
los portadores del alelo \varepsilon4 en el grupo de dosis de
\geq6 mg, tienen una reducción en su puntuación
ADAS-Cog (-1.74). Mientras que los
no-portadores de \varepsilon4, el cambio a partir
de la referencia es mínimo (0.39). El efecto del genotipo no se
observa en el grupo de dosis inferior o en el grupo placebo,
indicando que el efecto del genotipo es dependiente de la
dosificación de rivastigmina.
No existen diferencias significantes entre la
información demográfica entre las poblaciones genotipadas y las no
genotipadas como se observa en la Tabla 11. Las frecuencias de los
genotipos del \varepsilon4 del ApoE y su distribución entre
diferentes tratamientos, también se dan en la Tabla 12.
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Los fenotipos y genotipos de ApoE son bien
descritos y conocidos en el oficio. El sistema de nomenclatura
establecida así como los fenotipos y genotipos para ApoE, se
describen en, por ejemplo, Zannis et al., J. Lipid. Res.,
Vol. 23, p. 911 et seq. (1982), que se incorpora por
referencia aquí. Ver U.S. Patent No. 5,508,167.
La etapa de detección de la presencia o ausencia
de ApoE4 o de ADN que codifica dicha isoforma (incluyendo el número
de alelos para ApoE4) se puede llevar a cabo tanto directa como
indirectamente por cualquier medio apropiado. Una variedad de
técnicas se conoce por aquellos de habilidad en el oficio. Todos
generalmente involucran la etapa de recolectar una muestra de
material biológico que contiene tanto el ADN como ApoE del sujeto, y
a continuación la detección o no del sujeto que posee ApoE4 o ADN
que codifica tal isoforma a partir de esta muestra. Por ejemplo, la
etapa de detección se puede llevar a cabo mediante la recolección de
una muestra de ApoE a partir del sujeto (por ejemplo, de fluido
cerebroespinal, o cualquier otro fluido o tejido que contiene
ApoE), y entonces se determina la presencia o ausencia de una
isoforma de ApoE4 en la muestra de ApoE (por ejemplo, por
isoelectroenfoque o inmunoensayo).
El aislamiento y caracterización de ApoE se
describe, por ejemplo, en Rall et al., Methods in Enzymology,
Vol. 128, pp. 273-287 (1986); Davignon et
al., Arteriosclerosis, Vol. 8, pp. 1-21 (1988);
y Warnick et al., Clin. Chem., Vol. 25, pp.
279-284 (1979). El isoelectroenfoque es una técnica
electroforética, por la cual las moléculas se separan basándose en
sus puntos isoeléctricos (pI) a lo largo de un gradiente de pH
continuo. Las proteínas referencia, disponibles comercialmente (por
ejemplo, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), se utilizan para
indicar un gradiente a lo largo del cual las proteínas de muestra
coinciden de acuerdo con su pH cuando este coincide con su pI. En
Wamick et al. ApoEs de muy baja densidad se aíslan a partir
de las muestras de plasma y se aplica a los geles de
isoelectroenfoque y se obtienen los patrones de isoelectroenfoque
de las isoformas de ApoE. De acuerdo con el procedimiento de Wamick
et al., los valores pI de las isoformas de ApoE, E2, E3 y
E4, fueron aproximadamente 5.9, 6.0 y 6.1, respectivamente, en urea
8M a 4ºC. Ver también Pagnan et al., J. Lipid. Res., Vol.
18, pp. 613-622 (1977); y Utermann et al.,
FEBS Lett., Vol. 56, pp. 352-355 (1975).
\newpage
Varias técnicas del tipo de isoelectroenfoque,
también se proporcionan en Rall et al., supra,
incluyendo isoelectroenfoque analítico, tratamiento de cisteamina,
tratamiento de neuraminidasa, electroforesis en gel de dodecil
sulfato de sodio-poliacrilamida, así como análisis
de aminoácido y análisis de secuenciación de ácido nucleico, e
isoelectroenfoque capilar se describe en Swartz, Biotechnology, Vol.
12, pp. 408-409 (1994).
En la alternativa, la etapa de detección se
puede llevar a cabo, recolectando una muestra biológica que contiene
ADN a partir del sujeto, y entonces determinar la presencia o
ausencia de ADN que codifica una isoforma de ApoE4 en la muestra
biológica. Cualquier muestra biológica que contiene el ADN de este
sujeto se puede emplear, incluyendo muestras de tejido y muestras
de sangre, con células sanguíneas que son una fuente particularmente
conveniente. Las secuencias de aminoácido y secuencias de ácido
nucleico para ApoE2, ApoE3 y ApoE4 se conocen y describen. Ver, por
ejemplo, Paik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82,
pp. 3445-3449 (1985), incorporado aquí por
referencia, para la secuencia del ácido nucleico de ApoE3 y ApoE4; y
Mahley (1988), supra, para la información de la secuencia
del aminoácido.
La determinación de la presencia o ausencia de
ADN que codifica una isoforma de ApoE4 se puede llevar a cabo con
una sonda de oligonucleótido marcada con un grupo detectable
apropiado, o por medio de una reacción de amplificación, tal como
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o reacción en cadena
de la ligasa (LCR) (el producto del cual la reacción de
amplificación entonces puede ser detectada con una sonda marcada de
oligonucleótido o un número de otras técnicas). Adicionalmente, la
etapa de detección puede incluir la etapa de detección si el sujeto
es heterocigótico u homocigótico por el gen que codifica una
isoforma de ApoE4. Numerosos formatos de ensayo de diferentes
sondas de oligonucleótidos, se sabe que se pueden emplear para
llevar a cabo la presente invención. Ver, por ejemplo, U.S. Patent
No. 4,302,204 to Wahl et al.; U.S. Patent No. 4,358,535 to
Falkow et al.; U.S. Patent No. 4,563,419 to Ranki et
al.; y U.S. Patent No. 4,994,373 to Stavrianopoulos et
al.
La amplificación de una secuencia del ácido
nucleico seleccionada, o diana, se puede llevar a cabo por cualquier
medio apropiado. Ver, generalmente, Kwoh et al., Am.
Biotechnol. Lab., Vol. 8, pp. 14-25 (1990). Ejemplos
de técnicas de amplificación apropiadas incluyen, pero no se
limitan a, PCR, LCR, amplificación por desplazamiento de la hebra
(ver, generalmente, Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 89, pp. 392-396 (1992); y Walker et
al., Nuc. Acids Res., Vol. 20, pp. 1691-1696
(1992)); amplificación basada en la transcricpción (ver Kwoh et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp.
1173-1177 (1989)); replicación de secuencia
autosostenida (3SR) (ver Guatelli et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Vol. 87, pp. 1874-1878 (1990)); el sistema
Q.beta. replicasa (ver Lizardi et al., BioTechnology, Vol.
6, pp. 1197-1202 (1988)); amplificación basada en la
secuencia de ácido nucleico (NASBA) (ver Lewis, Genetic Engineering
News, Vol. 12, No. 9, p. 1 (1992)); la reacción en cadena de
reparación (RCR) (ver Lewis, supra); y amplificación de ADN
bumerang (BDA) (ver Lewis, supra). Se prefiere actualmente
la PCR.
Las técnicas de amplificación de ADN tales como
las anteriores pueden involucrar el uso de una sonda, un par de
sondas, o dos pares de sondas que se unen específicamente al ADN que
codifica ApoE4, pero no se une al ADN que codifica ApoE2 o ApoE3
bajo las mismas condiciones de hibridación, y que sirven como el
cebador o cebadores para la amplificación del ADN de ApoE4 o una
porción de estos en la reacción de amplificación (asimismo, se
puede utilizar una sonda, un par de sondas, o dos pares de sondas
que se unen específicamente al ADN que codifica ApoE2, pero no se
une al ADN que codifica ApoE3 o ApoE4 bajo las mismas condiciones de
hibridación, y que sirven como el cebador o cebadores para la
amplificación del ADN de ApoE2 o una porción de este, en la
reacción de amplificación; y se puede utilizar una sonda, un par de
sondas, o dos pares de sondas que se unen específicamente al ADN
que codifica ApoE3, pero no se une al ADN que codifica ApoE2 o ApoE4
bajo las mismas condiciones de hibridación, y que sirven como el
cebador o cebadores para la amplificación del ADN de ApoE3 o una
porción de este en la reacción de amplificación).
