ES2327500T3

ES2327500T3 - Implante de traquea bioartificial y procedimiento para su fabricacion.

Info

Publication number: ES2327500T3
Application number: ES02779217T
Authority: ES
Inventors: Ole H. Brenning; Axel Haverich
Original assignee: Corlife OHG
Current assignee: Corlife OHG
Priority date: 2001-11-20
Filing date: 2002-11-13
Publication date: 2009-10-30
Anticipated expiration: 2022-11-13
Also published as: DE10156561A1; WO2003045277A1; AU2002342564A1; EP1446070B1; EP1446070A1; DE50213592D1; ATE432671T1

Abstract

Procedimiento para la fabricación de un implante de tráquea bioartificial, en el que se introducen células viables con función (40) de sostén entre una matriz (10) interna, en forma de tubo o de tubo flexible, biológica o artificial y una matriz (30) de tejido tubular, externa a) acelularizada o parcialmente acelularizada, b) acelularizada o parcialmente acelularizada y al menos parcialmente recolonizada o c) nativa, dispuesta de manera coaxial con respecto a ésta, dotada de una alimentación (20) vascular, disponiéndose la matriz (10) interna dentro de la matriz (30) de tejido externa de tal modo, que entre ambas queda o puede formarse fácilmente un espacio tubular, anular o en forma de tubo flexible, en el que se introducen las células con función de sostén y se cultivan hasta la formación de un complejo celular entre las matrices.

Description

Implante de tráquea bioartificial y procedimiento para su fabricación.

La invención se refiere a un implante de tráquea bioartificial y a un procedimiento para su fabricación.

Por implante "bioartificial" se entiende en el presente documento un tejido a partir de materiales biológicos obtenido con los medios de la denominada "ingeniería de tejidos" reproducido con medios técnicos. En un sentido más amplio se entienden por esto en el presente documento también aquellos constructos, en los que están incorporados materiales artificiales, no biológicos (materiales sintéticos, polímeros), aunque a menos que no puedan degradarse biológicamente, preferiblemente en una posición completamente recubierta por materiales biológicos o en una posición, en la que no cabe esperar ninguna reacción inmunológica desfavorable sobre el material artificial, tal como por ejemplo en zonas dirigidas desde el organismo hacia fuera o hacia el tracto digestivo.

Como base para el tejido o implante bioartificial se utilizan sustancias de matriz biológicas, por regla general colágeno, o materiales sintéticos biológicamente tolerables, dado el caso biológicamente degradables; éstas pueden embutirse o verterse en una estructura. Por matriz de tejido biológica se entiende aquélla que, tras la acelularización de un material biológico natural obtenido mediante extracción del organismo queda como "andamio" con estructura natural. A continuación se colonizan (recolonizan) las diferentes matrices, dado el caso tras un almacenamiento intermedio, congelación o cualquier otra etapa de procesamiento, con células viables. Las diferentes células necesarias para la colonización se expanden con frecuencia y a ser posible a partir de células autólogas y se cultivan in vitro.

Ocasionalmente, se utilizan como matriz también materiales sintéticos biológicamente tolerables, que se enmascaran mediante colonización con células propias del organismo, para evitar un rechazo. Cuando se utilizan materiales sintéticos biológicamente degradables, se espera que éstos, con el tiempo, se transformen en el organismo en material natural propio del organismo (remodelado). Sin embargo, estos intentos son a menudo insatisfactorios.

La invención se refiere especialmente a un implante de tráquea bioartificial.

Numerosas causas requieren una resección y reconstrucción de la tráquea. Entre éstas se encuentran las malformaciones congénitas, tales como la traqueostenosis de segmento largo, agenesia o atresia, fístulas traqueoesofágicas o traumatismos en el sentido de un traumatismo por intubación o tras accidentes. Además los tumores primarios y secundarios (cáncer de esófago, cáncer de tiroides) hacen necesaria dentro de la cirugía tumoral una resección adecuada, que hoy en día va acompañada exclusivamente de anastomosis quirúrgicas de la tráquea (Backer CL, Mavroudis C, Dunham ME, Holinger L., Intermediate-term results of the free tracheal autograft for long segment longenital tracheal stenosis. J Pediatr Surg 2000 Jun; 35(6): 813-8; discussion 818-9).

