ES2327611T3 - Empleo de antucuerpos monoclonales especificos de cd28 para estimular celulas sanguineas sin cd28. - Google Patents
Empleo de antucuerpos monoclonales especificos de cd28 para estimular celulas sanguineas sin cd28. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2327611T3 ES2327611T3 ES01986609T ES01986609T ES2327611T3 ES 2327611 T3 ES2327611 T3 ES 2327611T3 ES 01986609 T ES01986609 T ES 01986609T ES 01986609 T ES01986609 T ES 01986609T ES 2327611 T3 ES2327611 T3 ES 2327611T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- animals
- antibodies
- monoclonal antibodies
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 title claims abstract description 60
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 title abstract description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 106
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 71
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 23
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 16
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 15
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 7
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims description 6
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010000 Agranulocytosis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010018687 Granulocytopenia Diseases 0.000 claims description 4
- 206010053138 Congenital aplastic anaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010002961 Aplasia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004939 Fanconi anemia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010027905 Monocytopenia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 2
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001911 Idiopathic aplastic anemia Diseases 0.000 claims 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 abstract description 6
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 66
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 33
- 101100166600 Homo sapiens CD28 gene Proteins 0.000 description 25
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 17
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 17
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 17
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 13
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 13
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 7
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 6
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 6
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 4
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 4
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 3
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- 101001007348 Arachis hypogaea Galactose-binding lectin Proteins 0.000 description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 2
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 2
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 2
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 2
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 206010028537 myelofibrosis Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035921 thrombopoiesis Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 2
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 2
- 241000750676 Bacillus phage Gamma Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000025212 Constitutional neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 208000000280 Cyclic neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010052210 Infantile genetic agranulocytosis Diseases 0.000 description 1
- 208000012565 Kostmann syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000010638 acquired aplastic anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100001018 bone marrow damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000018486 cell cycle phase Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 201000004425 congenital hypoplastic anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002344 gold compounds Chemical class 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002935 megaloblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002895 phenylbutazone Drugs 0.000 description 1
- VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N phenylbutazonum Chemical compound O=C1C(CCCC)C(=O)N(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=CC=C1 VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004765 promyelocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 208000027390 severe congenital neutropenia 3 Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Empleo de anticuerpos monoclonales específicos de CD28 y linfocitos T de varios subgrupos a todos los subgrupos sin ocupación de un receptor de antígeno de linfocitos T y, por ende, activación antigénica específica para la producción de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades en que se dé una reducción de la cantidad de células sanguíneas, que no porten CD28, a lo cual la enfermedad ha de adscribirse al grupo conformado por "granulocitopenia, especialmente neutropenia y monocitopenia, trombocitopenia, anemias aplásticas, deficiencia de la médula ósea con aplasia/hipoplasia de la médula ósea misma, pancitopenia, anemia de Fanconi, anemias aplásticas adquiridas, especialmente anemia aplástica idiopática y anemias aplásticas secundarias así como anemia, trombocitopenia y/o granulocitopenia en casos de leucemia aguda".
Description
Empleo de anticuerpos monoclonales específicos
de CD28 para estimular células sanguíneas sin CD28.
La invención es relativa a un empleo de
anticuerpos monoclonales específicos de CD28 que activan los
linfocitos T sin ocupación de un receptor de antígeno de linfocitos
T y, por ende, de modo antigen-inespecífico.
Existen diversas enfermedades propias de las
especies tanto humana como animales de sangre caliente en las
cuales la cantidad de la diversas células sanguíneas es inferior a
la que se tiene en estado de salud.
Uno de estos grupos de enfermedades se llama
granulocitopenia (neutropenia y monocitopenia) y afecta a los
granulocitos. En tanto causas de esta enfermedad se consideran: i)
una granulocitopoyesis reducida (perturbación aplástica) causada
por un daño de la médula ósea debido, por ejemplo, a 25 agentes
químicos como el benzol, medicamentos como los citostáticos,
inmunosupresores, AZT y/o cloramfenicol (toxicidad relativa a las
dosis) o como la fenilbutazona, compuestos de oro, raras veces
cloramfenicol (independientemente de la dosis por causa de
reacciones farmacogenéticas), rayos o autoanticuerpos nocivos a las
células madre (en algunos casos de inmunoneutropenia), debido a
infiltración en la médula ósea (leucemias, carcinomas, linfomas
malignos) y/o debido a osteomielosclerosis, ii) perturbaciones en
la maduración de la granulocitopoyesis, por ejemplo debido a
perturbaciones congenitales de la maduración o mielopoyesis,
síndrome de Kostmann (detención de la maduración de la mielopoyesis
en el estadio de los promielocitos), neutropenia cíclica, síndrome
de mielodisplasia, carencia de vitamina B12 o de ácido fólico con
granulopoyesis, eritropoyesis y/o trombopoyesis inefectiva. Las
terapias convencionales abarcan el suministro de factores del
crecimiento de la granulocitopoyesis (por ejemplo
G-CSF y GM-CSF).
Un segundo grupo se denomina trombocitopenia. En
tanto causas cabe considerar: i) reducida trombocitopoyesis en la
médula ósea (perturbación aplástica o bien una cantidad reducida de
megacariocitos en la médula ósea) por causa de un daño en la médula
ósea debido, por ejemplo, a agentes químicos como el benzol,
medicamentos como es el caso de los citostáticos y/o los
inmunosupresores, rayos, infecciones como por ejemplo VIH o
autoanticuerpos nocivos a los megacariocitos (en algunos casos de
inmunotrombocitopenia) por causa de infiltración en la médula ósea
(leucemias, carcinomas; linfomas malignos) y/o por causa de
osteomielosclerosis, ii) perturbaciones de la maduración de los
megacariocitos (megacariocitos en la médula ósea normal en aumento)
con trombopoyesis, eritropoyesis y/o granulopoyesis inefectiva con
megaloblastos, metamielocitos gigantes y demás debido a carencia de
vitamina B12 o ácido fólico. Las terapias convencionales abarcan la
supresión de los medicamentos inseguros, substitución de
trombocitos (en casos de perturbaciones de la producción en la
médula ósea: trombocitopoyetina) así como MGDF (Megakaryocyte
Growth and Development Factor, estimulación de la proliferación y
maduración de los megacariocitos).
Un tercer grupo está conformado por las anemias
aplásticas o bien la deficiencia de la médula ósea con
aplasia/hipoplasia de médula ósea y pancitopenia (enfermedad de las
células madre). Una anemia aplástica congénita es, por ejemplo, la
anemia Fanconi. Más frecuentes son las anemias aplásticas adquiridas
como es el caso de la anemia idiopática aplástica (cuya causa es
desconocida) y anemias aplásticas secundarias debidas al efecto de
los medicamentos, substancias tóxicas, radiaciones con ionización e
infecciones víricas (véase arriba). Los enfoques terapéuticos de
apoyo abarcan la substitución de eritrocitos/trombocitos. Los
enfoques terapéuticos causales abarcan el transplante de médula
ósea o el transplante de células madre, terapias inmunosupresivas
(por ejemplo ATG) y otras medidas terapéuticas como, por ejemplo,
el suministro de citocinas (GM-CSF,
G-CSF, MGDF, y/o trombocitopoyetina).
Finalmente cabe mencionar la leucemia aguda, que
frecuentemente se presenta en tanto anemia, trombocitopenia y/o
granulocitopenia. Las terapias abarcan la substitución de los
eritrocitos y los trombocitos en la medida necesaria o bien la
estimulación de la granulopoyesis a través de G-CSF
y/o GM-CSF, la quimioterapia y los transplantes de
médula óseas y/o células madre.
Las enfermedades anteriormente mencionadas
comparten un aspecto común, a saber, el que las células sanguíneas
afectadas son precisamente aquellas que no llevan ningún CD28 en su
superficie.
CD28 se denomina una molécula expresada de la
membrana celular de linfocitos T de procedencia humana o animal con
una secuencia conocida de aminoácidos a la cual, en el marco del
"Human Leukocyte Typing Workshops" internacional, se le ha
asignado la abreviatura de CD28. Con la activación de los linfocitos
T la proliferación de la actividad metabólica, el aumento del
volumen de las células, la síntesis de moléculas inmunológicamente
importantes y el que tenga lugar la división celular
(proliferación) de los linfocitos T se indica un estímulo exterior.