En general, una sonda de oligonucleótido que se
utiliza para detectar el ADN que codifica ApoE4 es una sonda de
oligonucleótido que se une al ADN que codifica ApoE4, pero no se une
al ADN que codifica ApoE2 o ApoE3 bajo las mismas condiciones de
hibridación. La sonda de oligonucleótido se marca con un grupo
detectable apropiado, tal como aquel publicado abajo en conexión
con anticuerpos. Así mismo, una sonda de oligonucleótido, que se
utiliza para detectar el ADN que codifica ApoE2 es una sonda de
oligonucleótido que se une al ADN que codifica ApoE2 pero no se une
al ADN que codifica ApoE3 o ApoE4 bajo las mismas condiciones de
hibridación, y una sonda de oligonucleótido que se utiliza para
detectar el ADN que codifica ApoE3 es una sonda de oligonucleótido
que se une al ADN que codifica ApoE3 pero no se une al ADN que
codifica ApoE2 o ApoE4 bajo las mismas condiciones de
hibridación.
La PCR se puede llevar a cabo de acuerdo con
técnicas conocidas. Ver, por ejemplo, U.S. Patent Nos. 4,683,195;
4,683,202; 4,800,159; y 4,965,188. En general, la PCR involucra, en
primer lugar, el tratamiento de una muestra de ácido nucleico (por
ejemplo, en la presencia de una polimerasa de ADN estable al calor)
con un cebador de oligonucleótido para cada hebra de la secuencia
específica que se detecta bajo las condiciones de hibridación, de
tal manera que un producto de extensión de cada cebador se
sintetiza, el cual es complementario a cada hebra de ácido
nucleico, con los cebadores suficientemente complementarios a cada
hebra de la secuencia específica para hibridizar con este, de tal
manera que el producto de extensión sintetizado a partir de cada
cebador, cuando se separa de su complemento, puede servir como una
plantilla para la síntesis del producto de extensión del otro
cebador, y luego el tratamiento de la muestra bajo condiciones de
desnaturalización para separar los productos de extensión del
cebador a partir de su plantillas si la secuencia o secuencias que
se detecta están presentes. Estas etapas se repiten cíclicamente
hasta que el grado de amplificación deseado se obtiene. La
detección de la secuencia amplificada se puede llevar a cabo,
adicionando al producto de reacción una sonda de oligonucleótido
capaz de hibridizar al producto de reacción, la sonda que lleva un
marcador detectable, y a continuación detectar el marcador de
acuerdo con técnicas conocidas, o por visualización directa en un
gel.
Cuando las condiciones de PCR permiten la
amplificación de todos los tipos alélicos de ApoE, los tipos se
pueden distinguir por hibridación con una sonda específica alélica,
por digestión de la endonucleasa de restricción, por electroforesis
en geles con gradiente de desnaturalización, u otras técnicas. Un
protocolo de PCR para determinar el genotipo ApoE se describe en
Wenham et al., The Lancet, Vol. 337, pp.
1158-1159 (1991). Ejemplos de cebadores efectivos
para la amplificación e identificación de las isoformas de ApoE se
describen en este. Los cebadores específicos para la región
polimórfica de ApoE (tanto ApoE4, E3 como E2) se pueden emplear. En
Wenham, por ejemplo, los cebadores de PCR que se emplean para
amplificar una región de ADN de 227 bp que abarca los sitios
polimórficos de ApoE (codones 112 y 158, que contienen los
nucleótidos 3745 y 3883). Los fragmentos amplificados, luego se
someten a la Cfol de la endonucleasa de restricción, que proporciona
diferentes fragmentos de restricción a partir de los seis posibles
genotipos de ApoE que pueden ser reconocibles en un gel de
electroforesis (ver, también, Hixon et al., J. Lipid Res.,
Vol. 31, pp. 545-548 (1990); Houlston et
al., Hum. Genet., Vol. 83, pp. 364-365 (1989);
Wenham et al., Clin. Chem., Vol. 37, pp.
241-244 (1991); y Konrula et al., Vol. 36,
pp. 2087-2092 (1990) para métodos adicionales.
Para un método particularmente preferido y
mejorado de genotipado de los polimorfismos de ApoE, mediante el
uso de un ensayo basado en PCR con el uso simultáneo de dos enzimas
de restricción distintas. Ver Zivelin et al., Clin. Chem.,
Vol. 43, No. 9, pp. 1657-1659 (1997).
La LCR también se realiza de acuerdo con
técnicas conocidas. Ver, por ejemplo, Weiss, Science, Vol. 254, p.
1292 (1991). En general, la reacción se lleva a cabo con dos pares
de sondas de oligonucleótido: un par se une a una hebra de la
secuencia que se detecta; el otro par se une a la otra hebra de la
secuencia que se detecta. Cada par juntos abarca completamente la
hebra a la cual esta corresponde. La reacción se lleva a cabo, en
primer lugar, por desnaturalización (por ejemplo, separación) las
hebras de la secuencia que se detectan, a continuación las hebras
se hacen reaccionar con los dos pares de sondas de oligonucleótido
en la presencia de una ligasa estable al calor de tal manera que
cada par de sondas de oligonucleótido se liga conjuntamente, luego
la separación del producto de reacción, y entonces se repite
cíclicamente el proceso hasta que la secuencia ha sido amplificada
al grado deseado. La detección entonces se puede realizar de la
misma manera como se ha descrito anteriormente en consideración a
PCR.
Se apreciará fácilmente, que las etapas de
detección descritas aquí, se pueden llevar a cabo tanto directa
como indirectamente. De esta manera, por ejemplo, si ya sea ApoE2 o
ApoE3 también se detectan en el sujeto, entonces se determina que
el sujeto no es homocigótico para ApoE4; y si ambos ApoE2 y ApoE3 se
detectan en el sujeto, entonces se determina que el sujeto no es
homocigótico ni heterocigótico para ApoE4. Otra manera para
determinar indirectamente el tipo alélico podría ser, midiendo los
marcadores polimórficos que se unen al alelo de ApoE, como se ha
demostrado por la VNTR (repeticiones tándem del número variable) y
los alelos de ApoB. Ver Decorter et al., ADN & Cell
Biology, Vol. 9, No. 6, pp. 461-469 (1990).
Como una alternativa al isoelectroenfoque y las
técnicas de detección de alelos, la etapa para determinar la
presencia o ausencia de la isoforma de ApoE4 en una muestra se puede
llevar a cabo por un ensayo de anticuerpo con un anticuerpo que
selectivamente se une a ApoE4, i.e., un anticuerpo que se une a
ApoE4, pero no muestra esencialmente un enlace a ApoE2 o ApoE3 en
las mismas condiciones de enlace. Cuando se desea determinar el
complemento preciso de ApoE de un paciente y si o no este paciente
es homocigótico o heterocigótico para ApoE4, entonces los
anticuerpos que se unen selectivamente a ApoE2 y ApoE3, también se
pueden emplear, i.e., un anticuerpo que se une a ApoE2, pero no
muestra esencialmente enlace a ApoE3 o ApoE4 en las mismas
condiciones de enlace; un anticuerpo que se une a ApoE3 pero no
muestra esencialmente enlace a ApoE2 o ApoE4 en las mismas
condiciones de enlace.
Los anticuerpos utilizados para unir selectiva o
específicamente ApoE2, ApoE3 y ApoE4 se pueden producir por
cualquier técnica apropiada. Por ejemplo, los anticuerpos
monoclonales se pueden producir en una línea celular de hibridoma
de acuerdo con las técnicas de Kohler and Milstein, Nature, Vol.
265, pp. 495-497 (1975). ApoE2, ApoE3 o ApoE4 se
puede obtener de un paciente humano determinado que es homocigótico
por consiguiente, a continuación se purifica por la técnica
descrita en Rall et al., Methods in Enzymol., Vol. 128, p.
