CN1681941A - 基于ApoE基因型治疗痴呆的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过ApoE基因分型指导AChEI药物包括雷司替明的使用以防止痴呆患者认知功能和行为问题恶化和/或改善认知功能和行为问题的方法。本发明还包括用于确定ApoE4状态和推荐的治疗策略的试剂盒。

Description

基于ApoE基因型治疗痴呆的方法
发明背景
发明领域
本发明属于药学和医学领域并提供了痴呆包括阿尔茨海默型痴呆(DAT)的治疗方法。具体地，本发明涉及使用基因组分析确定痴呆患者对胆碱酯酶抑制剂(ChEIs)治疗的响应性以及确定痴呆患者的最佳治疗策略的方法和试剂盒。
相关技术描述
痴呆是一组异质的和多原因的病状，其特征是发生多种认知缺陷，包括记忆损伤和至少一种下面的认知障碍：失语症、失用症、认识不能或执行机能障碍。阿尔茨海默病(AD)或DAT是老年人痴呆的主要原因并且是发达国家中死亡的第四位主要原因(排在心脏病、癌症和中风之后)。痴呆病例中高达70％是由于AD，血管疾病(中风、动脉粥样硬化症)是第二种最常见的原因。60多岁的人中AD的频率为约1％。该发病率约每5年翻番，在65岁为2％，70岁为4％，75岁为8％，80岁为16％，85岁为32％。见Forsyth，Phys.Ther.，78卷，1325-1331页(1998)；Evans等，JAMA，262卷，2551-2556页(1989)。据估计，90多岁的人群中多达2/3的人患有某种形式的痴呆。见Merritt，神经学教程，第6版，Lea & Febiger，484-489页，Philadelphia，PA(1979)；和Gilroy & Meyer，医学神经学，MacMillanPublishing Co.，175-179页(1979)。估计仅在美国就有4百万人患AD，每年耗费1000亿美元。见Schumock，J.Health Syst.Pharm.，55卷，52期，17-21页(1998)；和Hay & Ernst，Am.J.Public Health，77卷，1169-1175页(1987)。
此外，发现该疾病在较年轻的人群中的水平低得多，偶尔在约30岁的年龄开始，在儿童期末开始的情况甚至更稀少。见Adams & Victor，神经学原理，401-407页(1977)。
AD是不能治愈的。其在诊断后平均8年内导致死亡，最后3年通常在医院中度过。除了记忆丧失，AD患者还显示出显著的性格改变、迷向、身体协调性下降和不能照顾自己、日常生活活动(ADL)减少、进行性认知损伤、行为障碍即神志恍惚、激动、攻击行为；和精神病病征/症状，其包括但不限于精神异常、抑郁和焦虑。AD中主要的抑郁、精神异常和激动的平均率分别为8％、20％和20％。见Mayeux和Sano，NEJM，341卷，1670-1679页(1999)。
AD的遗传学
AD是痴呆的最常见类型，其特征是渐进性认知能力恶化。见Bayles，Semin.Speech Lang.，22卷，4期，251-259页(2001)；和Storey等，FrontBiosci.，7卷，E155-E184页(2002)。在过去十年内，在了解AD的发病机理方面已经取得了实质性的进步并且已经发现与AD相关的一些危险因素，包括遗传背景和年龄。见Tanzi等，Neuron.，32卷，2期，181-184页(2001)综述；Myers等，Curr.Opin.Neurol.，14卷，4期，433-440页(2001)综述；和Shastry，“阿尔茨海默病的分子和细胞生物学”，J.Hum.Genet.，46卷，11期，609-618页(2001)综述。
尽管AD的确切病因还不清楚，但是从一些重要的观察得到遗传影响的证据，这些观察为例如家族发病率、谱系分析、单卵双生和异卵双生研究和该疾病与唐氏综合征的相关性。对AD患者家族中发病率和传播模式的研究表明当与一般人群的成员相比时，患病个体的亲属患AD的危险增加。患有AD的单卵双生先证者的孪生兄弟(姐妹)中的一致率为40-60％，从而表明对该疾病的强烈但不是绝对的遗传影响。一般性综述见Baraitser，“The Genetics of Neurological Disorders”，第二版，85-88页(1990)。
已有四种基因与AD连锁。这些基因位于1、14、19和21号染色体中。21号染色体携带编码β-淀粉状蛋白前体即淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的基因。观察到活到成年期的唐氏综合征(三体21)个体中痴呆以高比例发生，并且在他们的尸检时存在AD样病理，在该观察之后克隆了淀粉状蛋白前体蛋白的基因。在具有早发作的家族性AD的家族中淀粉状蛋白前体蛋白基因中突变的随后发现表明β-淀粉状蛋白的过量产生与AD的一些病例相关。
通过使用早发作AD家族中的遗传连锁策略在1992年定位了14号染色体上的早衰蛋白(presenilin；PS1)基因。已经在白种人、德系犹太人、西班牙人和日本人家族中发现了该蛋白不同区域中的约25个不同突变。在评价了具有常染色体显性早发作性AD的几个大的伏尔加-德国人宗族后，发现另一基因早衰蛋白2(PS2)定位于1号染色体。具有PS1突变的患者具有特征性的早龄发作，为35岁到60岁之间。PS2突变几乎仅在伏尔加-德国人家族中发现。在门诊部遇到的大多数患者可能不是早衰蛋白突变试验的候选者，尽管PS1试验可通过商业途径得到。12号染色体可能含有与晚发作性AD相关的原因性突变并且现在正在研究中。
载脂蛋白E(ApoE)的作用
近年来，研究已经表明ApoE在AD的病理发生中起着潜在的作用。ApoE作为血浆脂蛋白的蛋白成分发挥着多种功能，包括其在胆固醇代谢中的作用。ApoE首先被鉴定为由肝脏合成的极低密度脂蛋白(VLDL)的组分，极低密度脂蛋白将甘油三酯从肝脏运输到外周组织。
患有晚发作性AD的患者中最重要的遗传信息来自ApoE基因的多态性分析。见Scarmeas等，Neurology，58卷，8期，1182-1188页(2002)。ApoE基因含有三种主要同种型：ApoE2、ApoE3和ApoE4，它们相互之间仅有一个氨基酸替代的差别。见Rosenberg，“阿尔茨海默病的分子和遗传基础：开始的结束：2000 Wartenberg讲座”，Neurology，54卷，11期，2045-2054页(2000)。
ApoE是参与胆固醇运输的一种血浆蛋白并且由19号染色体上的一个基因编码。其主要在肝脏中合成并且认为其参与神经系统损伤后的修复。ApoE基因型是AD易感性的一种重要作用因素但是也在一些其他神经变性疾病如拳击员痴呆中发现。三种常见等位基因E2、E3和E4相应于6种表型。ε4等位基因已经被鉴定为AD的危险因子，其可导致的危险估计为45-60％。E4纯合子比E4杂合子具有更大的危险。ApoE4存在于血小板并且可能促进脑中淀粉状蛋白的积累。
ApoE4等位基因与AD的较高危险性和更早发作的相关性可能是由于与其他同种型相比ApoE4等位基因对β-淀粉状蛋白的亲和性更高，这导致β-淀粉状蛋白的清除减弱。见Selkoe，“细胞生物学在阿尔茨海默病治疗进展中的应用”，Nature，399卷，Suppl.6738，A23-A31页(1999)综述。
ApoE以几种方式在脂蛋白代谢中起作用。见Mahley等，J.Lipid Res.，25卷，1277-1294页(1984)。它是几种细胞脂蛋白受体的识别位点，这些受体包括乳糜微粒和VLDL残粒的受体。见Hui等，J.Biol.Chem.，259卷，860-869页(1984)；和Shelburne等，J.Clin.Invest.，65卷，652-658页(1980)。
还描述了富含ApoE的脂蛋白在免疫系统中具有功能，其抑制体外和体内促细胞分裂素刺激或抗原刺激的淋巴细胞增殖。在卵巢中，ApoE抑制由LH-刺激的经培养膜和间质细胞的雄激素产生。见Dyer等，J.Biol.Chem.，263卷，10965页(1988)。
关于含有ApoE和ApoB的脂蛋白是淋巴细胞功能的重要调节子的其他证明来自对胎儿脐血血浆脂蛋白抑制性质的研究。见Curtiss等，J.Immunol.，133卷，1379页(1984)。在这些研究中建立了ApoE和抑制之间的直接相关性。
ApoE有三种主要的同种型，称为ApoE2、ApoE3和ApoE4，它们是单个基因座上的三种等位基因的产物。三种纯合表型(ApoE2/2、E3/3和E4/4)和三种杂合表型(ApoE3/2、E4/3和E4/2)来自三种等位基因的任何两种的表达。最常见的表型是ApoE3/3，最常见的等位基因是E3。见Mahley，Science，240卷，622-630页(1988)。
三种类型的氨基酸序列仅有微小不同。ApoE4和ApoE3的差异是ApoE4精氨酸代替了112位氨基酸残基处通常存在的半胱氨酸。ApoE2的最常见形式与ApoE3在158位残基处不同，其中半胱氨酸代替了通常存在的精氨酸。见Mahley(1988)，见上文。在如上描述的文献中详细描述和了解了Apo表型和基因型。关于ApoE的成熟命名系统以及表型和基因型在例如Zannis等，J.Lipid Res.，23卷，91l页(1982)以及下列等等中描述，该文献在这里被并入作为参考。
具有ApoE4/4基因型的受试者可能患AD的可能性是具有ApoE2/3或ApoE3/3基因型受试者的8倍。此外，AD发作的平均年龄和幸存的平均年龄在具有一个ApoE4等位基因的受试者中较低，在具有两个ApoE4等位基因的受试者中最低(见美国专利号5,508,167，其在这里被完整并入作为参考)。从而，如果受试者具有一个ApoE4等位基因，那么其AD预后更可能是不理想的，如果受试者具有一个以上的ApoE4等位基因，那么AD预后可能最不理想。不理想的预后可被认为更可能患该疾病，或者发作的年龄更早。
其他ApoE-连锁的疾病包括III型高脂血和动脉粥样硬化症。其他证据指出ApoE启动子中多态性也和AD增加的危险性相关。见Lambert等，Human Maol.Gen.，7卷，533页(1998)；和Lambert等，Human Mol.Gen.，7卷，1511页(1998)。
研究已经表明在来自对照患者和AD患者的死后脑脊液中都存在5-22kDa的ApoE片段。通过识别推定的毒性结构域的单克隆抗体进行免疫沉淀，产生的唯一主要带的表观分子量为约22kDa。该片段可能相当于主要ApoE凝血酶切割产物，已经显示该切割产物是蛋白酶抗性的。见Weisgraber等，J.Biol.Chem.，258卷，12348-54页(1983)。
人ApoE中氨基酸130-169包含一免疫调节结构域，其具有针对依赖白介素2的T细胞具有细胞抑制和细胞毒性活性。该发现和以前研究的结果一致，这些研究暗示ApoE的141-155位残基对促细胞分裂剂活化的幼稚(
Figure A0382125200101
)T细胞具有抗增殖作用。见Cardin等(1988)；和Dyer等(1991)。
痴呆的治疗
痴呆，包括AD的治疗是多形式的，根据每个个体而定并且随着疾病的发展进行调整。治疗可以分成三个范围：针对痴呆的特定病理生理进行的药学干预，如果可能，还进行施用改善特定症状如妄想和睡眠紊乱的药剂，以及行为干预，其可以改善特定症状并改善患者的日常生活活动。
AD的治疗目标是：(1)在症状方面—改善认知损伤的程度，包括注意力不足和执行机能失调、行为症状，和日常生活活动的行为；和/或(2)在改善疾病方面—延缓疾病的恶化并从而将独立的功能尽可能长地维持。
现今对AD的认知受损，唯一成功的药学治疗是ChEI药物。它们包括：他克林、多奈哌齐、雷司替明(rivastigmine)和加兰他敏。见Jacobsen，“阿尔茨海默病：当前和新出现的治疗策略综述”，Curr.Top.Med.Chem.，2卷，4期，343-352页(2002)；和Giacobini，Ann.N.Y.Acad.Sci.，920卷，321-327页(2000)综述。
用于AD治疗的ChEI在下面的表1给出。
表1.用于AD治疗的ChEI
    1    雷司替明(EXELONTM或ENA 713)
    2    他克林(COGNEXTM)
    3    多奈哌齐(ARICEPTTM)
    4    石杉碱甲
    5    敌百虫
    6    加兰他敏(REMINYLTM)
    7    毒扁豆碱
    8    依斯的明
    9    Ibedenone
    10   Zifrosilone
    11   Quilostigmine
ChEI是唯一已知的一类有效靶定疾病的病理生理的药剂并且通过增加乙酰胆碱水平起作用，已发现在AD患者的脑中乙酰胆碱水平降低。这些药物可以仅抑制乙酰胆碱酯酶或者可以抑制乙酰-ChE和丁酰-ChE。雷司替明有效抑制乙酰-ChE和丁酰-ChE并且该双重抑制可归因于该药物的特殊性质。
