ES2327611T3 - Empleo de antucuerpos monoclonales especificos de cd28 para estimular celulas sanguineas sin cd28. - Google Patents
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Abstract
Empleo de anticuerpos monoclonales específicos de CD28 y linfocitos T de varios subgrupos a todos los subgrupos sin ocupación de un receptor de antígeno de linfocitos T y, por ende, activación antigénica específica para la producción de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades en que se dé una reducción de la cantidad de células sanguíneas, que no porten CD28, a lo cual la enfermedad ha de adscribirse al grupo conformado por "granulocitopenia, especialmente neutropenia y monocitopenia, trombocitopenia, anemias aplásticas, deficiencia de la médula ósea con aplasia/hipoplasia de la médula ósea misma, pancitopenia, anemia de Fanconi, anemias aplásticas adquiridas, especialmente anemia aplástica idiopática y anemias aplásticas secundarias así como anemia, trombocitopenia y/o granulocitopenia en casos de leucemia aguda".
Description
Empleo de anticuerpos monoclonales específicos
de CD28 para estimular células sanguíneas sin CD28.
La invención es relativa a un empleo de
anticuerpos monoclonales específicos de CD28 que activan los
linfocitos T sin ocupación de un receptor de antígeno de linfocitos
T y, por ende, de modo antigen-inespecífico.
Existen diversas enfermedades propias de las
especies tanto humana como animales de sangre caliente en las
cuales la cantidad de la diversas células sanguíneas es inferior a
la que se tiene en estado de salud.
Uno de estos grupos de enfermedades se llama
granulocitopenia (neutropenia y monocitopenia) y afecta a los
granulocitos. En tanto causas de esta enfermedad se consideran: i)
una granulocitopoyesis reducida (perturbación aplástica) causada
por un daño de la médula ósea debido, por ejemplo, a 25 agentes
químicos como el benzol, medicamentos como los citostáticos,
inmunosupresores, AZT y/o cloramfenicol (toxicidad relativa a las
dosis) o como la fenilbutazona, compuestos de oro, raras veces
cloramfenicol (independientemente de la dosis por causa de
reacciones farmacogenéticas), rayos o autoanticuerpos nocivos a las
células madre (en algunos casos de inmunoneutropenia), debido a
infiltración en la médula ósea (leucemias, carcinomas, linfomas
malignos) y/o debido a osteomielosclerosis, ii) perturbaciones en
la maduración de la granulocitopoyesis, por ejemplo debido a
perturbaciones congenitales de la maduración o mielopoyesis,
síndrome de Kostmann (detención de la maduración de la mielopoyesis
en el estadio de los promielocitos), neutropenia cíclica, síndrome
de mielodisplasia, carencia de vitamina B12 o de ácido fólico con
granulopoyesis, eritropoyesis y/o trombopoyesis inefectiva. Las
terapias convencionales abarcan el suministro de factores del
crecimiento de la granulocitopoyesis (por ejemplo
G-CSF y GM-CSF).
Un segundo grupo se denomina trombocitopenia. En
tanto causas cabe considerar: i) reducida trombocitopoyesis en la
médula ósea (perturbación aplástica o bien una cantidad reducida de
megacariocitos en la médula ósea) por causa de un daño en la médula
ósea debido, por ejemplo, a agentes químicos como el benzol,
medicamentos como es el caso de los citostáticos y/o los
inmunosupresores, rayos, infecciones como por ejemplo VIH o
autoanticuerpos nocivos a los megacariocitos (en algunos casos de
inmunotrombocitopenia) por causa de infiltración en la médula ósea
(leucemias, carcinomas; linfomas malignos) y/o por causa de
osteomielosclerosis, ii) perturbaciones de la maduración de los
megacariocitos (megacariocitos en la médula ósea normal en aumento)
con trombopoyesis, eritropoyesis y/o granulopoyesis inefectiva con
megaloblastos, metamielocitos gigantes y demás debido a carencia de
vitamina B12 o ácido fólico. Las terapias convencionales abarcan la
supresión de los medicamentos inseguros, substitución de
trombocitos (en casos de perturbaciones de la producción en la
médula ósea: trombocitopoyetina) así como MGDF (Megakaryocyte
Growth and Development Factor, estimulación de la proliferación y
maduración de los megacariocitos).
Un tercer grupo está conformado por las anemias
aplásticas o bien la deficiencia de la médula ósea con
aplasia/hipoplasia de médula ósea y pancitopenia (enfermedad de las
células madre). Una anemia aplástica congénita es, por ejemplo, la
anemia Fanconi. Más frecuentes son las anemias aplásticas adquiridas
como es el caso de la anemia idiopática aplástica (cuya causa es
desconocida) y anemias aplásticas secundarias debidas al efecto de
los medicamentos, substancias tóxicas, radiaciones con ionización e
infecciones víricas (véase arriba). Los enfoques terapéuticos de
apoyo abarcan la substitución de eritrocitos/trombocitos. Los
enfoques terapéuticos causales abarcan el transplante de médula
ósea o el transplante de células madre, terapias inmunosupresivas
(por ejemplo ATG) y otras medidas terapéuticas como, por ejemplo,
el suministro de citocinas (GM-CSF,
G-CSF, MGDF, y/o trombocitopoyetina).
Finalmente cabe mencionar la leucemia aguda, que
frecuentemente se presenta en tanto anemia, trombocitopenia y/o
granulocitopenia. Las terapias abarcan la substitución de los
eritrocitos y los trombocitos en la medida necesaria o bien la
estimulación de la granulopoyesis a través de G-CSF
y/o GM-CSF, la quimioterapia y los transplantes de
médula óseas y/o células madre.
Las enfermedades anteriormente mencionadas
comparten un aspecto común, a saber, el que las células sanguíneas
afectadas son precisamente aquellas que no llevan ningún CD28 en su
superficie.
CD28 se denomina una molécula expresada de la
membrana celular de linfocitos T de procedencia humana o animal con
una secuencia conocida de aminoácidos a la cual, en el marco del
"Human Leukocyte Typing Workshops" internacional, se le ha
asignado la abreviatura de CD28. Con la activación de los linfocitos
T la proliferación de la actividad metabólica, el aumento del
volumen de las células, la síntesis de moléculas inmunológicamente
importantes y el que tenga lugar la división celular
(proliferación) de los linfocitos T se indica un estímulo exterior.
Estos procesos, por ejemplo, se inducen por medio de la ocupación de
la molécula CD28 en células T por medio de anticuerpos monoclonales
especiales específicos de CD28. La activación de los linfocitos T
con los epifenómenos descritos es un aspecto de la inmunoreacción
fisiológica que, en todo caso, puede derivar en casos patológicos
en descontrol (enfermedades linfoproliferativas) o ser insuficientes
(inmunodeficiencia).
