ES2326077T3 - Nucleotidos marcados. - Google Patents
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Abstract
Un nucleótido o nucleósido que tiene una base unida a un marcador detectable por un enlazador escindible, caracterizado por que el enlazador escindible contiene un resto seleccionado del grupo que comprende: en el que X se selecciona del grupo que comprende O, S, NH y NQ donde Q es un grupo alquilo C1-10 sustituido o no sustituido, Y se selecciona del grupo que comprende O, S, NH y N(alilo), T es hidrógeno o un grupo alquilo C1-10 sustituido o no sustituido y * indica dónde se conecta el resto a la parte restante del nucleótido o nucleósido.
Description
Nucleótidos marcados.
Esta invención se refiere a nucleótidos
marcados. En particular, esta invención describe nucleótidos que
tienen un marcador detectable que se puede eliminar y su uso en
métodos de secuenciación de polinucleótidos.
Los avances en el estudio de moléculas se han
realizado, en parte, por mejora en las tecnologías usadas para
caracterizar las moléculas o sus reacciones biológicas. En
particular, el estudio de los ácidos nucleicos ADN y ARN se ha
aprovechado de tecnologías en desarrollo usadas para el análisis de
secuencia y el estudio de acontecimientos de hibridación.
Un ejemplo de las tecnologías que han mejorado
el estudio de ácidos nucleicos, es el desarrollo de matrices
fabricadas de ácidos nucleicos inmovilizados. Estas matrices
consisten típicamente en una matriz de alta densidad de
polinucleótidos inmovilizados sobre un material de soporte sólido.
Véase, por ejemplo, Fodor et al., Trends Biotech. 12:
19-26, 1994, que describe formas de ensamblar los
ácidos nucleicos usando una superficie de vidrio sensibilizada
químicamente protegida por una máscara, pero expuesta en áreas
definidas para permitir la unión de fosforamiditas de nucleótidos
modificados adecuadamente. Las matrices fabricadas también se pueden
fabricar mediante la técnica de "aplicación puntual" de
polinucleótidos conocidos sobre un soporte sólido en posiciones
predeterminadas (por ejemplo, Stimpson et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92: 6379-6383, 1995).
Un desarrollo adicional en la tecnología de
matriz es la unión de los polinucleótidos al material de soporte
sólido para formar matrices de una sola molécula. Las matrices de
este tipo se describen en la Solicitud de Patente Internacional WO
00/06770. La ventaja de estas matrices es que las reacciones se
pueden controlar a nivel de una sola molécula y la información de
grandes números de moléculas individuales se puede cotejar a partir
de una única reacción.
Para que las matrices de ADN sean útiles, se
tienen que determinar las secuencias de las moléculas. La Patente
de Estados Unidos Nº 5.302.509 describe un método para secuenciar
polinucleótidos inmovilizados sobre un soporte sólido. El método
depende de la incorporación de bases A, G, C y T bloqueadas en 3',
cada una de las cuales tiene un marcador fluorescente distinto, en
el polinucleótido inmovilizado, en presencia de ADN polimerasa. La
polimerasa incorpora una base complementaria al polinucleótido
diana, pero se evita otra adición mediante el grupo de bloqueo 3'.
Después, se puede determinar el marcador de la base incorporada y el
grupo de bloqueo se puede eliminar mediante escisión química para
permitir que tenga lugar polimerización adicional.
Welch et al., (Chem. Eur. J.
5(3): 951-960, 1999) describe la síntesis de
nucleótidos trifosfato modificados con un grupo de bloqueo
3'-O- que es fotolábil y fluorescente. Los
nucleótidos modificados tienen por objeto el uso en experimentos de
secuenciación de ADN. Sin embargo, esos nucleótidos demostraron ser
difíciles de incorporar en un polinucleótido existente, debido a
una incapacidad para encajar en el sitio activo de la enzima
polimerasa.
Zhu et al. (Cytometry 28:
206-211, 1997) también describe el uso de marcadores
fluorescentes unidos a un nucleótido por el grupo base. Los
nucleótidos marcados tienen por objeto el uso en experimentos de
hibridación in situ fluorescente ("FISH"), donde se
requiere una serie de nucleótidos marcados incorporados para
producir un "código de barras" fluorescente.
El documento WO99/57321 describe el uso de
nucleótidos que comprenden fluoróforos enlazados al nucleótido
mediante restos enlazadores escindibles químicamente o
fotoquímicamente.
Los documentos WO00/53812 y
EP-A2-1 291 354 describen compuestos
de nucleótidos de estructura general
Fluoróforo-S-S-Enlazador-Nucleótido
y su uso en métodos de ensayo de ácidos nucleicos. El documento WO
00/53812 también hace referencia a la escisión con periodato de un
enlace cis-glicol entre el nucleótido y el
fluoróforo.
El documento WO 01/92284 describe el uso de
grupos escindibles por enzimas que unen restos de bloqueo e
indicadores a nucleótidos. Se prefiere que esos grupos escindibles
por enzimas sean los mismos, es decir, que tanto los restos de
bloqueo como los indicadores se unan al nucleótido mediante una
cadena que comprende un grupo escindible por una enzima común. Los
grupos escindibles descritos en el documento WO 01/92284 son ésteres
y amidas, escindibles respectivamente por esterasas y amidasas.
El documento WO02/29003 describe análogos de
nucleótidos que contienen un marcador unido mediante enlazadores
escindibles a la base de nucleótido o a un análogo de la base. Se
describen enlazadores fotoescindibles que comprenden restos
2-nitrobencilo.
Los presentes inventores han observado
sorprendentemente que ciertos enlazadores que conectan las bases de
nucleótidos a marcadores separables, por ejemplo, fluoróforos, se
pueden escindir usando fosfinas solubles en agua o catalizadores de
metales de transición solubles en agua formados a partir de un metal
de transición y ligandos al menos parcialmente solubles en agua.
Los últimos forman en solución acuosa complejos de metales de
transición al menos parcialmente solubles en agua.
Los nucleótidos marcados que comprenden tales
enlazadores y métodos para usar los mismos son claramente ventajosos
en el contexto de técnicas llevadas a cabo en medios acuosos tales
como reacciones de secuenciación, síntesis de polinucleótidos,
amplificación de ácidos nucleicos, ensayos de hibridación de ácidos
nucleicos, estudios de polimorfismo de un solo nucleótido y otras
técnicas que usan enzimas tales como polimerasas, transcriptasas
inversas, transferasas terminales u otras enzimas modificadoras de
ADN. La invención es especialmente útil en técnicas que usan dNTP
marcados, tales como traslado de mella, el marcado con cebador al
azar, marcado de extremo (por ejemplo, con
desoxinucleotidiltransferasa terminal), transcripción inversa o
amplificación de ácidos nucleicos.
De acuerdo con un primer aspecto de la
invención, se proporciona un nucleótido o nucleósido que tiene una
base unida a un marcador detectable por un enlazador escindible,
caracterizado por que el enlazador escindible contiene un resto
seleccionado del grupo que comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(en el que X se selecciona del
grupo que comprende O, S, NH y NQ donde Q es un grupo alquilo
C_{1-10} sustituido o no sustituido, Y se
selecciona del grupo que comprende O, S, NH y N(alilo), T es
hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-10} sustituido
o no sustituido y * indica dónde se conecta el resto a la parte
restante del nucleótido o
nucleósido).
De acuerdo con un segundo aspecto de la
invención, se proporciona un método para escindir un enlazador que
contiene un resto seleccionado del grupo que comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(en el que X se selecciona del
grupo que comprende O, S, NH y NQ donde Q es un grupo alquilo
C_{1-10} sustituido o no sustituido, Y se
selecciona del grupo que comprende O, S, NH y N(alilo), T es
hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-10} sustituido
o no sustituido y * indica dónde se conecta el resto a la parte
restante de un nucleótido o nucleósido), estando presente dicho
enlazador en el nucleótido o nucleósido y conectando la base del
mismo a un marcador detectable, comprendiendo dicho método poner en
contacto el nucleótido o nucleósido con un catalizador de metal de
transición basado en fosfina soluble en
agua.
\newpage
De acuerdo con un tercer aspecto de la
invención, se proporciona un método para escindir un enlazador que
contiene un resto seleccionado del grupo que comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(en el que X se selecciona del
grupo que comprende O, S, NH y NQ donde Q es un grupo alquilo
C_{1-10} sustituido o no sustituido, T es
hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-10} sustituido o
no sustituido y * indica dónde se conecta el resto a la parte
restante de un nucleótido o nucleósido), estando presente dicho
enlazador en el nucleótido o nucleósido y conectando la base del
mismo a un marcador detectable, comprendiendo dicho método poner en
contacto el nucleótido o nucleósido con una fosfina soluble en
agua.
El método de acuerdo con el segundo y tercer
aspecto de la invención es particularmente útil en reacciones de
secuenciación. Tales reacciones constituyen un aspecto adicional de
la invención. Visto desde este aspecto, la invención proporciona un
método para determinar una identidad de un nucleótido en un
polinucleótido diana monocatenario, que comprende:
- (a)
- proporcionar uno o más de los nucleótidos A, G, C y T o U en los que cada uno de dichos nucleótidos tiene una base que está unida a un marcador detectable distinto por un enlazador de acuerdo con el primer aspecto de la invención, siendo escindible dicho enlazador con una fosfina soluble en agua: y un polinucleótido naciente complementario al polinucleótido diana, siendo uno de dichos nucleótidos proporcionados adecuado para incorporación en dicho polinucleótido naciente.
- (b)
- incorporar el nucleótido adecuado para incorporación en dicho polinucleótido naciente; y
- (c)
- realizar un método de acuerdo con el segundo o tercer aspecto de la invención.
