ES2237918T3

ES2237918T3 - Reconstruccion peneana mediante tejido corporal.

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Publication number: ES2237918T3
Application number: ES99924284T
Authority: ES
Inventors: Anthony Atala
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1998-05-21
Filing date: 1999-05-17
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2019-05-17
Also published as: US6514292B1; AU750058B2; AU4082199A; EP1079772A1; EP1079772B1; JP4282233B2; JP2002515292A; DE69923674T2; WO1999059506A1; CA2333058A1; ATE288767T1; DK1079772T3; EP1079772A4; PT1079772E; WO1999059506A9; CA2333058C; DE69923674D1

Abstract

Estructura cavernosal corporal protésica implantable para su uso en reconstrucción peneana, comprendiendo dicha estructura una matriz polimérica que presenta una forma alargada con células de músculos lisos cavernosas corporales sembradas sobre la misma, comprendiendo además dicha estructura un medio adaptado para recibir una uretra, de modo que la implantación de dicha estructura induce la implantación y crecimiento de células de músculos lisos formándose así un elemento cavernoso artificial.

Description

Reconstrucción peneana mediante tejido corporal.

Antecedentes de la técnica Campo de la invención

La invención se refiere a elementos estructurales, procedimientos y materiales para preparar los elementos estructurales y al uso de dichos elementos estructurales para el tratamiento de los defectos del pene empleando un implante que comprende tejido cavernosal corporal crecido sobre un soporte y en particular, se refiere a procedimientos y materiales útiles en la reconstrucción de un pene eréctil.

Descripción de la técnica anterior

El pene o falo es el órgano masculino de copulación y de excreción urinaria, que comprende una raíz, cuerpo y extremo o glande del pene. La estructura del pene consiste en dos cuerpos cilíndricos paralelos, la córpora cavernosa y por debajo de ellos el corpus espongiosum, a través del cual pasa la uretra. La raíz del pene está unida a las partes descendentes del hueso púbico por la crura, siendo esta última los extremos de la córpora cavernosa. La uretra pasa a lo largo del lado inferior del pene y luego se eleva para abrirse en la punta de forma cónica expandida, el glande, que se adapta como un casquete sobre el extremo del pene. La caverna, también denominada las cavernae, corporum o cavernosorum penis, se refiere a las cavernas de córpora cavernosa del pene o los espacios dilatables dentro de la córpora cavernosa del pene, que se llenan con sangre y hacen que se distiendan con la erección. La piel suelta rodea el pene y también forma la piel retráctil o prepucio. Corporal, corpóreo y corpórico son términos utilizados para describir tejidos que se derivan de la córpora cavernosa o que se pueden desarrollar, diferenciar o alterar por medios naturales o artificiales en el tejido de la córpora cavernosa.

Una diversidad de anormalidades adquiridas del tracto genitourinario requiere una reconstrucción quirúrgica y/o aumento del falo. Los cirujanos consideran dichas condiciones diversas como genitaria ambigua, complejo extrofia-epispadias, micropene, afalia, curvaturas peneanas severas, pene hipocrático, pene oculto, pene doble, pene palmeado (penis palmatus), penis plástica, impotencia, reasignación genital hembra a macho, hipospadias ventral y falo retraído (en pacientes con lesiones en la columna vertebral y defectos del pene adquiridos por causas traumáticas o quirúrgicas), encuentran dificultades comunes presentadas por la falta de tejido corporal normal suficiente para la faloplastia funcional satisfactoria (Wood- house, C.R.J.: J. Urol. 152: 645, 1994; Atala, A et al. y otros J. Urol, 150: 745, 1993).

Las modalidades operativas actuales, destinadas al alargamiento y reconstrucción del pene, suelen basarse en técnicas desarrolladas para el tratamiento de las epispadias asociadas con el falo corto. Aunque estas técnicas, tales como lisis del ligamento suspensorio del pene o el desprendimiento corporal de las ramas isquiopúbicas, que fueron diseñadas para liberar la córpora de sus uniones ligamentosas, han dado lugar a incrementos en la longitud visible del pene, estando limitadas por su dependencia inherente por la presencia de tejido corporal nativo suficiente. Muchos de estos pacientes, aun cuando sean potentes, están insatisfechos debido a las limitaciones en la longitud de su pene.

Las operaciones destinadas a la faloplastia total o casi total que utilizan técnicas de colgajo libre pueden producir resultados estéticamente aceptables, pero han sido decepcionantes en la obtención de rigidez suficiente para permitir la penetración sexual. Los tejidos de autoimplante, solos o junto con prótesis de penees sintéticas, han sido incapaces de sustituir satisfactoriamente la función eréctil muy especializada del pene. Además, implantes autólogos y sintéticos similares han dado lugar a numerosas complicaciones que comprenden las de erosión, extrusión, resorción, curvado y dislocación. Resulta evidente que los procedimientos actuales están limitados debido a la falta de un sustituto adecuado para el tejido eréctil funcional normal (Horton, C.E. y Dean, J.A.: World J. Surg., 14: 757, 1990; Hage, J.J. y De Graaf, F.H., Microsur, 14: 592, 1993).

Las técnicas quirúrgicas también han resultado inadecuadas para resolver los síntomas de impotencia. Existen muchas causas de la impotencia. La impotencia orgánica es la pérdida de la capacidad para obtener o mantener una erección funcional debido a la interrupción de algunos procesos fisiológicos. Las causas de la impotencia orgánica comprenden el trauma tal como lesión en la columna vertebral o fractura pélvica; complicaciones postoperativas tales como prostateotomía, cisteotomía, esfinterotomía externa y resección perineal abdominal; enfermedad vascular tal como arteriosclerosis o priapisma; enfermedad neurológica tal como neuropatía periférica y esclerosis múltiple; enfermedad endocrinológica y metabólica tal como diabetes, hipogonadismo e insuficiencia renal y medicación tal como estrógeno, parasimpatolítica, morfina y heroína. Los reflejos complejos implicados en el mecanismo de la erección son también afectados por factores fisiológicos.

La construcción fálica fue inicialmente intentada a finales de los años 1930 utilizando tejido autógeno (ver, p.e., Goodwin, W.E., et al, Phalloplasty J. Urol. 68: 903, 1952). Se utilizó cartílago costal como un rigidizador en pacientes con pérdida de pene traumática. Este procedimiento implica una cirugía multietápica que no tiene un resultado cosméticamente satisfactorio (Frumpkin, A. P.; Am. Rev. Sov. Med., 2:14, 1944). Las prótesis silicónicas llegaron a popularizarse en los años 1970 (Bretan, P.N., Jr; In: Genitourinary Prostheses. Montague, D.K. (ed) Philadelphia, W. B. Saunders Co, 1989, Small M. P. et al, Urology 5: 479, 1975). Aunque las prótesis de penees silicónicas son una modalidad de tratamiento aceptado para adultos, las complicaciones tales como erosión e infección siguen siendo un problema (Nukui, F. et al., Int. J. Urol, 4:52 1997; Kardar A. et al, Scan. J. Urol & Nephrol, 29:355, 1995). Otros problemas asociados a las prótesis sintéticas comprenden la extrusión a través de la uretra o depresión del eje dorsal del pene; edema linfático; irritación del glande en la corona; deslizamiento del glande sobre la prótesis; infección de la córpora cavernosa; perforación crural; perforación sectal del eje medio y dolor de pene (Small M.P. et al, Urology, 5:479, 1975).

Aunque las prótesis de penees silicónicas son una modalidad de tratamiento aceptada para adultos que requieren una reconstrucción peneana, su uso no ha sido generalmente aplicado a la población pediátrica, principalmente debido a los problemas a largo plazo asociados con estos dispositivos artificiales. Por lo tanto, existe la necesidad de implantes de pene biocompatibles y elásticos que podrían utilizarse en niños que requieren una reconstrucción genital.

Los inconvenientes de los métodos actuales han impuesto graves limitaciones sobre la reconstrucción fálica. Por ejemplo, los niños genotípicos nacidos con seudohermafroditismo y/o microfalo severos pueden ser subyugados a reasignación de género debido a la incapacidad del médico para proporcionar un nuevo falo funcional y suficientemente dimensionado. Análogamente, careciendo de la opción de recibir tejido eréctil funcional por transplante, el paciente impotente con fibrosis corporal y miopatía severa, insensible a agentes terapéuticos vasoactivos y bypass vascular, se deja con la elección última de la colocación de una prótesis de pene y se le niega la futura perspectiva de recuperar la función eréctil del pene normal.

Sumario de la invención

La presente invención resuelve los problemas e inconvenientes asociados con las estrategias y diseños actuales en la reconstrucción de tejidos y órganos para reformar elementos estructurales de soporte.