Para comprender la invención es primeramente
importante considerar el trasfondo tecnológico que a continuación
se ilustra. La activación de las células T en reposo con vistas a la
proliferación y la diferenciación funcional requiere, en primer
lugar, la ocupación de estructuras superficiales dobles, los
llamados receptores: 1. primero, del receptor del antígeno, que
posee una especificidad diferente de célula a célula y que es
necesaria para el reconocimiento de antígenos como, por ejemplo,
productos de disociación virales; así como la molécula CD28
expresada del mismo modo en todas las células T en reposo, la cual
se une de un modo natural a ligandos sobre la superficie de otras
células del sistema inmunológico. Cabe mencionar a este respecto la
expresión de "coestimulación" relativa a la inmunoreacción
específica de antígeno por causa de CD28. En el cultivo celular
pueden reproducirse estos procesos por ocupación del receptor de
antígeno así como de la molécula CD28 con anticuerpos monoclonales
apropiados. En el sistema clásico de la coestimulación ni la
ocupación del receptor de antígenos ni de la molécula CD28 sólo
tienen por consecuencia la proliferación celular T, no obstante la
ocupación de ambos receptores es efectiva. Esto mismo se ha
observado en células T tanto humanas como de ratones y ratas.
Una activación "directa", es decir, una
activación independiente de la ocupación del receptor de antígeno
de linfocitos T en reposo a través de anticuerpos monoclonales
específicos de CD28, se ha observado en los siguientes sistemas: en
la nota bibliográfica de Brinkmann et al., J. Immunology,
1996, 156: 4100-4106 se mostró que una muy reducida
porción (del 5%) de los linfocitos T humanos portadores de los
marcadores superficiales CD45 RO típicos de los linfocitos T en
reposo se activa por medio de los anticuerpos monoclonales
"clásicos" específicos de CD28 9.3 en caso de adición del
factor de crecimiento interleucina 2 (IL-2) sin
ocupación del receptor de antígeno. En el trabajo de Siefken et
al., Cellular Immunology, 1997, 176: 59-65, se
mostró que por vías convencionales, es decir, por medio de
inmunizar a ratones con células T humanas, los anticuerpos
monoclonales específicos de CD28 producidos pueden activar en
cultivos celulares un subgrupo de células T humanas sin ocupación
de receptor de antígeno con vistas a la proliferación siempre que el
CD28 sea ocupado por estos anticuerpos monoclonales y las moléculas
monoclonales ligadas celularmente se enlacen además conformando una
red entre sí por la acción de otros anticuerpos. En ambos casos los
anticuerpos descritos primera y fundamentalmente no son apropiados
para el empleo en la medicina humana, ya que se trata de anticuerpos
de ratón. Por lo demás ambos anticuerpos comparten la
característica de que tan sólo una porción muy reducida de las
células T puede activarse "directamente".
En el trabajo de Tacke et al., Eur. J.
Immunol., 1997, 27:239-247 se describen dos tipos de
anticuerpos monoclonales específicos de CD28 de diferentes
propiedades funcionales: "anticuerpos clásicos" que coestimulan
la activación de las células T en reposo solamente con la ocupación
del receptor de antígeno simultánea; y "directos", los cuales
pueden activar la proliferación sin del receptor de antígeno de
linfocitos T de todas las clases in vitro y en animales de
laboratorio. Ambos anticuerpos monoclonales conocidos hasta este
punto se relacionan a la inmunización con células en las que se
expresa el CD28 de ratos y pueden obtenerse en diferentes
selecciones de acuerdo a sendas propiedades descritas.
De la nota bibliográfica WO 98/54225, a la cual
se hace referencia expresa y en toda su extensión de modo que se
eviten las repeticiones, se conocen los anticuerpos monoclonales
"directos" específicos de CD-28 así como su
empleo destinado al tratamiento de enfermedades en las que tenga
lugar una disminución patológica de la cantidad de células T CD4 o
a la modulación de inmunoreacciones en las vacunas. En los casos de
estas aplicaciones se consideran regularmente células que portan el
CD28 en su superficie (células T) y que, consecuentemente, se
estimulan inmediatamente por la acción de los anticuerpos
monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales
anti-CD28 que activan los linfocitos T
inespecíficamente son conocidos en la bibliografía del European
Journal of Immunology, 27(1):239-247 (1997),
European Journal of Immunology, 30(3):424-428
(2000) y Cellular Immunology 176(1):59-65
(1997). De la nota bibliográfica Clinical and Experimental
Immunology 85(3):424-428 (1991) es conocido
el hecho de que un paciente con trombocitopenia mostraba un déficit
de CD-28.
La invención se relaciona al problema técnico de
haber de indicarse una composición farmacológica por medio de la
cual se estimule la formación y/o activación de células sanguíneas
que no sean portadoras de CD 28.
Respecto de la solución de este problema técnico
la invención indica el empleo de acuerdo a la única reivindicación
de patente.
En tanto estimulación se denomina el incremento
de la actividad metabólica, el aumento del tamaño de las células,
la síntesis de los factores y/o el hecho de que la proliferación
tenga lugar.
Análogas son substancias que no sean anticuerpos
monoclonales y que, no obstante, desempeñen las funciones
ilustradas en el marco de la invención. Ejemplos a este respecto son
las proteínas altamente específicas "cortadas" o RNA, DNA o
PNA (por ejemplo, aptámeros, especialmente aptámeros estabilizados
frente a encimas disociadoras de ácido nucleico o bien RNA, DNA o
PNA). El criterio común es, en todo caso, la especificidad CD28 de
efecto "directamente" estimulante sobre las células sanguíneas
portadoras de CD28.
La invención se base en el sorprendente
descubrimiento de que los anticuerpos monoclonales específicos de
CD28 también surten el efecto de la proliferación, la formación o
activación de células sanguíneas que no porten ningún CD28; se
trata de células sanguíneas, pues, en las que el acoplamiento de los
anticuerpos no parece posible. Sin el deseo de establecer un
compromiso con una teoría concreta se sospecha que el sorprendente
efecto se relaciona con el hecho de que por medio de la estimulación
"directa" (es decir, sin coestimulante) de las células
portadoras de CD28, especialmente las células T, estas células
producen y emiten por su cuenta factores que a su vez estimulan las
células sanguíneas no portadoras de CD28. Por lo tanto se sospecha
la existencia de un proceso indirecto.
La composición farmacológica para el suministro
a personas muestran los anticuerpos monoclonales aplicados según la
invención, preferentemente componentes constantes humanos. Los
componentes constantes de un anticuerpo son sectores sin
importancia respecto del reconocimiento del antígeno al contrario
que en el caso de los sectores variables que definen la
especificidad antígena de un anticuerpo. Los componentes constantes
se diferencian, no obstante, en los anticuerpos de diversos tipos
y, por ende, también de animales y personas. Los sectores
constantes de un anticuerpo pueden corresponderse, por ejemplo, a
los de anticuerpos de un organismo que haya de ser tratado con
anticuerpos por motivos de compatibilidad. Los anticuerpos
monoclonales aplicados a personas según la invención son, por
tanto, por una parte humanamente compatibles y ello, a saber, sea
tanto per se o por humanización, mientras que por otra parte pueden
servir para el tratamiento, puesto que los anticuerpos puede
encontrarse específicamente configurados frete al humano CD28 y
puesto que la activación de los linfocitos T es amplia. Con la
adaptación correspondiente o con la producción de un derivado los
anticuerpos monoclonales aplicados según la invención pueden
aplicarse también a mamíferos no humanos. A este respecto cabe
mencionar que los anticuerpos monoclonales no humanizados bien
pueden ser humano-compatibles.