Estos procesos, por ejemplo, se inducen por medio de la ocupación de
la molécula CD28 en células T por medio de anticuerpos monoclonales
especiales específicos de CD28. La activación de los linfocitos T
con los epifenómenos descritos es un aspecto de la inmunoreacción
fisiológica que, en todo caso, puede derivar en casos patológicos
en descontrol (enfermedades linfoproliferativas) o ser insuficientes
(inmunodeficiencia).
Para comprender la invención es primeramente
importante considerar el trasfondo tecnológico que a continuación
se ilustra. La activación de las células T en reposo con vistas a la
proliferación y la diferenciación funcional requiere, en primer
lugar, la ocupación de estructuras superficiales dobles, los
llamados receptores: 1. primero, del receptor del antígeno, que
posee una especificidad diferente de célula a célula y que es
necesaria para el reconocimiento de antígenos como, por ejemplo,
productos de disociación virales; así como la molécula CD28
expresada del mismo modo en todas las células T en reposo, la cual
se une de un modo natural a ligandos sobre la superficie de otras
células del sistema inmunológico. Cabe mencionar a este respecto la
expresión de "coestimulación" relativa a la inmunoreacción
específica de antígeno por causa de CD28. En el cultivo celular
pueden reproducirse estos procesos por ocupación del receptor de
antígeno así como de la molécula CD28 con anticuerpos monoclonales
apropiados. En el sistema clásico de la coestimulación ni la
ocupación del receptor de antígenos ni de la molécula CD28 sólo
tienen por consecuencia la proliferación celular T, no obstante la
ocupación de ambos receptores es efectiva. Esto mismo se ha
observado en células T tanto humanas como de ratones y ratas.
Una activación "directa", es decir, una
activación independiente de la ocupación del receptor de antígeno
de linfocitos T en reposo a través de anticuerpos monoclonales
específicos de CD28, se ha observado en los siguientes sistemas: en
la nota bibliográfica de Brinkmann et al., J. Immunology,
1996, 156: 4100-4106 se mostró que una muy reducida
porción (del 5%) de los linfocitos T humanos portadores de los
marcadores superficiales CD45 RO típicos de los linfocitos T en
reposo se activa por medio de los anticuerpos monoclonales
"clásicos" específicos de CD28 9.3 en caso de adición del
factor de crecimiento interleucina 2 (IL-2) sin
ocupación del receptor de antígeno. En el trabajo de Siefken et
al., Cellular Immunology, 1997, 176: 59-65, se
mostró que por vías convencionales, es decir, por medio de
inmunizar a ratones con células T humanas, los anticuerpos
monoclonales específicos de CD28 producidos pueden activar en
cultivos celulares un subgrupo de células T humanas sin ocupación
de receptor de antígeno con vistas a la proliferación siempre que el
CD28 sea ocupado por estos anticuerpos monoclonales y las moléculas
monoclonales ligadas celularmente se enlacen además conformando una
red entre sí por la acción de otros anticuerpos. En ambos casos los
anticuerpos descritos primera y fundamentalmente no son apropiados
para el empleo en la medicina humana, ya que se trata de anticuerpos
de ratón. Por lo demás ambos anticuerpos comparten la
característica de que tan sólo una porción muy reducida de las
células T puede activarse "directamente".
En el trabajo de Tacke et al., Eur. J.
Immunol., 1997, 27:239-247 se describen dos tipos de
anticuerpos monoclonales específicos de CD28 de diferentes
propiedades funcionales: "anticuerpos clásicos" que coestimulan
la activación de las células T en reposo solamente con la ocupación
del receptor de antígeno simultánea; y "directos", los cuales
pueden activar la proliferación sin del receptor de antígeno de
linfocitos T de todas las clases in vitro y en animales de
laboratorio. Ambos anticuerpos monoclonales conocidos hasta este
punto se relacionan a la inmunización con células en las que se
expresa el CD28 de ratos y pueden obtenerse en diferentes
selecciones de acuerdo a sendas propiedades descritas.
De la nota bibliográfica WO 98/54225, a la cual
se hace referencia expresa y en toda su extensión de modo que se
eviten las repeticiones, se conocen los anticuerpos monoclonales
"directos" específicos de CD-28 así como su
empleo destinado al tratamiento de enfermedades en las que tenga
lugar una disminución patológica de la cantidad de células T CD4 o
a la modulación de inmunoreacciones en las vacunas. En los casos de
estas aplicaciones se consideran regularmente células que portan el
CD28 en su superficie (células T) y que, consecuentemente, se
estimulan inmediatamente por la acción de los anticuerpos
monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales
anti-CD28 que activan los linfocitos T
inespecíficamente son conocidos en la bibliografía del European
Journal of Immunology, 27(1):239-247 (1997),
European Journal of Immunology, 30(3):424-428
(2000) y Cellular Immunology 176(1):59-65
(1997). De la nota bibliográfica Clinical and Experimental
Immunology 85(3):424-428 (1991) es conocido
el hecho de que un paciente con trombocitopenia mostraba un déficit
de CD-28.
La invención se relaciona al problema técnico de
haber de indicarse una composición farmacológica por medio de la
cual se estimule la formación y/o activación de células sanguíneas
que no sean portadoras de CD 28.
Respecto de la solución de este problema técnico
la invención indica el empleo de acuerdo a la única reivindicación
de patente.
En tanto estimulación se denomina el incremento
de la actividad metabólica, el aumento del tamaño de las células,
la síntesis de los factores y/o el hecho de que la proliferación
tenga lugar.
Análogas son substancias que no sean anticuerpos
monoclonales y que, no obstante, desempeñen las funciones
ilustradas en el marco de la invención. Ejemplos a este respecto son
las proteínas altamente específicas "cortadas" o RNA, DNA o
PNA (por ejemplo, aptámeros, especialmente aptámeros estabilizados
frente a encimas disociadoras de ácido nucleico o bien RNA, DNA o
PNA). El criterio común es, en todo caso, la especificidad CD28 de
efecto "directamente" estimulante sobre las células sanguíneas
portadoras de CD28.
La invención se base en el sorprendente
descubrimiento de que los anticuerpos monoclonales específicos de
CD28 también surten el efecto de la proliferación, la formación o
activación de células sanguíneas que no porten ningún CD28; se
trata de células sanguíneas, pues, en las que el acoplamiento de los
anticuerpos no parece posible. Sin el deseo de establecer un
compromiso con una teoría concreta se sospecha que el sorprendente
efecto se relaciona con el hecho de que por medio de la estimulación
"directa" (es decir, sin coestimulante) de las células
portadoras de CD28, especialmente las células T, estas células
producen y emiten por su cuenta factores que a su vez estimulan las
células sanguíneas no portadoras de CD28. Por lo tanto se sospecha
la existencia de un proceso indirecto.
La composición farmacológica para el suministro
a personas muestran los anticuerpos monoclonales aplicados según la
invención, preferentemente componentes constantes humanos. Los
componentes constantes de un anticuerpo son sectores sin
importancia respecto del reconocimiento del antígeno al contrario
que en el caso de los sectores variables que definen la
especificidad antígena de un anticuerpo. Los componentes constantes
se diferencian, no obstante, en los anticuerpos de diversos tipos
y, por ende, también de animales y personas. Los sectores
constantes de un anticuerpo pueden corresponderse, por ejemplo, a
los de anticuerpos de un organismo que haya de ser tratado con
anticuerpos por motivos de compatibilidad. Los anticuerpos
monoclonales aplicados a personas según la invención son, por
tanto, por una parte humanamente compatibles y ello, a saber, sea
tanto per se o por humanización, mientras que por otra parte pueden
servir para el tratamiento, puesto que los anticuerpos puede
encontrarse específicamente configurados frete al humano CD28 y
puesto que la activación de los linfocitos T es amplia. Con la
adaptación correspondiente o con la producción de un derivado los
anticuerpos monoclonales aplicados según la invención pueden
aplicarse también a mamíferos no humanos. A este respecto cabe
mencionar que los anticuerpos monoclonales no humanizados bien
pueden ser humano-compatibles.