已经表明这些ChEI药物中的一些可有效改善AD患者认知缺陷的程度(例如通过如阿尔茨海默病评定标准(ADAS)评分测定)，而且还改善AD患者的神经精神障碍，如激动、神志恍惚、好战、冷漠和焦虑。此外，一些乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)药物能够延缓恶化进程并因此在一定时期稳定该疾病进程。这些药物所产生的在AD中见到的所有益处的准确机理还不完全清楚，但是似乎清楚它们不仅仅导致胆碱能神经传递的暂时增加。
通常，ChEI药物在具有胆碱能缺陷的痴呆患者中有效，该痴呆包括但不限于AD、具有卢伊体的痴呆、帕金森病以及痴呆。通常，这些药物应该在痴呆特别是AD的早期使用。
人脑含有ChE的两个主要类型：AChE和丁酰胆碱酯酶(BuChE)。AChE的主要作用是通过快速水解乙酰胆碱(ACh)终止胆碱能突触的脉冲传递。见Giacobini，如前。
直到最近，一直认为AChE是药物设计的主要靶标而BuChE对ACh水平的调节的相对贡献很大程度上被忽视。然而，越来越多的证据指出AChE和BuChE在ACh水平的调节中都起作用并且在AD的发展和恶化中也可能是重要的。见Greig等，Curr.Med.Res.Opin.，17卷，3期，159-165页(2001)。
尽管所有ChEI对AChE抑制具有共同的作用，但是雷司替明是AChE和BuChE的双重抑制剂并且已经显示出对AD患者的重要的和临床相关的益处。见Bar-On等，“胆碱酯酶与抗阿尔茨海默氏药物雷司替明相互作用的动力学和结构研究”，Biochem.，41卷，11期，3555-3564页(2002)。此外，还发现不响应或者不能耐受多奈哌齐(ARICEPTM)的患者当改用雷司替明治疗时，通常响应和/或耐受雷司替明的治疗。见Auriacombe等，CurrentMedical Research Opinion，18卷，129-138页(2002)。
尽管ChEI已经是成功的药物，但是仅有一部分AD患者从它们受益。见Burns等，Dement.Geriatr.Cogn.Disord.，10卷，3期，237-244页(1999)；和Rosler等，BMJ，318卷，7184期，633-638页(1999)。通常，至少1/3的患者对ChEI治疗根本不响应。从而，很需要建立一种方法事先预测患者可能响应该类药物以便避免将患者暴露于他们不能从中受益的药物方案。如果患者的遗传图谱可用于提供对ChEI治疗响应的预测，那么将具有重要的临床价值。然而，在过去ApoE基因型对ChEI响应的影响的研究已经得到了矛盾的结果。已经表明ApoE4表型是阴性预测者或者对AD患者用他克林治疗的功效没有影响。见Sjogren等，J.Neural.Transm.108卷，4期，451-458页(2001)；Farlow等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，802卷，101-110页(1996)；Farlow等，Neurology，50卷，3期，669-677页(1998)；Rigaud等，Eur.J.Neurol.，7卷，3期，255-258页(2000)；Poirier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92卷，26期，12260-12264页(1995)；和MacGowan等，Int.J.Geriatr.Psychiatry，13卷，9期，.625-630页(1998)。
还表明ApoE4表型对用加兰他敏治疗AD的功效没有影响。见Aerssens等，Geriatr.Cogn.Disord.，12卷，2期，69-77页(2001)；和Wilcock等，BMJ，321卷，7274期，1445-1449页(2000)。
所有ChEI都可导致副作用，如恶心、呕吐、腹泻、失眠、肌肉痉挛、疲劳和厌食。这些副作用可以从轻微的到严重的。此外，当服用这些药物时，不是所有AD患者都显示出改善或者甚至恶化速度的减慢。从而，需要确定治疗中哪些患者将响应ChEI，哪些患者将发生不利副作用的方法。
痴呆患者护理者最实际关心的问题之一是估计患者将来需要的护理水平。“护理水平”指使患者保持安全并使生活质量和健康最佳所需要的外在帮助和监控的程度和强度。
对痴呆患者护理水平的不同所产生的差异是巨大的。更高护理水平的花费也是非常大的。所述护理水平的范围可以为：从对于患有非常早且轻微疾病并且完全自主并独立生活的患者进行的最小护理水平，到增加强度的家庭护理，到处于个人限制和看护帮助强度的不同水平的住院治疗。在更严重的情况下，除了认知能力不断下降，通常还发生严重的行为问题。这些行为问题包括但不限于抑郁、攻击行为或反复的神志恍惚行为，以及在这些患者中经常发生的并发医学问题，这些行为问题可能需要在医学和/或精神病病房进行非常昂贵的住院治疗。
预期对于任何给定的患有痴呆的患者，所需要的护理水平将随着时间不断增加。这些变化的时间历程以数月到数年测定。然而，由于疾病过程自身的不同和最重要地，由于患者对于治疗，特别是ChEI治疗的响应不同，不能准确预测该渐进性增加的速度和性质。从而，除了上面所述之外，还需要预测或估计不远的将来，例如6个月、1年、3年或更长时间里患者所需要的护理水平的方法。这种预测将有助于安排最大化护理质量和最小化这种护理的花费。
发明概述
本发明通过提供基于ApoE基因型预测患有痴呆包括但不限于DAT的患者对ChEI药物治疗的响应性的方法，克服了上述问题。此外，本发明提供了预测不远的将来疾病的可能临床发病病程和因此该患者可能需要的护理水平的方法。此外，本发明提供了允许确定患者ApoE基因型的试剂盒并提供了上面的临床发病病程和护理水平预测。
从而，本发明的一个方面是防止患有痴呆包括但不限于DAT的患者中认知功能恶化的方法，对于患者中存在的ApoE基因两份拷贝中的每一份拷贝确定ApoE基因型的性质。如果患者中存在的ApoE基因两份拷贝中的一份或两份含有ε4等位基因，那么该患者用ChEI治疗，如选自表1中所示的一种药物或者雷司替明治疗，包括以6mg/天或更多雷司替明治疗。
本发明的另一方面是防止痴呆患者中行为问题恶化的方法，这些行为问题包括但不限于抑郁、精神异常、妄想、睡眠障碍、神志恍惚、大怒、攻击行为、激动、冷漠、焦虑、多疑、害怕和偏执狂，该方法包括：对于患者中所存在ApoE基因的两份拷贝中的每一份拷贝确定ApoE基因型的性质，其中如果患者中存在的ApoE基因的两份拷贝的一份或两份含有ε4等位基因，那么该患者用ChEI药物治疗。在本发明的另一方面，痴呆为DAT并且ChEI选自表1中所示组，包括用6mg/天或更多的雷司替明治疗。
本发明的另一方面是改善痴呆患者中认知能力损伤的方法，包括：对于患者中存在的ApoE基因的两份拷贝的每一份确定ApoE基因型的性质，其中如果患者中存在的ApoE基因的两份拷贝的一份或两份含有ε4等位基因，那么该患者用ChEI药物治疗。另一方面包括如下情况，其中痴呆为DAT并且ChEI选自表1中所示组，包括用6mg/天或更多的雷司替明治疗。
本发明的另一方面是对患有痴呆的患者认知能力损伤的改善多于4分(通过使用ADAS-Cog测定)的方法，包括：对于患者中存在的ApoE基因的两份拷贝的每一份确定ApoE基因型的性质，其中如果患者中存在的ApoE基因的两份拷贝的一份或两份含有ε4等位基因，那么该患者用ChEI药物治疗。另一方面包括如下情况，其中痴呆为DAT并且ChEI选自表1中所示组，包括用6mg/天或更多的雷司替明治疗。
本发明的再一方面是改善痴呆患者的行为问题的方法，这些行为问题包括但不限于抑郁、精神异常、妄想、睡眠障碍、神志恍惚、大怒、攻击行为、激动、冷漠、焦虑、多疑、害怕和偏执狂，该方法包括：对于患者中存在的ApoE基因的两份拷贝的每一份确定ApoE基因型的性质，其中如果患者中存在的ApoE基因的两份拷贝的一份或两份含有ε4等位基因，那么该患者用ChEI药物治疗。此外，患者可以用选自表1中所示列表中的ChEI治疗，包括用6mg/天或更多的雷司替明治疗。此外，痴呆类型可以包括但不限于DAT。
本发明的另一方面是确定痴呆个体对一种ChEI药物治疗的响应性的方法，包括：对于个体中存在的ApoE基因的两份拷贝的每一份确定ApoE基因型的性质，其中如果个体中存在的ApoE基因的两份拷贝的一份或两份含有ε4等位基因，那么该患者将被置于良好响应者组中；或者如果患者ApoE基因的两份拷贝都不含有ε4等位基因，那么该患者被置于不良响应者组申。在这方面，痴呆选自：DAT、血管性痴呆、卢伊体痴呆、帕金森病痴呆、唐氏综合征痴呆和轻度认知损伤。
本发明的另一方面是预测/估计痴呆患者在不远的将来所需要的护理水平的方法，包括：对于患者中存在的ApoE基因的两份拷贝的每一份确定ApoE基因型的性质，其中如果患者中存在的ApoE基因的两份拷贝的一份或两份含有ε4等位基因，那么该患者将被分类为“保持稳定或改善”不远的将来治疗组，其中预期ChEI药物治疗将稳定或改善患者症状并且该患者在不远的将来将不需要增加所需要的护理水平，如果患者中存在的ApoE基因的两份拷贝都不含有ε4等位基因，那么该患者将被归为“继续恶化”不远的将来治疗组，其中患者症状将可能表现恶化并且该患者在不远的将来将可能需要提高护理水平。本发明的该方面包括使用选自表1中所示组的药物，包括以6mg/天或更多的雷司替明治疗并且其中痴呆为DAT。
本发明的另一方面是确定存在或不存在ApoE4的试剂盒，其含有：至少一种特定用于检测ApoE4的存在与否的试剂；和基于ApoE4状态推荐治疗选择的使用说明书，所述试剂盒包括一种这样的试剂盒，其中试剂含有用于检测ApoE4基因的核酸。
本发明的另一方面是用于确定痴呆患者的治疗策略的试剂盒，其含有：能够识别和结合ApoE4基因的多肽表达产物的抗体和适于容纳所述抗体和来自所述个体的体液样品的容器，其中该抗体可以接触ApoE4多肽(如果存在)，和检测所述抗体与ApoE4多肽组合的方法和试剂盒的使用说明书。
本发明的另一方面是用于确定痴呆患者的治疗策略的试剂盒，该试剂盒含有能够识别和结合ApoE4基因的mRNA表达产物的多核苷酸和适于容纳所述多核苷酸和来自所述个体的体液样品的容器，其中如果存在ApoE4 mRNA，那么所述多核苷酸可以接触ApoE4 mRNA，和检测所述多肽与ApoE4多肽组合的方法和试剂盒的使用说明书。
本发明的再一方面是用于确定痴呆患者的治疗策略的试剂盒，其含有能够识别和结合ApoE4基因的某部分DNA序列的多核苷酸和适于容纳所述多核苷酸和来自所述个体的体液样品的容器，其中该多核苷酸可以接触ApoE4 DNA序列(如果存在)，和检测所述多核苷酸与ApoE4 DNA序列组合的方法和试剂盒的使用说明书。
附图简述
发明详述
本发明提供了确定哪些患有痴呆(包括但不限于AD)的患者将最可能响应ChEI药物(包括但不限于雷司替明)的治疗，从而症状组之一或两组中认知功能提高、行为问题改善或者临床恶化稳定的方法。如此处所用的术语“响应治疗”旨在包括预防性和保护性效果，借此疾病的症状或者被防止而不会发生或者一段时间内被防止恶化，以及此外已经出现的症状在强度、严重性或持续时间上得到改善或减少。
从而，本发明的一个方面是防止痴呆患者中认知缺陷和痴呆相关行为问题的发生或恶化的方法，该方法包括对患者中存在的ApoE基因的两份拷贝确定两个等位基因的性质。如果一个或两个基因携带ε4同种型等位基因，那么该患者将用ChEI治疗，包括用雷司替明以6mg/天或更大剂量治疗。预期用该剂量水平或更高剂量水平的雷司替明的治疗将延迟或防止AD患者中认知缺陷、日常生活活动和行为缺陷的恶化。
本发明的另一方面是改善AD患者中已经存在的认知缺陷和痴呆相关行为问题的方法，该方法包括对患者中存在的ApoE基因的两份拷贝确定两个等位基因的性质。如果一个或两个基因携带ε4同种型等位基因，那么该患者将用ChEI治疗，包括用雷司替明以6mg/天或更大剂量治疗。预期用该剂量水平或更高剂量水平的雷司替明的治疗将改善已经存在的痴呆相关症状，这些症状包括认知的、日常生活活动的和痴呆相关的行为缺陷和问题。
本发明的另一方面是事先确定患者将怎样响应ChEI的治疗，包括用雷司替明治疗，该方法包括对患者中存在的ApoE基因的两份拷贝确定两个等位基因的性质。如果一个或两个基因携带ε4同种型等位基因，那么该患者将被置于良好响应者组并预期将响应ChEI治疗，包括用雷司替明以6mg/天或更大剂量的治疗。如果ApoE基因的两份拷贝都不存在ε4等位基因，那么该患者被置于弱响应者组中。在实际治疗前确定患者对ChEI治疗的响应性在帮助临床医生提供患者的最佳治疗方案和使不利的副作用最小化方面具有价值。
本发明的另一方面是预测或估计不远的将来可能需要的对患有痴呆(包括但不限于AD)的患者的护理水平。如此处所用的，术语“不远的将来”将表示离评定日期至少26周，优选12个月，更优选24个月，最优选48个月。