273 (1986), y utilizado como el inmunógeno para la producción de
anticuerpos monoclonales o policlonales. Las isoformas de ApoE
purificadas se pueden producir por medio recombinante para expresar
una isoforma biológicamente activa, o aún un fragmento inmunogénico
de estos se puede utilizar como un inmunógeno. Los fragmentos Fab
monoclonales se pueden producir en Escherichia coli a partir
de las secuencias conocidas por técnicas recombinantes conocidas por
aquellos de habilidad en el oficio. Ver, por ejemplo, Huse,
Science, Vol. 246, pp. 1275-1281 (1989) (recombinant
Fab techniques); y Wenham et al., Lancet, Vol. 337, p. 1158
(1991) (ApoE cebadores de PCR). El ADN que codifica un subtipo de
ApoE se puede obtener y convertir en el otro por mutagénesis de
sitio-dirigido. Ver, por ejemplo, Kunkel et
al., Métodos in Enzymol., Vol. 154, pp. 367-382
(1987); y Kunkel, U.S. Patent No. 4,873,192.
El término "anticuerpos" tal como se
utiliza aquí, se refiere a todos los tipos de inmunoglobulinas,
incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Los anticuerpos pueden ser
monoclonales o policlonales y pueden ser de cualquier especie de
origen, incluyendo, por ejemplo, ratón, rata, conejo, caballo o
humano, o pueden ser anticuerpos quiméricos, e incluyen fragmentos
de anticuerpo, tales como por ejemplo, fragmentos Fab,
F(ab')2 y Fv, y los fragmentos correspondientes obtenidos de
anticuerpos diferentes de IgG.
Un anticuerpo unido selectiva o específicamente
a ApoE o una isoforma de ApoE particular (ligando) generalmente se
refiere a una molécula capaz de reaccionar con o de otra manera
reconociendo o uniendo dicho ligando. Un anticuerpo tiene afinidad
de enlace por un ligando o es específico para un ligando si el
anticuerpo se une o es capaz de unir el ligando como se mide o
determina por ensayos estándar anticuerpo-antígeno o
ligando-receptor, por ejemplo, ensayos
competitivos, ensayos de saturación, o inmunoensayos estándar, tales
como ELISA o RIA. Esta definición de especificidad se aplica a
cadenas pesadas y/o livianas solas, CDRs, proteínas de fusión o
fragmentos de cadenas pesadas y/o livianas, que son específicas para
el ligando si se unen al ligando solas o en combinación.
Los ensayos de anticuerpos (inmunoensayos)
pueden, en general, ser ensayos homogéneos o ensayos heterogéneos.
En un ensayo homogéneo la reacción inmunológica por lo general
involucra el anticuerpo específico, un analito marcado y la muestra
de interés. La señal que se origina del marcador se modifica,
directa o indirectamente, en la unión del anticuerpo con el analito
marcado. Ambas la reacción inmunológica y la detección de la
amplitud de estos se llevan en una solución homogénea. Los
marcadores inmunoquímicos que se pueden emplear incluyen radicales
libres, radioisótopos, colorantes fluorescentes, enzimas,
bacteriófagos, co-enzimas y así sucesivamente.
En un enfoque de ensayo heterogéneo, los
reactivos son por lo general la muestra, el anticuerpo y un sistema
o medio para producir una señal detectable. Las muestras similares
como se ha descrito anteriormente se pueden utilizar. El
anticuerpo, generalmente se inmoviliza sobre un soporte, tal como un
perla, placa o lámina, y se contacta con la muestra que se sospecha
contiene el antígeno en una fase líquida. El soporte entonces se
separa a partir de la fase líquida y ya sea la fase soporte o la
fase líquida se examina por una señal detectable que emplea medios
para producir dicha señal. La señal se relaciona con la presencia
del analito en la muestra. Los medios para producir una señal
detectable incluyen el uso de marcadores radioactivos, marcadores
fluorescentes, marcadores de enzimas y así sucesivamente. Por
ejemplo, si el antígeno que se detecta contiene un segundo sitio de
enlace, un anticuerpo que se une a este sitio, se puede conjugar a
un grupo detectable y se adiciona a la solución de reacción de fase
líquida antes de la etapa de separación. La presencia del grupo
detectable en el soporte sólido indica la presencia del antígeno en
la muestra de prueba. Ejemplos de inmunoensayos apropiados son los
métodos de radioinmunoensayo, inmunofluorescencia, inmunoensayo de
enzima ligada y similares.
Aquellos de habilidad en el oficio serán
familiares con numerosos formatos de inmunoensayo específicos y
variaciones de estos, que pueden ser útiles para llevar a cabo el
método revelado aquí. Ver, generalmente, Maggio,
Enzyme-Immunoassay, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL
(1980). Ver, también, U.S. Patent No. 4,727,022 to Skold et
al., "Methods for Modulating Ligand-Receptor
Interactions and their Application"; U.S. Patent No. 4,659,678 to
Forrest et al.; U.S. Patent No. 4,376,110 to David et
al.; U.S. Patent No. 4,275,149 to Litman et al.; U.S.
Patent No. 4,233,402 to Maggio et al.; y U.S. Patent. No.
4,230,767 to Boguslaski et al.
Los anticuerpos, que se unen selectivamente a
una isoforma ApoE, i.e., se unen a una de ApoE2, ApoE3 o ApoE4
mientras que muestra que esencialmente no se unen a la otros bajo
las mismas condiciones de enlace, se puede conjugar a un soporte
sólido apropiado para un ensayo de diagnóstico (por ejemplo, perlas,
placas, láminas o pozos formados de materiales, tales como látex o
poliestireno) de acuerdo con técnicas conocidas, tales como
precipitación. Los anticuerpos que unen una isoforma de ApoE pueden
igualmente ser conjugados con grupos detectables, tales como
radiomarcadores, por ejemplo, ^{35}S, ^{125}I, ^{131}I;
marcadores de enzimas, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante,
fosfatasa alcalina; y marcadores fluorescentes, por ejemplo,
fluoresceína; de acuerdo con técnicas
conocidas.
conocidas.
Los Kits para determinar la presencia o ausencia
de ApoE4, y por consiguiente la respuesta esperada al tratamiento
con los fármacos AchEI, incluirán al menos un reactivo específico
para la detección de la presencia o ausencia de ApoE4 y las
instrucciones de opciones de tratamiento recomendadas, basándose el
estado de ApoE4. El kit opcionalmente puede incluir un ácido
nucleico para la detección del gen de ApoE4. Preferiblemente el kit
puede comprender al menos dos ácidos nucleicos diferentes para la
detección del gen de ApoE4. El kit puede comprender al menos un
oligonucleótido genotipado específico del gen, para la detección de
la presencia o ausencia del alelo ApoE4. Preferiblemente, el kit
comprende dos oligonucleótidos genotipados específicos del gen. En
otra modalidad el kit puede comprender al menos una composición del
cebador genotipado específico del gen. La composición del cebador
preferiblemente comprende al menos un oligonucleótido genotipado
específico del gen. Más preferiblemente, la composición comprende
al menos dos conjuntos de pares de cebador específicos del alelo.
Los dos oligonucleótidos genotipados específicos del alelo, se
pueden empacar en recipientes separados.
El kit opcionalmente puede incluir las
instrucciones de métodos de isoelectroenfoque para la detección
de
ApoE4.
ApoE4.
Los kits de diagnóstico similares, para llevar a
cabo ensayos de anticuerpo se pueden producir de diferentes
maneras. En una modalidad, el kit de diagnóstico comprende: (a) un
anticuerpo que se une a ApoE2, ApoE3 o ApoE4 conjugado con un
soporte sólido; y (b) un segundo anticuerpo que se une a ApoE2,
ApoE3 o ApoE4 conjugado a un grupo detectable. Los reactivos,
también pueden incluir agentes complementarios tales como agentes
reguladores y agentes estabilizantes de proteína, por ejemplo,
polisacáridos y similares. El kit de diagnóstico puede además
incluir, cuando sea necesario, otros miembros del sistema de
producción de la señal de cuyo sistema el grupo detectable es un
miembro (por ejemplo, sustratos de enzima), agentes para reducir la
interferencia de fondo en una prueba, reactivos control, aparatos
para realizar una prueba y similares. Otro kit de análisis
comprende: (a) un anticuerpo como el anterior; y (b) un patrón de
enlace específico para el anticuerpo conjugado a un grupo
detectable. Los agentes complementarios como se ha descrito
anteriormente se pueden igualmente incluir. El kit de análisis se
puede empacar de cualquier manera apropiada, por lo general con
todos los elementos en un solo contenedor, junto con una hoja de
instrucciones impresas para llevar a cabo la prueba.