Una realización de la invención se refiere a una estructura cavernosal corporal protésica implantable para su uso en la reconstrucción peneana, comprendiendo dicha estructura una matriz polimérica que tiene una forma alargada con células de músculos lisos cavernosales corporales que le están implantadas, comprendiendo además dicha estructura un medio adaptado para recibir una uretra, gracias a lo cual la implantación de dicha estructura induce la implantación y el crecimiento de células de músculo liso, de modo que se forma un elemento cavernoso artificial.

Otra realización de la invención se refiere al uso de una matriz polimérica conformada en forma de un elemento estructural deseado para la preparación de un implanta para tratar un paciente con un defecto de pene. La matriz polimérica se incorpora depositando células de músculo liso disociadas sobre y en dicha matriz para formar una construcción matricial/celular, que debe implantarse dentro del pene de dicho paciente para formar una estructura cavernosa corporal protésica que tiene propiedades biomecánicas controladas.

Mientras que las células cavernosas cultivadas objeto de siembra en polímeros formarán un músculo corporal cuando se implanten in vivo, el tejido corporal reconstruido preferido contiene células endoteliales y musculares. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento para desarrollar tejidos corporal in vivo combinando células de músculo liso con células endoteliales (Figura 1).

Otras realizaciones y ventajas de la invención se ilustran, en parte, en la descripción que sigue y, en parte, serán evidentes a partir de esta descripción y pueden aprenderse a partir de la práctica de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra un diagrama esquemático del procedimiento del ejemplo. Las células de músculo liso corporales humanas y las células endoteliales humanas ECV 304 son objeto de crecimiento, expansión y siembra sobre soportes poliméricos biodegradables. Los soportes se implantan en ratones atímicos y se recuperan en diferentes puntos en el tiempo para sus análisis.

La Figura 2 ilustra unas vistas microscópicas de una estructura celular obtenida según el procedimiento de la presente invención. (A) las células endoteliales humanas ECV 304 se agregaron y formaron una red tubular de forma capilar extensiva en 27 días de cultivo. La microscopia de contraste de fase produjo una reducción desde x100. (B) Células ECV 304 coloreadas con anti-pancitoqueratina, reducidas desde x 100. (C) células de músculo liso cavernosas del cuerpo humano primarias coloreadas con alfa-actina de músculo liso. Reducida desde x 100. (D) las células endoteliales ECV 304 no se colorearon con anticuerpos anti-vWF policlonales. Reducida desde x
100.

La Figura 3 ilustra una vista microscópica de una estructura celular obtenida según el procedimiento de la presente invención. Los soportes poliméricos de células, a los 7 días después de la implantación, presentan la formación de bandas multicapas de músculo liso adyacente al endotelio. H & E, reducido desde x250.

La Figura 4 ilustra unas vistas microscópicas de una estructura celular obtenida según el procedimiento de la presente invención. (A) Análisis inmunocitoquímicos, utilizando anti-vWF colorearon los vasos nativos cuatro semanas después de la implantación. Los nuevos vasos compuestos de células ECV 304 dejaron de colorearse. Reducida desde x 400. La organización continuada de células endoteliales y musculares se observa a 4 semanas (B) y 6 semanas (C) después de la implantación. Las células endoteliales ECV 304 y los nuevos vasos están coloreados de forma positiva mientras que los vasos anfitriones dejaron de colorearse con anti-pancitoqueratinas. Reducida desde x 400 (B, 4 semanas), 200 (C, 6 semanas); x 400 (C, 4 semanas).

La Figura 5 ilustra unas vistas microscópicas de una estructura celular obtenida según el procedimiento de la presente invención. Los anticuerpos de alfa -actina identificaron el tejido de músculo liso adecuadamente organizado 6 semanas después de la implantación. Reducido desde x 400.

Descripción de la invención

En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a procedimientos y materiales para preparar un implante para tratamiento de un paciente que tiene un defecto anatómico del falo y que se puede tratar, al menos en parte, proporcionando un elemento de soporte estructural eréctil al falo. Este procedimiento puede utilizarse también para preparar un implante para tratar defectos similares en el clítoris para proporcionar un soporte eréctil necesario. El soporte estructural requerido se puede proporcionar según la presente invención, mediante elementos estructurales artificiales de tejidos de una forma predeterminada y que tienen propiedades controladas biomecánicas y eréctiles y que se implantan con células cavernosas corporales.

Una ventaja de los procedimientos de la invención es que permite que un pene reconstruido funcione de una manera sustancialmente similar al tejido corporal nativo con respecto a la función anatómica y fisiológica. Puesto que forma la parte voluminosa del parenquima del corpus cavernosa, el procedimiento más natural de reconstrucción cavernosa es utilizar el propio músculo liso corporal.

El tejido de córpora cavernosa puede obtenerse, de forma fácil y segura, bajo anestesia local, en un procedimiento quirúrgico percutáneo basado en paciente ambulatorio (Wespes, E. et al., Eur. Urol, 18:81, 1990). Una vez recogido, este tejido se puede utilizar para establecer cultivos de explantes de células de músculos lisos corporales humanas autólogas, fibroblastos y células endoteliales. Estas células, después de la expansión in vitro, pueden sembrarse en soportes poliméricos de adición poliglicólica de tipo biodegradable, donde pueden unirse y multiplicarse. Una vez entregados al entorno in vivo, como un autoimplante, en un procedimiento reconstructivo, las células pueden reorganizarse y recuperar su función fisiológica altamente especializada. La disponibilidad de células de músculo liso corporal recogidas para uso en transplante celular autólogo se pueden utilizar para el tratamiento de la impotencia según la presente invención.

Otra realización de la invención se refiere al tratamiento de células de músculos lisos corporales enfermos recogidas de pacientes impotentes. El tratamiento puede ser en la forma de alteración genética. La alteración genética puede realizarse utilizando técnicas generalmente reconocidas tales como transfecciones con base química o con base viral. Por ejemplo, algunas células de músculo liso cavernoso del cuerpo humano son defectuosas debido a una sobreproducción celular de la citoquina, que transforma el factor de crecimiento-1 (TGF-1). El incremento del TGF-1, a su vez, conduce a la síntesis y acumulación de colágeno excedente en pacientes con insuficiencia arterial, que da lugar a la fibrosis corporal (Moreland, R.B. et al J. Urol, 153:826, 1995). Aunque la administración de prostaglandina E_{1} (PGE_{1}) fue demostrado que suprime este efecto in vitro, la ablación de síntomas es solamente temporal. En una realización de la invención, células de músculo liso de córpora cavernosa son recogidas de un paciente impotente y genéticamente alteradas para reducir o eliminar la producción de TGF-1 o, como alternativa, para mejorar la producción de PGE_{1}. Las células son utilizadas para la reconstrucción peneana. El paciente puede tener una recuperación de la funcionalidad eréctil, una vez que estas células se utilicen para repoblar los cuerpos corporales enfermos.

Otra realización de la invención se refiere a un implante y al uso de dicho implante para el tratamiento de la disfunción eréctil mediante la preselección de una población de células particular sobre la base de la normalidad ultraestructural. La viabilidad de utilizar ultrasonidos para seleccionar células normales (eréctiles) y anormales (no eréctiles) fue ya demostrada (Jevtich, M et al J. Urol, 143: 289, 1990; Persson, C et al, J. Urol 142: 1462, 1989). El rendimiento del análisis ultraestructural en cultivos de explantes a partir de pacientes disfuncionales eréctiles permitiría la expansión seleccionada de una población de células ultraestructuralmente normales. La reintroducción un gran número de estas células funcionales en la córpora de estos pacientes puede utilizarse en una recuperación de la función eréctil. Una ventaja de este procedimiento es que el tratamiento no implicaría una alteración genética. Este modo de tratamiento puede ser más aceptable para algunas poblaciones de pacientes y agencias reguladoras.

Otra realización de la invención se refiere a un implante y al uso de dicho implante para el tratamiento de un trastorno del pene mediante el suministro quirúrgico de implantes celulares/poliméricos para empleo en la reconstrucción genital o como tratamiento para la impotencia. En este procedimiento, se puede utilizar un tratamiento percutáneo en el que un polímero inyectable actúa como el vehículo de entrega para las células de músculos lisos corporales. Por ejemplo, el tejido cavernoso corporal se puede aislar, cultivar y expandir y mezclar con un gel de matriz inyectable. La mezcla celular se inyecta para tratamiento percutáneo de un trastorno pernil, donde un bajo porcentaje de células de músculos lisos corporales en funcionamiento están presentes en el tejido nativo.

Otra realización de la invención se refiere a un implante y al uso de dicho implante para el tratamiento de un trastorno del pene mediante la reimplantación de células corporales con un factor de angiogenesis. El factor de angiogenesis puede ser exógeno o endógeno. El factor de angiogenesis exógeno puede mezclarse con la célula o la matriz polimérica. Los factores de angiogenesis endógenos pueden obtenerse por la alteración genética de las células corporales para expresar factores de angiogenesis o precursores de estos factores. Otro procedimiento para proporcionar factores de angiogenesis es mezclar poblaciones de células, incluyendo células que expresen factores de angiogenesis. Una ventaja de este método de tratamiento es la capacidad para invertir la modulación fenotípica de las células corporales.