La Figura 1 muestra estructuras ejemplares de
nucleótidos útiles en la invención. Para cada estructura, X puede
ser H, fosfato, difosfato o trifosfato. R_{1} y R_{2} pueden ser
iguales o diferentes y pueden seleccionarse de H, OH o cualquier
grupo que pueda transformarse en un OH.
La Figura 2 muestra algunas moléculas
funcionales útiles en la invención, lo que incluye algunos
enlazadores escindibles. En estas estructuras, R_{1} y R_{2}
pueden ser iguales o diferentes y pueden ser H, OH o cualquier
grupo que pueda transformarse en un grupo OH, incluyendo un
carbonilo. R_{3} representa uno o más sustituyentes seleccionados
independientemente de grupos alquilo, alcoxilo, amino o halógeno.
Alternativamente, los enlazadores escindibles pueden construirse a
partir de cualquier funcionalidad inestable usada en el bloque
3'.
La Figura 3 es una ilustración esquemática de
algunos de los grupos de bloqueo de OH 2' y 3' que pueden estar
presentes en los nucleótidos y nucleósidos de acuerdo con la
invención.
La Figura 4 muestra dos ciclos de incorporación
de un nucleósido trifosfato T completamente funcional frente a un
molde poli A.
Cada una de las moléculas de nucleótido o
nucleósido de la invención tiene una base que está enlazada a un
marcador detectable por enlazadores que pueden escindirse por
contacto con fosfinas solubles en agua o catalizadores que
contienen metales de transición solubles en agua descritos más
adelante en este documento con más detalle. Preferiblemente, el
resto "T" es hidrógeno. La base puede ser una purina o una
pirimidina. La base puede ser una desazapurina. La molécula puede
tener un resto azúcar ribosa o desoxirribosa. El azúcar ribosa o
desoxirribosa puede incluir un grupo protector unido por el átomo
de oxígeno 2' y 3'. El grupo protector puede eliminarse para
exponer un -OH 3'. La molécula puede ser un desoxirribonucleótido
trifosfato. El marcador detectable puede ser un fluoróforo.
La invención también incluye oligonucleótidos
que comprenden uno o más nucleótidos de la invención.
Preferiblemente, al menos un nucleótido de la invención está
presente en una posición terminal en tal oligonucleótido.
El enlazador puede unirse a la posición 5 en
pirimidinas y a la posición 7 en purinas o desazapurinas. El rasgo
característico de los nucleótidos y nucleósidos de la presente
invención es la susceptibilidad del enlace a escisión por ciertas
fosfinas solubles en agua o catalizadores de metales de transición
basados en fosfina. Ya que los oligonucleótidos se manipulan en
solución acuosa, las ventajas de esta solubilidad en agua son
evidentes.
Cada uno de los enlaces escindibles presentes en
los nucleósidos y nucleótidos de la invención comprenden un grupo
alilo o azido.
Cuando los enlazadores comprenden un grupo que
contiene azida, los enlazadores pueden contener un resto de la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
Estos restos pueden estar presentes en cualquier
orientación en el enlazador que conecta la base del
nucleótido/nucleósido con el marcador detectable, esto quiere decir
que cualquiera de los enlaces mostrados que terminan en asteriscos
en cada resto puede estar más cerca de la base (o del marcador) en
cada nucleótido o nucleósido que el otro asterisco mostrado en cada
estructura. Por tanto, la invención incluye nucleótidos y
nucleósidos que tienen esquemáticamente las siguientes estructuras
(mostradas a la izquierda) que se pueden hacer reaccionar con las
fosfinas solubles en agua (descritas más adelante en este documento
con más detalle) para generar los productos mostrados a la derecha
en los que se ha escindido el enlazador que contiene azido:
Mientras los puntos de conexión * indican los
puntos en los que los restos se conectan al nucleótido o nucleósido,
se entenderá que estos puntos son generalmente los puntos a los que
se conecta el resto a la parte restante del enlazador. En otras
palabras, los restos descritos en este documento que contienen
grupos alilo o azido son generalmente parte, en vez de constituir
exclusivamente, del enlazador escindible.
Cuando el resto es de fórmula
-X-CH(N_{3})-, la naturaleza de los
sustituyentes a cualquier lado del resto
-X-CH(N_{3})- afecta a la estabilidad del
resto y, por tanto, a la velocidad a la que se escinde. Por ejemplo,
cuando el enlace contiene un grupo arilo sustituido unido al resto
en que los sustituyentes (indicados como "R" en las
estructuras inmediatamente siguientes) son aceptores de electrones,
esto se manifiesta en el modo en el que se escinde el resto. Por
ejemplo, los grupos aceptores de electrones sirven para estabilizar
el enlace particularmente cuando X es O o S. Esto hace que la
escisión ocurra más lentamente.
A continuación se muestra esquemáticamente los
resultados de cuatro escisiones de construcciones esquemáticas de
nucleótidos y una representación esquemática adicional de una
construcción preferida. Las líneas de puntos que conectan
"fluor", "dNTP" o el grupo R al anillo de benceno o a los
restos escindibles indican que la sustitución puede ser en
cualquiera posición libre del anillo de benceno y que otros átomos
(no mostrados) en el enlazador pueden estar presentes del motivo
escindible mostrado y el nucleótido y el marcador detectable que
conecta el enlazador:
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando los restos azida son enlazadores Sieber,
es decir, son de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
la escisión del resto tiene lugar
en el enlace que une el anillo central de 6 miembros del triciclo
con la amida, de tal manera que un grupo amida terminal se deja
colgante en cualquiera de la base o el fluoróforo después de la
escisión.
\newpage
Se entenderá que los restos enlazadores Sieber
que contienen azida pueden contener uno o más sustituyentes que
pueden ser grupos donadores de electrones (los ejemplos incluyen
grupos alquilo o alcoxi, por ejemplo, alquilo
C_{1-6} o alcoxi C_{1-6}) o
aceptores de electrones (por ejemplo, nitro, ciano, fluoro etc.) La
introducción de tales sustituyentes posibilita al especialista
ajustar las condiciones en las que se puede efectuar la
escisión.
Cuando los nucleótidos comprenden un grupo azida
en el enlazador, el mismo se puede convertir en el grupo amina
primaria con un tiol (en lugar de las fosfinas), preferiblemente un
tiol soluble en agua como ditiotreitol (DTT).
Cuando los enlazadores comprenden un grupo
alilo, los mismos pueden ser de las fórmulas:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como con los restos que contienen azido que se
han analizado anteriormente, estos restos enlazadores pueden estar
presentes en cualquier orientación en el enlazador que conecta la
base del nucleótido/nucleósido con el marcador detectable.
Cuando los enlaces comprenden restos que
contienen alilo, estos enlazadores pueden escindirse con
catalizadores de metales de transición solubles en agua formados
por un metal de transición y ligandos al menos parcialmente
solubles en agua. Estos forman en solución acuosa complejos de
metales de transición al menos parcialmente solubles en agua.
Las especies de metales de transición sirven
para eliminar el grupo alilo. Cuando el grupo alilo es parte de
carbamato, la desalilación proporciona el correspondiente ácido
carbámico. Éste se descarboxila espontáneamente para proporcionar
un hemiaminal que se hidroliza para efectuar la escisión del
enlazador. Las químicas correspondientes funcionan con el
tiocarbamato análogo y carbonatos para generar compuestos que
contienen restos de estructura
*-C(NH_{2})-X-*. Estos desaparecen por
hidrólisis, escindiendo nuevamente el enlazador.
Con solución acuosa se quiere decir en este
documento un líquido que comprende al menos 20% en volumen,
preferiblemente al menos el 50%, por ejemplo, al menos el 75% en
volumen, particularmente al menos el 95% en volumen y especialmente
más del 98% en volumen, de forma ideal el 100% en volumen de agua
como la fase continua.
Los metales de transición de uso en la formación
de los catalizadores descritos en este documento son preferentemente
platino, paladio, rodio, rutenio, osmio e iridio. Se prefiere
particularmente el paladio.
El metal de transición, por ejemplo, paladio, se
introduce convenientemente como una sal, por ejemplo, como un
haluro. También se pueden usar sales mixtas tales como
Na_{2}PdCl_{4}. El especialista determinará fácilmente otras
sales y compuestos apropiados y están disponibles en el mercado, por
ejemplo, en la Aldrich Chemical Company.
Las fosfinas adecuadas son cualquier fosfina o
ligandos mixtos de nitrógeno-fosfina conocidos por
los especialistas en la técnica, caracterizados por que los
ligandos se derivatizan para convertir los mismos en solubles en
agua, por ejemplo, introduciendo uno o más restos sulfonato, amina,
hidroxilo (preferiblemente una pluralidad de hidroxilo) o
carboxilato. Cuando están presentes restos amina, la formación de
sales de amina puede ayudar a la solubilización del ligando y, por
tanto, del complejo metal-alilo. Son ejemplos de
ligandos apropiados las triaril fosfinas, por ejemplo, trifenil
fosfina, derivatizados para hacer que sean solubles en agua. También
se prefieren trialquil fosfinas, por ejemplo,
tri-alquil-C_{1-6}
fosfinas tales como trietil fosfinas; tales trialaquil fosfinas se
derivatizan del mismo modo para que sean solubles en agua. Las
fosfinas que contienen sulfonato y que contienen carboxilato se
prefieren particularmente; un ejemplo de las primeras es
3,3',3''-fosfinidinotris(ácido
bencenosulfónico) que está disponible en el mercado en la Aldrich
Chemical Company como la sal trisódica; y un ejemplo preferido de
las últimas es
tris(2-carboxietil)-fosfina
que está disponible en Aldrich como la sal clorhidrato. Las
fosfinas derivatizadas solubles en agua y fosfinas que contienen
nitrógeno descritas en este documento se pueden usar como sus sales
(por ejemplo, como las sales clorhidrato o sódicas) o, por ejemplo,
en el caso de las fosfinas que contienen ácido sulfónico o
carboxílico descritas en este documento, como los ácidos libres.