Humano-compatibles son los anticuerpos monoclonales
cuando no producen ninguna inmunoreacción indeseada durante un
espacio determinado de tiempo, como, por ejemplo, es ello
demostrable por la determinación de anticuerpos de
anti-inmunoglobulina cuando estos impidan su
empleo.
Los derivados de anticuerpos monoclonales se
entienden como modificaciones de anticuerpos monoclonales que se
hayan producido por una manipulación convencional bioquímica o
técnico-genética. Este caso se da, por ejemplo, en
la humanización de un anticuerpo monoclonal de ratón por
substitución parcial de componentes estructurales (constantes) del
anticuerpo de ratón por otros humanos.
En detalle los anticuerpos monoclonales
aplicados según la invención pueden obtenerse por medio de: A)
creación de células de hibridomas aptas para la producción de CD28
humano monoclonal específicos de anticuerpos de animales en vías de
una inmunización con líneas de células tumorales no T en las cuales
se encuentre expresado el CD28 humano o con CD28 recombinantemente
expresado; B) en su caso, humanización de los anticuerpos de
animales obtenibles según el nivel A de las células hibridomas por
medio de substitución bioquímica o técnico-genética
de componentes constantes de anticuerpos de animales por componentes
constantes análogos de un anticuerpo humano o bien por substitución
de los componentes de los genes correspondientes de células
hibridomas; C) secreción de los anticuerpos en cultivos de células
hibridomas y aislamiento de los anticuerpos resultantes o
producción de anticuerpos por medio de inyección de las células
hibridomas en animales, por ejemplo, en ratones, y aislamiento de
los anticuerpos de los líquidos corporales de los animales. -Un
aspecto importante de los anticuerpos monoclonales aplicados según
la invención consiste, en comparación con las siguientes notas
bibliográficas de Brinkmann et al., J. Immunology, 1996, 156:
4100-4106, y Siefken et al., Cellular
Immunology, 1997, 176: 59-65, en el descubrimiento
de que los anticuerpos monoclonales se dan por inmunización con
células tumorales no T en las cuales se encuentra expresado el CD28
humano en lugar de inmunización con líneas celulares T. Pues de
este modo pueden obtenerse anticuerpos monoclonales que no solamente
son específicos frente al CD28 (humano) sino que también tienen el
efecto de una activación "directa" en una amplitud
considerable. En particular los anticuerpos monoclonales aplicados
según la invención pueden presentar la especificidad relativa a
determinantes, por ejemplo, de la molécula humana CD28, que son
difícilmente accesibles a la molécula CD28 naturalmente expresada y
cuya ocupación por los novedosos anticuerpos monoclonales coopera a
la activación de las células T y, finalmente, a la activación de
células sanguíneas no portadoras de CD28. Por determinante ha de
entenderse el sector de una molécula que queda definido por la
especificidad enlazante de uno o varios anticuerpos.
El modo básico de proceder en la producción de
células hibridomas, la humanización así como en la producción de
anticuerpos monoclonales a partir de células hibridomas
(humanizadas), es bien conocido por el personal especializado y no
requiere ser ilustrado aquí. En principio pueden emplearse todas las
líneas celulares conocidas y libremente disponibles especiales para
la producción de células hibridomas. Para la producción de los
anticuerpos monoclonales se tienen en cuenta por principio general,
además del método en adelante descrito, la expresión recombinada
con la que el especialista está familiarizado en detalle.
Concretamente es preferible que los anticuerpos
de animales específicos para la producción de monoclonales humanos
CD28 contengan células hibridomas por medio de a) creación de un
plásmido por medio de inserción de ADN complementario de CD28
humano en el vector
pH\betaAPr-l-neo tras escisión del
fragmento SalI-HindIII y creación de protoplastos
de escherichia coli (MC1061) que porten el plásmido; b)
fusión de los protoplastos con células tumorales de ratón A2OJ y/o
L929 por medio de polietilenglicol; c) cultivo de las líneas
transferidas contenidas en el nivel b; d) screenen de las células
de ratón transferidas A2OJ y/o L929 a la expresión del CD28 humano
y selección de células de ratón A20J y/o L929 que expresen el CD28
humano; e) inmunización de ratones BALB/c con las células de ratón
A2OJ y/o L929 que expresen el CD28 humano (por ejemplo por medio de
seis inyecciones intraperitoneales y seguidamente una intravenosa);
f) toma de células del bazo de los ratones así inmunizados y fusión
de las células del bazo con células ("nonproducer", es decir,
que no produzcan anticuerpos) de la línea de meta
X63-Ag 8.653 por medio de polietilenglicol, g)
selección de células hibridomas así obtenidas con el cometido de
que en el excedente de las células hibridomas seleccionadas se
encuentren anticuerpos que se enlacen a las células de ratón que
expresen el CD28 humano y h) cultivo/subclonación de las células
hibridomas seleccionadas obtenidas en el nivel g. En el lugar de
los niveles de a) a d) pueden emplearse naturalmente otros sistemas
de expresión con los que el especialista se encuentre familiarizado.
El ADN complementario de CD28 humano puede adquirirse libremente
por medio del Dr. A. Aruffo y el Dr. B. Seed, que han publicado la
secuencia y también la siguiente nota bibliográfica: Aruffo, A., and
Seed, B, 1987, "Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high
efficiency COS cell expression system", Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84:8573. De esta nota bibliográfica puede tomarse en detalle,
pues, el ADN complementario de CD28 humano. Por lo demás todos los
especialistas, sin problema alguno y por medio de la secuencia
depuesta en el banco de genes y de la reacción de polimerización en
cadena, pueden producir de un modo muy sencillo y rápido un clon de
ADN complementario de CD28 humano. El vector
pH\betaAPr-l-neo puede adquirirse
libremente por medio de los autores de la posición bibliográfica
Gunning, P, et al., 1987, "A human
\beta-actin expression vector system directs
high-level accumulation of antisense
transcripts", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:4831. "neo" no
significa sino resistencia a la neomicina. El nivel c) se lleva a
cabo pues en ausencia de la neomicina. Las líneas celulares y/o los
microorganismos anteriormente mencionados se encuentran libremente
disponibles y pueden adquirirse comercialmente en la American Type
Culture Collection (ATCC). En relación a la escherichia coli
(MC1061) hacemos referencia complementariamente a la posición
bibliográfica de Meissner, P.S., et al., 1987,
"Bacteriophage gamma cloning system for the construction of
directional cDNA libraries", Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
84:4171.