Especialmente la resección de la carina presenta la mayor mortalidad posoperatoria en la cirugía torácica. Aproximadamente el 17% de los pacientes mueren durante la operación, en aproximadamente el 39% de los pacientes aparecen complicaciones posoperatorias, que en aproximadamente el 43% de los casos conducen a la muerte. Entre las complicaciones más frecuentes se encuentra la insuficiencia o estenosis de la anastomosis (el 17,2%). La supervivencia de 5 años se encuentra en aproximadamente el 42% (Mitchell 2001). El motivo esencial para las complicaciones es la elevada tensión que se produce en la anastomosis de la tráquea. A medida que aumenta la longitud del segmento traqueal que ha de resecarse, aumenta la tensión en la anastomosis y disminuye el éxito de la operación.

Por este motivo, las resecciones están limitadas a por debajo del 50% de la longitud de la tráquea (como máximo aproximadamente 4-6 cm). Por esto se limita claramente la indicación de una intervención quirúrgica. Por numerosos criterios de exclusión, una gran parte de los pacientes pierde la posibilidad de una intervención quirúrgica. Por tanto, para la gran mayoría de los afectados, la disponibilidad de un elemento de sustitución adecuado de la tráquea representa una opción de tratamiento vital.

Se han llevado a cabo numerosos intentos para colocar en la tráquea tejido de polipropileno sintético (tubos de malla Marlix) (Sekine T, Nakamura T, Liu Y, Ueda H, Matsumoto K, Shimizu Y. Collagen coated Y-shaped prosthesis for carinal replacement promotes regeneration of the tracheal epithelium. ASAIO J julio-agosto de 2000; 46(4): 421-5; Sekine T, Nakamura T, Shimizu Y, Liu Y, Ueda H, Matsumoto K, Experimental carinal replacement with an Y-shaped collagen-conjugated prosthesis. J Thorac Cardiovasc Surg junio de 2000; 48(3): 125-9) o conductos biológicos (por ejemplo segmentos aórticos, homoinjertos crioconservados) (Kunachak S, Kulapaditharom B, Vajaradul Y, Rochanawutanon M, Cryopreserved, irradiated tracheal homograft transplanation for laryngotracheal reconstruction in human beings. Otolaryngol Head Neck Surg junio de 2000; 122(6):911-6), aunque hasta hoy ninguno de los métodos ha encontrado aceptación clínica. En todos estos procedimientos se producen necrosis en la zona de las anastomosis y por tanto salidas de aire, puesto que estos implantes no pudieron conectarse con los vasos propios del paciente.

Por tanto, para la sustitución del tejido traqueal tras resecciones necesarias no está disponible actualmente ningún implante. Existe una necesidad urgente de implantes con los que puedan evitarse las complicaciones posoperatorias y con los que pueda reducirse la hasta ahora elevada mortalidad intraoperatoria.

Por el documento WO 00/15765 A se conoce un tejido submucoso intestinal como sustrato de cultivo de células. Se prefiere la túnica submucosa. Pueden colonizarse diferentes células, especialmente células epiteliales.

Por el documento WO 00/59618 A se conoce un procedimiento para la colonización de sustratos con células biológicas, en el que un sustrato preferiblemente tubular se sujeta en un dispositivo de colonización y según determinadas indicaciones lo rodea una suspensión celular.

El documento WO 99/62424 A da a conocer un implante de tráquea en el que está previsto aplicar células luminales sobre una matriz de colágeno tubular acelularizada. Esto también puede ocurrir con múltiples capas con diferentes tipos de células.