Un kit para utilizar en la determinación de una
estrategia de tratamiento para un paciente con demencia puede
comprender (a) un anticuerpo capaz de reconocer y unir al producto
de expresión del polipéptido del gen de ApoE4; (b) un contenedor
apropiado que contiene el anticuerpo y una muestra del fluido
corporal del individuo en donde el anticuerpo se puede poner en
contacto con el polipéptido de ApoE4, si está presente; (c) medio
para detectar la combinación de dicho anticuerpo con el polipéptido
de ApoE4; y (d) instrucciones para utilizar el kit.
Otro kit para utilizar en la estrategia del
tratamiento de determinación de un paciente con demencia comprende
(a) un polinucleótido capaz de reconocer y unir al producto de
expresión del mARN del gen de ApoE4; (b) un contenedor apropiado
que contiene el polinucleótido y una muestra de fluido corporal del
paciente en donde el citado polinucleótido se puede poner en
contacto con el mARN de ApoE4, si está presente; (c) medio para
detectar la combinación del citado polinucleótido con el mARN de
ApoE4; y (d) instrucciones para utilizar el kit.
Otro kit para utilizar en la estrategia de
tratamiento de determinación de un paciente con demencia que
comprende (a) un polinucleótido capaz de reconocer y unirse a
alguna porción de la secuencia de ADN del gen de ApoE4; (b) un
contenedor apropiado que contiene el polinucleótido y una muestra
del fluido corporal a partir del individuo en donde el
polinucleótido se puede poner en contacto con la secuencia de ADN de
ApoE4, si está presente; (c) medio para detectar la combinación del
citado polinucleótido con la secuencia de ADN de ApoE4; y (d)
instrucciones para utilizar el kit.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo inmunoquímico comprende opcionalmente
(pero preferiblemente) combinación de una muestra, tal como una
muestra sanguínea obtenida del sujeto con un agente reductor y, a
continuación, poner en contacto la muestra con un soporte sólido
que se une específicamente a grupos sulfidril reactivos, a
continuación separación de la muestra del soporte sólido; y luego
la detección por inmunoensayo: (i) la presencia o ausencia de ApoE
en dicha muestra, la presencia de ApoE4 en dicha muestra indica que
el sujeto tiene al menos un alelo para ApoE4, la ausencia de ApoE4
en dicha muestra indica que dicho sujeto no tiene alelos para ApoE4;
o (ii) la presencia o ausencia de ApoE inmovilizado en el soporte
sólido, la presencia de ApoE2 o ApoE3 inmovilizado en dicho soporte
sólido indica que dicho sujeto tiene uno o ningún alelo para ApoE4,
la ausencia de ApoE2 y ApoE3 inmovilizado en el soporte sólido
indica que dicho sujeto tiene dos alelos para ApoE4.
Cualquier muestra de material biológico que
contiene ApoE se puede utilizar, incluyendo pero no limitando a,
una muestra de fluido corporal. Por ejemplo, la muestra se puede
recolectar de sangre, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, fluido
cerebroespinal o cualquier otro fluido o tejido que contiene ApoE
del sujeto.
Será apreciado fácilmente, que las etapas de
detección descritas aquí se pueden llevar a cabo directa como
indirectamente. De esta manera, por ejemplo, si tanto ApoE2 como
ApoE3 también se detecta en el sujeto, entonces se determina que el
sujeto no es homocigótico para ApoE4; y si ambos ApoE2 y ApoE3 se
detectan en el sujeto, entonces se determina que el sujeto no es
homocigótico ni heterocigótico para ApoE4. Si tanto ApoE2 como ApoE3
están presentes, existe la posibilidad que el individuo sea
heterocigótico por ApoE4. La heterocigosidad para ApoE4 también se
indica si se determina que la cantidad de ApoE unida a la columna es
aproximadamente dos veces la cantidad eluida a partir de la
columna. Alternativamente, para hacer otras distinciones, el ensayo
se puede utilizar como una selección inicial y se combina con otro
ensayo capaz de distinguir entre ApoE2, ApoE3 y ApoE4, tal como un
inmunoensayo, isoelectroenfoque o análisis de PCR de ADN que
codifica ApoE2, ApoE3 y ApoE4.
Cualquier soporte sólido que se une
específicamente a los grupos sulfidril reactivos se puede emplear.
Por específico, se entiende que el soporte sólido se unirá
covalentemente a los grupos sulfidril en la presencia de grupos de
competición, tales como amino, hidroxilo y carboxilato. Estos
soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, soportes sólidos
que emplean química del tresilo (ver Nilsson, Métodos Enzymol., Vol.
63, p. 56 (1984)); geles activados que tienen piridil disulfuro
(ver Egoroy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, p.
171 (1975)); o fracciones ácido
ditio-5-nitrobenzoico que producen
enlaces disulfuro, y geles de agarosa TNB-tiol
(ácido
5-tio-2-nitrobenzoico)
(por ejemplo, Pierce product number 20409G, available from Pierce
Chemical Co., PO Box 117, Rockford, IL 61105). Los soportes sólidos
preferidos son aquellos representados por la fórmula
R-COCH_{2}X, en donde R es un sustrato sólido tal
como un gel y X es un halógeno, por ejemplo, Cl, Br, I,
preferiblemente I. Se prefiere particularmente el gel de
acoplamiento SULFOLINK.RTM.^{TM} disponible como números de
producto 44895G, 20405G, 20401 G, 20402G y 20403G de Pierce, PO Box
117, Rockford, IL 61105.
Cualquier agente capaz de reducir el enlace
disulfuro en residuos de cisteina a los correspondientes grupos
sulfidril reactivos, se puede utilizar como el agente reductor.
Preferiblemente el agente reductor es un tiol de peso molecular
inferior, más preferiblemente mercaptoetanol, ditiotreitol y
mercaptoetillamina. La reducción de los enlaces disulfuro en
cisteínas, por lo general se realizará en condiciones de
desnaturalización y levemente alcalinas, por ejemplo, urea 8M o
guanidina HCl 6M.
Una vez la muestra se ha puesto en contacto con
el soporte sólido, se separa del soporte sólido por cualquier
método conocido y, si se desea, se recolecta para otra prueba.
La etapa de inmunoensayo se lleva a cabo,
uniendo específicamente ApoE con un anticuerpo que se une
específicamente a ApoE. Los anticuerpos incluyen todos los tipos de
inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE producidos
por cualquier método conocido apropiado como se ha descrito
anteriormente.
Una ventaja de la técnica anterior es que no es
necesario emplear un anticuerpo, que se una específicamente a una
isoforma de ApoE, sin que se una a una o más de las otras isoformas.
Sin embargo, dicha isoforma-anticuerpo específico
se puede emplear si se desea. Los anticuerpos específicos para ApoE
se hacen y se conocen fácilmente.
Los inmunoensayos, en general, pueden ser
ensayos homogéneos o ensayos heterogéneos, como se ha descrito
anteriormente. Como también se ha descrito anteriormente, los
anticuerpos que se unen específicamente a ApoE se pueden conjugar
con un soporte sólido apropiado para un ensayo de diagnóstico (por
ejemplo, perlas, placas, láminas o pozos formados de materiales,
tales como látex o poliestireno) de acuerdo con técnicas conocidas,
y asimismo pueden ser conjugados con grupos detectables.
Los kits de diagnóstico, para llevar a cabo el
ensayo inmunoquímico, se pueden producir de diferentes maneras. El
kit puede comprender: (a) un soporte sólido que se une
específicamente a los grupos sulfidril reactivo; (b) un anticuerpo
que se une a ApoE2, ApoE3 y/o ApoE4; y (c), opcionalmente, un agente
reductor. Otro kit de diagnóstico puede comprender: (a) un
anticuerpo que se une a ApoE2, ApoE3 y/o ApoE4 conjugado con un
soporte sólido; y (b) un segundo anticuerpo que se une a ApoE2,
ApoE3 y/o ApoE4 conjugado con un grupo detectable.
