ES2326306T3 - Utilizacion del anticuerpo monoclonal especifico respecto del cd28 humano para la fabricacion de una composicion farmaceutica para la terapia de infecciones viricas humanas. - Google Patents
Utilizacion del anticuerpo monoclonal especifico respecto del cd28 humano para la fabricacion de una composicion farmaceutica para la terapia de infecciones viricas humanas. Download PDFInfo
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Abstract
Composición farmacéutica en las forma de presentación de preparado o paquete de preparado con dosis farmacéuticamente activas de los siguientes componentes de principio activo: a) un anticuerpo monoclonal específico respecto del CD28 humano que activa los linfocitos T humanos de varios a todos los subgrupos sin ocupación de un receptor antigénico de linfocitos T que es, por ende, antigénicamente inespecífico, b) un inhibidor de la transcriptasa inversa y c) un inhibidor de la proteasa.
Description
Utilización del anticuerpo monoclonal específico
respecto del CD28 humano para la fabricación de una composición
farmacéutica para la terapia de infecciones víricas humanas.
La invención es relativa a una composición
farmacéutica en la presentación de preparado o paquete de preparado
para la terapia de infecciones víricas humanas.
El VIH tiene un ciclo vital a lo largo del cual
puede encontrarse en diversos estadios o fases de latencia. Una
primera fase de latencia se denomina "preintegrativa", lo cual
viene a decir que el VIH ciertamente se ha importado ya a la célula
huésped y acaso haya sido sometido, parcialmente al menos, a la
transcripción inversa sin que, no obstante, haya llegado a
instalarse en el núcleo celular en tanto provirus. Este estado de
latencia prointegrativo puede permanecer funcionalmente latente a lo
largo de varias semanas hasta la pérdida de la aptitud funcional.
La latencia preintegrativa requiere que la célula huésped repose.
Otro estadio de latencia se denomina postintegrativo y viene a
decir que el VIH ha sido ciertamente integrado en el núcleo celular
en tanto provirus aunque la célula huésped, si bien a modo de mero
ejemplo, reposa por causa de su desactivación y consecuentemente no
tiene lugar ninguna replicación del virus. La latencia
postintegrativa es relativamente estable por un espacio de tiempo
dilatado y se mantiene hasta que suceda una activación de la célula
huésped. La activación de células huésped que contengan VIH latentes
(postintegrativos o preintegrativos) tiene lugar por medio de
diversos estímulos con la consecuencia de que también se activa la
replicación de los virus, con lo cual se destruye la célula huésped
y los virus acceden a los humores corporales. Las explicaciones
precedentes pueden aplicarse en principio a todos los retrovirus.
Los virus en estado de latencia se denominan consecuentemente virus
latentes.
Los enfoques terapéuticos habidos hasta ahora
con inhibidores de la transcriptasa inversa y, en su caso,
inhibidores de la proteasa, suprimen la proliferación del virus
tras la activación de éste encontrándose en estado de latencia. Es
cierto que de este modo en la terapia desaparecen de la circulación
los VIHs libres, no obstante los leucocitos en estado de reposo
siguen conteniendo virus latentes (T.W. Chun et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU., 94:13193-13197 (1997); D.
Finzi et al., Science, 278:1295-1300 (1997);
J.K. Wong et al., Science, 278:1291-1295
(1997)). La consecuencia es una reaparición de virus aptos para la
replicación si se interrumpe la terapia (M.D. de Jong et
al., SIDA, 1l:F79-84 (1997)) y la prosecución de
la enfermedad. La terapia con inhibidores de la transcriptasa
inversa y, en su caso, inhibidores de la proteasa es, por otra
parte, tóxica. Por lo tanto un tratamiento que necesariamente haya
de prolongarse de por vida tiene sus límites o bien es
cuestionable. Además el tratamiento con inhibidores de la
transcriptasa inversa y, en su caso, inhibidores de la proteasa
supone unos costes considerables.
En tanto consecuencia de la problemática general
precedente se ha propuesto someter los VIHs latentes a la terapia
con inhibidores de la transcriptasa inversa e inhibidores de la
proteasa con un tratamiento simultáneo con agentes
inmunoestimulantes cuya función sea la de activar los VIHs latentes
("flush out"; O.J. Cohen et al., J. Am. Med Assoc.,
280:87-88 (1998); J. Cohen, Science,
279:1854-1855 (1998); D.D. Ho, Science,
280:1866-1867 (1998); L.K. Schrager et al.,
J. Am. Med. Assoc., 280:67-71 (1998)). Concretamente
la publicación de T.W. Chun et al., Nature Medicine, volumen
5, número 6, pp. 651-655 (1999) muestra que
empleando el factor de crecimiento de células T interleucina 2
(IL-2) junto con la terapia retroviral altamente
activa (HAART) (a este respecto véase más abajo) se obtiene una
considerable reducción de la cantidad de componentes de replicación
de VIH en los linfocitos T en estado de reposo. En todo caso la
mayor parte de los linfocitos T CD4 en estado de reposo no expresa
ningún receptor relativo al factor de crecimiento
IL-2. Por lo tanto estas células, y por ende el VIH
en ellas latente, no se encuentran accesibles por medio del
suministro de IL-2. La problemática básica
precedente sigue persistiendo en consecuencia y en el mejor de los
casos sólo se aliva levemente. Además cabe considerar que el
suministro de IL-2 supone unos efectos secundarios
de considerables perturbaciones lo cual pone más aun en entredicho
el relativo éxito de esta
estrategia.
estrategia.
La terapia más extendida entre las que emplean
inhibidores de la transcriptasa inversa es la terapia HAART
("terapia retroviral altamente activa"). Ésta consiste en el
empleo combinado de dos inhibidores de la transcriptasa inversa,
por ejemplo el análogo de nucleósido AZT (o cidovudina) y el 3TC (o
lamivudina) junto con uno o varios inhibidores de la proteasa. Un
ejemplo de inhibidor de la proteasa es IDV (indinavir). Respecto de
la terapia HAART, las substancias en ella empleadas y la
planificación terapéutica cabe considerar las siguientes notas
bibliográficas: J. Laurence, HAART Regiments: Do the effects last?
en The AIDS Reader 7(6):84-85 (1997); R.M.