Humano-compatibles son los anticuerpos monoclonales
cuando no producen ninguna inmunoreacción indeseada durante un
espacio determinado de tiempo, como, por ejemplo, es ello
demostrable por la determinación de anticuerpos de
anti-inmunoglobulina cuando estos impidan su
empleo.
Los derivados de anticuerpos monoclonales se
entienden como modificaciones de anticuerpos monoclonales que se
hayan producido por una manipulación convencional bioquímica o
técnico-genética. Este caso se da, por ejemplo, en
la humanización de un anticuerpo monoclonal de ratón por
substitución parcial de componentes estructurales (constantes) del
anticuerpo de ratón por otros humanos.
En detalle los anticuerpos monoclonales
aplicados según la invención pueden obtenerse por medio de: A)
creación de células de hibridomas aptas para la producción de CD28
humano monoclonal específicos de anticuerpos de animales en vías de
una inmunización con líneas de células tumorales no T en las cuales
se encuentre expresado el CD28 humano o con CD28 recombinantemente
expresado; B) en su caso, humanización de los anticuerpos de
animales obtenibles según el nivel A de las células hibridomas por
medio de substitución bioquímica o técnico-genética
de componentes constantes de anticuerpos de animales por componentes
constantes análogos de un anticuerpo humano o bien por substitución
de los componentes de los genes correspondientes de células
hibridomas; C) secreción de los anticuerpos en cultivos de células
hibridomas y aislamiento de los anticuerpos resultantes o
producción de anticuerpos por medio de inyección de las células
hibridomas en animales, por ejemplo, en ratones, y aislamiento de
los anticuerpos de los líquidos corporales de los animales. -Un
aspecto importante de los anticuerpos monoclonales aplicados según
la invención consiste, en comparación con las siguientes notas
bibliográficas de Brinkmann et al., J. Immunology, 1996, 156:
4100-4106, y Siefken et al., Cellular
Immunology, 1997, 176: 59-65, en el descubrimiento
de que los anticuerpos monoclonales se dan por inmunización con
células tumorales no T en las cuales se encuentra expresado el CD28
humano en lugar de inmunización con líneas celulares T. Pues de
este modo pueden obtenerse anticuerpos monoclonales que no solamente
son específicos frente al CD28 (humano) sino que también tienen el
efecto de una activación "directa" en una amplitud
considerable. En particular los anticuerpos monoclonales aplicados
según la invención pueden presentar la especificidad relativa a
determinantes, por ejemplo, de la molécula humana CD28, que son
difícilmente accesibles a la molécula CD28 naturalmente expresada y
cuya ocupación por los novedosos anticuerpos monoclonales coopera a
la activación de las células T y, finalmente, a la activación de
células sanguíneas no portadoras de CD28. Por determinante ha de
entenderse el sector de una molécula que queda definido por la
especificidad enlazante de uno o varios anticuerpos.
El modo básico de proceder en la producción de
células hibridomas, la humanización así como en la producción de
anticuerpos monoclonales a partir de células hibridomas
(humanizadas), es bien conocido por el personal especializado y no
requiere ser ilustrado aquí. En principio pueden emplearse todas las
líneas celulares conocidas y libremente disponibles especiales para
la producción de células hibridomas. Para la producción de los
anticuerpos monoclonales se tienen en cuenta por principio general,
además del método en adelante descrito, la expresión recombinada
con la que el especialista está familiarizado en detalle.
Concretamente es preferible que los anticuerpos
de animales específicos para la producción de monoclonales humanos
CD28 contengan células hibridomas por medio de a) creación de un
plásmido por medio de inserción de ADN complementario de CD28
humano en el vector
pH\betaAPr-l-neo tras escisión del
fragmento SalI-HindIII y creación de protoplastos
de escherichia coli (MC1061) que porten el plásmido; b)
fusión de los protoplastos con células tumorales de ratón A2OJ y/o
L929 por medio de polietilenglicol; c) cultivo de las líneas
transferidas contenidas en el nivel b; d) screenen de las células
de ratón transferidas A2OJ y/o L929 a la expresión del CD28 humano
y selección de células de ratón A20J y/o L929 que expresen el CD28
humano; e) inmunización de ratones BALB/c con las células de ratón
A2OJ y/o L929 que expresen el CD28 humano (por ejemplo por medio de
seis inyecciones intraperitoneales y seguidamente una intravenosa);
f) toma de células del bazo de los ratones así inmunizados y fusión
de las células del bazo con células ("nonproducer", es decir,
que no produzcan anticuerpos) de la línea de meta
X63-Ag 8.653 por medio de polietilenglicol, g)
selección de células hibridomas así obtenidas con el cometido de
que en el excedente de las células hibridomas seleccionadas se
encuentren anticuerpos que se enlacen a las células de ratón que
expresen el CD28 humano y h) cultivo/subclonación de las células
hibridomas seleccionadas obtenidas en el nivel g. En el lugar de
los niveles de a) a d) pueden emplearse naturalmente otros sistemas
de expresión con los que el especialista se encuentre familiarizado.
El ADN complementario de CD28 humano puede adquirirse libremente
por medio del Dr. A. Aruffo y el Dr. B. Seed, que han publicado la
secuencia y también la siguiente nota bibliográfica: Aruffo, A., and
Seed, B, 1987, "Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high
efficiency COS cell expression system", Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84:8573. De esta nota bibliográfica puede tomarse en detalle,
pues, el ADN complementario de CD28 humano. Por lo demás todos los
especialistas, sin problema alguno y por medio de la secuencia
depuesta en el banco de genes y de la reacción de polimerización en
cadena, pueden producir de un modo muy sencillo y rápido un clon de
ADN complementario de CD28 humano. El vector
pH\betaAPr-l-neo puede adquirirse
libremente por medio de los autores de la posición bibliográfica
Gunning, P, et al., 1987, "A human
\beta-actin expression vector system directs
high-level accumulation of antisense
transcripts", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:4831. "neo" no
significa sino resistencia a la neomicina. El nivel c) se lleva a
cabo pues en ausencia de la neomicina. Las líneas celulares y/o los
microorganismos anteriormente mencionados se encuentran libremente
disponibles y pueden adquirirse comercialmente en la American Type
Culture Collection (ATCC). En relación a la escherichia coli
(MC1061) hacemos referencia complementariamente a la posición
bibliográfica de Meissner, P.S., et al., 1987,
"Bacteriophage gamma cloning system for the construction of
directional cDNA libraries", Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
84:4171.
La presentación galénica de los anticuerpos
monoclonales de la invención para las diversas formas de suministro
es bien conocida por los especialistas y no necesita ser ilustrada
aquí con más detalle. Especialmente, además de los componentes
activos relativos a la invención, pueden contenerse otras
substancias activas y/o otras substancias prácticas o necesarias
con vista a la presentación galénica. Ha de comprenderse que una
composición farmacológica según la invención ha de contener los
anticuerpos en una dosis terapéuticamente efectiva. Una dosis
terapéutica activa puede determinarse respecto de los diversos
organismos determinando la dosis misma que tenga por consecuencia
un aumento estadísticamente significante de la cantidad de células
sanguíneas no portadoras de CD28 en comparación con el estado
anterior al del suministro de la composición.
El invento incluye un método para la producción
de un medicamento destinado a la curación de las enfermedades
inicialmente mencionadas empleándose los anticuerpos monoclonales
relativos a la invención.
En adelante se ilustra la invención con más
detalle partiendo de unos ejemplos de ejecución.
Los experimentos representados o bien los
ejemplos relativos a los efectos de los anticuerpos monoclonales
"directos" específicos de CD28 se llevaron a cabo en el modelo
de la rata, respecto de lo cual en tanto ejemplo de un anticuerpo
específico de CD28 "clásico" se aplicó el anticuerpo
monoclonale JJ319 y en tanto ejemplo de uno "directamente"
activante se aplicó el anticuerpo monoclonal JJ316. Ambos
anticuerpos se encuentran libremente disponibles y pueden
adquirirse comercialmente en la empresa Pharmingen, San Diego, USA.