La capacidad de las células corporales para mantener un fenotipo funcional puede ser dependiente de una aportación de sangre suficiente (Moreland R.B. et al J. Urol, 153: 826, 1995; Jevtich, M. et al J. Urol 143: 289, 1990; Persson, C. et al J. Urol 142:1462, 1989). La población de células transplantadas, muy similares a las células de músculos lisos corporales de pacientes impotentes con insuficiencia arterial peneana crónica, puede sufrir atrofia y/o modulación para un fenotipo sintético, que da lugar a la acumulación gradual de una matriz extracelular en la forma de fibrilos de colágeno depositados. Una ventaja del procedimiento de la invención es que el factor de angiogenesis puede dar lugar a más altas tensiones de oxígeno, lo que favorecería un mayor grado de diferenciación hacia el fenotipo contráctil.

Otra realización de la invención se refiere a un implante para tratamiento de un trastorno del pene mediante el uso de un soporte polimérico biodegradable para entrega de células de músculos lisos corporales mediante una estructura anatómica preformada. La entrega de células de músculos lisos corporales sobre dicha estructura crearía la posibilidad de un cuerpo neo-corporal funcional después de la biodegradación polimérica. Además, los polímeros sintéticos tienen el potencial para sufrir una modificación in vitro antes de su uso y podrían aportar factores de crecimiento necesarios y/o otros agentes que podría esperarse que favorecieran el crecimiento celular y la diferenciación in vivo (Langer, P. and Moses M.; J Cell Biochem, 45: 340, 1991).

Células

Las células pueden aislarse desde cualquier tejido que comprenda células de músculos lisos. Un tipo de tejido preferido para el aislamiento de células es el tejido cavernoso corporal del pene. Otros tejidos que pueden servir como una fuente para células de músculos lisos comprenden células de cualquier grupo muscular en un paciente. Un grupo muscular preferido es el de los músculos involuntarios no estriados del cuerpo de un paciente. Puesto que los procedimientos enseñados permiten la expansión de una pequeña población inicial de células musculares, solamente se requiere una pequeña muestra de tejido. Una ventaja de la capacidad de expandir células in vitro es que el procedimiento de tratamiento de la invención se puede utilizar para el implante autólogo y tratamiento de un paciente aun cuando el paciente solamente tenga una cantidad limitada de tejido cavernoso corporal normal.

Las células de músculos lisos, tales como las células cavernosas corporales, y preferentemente, las células cavernosas corporales autólogas se pueden cultivar in vitro, si así se desea, para aumentar el número de dichas células disponibles para siembra en el "andamio" de la matriz polimérica. Las condiciones de cultivo se describen en la sección de ejemplos de esta memoria. El uso de células alogénicas, y más preferentemente autólogas, las células cavernosas corporales, se prefiere para impedir el rechazo de tejidos. Sin embargo, si se produce una respuesta inmunológica en el sujeto después de la implantación de la estructura de reconstrucción peneana, el sujeto puede tratarse con agentes inmunosupresivos tales como, por ejemplo, ciclosporina o FK506, para reducir la probabilidad de rechazo de la PCCS. En algunas realizaciones, células quiméricas, o células procedentes de un animal transgénico, pueden sembrarse en la matriz polimérica. Las células quiméricas o transgénicas pueden ser objeto de ingeniería genética para reducir el rechazo del injerto.

Procedimientos para el inmunorechazo son conocidos para los expertos en esta materia. Ejemplos de procedimientos conocidos para suprimir el inmunorechazo comprenden la ablación o supresión (p.e., utilizando técnicas tales como ARN antisentido) de genes de mayor y menor histocompatibilidad, por ejemplo, la expresión de antígenos de superficies celulares tales como los antígenos de histocompatibilidad clase I y clase II puede suprimirse. Esto puede permitir que las células transplantadas tengan una posibilidad reducida de rechazo por el anfitrión. Además, podría utilizarse también la transfección para entrega de genes. Células de músculos lisos tales como células cavernosas corporales pueden inducirse mediante la transfección para reducir la expresión de TGF-1 o para incrementar la expresión del factor de angiogenesis. La angiogenesis es importante para la función eréctil de neofalo y para evitar la diferenciación de las células en un fenotipo no eréctil.

En otra realización de la invención, células cavernosas corporales pueden ser objeto de transfección con genes específicos antes de la siembra polimérica. La construcción de células - polímeros podrían contener información genética requerida para la supervivencia a largo plazo del neo-órgano de tejido o anfitrión resultado de ingeniería genética. Por ejemplo, las células pueden ser objeto de transfección para expresar insulina para el tratamiento de la diabetes.

Pueden prepararse cultivos de células con o sin una etapa de fraccionación celular. Una etapa de fraccionación puede ser útil si un alto porcentaje de las células donantes son defectuosas. Por ejemplo, en el tratamiento de cáncer del pene, una muestra del tejido cavernoso corporal puede cultivarse y clasificarse para eliminar las células neoplásticas. Las restantes células neoplásticas pueden ser para la reconstrucción del pene.

El fraccionado y clasificación de células se pueden realizar utilizando técnicas tales como la clasificación celular activada fluorescente con anticuerpos específicos para una subpoblación de células. Otros criterios tales como segmentación, volumen celular, transmisión de ondas eléctricas y radioeléctricas y expresión de EGF - 1 pueden emplearse para clasificar o preclasificar células. Aunque puede utilizarse la fraccionación celular, no es necesaria para la práctica de la invención.

Otro procedimiento opcional es la crioconservación. La conservación criogénica puede ser útil, por ejemplo, para reducir la necesidad de múltiples procedimientos quirúrgicos invasivos. La población celular puede ser ampliada y una parte de las células ampliadas puede emplearse y otra parte puede ser preservada de forma criogénica. La capacidad para ampliar y preservar las células permite una considerable flexibilidad en la elección de células donantes. Por ejemplo, las células procedentes de un donante histocompatible pueden ampliarse y utilizarse en más de un receptor.

Otro ejemplo de la utilidad de la conservación criogénica está en los bancos de tejidos. Las células donantes pueden ser crioconservadas junto con datos de histocompatibilidad. Las células donantes pueden guardarse, por ejemplo, en un banco de tejidos donantes. Puesto que se necesita un tejido para la estructura PCCS, pueden seleccionarse células que sean las más histocompatibles para el paciente. Los pacientes que tengan una enfermedad o estén sometidos a un tratamiento de faloplastia convencional pueden tener una parte de la cavernosa corporal preservada por medios criogénicos. En un momento posterior, si el tratamiento convencional resultare insatisfactorio, las células preservadas pueden descriogenarse para la reconstrucción del pene. La crioconservación de células puede ser también de utilidad si el paciente es muy joven o en una emergencia médica, donde debe retrasarse la faloplastia. Por ejemplo, las víctimas de quemaduras y los niños con sistemas inmunes insuficientes pueden crioconservar tejido para una posterior reconstrucción cuando mejora la condición de los pacientes.

Material de matriz polimérica

Un material biocompatible y material especialmente biodegradable es el material preferido para la construcción de la matriz polimérica. El término biocompatible se refiere a materiales que tengan poco o ningún efecto tóxico ni perjudicial sobre las funciones biológicas. El término biodegradable se refiere a material que pueda ser absorbido o degradado en el cuerpo de un paciente. Ejemplos de materiales biodegradables comprenden, por ejemplo, suturas absorbibles. Materiales representativos para formar la estructura biodegradable comprenden polímeros naturales o sintéticos, tales como, por ejemplo, colágeno, poli (alfa esteres) tales como poli (lactato ácido), poli (ácido glicólico), poliortoesteres y polianhídridos y sus copolímeros, que se degradan por hidrólisis a un régimen controlado y son reabsorbidos. Estos materiales proporcionan el control máximo de la degradabilidad, gestionabilidad, tamaño y configuración. El material polimérico biodegradable preferido comprende el ácido poliglicólico y la poligalactina, que se desarrollan como material de sutura sintético absorbible. El ácido poliglicólico y las fibras de poligalactina se pueden utilizar según se suministra por el propio fabricante. Otros materiales biodegradables son éter de celulosa, celulosa, ester celulósico, polietileno fluorado, polimérico fenólico, poli-4-metilpenteno, poliacrilonitrilo, poliamida, poliamidoimida, poliacrilato, polibenzoxazol, policarbonato, policianoarileter, poliester, poliestercarbonato, polieter, polieteretercetona, polietelinida, polietercetona, polietersulfona, polietileno, polifluorolefina, poliimida, poliolefina, polioxadiazol, polifenilen óxido, sulfuro de polifenileno, popropileno, poliestireno, polisulfuro, polisulfona, politetrafluoroetileno, politioeter, politriazol, poliuretano, polivinilo, cloruro de polivinileno, celulosa regenerada, silicona, urea-formaldehído o copolímeros o mezclas físicas de estos compuestos. El material puede impregnarse con agentes antimicrobianos adecuados y puede colorearse mediante un aditivo colorante para mejorar su visibilidad y ayudar en los procedimientos quirúrgicos.