La invención se basa por tanto en el objetivo de proporcionar un implante de tráquea bioartificial y un procedimiento para su fabricación, que evite los inconvenientes existentes en los implantes hasta el momento y permita una unión y alimentación del implante en el lugar de implantación similares a las naturales.

Según la invención, este objetivo se soluciona mediante el procedimiento según la reivindicación 1, concretamente un procedimiento para la fabricación de un implante de tráquea bioartificial, en el que se introducen células viables con función de sostén entre una matriz interna, en forma de tubo o de tubo flexible, biológica o artificial y una matriz de tejido tubular, externa

a): acelularizada o parcialmente acelularizada,

b): acelularizada o parcialmente acelularizada y al menos parcialmente recolonizada o

c): nativa,

dispuesta de manera coaxial con respecto a ésta, dotada de una alimentación vascular, disponiéndose la matriz interna dentro de la matriz de tejido externa de tal modo, que entre ambas queda o puede formarse fácilmente un espacio tubular, anular o en forma de tubo flexible, en el que se introducen las células con función de sostén y se cultivan hasta la formación de un complejo celular entre las matrices.

\vskip1.000000\baselineskip

Esto puede producirse en condiciones de cultivo habituales a 37ºC en la incubadora.

El objetivo se soluciona además mediante un implante de tráquea bioartificial según la reivindicación 15.

En el caso de la matriz de tejido tubular externa se trata según la invención de una matriz de tejido tubular, es decir, en forma de tubo o de tubo flexible, alogénica, xenógena y autóloga a) acelularizada o parcialmente acelularizada o b) acelularizada o parcialmente acelularizada y al menos parcialmente recolonizada o c) nativa, extraída de un cuerpo donante, biológica, vascularizada, que preferiblemente procede del tracto gastrointestinal y especialmente se ha extraído del yeyuno o íleo con rama vascular adherida y con posibilidad de conexión. Una matriz de este tipo se conoce por el documento WO 02/064179 A2.

A ser posible, el tejido aislado para la matriz de tejido tubular externa debe ser autólogo, es decir, haberse extraído del paciente que posteriormente recibirá el implante de tráquea. Alternativamente se consideran materiales alogénicos de donantes de órganos humanos o también matrices de tejido xenógenas.

La matriz de tejido tubular externa tiene una alimentación vascular primaria, cuya estructura también permanece en caso de una posible acelularización que, como aún se describirá a continuación, no siempre es necesaria. En el aislamiento del tejido se extrae al menos una rama vascular funcional, que también originalmente (es decir, de manera primaria) está conectada con el tejido, junto con el tejido y se prepara con éste. La al menos una rama vascular o árbol vascular puede estar realizada/o en una realización especialmente preferida de manera que esté conectada/o con una red capilar intramural, es decir que pasa por las capas de pared de la matriz de tejido. Puede tratarse de una red vascular de luz pequeña, media o grande, debiendo tenerse en cuenta que la banda vascular superior puede conectarse de manera quirúrgica con el sistema vascular sanguíneo del receptor del implante (anastomosarse).

La rama o árbol vascular consiste en general en una arteria aferente y una vena eferente. La matriz de tejido puede estar conectada también con hasta 6, preferiblemente de 2 a 5 ramas vasculares. De manera especialmente preferida, la rama vascular está dotada de una red correspondiente a partir de vasos de luz pequeña. La cantidad de ramas vasculares que ha de seleccionarse en cada caso depende, entre otros, de la longitud y el tamaño del implante. Todo el sistema de vasos sanguíneos descrito anteriormente representa la alimentación vascular de la matriz de tejido biológica tubular externa.

La acelularización de las matrices biológicas utilizadas en este procedimiento puede realizarse con los procedimientos suficientemente conocidos para el experto, es decir, con todos los medios conocidos tales como procedimientos químicos, bioquímicos, físicos, mecánicos u otros, y por tanto, en el presente documento, no es necesario describirla especialmente. Con frecuencia, la acelularización se produce mediante digestión celular enzimática, o con agentes químicos protectores en una solución, en la que se deposita la matriz. Es posible una separación al menos parcialmente mecánica de las células, sobre todo de las capas superiores.