Por tanto, 3,3',3''-fosfinidinotris-(ácido
bencenosulfónico) y
tris(2-carboxietil)-fosfinas
pueden introducirse como los triácidos o como las sales trisódicas.
Otras sales apropiadas serán evidentes para los especialistas en la
técnica. La existencia en forma de sal no es particularmente
importante con tal de que las fosfinas sean solubles en solución
acuosa.
\newpage
Otras fosfinas que se pueden usar incluyen las
siguientes:
El especialista será consciente de que los
átomos quelados al metal de transición en el complejo soluble en
agua pueden ser parte de ligandos mono- o polidentados. Algunos de
tales ligandos polidentados se han mostrado anteriormente. Aunque
se prefieren ligandos monodentados, la invención, por tanto, también
incluye métodos que usan ligandos de fosfina solubles en agua bi-,
tri-, tetra-, penta- y hexadentados y ligandos de fosfina que
contienen nitrógeno solubes en agua.
Como se ha señalado anteriormente, la solución
acuosa en la que se realiza la desprotección no necesita ser al
100% (como la fase continua). Sin embargo, se prefiere agua
sustancialmente pura (por ejemplo, al menos el 98% en volumen y
preferiblemente aproximadamente el 100% en volumen). Generalmente no
se requieren codisolventes. Generalmente, los nucleótidos y
nucleósidos son fácilmente solubles en agua (por ejemplo, agua pura)
en la que se puede efectuar la escisión del enlace que se describe
en este documento. Si se desea, se pueden emplear uno más
codisolventes misicibles en agua. Los disolventes apropiados
incluyen acetonitrilo o dimetilsulfóxido, metanol, etanol y
acetona, prefiriéndose el metanol. Los disolventes menos preferidos
incluyen tetrahidrofurano (THF) y dioxano.
En los métodos de escisión de restos que
contienen alilo de acuerdo con la invención, se forma un completo
metálico soluble que comprende un metal de transición y uno o más
ligandos de fosfina solubles en agua (incluyendo ligandos de
fosfina que contienen nitrógeno solubles en agua). Se puede usar más
de un tipo de ligando de fosfina/fosfina que contiene nitrógeno
soluble en agua en cualquier reacción dada, aunque generalmente sólo
se usará un tipo de estas clases de ligando para cualquier
catalizador dado. La cantidad de metal de transición, por ejemplo,
paladio, puede ser inferior al 1% en mol (calculado con respecto al
número de moles de enlace a escindir). Ventajosamente, la cantidad
de catalizador puede ser mucho inferior al 1% en mol, por ejemplo,
<0,50% en mol, preferiblemente <0,10% en mol, particularmente
<0,05% en mol. Se pueden usar cantidades incluso menores de
metal, por ejemplo, <0,03 en mol o incluso <0,01% en mol. Sin
embargo, como serán conscientes los especialistas en la técnica, si
se reduce la cantidad de catalizador, también lo hace la velocidad
de la reacción. El especialista será capaz de estimar, en cualquier
caso, una cantidad apropiada de metal de transición y, por tanto,
el catalizador adecuado para cualquier reacción particular.
Al contrario que con la cantidad de metal
requerida para formar el catalizador activo, la cantidad de
ligando(s) que contienen fosfina soluble(s) en agua
usada preferiblemente es mayor que 1 equivalente molar (nuevamente
calculado con respecto al número de moles de enlace a escindir).
Pueden usarse preferiblemente más de 4, por ejemplo, más de 6, por
ejemplo, 8-12 equivalentes molares de ligando. Si se
desea, pueden usarse cantidades incluso mayores de ligando, por
ejemplo, >20 equivalentes molares.
El especialista será capaz de determinar la
cantidad de ligando que mejor se adapta a cualquiera reacción
individual.
Cuando el enlace contiene un grupo azida, la
presencia de un metal de transición no es necesaria para efectuar
la escisión. Por tanto, la escisión de tales enlazadores se puede
efectuar sólo en presencia de las fosfinas que se tratan en este
documento; las mismas pueden estar presentes en los métodos de la
invención como sales solubles, tales como las que se analizan en
este documento.
Como se conoce en la técnica, un
"nucleótido" consiste en una base nitrogenada, un azúcar y uno
o más grupos fosfato. En ARN, el azúcar es una ribosa y en ADN es
una desoxirribosa, es decir, un azúcar que carece de un grupo
hidroxilo que está presente en la ribosa. La base nitrogenada es un
derivado de purina o pirimidina. Las purinas son adenosina (A) y
guanidina (G) y las pirimidinas son citidina (C) y timidina (T), (o
en el contexto del ARN, uracilo (U)). El átomo C-1
de la desoxirribosa está enlazado al N-1 de una
pirimidina o al N-9 de una purina. Un nucleótido es
también un éster de fosfato de un nucleósido, ocurriendo una
esterificación en el grupo hidroxilo unido al C-5
del azúcar. Los nucleótidos son habitualmente mono-, di- o
trifosfatos.
Un "nucleósido" es estructuralmente similar
a un nucleótido, pero carece de los restos fosfato. Un ejemplo de
un análogo de nucleósido sería uno en que el marcador estuviera
unido a la base y no hubiera ningún grupo fosfato unido a la
molécula de azúcar.
Aunque la base se denomina habitualmente una
purina o pirimidina, el especialista entenderá que están disponibles
derivados y análogos que no alteran la capacidad del nucleótido o
nucleósido de experimentar un emparejamiento de bases de
Watson-Crick. "Derivado" o "análogo" se
refiere a un compuesto o una molécula cuya estructura central es la
misma, o se parece estrechamente, a la de un compuesto precursor,
pero que tiene una modificación física o química, tal como un grupo
lateral diferente o adicional, que permite al nucleótido o
nucleósido derivado enlazarse a otra molécula. Por ejemplo, la base
puede ser una desazapurina.
Los nucleótidos y nucleósidos modificados que se
describen y reivindican en este documento son ejemplos de tales
derivados o análogos con la adición de marcadores detectables
conectados a las bases por los enlazadores escindibles que
contienen alilo o azido descritos en este documento. Por tanto, se
entenderá que los términos nucleótidos y nucleósidos como se usan
en este documento incluyen tales nucleótidos y nucleósidos
modificados.
Los derivados deben ser capaces de experimentar
un emparejamiento de Watson-Crick. "Derivado" y
"análogo" se refieren también a un derivado de nucleótido o
nucleósido sintético que tiene restos de base modificados y/o
restos de azúcar modificados. Tales derivados y análogos se
discuten, por ejemplo, en Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley
& Son, 1980) y Uhlman et al., Chemical Reviews 90:
543-584, 1990. Los análogos de nucleótidos pueden
comprender también enlaces fosfodiéster modificados, incluyendo
enlaces fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato,
fosforanilidato y fosforamidato. Los análogos deben ser capaces de
experimentar emparejamiento de bases de
Watson-Crick. "Derivado", "análogo" y
"modificado" como se usan en este documento pueden usarse de
forma intercambiable y se incluyen en los términos "nucleótido"
y "nucleósido" definidos en este documento.
Los métodos de la presente invención hacen uso
de marcadores detectables convencionales. La detección se puede
realizar por cualquier método adecuado, incluyendo espectroscopia de
fluorescencia o por otro medio óptico. El marcador preferido es un
fluoróforo, que, después de la absorción de energía, emite radiación
a una longitud de onda definida. Se conocen muchos marcadores
fluorescentes adecuados. Por ejemplo, Welch et al., (Chem.
Eur. J. 5(3): 951-960, 1999) describe
restos fluorescentes funcionalizados con dansilo que se pueden usar
en la presente invención. Zhu et al., (Cytometry 28:
206-211, 1997) describe el uso de los marcadores
fluorescentes Cy3 y Cy5, que también se pueden usar en la presente
invención. También se describen marcadores adecuados para usar en
Prober et al. (Science 238: 336-341,
1987); Connell et al. (BioTechniques 5(4):
342-384, 1987), Ansorge et al. (Nucl.
Acids Res. 15(11): 4593-4602, 1987) y
Smith et al. (Nature 321: 674, 1986). Otros
marcadores fluorescentes disponibles en el mercado incluyen, aunque
sin limitación, fluoresceína, rodamina, (incluyendo TMR, Texas red
y Rox), alexa, bodipy, acridina, cumarina, pireno, benzantraceno y
las cianinas.
En la invención también se pueden usar
marcadores múltiples. Por ejemplo, los casetes FRET con
bi-fluoróforos (Tet. Letts. 46:
8867-8871, 2000) se conocen bien en la técnica y
pueden utilizarse en la presente invención. También se pueden ser
usar sistemas dendriméricos multi-fluor (J. Amer.
Chem. Soc. 123: 8101-8108, 2001).
Aunque se prefieren marcadores fluorescentes,
otras formas de marcadores detectables se entenderán como útiles
para los especialistas. Por ejemplo, se pueden usar micropartículas,
incluyendo puntos cuánticos (Empodocles, et al.,
Nature 399: 126-130, 1999), nanopartículas de
oro (Reichert et al., Anal. Chem. 72:
6025-6029, 2000), microperlas (Lacoste et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(17):
9461-9466, 2000) y marcadores detectables por
espectrometría de masas.
En la invención también se pueden usar
marcadores multicomponentes. Un marcador multicomponente es uno que
depende de la interacción con un compuesto adicional para la
detección. El marcador multicomponente más común usado en biología
es el sistema de biotina-estreptavidina. La biotina
se usa como el marcador unido a la base del nucleótido. La
estreptavidina se añade después por separado para posibilitar que
ocurra la detección. Están disponibles otros sistemas
multicomponentes. Por ejemplo, dinitrofenol tiene un anticuerpo
fluorescente disponible en el mercado que se puede usar para la
detección.