Gulick et al., N. Engl. J. Med., 337:734-739
(1997); S.M. Hammer et al., N. Engl. J. Med.,
337:725-733 (1997); y F.J. Jr. Palella et
al., N. Engl. J. Med., 338:853-860 (1998). Otros
ejemplos de inhibidores de la transcriptasa inversa apropiados con
los análogos de nucleósido d4T (estavudina), ddl (didanosina) y ddC
(zalcitabina) así como el no análogo de nucleósido DLV (delavirdina)
y NVP (vevirapina). Demás ejemplos de inhibidores de la proteasa
apropiados son NFV (nelfinavir), RTV (ritonavir) y SQV
(saquinavir).
De la publicación indicada en nota bibliográfica
WO 98/54225 se conocen anticuerpos monoclonales
humano-compatibles específicos respecto del CD28
humano y linfocitos T humanos de varios o incluso todos los
subgrupos sin ocupación de un receptor de antígeno de linfocitos T
humanos y, por lo tanto, de activación antigénica no específica. En
relación a demás informaciones en torno al tema se hace referencia
las citas mencionadas de este apartado bibliográfico. Del apartado
de esta publicación también nos es conocido el empleo de este
anticuerpo monoclonal para el tratamiento de enfermedades en las
que nos encontramos ante una reducción patológica de la cantidad de
células CD4-T como, por ejemplo, el SIDA. El
trasfondo de este uso viene a ser que por medio de este anticuerpo
la cantidad de células CD4-T pueden aumentarse de
nuevo. No tiene lugar la combinación con el suministro de
inhibidores de la transcriptasa inversa y, en su caso, inhibidores
de la proteasa.
De la nota bibliográfica Database AIDSLINE,
AN=1998:8037, M. Hezareh et al. es conocido que la
estimulación clásica de célula T anti CD3/CD28 tiene por
consecuencia un aumento de la producción vírica de VIH.
Frente al estado de la técnica más próximo según
T.W. Chun et al., Nature Medicine, volumen 5, número 6, págs.
651-655, a la invención subyace el problema técnico
de desarrollar un compuesto farmacéutico o bien un plan terapéutico
por medio del cual, por una parte, se active al menos una gran parte
de los virus VIH (si bien no todos) en estado de latencia (y por
ende, por medio de inhibidores de virus puedan llegar a inhibirse y
finalmente destruirse), mientras que por otra parte se reduzcan los
efectos secundarios.
La invención enseña el objeto de la
reivindicación número 1. Se parte del principio elemental de que los
componentes de principio activo han de emplearse en dosis
farmacéuticamente efectivas.
La composición farmacéutica puede contener
optativamente uno de b) varios inhibidores de transcriptasa inversa
y optativamente uno de c) varios inhibidores de proteasa.
Además de los precedentes componentes de
principio activo pueden contenerse otros principios activos y/o
otras substancias apropiadas o requeridas para la presentación
galénica.
La invención es apropiada para el tratamiento de
infecciones víricas con lentivirus, especialmente el SIDA, en
humanos.
La invención se basa primeramente en el hallazgo
de que por medio de la activación de una gran parte de los
linfocitos T también pueden activarse virus (latentes) en estado de
reposo y, de este modo, por medio de los inhibidores de la
transcriptasa inversa y de los inhibidores de la proteasa,
convertirse en susceptibles de ser destruidos. A este respecto
subsiguientemente la invención se basa en el sorprendente hallazgo
de que el empleo paralelo de inhibidores de la transcriptasa
inversa (tóxicos), por ejemplo en la terapia HAART (tóxica), no
evita la activación de los linfocitos T. El resultado de esto mismo
es doblemente significativo y, consecuentemente, de efecto
sinergético. Por una parte, pues, se pone a seguro la activación de
la mayor parte de los linfocitos T a pesar de la terapia HAART
aplicada paralelamente con la consecuente destrucción del conjunto
prácticamente íntegro de virus latentes gracias a la misma terapia
HAART. Por otra parte se aumenta de nuevo simultáneamente la
cantidad de linfocitos T patológicamente mermada con lo que,
consecuentemente, se consigue una estabilización del sistema
inmunológico. A este respecto cabe mencionar que con los medios
relativos a la invención probablemente se activan también
indirectamente conjuntos o reservas de células no T en relación a
los virus en estado de latencia (por ejemplo macrófagos) por efecto
de la intensa estimulación general del sistema inmunológico o las
células T con la correspondiente liberación de citocina y, por ende,
el hecho de que también puedan activarse y destruirse estos virus
latentes, con lo cual nos encontramos ante otro efecto sinergético
más.
Finalmente se consigue que no solamente se
desconecten de un modo prácticamente íntegro los virus libres sino
que también prácticamente el conjunto íntegro de virus latentes
pueda hacerse accesible al proceso de destrucción por medio de la
activación. De este modo la terapia HAART no necesita aplicarse ya
de por vida, sino que se consigue que al menos tan sólo haya de
aplicarse en unos intervalos temporales muy dilatados. Otra
sorprendente ventaja frente al estado de la técnica más próximo
consiste en el hecho de que los anticuerpos empleados según la
invención tras las primeras exploraciones en modelos con animales no
parecen producir efectos secundarios algunos. Visto ello en
conjunto se obtiene una desconexión esencialmente más efectiva de
los virus además de un considerable aumento del bienestar del
paciente ya incluso durante la terapia.
A este mismo respecto cabe mencionar también que
los anticuerpos monoclonales empleados según la invención de hecho
pueden promover la proliferación de todas las células T CD4. Tan
sólo una subpopulación de linfocitos T CD8 que no expresa CD28 no
puede activarse por medio de los reactivos activantes específicos de
CD28. Sea como sea, ella no supone ningún conjunto o reserva
esencial de VIH, ya que el receptor primario de VIH es la molécula
CD4.
"Anticuerpos monoclonales" se denominan a
los anticuerpos producidos por líneas celulares híbridas (los
hibridomas) generadas por medio de la fusión de una célula B de
origen humano o animal que produce anticuerpos con una célula
tumoral de mieloma apropiada. Con el término de "anticuerpos
monoclonales" de esta descripción se abarca también a sus
derivados.