\newpage

En caso de utilizar matrices alogénicas o xenógenas se acelularizan la matriz y las ramas vasculares preferiblemente en su totalidad. Por el contrario, en caso de utilizar una matriz autóloga, por regla general una matriz del intestino propia del paciente, puede prescindirse en casos individuales de una acelularización con una recolonización autóloga posterior o producirse mediante cocultivo. De este modo puede conservarse casi completamente la recolonización de la red capilar y del sistema vascular con las ramas vasculares. El experto puede seleccionar los procedimientos de acelularización adecuados según su finalidad. La matriz de tejido obtenida tras una acelularización parcial o completa puede colonizarse a continuación con procedimientos de colonización también conocidos para el experto con células biológicas, viables, es decir que pueden adherirse y seguir creciendo.

Como matriz interna puede utilizarse un tubo de material biocompatible o una matriz de tejido acelularizada o parcialmente acelularizada, dado el caso al menos parcialmente recolonizada, o nativa en forma de tubo. Siempre que se trate de de un material biológico, es válido para la acelularización y recolonización fundamentalmente lo dicho para la matriz tubular externa. Alternativamente puede utilizarse un material biocompatible, por ejemplo de material sintético. Se consideran, entre otros, tubos de tejidos de fibras sintéticas, en los que por ambos lados pueden crecer bien las células.

Alternativamente pueden utilizarse también como matriz de sostén interna tubos o láminas lisos con una superficie preferiblemente repelente, pudiendo volver a retirarse ésta tras finalizar el procedimiento. Sobre la superficie interna del implante están al descubierto entonces tras finalizar el procedimiento las células preferiblemente autólogas. Éstas pueden colonizarse a continuación con una capa de recubrimiento adicional, por ejemplo con epitelio ciliado.

La matriz interna, biológica o artificial en forma de tubo, que tiene un diámetro de sección transversal inferior que la matriz de tejido externa (que está alimentada con vasos) se dispone para el procedimiento dentro de la matriz de tejido tubular externa de tal modo, que entre ambas queda o puede formarse fácilmente un espacio tubular, anular o de nuevo en forma de tubo flexible, en el que ahora se introducen células con función de sostén.

Por "células con función de sostén" deben entenderse en el sentido de esta invención aquellas células que también de forma natural ejercen en el organismo una función de sostén (células diferenciadas de un tejido de sostén), en primer lugar células cartilaginosas, tal como existen en la tráquea natural. Las células cartilaginosas también pueden utilizarse añadiendo otras células con función de sostén, tales como por ejemplo células óseas. De este modo puede variarse la resistencia del implante. Preferiblemente se utilizan células cartilaginosas (condrocitos), más preferiblemente de cartílago costal. Para obtener las células deseadas pueden utilizarse también células precursoras que puedan desarrollarse, preferiblemente células madre mesenquimatosas, que a lo largo del cultivo dentro de este procedimiento maduran in situ para obtener las células deseadas con función de sostén.

Para la introducción entre la matriz interna en forma de tubo o de tubo flexible y la matriz externa dotada de la alimentación vascular, las células con función de sostén pueden estar presentes como es habitual en suspensión en solución nutritiva o sangre, o bien en una preparación con adyuvantes biológicos o sintéticos, tales como por ejemplo adhesivo de fibrina, colágeno, etc. y/o células adicionales. La preparación o la suspensión pueden tener una consistencia viscosa o pastosa y contener por ejemplo formadores de gel y/o polímeros.