La presentación galénica de los anticuerpos
monoclonales de la invención para las diversas formas de suministro
es bien conocida por los especialistas y no necesita ser ilustrada
aquí con más detalle. Especialmente, además de los componentes
activos relativos a la invención, pueden contenerse otras
substancias activas y/o otras substancias prácticas o necesarias
con vista a la presentación galénica. Ha de comprenderse que una
composición farmacológica según la invención ha de contener los
anticuerpos en una dosis terapéuticamente efectiva. Una dosis
terapéutica activa puede determinarse respecto de los diversos
organismos determinando la dosis misma que tenga por consecuencia
un aumento estadísticamente significante de la cantidad de células
sanguíneas no portadoras de CD28 en comparación con el estado
anterior al del suministro de la composición.
El invento incluye un método para la producción
de un medicamento destinado a la curación de las enfermedades
inicialmente mencionadas empleándose los anticuerpos monoclonales
relativos a la invención.
En adelante se ilustra la invención con más
detalle partiendo de unos ejemplos de ejecución.
Los experimentos representados o bien los
ejemplos relativos a los efectos de los anticuerpos monoclonales
"directos" específicos de CD28 se llevaron a cabo en el modelo
de la rata, respecto de lo cual en tanto ejemplo de un anticuerpo
específico de CD28 "clásico" se aplicó el anticuerpo
monoclonale JJ319 y en tanto ejemplo de uno "directamente"
activante se aplicó el anticuerpo monoclonal JJ316. Ambos
anticuerpos se encuentran libremente disponibles y pueden
adquirirse comercialmente en la empresa Pharmingen, San Diego, USA.
Los anticuerpos JJ319 y JJ316 puede adquirirse por lo demás según
la indicación bibliográfica de M. Tacke et al., Immunology,
1995, 154: 5121-5127, a la cual se hace aquí expresa
referencia también en relación a ciertos detalles de la producción
de células hibridomas y anticuerpos monoclonales.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se ilustra con más detalle la
producción del anticuerpo monoclonal empleado según la invención,
es decir, el humano específico de CD28. Estos se denominarán en
adelante también CMY-2. El CD28 humano procedente
de una biblioteca de ADN complementario fue expresado en líneas de
células A20J y/o L929 recombinantemente. Primeramente se creó a
este respecto un plásmido por medio de inserción de ADN
complementario de CD28 humano en el vector
pH\betaAPr-l-neo tras escisión del
fragmento SalI-HindIII. Partiendo de la
escherichia coli (MC1061) se produjeron protoplastos
portadores del plásmido. Tuvo después lugar la fusión de los
protoplastos con células tumorales A2OJ y/o L929 por medio de
polietilenglicol. Las células transferidas así obtenidas se
cultivaron del modo habitual. Seguidamente tuvo lugar una detección
sistemática por screen de las células transferidas de ratón A20J
y/o L929 a la expresión del CD28 humano y la selección del las
células de ratón A2OJ y/o L929 con expresión del CD28 humano.
La comprobación de que la expresión tuvo éxito
se llevó a cabo por medio de un anticuerpo convencional,
comercialmente adquirible, con marca fluorescente y especificidad
relativa al CD28 humano (9.3-ficoeritrina). En tanto
control negativo se colorearon células no transferidas A20J o bien
L929 con el mismo anticuerpo. Los transferidos
(A2OJ-CD28 y L929-CD28) mostraron
una intensidad fluorescente superior. Puesto que no todas las
células eran CD28-positivas, se subclonaron las
células CD28-positivas y se emplearon para la
inmunización. Como se reconoce en la figura 1, en el desplazamiento
de los cúmulos de puntos hacia arriba en ambos diagramas de la
derecha, reaccionan estas células con los anticuerpos que pueden
comprarse, o sea que expresan el CD28 humano en su superficie.
La línea celular A20J de CD28 humano se empleó
para la inmunización de ratones BALB/c. La fusión celular y la
detección sistemática (por screen) se llevaron a cabo de la
siguiente manera: i) inmunización de ratones BALB/c con las células
de ratón A2OJ expresantes de CD28 humano (seis inyecciones
intraperitoneales y seguidamente una vez intravenosa). ii) Toma de
células del bazo de los ratones así inmunizados y fusión de las
células del bazo con las células de la línea celular
X63-Ag 8.653 por medio de polietilenglicol. iii)
Selección de las células hibridomas así adquiridas con el cometido
de que en el excedente de las células hibridomas seleccionadas se
contengan anticuerpos que se enlacen a las células de ratón A2OJ y/o
L929 que expresen el CD28 humano.
En tanto read-out se
contaba con pigmentación de una mezcla de células tumorales de ratón
L929 con transferencia y sin transferencia de CD28. En la figura 2
se muestra que los anticuerpos monoclonales así aislados
diferenciaban células transferidas y no transferidas
CMY-2 de diferente intensidad fluorescente. La
detección sistemática por screen diferencial relativa a anticuerpos
frente al CD28 humano tuvo lugar de la siguiente manera. Se tomó en
cada caso 50 \mul de excedente de hibridomas celulares cultivados
y se incubaron durante 15 minutos con una mixtura de células L929 y
transfectantes L929-CD28. Tras el lavado se
colorearon las células con DaMIg-PE. La parte A
muestra el control negativo. Las células fueron incubadas sólo con
DaMIg-PE. La parte B muestra la pigmentación con un
excedente que era levemente positivo pero que no mostraba diferencia
alguna en ambas células. La parte C muestra las células coloreadas
con un excedente de CMY-2.
En los experimentos no representados se
colorearon células sanguíneas periféricas humanas con el nuevamente
aislado CMY-2 y el anticuerpo "clásico"
específico de CD28 9.3. Se encontró un modelo de expresión idéntico
en las subpoblaciones de células sanguíneas humanas.
En resumen mostraron los experimentos que el
CMY-2 es un anticuerpo humano específico de
CD28.
El CMY-2 se sometió entonces a
la comprobación relativa a la actividad clásica coestimulante y
"directamente" estimulante con linfocitos T humanos
procedentes de sangre periférica enriquecidos a un 80%. La
proliferación de células T fue medida por medio de la integración
de timidina ^{3}H entre los días segundo y tercero del cultivo.
Se obtuvieron los siguientes resultados.
Coestimulación:
| células no estimuladas | 276 cpm |
| anticuerpos específicos de CD3 | 3111 cpm |
| anticuerpos específicos de CD3 + CMY-2 | 51676 cpm |
\vskip1.000000\baselineskip
Estimulación directa:
| fase sólida anti-mouse Ig | 379 cpm |
| fase sólida anti-mouse Ig-+ control mAk | 258 cpm |
| fase sólida anti-mouse Ig más CMY-2 | 19115 cpm |
\vskip1.000000\baselineskip
Explicación: el anti CD3 se ocupa de la
estimulación del receptor celular T (CD3 es una parte del complejo
TCR). El CMY-2 se empleó en forma de un excedente de
cultivo no purificado (50º% del volumen final). Según la
experiencia la concentración efectiva de mAk que cabe esperar se
encuentra por debajo de óptimo con vistas a una activación directa,
no obstante es suficiente para la coestimulación. El experimento
muestra que el CMY-2 posee propiedades directamente
activantes.