En algunas realizaciones, la unión de las células al polímero se mejora recubriendo los polímeros con compuestos tales como componentes de membrana base, agar, agarosa, gelatina, goma arábica, colágenos, fibronectina, laminina, glicosaminoglicanos y sus mezclas así como otros materiales que tienen propiedades similares a las moléculas de matrices biológicas conocidas para los expertos en esta materia de cultivo celular. Todos los polímeros deben cumplir los parámetros mecánicos y bioquímicos necesarios para proporcionar un soporte adecuado para las células con su posterior crecimiento y proliferación. Factores, comprendiendo nutrientes, factores de crecimiento, inductores de diferenciación o desdiferenciación, productos de secreción, inmunomoduladores, inhibidores de inflamación, factores de regresión, compuestos biológicamente activos que mejoran o permiten el crecimiento interno de la red linfática o fibras nerviosas y fármacos pueden incorporarse en la matriz o proporcionarse en conjunción con la matriz. Análogamente, polímeros que contienen péptidos tales como péptido de unión RGD (Arg - Gly - Asp) se pueden sintetizar para uso en la formación de matrices.

Un polímero biocompatible actualmente preferido es la poliglactina y el ácido poliglicólico. La poliglactina fue desarrollada como material de sutura sintético absorbible, un copolímero 90:10 de glicólido y láctido, fabricado como suturas absorbibles trenzadas de Vicryl® (Ethicon Co., Somerville, N.J.) (Craig PH, Williams J. A, Davis KW, et al: A Biological Comparison of Polyglactin 910 and Polyglycolic Acid Sinthetic Absorbable Sutures. Surg. 141: 1010 (1975)). Las fibras de poliglactina y ácido poliglicólico se pueden utilizar según se suministran por el propio fabricante. El polímero biocompatible puede modelarse utilizando procedimientos tales como, por ejemplo, fusión de disolventes, moldeo de compresión, estirado de filamentos, formación de mallas, lixiviación, urdimbre y recubrimiento. En la función de disolventes, una solución de uno o más polímeros en un disolvente adecuado, tal como cloruro de metileno, es fundido como una estructura de relieve con bifurcación. Después de la evaporación del disolvente, se obtiene una película delgada. En el moldeo de compresión, un polímero se presiona a presiones de hasta 30.000 libras por pulgada cuadrada en un modelo adecuado. El estirado de filamentos implica el estirado del polímero fundido y en mallas implica la formación de una malla comprimiendo fibras en un material de forma de fieltro. En la lixiviación, una solución que contiene dos materiales se dispersa en una forma próxima a la forma final de la matriz, a continuación, se utiliza un disolvente para la eliminación por disolución de uno de los componentes, que resulta en la formación de poros (Ver Mikos US nº 5.514.378). En la nucleación, películas delgadas en la forma de una matriz son expuestas a productos de fisión radioactiva que crean pistas de material dañado por la radiación. A continuación, las láminas de policarbonato son atacadas con ácido o base, transformando las pistas de material dañado por la radiación en poros. Por último, se puede utilizar un láser para modelar y quemar orificios individuales a través de numerosos materiales para formar una estructura matricial con tamaños de poros uniformes.

La técnica de recubrimiento se refiere al revestimiento o permeación de una estructura polimérica con un material tal como, por ejemplo, copolímeros licuados (poli-D,L-lactida co-glicolida 50:50, 80 mg/ml de cloruro de metileno) para modificar sus propiedades mecánicas. El recubrimiento se puede realizar en una sola capa o en múltiples capas hasta que se consigan las propiedades mecánicas deseadas. Estas técnicas de modelación pueden emplearse en combinación, por ejemplo, una matriz polimérica se puede formar mediante moldeo de compresión y adhesión juntas. Además, diferentes materiales poliméricos formados por diferentes procesos se pueden unir para formar un modelo compuesto. El modelo compuesto puede ser una estructura laminar. Por ejemplo, una matriz polimérica puede unirse a una o más matrices poliméricas de la misma o diferente composición para formar una estructura cavernosa corporal protésica multicapa. La unión puede realizarse por un medio adecuado tal como adhesión con un polímero líquido, grapado, suturación o una combinación de estos procedimientos. Además, la matriz polimérica puede formarse como un bloque sólido y modelarse mediante láser u otras técnicas de mecanizado estándar para su forma final deseada. La modelación por láser se refiere al proceso de eliminar materiales usando un láser.

Los polímeros pueden ser caracterizados con respecto a sus propiedades mecánicas, tales como resistencia a la tracción utilizando un comprobador Instron, para peso molecular polimérico mediante cromatografía de permeación de geles (GPC), temperatura de transición de vidrio mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) y estructura de enlace por espectroscopia de infrarrojos (IR) con respecto a la toxicología mediante pruebas de selección inicial que implican ensayos Ames y ensayos de teratogenicidad in vitro y estudios de implantación en animales para estudiar la inmunogenicidad, la inflamación, la liberación y la degradación. La unión celular in vitro y su viabilidad se pueden evaluar utilizando la exploración con microscopia electrónica, histología y evaluación cuantitativa con
radioisótopos.

Las matrices poliméricas se pueden tratar con aditivos o fármacos antes de la implantación (antes o después de que la matriz polimérica sea sembrada con células), por ejemplo, para favorecer la formación de un nuevo tejido después de la implantación. Por lo tanto, por ejemplo, factores de crecimiento, factores de angiogenesis, citoquinas, componentes matriciales extracelulares y otros materiales bioactivos se pueden añadir a la matriz polimérica para favorecer la curación de injertos y la formación de un nuevo tejido. Factores de crecimiento y otros aditivos (p.e., factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de unión a heparina (HBGF), factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), citoquinas, genes, proteínas y elementos similares) se pueden añadir en cantidades en exceso de cualquier cantidad de dichos factores de crecimiento (si los hubiere) que puedan producirse por las células sembradas sobre la matriz polimérica si se emplean células añadidas. Dichos aditivos son preferentemente proporcionados en una cantidad suficiente para favorecer la formación del neofalo, tal como la formación de tejido cavernoso corporal nuevo.

Otros aditivos útiles son los agentes antibacterianos y antifungales, para favorecer la curación mediante supresión de infecciones.

Una matriz de soporte preferida está constituida por filamentos cruzados que pueden permitir la supervivencia de las células por difusión de nutrientes a través de cortas distancias una vez que se implante la matriz de soporte celular.

Estructura cavernosa corporal protésica (PCCS)

La estructura PCCS se puede obtener con una estructura controlada de poros según se ha descrito anteriormente. El tamaño de los poros se puede utilizar para determinar la distribución de células. Por ejemplo, los poros en la matriz polimérica pueden ser grandes para permitir la migración de las células al interior de la estructura.

La matriz polimérica puede modelarse en cualquier número de configuraciones deseables para formar una estructura de neofalo o cavernosa corporal reconstruida. Por ejemplo, si se desea reconstruir la estructura natural del pene, pueden construirse dos estructuras cavernosas corporales e implantarse en el paciente. Como alternativa, una estructura grande puede sustituir la córpora cavernosa y el corpus spongiosum en un paciente. Estructuras preferidas son las que se asemejan aproximadamente a la forma del pene o cavernosa corporal deseada resultante. En los casos en que se implanta la estructura PCCS para proporcionar soporte o para sustituir la córpora cavernosa, la estructura PCCS se puede modelar similar a la córpora cavernosa. Es decir, la estructura PCCS se puede modelar para formar dos cilindros alargados o dos balones alargados. En el caso de una reconstrucción peneana más extensa, la estructura PCCS puede modelarse para asemejarse a una varilla alargada. Cuando se diseña para sustituir a la córpora cavernosa, la estructura PCCS puede tener la forma de un cilindro alargado con una sección transversal en forma de riñón. La estructura PCCS puede ser hueca o adoptar la forma de una varilla maciza. Si la estructura PCCS es hueca, la varilla hueca puede tener un espacio adaptado para la colocación de una uretra. La uretra puede ser natural, sintética o una neuretra de diseño especial.

La importante característica de una prótesis de pene es la capacidad para conseguir una rigidez suficiente necesaria para mantener su configuración. En la población adulta, la prótesis debe ser capaz de soportar alguna presión para permitir el coito. Por lo tanto, es deseable conseguir que la capa celular de la prótesis de pene tenga resistencia mecánica suficiente para conseguir la función eréctil. La resistencia mecánica en la estructura reconstituida puede conseguirse mediante múltiples capas de células o la inducción de una capa suficientemente fuerte de matriz extracelular. La forma de la matriz polimérica puede ajustarse para afectar a la resistencia final del cuerpo cavernoso protésico resultante. Por ejemplo, una resistencia más alta puede conseguirse mediante el uso de una capa más gruesa y más porosa de la matriz polimérica. La capa gruesa permitirá que se forman múltiples capas de células y se adhieran entre sí.