La introducción se lleva a cabo con medios habituales, por ejemplo mediante inyección. En una forma de realización preferida, la matriz de tejido externa puede unirse de forma anular de manera múltiple sobre la matriz interna antes de introducir las células con función de sostén. Esto se produce por ejemplo mediante hilos o tubos flexibles (elementos de unión) desde fuera. A continuación, tal como se ha descrito anteriormente, se inyectan las células en solución nutritiva o una preparación, en uno o preferiblemente varios espacios anulares entre la matriz externa e interna.

Adicionalmente pueden introducirse células adicionales junto con las células con función de sostén o antes o después de introducir las células con función de sostén en el espacio anular. Éstas u otras células adicionales también pueden aplicarse y colonizarse en etapas adicionales en el exterior sobre la matriz de tejido externa con la al menos una rama vascular, situada en el exterior, y/o en el interior sobre el lado interno de la matriz interna en forma de tubo (en la luz).

Como células adicionales pueden utilizarse según necesidad las más diversas células, especialmente fibroblastos y/o células mesenquimatosas, tales como células musculares lisas, células endoteliales o células epiteliales. Las células seleccionadas para la colonización pueden ser células autólogas, alogénicas o xenógenas, muy preferiblemente sin embargo autólogas con respecto al receptor posterior del implante. Es ventajoso, colonizar con diferentes células por zonas y/o en varias capas, tal como corresponde a la construcción morfológica y a la función del tejido traqueal natural, como conoce el experto. En este caso también cabe mencionar la colonización de la capa interna/luminal con epitelio ciliado. Puede prescindirse de la recolonización desde el exterior cuando la matriz es nativa y autóloga y tras la implantación debe transformarse por el propio organismo o es acelularizada y tras la implantación debe colonizarse por el propio organismo.

Puede prescindirse de la recolonización desde el interior cuando la matriz interna es artificial, xenógena o alogénica y acelularizada, o autóloga. Según las necesidades del caso individual el experto puede decidir si se prescinde de la colonización in vitro, sin embargo en general será recomendable una colonización con células autólogas.

\newpage

En caso deseado pueden utilizarse mezclas de diferentes tipos de células. Las células pueden añadirse mezcladas en preparaciones de células con adyuvantes. Las células pueden utilizarse también mezcladas con polímeros, tales como policarbonatos, polilactatos, etc. Especialmente pueden utilizarse colágenos o por ejemplo (adhesivos de) fibrina.

En caso de utilizar una matriz de tejido alogénica o xenógena la al menos una rama vascular se coloniza preferiblemente con células endoteliales. En caso de que la matriz interna también se haya obtenido biológicamente mediante extracción de tejido, en el interior (en la luz) se colonizan preferiblemente células endoteliales vasculares autólo-
gas.

Las células que han de utilizarse para una colonización proceden preferiblemente de material obtenido de forma biótica, especialmente del receptor previsto del implante. Se expanden in vitro con procedimientos habituales y se cultivan con los procedimientos conocidos en el estado de la técnica.

Ya durante la colonización pueden alimentarse las células colonizadas con ayuda de la alimentación vascular conectada, concretamente la una o varias ramas vasculares, con nutrientes y oxígeno. De este modo se facilita y acelera en primer lugar la adhesión y el crecimiento. Precisamente en caso de mayores cantidades de células y mayores grosores de capa, la alimentación a través del sistema vascular primario presente según la invención posibilita inicialmente una alimentación suficiente y duradera con nutrientes, minerales y oxígeno. Así puede evitarse una muerte prematura del implante por muerte celular y conversión degenerativa. Sólo así puede obtenerse la vitalidad de complejos celulares, tejidos u órganos complejos. Mediante la colonización de la matriz de tejido con células se obtiene un implante de tráquea bioartificial, vascularizado de forma primaria según la invención. Éste tiene la ventaja de que al contrario que los tejidos sintéticos, biológicos y bioartificiales habituales está vascularizado de forma primaria. Por tanto, simultáneamente con el transplante puede conectarse a la circulación sanguínea del receptor del transplante. Las células en todas las capas de pared del implante, esto es, también en las áreas situadas más profundamente pueden alimentarse con nutrientes y no se mueren. De este modo, al contrario que los implantes de tráquea hasta ahora disponibles se evita una degeneración prematura, especialmente una insuficiencia o estenosis en la zona de las anastomosis y adicionalmente se garantiza la funcionalidad del transplante o implante a largo plazo.