Las células hibridomas relativas a la invención
y que producen CMY-2 se han depuesto en la DSMZ,
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
empresa sita en Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, con el número DSM ACC2353 (20.05.1998).
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento con mitógeno y no con el
anti-CD28 MAK convencional tiene por consecuencia
una rápida reconstitución de la cantidad de células T en ratas con
linfopenia T, lo cual se expone en adelante.
El plan experimental se representa en la figura
3. Las ratas obtenidas por consanguineidad PVG fueron sometidas a
la radiación gamma procedente de una fuente de cesio de tal manera
que el sistema reproductor de sangre, leucocitos incluidos, quedó
destruido. En tanto fuente de células madre generadoras de sangre se
les suministró a los animales células de la médula ósea
consanguínea intravenosamente. En el experimento 1 se les suministró
adicionalmente 5x10^{6} de células T CD4 y en el experimento 2
5x10^{6} de células T (CD4 y CDB) del mismo tronco consanguíneo
PVG.RT7^{b}. Estos animales son idénticos con el tronco
consanguíneo receptor PVG salvo por la molécula de superficie de
leucocitos RT7, de la que expresan el alelo b en lugar del a. Por
medio del MAK marcado por fluorescencia específico de RT7^{b}
pueden identificarse en los animales células T que proceden del
5x10^{6} de células T maduras inyectadas. Estos linfocitos T, que
maduran nuevamente en tanto linfocitos T procedentes de las células
precursoras inmaduras de la médula ósea inyectada en el timo de los
animales receptores, no reaccionan por el contrario con el MAK
marcado por fluorescencia específico de RT7^{b}. La cantidad de
5x10^{6} linfocitos T se corresponde aproximadamente a una
milésima de la cantidad de linfocitos T maduros de una rata adulta,
de modo que nos encontramos ante un modelo de de linfopenia T grave.
Para el aumento en el animal receptor de las células T inyectadas
se aplicó, de acuerdo al esquema de tratamiento mostrado, 1 mg del
mitógeno anti-CD28 MAK JJ316 intravenosamente
durante dos días (día 0 y día 10 en el experimento 1, día 0 y día
13 en el experimento 2). En los momentos indicados se tomo sangre de
los animales a y se determinó la cantidad de los linfocitos T
mediante medición de la cantidad total de leucocitos así como de la
porción de linfocitos T. Por lo demás se diferencia entre los
linfocitos T procedentes de las células T maduras inyectadas
(RT7^{b} positivo) y aquellos otros que se generaron nuevamente en
el timo (RT7^{b} negativo). Estos análisis fueron llevados a cabo
por medio de anticuerpos monoclonales con especificidad relativa a
los marcadores de superficie de células T. La técnica empleada es
la inmunofluorescencia de varios colores junto con la citofotometría
de flujo (análisis "FACS®").
En la figura 4 se representa el experimento 1,
es decir, la reconstitución con células CD4 T maduras. Los
diferentes tratamientos de los animales se han anotado en la abcisa;
cada uno de los animales se simboliza por medio de un punto. Ya tan
sólo nueve días tras el comienzo del experimento se mostró un avance
considerable de la cantidad de linfocitos T en la sangre periférica
del grupo tratado con el mitógeno anti-CD28 MAK
frente a los animales de control, a los que se suministró el
anti-CD28 MAK convencional o solamente una solución
salina tamponada con fosfato (PBS), que se empleó en tanto solución
para el MAK. Este avance se mantuvo hasta el último punto de
medición (día 36). Si se consideran solamente los linfocitos T
procedentes de las células T maduras RT7^{b} positivas CD4, el
efecto terapéutico del mitógeneno anti-CD28 MAK
resulta más dramático en comparación con el grupo de control. La
causa de esto viene a ser que con el avance del tiempo se generan
en el timo nuevas células T RT7^{b} negativas. El origen de estas
células T es independiente de la estimulación de anticuerpos y, en
todo caso no fue afectado por estos.
La figura 5 muestra el experimento 2, es decir,
la reconstitución con células T CD4 y CD8 maduras. De acuerdo al
esquema de la figura 3 se transfirieron 5x10^{6} RT7^{b}
linfocitos T positivos que consisten aproximadamente en 3/4 de
células T CD4 y 1/4 de células T CD8. La cantidad de células T en
sangre fue determinada como se describe en la figura 5. Cada una de
las líneas representa un animal experimental. Los símbolos abiertos
muestran el tratamiento con PBS, los cerrados el realizado con el
mitógeneno anti-CD28 MAK JJ316. Ambos gráficos
muestran el desarrollo de la cantidad de células RT7^{b}
positivas derivadas del inóculo celular T maduro, las dos
inferiores el RT7^{b} negativo originado nuevamente en el timo.
Los resultados muestran un rápido aumento de los linfocitos T
maduros CD4 y CD8 por medio del tratamiento con mitógeno anti CD28
MAK (arriba). La nueva formación de células T (abajo) que
posteriormente tuvo lugar no fue afectada por el tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se muestro que los linfocitos T
que se reprodujeron por medio de la terapia con
anti-CD28 son longevos y funcionan bien.
La figura 6 muestra el plano de ensayos y la
demostración de la proliferación de células T en los nódulos
linfáticos por medio de anti-CD28. El tratamiento de
los animales de ensayo se corresponde primeramente al esquema
ilustrado en la figura 4 del experimento 2. Tras 55 días se
sacrificó a los animales. El análisis de los linfocitos en los
nódulos linfáticos dio por resultado que tras el tratamiento PBS tan
sólo el 6% (3.33 del 47.9%) se derivó del inóculo inyectado al
principio del ensayo de células maduras RT7^{b} positivas; el
resto de las células T CD4 eran nuevas y se formaron en el timo
(RT7^{b} negativo). Por el contrario las células T CD4 RT7^{b}
positivas supusieron en el grupo sometido a terapia el 40%
aproximadamente (22.26 de 56.42%). Los "dot plots"
representados muestran por su parte los resultados del análisis de
citofotometría de flujo descrito en el ejemplo 3. Se emplearon
anticuerpos marcados fluorescentemente frente a CD4 (abcisa) y
RT7^{b} (ordenada). Este resultado muestra que la terapia llevada
a cabo al principio del ensayo (día 0 y día 13) tiene por
consecuencia una repoblación duradera con los linfocitos T
reproducidos por medio de la terapia con anti-CD28.
Los linfocitos T RT7^{b} positivos y RT7^{b} negativos se
separaron entre sí. Siguió después un enriquecimiento de las
células T por medio de una pasada a través de fibra lanosa de nylon.