La matriz polimérica se puede esterilizar utilizando cualquier procedimiento conocido antes de su uso. El procedimiento utilizado depende del material usado en la matriz polimérica. Ejemplos de procedimientos de esterilización incluyen vapor, calor seco, radiación, gases tales como óxido de etileno y ebullición.

Siembra

El procedimiento para sembrar la matriz polimérica se describe en los ejemplos y además, se puede realizar por varios procedimientos tales como los enseñados en la patente US nº 5.041.138.

Reconstrucción peneana

La implantación y reconstrucción se puede realizar utilizando varias técnicas. En condiciones normales, el paciente se coloca en la posición de litotomía dorsal y se coloca un catéter en la uretra para fines de identificación. Se practica una incisión en la línea media vertical desde la base del escroto hacia el ano y la incisión se realiza hasta el músculo bulbo cavernoso. El músculo cavernoso y la uretra se retraen a un lado y el músculo cavernoso isquial y la crus del pene son identificadas. Una vez que se haya identificado la crus, se abre en una longitud aproximada de 2 cm. Se utilizan dilatores de Hegar para dilatar el crus del pene en la proximidad de la tuborosidad isquial y distal para la extensión completa de la córpora cavernosa. La estructura PCCS se inserta dentro de la córpora. La prótesis debe adaptarse firmemente contra la pared de la córpora cavernosa. En condiciones ideales, debe proporcionarse poca estructura PCCS de tamaños diferentes. Como alternativa, el cirujano puede recortar la estructura PCCS para adaptarse al paciente. Después de que se inserte una prótesis, el mismo procedimiento puede realizarse en el lado contralateral. La incisión en cada córpora se cierra luego con una sutura de tripa Cromica 3 - 0. El resto de la herida se cierra de una manera rutinaria. Durante el procedimiento, la estructura PCCS se moja en una solución antibiótica tal, por ejemplo, polimixina - neomicina. Después de la inserción, la herida se irriga con la misma solución. Un antibiótico de amplio espectro se administra y se continúa administrando después de la operación. Procedimientos quirúrgicos alternativos para la implantación de la estructura PCCS serán fácilmente evidente para los expertos en esta materia.

La estructura PCCS se puede utilizar también para la reconstrucción peneana total. Técnicas microquirúrgicas para reconstrucción peneana son conocidas (ver, por ejemplo, Jordan et al J. Urol 152:410 - 414, 1994). Dichas técnicas comprenden la creación de un neofalo sensible inicialmente mediante la coaptación de los nervios de colgajos a los nervios genitofemorales o ilionginales; la coadaptación de los nervios locales de los colgajos fasciocutáneos a los nervios dorsales del pene; la reconstrucción utilizando colgajos musculocutáneos gracilis y colgajos musculocutáneos ractus abdominis con colgajos libres suplementarios para cobertura de piel sensible; reconstrucción de colgajo libre de antebrazo faciocutáneo. Una neo - uretra se puede obtener junto con el neofalo para una reconstrucción completa. La neo-uretra puede obtenerse por separado y unirse al neofalo antes de la implantación. Como alternativa, la neo-uretra puede ser parte de la estructura PCCS original, que está poblada con dos tipos de células diferentes. Por lo tanto, podría conseguirse una construcción fálica total.

La estructura PCCS podría sustituir a los implantes intracorporales, eliminando así posibles complicaciones tales como erosión e infección. Un procedimiento similar se podría aplicar a pacientes que presentan anemia drepanocítica. Las gestiones actualmente disponibles no han demostrado impedir el priapisma recurrente. La implantación de prótesis naturales diseñadas constituidas por células cavernosas corporales autólogas eliminarían permanentemente los problemas de la ingurgitación dentro de la córpora.

Otra posible utilidad para la estructura PCCS se aplicaría a condiciones genitales dolorosas tales como la enfermedad de Peyronie. Un posible método terapéutico para estos casos podría conseguirse utilizando células objeto de transfección con material genético. Los soportes de célula-polímero objeto de transfección constituyen una estructura análoga a la de los órganos con expresión funcional de los genes proporcionados. Genes reguladores de la inflamación y fibrosis podrían proporcionarse en las prótesis de penees diseñadas constituidas por células cavernosas corporales autólogas. Esta prótesis modificada por genes transportaría toda la información genética requerida para la expresión funcional para evitar enfermedades recurrentes.

Las células de músculos lisos corporales humanos han sido satisfactoriamente proporcionadas al entorno in vivo, con su supervivencia sobre soportes poliméricos biodegradables y permaneciendo diferenciadas. Sin embargo, las células endoteliales humanas están también presentes en el tejido corporal. Por lo tanto, se investigó la posibilidad de crear tejido corporal in vivo utilizando células de músculos lisos cavernosas humanas en conjunción con células endoteliales humanas. En una realización preferida, las células endoteliales y de músculos lisos corporales humanos se siembran sobre soportes poliméricos biodegradables, que pueden ser soportes de poliglicolato, normalmente a concentraciones de 20 x 10^{6} células/cm^{3} y 10 x 10^{6} células/cm^{3}, respectivamente.

El uso de endoletilo se ha intentado en experimentos en vivo para recubrir injertos para sustitución bascular con el fin de reducir la incidencia de trombosis (Herring, et al, 1978, Surgery, 84:498; Machluf et al, 1998, Graft 1:31). Además, las células endoteliales se han utilizado para la entrega de factores de crecimiento y citoquinas con el objeto de evitar la estenosis vascular (Thompson, et al, 1988, Science 241: 1349). Sin embargo, según nuestro conocimiento, el uso de células endoteliales como un facilitador del crecimiento interno capilar en tejido compuesto no se ha intentado todavía. Aunque la implantación de células musculares corporales, por sí misma, es capaz de inducir angiogenesis, la neovascularidad no es suficiente para la creación de una arquitectura cavernosa corporal normal. La implantación añadida de células endoteliales, a la concentración normalmente presente en el tejido corporal humano normal (un tercer endotelio), fue esencial para la formación de una arquitectura análoga a la corporal.

Se informó anteriormente del desarrollo de un sistema para recoger y hacer crecer células urológicas (Atala, et al., 1993, J Urol 150: 608 - 612; Cliento et al 1994, J. Urol 152:665 - 670). Las células fueron utilizadas para crear varios órganos urológicos incluyendo la uretra, utilizando polímeros biodegradables (Atala, In Atala A, y Mooney D: Tissue Engineering, Boston, Birkhauser Pre, Boston, 1997 Pág. 149 - 164; Yoo et al 1987, Urology 51: 21, Yoo et al, 1998, J. Urol 160: 1164). Los inventores han informado también con anterioridad sobre la construcción de implantes de pene utilizando células uroteliales (Yoo et al, 1997 Amer Acad Ped 10:576). Otras estructuras urológicas que han sido preparadas in vitro y posteriormente implantadas se describe en Atala et al 1998 Urol Clinics North Amer 25:39 - 50. La presente invención enseña la construcción fálica total que puede conseguirse utilizando técnicas de ingeniería tisular. Pueden obtenerse pequeñas biopsias de tejido del pene y células uroteliales, musculares y endoteliales pueden ser objeto de crecimiento y expansión por separado. Las células se pueden sembrar sobre soportes poliméricos biodegradables preconfigurados seguidos por la construcción de un falo macho, constituido por tejido eréctil y una neo-uretra. Además, genes reguladores de la fibrosis e inflamación pueden proporcionarse al tejido cavernoso recientemente formado utilizando los procedimientos de entrega de genes ya establecidos (Yoo et al, 1997 J. Urol 158:1066).

Otras realizaciones y ventajas de la invención se exponen, en parte, en la descripción que sigue y, en parte, serán evidentes a partir de esta descripción y pueden aprenderse a partir de la práctica de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Cultivo de células de músculos lisos del cuerpo humano

Los cultivos de explantes del corpus cavernosus humano fueron derivados de las biopsias operativas del tejido cavernoso obtenido durante la implantación de prótesis de penees y procesadas según los procedimientos anteriormente publicados (Moreland, RB et al J. Urol 153:826, 1995). Todos los reactivos, a no ser que se especifique de otro modo, son reactivos estándar comercialmente disponibles a partir de proveedores científicos tales como Gibco (Galthersburg, MD) o Sigma (St. Louis, MO). En resumen, muestras quirúrgicas fueron reducidas a pequeños fragmentos de aproximadamente 1 mm, lavadas en una solución salina equilibrada de Hank libre de calcio y magnesio y colocada en pocillos de cultivo celular de 35 mm en el medio de Eagle modificado de Dulbecco, conteniendo 1 gramo de glucosa por litro y complementado con suero bovino fetal al 10%; 100 unidades por ml de penicilina, 100 \mug/ml de estetomicina, 0,25 \mug/ml de FUNGIZONE® (Gilbco, Gaithersburg, MD) y 2 mM de glutamina (DMEM/Supp). Las células fueron cultivadas a una temperatura de 37ºC en una atmósfera humidificada con un 95% de aire y un 5% de CO_{2} . Durante 7 días de cultivo, se observaron que las células de músculos lisos eran objeto de migración desde los explantes. Los explantes fueron eliminados posteriormente y las células fueron dejadas crecer para confluencia. Las células fueron subcultivadas en frascos de cultivo celular cuando alcanzaron la confluencia. El medio de cultivo celular fue cambiado periódicamente cada tres días. Las células fueron subcultivadas en placas de cultivo tisular de plástico con un diámetro de 25 cm para el tercer paso y mantenidas en cultivo continuo durante un periodo de 34 días.