将来护理水平的估计将以对患者中ApoE基因的两份拷贝确定两个等位基因的性质开始。如果一个或两个基因携带ε4等位基因，那么如果该患者用ChEI治疗，包括用6mg/天或更多雷司替明治疗，在不远的将来患者将可能在认知功能和行为问题中显示出较少恶化或者没有恶化或者改善。这种患者将被分类为“保持稳定或改善”不远的将来治疗组并且将较少可能需要在不远的将来增加护理水平。
如果患者ApoE4基因的两份拷贝都不携带ε4基因，那么该患者将被分类为“继续恶化”不远的将来治疗组。在该组中，预期患者将需要持续增加护理水平，需要护理者的更多关心，以及在不远的将来除了特定治疗之外更多的花费。该分类系统将允许提出对患者的安排并且将帮助优化护理和昂贵的护理者资源的利用。
如此处所用的，术语“以6mg/天或更多雷司替明治疗”将指通过任何方法在24小时内对患者施用6mg或更多摩尔当量的雷司替明酒石酸盐(EXELONTM)。雷司替明酒石酸盐(EXELONTM)可通过商业途径从NovartisPharmaceutical Corporation，East Hanover，NJ得到。雷司替明可以以单剂量施用或者可以细分为任何数目的单独更小剂量以在24小时内施用。雷司替明可以是将允许身体吸收的任何可药用形式，包括作为无机酸或有机酸的盐或者可以与任何可药用赋形剂组合或配制。可通过任何途径施用，这些途径包括但不限于作为水性溶液经口，或者通过速释或延释，或者缓释；口服药学制剂；肠胃外的，包括通过肌内、静脉内或鞘内途径；鼻内；直肠内；阴道内或通过透皮吸收或扩散，包括通过透皮贴剂(包括但不限于TRANS DERMAL SYSTEM PATCHTM)。
痴呆的诊断特征
在临床发现表明任何类似痴呆的过程，包括AD的患者中，这些症状的所有其他原因都应该被病史、检查和适宜的实验室研究排除。在某些类型的痴呆中，实验室研究可以非常有用。例如，评价脑脊液(CSF)的淀粉状蛋白和τ蛋白可以增加AD诊断的可能性，但是它们不够特异而不能成为AD的筛选和早期诊断的常规值。改进这些检验并联合定量磁共振成像(MRI)可最终允许早期的特异性检验。ApoE4等位基因的存在使得患者的痴呆非常可能由AD产生。ApoE4的存在也与血管性痴呆相关。
此处所用的术语“AD和DAT”指相同的疾病并且可互换使用。
所有类型的痴呆(包括但不限于AD)导致患者机能的渐进性恶化并导致持续恶化的行为问题，该持续恶化的行为问题与认知机能的恶化一致并且是该疾病过程的部分。痴呆患者所表现的典型行为问题包括但不限于抑郁、精神异常、妄想、睡眠障碍、神志恍惚、大怒、攻击行为、激动、冷漠、焦虑、多疑、害怕和偏执狂。在包括AD的痴呆的多数形式的最后阶段，受害者卧床不起、丧失对尿和肠的控制并且遭受癫痫侵袭。通常由于肺炎或尿道感染而死亡。
尽管例如AD的明确诊断需要尸检或活检时的组织检查，但是通过临床标准可以进行高准确性的诊断。AD的临床表现相当有特征，在疾病的早期发生记忆障碍；患者学习和记忆新东西有困难。空间和时间上的迷失也可能在早期发生，患者变得在熟悉的环境中迷失。随着疾病的恶化发生失语症、失用症和失算症，并且可能发生冷漠或偏执狂。患者经常有偷窃和配偶不忠的妄想。患者可能徘徊、踱步、反复打开并关闭抽屉、和重复相同的问题。睡-醒周期异常可能变得明显，例如患者可能在夜晚醒来但是认为是白天。日常生活活动在整个疾病过程中一直下降。患者失去自己吃和打扮的能力并且有穿衣的困难。在该疾病的末期阶段，患者在几乎所有智力方面表现出认知下降，运动异常变得明显并且发生尿和粪便失禁。
任何痴呆的基本特征是发生多认知缺陷，其包括记忆损伤和以下认知障碍中的至少一种：失语症、失用症、认识不能或执行机能障碍。认知缺陷必须足够严重才能导致职业或社会机能中的削弱并且可以代表以前较高机能水平的下降。
如果认知缺陷只在谵妄过程中发生，那么不应诊断为痴呆。然而，如果当不存在谵妄时存在痴呆，那么可以诊断为痴呆和谵妄。痴呆在病源上可和一般的医学疾病相关，和物质使用(包括毒素暴露)的持续作用有关，或者和这些因素的组合有关。
记忆损伤需要进行痴呆的诊断并且是显著的早期症状(标准A1)。患有痴呆的个体学习新内容的能力受损，或者他们忘记以前学到的内容。多数痴呆个体具有记忆受损的两种形式，尽管有时难以在疾病的早期证明失去了以前学习的内容。他们可能丢失贵重物品像钱包和钥匙，忘记在火炉上烹饪的食物，并且在不熟悉的地方迷路。在痴呆的晚期，记忆受损如此严重以致患者忘记他或她的职业、教育、生日、家庭成员和甚至有时是名字。
通过要求某人记录、保持、回想和识别信息可以正式地检查其记忆。通过要求个体学习一组单词评定学习新信息的能力。要求个体重复单词(记录)，延迟几分钟后回想信息(保持、回想)，和识别多个表的单词(识别)。对学习新信息有困难的个体不给予线索或提示，例如不给予多选问题的帮助，因为他们最初没有学会该内容。相反，具有原发性回想缺陷的个体可以受到线索和提示的帮助，因为他们的损伤在于获得他们的记忆的能力。通过要求患者回想个人信息或该个体认为有趣的一些过去的内容，例如政治、运动、娱乐来检验久远记忆。确定(从个体或病史申述者确定)记忆障碍对个体的机能例如工作、购物、烹调、付钱、不迷路回家这些能力的影响也是有用的。
语言功能的退化(失语症)可通过难以说出个体和物体的名字来表现(标准A2a)。患有失语症的个体的言语可变得模糊或空洞，没有长的委婉短语和过多使用不确定参考的术语，如“东西”和“它”。口语和书面语言的理解以及语言的重复也可受损。在痴呆的晚期，个体可能变哑或者具有恶化的言语模式，其特征是模仿言语，即模仿所听到的；或者重复言语，即再三重复声音或单词。通过要求个体说出室内物体，例如领带、衣服、桌子、灯；或者身体部分，例如鼻子、下巴、肩的名字；服从命令，例如“指向门然后指向桌子”；或者重复短语，例如，“无如果、和或但是”检查语言。
痴呆个体可显示出失用症，即执行运动活动的能力受损，尽管其具有完整的运动能力、感觉功能和所要求任务的理解能力(标准A2b)。他们以手势表达物品的用途(例如梳理头发)或者执行已知运动动作(例如挥手再见)的能力将受损。失用症可促成烹饪、穿衣和绘画中的不足。通过要求个体执行运动功能，例如显示怎样刷牙、复制相交的五边形、搭积木或以特定图案排列棍棒来检验运动技能障碍。
痴呆个体可表现出认识不能，即尽管具有完整的感观功能但是不能识别或鉴定物体(标准A2c)。例如，个体可能具有正常的视力但是丧失识别物体如椅子或铅笔的能力。最后他们可能不能识别家庭成员或者甚至他们自己在镜子中的映像。类似地，他们可能具有正常的触觉感觉，但是不能仅通过触觉鉴定放在他们手中的物体，例如硬币或钥匙。
执行机能中的障碍是痴呆的常见表现(标准A2d)并且可特别与额叶或相关皮层下途径的紊乱有关。执行机能涉及抽象思维和计划、发起、排序、监控和停止复杂行为的能力。抽象思维受损可表现为个体难以处理新任务和避免处理新的和复杂信息的情况。抽象能力可正式地通过要求个体发现相关单词的相似和不同之处进行评定。执行机能障碍还明显表现为转换心理定向(shift mental set)、产生新的语言或非语言信息以及执行连续运动活动的能力下降。
执行机能的试验包括要求个体数到10、背诵字母表、连续地减去7、在1分钟内陈述尽可能多的动物，或者画出由m和n交替组成的连续线。确定(来自个体和病史申述者)执行机能中的障碍对该个体的日常生活，例如工作、安排活动、预算的能力的影响也是有用的。
标准A1(记忆受损)和标准A2(失语症、失用症、认识不能或执行机能障碍)中的项目必须足够严重而导致社会或职业机能，例如上学、工作、购物、穿衣、沐浴、处理财政和日常生活的其他活动严重受损；并且必须代表以前机能水平的下降(标准B)。受损的性质和程度是多变的并且通常有赖于个体的特定社会地位。相同水平的认知受损可以严重损伤个体进行复杂工作但不是要求不高的工作的能力。测定身体保养例如个人卫生、智力机能和使用仪器或工具如电话、洗衣机的能力的标准化已出版的等级量表可用于测定受损的严重性。
如果这些症状仅在谵妄过程中发生，那么不诊断为痴呆。然而，谵妄可以叠合在已经存在的痴呆中，在这种情况下，应该给出两种诊断。
相关特征和病症
相关描述性特征和精神病症
痴呆个体可能变得空间上迷失反向并且对空间任务有困难。可以通过要求个体复制图画，如圆、重叠的五边形和立方体来评定视觉空间机能。判断不足和洞察力不足在痴呆中是常见的。个体可显示出几乎不知道或完全不知道记忆丧失或其他认知异常。他们可能对他们的能力作出不切实际的评定并作出与他们的不足和预后不一致的计划，例如开始新生意。他们可能低估与活动例如驾驶相关的危险。偶然地，他们可能变得暴力而伤害别人。可能发生自杀行为，尤其在早期，此时他们更能够执行行动计划。痴呆有时伴随着导致跌倒的步态运动障碍。
一些痴呆个体显示出解除抑制的行为，包括开不适宜的玩笑、忽视个人卫生、显示出对陌生人的过分熟悉，或者漠视社会行为的常规规则。在与皮层下病理相关的痴呆，如帕金森病、亨廷顿病和血管痴呆的一些病例中可能发生语言不清。痴呆的多认知损伤通常与焦虑、情绪和睡眠障碍相关。妄想是常见的，特别是与迫害主题相关的妄想，例如放错地方的财产已经被偷窃的妄想。幻觉可以以所有感观形式发生，但是视觉幻觉是最常见的。谵妄经常叠合在痴呆中，因为根本的脑疾病可增加对精神混乱状态的易感性，该精神混乱状态可由药物治疗或其他同时发生的常规医学疾病产生。痴呆个体对身体紧张性刺激例如疾病或小手术；以及心理紧张性刺激例如去医院、亲人丧亡特别脆弱，这些刺激可加重他们的智力不足和其他相关问题。
相关实验发现
在每种痴呆的正文中包括痴呆类型特定的相关实验发现的讨论。在认知和记忆机能中总是有异常，它们可使用精神状态检查和神经心理学试验评定。神经成像可有助于痴呆的差别诊断。计算机化轴向层面摄影法(CT)或MRI可揭示脑萎缩、病灶性脑损伤(皮质中风、肿瘤、硬膜下血肿)、脑积水或室周局部缺血性脑损伤。功能成像如正电子发射X射线断层照相术(PET)或单光子发射计算机化断层显相(SPECT)不常规地用于痴呆的评估，但是可以在CT或MRI扫描没有明显结构变化的个体中提供有用的差别诊断信息，例如，AD中顶叶变化或者额叶退化中额叶的变化。
相关体检发现和常见医学疾病
痴呆的相关体检发现取决于潜在病理的性质、位置和发展状态。痴呆的最常见病因是AD，然后是血管疾病，接着是多病因。痴呆的其他病因包括皮克病、常压脑积水、帕金森病、亨廷顿病、创伤性脑损伤、脑肿瘤、缺氧症、传染性疾病，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、梅毒；朊病毒疾病，例如克-雅综合征；内分泌疾病，例如甲状腺机能减退、血钙过多、低血糖；维生素不足，例如硫胺素、烟酸、维生素B12的不足；免疫疾病，例如风湿性多肌痛、系统性红斑狼疮；肝疾病、代谢疾病，例如库夫斯病、脑白质肾上腺萎缩症、异染性脑白质病变、和成人期和儿童期的其他积贮病；和其他神经学疾病，例如多发性硬化。
DAT的诊断标准
A.多认知缺陷的发展的表现为：
(1)记忆损伤(学习新信息或回忆以前学过的信息的能力受损)；和
(2)一种(或多种)下面的认知障碍：
(a)失语症(语言障碍)；
(b)失用症(尽管有完整的运动功能，但是执行运动活动的能力受损)；
(c)认识不能(不能识别或鉴定物体，尽管有完整的感觉功能)；和/或
(d)执行机能(即计划、组织、排序、抽象)障碍。
B.标准A1和A2中的认知缺陷每一种都导致社会和职业机能的严重损伤并代表以前机能水平的显著下降。
C.该过程的特征是逐渐发作和持续的认知下降。
D.标准A1和A2中的认知缺陷不是由于下面的任一项：
(1)导致记忆和认知进行性不足的其他中枢神经系统疾病，例如脑血管疾病、帕金森病、亨廷顿病、硬脑膜下血肿、常压脑积水、脑肿瘤；
(2)已知导致痴呆的全身疾病，例如甲状腺机能减退、维生素B12或叶酸缺乏、烟酸缺乏、血钙过多、神经梅毒、HIV感染；或者
(3)物质诱发的疾病。
E.不足不仅仅在谵妄过程中发生。
F.该障碍不能由另一Axis I疾病例如主要的抑郁症或精神分裂症更好地解释。
DAT的代号(基于发作类型和主要特征)
早发作—如果发作在65岁或65岁以下：
290.11有谵妄：如果谵妄叠合在痴呆中。
290.12有妄想：如果妄想是显性特征。
290.13有抑郁的情绪：如果抑郁情绪(包括表现出满足重型抑郁事件的全部症状标准)是显性特征。没有给出由于常规医学疾病所致情绪症状的单独诊断。
290.10简单的：如果在当前的临床表现中没有一种上述情况。
晚发作—如果发作在65岁以后：
290.3有谵妄：如果谵妄叠合在痴呆中。
290.20有妄想：如果妄想是显性特征。
290.21有抑郁的情绪：如果抑郁情绪(包括表现出满足重型抑郁事件的全部症状标准)是显性特征。没有给出由于常规医学疾病所致情绪症状的单独诊断。
290.0简单的：如果在当前的临床表现中没有一种上述情况。
说明：如果有行为障碍，见“精神症状的诊断和统计手册”第四版(DSM-IV)，美国精神病学协会，华盛顿，DC(1994)。
痴呆严重性的评定