El marcador (o la construcción de marcador y
enlazador) puede tener un tamaño o una estructura suficiente para
actuar como un bloqueo para la incorporación de un nucleótido
adicional en el nucleótido de la invención. Esto permite realizar
polimerización controlada. El bloqueo se puede deber a impedimento
estérico o se puede deber a una combinación de tamaño, carga y
estructura.
La invención se describirá adicionalmente
principalmente con referencia a nucleótidos. Sin embargo, a menos
que se indique de otro modo, las referencias en este documento a
nucleótidos tienen también por objeto ser aplicables a nucleósidos.
La invención también se describirá adicionalmente con referencia al
ADN, aunque la descripción será también aplicable a ARN, ANP y
otros ácidos nucleicos, a menos que se indique de otro modo.
Los nucleótidos modificados de la invención usan
un enlazador escindible para unir el marcador al nucleótido. El uso
de un enlazador escindible asegura que el marcador puede eliminarse,
si se requiere, después de la detección, evitando cualquier señal
interferente con cualquier nucleótido marcado incorporado
posteriormente.
El uso de la expresión "enlazador
escindible" no quiere decir que implique que se requiera eliminar
todo el enlazador de la base de nucleótido. El lugar de escisión
puede localizarse en una posición en el enlazador que asegura que
parte del enlazador permanece unido a la base del nucleótido después
de la escisión.
El enlazador puede unirse a cualquier posición
en la base del nucleótido con tal de que todavía pueda realizarse
el emparejamiento de bases de Watson-Crick. En el
contexto de las bases de purina se prefiere que el enlazador se una
por la posición 7 de la purina o el análogo desazapurina preferido,
por una purina modificada en 8, por una adenosina modificada en
N-6 o una guanina modificada en N-2.
Para pirimidinas, la unión es preferiblemente por la posición 5 de
la citidina, timidina o uracilo y la posición N-4 de
la citosina. Se muestran estructuras de nucleótido adecuadas en la
Figura 1. Para cada estructura en la Figura 1, X puede ser H,
fosfato, difosfato o trifosfato. R_{1} y R_{2} pueden ser
iguales o diferentes y pueden seleccionarse de H, OH o cualquier
grupo que pueda transformarse en un OH, incluyendo, aunque sin
limitación, un carbonilo.
Los enlazadores adecuados comprenden los restos
que contienen azida y alilo que se han analizado anteriormente. Sin
embargo, además de estos restos escindibles, otros motivos
escindibles pueden, por supuesto, estar presentes en los
enlazadores. Con referencia a la Figura 2, los ejemplos de los
mismos incluyen, aunque sin limitación, enlazadores de disulfuro
(1), restos inestables a ácidos (2, 3, 4 y 5; incluyendo restos
dialcoxibencilo (por ejemplo, 2), enlazadores Sieber (por ejemplo,
3), restos indol (por ejemplo, 4), restos Sieber t-butilo
(por ejemplo, 5), restos escindibles electrofílicamente, restos
escindibles nucleofílicamente, restos fotoescindibles, escisión en
condiciones reductoras, condiciones oxidantes, escisión mediante el
uso de restos de seguridad y escindibles por mecanismos de
eliminación. Los ejemplos de dichos restos se describen en el
documento WO03/048387.
Así como el resto escindible por fosfinas
solubles en agua o catalizadores basados en metales de transición
descritos en este documento, los enlaces escindibles pueden
comprender también una unidad espaciadora. El espaciador separa la
base de nucleótido del lugar de escisión o marcador. La longitud del
resto es irrelevante con tal de que el marcador se mantenga a una
distancia suficiente del nucleótido para no interferir con ninguna
interacción entre el nucleótido y una enzima.
Tales grupos espaciadores pueden contener uno o
más arilenos, por ejemplo, fenileno, grupos en la cadena (es decir,
un resto -Ar- donde el anillo de fenilo es parte del enlazador por
medio de sus átomos de carbono dispuestos en 1,4, 1,3 ó 1,2). El
anillo de fenilo puede estar sustituido en su posición no enlazada
con uno o más sustituyentes como alquilo, hidroxilo, alquiloxi,
haluro, nitro, carboxilo o ciano y similares, particularmente grupos
aceptores de electrones, cuya acepción de electrones es por
inducción o resonancia. Un ejemplo de un grupo aceptor de
electrones por resonancia es nitro; un grupo que actúa mediante
inducción es fluoro. El especialista será consciente de otros
grupos aceptores de electrones apropiados. El enlace en el grupo R'
puede incluir también restos como un -O-,
-S(O)_{q}, donde _{q} es 0, 1 ó 2 o NH o
N-alquilo.
Los nucleótidos modificados pueden comprender
también grupos adicionales o modificaciones en el grupo azúcar. Por
ejemplo, un derivado de didesoxirribosa, que carece de ambos grupos
hidroxilo en la estructura de anillo de ribosa (en las posiciones
2' y 3'), puede prepararse y usarse como un bloqueo para la
incorporación adicional de nucleótido en una cadena
oligonucleotídica creciente. El grupo protector tiene por objeto
evitar la incorporación en una cadena polinucleotídica naciente y
puede eliminarse en condiciones definidas para permitir que ocurra
la polimerización. En contraste con la técnica anterior, no es
necesario que haya marcador detectable unido a la posición 3' de la
ribosa. Esto permite que se reduzca el impedimento estérico con la
enzima polimerasa, mientras que todavía se permite el control de la
incorporación usando el grupo protector.
El especialista valorará cómo unir un grupo
protector adecuado al anillo de ribosa para bloquear interacciones
con el -OH en 3'. El grupo protector se puede unir directamente a la
posición 3' o puede unirse a la posición 2' (teniendo el grupo
protector suficiente tamaño o carga para bloquear interacciones en
la posición 3'). Alternativamente, el grupo protector puede unirse
tanto en la posición 3' como 2' y puede escindirse para exponer el
grupo OH 3'.
Los grupos protectores adecuados serán evidentes
para el especialista y pueden formarse a partir de cualquier grupo
protector adecuado descrito en "Protective Groups in Organic
Synthesis", T. W. Greene y P. G. M. Wuts, 3ª Ed., Wiley
Interscience, New York. El grupo protector debe poderse eliminar (o
ser modificable) para producir un grupo OH 3'. El proceso usado
para obtener el grupo OH 3' puede ser cualquier reacción química o
enzimática adecuada.
Preferiblemente, el grupo de bloqueo o protector
es un grupo alilo o un grupo de la estructura
-O-Z
en el que Z es cualquiera de
-C(R')_{2}-O-R'',
-C(R')_{2}-N(R'')_{2},
-C(R')_{2}-N(H)R'',
-C(R')_{2}-S-R'' y
-C(R')_{2}-F,
en el que cada R'' es o es parte de un grupo
protector que se puede eliminar;
cada R' es independientemente un átomo de
hidrogeno, un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilalquilo,
alquenilo, aquinilo, arilo, heteroarilo, heterocíclico, acilo,
ciano, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi o amido; o (R')_{2}
representa un grupo alquilideno de fórmula =C(R''')_{2} en
el que cada R''' puede ser igual o diferente y se selecciona del
grupo que comprende átomos de hidrógeno y halógeno y grupos alquilo;
y
en el que dicha molécula puede hacerse
reaccionar para dar un intermedio en el que cada R'' se cambia por
H o, cuando Z es -C(R')_{2}-F, el F se
cambia por OH, SH o NH_{2,} preferiblemente OH, cuyo intermedio
se disocia en condiciones acuosas para dar una molécula con un OH 3'
libre;
a condición de que cuando Z es
-C(R')_{2}-S-R'', los dos
grupos R' no sean H.
Cuando el grupo de bloqueo es un grupo alilo, el
mismo puede introducirse en la posición 3' usando procedimientos
estándar de la bibliografía tales como los que usados por Metzker
(Nucleic Acids Research, 22(20):
4259-4267, 1994).
Los intermedios producidos ventajosamente y
espontáneamente se disocian en condiciones acuosas de nuevo a la
estructura natural hidroxi 3', que permite la incorporación
adicional de otro nucleótido. Se puede usar cualquier grupo
protector adecuado. Preferiblemente, Z es de fórmula
-C(R')_{2}-O-R'',
-C(R')_{2}-N-(R'')_{2},
-C(R')_{2}-N(H)R'' y
C(R')_{2}-SR''. Particularmente
preferiblemente, Z es de la fórmula
-C(R')_{2}-O-R'',
-C(R')_{2}-N-(R'')_{2} y
C(R')_{2}-SR''. R'' puede ser un grupo
bencilo o un grupo bencilo sustituido.
Un ejemplo de grupos de estructura
-O-Z en los que Z es
-C(R')_{2}-N-(R'')_{2} son aquellos en
que -N(R'')_{2} es azido (-N_{3}). Un ejemplo preferido
de este tipo es azidometilo en el que cada R' es H.
Alternativamente, R' en grupos Z de fórmula
-C(R')_{2}-N_{3} y otros grupos Z puede
ser cualquiera de los otros grupos tratados en este documento. Los
ejemplos de grupos R' típicos incluyen alquilo
C_{1-6}, particularmente metilo y etilo y los
siguientes (en los que cada estructura muestra el enlace que conecta
el resto R' al átomo de carbono al que se une en los grupos Z; los
asteriscos (*) indican los puntos de unión):
(en los que cada R es un alquilo
C_{1-10} sustituido opcionalmente, un grupo alcoxi
sustituido opcionalmente, un átomo de halógeno o grupo funcional
tal como hidroxilo, amino, ciano, nitro, carboxilo y similares) y
"Het" es un heterocíclico (que puede ser, por ejemplo, un
grupo heteroarilo). Estos grupos R', que se han mostrado
anteriormente, se prefieren cuando el otro grupo R' es el mismo que
el primero o es hidrógeno. Los grupos Z preferidos son de fórmula
-C(R')_{2}N_{3} en la que los grupos R' se seleccionan de
las estructuras que se han indicado anteriormente e hidrógeno; o en
la que (R')_{2} representa un grupo alquilideno de fórmula
=C(R''')_{2}, por ejemplo,
=C(Me)_{2}.