Con "CD28" se expresa una molécula de
superficie celular expresada en linfocitos T de origen humano y
animal de secuencia de aminoácidos conocida a la cual, en el marco
del "Human Leukocyte Typing Workshops" internacional se le
asignó la abreviatura CD28.
Con la activación de los linfocitos T se hacen
referencia al aumento de la actividad metabólica, el aumento del
volumen celular, la síntesis de moléculas inmonológicamente
importantes y la penetración en la división de la célula
(proliferación) de linfocitos T por efecto de un estímulo exterior.
Estos procesos, por ejemplo, son causados por efecto por la
ocupación de la molécula CD28 en células T por anticuerpos
monoclonales específicos de CD28. La activación de los linfocitos T
con los efectos colaterales descritos es una parte de la
inmunorreacción fisiológica, sin embargo, en situaciones
patológicas, puede descontrolarse (enfermedades linfoproliferativas)
o ser insuficiente (inmunodeficiencia).
Los componentes constantes de un anticuerpo son
zonas no pertinentes para la localización de los antígenos, al
contrario que las zonas variables que antes bien definen la
especificidad antigénica de un anticuerpo. Los componentes
constantes se diferencian, por otra parte, en los anticuerpos de
diversos tipos y consecuentemente en animales y personas. Las zonas
constantes de un anticuerpo han de corresponderse con las de los
anticuerpos de un organismo que haya de ser tratado con anticuerpos
por motivos de compatibilidad.
Los derivados de los anticuerpos monoclonales
son modificaciones del anticuerpo monoclonal que se generan por
medio de las manipulaciones habituales bioquímicas o
técnico-genéticas. Esto tiene lugar, por ejemplo,
en el caso de la humanización de un anticuerpo monoclonal de ratón
substituyéndose parcialmente componentes estructurales (constantes)
del anticuerpo de ratón por otros humanos. Los derivados siguen
siendo anticuerpos monoclonales que, si bien han sido modificados
químicamente, desempeñan en el marco de la invención unas funciones
esclarificadoras. El criterio común es siempre la especificidad de
CD28 con efecto de simulación.
"Análogas" se llama a las substancias que
no son anticuerpos monoclonales y que, sin embargo, desempeñan
funciones esclarificadoras en el marco de la invención. Un ejemplo a
este respecto son las proteínas sintéticas altamente específicas
"a medida" o moléculas ARN o bien ADN (por ejemplo aptámeros,
especialmente aptámeros o bien moléculas ARN o ADN estabilizados
frente a encimas divisoras de ácidos nucleicos). El criterio común
es siempre la especificidad de CD28 con efecto de simulación.
Con "determinante" se da a conocer la zona
de una molécula definida por medio de la especificidad de conexión
de uno o varios anticuerpos.
Con la expresión de "dosis terapéutica
activa" se denominan en relación a los virus inhibidores, por
ejemplo en relación a los inhibidores de la transcriptasa inversa
(y, en su caso, los inhibidores de la proteasa), una dosis que
tiene por consecuencia una disminución considerable de la cantidad
de virus capaces de replicarse a partir de un espacio cronológico
determinado tras el suministro de los inhibidores de virus a un
paciente (o en un sistema de pruebas) en comparación con la
cantidad de virus aptos para replicarse tras el mismo espacio
temporal (y la misma cantidad inicial de virus con la capacidad de
replicarse) si bien sin suministrarse nada.
Con la expresión de "dosis terapéutica
activa" se denomina, en relación con los anticuerpos empleados
en el sentido definido de la invención, una dosis que tiene por
consecuencia un aumento considerable de la cantidad de células T
CD4 y/o de la expresión de marcadores de activación serológicamente
comprobables (CD25, CD45R0, CD71) tras un espacio cronológico
definido en un organismo o sistema de pruebas a los que fueron
suministrados los anticuerpos en comparación con valores
respectivos tras el mismo espacio cronológico y los mismos valores
iniciales si bien sin suministrarse nada.
Con "humano-compatibles" se
hace referencia a los anticuerpos que se han humanizado. A este
respecto cabe mencionar que los anticuerpos no humanizados y, por
tanto, no afectados por la definición aquí tomada de anticuerpos
humano-compatibles, pueden emplearse para la terapia
de personas. En la terapia de las personas pueden emplearse todos
los anticuerpos que a lo largo de un espacio cronológico determinado
no activan ninguna inmunorreacción indeseada como ejemplarmente es
verificable determinando el anticuerpo
anti-inmunglobulina en tanto criterio para la
interrupción.
Como "inhibidor de virus" se denomina a la
substancia que en cualquier nivel del ciclo vital ataca a un virus
directa o indirectamente con efecto de inhibición. A este respecto
se consideran además de los inhibidores de la transcriptasa inversa
y los inhibidores de la proteasa, por ejemplo, los inhibidores de
los receptores de la superficie celular a los cuales se conecta un
virus o bien los inhibidores de todas las proteínas o procesos
víricos positivamente reguladores, incluyendo los inhibidores de
substancias celulares positivamente reguladoras que surten efecto
en la llamada "long terminal repeat" de un virus. Por principio
general se consideran a este respecto también las substancias que
no son inhibidores siempre que induzcan proteínas o bien procesos
víricos negativamente reguladores; estas substancias activas quedan
igualmente contenidas por la expresión de "inhibidor de
virus".
El concepto de "suministro continuo" de un
componente de substancia activa b) y/o c) y/o d) y/o e) viene a
decir que se prosigue de un modo continuo un subplán terapéutico (en
sí mismo acaso discontinuo) relativo a este componente. En este
sentido la expresión de "suministro continuo" contiene también,
por ejemplo en la terapia HAART, una variación y adaptación
individual de los componentes del principio activo o bien de su
dosificación en la prosecución del suministro continuo.
En adelante se indican e ilustran más
detalladamente las formas de ejecución oportunas o preferentes de la
invención.
La invención es apropiada para el tratamiento de
enfermedades en las cuales los linfocitos T CD4, especialmente los
linfocitos T humanos CD4, se hayan infectado, respecto de lo cual
son específicos los anticuerpos monoclonales relativos al CD28
humano mientras que los anticuerpos monoclonales son optativamente
humano-compatibles. En el tratamiento de
infecciones de los linfocitos humanos CD4, los anticuerpos deben ser
específicos humanos CD28, si bien no tienen que ser necesariamente
humano-compatibles. La invención puede aplicarse,
por ejemplo, siempre que una infección vírica se trate de una
infección con retrovirus, especialmente con lentivirus como, por
ejemplo, el VIH.