由受过训练的临床医生通过临床检查可以评定痴呆中症状的严重程度。为了帮助该评定和允许标准化的和可测定的评分，可以使用许多临床评定等级量表。临床医生评定认知力常用的等级量表包括但不限于简易智能状态(Mini-Mental Status)、痴呆症状评定等级量表(Dementia SymptomAssessment Scale)和ADAS。PDS(即进行性恶化等级量表)、ADCS-ADL和DAD评定日常生活活动的执行情况。神经心理学调查表(Neuropsychiatric Inventory，NPI)和BEHAVE-AD评定行为。CIBIC-PLUS和CGIC评定总的机能。
ADAS
对于AD和潜在治疗性干预和临床评价研究，通常使用的标准化评估是ADAS，其可特异地用于测定AD患者特征性的认知和非认知行为中主要机能不良的严重性。
21项的ADAS是基于执行的等级量表，其包括11项用于评估认知功能例如记忆和方向(ADAS-Cog)和10项用于评估非认知功能例如情绪状态和行为变化(ADAS-Noncog)(表2)。在该等级量表的认知部分可能有0到70的评分，其中0表示患者根本没有犯错，70表示患者高度精神错乱。然而实践中健康个体将通常得5到10分。因此，显然该等级量表横跨正常到极端精神错乱的全部范围。见Rosen等，Amer.J.Psych.，141卷，1356-1364页(1984)。
表2：ADAS的结构
症状范围   项目数   得分数
认知总共有记忆方向语言实践非认知总共有     11315210     70278251050
11个认知项包括口语能力、口语的理解、试验指令的回忆、自发言语中的单词发现困难、跟随指令、命名物体和手指、构造实践、构思实践、定向、单词回忆任务和单词识别任务。首先执行单词回忆任务然后接下来的10分钟花在自由回答的交谈上以便评估语言的各种其他方面。然后进行剩下的认知任务。
表3：ADAS项目特征
最大可能得分
ADAS-Cog(ADAS的认知部分)
    单词回忆定向构思实践绘画指令命名单词识别测试指令的回忆表达语言语言理解单词发现困难     1085555125555
 ADAS-Noncog(ADAS的非认知部分)
    颤抖步测运动烦躁含泪抑郁妄想幻觉食欲专心不合作     5555555555
实施例1
进行了患者ApoE ε4基因型在ChEI-雷司替明响应方面产生影响的药物遗传学研究。雷司替明酒石酸盐是AChE和BuChE两者的抑制剂并且可通过商业途径以名称EXELONTM从Novartis PharmaceuticalsCorporation(East Hanover，NJ)得到。试验中的个体根据他们所接受的剂量，即＜6mg/天雷司替明、6-12mg/天雷司替明和安慰剂，分成治疗组。每个治疗组单独分析。每个治疗组中的个体然后基于基因型数据分类为ApoEε4携带者或非携带者。在6-12mg组中发现ApoE ε4携带者与提高多于4分之间的显著相关性(P＝0.0071)。相反，在该相同组中ApoE ε4等位基因与研究中无恶化的相关性不显著(P＝0.1172)。当用剂量大于或等于6mg的雷司替明治疗时，在65％的ApoE ε4携带者中观察到治疗响应，而非ApoE ε4携带者中为48.7％(表7)。
还分析了该数据以确定ApoE ε4携带者和非携带者中不同的治疗之间是否存在显著差异。在ApoE ε4携带者中发现三个治疗组中的高度显著性差异(无恶化P＝0.00000151，提高4分P＝0.00000175)，但在非ApoEε4携带者中没有发现(无恶化P＝0.1137，提高4分P＝0.7916)。在非ApoEε4携带者中有统计学上显著的差异(P＝0.0434)，指出非ApoE ε4携带者响应雷司替明治疗，但是响应率不如ApoE ε4携带者显著(表6)。使用提高4分的标准，非ApoE ε4携带者没有响应趋势(P＝0.7106)。
在6-12mg组中基线ADAS-Cog得分的变化与ApoE ε4等位基因的相关性是显著的(P＝0.0357)。在其他治疗组中没有发现显著相关性。当用≥6mg/天的雷司替明处理时，携带ApoE ε4等位基因的个体的ADAS-Cog得分中自基线的平均变化为-1.72，而非ε4携带者为0.335。这指出ε4携带者是雷司替明治疗的更好响应者。
方法
样品
III期临床试验ENA 713 B352和ENA 713 B351是多中心、双盲、安慰剂对照的、平行组研究，用于检查可能患有AD的门诊患者中雷司替明的效果。两个试验都在26周的期间内进行。ENA 713 B351有四种治疗方式，包括雷司替明3mg/天、雷司替明6mg/天、雷司替明9mg/天或安慰剂。最初的剂量调整期(1-12周)后为固定的剂量期(13-26周)，总的随机双盲治疗期间为26周。ENA 713 B352有3种治疗方式，包括雷司替明1-4mg/天、雷司替明6-12mg/天和安慰剂。最初的剂量调整期(1-7周)后为固定的剂量期(8-26周)，总的随机双盲治疗期间为26周。血样由University ofSouth Florida的Roskamp Institute处理。
基因分型
由Roskamp Institute，University of South Florida进行ApoE多态性的基因分型。所用的基因分型方法使用如在Wenham PR等，Lancet.1991年5月11日；337(8750)：1158-9中描述的一步PCR。ApoE的多态性概述于表4中。
表4.基于ApoE序列中氨基酸变化的ApoE基因型分类
    ApoE分类   氨基酸位置112   氨基酸位置158
    ε2ε3ε4     CysCysArg     CysArgArg
统计分析
响应中提高4分
如果试验中个体的基线ADAS-COG得分大于或等于4分，那么这些个体被分类为响应者。使用Fisher精确检验发现ApoE基因型和响应之间的相关性。
在ADAS-Cog中无恶化
如果试验中个体的基线ADAS-Cog得分小于或等于0分，那么这些个体被分类为响应者。使用Fisher精确检验发现ApoE基因型和响应之间的相关性。
分析了ApoE ε4和非ApoE ε4携带者中的治疗差异。治疗差异被测定为减少4分和非恶化类。使用趋势的精确Cochran-Armitage检验确定每个基因型组中是否响应者人数随着雷司替明的剂量增加。
试验群体基于他们接受的治疗被分成3组。这三组是安慰剂、雷司替明＜6mg/天和雷司替明≥6mg/天。所有分析都在每组中单独进行。对ε4等位基因的存在或不存在重新编排ApoE的基因型数据。重新编排的基因型数据用作分类变量。重新编排的值在表5中给出。
表5.ApoE基因型的重新分类
    ApoE基因型     重新编排的基因型
    ε2/ε3ε3/ε3     非-ε4携带者
    ε2/ε4ε3/ε4ε4/ε4 ε4携带者
方差的非参数分析(ANOVA)模型用于分析。ADAS-Cog评分中自基线的变化用作非独立变量。
分别如此处所用的术语“ε2、ε3、ε4”和“E2、E3、E4”可互换使用。
除了所进行的相关性研究，还分析了基因型已确定的群体中人口统计学的表示(年龄、性别和种族)以检查各种基因型和治疗组中群体的过高或过低表示，见表11。而且，检查了已基因分型和未基因分型群体之间人口统计学中的差异(如果有)，见表12。
结果
在剂量≥6mg/天雷司替明的治疗组中提高4分组中结果高度显著(P＝0.0071)，如可以在表6中看到的。如可以在表6中看到的，安慰组或雷司替明＜6mg/天的组中没有见到显著的基因型效果。
表6.治疗响应的比较(通过不同治疗组中ApoE ε4等位基因携带者和非携带者之间ADAS-Cog得分提高4分或更多而测定的)
治疗响应     安慰剂   雷司替明＜6mg/天   雷司替明≥6mg/天
无ε4等 ε4等位基因  位基因 无ε4等  ε4等位基因   位基因 无ε4等 ε4等位基因  位基因
  未提高4分提高4分P-值 41      693       20.3691   32       834        121   37    544     260.0071
在无恶化研究中，基因型(ApoE ε4对非ApoE ε4)似乎对治疗响应没有显著影响(P＝0.1172)。如表7中看到的，雷司替明＜6mg/天和安慰剂-治疗的患者中没有观察到基因型影响。
表7.治疗响应的比较(通过不同治疗组中ApoE ε4等位基因携带者和非携带者之间ADAS-Cog得分中无恶化来测定)
治疗响应     安慰剂     雷司替明＜6mg/天     雷司替明≥6mg/天
无ε4等  ε4等位基因  位基因 无ε4等 ε4等位位基因   基因 无ε4等 ε4等位基因  位基因
    恶化无恶化P-值 32      5212      191 24       6312       321 21      2820      520.1172
从表8和9明显看到ApoE ε4等位基因携带者具有更高的响应率，特别是当以至少6mg/天雷司替明施用时。在无恶化标准中尤其是这样。另一方面，在非ApoE ε4携带者中，三个治疗组之间没有显著差异。
发现在ApoE ε4携带者中通过ADAS-Cog等级量表标准中提高4分测定的治疗响应的差异是显著的(P＝0.00000175)，如表8中所示。
表8.治疗响应的比较(通过ApoE ε4等位基因携带者和非携带者中不同治疗组之间ADAS-Cog中提高4分的标准而测定的)
  治疗响应           ApoE ε4携带者         非ApoE ε4携带者
安慰剂 雷司替明  雷司替明＜6mg/天  ≥6mg/天 安慰剂 雷司替明  雷司替明＜6mg/天  ≥6mg/天
  未提高4分提高4分P-值     692 83        5412        260.00000175  8312 37        544         260.7916
在ApoE ε4携带者中通过无恶化标准进行的测定发现治疗响应的差异非常显著(P＝0.00000151)，如表9中所示。
表9.治疗响应的比较(ApoE ε4携带者和非携带者的不同治疗组之间通过ADAS-Cog中的无恶化测定)
  治疗响应           ApoE ε4携带者         非ApoE ε4携带者
安慰剂 雷司替明   雷司替明＜6mg/天   ≥6mg/天 安慰剂 雷司替明 雷司替明＜6mg/天 ≥6mg/天
    恶化无恶化P-值    5219 63         2812         520.00000151   3212 24       2112       200.1137
非参数ANOVA模型产生显著结果(P＝0.0357)，表明当雷司替明日剂量为6mg/天或更高剂量治疗时，与非ApoE ε4等位基因携带者相比，ApoE ε4等位基因携带者具有对雷司替明的更好响应。来自非参数ANOVA模型的结果在表10中给出。
表10.非参数ANOVA模型的结果(研究结束时自ADAS-Cog分值基线变化的平均值)
ApoE ε4携带者 安慰剂    雷司替明＜6mg/天   雷司替明≥6mg/天
  ε4等位基因非ε4等位基因P-值   3.154.610.5844     1.2931.4440.4845     -1.740.390.0357
如可以从表10看到的，≥6mg剂量组中ε4等位基因携带者的ADAS-Cog得分减少(-1.74)。而对于非ε4携带者，自基线的变化是最小的(0.39)。在更低剂量组或安慰剂组中没有见到基因型的影响，指出基因型影响依赖于雷司替明的剂量。
如在表11中所见的，基因型已确定和基因型未确定的群体之间人口统计信息之间没有显著差异。不同治疗中ApoE ε4基因型和它们的分布频率在表12中给出。
表11.基因型已确定和基因型未确定群体的人口统计信息
    ApoE                  种族      性别   年龄(SD)
白种人 黑种人   亚洲/东方人   其他人种 男 女
基因型未确定基因型已确定 926363 758 42 195 410174 614204   74.4(8.04)74.03(7.6)
不同治疗组中基因型已确定和基因型未确定个体的分布
  基因型状态     安慰剂   0-6mg/天   6-12mg/天
基因型未确定   293(28.61％)*   275(26.86％)*   456(44.53％)*
基因型已确定   116(30.69％)*   134(35.45％)*   128((33.87％)*
*圆括号中数字为占该行总和的百分数。
表12.不同基因型组中的人口统计信息
APOE                 种族      性别 平均年龄(SD) APOE ε4分类
白种人 黑种人 亚洲/东方人 其他人种 男 女
ε2/ε3ε3/ε3ε2/ε4ε3/ε4ε4/ε4 151021316953 12122 00020 01022 125267920 45389637 76.4(10.8)73.9(9.0)74.4(7.6)74.4(6.9)72.5(5.4) 非ε4(121)*ε4(246)*
*圆括号中数字为该类中个体数。
不同治疗组中ApoE ε4携带者状态的分布：