Cuando las moléculas contienen grupos Z de
fórmula C(R')_{2}N_{3}, el grupo azido se puede convertir
en amino poniendo en contacto tales moléculas con los ligandos de
fosfina o fosfina que contiene nitrógeno descritos con detalle en
relación con los complejos de metales de transición que sirven para
escindir los grupos alilo de compuestos de fórmula
PN-O-alilo, fórmula
R-O-alilo, R_{2}N(alilo),
RNH(alilo), RN(alilo)_{2} y
R-S-alilo. Cuando se transforma
azido en amino, sin embargo, no es necesario metal de transición.
Alternativamente, el grupo azido en los grupos Z de fórmula
C(R')_{2}N_{3} se puede convertir en amino poniendo en
contacto tales moléculas con los tioles, en particular, tioles
solubles en agua como ditiotreitol (DTT).
El enlazador inestable puede consistir, y
preferiblemente consiste, en una funcionalidad escindible en
condiciones idénticas a las del bloqueo. Esto hace que el proceso
de desprotección sea más eficaz ya que sólo se requerirá un único
tratamiento para escindir tanto el marcador como el bloqueo. Por
ejemplo, cuando el enlace contiene un resto alilo como se trata y
reivindica en este documento y el grupo de bloqueo es un grupo
alilo, tanto el enlace como el grupo de bloqueo se escindirán en
condiciones idénticas. De forma similar, si el enlace contiene un
resto azido como se trata y reivindica en este documento y el grupo
de bloqueo comprende un resto azido, por ejemplo, es de fórmula Z
en la que R'' es N_{3} como se ha analizado anteriormente en este
documento, tanto el enlace como el grupo de bloqueo se podrán
escindir en condiciones idénticas. El grupo de bloqueo puede, por
supuesto, desprotegerse en condiciones químicas totalmente
diferentes a las requeridas para escindir el enlazador.
El término "alquilo" incluye grupos alquilo
tanto de cadena lineal como de cadena ramificada. A menos que el
contexto lo indique de otro modo, el término "alquilo" se
refiere a grupos que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por
ejemplo, de 1 a 8 átomos de carbono y típicamente de 1 a 6 átomos de
carbono, por ejemplo, de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplo de
grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo,
n-butilo, isobutilo, terc-butilo,
n-pentilo, 2-pentilo,
3-pentilo, 2-metil butilo,
3-metil butilo y n-hexilo y sus
isómeros.
Son ejemplos de grupos cicloalquilo los que
tienen de 3 a 10 átomos en el anillo, incluyendo los ejemplos
particulares los derivados de ciclopropano, ciclobutano,
ciclopentano, ciclohexano y cicloheptano, bicicloheptano y
decalina.
Cuando los grupos alquilo (incluyendo
cicloalquilo) están sustituidos, particularmente cuando los mismos
forman cada uno de los dos grupos R' de las moléculas de la
invención, los ejemplos de sustituyentes apropiados incluyen
sustituyentes de halógeno o grupos funcionales tales como hidroxilo,
amino, ciano, nitro, carboxilo y similares. Tales grupos pueden ser
también sustituyentes, cuando sea apropiado, de los demás grupos R'
en las moléculas de la invención.
Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, pero
sin limitación, etenil (vinilo), 1-propenilo,
2-propenil (alilo), isopropenilo, butenilo,
buta-1,4-dienilo, pentenilo y
hexenilo.
Los ejemplos de grupos cicloalquenilo incluyen,
pero sin limitación, ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo,
ciclopentadienilo y ciclohexenilo.
El término alcoxi se refiere a alcoxi
C_{1-6} a menos que se indique de otro modo: -OR,
donde R es un grupo alquilo C_{1-6}. Los ejemplos
de grupos alcoxi C_{1-6} incluyen, pero sin
limitación, -OMe (metoxi), -OEt (etoxi), -O(nPr),
(n-propoxi), -O(iPr), (isopropoxi),
-O(nBu), (n-butoxi), -O(sBu),
(sec-butoxi), -O(iBu) (isobutoxi) y
-O(tBu) (terc-butoxi).
El término "halógeno" como se usa en este
documento incluye flúor, cloro, bromo y yodo.
Las moléculas de nucleótido de la presente
invención son adecuadas para el uso en muchos métodos diferentes en
los que se requiere la detección de nucleótidos.
Los métodos de secuenciación de ADN, tales como
los resumidos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.302.509, pueden
realizarse usando el nucleótido.
Preferiblemente, las construcciones de
nucleótido modificado bloqueado y marcado de las bases de nucleótido
A, T, C y G se reconocen como sustratos por la misma enzima
polimerasa.
En los métodos descritos en este documento, cada
uno de los nucleótidos se puede poner en contacto con la diana
secuencialmente, con eliminación de nucleótidos no incorporados
antes de la adición del siguiente nucleótido, cuando la detección y
eliminación del marcador y del grupo de bloqueo, si está presente,
se realiza después de la adición de cada nucleótido o después de la
adición de los cuatro nucleótidos.
En los métodos, todos los nucleótidos pueden
ponerse en contacto con la diana simultáneamente, es decir, una
composición que comprende todos los diferentes nucleótidos se pone
en contacto con la diana y los nucleótidos no incorporados se
eliminan antes de la detección y posteriormente a la eliminación del
marcador y el grupo de bloqueo, si están presentes.
Los cuatro nucleótidos, uno de los cuales será
complementario a la primera base desapareada en el polinucleótido
diana, pueden ponerse en contacto con la diana secuencialmente,
opcionalmente con eliminación de nucleótidos no incorporados antes
de la adición del siguiente nucleótido. La determinación del éxito
de la incorporación se puede realizar después de la proporción de
cada nucleótido o después la adición de todos los nucleótidos
añadidos. Si se determina después de la adición de menos de cuatro
nucleótidos que uno se ha incorporado, no es necesario proporcionar
nucleótidos adicionales para detectar los nucleótidos
complementarios al nucleótido incorporado.
Alternativamente, todos los nucleótidos se
pueden poner en contacto simultáneamente con la diana, es decir,
una composición que comprende todos los diferentes nucleótidos (es
decir, A, T, C y G o A, U, C y G) se pone en contacto con la diana
y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección
y eliminación del marcador(es). Los métodos que implican la
adición secuencial de nucleótidos pueden comprender una primera
subetapa y, opcionalmente, una o más subetapas posteriores. En la
primera subetapa se proporciona una composición que comprende uno,
dos o tres de los cuatro nucleótidos posibles, es decir, se pone en
contacto con la diana. Después de esto, cualquier nucleótido no
incorporado puede eliminarse y se puede llevar a cabo una etapa de
detección para determinar si se ha incorporado uno de los
nucleótidos. Si se ha incorporado uno, se puede efectuar la
escisión del enlazador y, si es necesario, se puede introducir
después una funcionalidad amida terminal en el brazo colgante. De
este modo se puede determinar la identidad de un nucleótido en el
polinucleótido diana. El polinucleótido naciente se puede prolongar
después para determinar la identidad del siguiente nucleótido
desapareado en el oligonucleótido diana.
Si la primera subetapa anterior no conduce a la
incorporación de un nucleótido o si éste no se conoce, ya que la
presencia de nucleótidos incorporados no se busca inmediatamente
después de la primera subetapa, se pueden realizar una o más
subetapas posteriores en las que se proporcionan alguno o todos de
los nucleótidos no proporcionados en la primera subetapa, cuando
sea apropiado, simultáneamente o posteriormente. Después de esto,
puede eliminarse cualquier nucleótido no incorporado y puede
llevarse a cabo una etapa de detección para determinar si se ha
incorporado alguna de las clases de nucleótidos. Si se ha
incorporado una, se puede efectuar la escisión del enlazador y, si
es necesario, como una etapa o etapas adicionales, se puede
introducir una funcionalidad amida terminal en el brazo colgante.
De este modo se puede determinar la identidad de un nucleótido en
el polinucleótido diana. El polinucleótido naciente se puede
prolongar después para determinar la identidad del siguiente
nucleótido desapareado en el oligonucleótido diana. Si es necesario,
se puede efectuar una tercera y opcionalmente una cuarta subetapa
de manera similar a la segunda subetapa. Obviamente, una vez se han
efectuado las cuatro subetapas, se habrán proporcionado todos los
cuatro nucleótidos posibles y uno se habrá incorporado.
Es deseable determinar si un tipo o clase de
nucleótido se ha incorporado después de que se haya proporcionado
cualquier combinación particular que comprende uno, dos o tres
nucleótidos. De este modo se elimina el coste innecesario y el
tiempo consumido en proporcionar el otro nucleótido o nucleótidos.
Sin embargo, esto no es una característica requerida de la
invención.
Es también deseable, cuando el método para
secuenciar comprende una o más subetapas, eliminar cualquier
nucleótido no incorporado antes de proporcionar otro nucleótido.
Nuevamente, esto no es una característica requerida de la
invención. Obviamente, es necesario que al menos alguno de los
nucleótidos no incorporados y, preferiblemente tantos como sea
factible, se eliminen antes de la detección del nucleótido
incorporado.
Un método para determinar la secuencia de un
polinucleótido diana se puede realizar poniendo en contacto el
polinucleótido diana por separado con los diferentes nucleótidos
para formar el complemento al del polinucleótido diana y detectando
la incorporación del nucleótido. Un método de este tipo hace uso de
la polimerización, mediante la que una enzima polimerasa prolonga
la cadena complementaria incorporando el nucleótido correcto
complementario al de la diana. La reacción de polimerización también
requiere un cebador específico para inciar la polimerización.