Cuando por lo menos se aísla una rama vascular completa ya al extraer el tejido para la matriz de tejido externa como tronco vascular intacto con red capilar intramural conectada y durante las etapas adicionales del procedimiento se mantiene funcional, el implante de tráquea bioartificial, vascularizado de forma primaria según la invención tiene la ventaja de ya durante la fabricación tener la estructura geométrica morfológica y composición celular bioquímica presente in vivo. De este modo se facilita el crecimiento del transplante o implante así como una aceptación funcional en el receptor correspondiente a las condiciones y necesidades naturales.

Una gran ventaja adicional del implante de tráquea bioartificial, vascularizado de forma primaria según la invención consiste en que además de células autólogas puede utilizarse también material de tejido autólogo (preferiblemente fragmentos de intestino del receptor), de modo que se evita un rechazo.

El implante de tráquea según la invención puede ser una tráquea entera, por ejemplo también con bifurcación, o una parte. El elemento de sustitución de la tráquea puede estar adaptado según las necesidades del receptor, como parte de tráquea más larga o más corta o fragmento de tráquea arbitrario.

Puesto que mediante la técnica descrita en el presente documento existe la posibilidad de adaptar la longitud del elemento de sustitución de la tráquea, pueden evitarse fuerzas de tracción en las anastomosis, que son causa de la aparición posoperatoria de estenosis o insuficiencias en la zona de las anastomosis. El elemento de sustitución de la tráquea según la invención puede utilizarse para el tratamiento de cualquier patología de la tráquea (y del árbol bronquial), que vaya acompañada de por ejemplo compresión o destrucción de la tráquea y que por ejemplo haga necesaria una resección de la tráquea o de un segmento de la tráquea.

Campos de aplicación especialmente preferidos son, entre otros, la sustitución de la tráquea y de los bronquios en caso de desarrollo embrionario defectuoso o malformaciones congénitas pulmonares y traqueales, tales como por ejemplo la traqueostenosis de segmento largo, agenesia o atresia, fístulas traqueoesofágicas. En caso de patologías, tras lesiones o pérdida por traumatismo, tumores o infecciones de la tráquea o de un bronquio.

Mediante la invención se proporcionó por primera vez un implante de tráquea vascularizado vital, que precisamente se adapta bien en el campo de las anastomosis y de este modo evita problemas tales como los que se producen al utilizar prótesis traqueales artificiales. El implante de tráquea según la invención posibilita reconstruir de manera suficiente grandes defectos a largo plazo y sin tensión. Cabe esperar que mediante el implante de tráquea nuevo pueda reducirse enormemente por primera vez la tasa de complicaciones intra y posoperatoria (morbilidad) y relacionado con esto la tasa de mortalidad en caso de patologías traqueales. Las operaciones sucesivas tras operaciones de tráquea en la infancia se hacen superfluas mediante un crecimiento propio en longitud. La invención tiene por tanto también un significado considerable en cuanto a economía sanitaria.

Mediante la invención se abren posibilidades de tratamiento completamente nuevas de fístulas, neoplasias traqueales, traqueostenosis de segmento corto y especialmente de segmento largo, etc.

\newpage

A continuación se representa la invención con más detalle mediante un ejemplo. El ejemplo sirve únicamente a modo de ilustración. Para el experto instruido en el campo se harán evidentes inmediatamente a partir del mismo otras formas de realización posibles.

En primer lugar se explica el procedimiento general mediante un esquema.

La figura 1 muestra una representación esquemática de la construcción del implante de tráquea bioartificial, vascularizado de forma primaria en un corte longitudinal.