    基因型状态   安慰剂   0-6mg/天*   6-12mg/天
ApoE ε4携带者ApoE ε4非携带者     7144     9536     8041
*0和6mg剂量不包括在该类别中。
基因分型方法
ApoE表型和基因型在本领域中详细描述并且是熟知的。ApoE以及表型和基因型的成熟命名系统在例如Zannis等，J.Lipid.Res.，23卷，911页(1982)中描述，该文献在这里被并入作为参考。见美国专利号5,508,167，其在这里被完整地和为了所有目的被并入作为参考。
直接或间接通过任何适宜的方法可以实施检测编码这些同种型的ApoE4或DNA的存在或不存在(包括ApoE4的等位基因数)的步骤。多种技术是本领域技术人员公知的。所有技术一般都包括收集含有来自受试者的DNA或ApoE的生物材料的样品，然后检测该受试者是否具有来自该样品的编码这些同种型的ApoE4或DNA的步骤。例如，通过收集来自受试者的ApoE样品(例如来自脑脊液或来自含有ApoE的任何其他液体或组织)，并确定该ApoE样品中是否存在ApoE4同种型(例如，通过等电聚焦或免疫测定法)可以实施检测步骤。
在例如Rall等，Methods in Enzymology，128卷，273-287页(1986)；Davignon等，Arteriosclerosis，8卷，1-21等(1988)；和Warnick等，Clin.Chem.，25卷，279-284页(1979)中描述了ApoE的分离和鉴定，所有这些文献在这里被并入作为参考。等电聚焦是一种电泳技术，通过等电聚焦，分子基于它们的等电点(pI)沿着连续pH梯度分离。参照蛋白质(可通过商业途径得到(例如，Sigma Chemical Company，St.Louis，MO))用于指示梯度，样品蛋白质根据它们pH在哪里与它们的pI匹配而沿着梯度配对。在Warnick等中，极低密度ApoE从血浆样品分离并应用于等电聚焦凝胶并且得到了ApoE同种型的等电聚焦图谱。根据Warnick的方法，在8M脲中4℃下ApoE同种型E2、E3和E4的pI值分别为约5.9、6.0和6.1。还见Pagnan等，J.Lipid.Res.，18卷，613-622页(1977)；和Utermann等，FEBS Lett.，56卷，352-355页(1975)，这两篇文献在这里被并入作为参考。
在Rall等(如前)中还提供了多种等电聚焦类型的技术，包括分析型等电聚焦、半胱胺处理、神经氨酸酶处理、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以及氨基酸分析和核酸序列分析，在Swartz，Biotechnology，12卷，408-409页(1994)中描述了毛细管等电聚焦。
备选地，通过收集含有受试者DNA的生物样品，然后确定该生物样品中编码ApoE4同种型的DNA存在与否而实施检测步骤。可以使用含有受试者DNA的任何生物样品，包括组织样品和血液样品，血细胞是尤其方便的来源。ApoE2、ApoE3和ApoE4的氨基酸序列和核酸序列是公知的并且已被描述。关于ApoE3和ApoE4和核酸序列见例如Paik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82卷，3445-3449页(1985)，其在此处被并入作为参考；关于氨基酸序列信息见Mahley(1988)，如前。
使用以适宜的可检测基团标记的寡核苷酸探针，通过扩增反应如聚合醇链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)(扩增反应的产物然后可以用被标记的寡核苷酸探针或许多其他技术检测)，可以确定编码ApoE4同种型的DNA存在与否。此外，检测步骤可包括检测受试者编码ApoE4同种型是杂合的还是纯合的步骤。许多不同寡核苷酸探针分析形式是公知的并且可用于实施本发明。见例如，Wahl等的美国专利号4,302,204、Falkow等的美国专利号4,358,535、Ranki等的美国专利号4,563,419、Stavrianopoulos等的美国专利号4,994,373(申请人特别想要此处应用的所有美国专利参考文献的所有公开在这里被并入作为参考)。
所选的、或者目标核酸序列的扩增可以通过任何适宜方法进行。一般见Kwoh等，Am.Biotechnol.Lab.，8卷，14-25页(1990)。适宜的扩增技术的实例包括但不限于PCR、LCR、链置换扩增(一般见，Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89卷，392-396页(1992)；和Walker等，Nuc.AcidsRes.，20卷，1691-1696页(1992))、基于转录的扩增(见Kwoh等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86卷，1173-1177页(1989))、自维持序列复制(3SR)(见Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87卷，1874-1878页(1990))、Q-β复制酶系统(见Lizardi等，BioTechnology，6卷，1197-1202页(1988))、基于核酸序列的扩增(NASBA)(见Lewis，Genetic Engineering News，12卷，9期，1页(1992))、修复链反应(RCR)(见Lewis，如前)、和回旋(boomerang)DNA扩增(BDA)(见Lewis，如前)。现今优选PCR。
DNA扩增技术如前面的DNA扩增技术可以包括使用一种探针、一对探针或者两对探针，这些探针特异结合编码ApoE4的DNA，但是在相同杂交条件下不结合编码ApoE2或ApoE3的DNA，并且它们作为扩增反应中用于ApoE4 DNA扩增的一种或几种引物或者它们的一部分(同样地，可以使用一种探针、一对探针或两对探针，它们特异结合编码ApoE2的DNA，但是在相同条件下不结合编码ApoE3或ApoE4的DNA，并且它们作为扩增反应中用于ApoE2 DNA扩增的一种或几种引物或者它们的一部分；并且可以使用一种探针、一对探针或两对探针，它们特异结合编码ApoE3的DNA，但是在相同条件下不结合编码ApoE2或ApoE4的DNA，并且它们作为扩增反应中用于ApoE3 DNA扩增的一种或几种引物或者它们的一部分)。
通常，用于检测编码ApoE4的DNA的寡核苷酸探针是结合编码ApoE4的DNA但是在相同杂交条件下不结合编码ApoE2或ApoE3的DNA的寡核苷酸探针。该寡核苷酸探针用适宜的可检测基团标记，如下面提出的与抗体有关的可检测基团。同样地，用于检测编码ApoE2的DNA的寡核苷酸探针是结合编码ApoE2的DNA但是在相同杂交条件下不结合编码ApoE3或ApoE4的DNA的寡核苷酸探针，用于检测编码ApoE3的DNA的寡核苷酸探针是结合编码ApoE3的DNA但是在相同杂交条件下不结合编码ApoE2或ApoE4的DNA的寡核苷酸探针。
可以按照公知技术进行PCR。见例如美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、和4,965,188。通常，PCR包括，首先，在杂交条件下用针对待检测特定序列的每条链的寡核苷酸引物处理核酸样品(例如，在热稳定DNA聚合酶存在下)，从而合成每种引物的延伸产物，其与每一核酸链互补，引物与所要杂交的特定序列的每条链足够互补从而从每种引物合成延伸产物，当延伸产物与其互补物分开时，可以作为合成其他引物的延伸产物的模板，然后如果存在待检测的一种或几种序列，那么在变性条件下处理样品以将引物延伸产物与它们的模板分离。这些步骤循环重复直到得到目的扩增程度。扩增序列的检测可以通过向反应产物中加入能够杂交该反应产物的寡核苷酸探针(例如，本发明的寡核苷酸探针)、携带可检测标记的探针，然后按照公知的技术或者通过凝胶上的直接可视化检测标记进行。
当PCR条件允许扩增所有ApoE等位基因类型时，通过用等位基因特异探针杂交、通过限制性内切酶消化、通过变性梯度凝胶上电泳，或者其他技术可以区分这些类型。确定ApoE基因型的PCR方案在Wenham等，The Lancet，337卷，1158-1159页(1991)中描述，该文献在这里被并入作为参考。其中描述了有效扩增和鉴定ApoE同种型的引物的实例。可以使用ApoE多态区(ApoE4、E3或E2)的特异引物。在Wenham中，例如使用了扩增横跨ApoE多态位点(密码子112和158，其含有核苷酸3745和3883)的DNA的227bp区的PCR引物。然后将扩增的片段用限制性内切酶CfoI消化，得到来自6种可能的ApoE基因型的不同限制性片段，它们可以在电泳凝胶上辨认(其他方法见Hixon等，J.Lipid Res.，31卷，545-548页(1990)；Houlston等，Hum.Genet.，83卷，364-365页(1989)；Wenham等，Clin.Chem.，37卷，241-244页(1991)；和Konrula等，36卷，2087-2092页(1990)，所有这些文献在这里被并入作为参考)。
ApoE多态性的基因分型的尤其优选的和改良方法使用基于PCR的测定法，同时使用两种不同的限制酶。见Zivelin等，Clin.Chem.，43卷，9期，1657-1659页(1997)。
按照公知的技术进行LCR。见例如Weiss，Science，254卷，1292页(1991)。一般地，用两对寡核苷酸探针进行反应：一对结合所要检测的序列的一条链；另一对结合所要检测的序列的另一条链。每对引物一起完全包含其相应的链。实施反应首先通过将所要检测的序列的链变性(例如，分开)，然后在热稳定的连接酶存在下将链与两对寡核苷酸探针反应从而每对寡核苷酸探针连接到一起，然后分离反应产物，然后循环重复该过程直到序列被扩增到所想要的程度。可以如关于PCR的上述类似方式进行PCR的检测。
容易理解此处描述的检测步骤可以直接或间接实现。从而，例如，如果在受试者中也检测到ApoE2或ApoE3，那么可以确定该受试者对于ApoE4不是纯合的；如果在受试者中检测到ApoE2和ApoE3两者，那么可确定该受试者对于ApoE4既不是纯合的也不是杂合的。间接确定等位基因类型的其他方法可以是通过测定连接到ApoE等位基因的多态性标记(如VNTR(可变数目的串连重复)已经表明的)和ApoB等位基因的多态性标记。见Decorter等，DNA & Cell Biology，9卷，6期，461-469页(1990)。
作为等电聚焦和等位基因检测技术的备选方案，确定样品中ApoE4同种型存在或不存在的步骤可以通过用选择性结合ApoE4的抗体(即，结合ApoE4但是在相同结合条件下基本上不显示出对ApoE2或ApoE3的结合的抗体)进行抗体分析而实施。当希望确定患者的精确ApoE互补片段和该患者对于ApoE4是纯合的或杂合的时，那么也可以使用选择性结合ApoE2和ApoE3的抗体，即，结合ApoE2但是在相同结合条件下基本不显示对ApoE3或ApoE4的结合的抗体；和结合ApoE3但是在相同结合条件下基本不显示对ApoE2或ApoE4的结合的抗体。
可通过任何适宜的技术产生选择性或特异结合ApoE2、ApoE3和ApoE4的抗体。例如，可以根据Kohler和Milstein，Nature，265卷，495-497页(1975)的技术在杂交瘤细胞系中产生单克隆抗体。ApoE2、ApoE3或ApoE4可以从确定为纯合的人类患者得到，然后通过Rall等，Methods inEnzymol.，128卷，273页(1986)中描述技术纯化，并用作产生单克隆或多克隆抗体的免疫原。通过重组方法表达生物学活性的同种型可以产生纯化的ApoE同种型，或者甚至其免疫原性片段也可用作免疫原。通过本领域技术人员公知的重组技术可以在大肠杆菌中从已知序列产生单克隆Fab片段。见例如Huse，Science，246卷，1275-1281页(1989)(重组Fab技术)；和Wenham等，Lancet，337卷，1158页(1991)(ApoE PCR引物)。可以得到编码ApoE的一种亚型的DNA并通过定点诱变转化成其他DNA。见，例如，Kunkel等，Methods in Enzymol.，154卷，367-382页(1987)；和Kunkel，美国专利号4,873,192。
如此处所用的术语“抗体”指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以是单克隆的或多克隆的并且可以是任何种类的来源，包括例如小鼠、大鼠、兔、马或人来源的，或者可以是嵌合抗体，并包括抗体片段，如Fab、F(ab’)2和Fv片段，和从非IgG的抗体得到的相应片段。