Así pues las células T RT7^{b} positivas se cargaron con MAK
específico de RT7^{b} en que se enlazaron unas bolitas
paramagnéticas de hierro. Por medio de un imán tuvo lugar entonces
la separación de las células T RT7^{b} positivas y RT7^{b}
negativas. El sistema aquí empleado (y muy extendido en el mundo de
la investigación) de la empresa Miltenyi Biotech (sita en
Bergisch-Gladbach) se llama MACS (Magnetism
Activated Cell Sorting). Las células T RT7^{b} positivas y
RT7^{b} negativas así separadas se sometieron a un análisis
funcional (figuras de 7 a 9).
La Figura 7 muestra la proliferación in
vitro de las células T expandidas terapéuticamente en
vivo. Las células ilustradas en la figura 6, RT7^{b}
positivas aisladas, es decir las células T derivadas del inóculo
originalmente maduro así como las células T RT7^{b} negativas
("RT7^{3}" producidas nuevamente en el timo) se comprobaron
en un ensayo estándar de proliferación en cuanto a su reactividad
frente a la coestimulación convencional. A este respecto se
cultivaron células T 1x10^{5} en 0,2 ml de medio de cultura en
placa de microtiter de cuenco 96 durante dos días a 37ºC, seguido
ello de un pulso de 16 horas con timidina marcada 1 \muCi^{3}H.
La incorporación de ésta en el ADN se representa en tanto cpm x
10^{-3} y es una dimensión admisible para la actividad de la
división (proliferación) de las células. Las cuatro barras
superiores muestran enfoques en los que las células T fueron
estimuladas por medio de un MAK específico (R73) de receptor de
antígeno celular T (TCR) así como adicionalmente por medio de 15
MAKJJ319 específico de CD28 (coestimulación clásica). A este
respecto se reprodujeron las señales fisiológicas en la activación
de las células T. Las cuatro barras muestran la reacción de las
cuatro poblaciones diferentes de células T que fueron comprobadas,
es decir sendas RT7^{b} procedentes del inóculo originario de
células T maduras así como las células RT7^{a} nuevamente
generadas en el timo de ambos grupos de animales, a saber, el
sometido a la terapia con CD28 y el grupo de animales de control
tratados con PBS. El grupo inferior ("medio") muestra las
mismas células sin estimulación. Aquí no se observó proliferación
alguna. El ensayo muestra que incluso tras la expansión extensa
en vivo por medio de la terapia con CD28 se mantenía la
capacidad de reaccionar de los linfocitos.
La figura 8 muestra que las células T generadas
en vivo por medio de la terapia anti-CD28
reaccionan frente a antígenos extraños transplantados. El enfoque
del ensayo se corresponde en principio al ilustrado en la figura 7
excepto en que aquí la estimulación de las células T no se lleva a
cabo con ayuda de anticuerpos monoclonales, sino añadiendo células
estimuladoras del tronco LEW. Se trata de 10^{5} de células
irradiadas de nódulos linfáticos por cuenco. La irradiación se
lleva a cabo para que las células estimulantes mismas no cooperen a
la proliferación medida. El tronco LEW fue seleccionado por
diferenciarse por sus más potentes antígenos de trasplatación (de
acuerdo al antígeno HLA del ser humano) respecto del tronco PVG: LEW
expresa RT1^{1}, mientras que PVG, por el contrario, RT1^{c}.
Para determinar un valor básico se aplicó también al grupo inferior
células de nódulos linfáticos irradiadas PVG en tanto estimuladores.
El resultado muestra que de nuevo los cuatro grupos comprobados de
linfocitos T reaccionan a los antígenos de trasplantación extraños
con proliferación; por lo demás se muestra un aumento de la reacción
de fondo en las células T tanto del grupo sometido a terapia como
del grupo de control, que procede del inóculo originario de células
T (RT7^{b} positivas) maduras aplicado.
La figura 9 muestra que las células T
proliferadas en vivo por medio de la terapia con
anti-CD28 se encuentran en disposición de producir
citocina. Como se ilustra en la figura 7, las células T maduras
expandidas (RT7^{b+}) y las maduradas nuevamente en el timo
(RT7^{b-}, es decir las RT7^{a}) de las sometidas a terapia
anti-CD28 y las controladas in vitro se
activan por medio de coestimulación. Tras 5 días se colectaron las
células y se sometieron a comprobación (según un protocolo que
puede consultarse en el catálogo de la empresa Pharmingen/Becton
Dickinson) en cuanto a la aptitud reproductiva de la citocina
gamma-interferón e interleucina-4.
Estas dos citocinas se seleccionaron por ser características de
ambos tipos funcionales diversos de células T de Effektor CD4 que
pueden originarse tras la activación: las células estimulantes de la
inflamación TH1 producen interferón-gamma, las
células TH2 supresoras de la inflamación y estimuladoras de la
producción de anticuerpos TH2 producen IL-4. En
cuanto al método demostrativo se trata de una pigmentación
intracelular de citocina que se evalúa por medio de la
citofotometría de flujo. Cada punto que se encuentre por encima de
la línea de separación horizontal muestra una célula que sintetiza
la citocina indicada en la ordenada. Es notorio que los cuatro
grupos de linfocitos T contienen una fracción de células de
semejante tamaño que pueden producir
interferón-gamma. Por contrario las células que
producen IL-4 se encuentran solamente en aquellos
linfocitos T que fueron reproducidos en vivo por medio de la
terapia con mitógeno anti-CD28 (dot plot abajo a la
derecha). El experimento muestra que por medio de la expansión
en vivo con mitógeneno MAK específico de CD28 no se pierde la
capacidad de sintetizar citocina del tipo TH1. El que se den
células fenotipo TH2 (productoras W-4) no es
sorprendente.
\vskip1.000000\baselineskip
El enfoque de ensayo se corresponde al ilustrado
en la figura 3 con dos variantes: 1. Los animales recibieron
solamente una inyección de 1 mg de MAK el día 0; 2. A los animales
se les extirpó el timo antes de ser sometidos a irradiación y
reconstitución a fin de evitar la remaduración de las células T en
el timo. De este modo se reproduce la situación de la linfopenia en
personas adultas, por ejemplo tras una quimioterapia o radioterapia.
Las personas maduras a penas pueden producir nuevas células T en el
timo, ya que tras la pubertad el funcionamiento del timo concluye
prácticamente.
La figura 10 muestra el aumento de la cantidad
de células T en la sangre. No es necesario diferenciar entre
células RT7^{b} positivas y negativas, ya que todas las células T
son RT7^{b+} (falta de nueva producción de células T RT7^{b-}
en el timo). Los tres gráficos muestran las células T así como sus
subpoblaciones de CD4 y CD8 de tres animales terapeutizados con
anti-CD28 (símbolos rellenos) y tres animales
tratados con un anticuerpo de control del mismo tipo (símbolos
abiertos) cada uno. Como puede reconocerse fácilmente el
tratamiento de una dosis de 1 mg del mitógeno
anti-CD28 mAk JJ316 tuvo como consecuencia una
recuperación rápida de la cantidad de células T.