Los reactivos también pueden incluir agentes
complementarios, tales como agentes reguladores y agentes
estabilizantes de proteína, por ejemplo, polisacáridos y similares.
El kit de diagnóstico puede además incluir, cuando sea necesario,
otros miembros del sistema productor de la señal de cuyo sistema, el
grupo detectable es un miembro (por ejemplo, sustratos de enzima),
agentes para reducir la interferencia de fondo en una prueba,
reactivos control, aparatos para realizar una prueba y similares.
Alternativamente un kit de análisis puede comprender: (a) un
anticuerpo como el anterior; y (b) un patrón de enlace específico
para el anticuerpo conjugado a un grupo detectable. Los agentes
complementarios como se ha descrito anteriormente se pueden
igualmente incluir. El kit de análisis se puede empacar de
cualquier manera apropiada, por lo general con todos los elementos
en un solo contenedor, junto con una hoja de instrucciones impresas
para llevar a cabo la prueba y la interpretación de los
resultados.
En resumen, la sangre se recoge y se deja
coagular, y se elimina el suero. Una alícuota de suero se coloca en
un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol o
\beta-mercaptoetanol) para reducir las cisteinas,
con lo que se producen los grupos sulfidril reactivos. El suero
reducido, luego se incuba con un soporte activado que reacciona
específicamente y cuantitativamente con los grupos sulfidril (un
ejemplo de este soporte es el gel de acoplamiento
SULFOLINK.RTM.^{TM} producido por Pierce Inc.). La incubación de
los sueros reducidos con este soporte activado, por consiguiente
unirá todas las moléculas de ApoE que contienen cisteina. Después
de la incubación, el suero que contiene las proteínas no unidas se
separa del soporte activado con sus proteínas unidas (ya sea por
sedimentación o por centrifugación). A continuación el suero se
analiza para la presencia o ausencia de ApoE, mediante un
anticuerpo específico para ApoE utilizando un formato de ELISA, con
uno de varios posibles esquemas de detección, por ejemplo,
colorimétrico. ApoE2 o ApoE3 se unen cuantitativamente al soporte
activado, y ninguna ApoE libre será detectada en el suero en el
ELISA. ApoE4 no se unirá al soporte activado, y por consiguiente
será detectada en el ensayo ELISA. Los sueros de un paciente de
ApoE4 homocigoto (que contiene solo la isoforma de ApoE4) tendrán
aproximadamente la misma cantidad de ApoE en el suero después de la
incubación con el soporte activado como antes de la incubación. Los
sueros de un paciente de ApoE4 heterocigoto (que contiene tanto
ApoE4 como otra isoforma de ApoE) tendrán aproximadamente la mitad
de ApoE detectada después de la incubación con el soporte activado
como antes de la
incubación.
incubación.
Ejemplos de análisis de genotipo específico se
muestran a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El análisis de genotipo para un paciente se
puede realizar utilizando ADN de peso molecular alto, o ARN
alternativamente, aislado de 5 mL de sangre total extraídos de cada
paciente. El genotipo ApoE se determinó utilizando un método de
extensión de cebador alelo-específico. Los cebadores
marcadores D, E, F, G y H se sintetizaron por Genosys Biotech (The
Woodland, Tex.) utilizando secuencias cebador proporcionadas en Main
et al., J. Lipid Res., Vol. 32, pp. 183-187
(1991). Las reacciones se realizaron en un volumen de 50 \muL que
contiene 1 \mug de ADN; desoxiadenosina trifosfato, deoxicitidina
trifosfato, deoxitimidina trifosfato y deoxiguanosina trifosfato,
cada 0.2 mmol/L; 10% de dimetil sulfoxido; 12.5 pmol de tanto el
cebador D, E, F como G; 25 pmol del cebador H; y 10 \muL de 10 x
solución reguladora de reacción de PCR (Vector Biosystem, Toronto,
ONT.). El ADN en la mezcla de reacción en primer lugar, se
desnaturalizó por 10 minutos a 96ºC y luego se enfrió a 4ºC. Una
unidad de Taq polimerasa (Vector Biosystem, Toronto, ONT.), luego se
adicionó a cada muestra. Cada muestra se volvió a calentar por 2
minutos a 96ºC y se somete a 30 ciclos en un termociclador con cada
ciclo que consiste de una segunda desnaturalización por 10 minutos
a 96ºC, segunda hibridación de 30 ciclos a 58ºC y extensión de
1-minuto a 65ºC. Los productos de reacción, se
visualizaron por electroforesis de 10 \muL de la mezcla de
reacción en un gel de agarosa al 1% que contiene solución reguladora
TPE (0.08 mol/L de Tris-fosfato, 0.002 mol/L EDTA,
Sigma, St-Louis, MO) y bromuro de etidio (0.15
\mug/mL) por 1 hora a 67v. Los geles luego se fotografiaron y el
perfil de las bandas se comparó con estándares conocidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Alternativamente, el fenotipo de ApoE se puede
determinar en un paciente utilizando una muestra de suero o fluido
cerebroespinal. Las proteínas se separan por tamaño sobre un gel de
poliacrilamida de SDS de 25 cm (10%) y se transfirieron sobre un
filtro de nitrocelulosa utilizando una célula
Trans-blot BIORAD® y la detección de la proteína de
ApoE se lleva a cabo utilizando un anticuerpo policlonal construido
contra la proteína de ApoE humana (International Immunology Corp.,
CA, Dil. 1:2000). Para controlar la especificidad del anticuerpo,
la adsorción del anticuerpo anti-ApoE con proteína
de ApoE humana purificada (MW 34-36 kDa) se realiza
si la detección de ApoE bloquea específicamente. Los marcadores de
peso molecular (Rainbowmarkers, Amersham) se corren en pozos
adyacentes, mientras la visualización de las bandas se hace con un
kit de detección de quimioluminescencia (Amersham, Cat. No. RPN
2100). La cuantificación de las señales autoradiográficas se
desarrolla utilizando un sistema de análisis de imágenes MCID
(Ste-Catherine, ONT.) equipado con el software de
análisis 1 D-gel (ver, Published U.S. Patent
Application No. US20020086290A1; U.S. Patent No. 6,391,553.
\vskip1.000000\baselineskip
El genotipado de ApoE también se puede lograr
por métodos generales para identificar SNPs. Muchas técnicas
diferentes se pueden utilizar para identificar y caracterizar SNPs,
incluyendo análisis de (SSCP) de polimorfismo de confirmacional de
ADN monocatenario, análisis heterodúplex por cromatografía líquida
de alto-rendimiento de desnaturalización (DHPLC),
secuenciación de ADN directa y métodos computacionales. Ver Shi,
Clin. Chem., Vol. 47, pp. 164-172 (2001). Gracias a
la riqueza de la información de la secuencia en bases de datos
públicos, se pueden utilizar herramientas computacionales para
identificar SNPs in silico mediante la alineación de secuencias
sometidas independientemente para un gen dado (ya sea secuencias de
cADN o genómica). Comparación de SNPs obtenidos experimentalmente y
por métodos in silico mostraron que el 55% de SNPs candidato
encontrado por
SNPFinder(http://lpgws.nci.nih.gov:82/perl/snp/snp_{-}cgi.pl)
también ha sido hallado experimentalmente. Ver Cox et al.,
Hum. Mutal., Vol.17, pp. 141-150 (2001). Sin
embargo, estos métodos in silico podrían solo encontrar el 27% de
SNPs verdaderos.
Los métodos de tipificación de SNP más comunes
actualmente, incluyen hibridación, extensión del cebador y métodos
de segmentación. Cada uno de estos métodos se debe conectar a un
sistema de detección apropiado. La tecnologías de detección
incluyen polarización fluorescente (ver Chan et al., Genome
Res., Vol. 9, pp. 492-499 (1999)); detección
luminométrica de liberación de pirofosfato (pirosecuenciación) (ver
Ahmadiian et al., Anal. Biochem., Vol. 280, pp,
103-110 (2000)); ensayos de segmentación basados en
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET),
DHPLC y espectrometría de masas (ver Shi, supra; y U.S.
Patent No. 6,300,076 B1)). Otros métodos de detección y
caracterización de SNPs son aquellos revelados en U.S. Patent Nos.
6,297,018 B1 y 6,300,063 B1.