Los anticuerpos JJ319 y JJ316 puede adquirirse por lo demás según
la indicación bibliográfica de M. Tacke et al., Immunology,
1995, 154: 5121-5127, a la cual se hace aquí expresa
referencia también en relación a ciertos detalles de la producción
de células hibridomas y anticuerpos monoclonales.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se ilustra con más detalle la
producción del anticuerpo monoclonal empleado según la invención,
es decir, el humano específico de CD28. Estos se denominarán en
adelante también CMY-2. El CD28 humano procedente
de una biblioteca de ADN complementario fue expresado en líneas de
células A20J y/o L929 recombinantemente. Primeramente se creó a
este respecto un plásmido por medio de inserción de ADN
complementario de CD28 humano en el vector
pH\betaAPr-l-neo tras escisión del
fragmento SalI-HindIII. Partiendo de la
escherichia coli (MC1061) se produjeron protoplastos
portadores del plásmido. Tuvo después lugar la fusión de los
protoplastos con células tumorales A2OJ y/o L929 por medio de
polietilenglicol. Las células transferidas así obtenidas se
cultivaron del modo habitual. Seguidamente tuvo lugar una detección
sistemática por screen de las células transferidas de ratón A20J
y/o L929 a la expresión del CD28 humano y la selección del las
células de ratón A2OJ y/o L929 con expresión del CD28 humano.
La comprobación de que la expresión tuvo éxito
se llevó a cabo por medio de un anticuerpo convencional,
comercialmente adquirible, con marca fluorescente y especificidad
relativa al CD28 humano (9.3-ficoeritrina). En tanto
control negativo se colorearon células no transferidas A20J o bien
L929 con el mismo anticuerpo. Los transferidos
(A2OJ-CD28 y L929-CD28) mostraron
una intensidad fluorescente superior. Puesto que no todas las
células eran CD28-positivas, se subclonaron las
células CD28-positivas y se emplearon para la
inmunización. Como se reconoce en la figura 1, en el desplazamiento
de los cúmulos de puntos hacia arriba en ambos diagramas de la
derecha, reaccionan estas células con los anticuerpos que pueden
comprarse, o sea que expresan el CD28 humano en su superficie.
La línea celular A20J de CD28 humano se empleó
para la inmunización de ratones BALB/c. La fusión celular y la
detección sistemática (por screen) se llevaron a cabo de la
siguiente manera: i) inmunización de ratones BALB/c con las células
de ratón A2OJ expresantes de CD28 humano (seis inyecciones
intraperitoneales y seguidamente una vez intravenosa). ii) Toma de
células del bazo de los ratones así inmunizados y fusión de las
células del bazo con las células de la línea celular
X63-Ag 8.653 por medio de polietilenglicol. iii)
Selección de las células hibridomas así adquiridas con el cometido
de que en el excedente de las células hibridomas seleccionadas se
contengan anticuerpos que se enlacen a las células de ratón A2OJ y/o
L929 que expresen el CD28 humano.
En tanto read-out se
contaba con pigmentación de una mezcla de células tumorales de ratón
L929 con transferencia y sin transferencia de CD28. En la figura 2
se muestra que los anticuerpos monoclonales así aislados
diferenciaban células transferidas y no transferidas
CMY-2 de diferente intensidad fluorescente. La
detección sistemática por screen diferencial relativa a anticuerpos
frente al CD28 humano tuvo lugar de la siguiente manera. Se tomó en
cada caso 50 \mul de excedente de hibridomas celulares cultivados
y se incubaron durante 15 minutos con una mixtura de células L929 y
transfectantes L929-CD28. Tras el lavado se
colorearon las células con DaMIg-PE. La parte A
muestra el control negativo. Las células fueron incubadas sólo con
DaMIg-PE. La parte B muestra la pigmentación con un
excedente que era levemente positivo pero que no mostraba diferencia
alguna en ambas células. La parte C muestra las células coloreadas
con un excedente de CMY-2.
En los experimentos no representados se
colorearon células sanguíneas periféricas humanas con el nuevamente
aislado CMY-2 y el anticuerpo "clásico"
específico de CD28 9.3. Se encontró un modelo de expresión idéntico
en las subpoblaciones de células sanguíneas humanas.
En resumen mostraron los experimentos que el
CMY-2 es un anticuerpo humano específico de
CD28.
El CMY-2 se sometió entonces a
la comprobación relativa a la actividad clásica coestimulante y
"directamente" estimulante con linfocitos T humanos
procedentes de sangre periférica enriquecidos a un 80%. La
proliferación de células T fue medida por medio de la integración
de timidina ^{3}H entre los días segundo y tercero del cultivo.
Se obtuvieron los siguientes resultados.
Coestimulación:
células no estimuladas | 276 cpm |
anticuerpos específicos de CD3 | 3111 cpm |
anticuerpos específicos de CD3 + CMY-2 | 51676 cpm |
\vskip1.000000\baselineskip
Estimulación directa:
fase sólida anti-mouse Ig | 379 cpm |
fase sólida anti-mouse Ig-+ control mAk | 258 cpm |
fase sólida anti-mouse Ig más CMY-2 | 19115 cpm |
\vskip1.000000\baselineskip
Explicación: el anti CD3 se ocupa de la
estimulación del receptor celular T (CD3 es una parte del complejo
TCR). El CMY-2 se empleó en forma de un excedente de
cultivo no purificado (50º% del volumen final). Según la
experiencia la concentración efectiva de mAk que cabe esperar se
encuentra por debajo de óptimo con vistas a una activación directa,
no obstante es suficiente para la coestimulación. El experimento
muestra que el CMY-2 posee propiedades directamente
activantes.
Las células hibridomas relativas a la invención
y que producen CMY-2 se han depuesto en la DSMZ,
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
empresa sita en Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, con el número DSM ACC2353 (20.05.1998).
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento con mitógeno y no con el
anti-CD28 MAK convencional tiene por consecuencia
una rápida reconstitución de la cantidad de células T en ratas con
linfopenia T, lo cual se expone en adelante.
El plan experimental se representa en la figura
3. Las ratas obtenidas por consanguineidad PVG fueron sometidas a
la radiación gamma procedente de una fuente de cesio de tal manera
que el sistema reproductor de sangre, leucocitos incluidos, quedó
destruido. En tanto fuente de células madre generadoras de sangre se
les suministró a los animales células de la médula ósea
consanguínea intravenosamente. En el experimento 1 se les suministró
adicionalmente 5x10^{6} de células T CD4 y en el experimento 2
5x10^{6} de células T (CD4 y CDB) del mismo tronco consanguíneo
PVG.RT7^{b}. Estos animales son idénticos con el tronco
consanguíneo receptor PVG salvo por la molécula de superficie de
leucocitos RT7, de la que expresan el alelo b en lugar del a. Por
medio del MAK marcado por fluorescencia específico de RT7^{b}
pueden identificarse en los animales células T que proceden del
5x10^{6} de células T maduras inyectadas. Estos linfocitos T, que
maduran nuevamente en tanto linfocitos T procedentes de las células
precursoras inmaduras de la médula ósea inyectada en el timo de los
animales receptores, no reaccionan por el contrario con el MAK
marcado por fluorescencia específico de RT7^{b}. La cantidad de
5x10^{6} linfocitos T se corresponde aproximadamente a una
milésima de la cantidad de linfocitos T maduros de una rata adulta,
de modo que nos encontramos ante un modelo de de linfopenia T grave.
Para el aumento en el animal receptor de las células T inyectadas
se aplicó, de acuerdo al esquema de tratamiento mostrado, 1 mg del
mitógeno anti-CD28 MAK JJ316 intravenosamente
durante dos días (día 0 y día 10 en el experimento 1, día 0 y día
13 en el experimento 2). En los momentos indicados se tomo sangre de
los animales a y se determinó la cantidad de los linfocitos T
mediante medición de la cantidad total de leucocitos así como de la
porción de linfocitos T. Por lo demás se diferencia entre los
linfocitos T procedentes de las células T maduras inyectadas
(RT7^{b} positivo) y aquellos otros que se generaron nuevamente en
el timo (RT7^{b} negativo). Estos análisis fueron llevados a cabo
por medio de anticuerpos monoclonales con especificidad relativa a
los marcadores de superficie de células T. La técnica empleada es
la inmunofluorescencia de varios colores junto con la citofotometría
de flujo (análisis "FACS®").