Es adecuado cuando el inhibidor de la
transcriptasa inversa sea un análogo de nucleósido de pirimidina,
preferentemente 3'-azido-3'
dexositimidina (AZT o cidovudina) y optativamente en la composición
farmacéutica sigan conteniéndose a este respecto adicionalmente
otros análogos de nucleósido diversos, preferentemente 3TC. La
composición farmacéutica contiene adicionalmente un inhibidor de la
proteasa y, por lo demás, optativamente, otros inhibidores de la
proteasa diferentes al respecto. Con una combinación de substancias
o principios activos de un mínimo de dos inhibidores de la
transcriptasa inversa y un mínimo de un inhibidor de la proteasa
trabaja la terapia HAART.
Los anticuerpos monoclonales empleados según la
invención pueden obtenerse de las más diversas maneras. Un modelo
apto para el empleo según los ejemplos de modelos puede obtenerse
por A) producción células hibridomas específicas de anticuerpos de
animal aptas para la producción de CD28 humano monoclonal en vías de
una inmunización con no líneas celulares de tumor T en las que se
exprese el CD28 humano, B) en su caso, humanización de los
anticuerpos de animal monoclonales obtenidos de células hibridomas
según el nivel A por medio de substitución bioquímica o
técnico-genética de componentes constantes de los
anticuerpos animales por componentes constantes análogos de un
anticuerpo humano o bien por substitución de los genes
correspondientes a los componentes de las células hibridomas, C)
secreción de los anticuerpos monoclonales en cultivos de células
hibridomas y aislamiento de los anticuerpos monoclonales de ello
resultantes o producción de anticuerpos monoclonales por inyección
de células hibridomas en animales, por ejemplo en ratones, así como
aislamiento de los anticuerpos monoclonales de los humores
corporales de los animales. Las células hibridomas aptas para la
producción de anticuerpos de animales específicos de CD28 humanos
monoclonales pueden obtenerse por a) creación de un plásmido por
medio de inserción de ADN complementario de CD28 humano en el
vector pH\betaAPr-1-neo tras la
escisión del fragmento SalI- HindIII y creación de protoplastos de
escherichia coli (MC106l), los cuales contienen el plásmido,
b) fusión de los protoplastos con células tumorales de ratón A20J
y/o L929 por medio de polietilenglicol, c) cultivo de las células
transferidas obtenidas en el nivel b, d) detección sistemática (por
screen) de las células de ratón A20J y/o L929 transferidas a la
expresión de CD28 humano y selección de células de ratón A20J y/o
L929 que expresen el CD28 humano, e) inmunización de ratones BALB/c
con células de ratón A20J y/o L929 que expresen el CD28 humano, f)
extracción de células del bazo de ratones así inmunizados y fusión
de las células del bazo con las células de la línea celular
X63-Ag 8.653 por medio de polietilenglicol, g)
selección de las células hibridomas así obtenidas con vistas a que
los anticuerpos de células hibridomas seleccionadas en exceso
("sobrenadantes") se conecten a las células de ratón A20J y/o
L929 que expresen el CD28 humano y h) cultivo/subclonación de las
células hibridomas seleccionadas obtenidas en el nivel g. En lugar
de los niveles de a) a d) naturalmente pueden emplearse otros
sistemas de expresión con los que el especialista se sienta más
familiarizado. El ADN complementario de CD28 humano puede
solicitarse libremente a los doctores A. Aruffo y B. Seed, que han
publicado la secuencia y los siguientes escritos especializados:
Aruffo, A., and Seed, B, 1987, "Molecular cloning of a CD28 cDNA
by a high efficiency COS cell expression system", Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU., 84:8573. En este lugar bibliográfico puede
consultarse por tanto detalladamente la producción de ADN
complementario de CD28 humano. Por lo demás cualquier especialista
puede producir muy fácilmente un clon de ADN complementario de CD28
humano con la ayuda de la secuencia depuesta en el banco de genes y
la reacción de polimerización en cadena. El vector
pH\betaAPr-1-neo puede obtenerse
libremente de los autores de la cita bibliográfica Gunning, P,
et al., 1987, "A human \beta-actin
expression vector system directs high-level
aecumulation of antisense transcripts", Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU., 84:4831. "neo" significa a este respecto
"resistencia a la neomicina". El nivel c) se lleva a cabo, por
tanto, en ausencia de la neomicina. Las líneas celulares y/o los
microorganismos anteriormente mencionados son libremente accesibles
y pueden adquirirse por medio de compra en la American Type Culture
Collection (ATCC). En relación a la escherichia coli
(MC1061) cabe también hacer mención a la nota bibliográfica de
Meissner, P.S., et al., 1987, "Bacteriophage gamma cloning
system for the construction of directional cDNA libraries", Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU., 84:4171.
El modo de proceder por principio general en la
producción de células hibridomas, en la humanización así como en la
producción de anticuerpos monoclonales partiendo de células
hibridomas (humanizadas) es algo con lo que el especialista está
bien familiarizado y no requiere, por ende, ser aquí expuesto en
mayor detalle. Por principio general pueden emplearse todas líneas
celulares conocidas y libremente accesibles, especialmente las
habituales para la producción de células hibridomas. Para la
producción de los anticuerpos monoclonales cabe considerar en
general, además del método en adelante ilustrado, la expresión
recombinante que habitualmente conocen bien en detalle los
especialistas.
Los anticuerpos monoclonales que pueden
emplearse son accesibles, en todo caso, a través de otras vías. Así,
por ejemplo, la inmunización en el nivel A) puede realizarse frente
a recombinante humano CD28 soluble o ya disuelto. La humanización
puede hacer innecesaria si se emplean células animales para la
producción de células hibridomas que se hayan manipulado
genéticamente de tal modo que los anticuerpos generados ya presenten
los componentes constantes humanos. Otra idea completamente
diferente para la producción de anticuerpos monoclonales consiste
en que los ámbito de conexión antigénica de anticuerpos(por
ejemplo, humanos) se expresen técnico-genéticamente
en una biblioteca de bacteriófagos altamente compleja de cuyos
ámbitos de conexión apropiados y por su afinidad respecto de CD28
se puedan aislar y completarse de modo que se obtengan anticuerpos
completos.