对于本发明，选择性或特异性结合ApoE或特定ApoE同种型(配体)的抗体指与这种配体反应或者识别或结合这种配体的分子。如果抗体结合或能够结合配体，那么该抗体具有对该配体的结合亲和性或者对该配体是特异的，抗体与配体的结合通过标准抗体-抗原或配体-受体测定法测定或确定，这些测定法为例如竞争性测定法、饱和测定法或标准免疫测定法如ELISA或RIA。对特异性的这种定义应用于单条重链和/或轻链，CDRs、融合蛋白或重链和/或轻链的片段，如果它们单独或组合地结合该配体的话，它们对该配体是特异的。
抗体测定法(免疫测定法)可以通常是均相测定法或非均相测定法。在均相测定法中，免疫反应通常包括特异抗体、被标记的分析物和目标样品。抗体结合到被标记分析物时来自标记的信号被直接或间接改变。免疫反应和其程度的检测都在均相溶液中进行。可以使用的免疫化学标记包括自由基、放射性同位素、荧光染料、酶、细菌噬菌体、辅酶等。
在非均相测定方法中，试剂通常为样品、本发明的抗体和用于产生可检测信号的系统或方法。可以使用上述类似的样品。抗体通常固定在载体，如珠子、板或玻片上，并在液相中与可能含有抗原的样品接触。然后载体从液相分离并使用产生信号的方法检测载体相或液相的可检测信号。该信号与样品中分析物的存在相关。产生可检测信号的方法包括使用放射活性标记、荧光标记、酶标记等。例如，如果所要检测的抗原含有另一结合位点，结合该位点的抗体可以连接有可检测基团并在分离步骤前加到液相反应溶液中。固相载体上可检测基团的存在指出受试样品中抗原的存在。适宜的免疫测定法的实例为放射免疫测定法、免疫荧光方法、酶联免疫测定法等。
本领域技术人员熟悉许多特定免疫测定法和其可变形式，它们用于实施这里公开的方法。一般见，Maggio，Enzyme-Immunoassay，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL(1980)。还见Skold等的美国专利号4,727,022，“调节配体-受体相互作用的方法和它们的应用”；Forrest等的美国专利号4,659,678；David等的美国专利号4,376,110；Litman等的美国专利号4,275,149；Maggio等的美国专利号4,233,402；Boguslaski等的美国专利号4,230,767，所有这些文献在此为了所有目的被并入作为参考。
选择性结合ApoE同种型即结合ApoE2、ApoE3或ApoE4之一而在相同结合条件下基本上不结合其他同种型的抗体可用于按照公知技术(如沉淀)连接到适于诊断性分析的固相载体(例如，从如乳胶或聚苯乙烯形成的珠子、板、玻片或孔)。结合ApoE同种型的抗体同样也可根据公知技术连接至可检测基团，如放射性标记，例如35S、125I、131I；酶标记物，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；和荧光标记物，例如荧光素。
用于确定ApoE4的存在或不存在和由此对AchEI药物处理的预期响应的试剂盒也是本发明的方面并且将包括至少一种特异检测ApoE4的存在或不存在的试剂和基于ApoE4状态的推荐处理选择的使用说明书。该试剂盒可任选包含用于检测ApoE4基因的核酸。优选地，该试剂盒可含有至少两种不同的用于检测ApoE4基因的核酸。根据本发明的另一优选实施方案，该试剂盒可包含用于检测ApoE4等位基因的存在或不存在的至少一种基因特异性基因分型的寡核苷酸。优选地，该试剂盒含有两种特异性基因分型的寡核苷酸。在另一实施方案中，该试剂盒可含有至少一种基因特异性基因分型引物组合物。该引物组合物优选含有至少一种基因特异性基因分型寡核苷酸。最优选地，该组合物含有至少两组等位基因特异性引物对。这两组等位基因特异性基因分型寡核苷酸可被包装在单独的容器中。
在另一实施方案中，试剂盒可任选包括检测ApoE4的等电聚焦方法的使用说明书。
可以以多种方法制造用于实施抗体测定法的类似诊断试剂盒。在一个实施方案中，诊断试剂盒含有：(a)连接到固相载体上的结合ApoE2、ApoE3或ApoE4的抗体；和(b)连接有可检测基团的结合ApoE2、ApoE3或ApoE4的二级抗体。试剂还可包括辅助试剂，如缓冲剂和蛋白质稳定剂，例如多糖等。诊断试剂盒还可以包括(必要时)信号产生系统的其他成员(其中可检测基团是该系统的一个成员)(例如酶底物)，和用于减少试验中背景干扰的试剂、对照试剂、用于实施试验的仪器等。检测试剂盒的另一实施方案含有：(a)如上的抗体；和(b)连接有可检测基团的与抗体特异结合的分子。同样可包括如上述的辅助试剂。检测试剂盒可以以任何适宜的方式包装，通常所有成分以及一张印刷有实施该试验的使用说明书都包含在单个容器中。
本发明的一个方面提供了用于确定痴呆患者的治疗策略的试剂盒，其含有(a)一种能够识别并结合ApoE4基因的多肽表达产物的抗体；(b)适宜容纳该抗体和来自个体的体液样品的容器，其中该抗体可以接触ApoE4多肽(如果其存在)；(c)检测所述抗体与ApoE4多肽结合的方法；和(d)试剂盒的使用说明书。
根据另一方面，用于确定痴呆患者的治疗策略的试剂盒含有(a)能够识别并结合ApoE4基因的mRNA表达产物的多核苷酸；(b)适于容纳该多核苷酸和来自患者的体液样品的容器，其中所述多核苷酸可以与ApoE4mRNA接触(如果其存在)；(c)检测所述多核苷酸与ApoE4 mRNA结合的方法；和(d)试剂盒的使用说明书。
本发明的另一方面是用于确定痴呆患者的治疗策略的试剂盒，其含有(a)能够识别并结合ApoE4基因DNA序列的某部分的多核苷酸；(b)适于容纳该多核苷酸和来自患者的体液样品的容器，其中所述多核苷酸可以与ApoE4 DNA序列接触(如果其存在)；(c)检测所述多核苷酸与ApoE4 DNA结合的方法；和(d)试剂盒的使用说明书。
检测ApoE4的免疫化学方法
免疫化学测定法包括任选地(但是优选地)将样品如从受试者收集的血样与还原剂组合，然后将该样品与特异结合反应性巯基基团的固相载体接触，从固相载体分离样品；然后通过免疫测定法检测：(i)所述样品中ApoE的存在或不存在，所述样品中存在ApoE4说明该受试者具有ApoE4的至少一个等位基因，所述样品中不存在ApoE4说明所述受试者没有ApoE4的等位基因；或者(ii)固定于固相载体上的ApoE的存在或不存在，所述固相载体上存在ApoE2或ApoE3说明所述受试者有一种或没有ApoE4的等位基因，固相载体上不存在固定的ApoE2和ApoE3说明所述受试者有ApoE4的两种等位基因。
可以使用含有ApoE的生物材料的任何样品，包括但不限于体液样品。例如可以从受试者的血、血清、血浆、脑脊液或含有ApoE的任何其他液体或组织收集样品。
易于理解此处描述的检测步骤可以直接或间接进行。从而，例如，如果在受试者中也检测到ApoE2或ApoE3，那么可确定该受试者对于ApoE4不是纯合的；如果在受试者中检测到ApoE2和ApoE3两者，那么可确定该受试者对ApoE4既不是纯合的也不是杂合的。如果存在ApoE2或ApoE3，那么该个体对ApoE4可能是杂合的。如果结合到柱子的ApoE的量被确定为从柱子洗脱的量的约两倍，那么也说明对ApoE4是杂合的。备选地，为了进行进一步区分，本发明的测定法可以用作最初筛选并与能够区别ApoE2、ApoE3和ApoE4的另一测定法组合，该另一测定法为例如免疫测定法、等电聚焦或对编码ApoE2、ApoE3和ApoE4的DNA进行PCR分析。
特异结合反应性巯基基团的任一固相载体可用于实施本发明。“特异”指存在竞争基团如氨基、羟基和羧基时固相载体将共价结合巯基。这些固相载体包括但不限于使用tresyl化学的固相载体(见Nilsson，MethodsEnzymol.，63卷，56页(1984))；具有二硫化吡啶(pyridyl disulfide)的活化凝胶(见Egoroy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72卷，171页(1975))；或产生二硫键的二硫代-5-硝基苯甲酸部分，和TNB-硫醇(5-硫代-2-硝基苯甲酸)琼脂糖凝胶(例如，Pierce产品号20409G，可从Pierce Chemical Co.，PO Box117，Rockford，IL 61105得到)。优选的固相载体为式R-COCH2X代表的固相载体，其中R为固相基质如凝胶，X为卤素，例如，Cl、Br、I，优选I。尤其优选SULFOLINK.RTM.TM偶联凝胶，可从Pierce，PO Box 117，Rockford，IL 61105得到，产品号为44895G、20405G、20401G、20402G和20403G。
能够将半胱氨酸残基中的二硫键还原成相应的反应性巯基基团的任何试剂都可用作实施本发明的还原剂。还原剂优选为较低分子量的硫醇，更优选巯基乙醇、二硫苏糖醇和巯基乙胺。半胱氨酸中二硫键的还原一般是在弱碱性和变性条件下例如8M脲或6M盐酸胍中进行。
一旦样品已经接触固相载体，那么通过任何公知的方法将其从固相载体分开，如果希望，收集用于进一步试验。
通过用特异结合ApoE的抗体特异结合ApoE实施免疫测定步骤。所述抗体包括所有类型的免疫球蛋白，包括通过如上描述的任何公知的适宜方法产生的IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
前面技术的一个优点是不必使用特异结合一种ApoE同种型而不结合一种或多种其他同种型的抗体。然而，根据需要，可以使用这些同种型特异性抗体。对ApoE特异的抗体容易制备并且是已知的。
免疫测定法通常可以是均相测定法或非均相测定法，如上述。还如上述，特异结合ApoE的抗体可以按照公知的技术连接到适用于诊断性测定法的固相载体(例如，从如乳胶或聚苯乙烯的材料形成的珠子、板、玻片或孔)，并且它们同样可连接有可检测基团。
可以以多种方法产生用于实施免疫化学测定法的诊断性试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒含有：(a)特异结合反应性巯基的固相载体；(b)结合ApoE2、ApoE3和/或ApoE4的抗体；和(c)任选地，一种还原剂。在另一实施方案中，诊断性试剂盒含有：(a)连接到固相载体的结合ApoE2、ApoE3和/或ApoE4的抗体；和(b)连接有可检测基团的结合ApoE2、ApoE3和/或ApoE4的二级抗体。
试剂还可以包括辅助试剂，如缓冲剂和蛋白质稳定剂，例如多糖等。诊断试剂盒还可以包括(必要时)信号产生系统的其他成员(其中可检测基团是该系统的一个成员)(例如酶底物)，和用于减少试验中背景干扰的试剂、对照试剂、用于实施试验的仪器等。检测试剂盒的另一实施方案含有：(a)如上的抗体；和(b)连接有可检测基团的与抗体特异结合的分子。同样可包括如上述的辅助试剂。检测试剂盒可以以任何适宜的方式包装，通常所有成分以及一张印刷有实施该试验的使用说明书都包含在单个容器中。
简言之，在本发明的特定实施方案中，收集血液并凝结，并除去血清。将血清的等分试样置于还原剂(例如，二硫苏糖醇或β-巯基乙醇)中以还原半胱氨酸，从而产生反应性巯基基团。然后将还原的血清与被活化的载体孵育，该被活化载体特异地并定量地与巯基基团反应(该载体的一个实例是Pierce Inc.生产的SULFOLINK.RTM.TM偶联凝胶)。被还原的血清与该被活化载体孵育将因此结合含有半胱氨酸的所有ApoE分子。孵育后，含有未结合蛋白质的血清与活化载体和其结合的蛋白质分离(通过沉淀或离心)。通过对ApoE特异的抗体使用ELISA方法，并使用几种可能的检测方案之一例如比色法测定血清中ApoE的存在与否。ApoE2或ApoE3将定量地结合到活化的载体，并且在ELISA中在血清中检测不到游离的ApoE。ApoE4将不结合活化的载体，并且将因此在ELISA测定法中被检测到。纯合子ApoE4患者的血清(仅含有ApoE4同种型)在血清与活化的载体孵育后将具有和孵育前约相同量的ApoE。来自杂合子ApoE4患者的血清(含有ApoE4和另一种ApoE同种型)在与活化的载体孵育后含有的ApoE将是孵育前的约一半。
下面给出了特定基因型分析的实例。
实施例2
患者的基因型分析可以用自每个患者抽取的5mL全血中分离的高分子量DNA或者备选地RNA实现。使用等位基因特异性引物延伸方法确定ApoE基因型。由Genosys Biotech(The Woodland，Tex.)使用Main等，J.Lipid Res.，32卷，183-187页(1991)中提供的引物序列合成被标记的引物D、E、F、G和H。在50μL体积中进行反应，该50μL体积含有1μg DNA；三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷和三磷酸脱氧鸟苷，每种0.2mmol/L；10％二甲亚砜；12.5pmol引物D、E、F或G；25pmol引物H；和10μL 10xPCR反应缓冲液(Vector Biosystem，Toronto，ONT.)。反应混合物中的DNA首先在96℃变性10分钟，然后冷却到4℃。向每个样品中加入1单位Taq聚合酶(Vector Biosystem，Toronto，ONT.)。每个样品在96℃再加热2分钟并在热循环仪中进行30个循环，每个循环由96℃10秒钟变性、58℃30秒退火和65℃1分钟延伸组成。通过将10μL反应混合物在含有TPE缓冲液(0.08mol/L Tris-磷酸盐，0.002mol/L EDTA，Sigma，St-Louis，MO)和溴乙锭(0.15μg/mL)的1％琼脂糖凝胶中以67伏电泳1小时使反应产物显现。然后将凝胶照相并将条带图谱与已知的标准比较。