En una modalidad, la detección de un
polimorfismo, se puede lograr por medio de la tecnología así llamada
INVADER^{TM} (disponible de Third Wave Technologies Inc. Madison,
WI). En este ensayo, un oligonucleótido "invasor" secuencia
arriba específico y una sonda secuencia abajo parcialmente
solapante, juntos forman una estructura específica cuando se unen a
la plantilla de ADN complementario. Esta estructura se reconoce y
corta un sitio específico, mediante la enzima Cleavase, y esto da
lugar a la liberación del 5' flap de la oligonucleótido de la
sonda. Este fragmento entonces sirve como el oligonucleótido
"invasor" con respecto a las dianas secundarias sintéticas y
sondas señal secundarias marcadas fluorescentemente, contenidas en
la mezcla de reacción. Esto da lugar a la división específica de
las sondas señal secundarias por la enzima Cleavase. La señal de
fluorescencia se genera, cuando esta sonda secundaria, marcadores
con moléculas colorantes capaces de transferir la de energía de
resonancia de fluorescencia, se divide. Las Cleavases tienen
requisitos rigurosos relativos a la estructura formada por las
secuencias de ADN solapante o flaps y, por consiguiente, pueden ser
utilizadas para detectar específicamente el par de base único
incongruente inmediatamente secuencia arriba del sitio de división
en la hebra de ADN secuencia abajo. Ver Ryan et al.,
Molecular Diagnosis, Vol. 4, No 2, pp. 135-144
(1999); y Lyamichev et al., Nature Biotechnol., Vol. 17, pp.
292-296 (1999). Ver también U.S. Patent Nos.
5,846,717 y 6,001,567.
Una composición puede contener dos o más
oligonucleótidos del genotipado marcados diferentemente, para probar
simultáneamente la identidad de los nucleótidos en dos o más sitios
polimórficos. También se contempla que la composición de los
cebadores puede contener dos o más conjuntos de pares del cebador
alelo-específico, para permitir la simultánea
dirección y amplificación de dos o más regiones que contienen un
sitio polimórfico.
Los oligonucleótidos genotipados de ApoE de la
invención, también se pueden inmovilizar o sintetizar sobre una
superficie sólida tal como un microchip, perla o lámina de vidrio
(ver, por ejemplo, WO 98/20020 y WO 98/20019). Tales
oligonucleótidos genotipados inmovilizados se pueden utilizar en una
variedad de ensayos de detección de polimorfismo incluyendo, pero
no limitando a, ensayos de hibridación de sonda y extensión de
polimerasa. Los oligonucleótidos genotipados de ApoE inmovilizados
pueden comprender un arreglo ordenado de oligonucleótidos diseñados
para seleccionar rápidamente una muestra de ADN por polimorfismos en
genes múltiples al mismo tiempo.
Un cebador de oligonucleótido de
alelo-específico tiene un nucleótido 3' terminal, o
preferiblemente un nucleótido 3' penúltimo, que es complementario a
solo un nucleótido de un SNP particular, con lo que actúa como un
cebador para la extensión polimerasa-mediado solo
si el alelo que contiene este nucleótido está presente. Los
cebadores de oligonucleótido de alelo-específico,
que hibridizan a tanto la hebra codificante como la
no-codificante se contemplan. Un cebador ASO para
la detección polimorfismos del gen de ApoE, se podría desarrollar
utilizando técnicas conocidas por aquellos de habilidad en el
oficio.
Otros oligonucleótidos del genotipado hibridizan
a una región diana localizada uno a varios nucleótidos secuencia
abajo, de uno de los sitios polimórficos novedosos identificados
aquí. Tales oligonucleótidos son útiles en métodos de extensión del
cebador mediado de polimerasa para la detección de uno de los
polimorfismos novedosos descritos aquí y por consiguiente tales
oligonucleótidos del genotipado se refieren aquí como
"oligonucleótidos de cebador-extensión".
Preferiblemente, el 3'-terminal de un
oligonucleótido de extensión de cebador es un desoxinucleótido
complementario con el nucleótido localizado inmediatamente adyacente
al sitio polimórfico.
Un kit puede comprender al menos dos
oligonucleótidos del genotipado empacado en recipientes separados.
El kit también puede contener otros componentes, tales como
solución reguladora de hibridación (donde los oligonucleótidos son
para ser utilizados como una sonda) empacada en un contenedor
separado. Alternativamente, cuando los oligonucleótidos se utilizan
para amplificar una región diana, el kit puede contener, empacadas
en recipientes separados, una polimerasa y una solución reguladora
de reacción optimizada por la extensión del cebador mediado por la
polimerasa, tal como PCR.
Las composiciones y kits de oligonucleótido
descritos anteriormente son útiles en métodos para genotipado y/o
haplotipado del gen de ApoE en un individuo. Como se utiliza aquí,
los términos "genotipo ApoE" y "haplotipo ApoE"
significan el genotipo o haplotipo que contiene el par o pares de
nucleótidos o el o los nucleótidos, respectivamente, que están
presentes en uno o más de los sitios polimórficos descritos aquí y
opcionalmente también pueden incluir el par de nucleótidos o
nucleótido presente en uno o más sitios polimórficos adicionales en
el gen ApoE. Los sitios polimórficos adicionales pueden ser
actualmente sitios polimórficos conocidos o sitios que
posteriormente se descubren.
Una modalidad del método de genotipado involucra
el aislamiento a partir de un individuo de una mezcla de ácido
nucleico que comprende las dos copias del gen ApoE, o un fragmento
de estos, que están presentes en el individuo, y determinación de
la identidad del par de nucleótidos en uno o más de los sitios
polimórficos, en las dos copias para asignar un genotipo ApoE para
el individuo. Como se puede entender fácilmente por el trabajador
cualificado, las dos "copias" de un gen en un individuo pueden
tener el mismo alelo o puede tener diferentes alelos. En una
modalidad particularmente preferida, el método de genotipado
comprende, determinar la identidad del par de nucleótidos en cada
sitio polimórfico.
Por lo general, la mezcla de ácido nucleico o
proteína se aísla de una muestra biológica incluyendo una muestra
de fluido corporal, tomada del individuo, tal como una muestra
sanguínea o muestra de tejido. Las muestras de tejido apropiadas
incluyen, pero no se limitan a; sangre total, semen, CSF, saliva,
lágrimas, orina, materia fecal, sudor, frotis bucal, piel y
biopsias de específicos tejidos de órgano, tales como músculo o
tejido nervioso y cabello. La mezcla de ácido nucleico se puede
constituir de ADN genómico, mARN o cADN y, en los últimos dos
casos, la muestra biológica debe ser obtenida de un órgano en el
cual el gen ApoE se expresa. Adicionalmente, se entenderá por el
trabajador cualificado que las preparaciones de mARN o cADN no se
deberían utilizar para detectar polimorfismos localizados en
intrones o en regiones 5' y 3' no-transcritas. Sí un
fragmento de gen ApoE se aísla, debe contener el sitio(s)
polimórfico(s) que es genotipado.
Una modalidad del método de haplotipado
comprende, aislar a partir del individuo de una molécula de ácido
nucleico que contiene solo una de las dos copias del gen ApoE, o un
fragmento de esta, que está presente en el individuo y determinar
en qué copia la identidad del nucleótido en uno o más de los sitios
polimórficos en esta copia para asignar un haplotipo ApoE al
individuo. El ácido nucleico puede ser aislado utilizando cualquier
método capaz de separar las dos copias del gen ApoE o fragmento,
incluyendo pero no limitando a, uno de los métodos descritos
anteriormente para preparar los isogenes de ApoE, con la clonación
in vivo dirigida siendo la metodología preferida.
Como se apreciará fácilmente por aquellos de
habilidad en el oficio, cualquier clon del individuo, proporcionará
solo la información de haplotipo sobre una de las dos copias del gen
ApoE presente en un individuo. Si la información del haplotipo se
desea, para la otra copia del individuo, se necesitará que se
examinen clones ApoE adicionales. Por lo general, al menos cinco
clones serían examinados por tener más de un 90% de probabilidad de
haplotipado de ambas copias del gen ApoE en un individuo. En una
modalidad particularmente preferida, el nucleótido en cada uno de
los sitios polimórficos se identifica.