En relación a al composición farmacéutica los
componentes de principio activo b) y c) pueden elegirse, dosificarse
y prepararse de modo que queden listos para el suministro de
acuerdo a la terapia HAART. En principio pueden usarse todas las
variantes existentes y que se desarrollen en el futuro de la terapia
HAART o de cualquier otra terapia siempre que por medio de uno o
varios principios activos no se compense (en demasía) el efecto
activador de los anticuerpos monoclonales. En el marco de los
actuales enfoques terapéuticos es frecuentemente prometedor que los
componentes de la substancia o principio activo b) sea un análogo de
nucleósido de pirimidina, preferentemente
3'-azido-3' dexositimidina y/o
contenga 3TC. Puede ser conveniente que los componentes de
principio activo b) y c) formen parte de un primer componente de
paquete y que los componentes del principio activo a) formen parte
de un segundo componente de paquete.
A la hora de aplicar la invención en un proceso
terapéutico los componentes de principio activo b) y c) pueden
seleccionarse, dosificarse y suministrarse de acuerdo a la terapia
HAART, en lo cual cabe observar que el componente de principio
activo a) puede suministrarse antes, juntamente o después de los
componentes de principio activo b) y c). En ciertos casos los
componentes de principio activo b) y c) pueden suministrarse
continuamente y el componente de principio activo a) una o varias
veces en intervalos cronológicos con pausas. El componente de
principio activo b) puede ser un análogo de nucleósido de
pirimidina, preferentemente
3'-azido-3' dexositimidina y/o
3TC.
En el marco de un plan terapéutico el suministro
del componente de principio activo b) puede tener lugar en el marco
de una parte del plan terapéutico mismo (subplán) que viene a ser la
terapia HAART. Primeramente tiene lugar la terapia básica HAART a
lo largo de un espacio temporal de uno a doce meses, preferentemente
de dos a seis meses e idealmente de dos a cuatro meses, por ejemplo
tres meses (un mes = 30 días). Durante este tiempo puede examinarse
regularmente la cantidad de células T CD4 y/o la cantidad de virus
y/o los virus latentes (por ejemplo de acuerdo a lo indicado en la
nota bibliográfica de T.W. Chun et al., Nature,
387:183-188 (1997))y partiendo de los resultados
así obtenidos, la terapia HAART puede adaptarse individualmente al
paciente (seleccionando o bien substituyendo y combinando los
inhibidores de la transcriptasa inversa y/o los inhibidores de la
proteasa así como las dosis correspondientes). En un primer ciclo
puede suministrarse entonces una inyección (preferentemente por vía
intravenosa) de anticuerpos con una dosis de 0,1 a 50,
preferentemente de 0,5 a 20 e idealmente de 0,5 a 5 mg/kg de peso
corporal manteniendo la terapia HAART. La dosis precedente puede
suministrarse de una vez o bien en una cantidad de dos a diez,
preferentemente de dos a cinco particiones a lo largo de un espacio
temporal de una hora a un mes, preferentemente de uno a cinco días;
las particiones pueden ser iguales o desiguales. En una pausa que
sigue a esta medida (manteniéndose en todo caso la terapia HAART) de
un día a seis meses, preferentemente de medio mes a dos meses, por
ejemplo un mes, puede tener lugar una supervisión de los valores
precedentes mencionados con motivo de la terapia básica y/o del
hemograma y/o de los valores hematológicos y/o los valores de los
resultados clínicos internos y/o la formación de anticuerpos de
anti-inmunglobulina (Ig anti-animal
en el caso de anticuerpos no humanizados,
anti-idiotípico tras la humanización). Tras la
conclusión de la pausa y en caso de necesidad puede repetirse el
ciclo comenzando con el suministro del anticuerpo. Cuando las PBMC
(linfocitos más monocitos) se encuentren libres de virus y de virus
latentes o bien de provirus puede llevarse a cabo con el
consentimiento del paciente una biopsia de ganglios linfáticos con
fines de verificación. En el caso de un resultado positivo
(positivo = detección de virus, de virus latente o de provirus)
puede continuarse con demás ciclos del modo que se ha expuesto
anteriormente. En el caso de un resultado negativo puede
suspenderse el suministro de principios activos HAART y de
anticuerpos. Es recomendable que tras la suspensión se lleven a
cabo demás inspecciones del tipo precedente a modo de control en
intervalos cronológicos determinados y retomar el tratamiento en
caso necesario. Las explicaciones precedentes son vigentes en el
caso un proceso terapéutico.
En el marco de la invención pueden emplearse,
por ejemplo, los anticuerpos monoclonales CMY-2, que
pueden obtenerse a partir de células hibridomas según depósito DSM
ACC2353 o comprándolos a la empresa ALEXIS (ALEXIS Deutschland
GmbH, D-35305 Grünberg) y el clon ANC28.1/5D10
producido por la empresa Ancell Corporation (EE.UU.) o bien una
variante preferentemente humanizada o
humano-compatible del clon ANC28.1/5D10.
Los anticuerpos monoclonales empleados según la
invención pueden presentar especialmente la especificidad respecto
de determinantes de la molécula humana CD28, que son difícilmente
accesibles a la molécula CD28 expresada de un modo natural y cuya
ocupación por los anticuerpos monoclonales tiene por consecuencia la
activación de las células T.
La presentación galénica de los componentes de
principio activo o de mixturas a partir de ellos destinadas a las
diferentes formas de aplicación es bien conocida por el
especialista, de modo que no necesitamos aquí detallar más al
respecto.
En el marco de la invención pueden presentarse o
emplearse optativamente demás substancias o principios activos
adicionales que son diferentes de los principios activos
anteriormente mencionados y empleados según la concepción básica de
la invención. Estos principios activos adicionales son, por ejemplo,
principios activos que posiblemente contrarresten ciertos efectos
secundarios. Simplemente a modo de ejemplo cabe mencionar a este
respecto los anticuerpos anti-TNF (TNF: factor de
necrosis tumoral) en el caso de una reacción TNF proinflamatoria.