En la figura 11 puede reconocerse que las
células reproducidas en vivo por medio de la terapia con
anti-CD28 pueden inmunizarse. Los animales
referidos en la figura 10 fueron inmunizados durante cuatro semanas
tras el tratamiento con el antígeno modelo Keyhole Limpet
hemocianina (KLH) a fin de someter a prueba la capacidad de
funcionamiento de los linfocitos. Tras cuatro semanas más se
sacrificaron los animales y las células de los nódulos linfáticos
fueron sometidas a la comprobación de su aptitud de reaccionar ante
la estimulación de KLH proliferando. Una prueba de este tipo se
denomina de antígeno de "Recall"; semejantes pruebas se
emplean, por ejemplo, con las personas a fin de comprobar el éxito
de la inducción de la inmunidad T relativa a antígeno de vacuna
como el toxoide tetánico. El sistema de comprobaciones se
corresponde por principio general con el de las figuras 7 y 8, en
todo caso para la estimulación se empleó el antígeno de vacuna KLH.
Es algo claro que los animales de ambos grupos contaban con la
inmunidad celular T contra KLH como consecuencia de la vacuna. Esto
es igual de intenso en ambos grupos, ya que para la prueba in
vitro la cantidad de células por cuenco de cultivo se iguala de
modo que las diferencias en la expansión celular T terapéutica
previa se suprimen por medio del mitógeno anti-CD28
mAk.
La figura 12 muestra la producción de
anticuerpos contra el antígeno modelo KLH. La producción de
anticuerpos a través de los nódulos linfáticos B depende de la
función de los linfocitos T CD4. De los animales inmunizados con
KLH referidos en la figura 11 se tomó por este motivo sangre en los
momentos ilustrados en la abcisa y fueron sometidos a comprobación
relativa a la presencia de anticuerpos específicos de KLH en un
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Como muestra el gráfico
superior todos los animales sometidos a terapia con
anti-CD28 reaccionaron con la misma rápida cinética
a la inmunización (símbolos rellenos) mientras que dos de los tres
animales de control no mostraron reacción alguna; el tercero
reaccionó de modo semejante al del grupo sometido a terapia si bien
con cinética retardada (véase los gráficos de los resultados de
ELISA de los días 7, 14 y 21;, estos valores fueron medidos en una
segunda prueba; la densidad óptica medida no es directamente
comparable por este motivo con los gráficos superiores).
En un experimento que no se ilustra con ninguna
figura se mostró que los animales T-linfopénicos
sometidos a terapia con anti-CD28 rechazaban los
trasplantes de piel ajena. El combate de las células infectadas con
virus, de tumores y de bacterias intracelulares depende del
funcionamiento de las células proinflamatorias TH1. Por causa de la
presencia de las células TH2 productoras de IL-4
antiinflamatorio en los animales T-linfopénicos
sometidos a terapia con CD28 hubo de tenerse en cuenta la
posibilidad de que se suprimiera la inmunidad proinflamatoria,
"de mediación celular". Esto puede comprobarse partiendo de la
capacidad de los animales de rechazar un transplante de piel
extraña. También esta reacción depende de TH1. A los animales
sometidos a terapia con CD28 se les aplicó por ello un transplante
de piel del tronco LEW que expresa los alelos de RT1^{1} de los
antígenos de trasplantación fuertes, mientras que los animales PVG
sometidos a terapia portan RT1^{c}. A modo de control se
transfirió un transplante singénico PVG. Los ocho animales sometidos
a terapia rechazaron la piel extraña, mientras que aquellos de
tronco genéticamente idéntico la incorporaron. Ejemplar a este
respecto fue, por una parte, el LEW necrótico y, por otra parte, el
transplante PVG bien vascularizado en un animal. Por término medio
el rechazo en los animales sometidos a terapia sucedió más
rápidamente que en los animales de control. Este resultado confirma
que por medio de la terapia con anti-CD28 no se
pierde la inmunidad mediada por línea.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 13 muestra una cinética de la cantidad
de granulocitos tras el tratamiento con mAk
anti-CD28 convencional (símbolos abiertos) y
mitógeno (símbolos rellenos). Cada una de las línea representa un
animal. Las ratas LEW adultas recibieron 1 mg del mAk
anti-CD28 mitógeno JJ316 o del mAk
anti-CD28 JJ319 convencional aplicado
intravenosamente. La cantidad de los granulocitos en la sangre
periférica se constató en los momentos concretos por determinación
de la cantidad total de leucocitos así como de la porción de
granulocitos. Esta medición tuvo lugar con la citofotometría de
flujo y partiendo de las propiedades de dispersión lumínica especial
de los granulocitos. Como se muestra en la figura 13, en todos los
animales que recibieron el mitógeno mAk anti-CD28
se observó un dramático aumento de la cantidad de granulocitos, al
contrario que en el caso de los animales de control, a los que se
suministró el mAk anti-CD28 convencional.
La figura 14 muestra un ejemplo del aumento de
la cantidad de granulocitos en la sangre de los animales estimulados
con CD28. Los leucocitos se sometieron a comprobación en cuanto a
sus propiedades de dispersión lumínica por medio de una
citofotometría. FSC significa forward scatter o dispersión de
la luz hacia delante, SSC sideward scatter o bien la luz
desviada 90º, que es una dimensión relativa a la granularidad de las
células. Cada una de las líneas se representa por medio de un
punto. La nube rotulada muestra los granulocitos, cuyo porcentaje
es resultado directo de la medición; la cantidad de células añadidas
por microlitro de sangre se calcula por medio de la cantidad
anteriormente determinada de leucocitos por microlitro de sangre. Se
reconoce un aumento (que sobrepasa el límite de significancia) de
la cantidad de granulocitos tras el tratamiento con mAk
"directo" específico de CD28.
\vskip1.000000\baselineskip
Las ratas LEW adultas recibieron 1 mg del
mitógeno anti-CD28 mAk JJ316 (símbolos rellenos) o
del convencional anti-CD28 mAk JJ319 (símbolos
abiertos) intravenosamente. La cantidad de los monocitos en la
sangre periférica fue constatada en los momentos previstos por
determinación de la cantidad total de leucocitos así como su
porción de monocitos. Esta medición se realizó con la citofotometría
de flujo partiendo de las propiedades de dispersión lumínica
especiales de los monocitos así como de la expresión del antígeno
Mac-1, que fue constatada por medio del MAX 0X42
fluorescentemente marcado. Como se muestra en la figura 15, en todos
los animales que recibieron el mitógeno anti-CD28
mAk se observó un dramático aumento de la cantidad de monocitos, al
contrario que en los animales de control, los cuales recibieron el
anti-CD28 mAk convencional.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras afectación del sistema hematopoyético, por
ejemplo por causa de quimioterapia o radioterapia, han de
regenerarse también los granulocitos y monocitos del sistema
inmunológico congénito o natural. Puesto que los linfocitos T
activados pueden estimular esto mismo, por ejemplo por medio de
producción de citocina (G-CSP,
GM-CSF) y puesto que en los animales sanos se ha
observado un aumento de la cantidad de los granulocitos y monocitos
en la sangre tras el tratamiento con anti-CD28, se
sometió a comprobación la capacidad del mitógeno MAK
anti-CD28 de acelerar la recuperación de esta
población de leucocitos.