Para cada ciclo, la enzima polimerasa realiza la
incorporación del nucleótido modificado y después se determina el
acontecimiento de incorporación. Existen muchas polimerasas
diferentes y para el especialista será evidente cuál es la más
apropiada para usar. Las enzimas preferidas incluyen ADN polimerasa
I, el fragmento de Klenow, ADN polimerasa III, ADN polimerasa de T4
o T7, Polimerasa de Taq o Polimerasa de Vent. También pueden usarse
polimerasas diseñadas para tener propiedades específicas.
Preferiblemente, la molécula se incorpora por una polimerasa y
particularmente de Thermococcus sp., tal como 9ºN. Incluso
más preferiblemente, la polimerasa es un mutante 9ºN A485L y aún
más preferiblemente, es un doble mutante Y409V y A485L. Un ejemplo
de una enzima preferida de este tipo es Thermococcus sp. 9ºN
exo -Y409V A485L disponible en New England Biolabs. Los ejemplos de
tales polimerasas apropiadas se describen en Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1996(93), págs. 5281-5285,
Nucleic Acids Research, 1999(27), págs.
2454-2553 y Acids Research, 2002(30),
págs. 605-613.
Los especialistas en la técnica serán
conscientes de la utilidad de los didesoxinucleótidos trifosfato en
los denominados métodos de secuenciación de Sanger y protocolos
relacionados (de tipo Sanger), que dependen de terminación de
cadena aleatorizada en un tipo particular de nucleótido. Un ejemplo
de un protocolo de secuenciación de tipo Sanger es el método BASS
descrito por Metzker (más adelante). Los especialistas en la técnica
conocerán otros métodos de secuenciación de tipo Sanger.
Los métodos Sanger o de tipo Sanger generalmente
funcionan mediante la realización de un experimento en el que se
proporcionan ocho tipos de nucleótidos, cuatro de los cuales
contienen un grupo OH 3' y cuatro de los cuales omiten el grupo OH
y que están marcados de modo distinto entre sí. Los nucleótidos
usados que omiten el grupo OH 3' -didesoxi nucleótidos- se abrevian
convencionalmente como ddNTP. Como el especialista conoce, ya que
los ddNTP están marcados de modo distinto, determinando las
posiciones de los nucleótidos terminales incorporados y combinando
esta información, se puede determinar la secuencia del
oligonucleótido diana.
Se reconocerá que los nucleótidos de la presente
invención en los que el grupo OH 3' está ausente o bloqueado pueden
ser de utilidad en métodos Sanger y protocolos relacionados ya que
el mismo efecto conseguido usando ddNTP puede conseguirse usando
grupos de bloqueo de OH 3': ambos evitan la incorporación de
posteriores nucleótidos.
El uso de los nucleótidos de acuerdo con la
presente invención en métodos de secuenciación Sanger o de tipo
Sanger forma un aspecto adicional más de esta invención. Visto desde
ese aspecto, la invención proporciona el uso de tales nucleótidos
en un método de secuenciación Sanger o tipo Sanger.
Los métodos de secuenciación se realizan
preferiblemente con el polinucleótido diana dispuesto sobre un
soporte sólido. Mediante moléculas enlazadoras se pueden
inmovilizar múltiples polinucleótidos diana en el soporte sólido o
también se pueden unir a partículas, por ejemplo, microesferas, que
pueden unirse también a un material de soporte sólido.
Los polinucleótidos pueden unirse al soporte
sólido mediante varios medios, incluyendo el uso de interacciones
avidina-biotina. Los métodos para la inmovilización
de polinucleótidos sobre un soporte sólido se conocen bien en la
técnica e incluyen técnicas litográficas y "aplicación puntual"
de polinucleótidos individuales en posiciones definidas sobre un
soporte sólido. Se conocen soportes sólidos adecuados en la técnica
e incluyen portaobjetos de vidrio y perlas, superficies de cerámica
y silicio y materiales plásticos. El soporte es habitualmente una
superficie lisa aunque también se pueden usar perlas microscópicas
(microesferas) y se pueden unir, a su vez, a otro soporte sólido
por medios conocidos. La microesferas puede ser de cualquier tamaño
adecuado, típicamente en el intervalo de 10 a 100 nm de diámetro.
En una realización preferida, los polinucleótidos se unen
directamente sobre una superficie plana, preferiblemente una
superficie plana de vidrio. La unión será preferiblemente mediante
un enlace covalente. Preferiblemente, las matrices que se usan son
matrices de una sola molécula que comprenden polinucleótidos en
distintas áreas separables ópticamente, por ejemplo, como se
describe en la Solicitud Internacional Nº WO 00/06770.
El método de secuenciación se puede realizar
tanto en matrices de una sola molécula de polinucleótido o de
moléculas de multipolinucleótidos, es decir, matrices de moléculas
individuales distintas de polinucleótidos y matrices de regiones
distintas que comprenden copias múltiples de una molécula individual
de polinucleótido. Las matrices de una sola molécula permiten que
cada polinucleótido individual se separe por separado. Se prefiere
el uso de matrices de una sola molécula. La secuenciación de manera
no destructiva de matrices de de una sola molécula permite que se
forme una matriz espacialmente dirigida.
El método hace uso de la reacción de
polimerización para generar la secuencia complementaria de la diana.
Para el especialista estarán claras las condiciones compatibles con
reacciones de polimerización.
Para realizar la reacción de la polimerasa
habitualmente será necesario hibridar primero una secuencia de
cebador con el polinucleótido diana, reconociéndose la secuencia de
cebador por la enzima polimerasa y actuando como un sitio de inicio
para la prolongación posterior de la cadena complementaria. La
secuencia de cebador se puede añadir como un componente separado
con respecto al polinucleótido diana. Alternativamente, el cebador
y el polinucleótido diana pueden ser cada uno parte de una molécula
monocatenaria, formando la porción de cebador un dúplex
intramolecular con una parte de la diana, es decir, una estructura
de bucle en horquilla. Esta estructura se puede inmovilizar en el
soporte sólido en cualquier punto de la molécula. Para los
especialistas en la técnica estarán claras otras condiciones
necesarias para realizar la reacción de la polimerasa, incluyendo
temperatura, pH, composiciones del tampón, etc.
Los nucleótidos modificados de la invención se
ponen después en contacto con el polinucleótido diana, para
permitir que ocurra la polimerización. Los nucleótidos pueden
añadirse secuencialmente, es decir, adición separada de cada tipo
de nucleótido (A, T, G o C) o añadirse conjuntamente. Si se añaden
juntos, es preferible que cada tipo de nucleótido se marque con un
marcador diferente.
Se deja avanzar esta etapa de polimerización
durante un tiempo suficiente para permitir la incorporación de un
nucleótido.
Los nucleótidos que no se incorporan se eliminan
después, por ejemplo, sometiendo la matriz a una etapa de lavado y
después se puede realizar la detección de los marcadores
incorporados.
La detección puede ser por medios
convencionales, por ejemplo, si el marcador es un resto
fluorescente, la detección de una base incorporada se puede
realizar usando un microscopio de barrido confocal para explorar la
superficie de la matriz con un láser, para formar imágenes de un
enlace de fluoróforo unido directamente a la base incorporada.
Alternativamente, se puede usar un detector
sensible 2-D, tal como un detector acoplado por
carga (CCD), para visualizar las señales individuales generadas.
Sin embargo, están disponibles otras técnicas como la microscopia
óptica de barrido de campo cercano (SNOM) y se pueden usar cuando se
forman imágenes de matrices densas. Por ejemplo, usando SNOM, los
polinucleótidos individuales se pueden distinguir cuando están
separados por una distancia inferior a 100 nm, por ejemplo, de 10
nm a 10 \mum. Para una descripción de microscopia óptica de
barrido de campo cercano, veáse Moyer et al., Laser Focus
World 29: 10, 1993. Se conocen aparatos adecuados que se usan
para formar imágenes de matrices de polinucleótidos y su puesta en
marcha técnica será clara para el especialista.
Después de la detección, el marcador se puede
eliminar usando condiciones adecuadas que escinden el enlazador.
El uso de los nucleótidos modificados no está
limitado a técnicas de secuenciación de ADN y se pueden realizar
también otras técnicas, que incluyen síntesis de polinucleótidos,
ensayos de hibridación de ADN y estudios de polimorfismo de un solo
nucleótido, usando los nucleótidos de la invención. Cualquier
técnica que implique la interacción entre un nucleótido y una
enzima puede usar las moléculas de la invención. Por ejemplo, la
molécula se puede usar como un sustrato para una enzima
transcriptasa inversa o transferasa terminal.
Se describen estructuras adecuadas de
nucleótidos en los siguientes Ejemplos no limitantes y se muestran
en los dibujos adjuntos.
Se calentaron
2-bromoacetaldehído dietil acetal (3 ml, 20 mmol),
3-hidroxi-benzoato de etilo (1,66 g,
10 mmol), carbonato potásico (2,76 g, 20 mmol) y yoduro sódico (0,
298 g, 2 mmol) a 120ºC en dimetil formamida (DMF) (15 ml) durante
17 h. Se añadió otra extracción de
2-bromoacetaldehído dietil acetal (3 ml, 20 mmol) y
la mezcla de reacción se calentó a 120ºC durante 24 h más. La
reacción se enfrió a temperatura ambiente y todos los disolventes
se evaporaron a presión reducida. Los residuos se repartieron entre
diclorometano (DCM) (200 ml) y agua (200 ml). La capa de DCM se
separó y la fase acuosa se extrajo de nuevo con DCM (2 x 100 ml).
Todos los extractos de DCM se combinaron, se secaron sobre
MgSO_{4} y se evaporaron a presión reducida. El residuo se
purificó mediante una cromatografía en columna (4 x 20 cm). El
producto se eluyó con DCM al 100% y se obtuvo el compuesto del
título en forma de un aceite incoloro (2,21 g, al 78,3%).