En la figura 4 se representa el experimento 1,
es decir, la reconstitución con células CD4 T maduras. Los
diferentes tratamientos de los animales se han anotado en la abcisa;
cada uno de los animales se simboliza por medio de un punto. Ya tan
sólo nueve días tras el comienzo del experimento se mostró un avance
considerable de la cantidad de linfocitos T en la sangre periférica
del grupo tratado con el mitógeno anti-CD28 MAK
frente a los animales de control, a los que se suministró el
anti-CD28 MAK convencional o solamente una solución
salina tamponada con fosfato (PBS), que se empleó en tanto solución
para el MAK. Este avance se mantuvo hasta el último punto de
medición (día 36). Si se consideran solamente los linfocitos T
procedentes de las células T maduras RT7^{b} positivas CD4, el
efecto terapéutico del mitógeneno anti-CD28 MAK
resulta más dramático en comparación con el grupo de control. La
causa de esto viene a ser que con el avance del tiempo se generan
en el timo nuevas células T RT7^{b} negativas. El origen de estas
células T es independiente de la estimulación de anticuerpos y, en
todo caso no fue afectado por estos.
La figura 5 muestra el experimento 2, es decir,
la reconstitución con células T CD4 y CD8 maduras. De acuerdo al
esquema de la figura 3 se transfirieron 5x10^{6} RT7^{b}
linfocitos T positivos que consisten aproximadamente en 3/4 de
células T CD4 y 1/4 de células T CD8. La cantidad de células T en
sangre fue determinada como se describe en la figura 5. Cada una de
las líneas representa un animal experimental. Los símbolos abiertos
muestran el tratamiento con PBS, los cerrados el realizado con el
mitógeneno anti-CD28 MAK JJ316. Ambos gráficos
muestran el desarrollo de la cantidad de células RT7^{b}
positivas derivadas del inóculo celular T maduro, las dos
inferiores el RT7^{b} negativo originado nuevamente en el timo.
Los resultados muestran un rápido aumento de los linfocitos T
maduros CD4 y CD8 por medio del tratamiento con mitógeno anti CD28
MAK (arriba). La nueva formación de células T (abajo) que
posteriormente tuvo lugar no fue afectada por el tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se muestro que los linfocitos T
que se reprodujeron por medio de la terapia con
anti-CD28 son longevos y funcionan bien.
La figura 6 muestra el plano de ensayos y la
demostración de la proliferación de células T en los nódulos
linfáticos por medio de anti-CD28. El tratamiento de
los animales de ensayo se corresponde primeramente al esquema
ilustrado en la figura 4 del experimento 2. Tras 55 días se
sacrificó a los animales. El análisis de los linfocitos en los
nódulos linfáticos dio por resultado que tras el tratamiento PBS tan
sólo el 6% (3.33 del 47.9%) se derivó del inóculo inyectado al
principio del ensayo de células maduras RT7^{b} positivas; el
resto de las células T CD4 eran nuevas y se formaron en el timo
(RT7^{b} negativo). Por el contrario las células T CD4 RT7^{b}
positivas supusieron en el grupo sometido a terapia el 40%
aproximadamente (22.26 de 56.42%). Los "dot plots"
representados muestran por su parte los resultados del análisis de
citofotometría de flujo descrito en el ejemplo 3. Se emplearon
anticuerpos marcados fluorescentemente frente a CD4 (abcisa) y
RT7^{b} (ordenada). Este resultado muestra que la terapia llevada
a cabo al principio del ensayo (día 0 y día 13) tiene por
consecuencia una repoblación duradera con los linfocitos T
reproducidos por medio de la terapia con anti-CD28.
Los linfocitos T RT7^{b} positivos y RT7^{b} negativos se
separaron entre sí. Siguió después un enriquecimiento de las
células T por medio de una pasada a través de fibra lanosa de nylon.
Así pues las células T RT7^{b} positivas se cargaron con MAK
específico de RT7^{b} en que se enlazaron unas bolitas
paramagnéticas de hierro. Por medio de un imán tuvo lugar entonces
la separación de las células T RT7^{b} positivas y RT7^{b}
negativas. El sistema aquí empleado (y muy extendido en el mundo de
la investigación) de la empresa Miltenyi Biotech (sita en
Bergisch-Gladbach) se llama MACS (Magnetism
Activated Cell Sorting). Las células T RT7^{b} positivas y
RT7^{b} negativas así separadas se sometieron a un análisis
funcional (figuras de 7 a 9).
La Figura 7 muestra la proliferación in
vitro de las células T expandidas terapéuticamente en
vivo. Las células ilustradas en la figura 6, RT7^{b}
positivas aisladas, es decir las células T derivadas del inóculo
originalmente maduro así como las células T RT7^{b} negativas
("RT7^{3}" producidas nuevamente en el timo) se comprobaron
en un ensayo estándar de proliferación en cuanto a su reactividad
frente a la coestimulación convencional. A este respecto se
cultivaron células T 1x10^{5} en 0,2 ml de medio de cultura en
placa de microtiter de cuenco 96 durante dos días a 37ºC, seguido
ello de un pulso de 16 horas con timidina marcada 1 \muCi^{3}H.
La incorporación de ésta en el ADN se representa en tanto cpm x
10^{-3} y es una dimensión admisible para la actividad de la
división (proliferación) de las células. Las cuatro barras
superiores muestran enfoques en los que las células T fueron
estimuladas por medio de un MAK específico (R73) de receptor de
antígeno celular T (TCR) así como adicionalmente por medio de 15
MAKJJ319 específico de CD28 (coestimulación clásica). A este
respecto se reprodujeron las señales fisiológicas en la activación
de las células T. Las cuatro barras muestran la reacción de las
cuatro poblaciones diferentes de células T que fueron comprobadas,
es decir sendas RT7^{b} procedentes del inóculo originario de
células T maduras así como las células RT7^{a} nuevamente
generadas en el timo de ambos grupos de animales, a saber, el
sometido a la terapia con CD28 y el grupo de animales de control
tratados con PBS. El grupo inferior ("medio") muestra las
mismas células sin estimulación. Aquí no se observó proliferación
alguna. El ensayo muestra que incluso tras la expansión extensa
en vivo por medio de la terapia con CD28 se mantenía la
capacidad de reaccionar de los linfocitos.
La figura 8 muestra que las células T generadas
en vivo por medio de la terapia anti-CD28
reaccionan frente a antígenos extraños transplantados. El enfoque
del ensayo se corresponde en principio al ilustrado en la figura 7
excepto en que aquí la estimulación de las células T no se lleva a
cabo con ayuda de anticuerpos monoclonales, sino añadiendo células
estimuladoras del tronco LEW. Se trata de 10^{5} de células
irradiadas de nódulos linfáticos por cuenco. La irradiación se
lleva a cabo para que las células estimulantes mismas no cooperen a
la proliferación medida. El tronco LEW fue seleccionado por
diferenciarse por sus más potentes antígenos de trasplatación (de
acuerdo al antígeno HLA del ser humano) respecto del tronco PVG: LEW
expresa RT1^{1}, mientras que PVG, por el contrario, RT1^{c}.
Para determinar un valor básico se aplicó también al grupo inferior
células de nódulos linfáticos irradiadas PVG en tanto estimuladores.
El resultado muestra que de nuevo los cuatro grupos comprobados de
linfocitos T reaccionan a los antígenos de trasplantación extraños
con proliferación; por lo demás se muestra un aumento de la reacción
de fondo en las células T tanto del grupo sometido a terapia como
del grupo de control, que procede del inóculo originario de células
T (RT7^{b} positivas) maduras aplicado.