Los análisis morfológicos de los cultivos de explantes de células de músculos lisos corporales humanos mediante microscopia de contraste de fase demostraron el origen de músculos lisos en una población homogénea de células fusiformes. La confluencia fue normalmente conseguida 4 a 6 días después del subcultivo y fue seguida por un crecimiento logarítmico de las células en capas solapantes. La microscopia de contraste de fase de los cultivos confluentes de células de músculos lisos cavernosos del cuerpo humano (HCPCCS) demuestran la apariencia de "montes y valles" (Chamely - Campbell, J., Campbell, G y Ross, R.: Physiol, Rev 59 1, 1979).

Durante el periodo de cultivo celular de 34 días, las células proliferaron en un sincicio "de forma tisular" multicapa. En el día de la siembra de varillas poliméricas, se obtuvo una densidad celular media de 116 x 10^{6} células viables por placa de 25 cm, según se determina por el conteo celular mediante un hemocitómetro que utiliza el procedimiento de exclusión de azul de tripano. La unión celular a las fibras poliméricas fue observada dentro de las 24 horas siguientes a la siembra. La coloración inmunofluorescente indirecta de las células de HCPCCS cultivadas, para la alfa-actina de músculos lisos, confirma la identidad de los músculos lisos.

Ejemplo 2 Fabricación de la estructura polimérica

Láminas de mallas de polímeros del ácido poliglicólico no tejidas y biodegradables, de porosidad mayor que 95%, fueron cortadas y conformadas en varillas tubulares con dimensiones de 1 cm por 1 cm. Una stent (endoprótesis) uretral de tamaño 8 French fue colocado dentro de cada varilla como ayuda en el mantenimiento de la patencia luminal. Cada varilla fue marcada en sus extremos opuestos con suturas de polipropileno 2-0. El diámetro medio de la fibra del polímero fue de 15 \mum. Las distancias interfibras variaron entre 0 \mum y 200 \mum. Se esterilizaron polímeros en gas de óxido de etileno frío y se guardaron bajo condiciones de vacío estéril hasta la siembra celular.

Ejemplo 3 Selección de receptores

Como receptores de células, para todos los experimentos, se utilizaron ratones machos adultos jóvenes nu/nu congénitamente atímicos (desnudos). Los ratones fueron alojados juntos, permitiéndoles libre acceso a alimentos y agua y se mantuvieron en un ciclo de aproximadamente 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Todos los ratones fueron anestesiados con metoxiflurano mediante administración de conos. Una inyección intramuscular de 1 mg de Cefazolina sirvió como profilaxis antibiótica inmediatamente antes de la cirugía. Los ratones fueron sometidos a eutanasia antes de la toma de muestras.

Ejemplo 4 Siembra, implantación y recuperación de células de músculos lisos del cuerpo humano

Cada uno de los 18 soportes biodegradables de varillas poliméricas fue sembrado con las células de músculos lisos corporales humanos de una placa de 25 cm. Multicapas de células fueron elevadas cuidadosamente como una lámina contigua utilizando un elevador de células Costar y se sembraron, de forma circunferencial, alrededor de cada varilla polimérica. Se retiró medio de cultivo durante un periodo de 15 minutos para permitir una adhesión adecuada entre el soporte polimérico y las células. Cada soporte polimérico/célula fue transferido luego a un pocillo de cultivo celular individual y sumergido en un medio DMEM complementado reciente. Dicho medio fue cambiado cada día durante un periodo de tres días de cultivo. El examen microscópico de contraste de fase indica que las células de HCPCCS cultivadas se unieron a los soportes poliméricos biodegradables in vitro.

Un total de 18 soportes poliméricos y de células se implantaron, por vía subcutánea en los costados de ratones atímicos. Tres soportes sembrados fueron implantados por ratón anfitrión. Cuatro ratones adicionales recibieron un soporte polimérico no sembrado y sirvieron como controles. Los ratones receptores se sometieron a eutanasia al 7, 14 y 24 días después de la implantación. Los implantes poliméricos y celulares fueron recuperados y examinados de forma bruta, histológica, inmunocitoquímica y mediante análisis de transferencia Western.

Ejemplo 5 Examen histológico de los implantes

Se recogieron implantes desde los costados de ratones atímicos, fijados en una solución tamponada neutra de formalina al 10% durante 6 horas y posteriormente embebidos en parafina. Secciones serie de 5 \mum fueron cortadas de cada bloque de parafina. Las muestras fueron coloreadas con hematoxilina y eosina para histología convencional y la técnica tricromática de Masson para facilitar la diferenciación entre músculo liso y colágeno. La coloración inmunoistoquímica para la alfa-actina de músculo liso fue realizada para confirmar el fenotipo del músculo liso.

A los siete días después de la implantación, los análisis histológicos de las muestras recuperadas demostraron la presencia de multicapas de células de músculos lisos viables orientadas espacialmente a lo largo de la superficie de los soportes poliméricos. La población celular multicapa permaneció asociada con las fibras poliméricas durante todo el estudio. Un crecimiento vascular estuvo presente en todos los soportes y se incrementó con los tiempos de implantación prolongados. Una respuesta inflamatoria de fase aguda estuvo presente en dicho periodo de 7 días, que fue sustituido por una reacción de cuerpos extraños crónico suave más adelante. La biodegradación de fibras poliméricas fue evidente a los 24 días. El porcentaje de implantes conteniendo células de músculos lisos corporales identificables fue la más alta en los puntos en el tiempo de 7 días (100%) y 14 días (100%) y la más baja en el punto en el tiempo de 24 días (83%). No se produjo ninguna prueba evidente de presencia de músculo liso corporal humano en cualquiera de los implantes poliméricos de control. La coloración tricroma de Masson reveló el crecimiento de multicapas celulares de HCPCCS viables a lo largo de la superficie del soporte polimérico dos semanas después de la implantación en ratones atímicos. Capas de células de músculos lisos desarrolladas en pocillos, acompañadas por un crecimiento vascular importante, fueron visibles a los 24 días después de la implantación.

Se realizó un análisis inmunofluorescente indirecto utilizando anticuerpo monoclonales de ratones para el microfilamento de alfa-actina de músculos lisos (Dako Corp, Carpintería, CA) en células crecidas en platinas de cámara según el método de Kxall et al (7). En resumen, se fijaron las células en metanol durante 5 minutos a -20ºC, se trasladaron a acetona enfriada por hielo durante 5 minutos y luego se secaron al aire. Después de la rehidratación en solución tamponada salina de fosfato (PBS) durante 20 minutos, las platinas fueron incubadas con anticuerpo monoclonal primario para alfa-actina de músculos lisos durante 1 hora. Después de la retirada del anticuerpo a través de tres lavados sucesivos en PBS durante 10 minutos, las platinas fueron incubadas con inmunoglobina antiratón conjugada de fluoresceina - isotiocianato durante una hora. El lavado volvió a repetirse y las platinas fueron examinadas por microscopia de fluorescencia. Se proporcionaron controles negativos por la omisión del anticuerpo primario durante la primera incubación.

Con el uso del método de biotina - estreptavidina, se realizó una coloración inmunocitoquímica de muestras desparafinizadas recuperadas. En resumen, después de la extinción de la actividad de peroxidasa endógena con 3% de H_{2}O_{2} en agua durante 5 minutos y bloqueo del enlace no específico con suero de caballo normal diluido en PBS durante 30 minutos, las platinas fueron incubadas con anticuerpo primario diluido durante una hora. Las platinas fueron luego lavadas tres veces con PBS durante 5 minutos e incubadas durante 30 minutos con inmunoglobulinas antiratón biotinilatadas diluidas. El lavado repetido fue seguido por la incubación con el reactivo ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 30 minutos. Después de tres lavados finales de 5 minutos en PBS, se desarrollaron secciones con 3,3 diaminobenzidina tetrahidroclorudo durante 3 minutos, con la contracoloración con hematoxilina de Gill y examinadas bajo microscopia de luz. La coloración inmunocitoquímica de las células de HCPCCS transplantadas para alfa-actina de músculo liso confirma el fenotipo del músculo liso.