^{1}H RMN [CDCl_{3}]: 7,58 (1H,
Ar-H, d J 7,7), 7,51 (1H,
Ar-H, dd, J 2,4 y 1,5), 7,27 (1H,
Ar-H, t, J 8,0), 7,05 (1H,
Ar-H, dd, J 7,9 y 2,3), 4,79 (1H, CH, t,
J 5,2), 4,20 (2H, OCH_{2}, c, J 7,2), 3,99 (2H,
ArOCH_{2}, d, J 5,2), 3,75-3,65 (2H,
OCH_{2}, m), 3,63-3,53 (2H, OCH_{2}, m), 1,33
(3H, CH_{3}, t, J 7,2) y 1,19 (6H, CH_{3}, t, J
7,1).
A una mezcla de éster etílico del ácido
3-(2,2-dietoxi-etoxi)-benzoico
(1,128 g, 4 mmol) y azidotrimetilsilano (0,0584 ml, 4,4 mmol) se le
añadió SnCl_{4} (40 \mul) a temperatura ambiente. Después de 1
h, los precipitados se retiraron por filtración y el filtrado se
evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió en metanol y,
después de 10 minutos, el disolvente se retiró a presión reducida.
El residuo se purificó por cromatografía en columna (3 x 20 cm). El
producto se eluyó con éter de petróleo al 10%
(60-80ºC) en DCM. El compuesto del título se obtuvo
en forma de un aceito incoloro (0,909 g, al 81,5%).
^{1}H RMN [CDCl_{3}]: 7,51 (1H,
Ar-H, d J 7,7), 7,41 (1H,
Ar-H, dd, J 2,6 y 1,5), 7,19 (1H,
Ar-H, t, J 7,9), 6,96 (1H,
Ar-H, ddd, J 8,2, 2,7 y 0,9), 4,63 (1H, CHN_{3},
t, J 5,1), 4,20 (2H, OCH_{2}, c, J 7,2),
4,05-3,90 (2H, ArOCH_{2}, m),
3,80-3,78 (1H, OCH_{2}, H_{a}, m),
3,55-3,47 (1H, OCH_{2}, H_{b}, m), 1,22 (3H,
CH_{3}, t, J 7,1) y 1,13 (3H, CH_{3}, t, J
7,1).
\vskip1.000000\baselineskip
El éster etílico del ácido
3-(2,2-dietoxi-etoxi)-benzoico
(0,279 g, 1 mmol) se agitó con hidróxido sódico acuoso 4 M (2,5 ml,
10 mmol) y etanol (2,5 ml) a temperatura ambiente. Después de 4 h,
todos los disolventes se retiraron a presión reducida y el residuo
se disolvió en 50 ml de agua. La solución se acidificó con HCl 1 N
a un valor de pH de 2 y después se extrajo con DCM (3 x 50 ml).
Todos los extractos se combinaron, se secaron sobre MgSO_{4} y se
evaporaron a presión reducida. El compuesto del título se obtuvo en
forma de un sólido incoloro (0,247 g, al 98,4%).
^{1}H RMN [CDCl_{3}]: 7,68 (1H,
Ar-H, d J 7,7), 7,58 (1H,
Ar-H, dd, J 2,5 y 1,5), 7,34 (1H,
Ar-H, t, J 8,0), 7,13 (1H,
Ar-H, dd, J 7,4 y 2,7), 4,74 (1H, CHN_{3}, t,
J 5,0), 4,20-4,02 (2H, OCH_{2}, m),
3,95-3,80 (1H, OCH_{2}, H_{a}, m),
3,70-3,55 (1H, OCH_{2}, H_{b}, m) y 1,24 (3H,
CH_{3}, t, J 7,1).
\vskip1.000000\baselineskip
El ácido
3-(2,2-dietoxi-etoxi)-benzoico
(3,77 mg, 15 \mumol) se agitó con carbonato de
N,N'-disuccinimidilo (3,84 mg, 15 \mumol) y
4-dimetilaminopiridina (DMAP) (1,83 mg, 15 \mumol)
en DMF seca (1 ml) a temperatura ambiente. Después de 15 minutos,
toda la mezcla de reacción se añadió a una solución de la sal
trietilamonio de
mono-{5-[5-(3-amino-prop-1-inil)-2,4-dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-1-il)-3-hidroxi-tetrahidro-furan-2-il}
éster del ácido fosfórico (5 \mumol) en tampón carbonato 0,1 M
(NaHCO_{3} 0,1 M/Na_{2}CO_{3} 0,1 M, 1:1 v/v) (0,5 ml).
Después de 5 h a temperatura ambiente, la reacción se diluyó con
tampón bicarbonato de trimetilamonio (TEAB) 0,05 M (TEAB, pH 7,5)
(10 ml). La solución resultante se aplicó sobre una columna corta
de DEAE A-25 (1 x 5 cm). La columna se eluyó
inicialmente con tampón TEAB 0,1 M (50 ml) y después con tampón 0,7
M (50 ml). Los eluatos de TEAB 0,7 M se recogieron y se evaporaron a
presión reducida. El residuo se coevaporó con MeOH (2 x 10 ml) y
después se purificó por HPLC preparativa [gradiente de HPLC: A, TEAB
0,1 M al 100%; B, MeCN al 100%; 0-2 min, B al 5%
(flujo de 2-10 ml/min); 2-19 min, B
al 5-40% (flujo de 10 ml/min); 19-21
min, B al 40-95% (flujo de 10 ml/min);
21-24 min, B al 95% (flujo de 10 ml/min);
24-26 min, B al 95-5% (flujo de 10
ml/min); 26-30 min, B al 5% (flujo de
10-2 ml/min)]. El producto con tiempo de retención
de 19,6 min se recogió y se evaporó a presión reducida y el residuo
se coevaporó con metanol (3 x 5 ml) para formar el compuesto del
título en forma de la sal trietilamonio (3,67 mg, rendimiento del
80%). La ^{1}H RMN en D_{2}O indicó aproximadamente 3,2
contraiones de trimetilamonio.
^{1}H RMN [D_{2}O]: 7,89 (1H,
H-6, s), 7,44-7,31 (3H,
Ar-H, m), 7,28 (1H, Ar-H, m), 7,12
(1H, Ar-H, dt, J 7,1 y 2,3), 6,17 (1H,
H-1', t, J 6,9), 4,96 (1H, CHN_{3}, t,
J 4,4), 4,43-4,35 (1H, H-3',
m), 4,25 (2H, CHN_{3}, s), 4,18-4,06 (2H,
H-5', m), 4,05-3,90 (1H,
H-4', m), 3,89-3,50 (4H,
ArOCH_{2}, OCH_{2}, m), 3,03 (19H, CH_{2}N, c, J 7,3),
2,25-2,15 (2H, CH_{2}, m), 1,33 (32H, CH_{3}, t,
J 7,3). ^{31}P [D_{2}O]: 5,17 (s). MS-ES
(-), m/z 593 [M-1].
A una mezcla de 2-metil
dioxolano (0,897 ml, 10 mmol) y azidotrimetilsilano (1,6 ml, 12
mmol) se le añadió SnCl_{4} (40 \mul) a -78ºC. Después de la
adición, el extracto enfriado se retiró y la reacción se calentó a
temperatura ambiente. Después de 1 h, la reacción se trató
repartiéndose entre DCM (50 ml) y NaHCO_{3} saturado (50 ml). La
fase acuosa se extrajo adicionalmente con DCM (20 ml). Todos los
extractos de DCM se combinaron, se secaron sobre MgSO_{4} y se
evaporaron a presión reducida. El residuo se disolvió en metanol
acuoso al 10%. Después de 2 h a temperatura ambiente, todos los
disolventes se retiraron a presión reducida. El compuesto del
título se obtuvo en forma de un aceite incoloro (224 mg, al
17,1%).
^{1}H RMN [CDCl_{3}]: 4,46 (1H, CHN_{3,}
c, J 5,7), 3,77-3,68 (1H, OCH_{2}, H_{a},
m), 3,63 (2H, OCH_{2}, t, J 4,3),
3,48-3,40 (1H, OCH_{2}, H_{b}, m) y 1,34 (3H,
CH_{3}, d, J 5,7).
A una solución de
2-(1-azido-etoxi)-etanol
(0,15 g, 1,14 mmol) en tetrahidrofurano seco (THF) (5 ml) se le
añadió NaH (dispersión al 60%, 0,08 g, 2 mmol) a 0ºC. Después de 15
minutos, se añadió 2-bromoacetato de etilo (0,222
ml, 2 mmol). La reacción se mantuvo a esta temperatura durante 15
minutos y después se calentó a temperatura ambiente. Después de 1
h, la reacción se inactivó mediante la adición de NaHCO_{3} acuoso
saturado (5 ml). Después de un periodo adicional de 5 min, la
mezcla se repartió entre DCM (50 ml) y NaHCO_{3} acuoso saturado
(50 ml). La fase acuosa se extrajo adicionalmente con DCM (50 ml).
Todos los extractos de DCM se combinaron, se secaron sobre
MgSO_{4} y se evaporaron a presión reducida. El compuesto del
título se obtuvo en forma de un aceite (0,162 g, al 65,5%).
^{1}H RMN [CDCl_{3}]: 4,51 (1H, CHN_{3,}
c, J 5,6), 4,10 (2H, OCH_{2},c, J 7,1), 4,03 (2H,
OCH_{2}C(O), s), 3,85-3,77 (1H, OCH_{2},
H_{a}, m), 3,67-3,57 (3H, OCH_{2}, H_{b},
OCH_{2}, m), 1,37 (3H, CH_{3}, d, J 5,7) y 1,17 (3H,
CH_{3}, t, J 7,1).