La figura 9 muestra que las células T
proliferadas en vivo por medio de la terapia con
anti-CD28 se encuentran en disposición de producir
citocina. Como se ilustra en la figura 7, las células T maduras
expandidas (RT7^{b+}) y las maduradas nuevamente en el timo
(RT7^{b-}, es decir las RT7^{a}) de las sometidas a terapia
anti-CD28 y las controladas in vitro se
activan por medio de coestimulación. Tras 5 días se colectaron las
células y se sometieron a comprobación (según un protocolo que
puede consultarse en el catálogo de la empresa Pharmingen/Becton
Dickinson) en cuanto a la aptitud reproductiva de la citocina
gamma-interferón e interleucina-4.
Estas dos citocinas se seleccionaron por ser características de
ambos tipos funcionales diversos de células T de Effektor CD4 que
pueden originarse tras la activación: las células estimulantes de la
inflamación TH1 producen interferón-gamma, las
células TH2 supresoras de la inflamación y estimuladoras de la
producción de anticuerpos TH2 producen IL-4. En
cuanto al método demostrativo se trata de una pigmentación
intracelular de citocina que se evalúa por medio de la
citofotometría de flujo. Cada punto que se encuentre por encima de
la línea de separación horizontal muestra una célula que sintetiza
la citocina indicada en la ordenada. Es notorio que los cuatro
grupos de linfocitos T contienen una fracción de células de
semejante tamaño que pueden producir
interferón-gamma. Por contrario las células que
producen IL-4 se encuentran solamente en aquellos
linfocitos T que fueron reproducidos en vivo por medio de la
terapia con mitógeno anti-CD28 (dot plot abajo a la
derecha). El experimento muestra que por medio de la expansión
en vivo con mitógeneno MAK específico de CD28 no se pierde la
capacidad de sintetizar citocina del tipo TH1. El que se den
células fenotipo TH2 (productoras W-4) no es
sorprendente.
\vskip1.000000\baselineskip
El enfoque de ensayo se corresponde al ilustrado
en la figura 3 con dos variantes: 1. Los animales recibieron
solamente una inyección de 1 mg de MAK el día 0; 2. A los animales
se les extirpó el timo antes de ser sometidos a irradiación y
reconstitución a fin de evitar la remaduración de las células T en
el timo. De este modo se reproduce la situación de la linfopenia en
personas adultas, por ejemplo tras una quimioterapia o radioterapia.
Las personas maduras a penas pueden producir nuevas células T en el
timo, ya que tras la pubertad el funcionamiento del timo concluye
prácticamente.
La figura 10 muestra el aumento de la cantidad
de células T en la sangre. No es necesario diferenciar entre
células RT7^{b} positivas y negativas, ya que todas las células T
son RT7^{b+} (falta de nueva producción de células T RT7^{b-}
en el timo). Los tres gráficos muestran las células T así como sus
subpoblaciones de CD4 y CD8 de tres animales terapeutizados con
anti-CD28 (símbolos rellenos) y tres animales
tratados con un anticuerpo de control del mismo tipo (símbolos
abiertos) cada uno. Como puede reconocerse fácilmente el
tratamiento de una dosis de 1 mg del mitógeno
anti-CD28 mAk JJ316 tuvo como consecuencia una
recuperación rápida de la cantidad de células T.
En la figura 11 puede reconocerse que las
células reproducidas en vivo por medio de la terapia con
anti-CD28 pueden inmunizarse. Los animales
referidos en la figura 10 fueron inmunizados durante cuatro semanas
tras el tratamiento con el antígeno modelo Keyhole Limpet
hemocianina (KLH) a fin de someter a prueba la capacidad de
funcionamiento de los linfocitos. Tras cuatro semanas más se
sacrificaron los animales y las células de los nódulos linfáticos
fueron sometidas a la comprobación de su aptitud de reaccionar ante
la estimulación de KLH proliferando. Una prueba de este tipo se
denomina de antígeno de "Recall"; semejantes pruebas se
emplean, por ejemplo, con las personas a fin de comprobar el éxito
de la inducción de la inmunidad T relativa a antígeno de vacuna
como el toxoide tetánico. El sistema de comprobaciones se
corresponde por principio general con el de las figuras 7 y 8, en
todo caso para la estimulación se empleó el antígeno de vacuna KLH.
Es algo claro que los animales de ambos grupos contaban con la
inmunidad celular T contra KLH como consecuencia de la vacuna. Esto
es igual de intenso en ambos grupos, ya que para la prueba in
vitro la cantidad de células por cuenco de cultivo se iguala de
modo que las diferencias en la expansión celular T terapéutica
previa se suprimen por medio del mitógeno anti-CD28
mAk.
La figura 12 muestra la producción de
anticuerpos contra el antígeno modelo KLH. La producción de
anticuerpos a través de los nódulos linfáticos B depende de la
función de los linfocitos T CD4. De los animales inmunizados con
KLH referidos en la figura 11 se tomó por este motivo sangre en los
momentos ilustrados en la abcisa y fueron sometidos a comprobación
relativa a la presencia de anticuerpos específicos de KLH en un
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Como muestra el gráfico
superior todos los animales sometidos a terapia con
anti-CD28 reaccionaron con la misma rápida cinética
a la inmunización (símbolos rellenos) mientras que dos de los tres
animales de control no mostraron reacción alguna; el tercero
reaccionó de modo semejante al del grupo sometido a terapia si bien
con cinética retardada (véase los gráficos de los resultados de
ELISA de los días 7, 14 y 21;, estos valores fueron medidos en una
segunda prueba; la densidad óptica medida no es directamente
comparable por este motivo con los gráficos superiores).
En un experimento que no se ilustra con ninguna
figura se mostró que los animales T-linfopénicos
sometidos a terapia con anti-CD28 rechazaban los
trasplantes de piel ajena. El combate de las células infectadas con
virus, de tumores y de bacterias intracelulares depende del
funcionamiento de las células proinflamatorias TH1. Por causa de la
presencia de las células TH2 productoras de IL-4
antiinflamatorio en los animales T-linfopénicos
sometidos a terapia con CD28 hubo de tenerse en cuenta la
posibilidad de que se suprimiera la inmunidad proinflamatoria,
"de mediación celular". Esto puede comprobarse partiendo de la
capacidad de los animales de rechazar un transplante de piel
extraña. También esta reacción depende de TH1. A los animales
sometidos a terapia con CD28 se les aplicó por ello un transplante
de piel del tronco LEW que expresa los alelos de RT1^{1} de los
antígenos de trasplantación fuertes, mientras que los animales PVG
sometidos a terapia portan RT1^{c}. A modo de control se
transfirió un transplante singénico PVG. Los ocho animales sometidos
a terapia rechazaron la piel extraña, mientras que aquellos de
tronco genéticamente idéntico la incorporaron. Ejemplar a este
respecto fue, por una parte, el LEW necrótico y, por otra parte, el
transplante PVG bien vascularizado en un animal. Por término medio
el rechazo en los animales sometidos a terapia sucedió más
rápidamente que en los animales de control. Este resultado confirma
que por medio de la terapia con anti-CD28 no se
pierde la inmunidad mediada por línea.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 13 muestra una cinética de la cantidad
de granulocitos tras el tratamiento con mAk
anti-CD28 convencional (símbolos abiertos) y
mitógeno (símbolos rellenos). Cada una de las línea representa un
animal. Las ratas LEW adultas recibieron 1 mg del mAk
anti-CD28 mitógeno JJ316 o del mAk
anti-CD28 JJ319 convencional aplicado
intravenosamente. La cantidad de los granulocitos en la sangre
periférica se constató en los momentos concretos por determinación
de la cantidad total de leucocitos así como de la porción de
granulocitos. Esta medición tuvo lugar con la citofotometría de
flujo y partiendo de las propiedades de dispersión lumínica especial
de los granulocitos. Como se muestra en la figura 13, en todos los
animales que recibieron el mitógeno mAk anti-CD28
se observó un dramático aumento de la cantidad de granulocitos, al
contrario que en el caso de los animales de control, a los que se
suministró el mAk anti-CD28 convencional.