La figura 16 muestra el proceso cronológico de
la cantidad de granulocitos y monocitos en la sangre de ratas
irradiadas con médula ósea reconstituida tras la terapia con
anti-CD28.
A las ratas obtenidas por consanguineidad PVG se
les extirpó primeramente el timo a fin de evitar que remaduraran
las células T (de este modo se reproduce la situación de la
linfopenia en personas, por ejemplo tras una quimioterapia o
radioterapia; en las personas adultas el funcionamiento del timo ha
concluido prácticamente). Fueron sometidas a los efectos de los
rayos gamma procedentes de una fuente de cesio de tal modo que el
sistema generador de sangre, incluidos los glóbulos blancos, quedó
destruido. En tanto fuente de producción de células madre recibieron
los animales células de médula ósea del mismo tronco genético
consanguíneo intravenoso. Adicionalmente recibieron 5 x 10^{6}
células T CD4 o 5 x 10^{5} células T (CD4 y CD8) del tronco
genético consanguíneo PVG.RT7^{b}. Los animales de este tronco
son idénticos al tronco receptor PVG excepto en la molécula de la
superficie de los leucocitos RT7, de la cual expresan el alelo b en
lugar del a. Por medio del MAK específico de RT7b marcado
fluorescentemente pueden identificarse las células T de los animales
que procedan de las células T maduras inyectadas. La cantidad de
células T inyectadas se corresponde aproximadamente a una milésima
de la cantidad de de células T maduras de una rata adulta, de modo
que nos encontramos ante el modelo de una drástica linfopenia T. A
los animales se les suministró el día 0 1 mg de JJ316 o de
JJ319.
En el momento indicado se les tomó sangre y se
determinó la cantidad de células de acuerdo al ejemplo 7. De la
figura 16 se desprende una recuperación más rápida de la cantidad de
monocitos y granulocitos con el mAk aplicado según la invención, a
lo cual, en el caso de los granulocitos, se encontró una reacción
excedente los primeros días tras el tratamiento, la cual se
normalizó de nuevo.
La figura 17 muestra datos relativos a la
proporción de granulocitos en la sangre de ratas irradiadas con
médula ósea reconstituida tras la terapia con
anti-CD28. En tanto ejemplo se muestra una medición
de la proporción de granulocitos siete días tras el comienzo de la
terapia. El método se corresponde al descrito en el ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 18 muestra el plano del ensayo. A dos
monos adultos rhesus se les suministró intravenosamente una dosis
de 5 mg por kg de peso corporal de un mitógeno de mAk específico de
CD28. A fin de poder reconocer a tiempo el efecto tóxico que
posiblemente pudiera darse la dosis se repartió en tres subdosis de
0,25, 1,0 y 3,75 mg/kg de peso corporal que fueron aplicadas en el
espacio temporal de un día. El animal 1 no fue tratado, el animal 2
fue infectado 22 meses antes con un virus apatógeno
(SIV\Delta^{nef}). Esta infección no desempeñó ninguna función
respecto de los resultados aquí obtenidos y solamente se menciona
por de la exhaustividad. El animal 2, además, fue inmunizado dos
semanas antes del tratamiento con anticuerpos con un antígeno modelo
KLH. Ninguno de los animales mostró reacción tóxica perceptible a
la infusión de anticuerpos. En los momentos mostrados se les tomó a
los animales sangre destinada a los exámenes que describimos
seguidamente.
La figura 19 muestra la expresión
Ki-67 en células T de un mono rhesus estimulado con
CD28 (animal 2). La molécula Ki-67 se expresa en
núcleos de células que se encuentran en ciclo celular, es decir, que
se están dividiendo. Como muestra la figura, antes del tratamiento
se encontraba aproximadamente el 5% de las células T CD4 y el 5% de
las CD8 en fase de ciclo celular. Tras el tratamiento con CD28 (día
0) aumentó la frecuencia primeramente al 20, luego al 45% en ambas
poblaciones y, después, se precipitó regresando al 10%. Este
resultado muestra que la estimulación en vivo con CD28 es
efectiva en cuanto a la proliferación de las células T CD4 y
CD8.
\newpage
Las figuras de 20 a 22, que son esenciales en
cuanto a la invención, muestran finalmente el aumento que puede
obtenerse de la cantidad de granulocitos, monocitos y trombocitos en
la sangre periférica de monos rhesus sometidos a terapia con
anti-CD28. Los esquemas sanguíneos se obtuvieron en
un laboratorio hematológico con un aparato CellDyn 4000 y se
representan aquí en tanto células/microlitros de sangre en proceso
cronológico. La figura 20 manifiesta el aumento de la cantidad
granulocitos neutrófilos en la sangre periférica de monos rhesus
sometidos a terapia con anti-CD28.
Ambos animales mostraron un dramático aumento en
comparación al valor inicial. Esto mismo se obtuvo de nuevo con el
animal 1 tras un mes, con el animal 2 un poco después. Gracias a la
terapia puede ser innecesario el tratamiento habitual con
G-CSF en la trasplantación de médula ósea. La figura
21 demuestra el aumento de la cantidad de monocitos en la sangre
periférica de monos rhesus sometidos a terapia con
anti-CD28. En ambos animales se observó un aumento
considerable respecto del valor inicial con igualación lenta al
valor normal durante los dos meses siguientes. La figura 22
demuestra el aumento de la cantidad de monocitos en la sangre
periférica de monos rhesus sometidos a terapia con
anti-CD28. Ambos animales mostraron un dramático
aumento en comparación al valor inicial. Esto mismo se obtuvo de
nuevo con el animal 1 tras un mes, con el animal 2 algo antes.
Claims (1)
1. Empleo de anticuerpos monoclonales
específicos de CD28 y linfocitos T de varios subgrupos a todos los
subgrupos sin ocupación de un receptor de antígeno de linfocitos T
y, por ende, activación antigénica específica para la producción de
una composición farmacéutica destinada al tratamiento de
enfermedades en que se dé una reducción de la cantidad de células
sanguíneas, que no porten CD28, a lo cual la enfermedad ha de
adscribirse al grupo conformado por "granulocitopenia,
especialmente neutropenia y monocitopenia, trombocitopenia, anemias
aplásticas, deficiencia de la médula ósea con aplasia/hipoplasia de
la médula ósea misma, pancitopenia, anemia de Fanconi, anemias
aplásticas adquiridas, especialmente anemia aplástica idiopática y
anemias aplásticas secundarias así como anemia, trombocitopenia y/o
granulocitopenia en casos de leucemia aguda".
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