Las substancias o principios activos adicionales son por lo demás
substancias que pueden suponer una ayuda en relación con la
expansión del sistema inmunológico. Así pues, por ejemplo, por medio
del suministro de IL-2 puede inducirse o bien
intensificarse la proliferación de células CD8. En general en tanto
substancias adicionales pueden emplearse substancias
inmunomoduladoras con arreglo al proceso inmunológico (en detalle o
secundario) que se promueve (o inhibe) convenientemente en relación
a la invención. Un ejemplo a este respecto son los oligonucleótidos
con motivos CpG (D. Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU., 93:2879-2883 (1996)).
En adelante se expone la invención en mayor
detalle partiendo de ejemplos de modelos o aplicación. Entre otras
cosas se describirá la producción de los anticuerpos monoclonales
que se emplean según la invención. En estos ejemplos de modelo o de
aplicación se esclarecen también los procesos detección sistemática
(por screen) en detalle, con los cuales se seleccionan los
anticuerpos monoclonales o las células hibridomas a ellos
subyacentes según la invención. Con los siguientes ejemplo se
ilustran también los efectos terapéuticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos o ejemplos expuestos respecto
de los efectos de los anticuerpos monoclonales específicos de CD28
"directos" se han llevado a cabo en modelos con animales
(ratas) a lo cual cabe referir que en tanto ejemplo del anticuerpo
monoclonal específico CD28 "clásico" se empleó el anticuerpo
monoclonal JJ319 y en tanto ejemplo del "directo" se empleó el
anticuerpo activador y monoclonal JJ316. De ambos anticuerpos puede
disponerse libremente y comprarse en la empresa Pharmingen, San
Diego (EE.UU.). Los anticuerpos JJ319 y JJ316 puede obtenerse, por
lo demás, según la nota bibliográfica de M. Tacke et al.,
immunology, 1995, 154: 5121-5127, a la cual hacemos
aquí referencia expresa también en relación a ciertos detalles de la
producción de células hibridomas y anticuerpos monoclonales.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos ejemplos se expone con más detalle la
producción de anticuerpos monoclonales específicos de CD28 humanos
según la invención. Estos se denominarán en adelante también
"CMY-2". Un CD28 humano de una biblioteca de
ADN complementarios se ha expresado recombinantemente en una línea
celular A20J y/o L929. Primeramente se creó a este respecto un
plásmido por medio de inserción de ADN complementario de CD28 humano
en el vector pH\betaAPr-1-neo
tras escisión del fragmento SalI-HindIII. Partiendo
de la escherichia coli (MC1061) se obtuvieron protoplastos
que contienen el plásmido. Tuvo entonces lugar una fusión de los
protoplastos con A20J de ratón y/o células tumorales L929 por medio
de polietilenglicol. Las células transferidas así obtenidas se
cultivaron del modo habitual. Seguidamente tuvo lugar una detección
sistemática (por screen)de las células transferidas A20J de
ratón y/o células L929 en la expresión del CD28 humano y una
selección de células de ratón A20J y/o células L929 expresantes del
CD28 humano.
La demostración de que la expresión hubiera
tenido éxito tuvo lugar por medio de un anticuerpo convencional
marcado con fluorescencia, comercialmente adquirible y con la
especificidad CD28 humano (9.3-ficoeritrina). En
tanto control negativo se colorearon con el mismo anticuerpo células
no trasferidas A20J o L929. Los transfectantes
(A20J-CD28 y L929-CD28) mostraron
una intensidad de fluorescencia superior. Puesto que no todas las
células CD28 eran positivas, se subclonaron las células CD28
positivas y se emplearon para la inmunización. Como puede
reconocerse en la figura 1 en el desplazamiento del cúmulo de puntos
hacia arriba en ambos diagramas derechos, estas células
reaccionaron con los anticuerpos que pueden obtenerse
comercialmente; expresaban, por tanto, el CD28 humano en su
superficie.
La línea celular A20J CD28 humano se empleó para
la inmunización de BALB/c de ratones. La fusión celular y la
detección sistemática (por screen) se llevaron a cabo como se
describe a continuación: i) inmunización de BALB/c de ratón con las
células A20J de ratón con expresión del CD28 humano (6 inyecciones
i.p. y seguidamente una por vía intravenosa). ii) Toma de células
del bazo de los ratones así inmunizados y fusión de las células del
bazo con las células de la línea celular X63-Ag
8.653 por medio de polietilenglicol. iii) Selección de las células
hibridomas así obtenidas con vista a que en las células hibridomas
seleccionadas en exceso ("sobrenadantes") se encuentren
anticuerpos que se conecten a las células de ratón A20J y/o L929 que
expresen el CD28 humano.
En tanto read-out se
empleó la coloración de una mezcla de células tumorales de ratón
L929 transferidas y no transferidas de CD28. La figura 2 muestra
que los anticuerpos monoclonales CMY-2 aislados de
este modo diferencian por medio de la intensidad de la
fluorescencia las células transferidas de las no transferidas. La
detección sistemática diferencial por screen de anticuerpos frente a
CD28 humano tuvo lugar del modo que a continuación se expone. Se
tomó 50 \mul de cada excedente (o "sobrenadante") de los
hibridomas celulares cultivados y se incubaron con una mezcla de
células L929 y transfectantes L929-CD28 durante 15
minutos. Tras el lavado las células se colorearon con
DaMIg-PE. La parte A muestra el control negativo.
Las células solamente se incubaron con DaMIg-PE. La
parte B muestra la coloración con un excedente que era ligeramente
positivo pero que no mostraba diferencia alguna en ambas células.
La parte C muestra las células coloreadas con un excedente de
CMY-2.
En experimentos que no se exponen se colorearon
células sanguíneas humanas periféricas con el CMY-2
nuevamente aislado y el anticuerpo 9.3 específico CD28
"clásico". En la subpopulación de células sanguíneas humanas se
detectó una figura expresiva idéntica.
Resumidamente dicho mostraron los experimentos
que el CMY-2 es un anticuerpo humano específico
CD28.