实施例3
备选地，使用血清或脑脊液样品可以确定患者中的ApoE表型。蛋白质在25cm SDS聚丙烯酰胺凝胶(10％)上根据分子大小分离并使用BIORAD转移印迹池转移到硝酸纤维素滤膜上，用抗人ApoE蛋白的多克隆抗体(International Immunology Corp.，CA，Dil.1：2000)进行ApoE蛋白的检测。为了控制抗体特异性，进行抗ApoE抗体与纯化的人ApoE蛋白质(MW34-36kDa)的吸附以看是否将特异地阻碍ApoE检测。分子量标记(Rainbowmarkers，Amersham)在邻近孔中运行而带显现用化学发光检测试剂盒(Amersham，Cat.No.RPN 2100)进行。使用装备有1D-凝胶分析软件的MCID图像分析系统(Ste-Catherine，ONT.)进行放射自显影信号的定量(见，公开的美国专利申请号US20020086290A1、申请号09/548540和09/829113、美国专利号6,391,553，所有文献在这里为了所有的目的被并入作为参考)。
使用常规SNP鉴定技术进行ApoE基因分型的其他方法
也可以通过常规方法完成ApoE基因分型以鉴定SNP。可以使用许多不同技术鉴定和表征SNP，包括单链构象多态性(SSCP)分析、通过变性高效液相层析的异源双链分析(DHPLC)、直接DNA测序和计算方法。见Shi，Clin.Chem.，47卷，164-172页(2001)。由于公共数据库中大量序列信息，对给定基因可以使用计算工具硅片上(in silico)通过比对单独提交的序列(cDNA或基因组序列)鉴定SNP。通过实验方法和通过硅片上方法得到的SNP的比较表明SNP Finder(http://Ipgws.nci.nih.gov：82/perl/snp/snp_cgi.pl)发现的SNP候选者的55％也已经被实验方法发现。见Cox等，Hum.Mutal.，17卷，141-150页(2001)。然而，这些硅片上方法只能发现27％的真实SNP。
现今最常见的SNP分型方法包括杂交、引物延伸和切割方法。这些方法的每一种必须连接到适当的检测系统。检测技术包括荧光偏振(见Chan等，Genome Res.，9卷，492-499页(1999))、焦磷酸盐释放的发光检测(焦磷酸测序)(见Ahmadiian等，Anal.Biochem.，280卷，103-110页(2000))、基于荧光共振能量转移(FRET)的切割测定法、DHPLC和质谱(见Shi，如前；和美国专利号6,300,076 B1))。检测和表征SNP的其他方法为美国专利号6,297,018 B1和6,300,063 B1中公开的方法。上面参考文献的公开在此处被完整并入作为参考。
在一个实施方案中，通过所谓的INVADERTM技术(可从Third WaveTechnologies Inc.Madison，WI得到)可以实现多态性的检测。在该测定法中，特定上游“入侵者”寡核苷酸和部分重叠的下游探针当结合到互补DNA模板时形成特定结构。该结合被切割酶(Cleavase)在特定位点识别并切割，这导致探针寡核苷酸的5’突出端的释放。该片段然后作为反应混合物中合成的第二靶标和第二荧光标记的信号探针的“入侵者”寡核苷酸。这导致切割酶对第二信号探针的特异切割。当该第二探针(用能够荧光共振能量转移的染料分子标记)被切割时，产生荧光信号。切割酶相对于重叠DNA序列或突出端形成的结构具有严格要求，因此，可用于特异检测下游DNA链上紧挨着切割位点的上游存在的单个碱基对错配。见Ryan等，MolecularDiagnosis，4卷，2期，135-144页(1999)；和Lyamichev等，NatureBiotechnol.，17卷，292-296页(1999)。还见美国专利号5,846,717和6,001,567，它们的公开在此处被完整并入作为参考。
在一些实施方案中，组合物含有两种或多种不同标记的基因分型寡核苷酸，用于在两个或多个多态性位点同时探测核苷酸的身份。还考虑了引物组合物可含有两套或多套等位基因特异性引物对以允许同时靶向并扩增含有多态性位点的两个或多个区域。
本发明的ApoE基因分型寡核苷酸也可以固定于固体表面上或在固体表面上合成，该固体表面为例如微芯片、珠子或玻璃片(见例如WO 98/20020和WO 98/20019)。这些被固定的基因分型寡核苷酸可用于多种多态性检测测定法中，这些检测法包括但不限于探针杂交和聚合酶延伸测定法。本发明的固定化ApoE基因分型寡核苷酸可含有寡核苷酸有序阵列，设计该阵列用于同时筛选DNA样品中多个基因的多态性。
本发明的等位基因特异性寡核苷酸引物具有3’末端核苷酸或优选3’倒数第二位核苷酸与特定SNP的仅仅一个核苷酸互补，从而只有存在含有该核苷酸的等位基因时，作为引物用于聚合酶介导的延伸。本发明还考虑了杂交到编码链或非编码链的等位基因特异性寡核苷酸引物。使用本领域技术人员公知的技术可以开发用于检测ApoE基因多态性的ASO引物。
本发明的其他基因分型寡核苷酸杂交到位于此处鉴定的新多态性位点之一下游的一个到几个核苷酸的靶标区域。这些寡核苷酸用于聚合酶介导的引物延伸方法以检测此处描述的新多态性之一，并且因此这些基因分型寡核苷酸在此处被称为“引物延伸寡核苷酸”。在一个优选的实施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端为与位于紧邻多态性位点处的核苷酸互补的脱氧核苷酸。
在另一实施方案中，本发明提供了含有包装在单独的容器中的至少两种基因分型寡核苷酸的试剂盒。该试剂盒还可含有其他组分，如包装在单独容器中的杂交缓冲剂(其中寡核苷酸将用作探针)。备选地，当寡核苷酸将用于扩增目标区域时，试剂盒可含有包装在单独的容器中的优化用于聚合酶介导的引物延伸如PCR中的聚合酶和反应缓冲液。
上面描述的寡核苷酸组合物和试剂盒用于对个体中ApoE基因的基因分型和/或单体型分型的方法。如此处所用的术语“ApoE基因型”和“ApoE单体型”分别指在于此处描述的一个或多个多态性位点处存在含有一个或几个核苷酸对的基因型或单体型，并且也可任选地包括ApoE基因中一个或多个其他多态性位点处的核苷酸对或核苷酸。其他多态性位点可以是现在已知的一个或多个多态性位点或者以后发现的位点。
基因分型方法的一个实施方案包括从个体分离含有存在于个体的ApoE基因的两份拷贝或其片段的核酸混合物，并确定两份拷贝中一个或多个多态性位点处核苷酸对的身份以将ApoE基因型赋予该个体。本领域技术人员易于理解，个体中基因的两份“拷贝”可以是相同的等位基因或者可以是不同等位基因。在一个尤其优选的实施方案中，基因分型方法包括确定每个多态性位点处核苷酸对的身份。
一般，核酸混合物或蛋白质从采自该个体的生物样品分离，该生物样品包括体液样品，如血样或组织样品。适宜的组织样品包括但不限于全血、精液、CSF、唾液、泪液、尿、粪便物质、汗液、颊膜涂片、皮肤和特定器官组织如肌肉或神经组织的活组织检查和头发。核酸混合物可以为基因组DNA、mRNA或cDNA，对于后两者，生物样品必须从ApoE基因在其中表达的器官获得。此外，技术人员将理解mRNA或cDNA制备物将不用于检测位于内含子或5’和3’非转录区的多态性。如果ApoE基因片段被分离，那么该片段必须含有欲进行基因分型的一个或多个多态性位点。
单体型分型方法的一个实施方案包括从个体分离含有存在于该个体的ApoE基因的两份拷贝中的一份，或者其片段的核酸分子，并确定该拷贝中一个或多个多态性位点处核苷酸的身份以将一种ApoE单体型赋予该个体。可以使用能够分离ApoE基因的两份拷贝或片段的任何方法分离核酸，该方法包括但不限于上面描述的用于制备ApoE同源基因的方法之一，靶定的体内克隆为优选的方法。
本领域技术人员易于理解的是，任何单个克隆将仅提供关于个体中两份ApoE基因拷贝之一的单体型信息。如果想要为该个体的另一拷贝得到单体型信息，将需要检查额外的ApoE克隆。通常，将检查至少5个克隆以具有对个体中ApoE基因的两份拷贝进行90％以上可能性的单体型分型。在尤其优选的实施方案中，鉴定了每个多态性位点处的核苷酸。
在一个优选的实施方案中，通过鉴定存在于个体中的ApoE基因的每份拷贝中一个或多个多态性位点处核苷酸的相位序列(phased sequence)确定了ApoE单体型对。在尤其优选的实施方案中，基因分型方法包括鉴定ApoE基因的每份拷贝中每个多态性位点处核苷酸的相位序列。当对基因的两份拷贝进行单体型定型时，鉴定步骤优选用置于单独容器中的基因的每份拷贝进行。然而，还考虑了如果两份拷贝用不同标记物(tag)标记，或者分别可区别或可鉴定时，在一些情况下可以在同一容器中实施该方法。例如，如果基因的第一份和第二份拷贝分别用不同的第一和第二荧光染料标记，并且用第三种不同荧光染料标记的等位基因特异性寡核苷酸用于测定多态性位点，那么检测第一种和第三种染料的组合将鉴定第一份基因拷贝中的多态性，而检测第二种和第三种染料的组合将鉴定第二份基因拷贝中的多态性。
在基因分型和单体型分型方法中，通过直接从ApoE基因的一份或两份拷贝或者其片段扩增含有一个或多个多态性位点的靶标区域，并通过常规方法确定被扩增区域的序列，可以确定一个或多个多态性位点处一个或多个核苷酸(或者一个或多个核苷酸对)的身份。技术人员易于理解的是：如果个体在某一多态性位点是纯合的，那么在该多态性位点将仅检测到一种核苷酸，而如果该个体对该位点是杂合的，那么将检测到两种不同的核苷酸。多态性可以直接鉴定(称为肯定型鉴定)或者通过推理鉴定(称为否定型鉴定)。例如，当已知参照群体中SNP为鸟嘌呤和胞嘧啶时，对于在一位点为纯合的个体可以肯定地确定该位点为鸟嘌呤或胞嘧啶，或者如果个体在那一位点为杂合的，则可肯定地确定该位点为鸟嘌呤和胞嘧啶。备选地，可以否定地确定该位点不是鸟嘌呤(从而是胞嘧啶/胞嘧啶)或不是胞嘧啶(从而是鸟嘌呤/鸟嘌呤)。
此外，通过确定与目标多态性位点连锁不平衡的此处未公开的多态性位点的基因型可以间接确定此处描述的任何新多态性位点处存在的等位基因的身份。如果一个位点上特定变体的存在增强了另一位点上另一变体的可预言性，那么说两个位点连锁不平衡。见Stevens，Mol.Diag.，4卷，309-317页(1999)。与目前公开的多态性位点连锁不平衡的多态性位点可以位于此处没有检查的基因区域或其他基因组区域。通过但不限于上述用于检测多态性位点处等位基因身份的方法可以进行与此处描述的新多态性位点连锁不平衡的多态性位点的基因分型。
靶标区域可以使用任一寡核苷酸指导的扩增方法扩增，该方法包括但不限于PCR(见美国专利号4,965,188)、LCR(见Barany等，Proc Natl.Acad.Sci.USA，88卷，189-193页(1991)；和WO 90/01069)、和寡核苷酸连接测定法(见Landegren等，Science，241卷，1077-1080页(1988))。用作这些方法中引物或探针的寡核苷酸应该特异杂交含有多态性位点或与该多态性位点相邻的核酸的区域。一般，这些寡核苷酸长为10到35个核苷酸，优选长为15到30个核苷酸。这些寡核苷酸最优选长为20-25个核苷酸。所述寡核苷酸的精确长度将取决于技术人员的常规考虑和实践的许多因素。
其他公知的核酸扩增方法可用于扩增靶标区域，这些方法包括基于转录的扩增系统(见，美国专利号5,130,238和5,169,766；EP 329,822；和WO89/06700)、和等温方法(见Walker等，Proc Natl.Acad.Sci.USA，89卷，392-396页(1992))。
也可以在扩增之前或之后使用本领域公知的基于杂交的几种方法之一分析靶标区域中的多态性。一般，在实施这些方法中利用等位基因特异的寡核苷酸。等位基因特异的寡核苷酸可用作被不同标记的探针对，该探针对的一个成员显示出与靶标序列的一个变体的完美匹配并且其他成员显示出与不同变体的完美匹配。在一些实施方案中，可以使用一套等位基因特异的寡核苷酸或寡核苷酸对从而一次检测一个以上的多态性位点。优选地，当杂交到每个被检测的多态性位点时，该套中成员相互间的熔解温度在5℃内，更优选2℃内。
等位基因特异的寡核苷酸与靶标多核苷酸的杂交可以用溶液中的这两种实体进行或者当寡核苷酸或靶标多核苷酸共价或非共价固定到固相载体时可以进行该杂交。连接可例如通过抗体-抗原相互作用、多聚-L-Lys、链亲和素-生物素或亲和素-生物素、盐桥、疏水相互作用、化学键、UV交联烘焙等介导。等位基因特异的寡核苷酸可以直接在固相载体上合成或者在合成后接合到固相载体。适于用于本发明检测方法中的固相载体包括用硅、玻璃、塑料、纸等制造的基质，该基质可以形成例如孔(如96-孔板)、玻片、片、膜、纤维、芯片、盘和珠子。固相载体可被处理、涂上或衍生化以利于等位基因特异的寡核苷酸或靶标核酸的固定。