Ejemplo 6 Análisis de transferencia Western

Después de la aspiración de la totalidad del medio de cultivo, los cultivos multicapa de células confluentes de células de músculos lisos cavernosos del cuerpo humano crecidas en placas de cultivo de tejidos de 25 cm de diámetro, fueron lavados 2 veces con PBS enfriado en hielo. El PBS residual fue extraído y se añadió 200 \mul de solución tamponada de muestra de 1X sulfato de dodecilo de sodio (SDS) al plato de cultivo. Las células objeto de lisis fueron desechadas luego en la solución y transferidas a un macrotubo de centrifugación de 1,5 ml. Después de la solubilización a 100ºC, se eliminó los detritos por microcentrifugación y el sobrenadante fue trasladado a un tubo reciente (8).

Los implantes de células/polímeros y controles sin siembra fueron recogidos a los 7 y 24 días, siendo congelados y guardados en nitrógeno líquido hasta su empleo. Las muestras congeladas fueron fragmentadas utilizando un mortero. Los fragmentos de tejidos fueron lavados a fondo en PBS enfriado con hielo y luego nodulizados a 3000 g durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue aspirado y se añadieron tres volúmenes de solución tamponada de suspensión enfriada por hielo conteniendo 0,1 M de cloruro sodio, 0,01 M de tris cloruro (pH 7,6), 0.001 M EDTA (pH 8,0), 1 gramo por ml de aprotinina y 100 gramos por ml de fenilmetilsulfonil fluorudo. Después de la adición de un volumen igual de solución tamponada de muestra de 2X SDS, las proteínas se solubilizaron a 100ºC.

La electroforesis del gel de poliacrilamida de todos los lisatos de proteínas (950 \mug por muestra, según se determina por el ensayo de proteínas de DC bio-red) fue realizada en un gel separador al 10%, seguido por la electrotransferencia de las proteínas separadas en membranas de manchado de Inmobilon P.

Se realizó una inmunodetección según la instrucción proporcionada por Amersham Internatioinal (Buckinghamshire, Inglaterra), para la fabricación del sistema detección ECL. Los sitios de enlace no específicos fueron bloqueados en leche seca descremada al 10% (peso por volumen), 0,1% (volumen por volumen) de Tween 20, 137 mM, cloruro de sodio y base tris de 20 mM. Anticuerpos monoclonales para alfa-actina de músculo liso, con dilución a 1:500 con solución tamponada bloqueante fueron incubados con las membranas durante 45 minutos a la temperatura ambiente. Después de lavados repetidos con TBS - 0,1% Tween, las membranas fueron incubadas con IgG antiratón enlazado con peroxidasa rábano - caballo a una dilución de 1:25000 con solución tampón bloqueante durante 45 minutos a la temperatura ambiente. Las membranas fueron lavadas repetidamente en TBS- 0,1% Tween y luego una vez en TBS solo. La detección por quimioluminiscencia fue realizada utilizando el sistema ECL (Amersham International, Buckingham- Shire, Inglaterra) mediante exposición de película de autoradiografía.

Los análisis de transferencia Western de fracciones proteínicas, obtenidos de cultivos de células confluentes, demostraron la presencia del 42 kDa indicador de que las células cultivadas es una forma de \alpha-actina de músculo liso. Este resultado corrobora los resultados inmunocitoquímicos. El análisis de transferencia Western de fracciones proteínicas, obtenidas de implantes de célula/polímero de HCPCCS demuestra también la presencia de la proteína 42 kDa. Por lo tanto, los implantes de célula/polímero HCPCCS comprenden también una actina de músculo liso. En estos experimentos de la transferencia Western, la proteína aislada del falo de rata completo fue utilizada como un control positivo mientras que la proteína aislada de la línea A431 de células cultivadas de carcinoma epidemoide vulvar fue utilizada como un control negativo.

La coloración de células inmunofluorescente con anticuerpos monocronales específicos para una alfa-actina de músculo liso, en células cultivadas en platinas de cámaras, confirmó la identidad del músculo liso corporal.

Ejemplo 7 Mantenimiento de las células de músculos lisos corporales humanas in vivo sobre polímeros sintéticos

La coloración histoquímica por la técnica tricoma de Masson demostró un incremento cualitativo progresivo en la cantidad de deposición de colágeno con un incremento del tiempo de implantación. La coloración inmunocitoquímica para una alfa-actina de músculo liso confirmó un fenotipo de músculo liso dentro de los implantes. Los análisis de transferencia Western de fracciones proteínicas obtenidas de implantes de célula/polímero de músculos lisos corporales humanos a los 7 y 24 días, realizados con anticuerpos monocronales frente a alfa-actina de músculos lisos demostraron, de forma predominante, la presencia de la proteína 42 kDa. Esta proteína no estaba significativamente presente en los polímeros de control que fueron implantados sin células ni en una línea de células de carcinoma epidermoide vulvar (A431) utilizado como un control negativo.

Ejemplo 8 Reconstrucción utilizando células endoteliales y musculares

Las células endoteliales humanas ECV 304 se derivan de las venas normales del cordón umbilical (Takahashi et al, 1990, In vitro cell- Dev. Biol, 26:265). Estas células fueron elegidas para este estudio debido a sus características singulares. A diferencia de la mayoría de los tipos de células endoteliales, las células endoteliales ECV 304 no reaccionan con anticuerpos anti-vWF; sin embargo, se pueden identificar con varios tipos de anticuerpos anti-citoqueratina (Hughes, et al 1996, Experiment. Cell Res. 225:171). Confirmamos estas características en cultivo antes de la implantación y estas diferencias nos permiten distinguir las células ECV 304 implantadas respecto a las células endoteliales anfitriones. In vitro, las células ECV 304 formaron una red endotelial de forma capilar extensiva (Riehmann, et al., 1993, J. Urol , 149:1304).

Polímetros. Láminas no tejidas de polímeros del ácido poliglicólico (densidad de 58 mg/cc), con unas dimensiones de 1,0 x 1, 0 x 0,3 cm, se utilizaron como vehículos de entrega de células. Se compusieron mallas poliméricas no tejidas compuestas por fibras de 15 \mum de diámetro con una porosidad mayor que el 95% antes de la siembra. El soporte polimérico biodegradable fue diseñado para degradación mediante hidrólisis en 6-8 semanas. Los polímeros fueron esterilizados en óxido de etileno y guardados bajo condiciones estériles hasta la entrega celular.

Cultivo de células. Las células de músculos lisos cavernosas de cuerpo humano normal primarias y las células endoteliales humanas ECV 304 (ATCC, Rockville, Maryland) fueron utilizadas en este estudio. Se obtuvieron biopsias de tejidos musculares lisos corporales humanos después del consentimiento informado durante la cirugía peneana rutinaria. Las células musculares fueron aisladas mediante técnicas de explantes establecidas (Moreland et al., 1995 J. Urol 153:826). En resumen, las muestras quirúrgicas fueron enjuagadas en solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y troceadas en pequeños fragmentos de aproximadamente 1 mm de diámetro. Los fragmentos musculares fueron enjuagados con solución salina equilibrada de Hank libre de calcio y magnesio y colocados en placas de cultivo de tejidos de 35 mm conteniendo medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Sigma St. Louis, MO) suplementados con suero bovino fetal al 10%. Las células se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada con un 95% de aire y un 5% de CO_{2} . Las células endoteliales humanas ECV 304 fueron colocadas en placas de cultivo de tejidos de 100 mm conteniendo Medium 199 (Sigma, St. Louis, MO) complementado con suero bovino fetal al 10%. Monocapas confluentes fueron subcultivadas mediante el tratamiento con 0,05% trixina-0,53 mM EDTA 4Na (Gibco BRL, Grand Island, NY) en PBS libre de calcio. Las células endoteliales y de músculos lisos corporales humanos fueron expandidas hasta que se consiguieron cantidades de células suficientes. Las células fueron tripsinizadas, recogidas, lavadas y recontadas para siembra. Las células endoteliales y de músculos lisos corporales fueron sembradas en polímeros del ácido poliglicólico a concentraciones de 20 x 10^{6} célula/cm^{3} y 10 x 10^{6} célula/cm^{3} respecti-
vamente.

Implantación. Veinte ratones atímicos fueron utilizados como receptores de células para este estudio. Los ratones fueron alojados juntos, teniendo acceso libre permitido a alimentos y agua y mantenidos en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, respectivamente. Todos los ratones fueron anestesiados con isoflurano mediante administración de conos. Un total de 80 soportes poliméricos (60 sembrados con células y 20 sin células) fueron implantados en el espacio subcutáneo de 20 ratones atímicos. Cada ratón tenía 4 lugares de implantación constituidos por 3 soportes poliméricos sembrados con células endoteliales y musculares y un control (polímero solo). Los ratones fueron sacrificados a 1, 3, 5 y 7 días (2 cada día) y a los 14, 21, 28 y 42 días (3 cada día) después de la implantación. Las estructuras recuperadas fueron analizadas en bruto y de forma histológica.