El CMY-2, con linfocitos T
humanos de sangre periférica enriquecidos a un 80% aproximadamente,
se examinó en cuanto a la actividad clásica coestimulante y a la
actividad "directamente" estimulante. La proliferación de
células T se midió con la incorporación de timidina ^{3}H entre
los días segundo y tercero del cultivo. Se obtuvieron los
siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
A modo de explicación: el
anti-CD3 tiene el cometido de estimular el receptor
celular T (CD3 es parte del complejo TCR). CMY-2 se
empleó en forma de un excedente de cultivo no lavado (50% del
volumen final). Según muestra la experiencia la concentración
efectiva mAk que cabe esperar a este respecto se encuentra por
debajo del óptimo con vistas a una activación directa, sin embargo
es suficiente para la coestimulación. El experimento muestra que el
CMY-2 cuenta con propiedades directamente
activantes.
Las células hibridomas que producen
CMY-2 se han depuesto en la DSMZ, Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (sita en Mascheroder Weg
1b, D-38124 Braunschweig) con el número DSM ACC2353
(20.05.1998).
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 3 muestra al respuesta proliferativa
de células de ganglios linfáticos no divididos de rata en el
anticuerpo monoclonal específico de CD28 "directamente"
estimulante (JJ316) y la no aparición de semejante respuesta al
emplearse un anticuerpo monoclonal específico de CD28 "clásico"
(JJ319). Las células se cultivaron durante dos días en 0,2 ml de
medio (RPMI 1640, puede obtenerse en GIBCO/BRL, contiene 5% FCS
[fetal calf serum])con y sin los aditamentos indicados en una
densidad de un millón de células por ml. en incubadora sometida a
gas. La actividad proliferativa se determinó por medio de la
incorporación de timidina radioactivamente marcada (1
\muCi/procedimiento para 16 horas, 1Ci = 37GBq, determinación con
detector \beta).
Al contrario que en el caso de los resultados
publicados (Siefken et al., Cellular Immunology, 1997, 176:
59-65) muestran estos resultados que para la
activación de las células T por medio anticuerpos monoclonales
específicos de CD28 directamente activantes no es necesario enlazar
a estos en red artificialmente por medio de un segundo anticuerpo.
Antes bien es suficiente la presencia de células no T de órganos
linfoides, concretamente los linfocitos B y las llamadas células
accesorias, a fin de hacer posible la activación directa por medio
de anticuerpos monoclonales específicos de CD28 solubles.
Probablemente tiene esto lugar por la conexión de los anticuerpos
monoclonales a los llamados receptores Fc de estas células no T.
Este resultado es un requisito importante para el empleo
terapéutico "directo" de anticuerpos monoclonales específicos
de CD28 estimulantes por cuanto un enlace en red artificial con
anticuerpos de anti-inmunglobulina en el organismo
íntegro no es practicable.
Los anticuerpos monoclonales específicos de CD28
"directamente" activantes tienen por consecuencia un aumento
de la cantidad de células T CD4 en el organismo intacto. La figura 4
muestra esto en relación a los ganglios linfáticos de la rata que
diariamente recibió 0,1 mg. del anticuerpo monoclonal específico
"directamente" estimulante de CD28 (JJ316) o el anticuerpo
monoclonal "clásico" específico de CD28(JJ3l9). Con el
anticuerpo monoclonal directamente activante según la invención
específico del CD28 humano y su aptitud de estimular la
proliferación de linfocitos T se consiguen unos efectos
completamente análogos. En el caso presente la cantidad de células
T CD4 se encuentra aumentada sólo de un modo transitorio; esto se
debe a que los animales sanos fueron tratados con cantidades de
células T CD4 normales. Las células "excedentes" por causa de
la estimulación de la proliferación se eliminan por medio de
mecanismos homeostáticos.
Los resultados precedentes explicados
pormenorizadamente muestran que la activación de los linfocitos T
tiene efectivamente lugar y ello, a saber sin necesidad de otras
substancias o principios activos.
\vskip1.000000\baselineskip
En los ensayos que se refieren en adelante, en
lugar de los anticuerpos monoclonales descritos en el ejemplo 1 se
emplea el clon de anticuerpo ANC28.1/5D10 de la empresa Ancell
Corporation (EE.UU.), comercializados por la empresa ALEXIS
Deutschland GmbH (Giessener Str. 12, D-35305
Grünberg). De estos anticuerpos es conocido que en las células CD28
positivas inducen IL-2. En todo caso hasta el
presente no se ha descrito una actividad de este anticuerpo que sea
inductora de la proliferación. Este anticuerpo se denominará en
adelante brevemente "aCD28". En los siguientes ensayos se
empleará con fines comparativos un anticuerpo monoclonal que no
cuenta con la propiedad de estimular "directamente", a saber,
el CD28.2.
Los ensayos, siempre que no se indique lo
contrario, se realizaron en PBL humano o PBL de monos. Este enfoque
de cultivo celular es en cierto sentido análogo a la situación dada
en el organismo íntegro ya que los anticuerpos estimulantes, según
se prescribe ello en la terapia, se añaden en forma soluble.
En todos los experimentos relativos a la
proliferación se llevo a cabo la medición por medio de un pulso de
1 \muCi 3H-timidina durante 16 horas entre los
días tercero y cuarto; detección por medio de detector \beta.
Siempre que no se indique lo contrario se
cultivaron las células en 0,2 ml de medio (RPMI 1640, puede
obtenerse en GIBCO/BRL; contiene el 5% de suero AB humano) a una
densidad de un millón de células por ml. en incubadora sometida a
gas.
\vskip1.000000\baselineskip
En la figura 5 se representan los ensayos
respecto de la medida de la activación de la proliferación de las
células T CD4. La comprobación tuvo lugar por medio de
citofotometría de flujo (FACS, acrónimo de Facial Action Coding
System) el cuarto día tras la estimulación de las células in
vitro. La figura 10a muestra los llamados "dotplots", a lo
cual por un gate (R2) se definen las células T CD4 (expresan
CD3 y CD4). En la figura 10b se representa un histograma de la
coloración de estas células T CD4 con un anticuerpo monoclonal
frente al receptor de transferrina (CD71). La expresión de este
receptor de superficies es característica de las células en
proliferación. Se reconoce que en una gran parte, a saber, >90%
de los linfocitos T CD4+, la proliferación fue (directamente)
inducida por efectos de aCD28. Los exámenes tuvieron lugar con 5
\mug/ml. aCD28.