El implante designado en general con 100 muestra una matriz 10 interna, en forma de tubo, que no está vascularizada y que acaba el implante durante la fabricación, hacia la superficie interna como una matriz de sostén. En el exterior, sobre la matriz 10 interna, en forma de tubo se encuentra, dispuesta de manera coaxial alrededor de la matriz 10, una matriz 30 de tejido externa, dotada de una alimentación 20 vascular. Ésta puede estar colocada al inicio de la fabricación del implante sobre la matriz 10 interna, o puede estar sujeta en un reactor adecuado con una separación con respecto a la matriz 10 interna de tal modo, que entre las dos matrices 10 y 30 se encuentre un espacio anular. La alimentación 20 vascular parte de una rama vascular que comprende una vena (V) y una arteria (A). La figura 1 muestra además zonas anulares colonizadas de células con función 40 de sostén, especialmente condrocitos de cartílago costal. Las zonas anulares pueden obtenerse por ejemplo inyectando una suspensión de células de sostén (condrocitos) tras la unión de las zonas anulares entre las matrices 10 y 30 colocadas en primer lugar una sobre otra. Tras la inyección se incuban las células sobre la matriz o entre las matrices hasta el grosor de anillo deseado a 37ºC. Además, en el ejemplo de realización mostrado esquemáticamente sobre el lado interno de la matriz 10 interna, en forma de tubo está aplicado un epitelio 50 ciliado.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo de aplicación

Animales donantes

Como donantes de órganos para la obtención de la matriz y para el aislamiento de, entre otros, células cartilaginosas se utilizaron cerdos hembra con una edad de 3 meses.

Para la fabricación de la matriz se aisló un segmento de intestino con rama vascular adherida y se perfundió con una solución de nebacetina a una temperatura de 4ºC (1 g de nebacetina/1000 ml de NaCl al 0,9%) por vía intravascular y por vía intraluminal. Para el transporte, se almacenó el segmento de intestino vascularizado también en una solución de nebacetina a una temperatura de 4ºC. Para la obtención de condrocitos se utilizó cartílago costal. Para ello se extrajeron por ambos lados las dos costillas inferiores y también se almacenaron y transportaron en una solución de nebacetina a una temperatura de 4ºC. La extracción de órganos así como todas las operaciones en el animal se llevaron a cabo siempre en las condiciones de operación estériles habituales.

\vskip1.000000\baselineskip

Aislamiento de células

Se trituró el cartílago costal en fragmentos de 1 mm^{3}, se lavó en solución PBS y se incubó con colagenasa tipo II 1 mg/ml (Seromed, Berlín, Alemania) durante 16 h en un matraz de Erlenmeyer a 37ºC en baño de agua. Mediante filtración a través de un tamiz de nailon (tamaño de poro 200 m, Reichelt Chemie, Heidelberg) se separaron los condrocitos del cartílago sin digerir. La inactivación de la colagenasa tuvo lugar mediante suspensión en medio celular (HAM-F12, FCS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%) y centrifugación. Para comprobar la vitalidad y determinar la cantidad de células se utilizó la tinción con azul trípano.

\vskip1.000000\baselineskip

Cultivo celular tridimensional

En un dispositivo de cultivo (biorreactor) se sujetó un tubo de matriz no vascularizado, a través del que se tendió una matriz vascularizada obtenida tal como anteriormente. En el espacio a modo de hendidura se inyectaron los condrocitos, se suspendieron en medio nutritivo o adhesivo de fibrina con aproximadamente 10^{7} células/ml. El dispositivo de cultivo se rellenó con medio celular (HAM-F12, FCS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%) y se incubó a 37ºC durante de 4 a 6 semanas. A este respecto se rodeó la matriz por fuera y por dentro con medio celular.

\vskip1.000000\baselineskip

Formas de realización alternativas

Se añadieron los condrocitos también en mezcla con células de médula ósea o células óseas. La proporción puede ajustarse libremente.