La figura 14 muestra un ejemplo del aumento de
la cantidad de granulocitos en la sangre de los animales estimulados
con CD28. Los leucocitos se sometieron a comprobación en cuanto a
sus propiedades de dispersión lumínica por medio de una
citofotometría. FSC significa forward scatter o dispersión de
la luz hacia delante, SSC sideward scatter o bien la luz
desviada 90º, que es una dimensión relativa a la granularidad de las
células. Cada una de las líneas se representa por medio de un
punto. La nube rotulada muestra los granulocitos, cuyo porcentaje
es resultado directo de la medición; la cantidad de células añadidas
por microlitro de sangre se calcula por medio de la cantidad
anteriormente determinada de leucocitos por microlitro de sangre. Se
reconoce un aumento (que sobrepasa el límite de significancia) de
la cantidad de granulocitos tras el tratamiento con mAk
"directo" específico de CD28.
\vskip1.000000\baselineskip
Las ratas LEW adultas recibieron 1 mg del
mitógeno anti-CD28 mAk JJ316 (símbolos rellenos) o
del convencional anti-CD28 mAk JJ319 (símbolos
abiertos) intravenosamente. La cantidad de los monocitos en la
sangre periférica fue constatada en los momentos previstos por
determinación de la cantidad total de leucocitos así como su
porción de monocitos. Esta medición se realizó con la citofotometría
de flujo partiendo de las propiedades de dispersión lumínica
especiales de los monocitos así como de la expresión del antígeno
Mac-1, que fue constatada por medio del MAX 0X42
fluorescentemente marcado. Como se muestra en la figura 15, en todos
los animales que recibieron el mitógeno anti-CD28
mAk se observó un dramático aumento de la cantidad de monocitos, al
contrario que en los animales de control, los cuales recibieron el
anti-CD28 mAk convencional.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras afectación del sistema hematopoyético, por
ejemplo por causa de quimioterapia o radioterapia, han de
regenerarse también los granulocitos y monocitos del sistema
inmunológico congénito o natural. Puesto que los linfocitos T
activados pueden estimular esto mismo, por ejemplo por medio de
producción de citocina (G-CSP,
GM-CSF) y puesto que en los animales sanos se ha
observado un aumento de la cantidad de los granulocitos y monocitos
en la sangre tras el tratamiento con anti-CD28, se
sometió a comprobación la capacidad del mitógeno MAK
anti-CD28 de acelerar la recuperación de esta
población de leucocitos.
La figura 16 muestra el proceso cronológico de
la cantidad de granulocitos y monocitos en la sangre de ratas
irradiadas con médula ósea reconstituida tras la terapia con
anti-CD28.
A las ratas obtenidas por consanguineidad PVG se
les extirpó primeramente el timo a fin de evitar que remaduraran
las células T (de este modo se reproduce la situación de la
linfopenia en personas, por ejemplo tras una quimioterapia o
radioterapia; en las personas adultas el funcionamiento del timo ha
concluido prácticamente). Fueron sometidas a los efectos de los
rayos gamma procedentes de una fuente de cesio de tal modo que el
sistema generador de sangre, incluidos los glóbulos blancos, quedó
destruido. En tanto fuente de producción de células madre recibieron
los animales células de médula ósea del mismo tronco genético
consanguíneo intravenoso. Adicionalmente recibieron 5 x 10^{6}
células T CD4 o 5 x 10^{5} células T (CD4 y CD8) del tronco
genético consanguíneo PVG.RT7^{b}. Los animales de este tronco
son idénticos al tronco receptor PVG excepto en la molécula de la
superficie de los leucocitos RT7, de la cual expresan el alelo b en
lugar del a. Por medio del MAK específico de RT7b marcado
fluorescentemente pueden identificarse las células T de los animales
que procedan de las células T maduras inyectadas. La cantidad de
células T inyectadas se corresponde aproximadamente a una milésima
de la cantidad de de células T maduras de una rata adulta, de modo
que nos encontramos ante el modelo de una drástica linfopenia T. A
los animales se les suministró el día 0 1 mg de JJ316 o de
JJ319.
En el momento indicado se les tomó sangre y se
determinó la cantidad de células de acuerdo al ejemplo 7. De la
figura 16 se desprende una recuperación más rápida de la cantidad de
monocitos y granulocitos con el mAk aplicado según la invención, a
lo cual, en el caso de los granulocitos, se encontró una reacción
excedente los primeros días tras el tratamiento, la cual se
normalizó de nuevo.
La figura 17 muestra datos relativos a la
proporción de granulocitos en la sangre de ratas irradiadas con
médula ósea reconstituida tras la terapia con
anti-CD28. En tanto ejemplo se muestra una medición
de la proporción de granulocitos siete días tras el comienzo de la
terapia. El método se corresponde al descrito en el ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 18 muestra el plano del ensayo. A dos
monos adultos rhesus se les suministró intravenosamente una dosis
de 5 mg por kg de peso corporal de un mitógeno de mAk específico de
CD28. A fin de poder reconocer a tiempo el efecto tóxico que
posiblemente pudiera darse la dosis se repartió en tres subdosis de
0,25, 1,0 y 3,75 mg/kg de peso corporal que fueron aplicadas en el
espacio temporal de un día. El animal 1 no fue tratado, el animal 2
fue infectado 22 meses antes con un virus apatógeno
(SIV\Delta^{nef}). Esta infección no desempeñó ninguna función
respecto de los resultados aquí obtenidos y solamente se menciona
por de la exhaustividad. El animal 2, además, fue inmunizado dos
semanas antes del tratamiento con anticuerpos con un antígeno modelo
KLH. Ninguno de los animales mostró reacción tóxica perceptible a
la infusión de anticuerpos. En los momentos mostrados se les tomó a
los animales sangre destinada a los exámenes que describimos
seguidamente.
La figura 19 muestra la expresión
Ki-67 en células T de un mono rhesus estimulado con
CD28 (animal 2). La molécula Ki-67 se expresa en
núcleos de células que se encuentran en ciclo celular, es decir, que
se están dividiendo. Como muestra la figura, antes del tratamiento
se encontraba aproximadamente el 5% de las células T CD4 y el 5% de
las CD8 en fase de ciclo celular. Tras el tratamiento con CD28 (día
0) aumentó la frecuencia primeramente al 20, luego al 45% en ambas
poblaciones y, después, se precipitó regresando al 10%. Este
resultado muestra que la estimulación en vivo con CD28 es
efectiva en cuanto a la proliferación de las células T CD4 y
CD8.
\newpage
Las figuras de 20 a 22, que son esenciales en
cuanto a la invención, muestran finalmente el aumento que puede
obtenerse de la cantidad de granulocitos, monocitos y trombocitos en
la sangre periférica de monos rhesus sometidos a terapia con
anti-CD28. Los esquemas sanguíneos se obtuvieron en
un laboratorio hematológico con un aparato CellDyn 4000 y se
representan aquí en tanto células/microlitros de sangre en proceso
cronológico. La figura 20 manifiesta el aumento de la cantidad
granulocitos neutrófilos en la sangre periférica de monos rhesus
sometidos a terapia con anti-CD28.
Ambos animales mostraron un dramático aumento en
comparación al valor inicial. Esto mismo se obtuvo de nuevo con el
animal 1 tras un mes, con el animal 2 un poco después. Gracias a la
terapia puede ser innecesario el tratamiento habitual con
G-CSF en la trasplantación de médula ósea. La figura
21 demuestra el aumento de la cantidad de monocitos en la sangre
periférica de monos rhesus sometidos a terapia con
anti-CD28. En ambos animales se observó un aumento
considerable respecto del valor inicial con igualación lenta al
valor normal durante los dos meses siguientes. La figura 22
demuestra el aumento de la cantidad de monocitos en la sangre
periférica de monos rhesus sometidos a terapia con
anti-CD28. Ambos animales mostraron un dramático
aumento en comparación al valor inicial. Esto mismo se obtuvo de
nuevo con el animal 1 tras un mes, con el animal 2 algo antes.