En una modalidad preferida, un par de haplotipo
ApoE se determina para un individuo, identificando la secuencia de
nucleótidos por fases en uno o más de los sitios polimórficos en
cada copia del gen ApoE que está presente en el individuo. En una
modalidad particularmente preferida, el método de haplotipado
comprende la identificación de la secuencia de nucleótidos por
fases, en cada sitio polimórfico en cada copia del gen ApoE. Cuando
el haplotipado de ambas copias del gen, la etapa de identificación,
preferiblemente se desarrolla con cada copia del gen siendo
colocada en recipientes separados. Sin embargo, también se visualiza
que si las dos copias se marcan con diferentes etiquetas, o son de
otra manera por separado distinguibles o identificables, podría ser
posible en algunos casos, desarrollar el método en el mismo
contenedor. Por ejemplo, si la primera y segunda copia del gen se
marcan con diferentes primer y segundo colorante fluorescente,
respectivamente, y un marcador de oligonucleótido de
alelo-específico con incluso un tercer colorante
fluorescente diferente se utiliza para probar el sitio
polimórfico(s), entonces la detección de una combinación del
primer y tercer colorante debería identificar el polimorfismo en la
primera copia del gen mientras que la detección de una combinación
del segundo
\hbox{y tercer colorante debería identificar el
polimorfismo en la segunda copia del gen.}
En ambos métodos de genotipado y haplotipado, la
identidad de un nucleótido(s) (o par o pares de nucleótidos)
en un sitio(o) polimórfico(s) se puede determinar,
amplificando una región(s) diana que contiene el
sitio(s) polimórfico(s)
directamente de una o ambas copias del gen ApoE, o fragmento de este, y la secuencia de la(s) región(s) amplificada determinada por métodos convencionales. Será apreciado fácilmente por el trabajador cualificado que solo un nucleótido será detectado en cada sitio polimórfico en individuos que son homocigóticos en este sitio, mientras dos diferentes nucleótidos serán detectados si el individuo es heterocigótico para este sitio. El polimorfismo se puede identificar directamente, conocido como identificación de tipo positiva, o por inferencia, refiriéndose como identificación de tipo negativa. Por ejemplo, donde un SNP se conoce que es guanina y citosina en una población referencia, un sitio se puede determinar positivamente por ser tanto guanina como citosina para todos los individuos homocigóticos en este sitio, o ambas guanina y citosina, si el individuo es heterocigótico en este sitio. Alternativamente, el sitio se puede determinar negativamente por no ser guanina (y de esta manera citosina/citosina) o no citosina (y de esta manera guanina/guanina).
directamente de una o ambas copias del gen ApoE, o fragmento de este, y la secuencia de la(s) región(s) amplificada determinada por métodos convencionales. Será apreciado fácilmente por el trabajador cualificado que solo un nucleótido será detectado en cada sitio polimórfico en individuos que son homocigóticos en este sitio, mientras dos diferentes nucleótidos serán detectados si el individuo es heterocigótico para este sitio. El polimorfismo se puede identificar directamente, conocido como identificación de tipo positiva, o por inferencia, refiriéndose como identificación de tipo negativa. Por ejemplo, donde un SNP se conoce que es guanina y citosina en una población referencia, un sitio se puede determinar positivamente por ser tanto guanina como citosina para todos los individuos homocigóticos en este sitio, o ambas guanina y citosina, si el individuo es heterocigótico en este sitio. Alternativamente, el sitio se puede determinar negativamente por no ser guanina (y de esta manera citosina/citosina) o no citosina (y de esta manera guanina/guanina).
Además, la identidad del o los alelo(s)
presentes en cualquiera de los sitios polimórficos novedosos
descritos aquí, se puede determinar indirectamente por el
genotipado de un sitio polimórfico no revelado aquí, que está en
desequilibrio de ligamento con el sitio polimórfico que es de
interés. Se dice que dos sitios están en desequilibrio de ligamento
si la presencia de una variante particular en un sitio mejora la
predictibilidad de otra variante en el segundo sitio. Ver Stevens,
Mol. Diag., Vol. 4, pp. 309-317 (1999). Los sitios
polimórficos en desequilibrio de ligamento con los sitios
polimórficos revelados en el momento presente, se pueden localizar
en regiones del gen o en otras regiones genómicas no examinadas
aquí. El Genotipado de un sitio polimórfico en desequilibrio de
ligamento con los sitios polimórficos novedosos descritos aquí se
puede realizar mediante, pero no se limita a, cualquiera de los
métodos mencionados anteriormente para la detección de la identidad
del alelo en un sitio polimórfico.
La(s) región(s) diana, puede ser
amplificada utilizando cualquier método de amplificación dirigida de
oligonucleótido incluyendo, pero no limitando a, PCR (ver U.S.
Patent No. 4,965,188); LCR (ver Barany et al., Proc Natl.
Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 189-193 (1991); y WO
90/01069); y ensayo de unión de oligonucleótido (ver Landegren
et al., Science, Vol. 241, pp. 1077-1080
(1988)). Los oligonucleótidos útiles como cebadores o sondas, en
tales métodos deberían hibridizar específicamente a una región del
ácido nucleico que contiene o es adyacente al sitio polimórfico.
Por lo general, los oligonucleótidos tienen entre 10 y 35
nucleótidos de longitud y preferiblemente, entre 15 y 30
nucleótidos de longitud. La mayoría preferiblemente, de los
oligonucleótidos tienen 20-25 nucleótidos de largo.
La longitud exacta del oligonucleótido dependerá de muchos factores
que se consideran rutinarios y experimentados por el trabajador
cualificado.
Otros procedimientos de amplificación de ácido
nucleico conocidos, se pueden utilizar para amplificar la región
diana incluyendo sistemas de amplificación basados en la
transcripción (ver U.S. Patent Nos. 5,130,238 y 5,169,766; EP
329,822; y WO 89/06700); y métodos isotérmicos (ver Walker et
al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp.
392-396 (1992)).
Un polimorfismo(s) en la región diana,
también se puede analizar antes de o después de la amplificación
utilizando uno de varios métodos basados en la hibridación,
conocidos en el oficio. Por lo general, se utilizan oligonucleótidos
de alelo-específico para desarrollar dichos
métodos. Los oligonucleótidos de alelo-específico se
pueden utilizar como pares de sonda marcadas diferentemente, con un
miembro del par que muestra una correspondencia perfecta con una
variante de una secuencia diana y el otro miembro que muestra una
correspondencia perfecta con una variante diferente. En algunas
modalidades, más de un sitio polimórfico puede ser detectado de
inmediato utilizando un conjunto de oligonucleótidos de alelo
específico o pares de oligonucleótidos. Preferentemente, los
miembros del conjunto tienen temperaturas de fusión dentro de 5ºC y
más preferiblemente dentro de 2ºC, de unos a otros cuando se
hibridiza con cada uno de los sitios polimórficos que se
detecta.
La hibridación de un oligonucleótido
alelo-específico a un polinucleótido diana se puede
realizar con ambas entidades en solución o dicha hibridación se
puede realizar ya sea cuando el oligonucleótido o cuando el
polinucleótido diana se fija covalentemente o
no-covalentemente con un soporte sólido. El
acoplamiento se puede mediar, por ejemplo, por interacciones
anticuerpo-antígeno,
poly-L-Lys, estreptavidina o
avidina-biotina, puentes de sal, interacciones
hidrofóbicas, enlaces químicos, horneado para entrecruzamiento UV,
etc. Los oligonucleótidos alelo-específico se
pueden sintetizar directamente en el soporte sólido o acoplar al
soporte sólido posterior para la síntesis. Los soportes sólidos
apropiados para utilizar en los métodos de detección incluyen
sustratos hechos de silicio, vidrio, plástico, papel y similares,
que se pueden formar, por ejemplo, en pozos (como en placas de
96-pozos), láminas, hojas, membranas, fibras,
rodajas, platos y perlas. El soporte sólido puede ser tratados,
recubiertos o derivatizados para facilitar la inmovilización del
oligonucleótido alelo-específico o el ácido
nucleico diana.