En la figura 6 se muestran las representaciones
correspondientes, si bien sin estimulación, en tanto controles
negativos.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 7 muestra que la proliferación de PBMC
no divididas de donantes humanos no infectados medida en
incorporación de timidina marcada 3H es más intensa por efecto de
aCD28 que por efecto de IL-2. Esto muestra que se
activan más células por medio de aCD28 que en la terapia en
vivo con HAART y IL-2 según el estado técnico
del presente. El cultivo tuvo lugar en presencia de 5 \mug/ml
aCD28 o bien 20 I.U./ml IL-2 en placas de probeta
96-well.
Por lo demás es importante el que
IL-2 preferentemente estimulan la proliferación de
los linfocitos T CD8 mientras que por medio de aCD28 se estimulan
especialmente las células T CD4. Esto es algo que se hace notorio
con los datos de la tabla I: las PBMC de un paciente infectado con
VIH se estimularon tres o diez días con IL-2 o bien
con aCD28. Por medio de IL-2, no por medio de aCD28,
tuvo lugar un desplazamiento considerable a favor de las células T
CD8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 8A muestra el efecto activante de
aCD28 respecto de al proliferación de PBMC de personas infectadas
con VIH-1; la figura 8B correspondientemente de PBMC
de monos rhesus infectados con SIV (virus de inmunodeficiencia
simia). Se empleó una cantidad de 5 \mug/ml de aCD28. En todos los
casos pudo inducirse una intensa proliferación que, en el caso de
la infección intensa con VIH, no obstante, fue la más inferior. Cabe
suponer que esto se relaciona con la inducción intensa paralela de
la multiplicación de virus y, por ende, la correspondiente
destrucción de células T, lo cual se evita en la terapia relativa a
la invención junto con el suministro conjunto de los principios
activos HAART (véase también el ejemplo 2.6a y la figura 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Los PBLs de una persona infectada con
VIH-l no fueron tratados solamente con los
principios activos de HAART (cidovudina + didanosina + saquinavir;
0,l\muM), solamente con aCD28 (5 \mug/ml) o con ambos. Tras seis
días se midió la proliferación.
En la figura 9, en la que se ilustran los
resultados, se reconoce que la inducción de la proliferación por
medio de aCD28 queda sin afectar en presencia de HAART.
\vskip1.000000\baselineskip
Las PBMC de un paciente infectado con
VIH-l se simularon como se ha descrito
anteriormente. La proliferación se medió del tercer al cuarto día.
Como en el caso de los pacientes infectados se ha observado entre
tanto, IL-2 induce una proliferación más intensa
que CD28, la cual, en todo caso, afecta principalmente a las células
T CD8 sin VIH (véase la tabla I). Esto no queda afectado por HAART,
mientras que las aCD28 inducidas se mejoran por medio de HAART
(véase la figura 10)
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la replicación de virus en PBMC de
personas infectadas con VIH-l. En intervalos
semanales se examinó el excedente libre por medio de ELISA respecto
de la presencia de p24Gag (proteína vírica). Se empleó HAART como
en el ejemplo 2.5. "+" significa aquí y en adelante la
participación de los componentes de principio activo
correspondientes, "-" la ausencia. En la figura 11 se reconoce
que al simulación aCD28 también induce una producción de virus
intensísima. En el caso de aplicarse simultáneamente HAART la
producción de virus queda sin embargo completamente suprimida. PHA
es fitohemaglutinina a modo de comparación.
\vskip1.000000\baselineskip
En la figura 12 se representan los resultados de
una serie de ensayos en los que unas PBMC de una persona infectada
con VIH-l fue tratada hasta el día sexto de acuerdo
a la tabla. Del día sexto al noveno tuvo lugar un tratamiento HAART
estricto (sin más) seguido de un tratamiento con aCD28 (también
llamado ComMCD28) del día noveno al día décimo cuarto. Los
resultados confirman los del ejemplo 2.7, pues según esto ni
siquiera tras una nueva simulación de cultivos de células de PBMC
infectado con VIH se observa producción alguna de virus tras la
conclusión de la terapia HAART.
\vskip1.000000\baselineskip
Las PBMC aisladas de una persona infectada con
VIH-l se cultivaron según la tabla y se trataron
in vitro (principios activos y cantidad de principios
activos como en el ejemplo 2.5). El undécimo día del cultivo se
llevó a cabo una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de DNA
específica de VIH-l:
a) externo; primer (partidor):
-
2
b) nested; primer (partidor):
-
3
En la figura 13 al respecto se reconoce que el
ADN de VIH proviral en tratamiento combinado con HAART y los
anticuerpos monoclonales empleados de acuerdo a la invención no
pueden ya detectarse mientras que en los otros casos de la tabla
siempre se encontraba presente el ADN de VIH proviral. Esto
demuestra en un sistema de comprobaciones muy semejante a la
situación del organismo íntegro la destrucción efectiva incluso del
conjunto o reserva de estructuras provirales gracias a la
invención.
Claims (4)
1. Composición farmacéutica en las forma de
presentación de preparado o paquete de preparado con dosis
farmacéuticamente activas de los siguientes componentes de
principio activo:
- a)
- un anticuerpo monoclonal específico respecto del CD28 humano que activa los linfocitos T humanos de varios a todos los subgrupos sin ocupación de un receptor antigénico de linfocitos T que es, por ende, antigénicamente inespecífico,
- b)
- un inhibidor de la transcriptasa inversa y
- c)
- un inhibidor de la proteasa.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación número 1 en la cual los componentes de principio
activo b) y c) se seleccionan, dosifican y presentan ya listos para
el suministro según la terapia HAART.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación número 1 o 2
en la cual
- \quad
- el componentes de principio activo b) es un análogo de nucleósido de pirimidina, preferentemente 3'-azido-3' dexositimidina y/o
- \quad
- el componente de principio activo c) es 3TC.
4. Composición farmacéutica según las
reivindicaciones del número 1 al 4, en la cual los componentes de
principio activo b) y c) forman parte de un primer componente de
paquete y el componente de principio activo a) forma parte de un
segundo componente de paquete.
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