Claims (1)
1. Empleo de anticuerpos monoclonales
específicos de CD28 y linfocitos T de varios subgrupos a todos los
subgrupos sin ocupación de un receptor de antígeno de linfocitos T
y, por ende, activación antigénica específica para la producción de
una composición farmacéutica destinada al tratamiento de
enfermedades en que se dé una reducción de la cantidad de células
sanguíneas, que no porten CD28, a lo cual la enfermedad ha de
adscribirse al grupo conformado por "granulocitopenia,
especialmente neutropenia y monocitopenia, trombocitopenia, anemias
aplásticas, deficiencia de la médula ósea con aplasia/hipoplasia de
la médula ósea misma, pancitopenia, anemia de Fanconi, anemias
aplásticas adquiridas, especialmente anemia aplástica idiopática y
anemias aplásticas secundarias así como anemia, trombocitopenia y/o
granulocitopenia en casos de leucemia aguda".
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10050935A DE10050935A1 (de) | 2000-10-11 | 2000-10-11 | Verwendung CD28 spezifischer monoklonaler Antikörper zur Stimulation von Blutzellen, welche kein CD28 tragen |
DE10050935 | 2000-10-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2327611T3 true ES2327611T3 (es) | 2009-11-02 |
Family
ID=7659771
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES01986609T Expired - Lifetime ES2327611T3 (es) | 2000-10-11 | 2001-09-28 | Empleo de antucuerpos monoclonales especificos de cd28 para estimular celulas sanguineas sin cd28. |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040247594A1 (es) |
EP (1) | EP1331944B1 (es) |
AT (1) | ATE431746T1 (es) |
AU (1) | AU2002223462A1 (es) |
DE (2) | DE10050935A1 (es) |
DK (1) | DK1331944T3 (es) |
ES (1) | ES2327611T3 (es) |
PT (1) | PT1331944E (es) |
WO (1) | WO2002030459A1 (es) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10230223A1 (de) * | 2002-07-04 | 2004-01-22 | Tegenero Ag | Mikropartikel mit CD28-spezifischen monoklonalen Antikörpern |
EP1460088A1 (en) * | 2003-03-21 | 2004-09-22 | Biotest AG | Humanized anti-CD4 antibody with immunosuppressive properties |
EP1600164A3 (de) * | 2003-09-22 | 2006-05-17 | TeGenero AG | Verwendung einer an CD28 bindenden Wirksubstanz zur Herstellung einer Pharmazeutischen Zusammensetzung mit dosisabhängiger Wirkung |
US8222206B2 (en) | 2008-03-04 | 2012-07-17 | Taiwan Advance Bio-Pharm Inc. | Method of enhancing the mobilization of hematopoietic stem cells using TAT-HOXB4H |
BRPI0909048A2 (pt) * | 2008-03-13 | 2015-11-24 | Biotest Ag | composição farmacêutica, e, método de tratamento de uma doença autoimune |
HUE028962T2 (en) * | 2008-03-13 | 2017-01-30 | Biotest Ag | Active ingredient for treating disease |
WO2009112502A1 (en) * | 2008-03-13 | 2009-09-17 | Biotest Ag | Agent for treating disease |
JP2012504110A (ja) * | 2008-09-29 | 2012-02-16 | バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト | 疾患治療組成物 |
GB0920944D0 (en) | 2009-11-30 | 2010-01-13 | Biotest Ag | Agents for treating disease |
KR20210035805A (ko) | 2018-06-15 | 2021-04-01 | 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. | 세포후 신호전달 인자의 조절을 통한 면역 활성의 증가 |
WO2020227159A2 (en) | 2019-05-03 | 2020-11-12 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Methods of modulating immune activity |
US20230114107A1 (en) | 2019-12-17 | 2023-04-13 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly |
CN116096906A (zh) | 2020-06-29 | 2023-05-09 | 旗舰创业创新五公司 | 工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途 |
US20220325287A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-10-13 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer |
US20240316104A1 (en) | 2021-06-29 | 2024-09-26 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof |
WO2024040194A1 (en) | 2022-08-17 | 2024-02-22 | Capstan Therapeutics, Inc. | Conditioning for in vivo immune cell engineering |
US20240174732A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-05-30 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer |
WO2024151687A1 (en) | 2023-01-09 | 2024-07-18 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Genetic switches and their use in treating cancer |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19722888A1 (de) * | 1997-05-28 | 1998-12-03 | Thomas Prof Dr Huenig | Human-CD28 spezifische monoklonale Antikörper zur antigenunspezifischen Aktivierung von T-Lymphozyten |
-
2000
- 2000-10-11 DE DE10050935A patent/DE10050935A1/de not_active Ceased
-
2001
- 2001-09-28 ES ES01986609T patent/ES2327611T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-28 EP EP01986609A patent/EP1331944B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-28 PT PT01986609T patent/PT1331944E/pt unknown
- 2001-09-28 DE DE50114906T patent/DE50114906D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-28 AT AT01986609T patent/ATE431746T1/de active
- 2001-09-28 AU AU2002223462A patent/AU2002223462A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-28 DK DK01986609T patent/DK1331944T3/da active
- 2001-09-28 US US10/399,056 patent/US20040247594A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-28 WO PCT/DE2001/003802 patent/WO2002030459A1/de active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PT1331944E (pt) | 2009-08-21 |
EP1331944B1 (de) | 2009-05-20 |
DE50114906D1 (de) | 2009-07-02 |
ATE431746T1 (de) | 2009-06-15 |
DK1331944T3 (da) | 2009-09-14 |
DE10050935A1 (de) | 2002-05-02 |
US20040247594A1 (en) | 2004-12-09 |
WO2002030459A1 (de) | 2002-04-18 |
EP1331944A1 (de) | 2003-08-06 |
AU2002223462A1 (en) | 2002-04-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2327611T3 (es) | Empleo de antucuerpos monoclonales especificos de cd28 para estimular celulas sanguineas sin cd28. | |
ES2891578T3 (es) | Antígeno quimérico y receptores de células T y métodos de uso | |
Ali et al. | T cells expressing an anti–B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of multiple myeloma | |
Barber et al. | Treatment of multiple myeloma with adoptively transferred chimeric NKG2D receptor-expressing T cells | |
ES2871349T3 (es) | Expansión selectiva y controlada de células NK educadas | |
Rosenberg | Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer—what clinicians need to know | |
Romee et al. | Utilizing cytokines to function‐enable human NK cells for the immunotherapy of cancer | |
JP2022023194A (ja) | 自己免疫および同種免疫への治療的介入としてのキメラ抗原受容体(car)t細胞 | |
KR20190130624A (ko) | 세포 면역치료요법 전 세포독성 사전컨디셔닝의 대체 | |
JP2020528744A (ja) | がん細胞を標的化するキメラ抗原受容体のための方法および組成物 | |
TW201803897A (zh) | Flt3之嵌合受體及其使用方法 | |
CN107075479A (zh) | 分离对癌症特异性突变具有抗原特异性的t细胞的方法 | |
CN107074932A (zh) | 分离对癌症特异性突变具有抗原特异性的t细胞受体的方法 | |
ES2333790T3 (es) | Microparticulas con anticuerpos monoclonales espacificos de cd28. | |
ES2910227T3 (es) | Composición y métodos para la estimulación y expansión de células T | |
Drakes et al. | Optimization of T-cell receptor–modified T cells for cancer therapy | |
KR20210105344A (ko) | 암 치료용 물질 및 방법 | |
Nash et al. | Clinical translation of immunomodulatory therapeutics | |
Zhang et al. | Chimeric antigen receptor-based natural killer cell immunotherapy in cancer: from bench to bedside | |
CA3219148A1 (en) | Pd-1 gene-edited tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy | |
JP2024050551A (ja) | マウス定常領域を伴うtcrを発現する細胞を選択的に増幅するための方法 | |
WO2020187340A2 (es) | Método para la expansión y diferenciación de linfocitos t y células nk en terapias de transferencia adoptiva | |
JP2024511414A (ja) | 腫瘍浸潤リンパ球のcish遺伝子編集及び免疫療法におけるその使用 | |
Breznik et al. | Natural killer cells in the treatment of glioblastoma: Diverse antitumor functions and potential clinical applications | |
KR20220152220A (ko) | Cd19-지시된 키메라 항원 수용체 t 세포 조성물 및 이의 방법 및 용도 |