还可以确定个体的ApoE基因的基因型或单体型，这可以通过将含有该基因的一份或两份拷贝的核酸样品与核酸阵列和亚阵列(如WO95/11995中描述的)杂交来确定。该阵列应该含有代表将被包括在基因型或单体型中的每一个多态性位点的一组等位基因特异性寡核苷酸。
使用错配检测技术还可以确定多态性的身份，该技术包括但不限于使用核探针的RNase保护法(见Winter等，Proc Natl.Acad.Sci.USA，82卷，7575页(1985)；和Meyers等，Science，230卷，1242页(1985))和识别核苷酸错配的蛋白质如大肠杆菌mutS蛋白质(见Modrich，Ann.Rev.Genet.，25卷，229-253页(1991))的RNase保护法。备选地，通过SSCP分析(见Orita等，Genomics，5卷，874-879页(1989)；和Humphries等，“遗传疾病的分子诊断”，Elles编辑，321-340页(1996))或变性梯度凝胶电泳(见Wartell等，Nucl.Acids Res.，18卷，2699-2706页(1990)；和Sheffield等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86卷，232-236页(1989))可以鉴定变体等位基因。
聚合酶介导的引物延伸方法也可用于鉴定多态性。在专利和科学文献中已经描述了若干种方法并且这些方法包括“遗传位点分析”方法(WO92/15712)和连接酶/聚合酶介导的遗传位点分析。见美国专利号5,679,524。相关方法在WO 91/02087、WO 90/09455、WO 95/17676、美国专利号5,302,509和5,945,283中公开。通过如美国专利号5,605,798中公开的质谱测定法可以检测含有多态性的延伸引物。另一个引物延伸方法是等位基因特异性PCR。见Ruafio等，Nucl.Acids Res.，17卷，8392页(1989)；Ruafio等，Nucl.Acids Res.，19卷，6877-6882页(1991)；WO 93/22456；和Turki等，J.Clin.Invest.，95卷，1635-1641页(1995)。此外，通过使用如Wallace等，WO 89/10414中描述的等位基因特异性引物组通过扩增核酸的多个区域可以研究多个多态性位点。
在一个优选的实施方案中，检查每一人种(ethnogeographic)组的单体型频率数据以确定该数据是否与Hardy-Weinberg平衡一致。Hardy-Weinberg平衡(见Hartl等，“种群基因组学原理”，SinauerAssociates，Sunderland，MA，第三版(1997))主张发现单体型对H1/H2的频率等于PH-W(H1/H2)＝2p(H1)p(H2)(如果H1 H2)和PH-W(H1/H2)＝p(H1)p(H2)(如果H1＝H2)。单体型频率的观测值和期望值之间的统计学显著差异可以是由于群体组中明显存在的近亲繁殖、对该基因的强选择压力、抽样偏误和/或基因分型过程中的误差。如果在人种组中观察到与Hardy-Weinberg平衡存在大偏差，那么可以增加该组中个体数目以观察该偏差是否是由于抽样偏误。如果更大的样本大小不减小单体型对频率的观测值和期望值之间的差异，那么希望用直接单体型分型方法，如CLASPERSYSTEMTM技术(美国专利号5,866,404)、SMD或等位基因特异性长范围PCR确定该个体的单体型。见Michalotos-Beloin等，Nucl.Acids Res.，24卷，4841-4843页(1996)。
在用于预测ApoE单体型对的该方法的一个实施方案中，所指定的步骤包括执行下面的分析。首先，每个可能的单体型对与参照群体中的单体型对比较。通常，参照群体中仅仅一个单体型对匹配可能的单体型对并且将该对赋予该个体。有时，在参照单体型中只有一种提供的单体型与个体的可能单体型对一致，在这种情况下，该个体被赋予这样一个单体型对，其含有该已知的单体型和通过从可能的单体型对减去该已知的单体型得到的新单体型。在罕有的情况中，在参照群体中没有单体型与可能的单体型对一致，或者备选地多个参照单体型对与可能的单体型对一致。在这些情况下，优选使用直接分子单体型分型方法，如CLASPER SYSTEMTM技术(美国专利号5,866,404)、SMD或等位基因特异性长范围PCR确定该个体的单体型。见Michalotos-Beloin等，如前。
术语
如此处所用的“抗体”包括多克隆和单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体、以及Fab片段，包括Fab或其他免疫球蛋白表达文库的产物。
“多核苷酸”一般指任何多聚核糖核苷酸(RNA)或多聚脱氧核糖核苷酸(DNA)，其可以是未被修饰的或被修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA、单链和双链区混合的DNA、单链和双链RNA、以及单链和双链区混合的RNA、含有DNA和RNA的杂合分子，该DNA和RNA可以是单链的或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物。此外，“多核苷酸”指含有RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语“多核苷酸”还包括为了稳定性或其他原因含有一个或多个被修饰碱基的DNA或RNA和主链被修饰的DNA或RNA。
引用的参考文献
此处所引用的所有参考文献在这里完整地并且为了所有目的被并入作为参考，就好像每个出版物或专利或专利申请被特别地和个别地指出完整地并且为了所有目的被并入作为参考一样。此外，此处所引用的所有GenBank登记号、Unigene Cluster号和蛋白质登记号在这里完整地并且为了所有目的被并入作为参考，就好像它们被特别地和个别地指出完整地并且为了所有目的被并入作为参考一样。
本发明不被该申请中描述的具体实施方案所限制，这些实施方案旨在作为本发明的个别方面的个别说明。如本领域技术人员将显而易见的，可以对本发明作出许多修改和变化而不背离其精神和范围。除了此处列举的方法和设备，本发明范围内的功能上等同的方法和设备在本领域技术人员阅读前面的描述和附图后将对于他们是显而易见的。这些修改和变化旨在位于所附权利要求的范围内。本发明将仅受限于所附权利要书以及这些权利要求等同的完整范围。

Claims (42)

1.防止痴呆患者认知功能退化的方法，该方法包括：
a)对该患者中存在的ApoE基因两份拷贝中的每一份拷贝确定ApoE基因型的性质，其中
b)如果该患者中存在的ApoE基因的两份拷贝之一或两者含有ε4等位基因，那么该患者用ChEI药物治疗。
2.权利要求1的方法，其中ChEI选自表1中所示的组。
3.权利要求2的方法，其中ChEI是雷司替明。
4.权利要求3的方法，其中患者用6mg/天或更大剂量的雷司替明治疗。
5.权利要求1的方法，其中认知功能退化的确定是通过使用ADAS-Cog评分而确定的。
6.权利要求1的方法，其中痴呆为阿尔茨海默型痴呆(DAT)。
7.防止痴呆患者行为问题恶化的方法，该方法包括：
a)对该患者中存在的ApoE基因两份拷贝中的每一份拷贝确定ApoE基因型的性质，其中
b)如果该患者中存在的ApoE基因的两份拷贝之一或两者含有ε4等位基因，那么该患者用ChEI药物治疗。
8.权利要求7的方法，其中痴呆为DAT。
9.权利要求7的方法，其中ChEI选自表1中所示的组。
10.权利要求7的方法，其中ChEI是雷司替明。
11.权利要求7的方法，其中患者用6mg/天或更大剂量的雷司替明治疗。
12.改善痴呆患者认知损伤的方法，该方法包括：
a)对该个体中存在的ApoE基因两份拷贝中的每一份拷贝确定ApoE基因型的性质，其中
b)如果该个体中存在的ApoE基因的两份拷贝之一或两者含有ε4等位基因，那么该患者用ChEI药物治疗。
13.权利要求12的方法，其中痴呆为DAT。
14.权利要求12的方法，其中ChEI选自表1中所示的组。
15.权利要求12的方法，其中ChEI是雷司替明。
16.权利要求15的方法，其中患者用6mg/天或更大剂量的雷司替明治疗。
17.权利要求12的方法，其中认知损伤通过使用ADAS-Cog而测定。
18.权利要求17的方法，其中改善为用ADAS-cog标准评分测定时分值提高多于4分。
19.改善痴呆患者行为问题的方法，该方法包括：
a)对该个体中存在的ApoE基因两份拷贝中的每一份拷贝确定ApoE基因型的性质，其中
b)如果该个体中存在的ApoE基因的两份拷贝之一或两者含有ε4等位基因，那么该患者用ChEI药物治疗。
20.权利要求19的方法，其中ChEI选自表1中所示的药物。
21.权利要求20的方法，其中ChEI是雷司替明。
22.权利要求21的方法，其中雷司替明的剂量为6mg/天或更大。
23.权利要求19的方法，其中行为问题选自抑郁、精神病、妄想、睡眠障碍、神志恍惚、爆发性发怒、攻击行为、激动、冷漠、焦虑、多疑、害怕和偏执狂。
24.权利要求19的方法，其中痴呆为DAT。
25.确定痴呆个体对用ChEI药物治疗的响应性的方法，该方法包括：
a)对该个体中存在的ApoE基因两份拷贝中的每一份拷贝确定ApoE基因型的性质，其中
b)如果该个体中存在的ApoE基因的两份拷贝之一或两者含有ε4等位基因，那么该患者将被置于良好响应者组中；或
c)如果患者ApoE基因的两份拷贝都不含有ε4等位基因，那么该患者被置于不良响应者组中。
26.权利要求25的方法，其中痴呆选自DAT、血管性痴呆、卢伊体痴呆、帕金森病痴呆、唐氏综合征痴呆和轻度认知损伤。
27.权利要求25的方法，其中痴呆为DAT。
28.预测在不远的将来被痴呆患者所需要的护理水平的方法，该方法包括：
a)对于患者中存在的ApoE基因两份拷贝中的每一份拷贝确定ApoE基因型的性质，其中
i)如果患者中存在的ApoE基因的两份拷贝的一份或两份含有ε4等位基因，那么该患者将被归类于不远的将来“保持稳定或改善”的治疗组，
ii)预期用ChEI药物治疗将稳定或改善患者的症状并且预计该患者在不远的将来不需要增加所需要的护理水平；和
iii)如果患者中存在的ApoE基因的两份拷贝都不含有ε4等位基因，那么该患者将被归类于不远的将来“继续恶化”的治疗组，其中可预计患者症状将表现出恶化并且该患者在不远的将来可能需要提高护理水平。
29.权利要求24的方法，其中ChEI选自表1中所示的组。
30.权利要求25的方法，其中ChEI是雷司替明。
31.权利要求26的方法，其中雷司替明以6mg/天或更高的剂量使用。
32.权利要求24的方法，其中痴呆为DAT。
33.确定患者中ApoE4等位基因存在或不存在的试剂盒，其包含：
a)至少一种特定用于检测ApoE4等位基因存在或不存在的试剂；和
b)基于ApoE4状态而推荐治疗选择的使用说明书。
34.权利要求33的试剂盒，其中试剂包含用于检测患者中ApoE4等位基因的核酸。
35.权利要求33的试剂盒，其中试剂包含至少一种基因特异的基因分型寡核苷酸。
36.权利要求33到35中任一项所述的试剂盒，其中试剂包含两种基因特异的基因分型寡核苷酸。
37.权利要求33到36中任一项所述的试剂盒，其中试剂包含至少一种基因特异的基因分型引物组合物，其中该引物组合物包含至少一种基因特异的基因分型寡核苷酸。
38.权利要求37的试剂盒，其中基因特异的基因分型引物组合物包含至少两套等位基因特异的引物对。
39.权利要求38的试剂盒，其中两种等位基因特异的基因分型寡核苷酸包装在分别的容器中。
40.用于确定痴呆患者的治疗策略的试剂盒，其包含：
a)能够识别并结合ApoE4基因的多肽表达产物的抗体；
b)适于容纳所述抗体和来自所述个体的体液样品的容器，其中如果ApoE4多肽存在，那么该抗体可以接触该ApoE4多肽；
c)检测所述抗体与ApoE4多肽结合的方法；和
d)试剂盒的使用说明书。
41.用于确定痴呆患者的治疗策略的试剂盒，其包含：
a)能够识别并结合ApoE4基因的mRNA表达产物的多核苷酸；
b)适于容纳所述多核苷酸和来自所述个体的体液样品的容器，其中如果存在ApoE4 mRNA，那么所述多核苷酸可以接触该ApoE4 mRNA；
c)检测所述多核苷酸与ApoE4 mRNA结合的方法；和
d)试剂盒的使用说明书。
42.用于确定痴呆患者的治疗策略的试剂盒，其包含：
a)能够识别并结合ApoE4基因的某部分DNA序列的多核苷酸；
b)适于容纳所述多核苷酸和来自所述个体的体液样品的容器，其中如果ApoE4 DNA序列存在，那么该多核苷酸可以接触该ApoE4 DNA序列；
c)检测所述多核苷酸与ApoE4 DNA序列结合的方法；和
d)试剂盒的使用说明书。
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