Tras finalizar la colonización de condrocitos se aplicaron por fuera sobre el implante (en el lado de la rama vascular) células endoteliales y células endoteliales vasculares luminales.

Claims

1. Procedimiento para la fabricación de un implante de tráquea bioartificial, en el que se introducen células viables con función (40) de sostén entre una matriz (10) interna, en forma de tubo o de tubo flexible, biológica o artificial y una matriz (30) de tejido tubular, externa

a): acelularizada o parcialmente acelularizada,

c): nativa,

dispuesta de manera coaxial con respecto a ésta, dotada de una alimentación (20) vascular, disponiéndose la matriz (10) interna dentro de la matriz (30) de tejido externa de tal modo, que entre ambas queda o puede formarse fácilmente un espacio tubular, anular o en forma de tubo flexible, en el que se introducen las células con función de sostén y se cultivan hasta la formación de un complejo celular entre las matrices.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como células viables biológicas con función (40) de sostén se utilizan células cartilaginosas (condrocitos), preferiblemente células cartilaginosas a partir de cartílago costal, o células cartilaginosas con adición de otras células de sostén, especialmente células óseas, y/o células precursoras que pueden desarrollarse para ello.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las células con función (40) de sostén se introducen en una preparación entre la matriz (10) interna y la matriz (30) de tejido externa.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la matriz (30) de tejido externa se une de forma anular de manera múltiple sobre la matriz (10) interna antes de introducir las células con función (40) de sostén y porque las células (40) se introducen en varios espacios anulares entre la matriz externa y la interna.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se retira la matriz (10) interna tras finalizar el procedimiento.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque adicionalmente se introducen células adicionales junto con las células con función (40) de sostén o antes o después de introducir las células con función de sostén entre la matriz (10) interna y la matriz (30) de tejido tubular externa.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque adicionalmente se aplican células adicionales externa y/o internamente (en la luz) sobre el implante de tráquea.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque como células adicionales se utilizan fibroblastos y/o células mesenquimatosas, tales como células musculares lisas, células endoteliales o células epiteliales.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se utilizan mezclas de células y/o mezclas de células con polímeros.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque para al menos uno de los tipos de células se utilizan células autólogas.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la matriz (30) de tejido dotada de la alimentación (20) vascular procede del tracto gastrointestinal y preferiblemente se extrae del yeyuno o íleo.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la alimentación (20) vascular presenta al menos una rama vascular conectada de manera primaria con la matriz (30) de tejido, especialmente una rama vascular o un árbol vascular venoso (V) y arterial (A), que además está conectado preferiblemente con una red capilar intramural, habiéndose acelularizado o acelularizado parcialmente la al menos una rama vascular preferiblemente junto con la matriz (30) de tejido conectada.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque las células con función de sostén y/o células colonizadas adicionales se alimentan con nutrientes a través de la al menos una rama vascular.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque como matriz interna, en forma de tubo o de tubo flexible, biológica o artificial se utiliza un tubo de material biocompatible, una lámina en forma de tubo flexible o una matriz de tejido acelularizada o parcialmente acelularizada, dado el caso al menos parcialmente recolonizada, o nativa en forma de tubo.

15. Implante de tráquea bioartificial, que puede obtenerse mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Implante de tráquea bioartificial con una matriz (10) interna, en forma de tubo o de tubo flexible, biológica o artificial, una matriz (30) de tejido tubular, externa a) acelularizada o parcialmente acelularizada, b) acelularizada o parcialmente acelularizada y al menos parcialmente recolonizada, o c) nativa, dotada de una alimentación (20) vascular así como con células viables con función (40) de sostén que se encuentran en al menos un espacio anular entre las matrices (10; 30).

17. Implante de tráquea bioartificial según la reivindicación 16, caracterizado porque sobre la superficie dirigida hacia dentro de la matriz (10) interna se encuentra epitelio ciliado.