Análisis inmunocitoquímicos e histológicos. Secciones serie (5 \mum) de tejidos embebidos en parafina y fijados con formalina fueron cortadas y coloreadas con hematoxilina y eoxina (H&E). Se realizaron análisis inmunocitoquímicos en células cultivadas crecidas en platinas de cámaras Lab-Tek (Nunc, Inc., Naperville IL) y las muestras fueron recuperadas utilizando varios anticuerpos específicos. Anti-vWF policronal (Dako Corp. Carpintería CA) fue utilizado para identificar los vasos anfitriones infiltrantes. Se utilizaron anti-panoitoqueratinas monoclonales de reacción amplia AE1/AE3 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) para identificar las células endoteliales humanas ECV 304. Las fibras de músculos lisos corporales fueron etiquetadas con anti-alfa actina de músculo liso monoclonal (Dako Corp. Carpintería CA). El inmunoetiquetado fue realizado utilizando el sistema de detección de avidina - biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las secciones fueron contracoloreadas con hematoxilina.

Resultados

Las células de músculos lisos cavernosas del cuerpo humano en cultivo mostraron poblaciones homogéneas de células fusiformes bajo microscopia de contraste de fase. Las células endoteliales humanas ECV 304 fueron observadas como monocapas en forma adoquinada inicial y progresivamente agregadas y formaron redes de tipo capilar extensivas a los 27 días de cultivo (Figura 2A). Los análisis inmunocitoquímicos de las células in vitro fueron capaces de identificar las células endoteliales humanas ECV 304 con anti-pancitokeratinas (Figura 2B) y las células de músculos lisos con alfa-actina de músculo liso (Figura 2C). Los anticuerpos anti-vWF policlonales no colorearon las células ECV 304 (Figura 2D).

Todos los ratones sobrevivieron hasta el sacrificio sin ningún efecto inconveniente digno de mención. En la recuperación, los soportes poliméricos, sembrados con células, habían formado estructuras tisulares distintas y mantenido su tamaño antes de la implantación. Los soportes de control sin células habían disminuido de tamaño en el transcurso del tiempo.

Desde el punto de vista histológico, los polímeros recuperados, sembrados con células endoteliales y de músculos lisos corporales, mostraron la formación de bandas multicapas de músculo liso adyacentes al endotelio 7 días después de la implantación (Figura 3). Se observó la presencia de vasculatura nativa penetrante. La presencia de mayor organización de músculos lisos y la acumulación de endotelio recubriendo las estructuras luminales fueron evidentes 14 días después de la implantación. Una construcción bien organizada, constituida por células endoteliales y musculares, fue observada a los 28 y 42 días después de la implantación. Una degradación marcada de las fibras poliméricas fue observada a los 28 días. No hubo prueba evidente de formación tisular en los controles (polímeros sin células).

Los análisis inmunocitoquímicos utilizando anti-cWF (identificador de vasculatura nativa) anti-pancitoqueratinas (identificador de células endoteliales ECV 304) distinguieron el origen de las estructuras vasculares en cada una de las construcciones. Anticuerpos anti-vWF colorearon positivamente los vasos nativos, pero no colorearon las células endoteliales implantadas y las estructuras vasculares reconstituidas (Figura 4A). Por el contrario, los anticuerpos anti-pancitoqueratinas identificaron las células endoteliales implantadas y los vasos reconstituidos, pero no colorearon las estructuras vasculares nativas (Figura 4 B, C). Los anticuerpos de anti-alfa actina confirmaron el fenotipo de músculo liso. Las fibras de músculos lisos fueron progresivamente organizadas con el tiempo (Figura 5).

Este estudio demostró que las células endoteliales y de músculos lisos cavernosos del cuerpo humano sembradas sobre soportes poliméricos eran capaces de una reconstrucción in vivo. Los soportes mostraron una construcción bien organizada, constituida por músculo liso corporal y neo-vasculización por las células endoteliales implantadas y anfitrionas. Las células endoteliales implantadas facilitaron la formación de una arquitectura corporal similar a la encontrada en el tejido humano normal. Estos hallazgos complementan los resultados de ejemplos anteriores cuando el músculo liso corporal fue implantado solo; en dichos estudios, el músculo liso estaba presente y vascularizado, pero había una escasez de endotelio. Por lo tanto, la arquitectura difería algo del tejido eréctil nativo.

Este estudio demuestra que las células de músculos lisos corporales humanas y las células endoteliales sembradas sobre soportes poliméricos biodegradables son capaces de formar tejido cavernosal vascularizado cuando se implantan in vivo. Esta es la primera demostración en la ingeniería tisular en la que la formación capilar se facilita mediante la adición de células endoteliales para la formación de tejido compuesto. Las células endoteliales son capaces de actuar en conjunción con la vasculatura nativa. La creación de tejido corporal eréctil autólogo bien vascularizado, constituido por células endoteliales y de músculos lisos, queda así demostrada.

Claims

1. Estructura cavernosal corporal protésica implantable para su uso en reconstrucción peneana, comprendiendo dicha estructura una matriz polimérica que presenta una forma alargada con células de músculos lisos cavernosas corporales sembradas sobre la misma, comprendiendo además dicha estructura un medio adaptado para recibir una uretra, de modo que la implantación de dicha estructura induce la implantación y crecimiento de células de músculos lisos formándose así un elemento cavernoso artificial.

2. Estructura según la reivindicación 1, en la que dicha estructura comprende además células de músculos lisos que liberan prostaglandina E_{1} (PGE_{1}).

3. Estructura según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha estructura es un balón alargado hueco con un espesor de pared y una perforación interna a lo largo de su longitud, estando el balón preferentemente adaptado para recibir una uretra.

4. Estructura según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además por lo menos un extremo para la unión de dicho implante a la pelvis descendente.

5. Uso de una matriz polimérica conformada en forma de un elemento estructural deseado para la preparación de un implante para tratar un paciente con un defecto de pene, en el que la matriz polimérica se siembra depositando células de músculos lisos disociadas sobre dicha matriz para formar una construcción de matriz/células y en el que dicha construcción de matriz/células debe implantarse dentro del pene de dicho paciente para formar una estructura cavernosal corporal protésica que presente propiedades biomecánicas controladas.

6. Uso según la reivindicación 5, en el que dicha matriz polimérica adopta la forma de un balón alargado hueco que presenta una pared que rodea una perforación interna que se extiende a lo largo de por lo menos una parte de su longitud y que comprende además un medio adaptado para recibir una uretra.

7. Uso según la reivindicación 5, en el que la estructura cavernosa corporal protésica, con propiedades biomecánicas controladas, proporciona al pene reconstituido una rigidez y una resistencia a la flexión suficientes cuando está en la condición erecta para servir como órgano funcional.

8. Estructura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que la matriz polimérica comprende un material biocompatible seleccionado de entre el grupo constituido por éter de celulosa, celulosa, éster celulósico, polietileno fluorado, polímero fenólico, poli-4-metilpenteno, poliacrilonitrilo, poliamida, poliamidoimida, poliacrilato, polibenzoxazol, policarbonato, policianoarileter, poliester, poliestercarbonato, polieter, polieteretercetona, poli-eterimida, polietercetona, polietersulfona, polietileno, polifluorolefina, poliimida, poliolefina, polioxidiazol, polifenilenóxido, sulfuro de polifenileno, polipropileno, poliestireno, polisulfuro, polisulfona, politetrafluoroetileno, politioeter, politriazol, poliuretano, polivinilo, cloruro de polivinilideno, celulosa regenerada, silicona, urea formaldehído o copolímeros o mezclas físicas de éstos.

9. Estructura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o uso de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que la matriz polimérica comprende un material biodegradable, preferentemente un polímero de ácido poliglicólico.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que dichas células de músculos lisos son células cavernosas corporales.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que dichas células de músculos lisos presentan una expresión reducida de TGF - 1.

12. Uso según la reivindicación 13, en el que dichas células de músculos lisos presentan una expresión elevada de prostaglandina E_{1} (PGE_{1}).

13. Uso según la reivindicación 7, en el que dicho elemento estructural es un cilindro alargado que comprende además unos medios adaptados para recibir una uretra.

14. Estructura según la reivindicación 1, o uso según la reivindicación 6 ó 13, en la que dicho medio adaptado para recibir una uretra es una ranura longitudinal a lo largo de su longitud.

15. Uso según la reivindicación 7, en el que dicho elemento estructural es un balón alargado hueco con espesor de pared y una perforación interna a lo largo de su longitud.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que el elemento estructural está adaptado para recibir una uretra.

17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16, en el que dicho elemento estructural comprende además por lo menos un extremo para la unión de dicho implante a la pelvis descendente.

18. Estructura según la reivindicación 1, que comprende además células endoteliales sembradas sobre dicha matriz polimérica, en la que las células endoteliales son preferentemente células endoteliales humanas EC 304.