El genotipo o haplotipo para el gen ApoE de un
individuo, también se puede determinar por hibridación de una
muestra de nucleico que contiene una o ambas copias del gen con
series y subseries de ácido nucleico, tal como se describe en WO
95/11995. La serie debería contener una batería de oligonucleótidos
de alelo-específico que representa cada uno de los
sitios polimórficos que se incluyen en el genotipo o haplotipo.
La identidad de polimorfismos también se puede
determinar utilizando una técnica de detección de discrepancia
incluyendo, pero no limitando a, el método de protección del RNase
utilizando ribosondas (ver Winter et al., Proc Natl. Acad.
Sci. USA, Vol. 82, p. 7575 (1985); y Meyers et al., Science,
Vol. 230, p. 1242 (1985)) y proteínas que reconocen el nucleótido
no emparejado, tal como la proteína E. coli mutS (ver
Modrich, Ann. Rev. Genet., Vol. 25, pp. 229-253
(1991)). Alternativamente, los alelos variantes se pueden
identificar por análisis SSCP (ver Orita et al., Genomics,
Vol. 5, pp. 874-879 (1989); y Humphries et
al., "Molecular Diagnosis of Genetic Diseases", Elles,
Ed., pp. 321-340 (1996)) o por electroforesis en gel
con gradiente de desnaturalización (ver Wartell et al.,
Nucl. Acids Res., Vol. 18, pp. 2699-2706 (1990); y
Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp.
232-236 (1989)).
Un método de extensión del cebador
polimerasa-mediado, también se puede utilizar para
identificar el polimorfismo(s). Varios de estos métodos han
sido descritos en la literatura de patentes y científica e incluyen
el método "Genetic Bit Analysis" (WO 92/15712) y el análisis
bit genético mediado por la ligasa/polimerasa. Ver U.S. Patent No.
5,679,524. Los métodos relacionados se revelan en WO 91/02087, WO
90/09455, WO 95/17676, U.S. Patent Nos. 5,302,509 y 5,945,283. Los
cebadores extendidos que contienen un polimorfismo se pueden
detectar por espectrometría de masas como se describe en U.S.
Patent No. 5,605,798. Otro método de extensión del cebador es PCR
de alelo-específico. Ver Ruafio et al., Nucl.
Acids Res., Vol. 17, p. 8392 (1989); Ruafio et al., Nucl.
Acids Res., Vol. 19, pp. 6877-6882 (1991); WO
93/22456; y Turki et al., J. Clin. Invest., Vol. 95, pp.
1635-1641 (1995). Además, múltiples sitios
polimórficos se pueden investigar por regiones múltiples de
amplificación simultánea del ácido nucleico utilizando conjuntos de
cebadores de alelo-específico como se describe en
Wallace et al., WO 89/10414.
En una modalidad preferida, los datos de
frecuencia de haplotipo por cada grupo etnogeográfico se examinan
para determinar si es consistente con equilibrio de
Hardy-Weinberg. El equilibrio de
Hardy-Weinberg (ver Hartl et al.,
"Principles of Population Genomics", Sinauer Associates,
Sunderland, MA, 3rd Edition (1997)) postula que la frecuencia del
hallazgo del haplotipo par H_{1}/H_{2} es igual a
P_{H-W} (H_{1}/H_{2}) =
2p(H_{1}) p (H_{2}) si H_{1}
\neqH_{2} y P_{H-W}
(H_{1}/H_{2}) = p(H_{1})
p(H_{2}) si H_{1} = H_{2}. Una
diferencia estadísticamente significante entre las frecuencias de
haplotipo observadas y esperadas podría deberse a uno o más factores
incluyendo endogamia significante en el grupo de población, la
presión selectiva fuerte en el gen, sesgo de muestreo, y/o errores
en el proceso de genotipado. Si las grandes desviaciones a partir
del equilibrio de Hardy-Weinberg se observan en un
grupo etnogeográfico, el número de individuos en este grupo se puede
aumentar para ver si la desviación se debe a un sesgo de muestreo.
Si un tamaño de muestra más grande no reduce la diferencia entre las
frecuencias par del haplotipo observadas y esperadas, entonces se
puede desear tener en consideración el haplotipado del individuo
utilizando un método directo de haplotipado, tal como, por ejemplo,
tecnología CLASPER SYSTEM^{TM} (U.S. Patent No. 5,866,404), SMD o
PCR de amplio rango de alelo-específico. Ver
Michalotos-Beloin et al., Nucl. Acids Res.,
Vol. 24, pp. 4841-4843 (1996).
En una modalidad de este método para pronosticar
un par de haplotipo ApoE, la etapa de asignación involucra el
desarrollo de los siguientes análisis. En primer lugar, cada uno de
los pares de haplotipo posibles es en comparación con los pares de
haplotipo en la población referencia. Generalmente, solo uno de los
pares de haplotipo en la población referencia corresponde a un
posible par de haplotipo y ese par se asigna al individuo.
Ocasionalmente, solo un haplotipo representado en los pares de
haplotipo referencia es consistente con un posible par de haplotipo
para un individuo, y en tales casos el individuo se le asigna un par
de haplotipo que contiene este haplotipo conocido y un nuevo
haplotipo derivado por la sustracción del haplotipo conocido a
partir del posible par de haplotipo. En casos raros, ninguno de los
haplotipos en la población referencia son consistentes con los
pares de haplotipo posibles, o alternativamente, múltiples pares de
haplotipo referencia son consistentes con los pares de haplotipo
posibles. En tales casos, el individuo preferiblemente se haplotipa
utilizando un método directo de haplotipado molecular, tal como, por
ejemplo, tecnología CLASPER SYSTEM^{TM} (U.S. Patent No.
5,866,404), SMD o PCR de amplio rango
alelo-específico. Ver
Michalotos-Beloin et al., supra).
\vskip1.000000\baselineskip
"Anticuerpos" tal como se utiliza
aquí, incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos
quimérico, humanizados y de cadena sencilla, así como fragmentos
Fab, incluyendo los productos de un Fab u otra biblioteca de
expresión de inmunoglobulina.
"Polinucleótido" generalmente se
refiere a cualquier poliribonucleotido (ARN) o
polidesoxribonucleotido (ADN), que puede ser ARN o ADN sin
modificar o modificado. "Polinucleótidos" incluyen, sin
limitation, ADN de cadena sencilla o doble, ADN que es una mezcla
de regiones de cadena sencilla o doble, ARN de cadena sencilla o
doble, y ARN que es una mezcla de regiones de cadena sencilla o
doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser
monocatenarios o, más usualmente, bicatenarios o una mezcla de
regiones de cadena sencilla o doble. Además, "polinucleótido"
se refiere a regiones de cadena triple que comprende ARN o ADN o
ambos ARN y ADN. El término "polinucleótido" también incluye
ADNs o ARNs que contienen una o más bases modificadas y ADNs o ARNs
con esqueletos modificados para la estabilidad o por otras
razones.
La presente invención no se limita en términos
de las modalidades particulares descritas en esta aplicación, las
cuales tienen la intención de ser solo ilustraciones de aspectos
individuales de la invención. Muchas modificaciones y variaciones
de esta invención se pueden hacer sin desviarse de su alcance, como
será aparente para aquellos de habilidad en el oficio.
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Claims (4)
1. Un método in vitro para determinar la
sensibilidad de un individuo con demencia al tratamiento con
Rivastigmina que comprende:
a) determinar, para cada una de las dos copias
del gen ApoE presente en el individuo, la naturaleza del genotipo
ApoE, en donde
b) si una o ambas de las dos copias del gen ApoE
presente en el individuo contiene el alelo \varepsilon4,
entonces el paciente se debería colocar en un grupo de pacientes de
respuesta buena; o
c) si ninguna de las dos copias del gen ApoE de
los pacientes contiene el alelo \varepsilon4, entonces el
paciente se coloca en un grupo de pacientes de respuesta pobre.
2. El método de la Reivindicación 1, en donde la
demencia se selecciona a partir del grupo que consiste de: demencia
vascular DAT (demencia del tipo de Alzheimer), demencia de cuerpos
de Lewy, demencia de la enfermedad de Parkinson, demencia del
Síndrome de Down y trastorno cognitivo leve.
3. El método de la Reivindicación 2, en donde la
demencia es DAT.
4. El método de la Reivindicación 2, en donde la
rivastigmina se utiliza a una dosis de 6 mg/día o más.
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