Se agitó éster etílico del ácido
[2-(1-azido-etoxi)-etoxi]-acético
(0,10 g, 0,46 mmol) con hidróxido sódico acuoso 4 M (1,15 ml, 4,6
mmol) y etanol (1,15 ml) a temperatura ambiente. Después de 4 h,
todos los disolventes se retiraron a presión reducida y el residuo
se disolvió en 5 ml de agua. La solución se ajustó a un valor de pH
de 5 con KH_{2}PO_{4} 1 N y después se extrajo con DCM (2 x 15
ml). Después, la fase acuosa se acidificó con HCl 1 N a un valor de
pH de 2 y después se extrajo con DCM (3 x 25 ml). Todos los
extractos de DCM se combinaron, secaron sobre MgSO_{4} y se
evaporaron a presión reducida. El compuesto principal se obtuvo en
forma de un sólido incoloro (42 mg, al 48,3%).
^{1}H RMN [CDCl_{3}]: 4,55 (1H, CHN_{3,}
c, J 5,7), 4,15 (2H, OCH_{2}(O), s),
3,92-3,84 (1H, OCH_{2}, H_{a}, m),
3,74-3,70 (3H, OCH_{2}, H_{b}, OCH_{2}, m) y
1,44 (3H, CH_{3}, d, J 5,7).
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó ácido
[2-(1-azido-etoxi)-etoxi]-acético
(5,7 mg, 30 \mumol) con carbonato de
N,N'-disuccinimidilo (7,68 mg, 30 \mumol) y DMAP
(3,7 mg, 30 \mumol) en DMF seca (2 ml) a temperatura ambiente.
Después de 10 minutos, toda la mezcla de reacción se añadió a una
solución de la sal trietilamonio de
mono-{5-[5-(3-amino}-prop-1-inil)-2,4-dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-1-il]-3-hidroxi-tetrahidro-furan-2-il}
éster del ácido fosfórico (10 \mumol) en TEAB 0,1 M (0,5 ml).
Después de 5 horas a temperatura ambiente, la reacción se diluyó
con tampón bicarbonato de trimetilamonio (TEAB) 0,05 M (TEAB, pH
7,5) (10 ml). La solución resultante se aplicó en una columna corta
de DEAE A-25 (1 x 10 cm). La columna se eluyó
inicialmente con tampón TEAB 0,1 M (50 ml) y después con tampón 0,5
M (50 ml). Los eluatos de TEAB 0,5 M se recogieron y se evaporaron
a presión reducida. El residuo se coevaporó con MeOH (2 x 10 ml) y
después se purificó por HPLC preparativa [gradiente de HPLC: A,
TEAB 0,1 M al 100%; B, MeCN al 100%; 0-2 min, B al
5% (flujo de 2-10 ml/min); 2-15
min, B al 5-15% (flujo de 10 ml/min);
15-28 min, B al 15-22% (flujo de 10
ml/min); 28-30 min, B al 22-95%
(flujo de 10ml/min); 30-34 min, B al 95% (flujo de
10 ml/min); 34-36 min, B al 95-5%
(flujo de 10 ml/min); 36-40 min, B al 5% (flujo de
10-2 ml/min)]. El producto con tiempo de retención
de 21,3 min se recogió y se evaporó a presión reducida y el residuo
se coevaporó con metanol (3 x 5 ml) para dar el compuesto del título
en forma de la sal trietilamonio (9,3 mmol, cuantificación a
\lambda_{288} en tampón TEAB 0,1 M, al 93%). La ^{1}H RMN en
D_{2}O indicó aproximadamente cinco contraiones de
trimetilamonio.
^{1}H RMN [D_{2}O]: 7,85 (1H,
H-6, s), 6,15 (1H, H-1', t, J
6,8), 4,75 (1H, CHN_{3}, c, J 5,7), 4,38 (1H,
H-3', m), 4,09 (2H, OCH_{2}C(O), s), 3,99
(2H, CHN, s), 3,95 (1H, H-4', m),
3,86-3,60 (6H, OCH_{2}CH_{2}O,
H-5', m), 3,03 (30H, CH_{2}N, c, J 7,2),
2,22-2,12 (2H, CH_{2}, m), 1,31 (3H, CH_{3}, d,
J 5,7) y 1,11 (45H, CH_{3}, t, J 7,2). ^{31}P
[D_{2}O]: 5,14 (s). MS-ES (-), m/z, 531
[M-1].
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentaron
2-bromoetil-1,3-dioxolano
(3,3 ml, 80 mmol),
3-hidroxi-benzoato de etilo (3,32 g,
20 mmol), carbonato potásico (5,53 g, 40 mmol) y yoduro sódico (1,2
g, 8 mmol) a 120ºC en DMF (8 ml) durante 17 h. La reacción se
enfrió a temperatura ambiente y todos los disolventes se evaporaron
a presión reducida. Los residuos se repartieron entre DCM (250 ml)
y agua (250 ml). La capa de DCM se separó y la fase acuosa se
extrajo de nuevo con DCM (2 x 100 ml). Todos los extractos se
combinaron, se secaron sobre MgSO_{4} y se evaporaron a presión
reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna (4 x
25 cm). El producto se eluyó con éter de petróleo al 20%
(60-80ºC) en DCM y se obtuvo el compuesto del título
en forma de un aceite ligeramente pardo (4,63 g, al 91,8%).
APCI-MS, m/z 252,95 (M+1).
^{1}H RMN [CDCl_{3}]: 1,39 (3H, CH_{3}, t,
J 7,2), 3,96-4,09 (6H, OCH_{2}CH_{2},
ArOCH_{2}, m), 4,36 (2H, OCH_{2}, q, J 7,2), 5,31 (1H,
CH, t, J 4,0), 7,14 (1H, Ar-H, ddd, J
1,6, 2,6 y 8,2), 7,34 (1H, Ar-H, t, J 7,9),
7,59 (1H, Ar-H, dd, J 1,5 y 2,5) y 7,67 (1H,
Ar-Hm dt, J 1,4 y 7,6).
A una mezcla de éster etílico del ácido
3-([1,3]-dioxolan-2-ilmetoxi)-benzoico
(2,02 g, 8 mmol) y azidotrimetilsilano (1,17 ml, 8,8 mmol) se le
añadió SnCl_{4} (60 \mul) a temperatura ambiente en una
atmósfera de nitrógeno. Después de 2 h, a la mezcla de reacción se
le añadió metanol acuoso al 2% (10 ml) y la reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 30 minutos. Todos los disolventes se
evaporaron a presión reducida. El residuo se coevaporó con etanol
(2 x 10 ml). El residuo se purificó mediante una cromatografía en
columna (3 x 20 cm). El producto se eluyó con metanol del 0 al 1%
en DCM. El compuesto del título se obtuvo en forma de un aceite
incoloro (2.01 g, al 85,1%). APCI-MS, m/z 267,90
(M-N_{2}+1).
^{1}H RMN [CDCl_{3}]: 1,38 (3H, CH_{3}, t,
J 7,1), 3,73-3,86 (3H, OCH_{2},H_{a},
OCH_{2}, m), 3,99-4,05 (1H, OCH_{2}, H_{b},
m), 4,17 (1H, Ar-OCH_{2}, H_{a}, dd, J
4,9 y 10,1), 4,23 (1H, ArOCH_{2}, H_{b}, dd, J 5,2 y
10,1), 4,38 (2H, OCH_{2}, c, J 7,1), 4,89 (1H,
CH-N_{3}, t, J 5,1), 7,13 (1H,
Ar-H, dd, J 2,1 y 8,4), 7,36 (1H,
Ar-H, t, J 7,9), 7,60 (1H,
Ar-H, dd, J 1,0 y 2,5) y 7,70 (1H,
Ar-H, d, J 7,8).
Se agitó éster etílico del ácido
3-[2-azido-2-(2-hidroxi-etoxi)-etoxi]-benzoico
con hidróxido sódico acuoso 4 M (11,4 ml, 45,5 mmol) y etanol (11,4
ml) a temperatura ambiente. Después de 3 h, todos los disolventes
se retiraron a presión reducida y el residuo se disolvió en 50 ml de
agua. La solución se acidificó con HCl 1 N a un valor de pH de 2 y
después se extrajo con DCM (3 x 50 ml). Todos los extractos de DCM
se combinaron, se secaron sobre MgSO_{4} y se evaporaron a
presión reducida. El compuesto del título se obtuvo en forma de un
sólido incoloro (1,2 g, al 98,7%). ES-MS, m/z 265,85
(M-1).
^{1}H RMN [CDCl_{3}]:
3,75-3,90 (3H, OCH_{2}, H_{a}, OCH_{2}, m),
4,00-4,08 (1H, OCH_{2}, H_{b}, m), 4,17 (1H,
Ar-OCH_{2}, H_{a}, dd, J 4,8 y 10,1),
4,24 (1H, ArOCH_{2}, H_{b,} dd, J 5,1 y 10,1), 4,90 (1H,
CH-N_{3}, t, J 5,1), 7,19 (1H,
Ar-H, dd, J 2,5 y 8,2), 7,40 (1H,
Ar-H, t, J 8,0), 7,60 (1H,
Ar-H, s) y 7,70 (1H, Ar-H, d,
J 7,9).
A una solución de ácido
3-[2-azido-2-(2-hidroxi-etoxi)-etoxi]-benzoico
(0,535 g, 2 mmol) en THF seco (6 ml) se le añadió NaH (dispersión
al 60%, 0,246 g, 6 mmol) a 0ºC. Después de 10 minutos, se añadió
2-bromoacetato de etilo (0,488 ml, 4,4 mmol).
Después, la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó
durante 4 horas. La reacción se interrumpió vertiéndola en agua
enfriada con hielo (50 ml). La mezcla se extrajo con DCM (2 x 50
ml) y los extractos de DCM se desecharon. Después, la fase acuosa se
acidificó a un valor de pH de 2 con HCl 1 N y se extrajo con DCM (2
x 50 ml). Estos extractos de DCM se combinaron, se secaron sobre
MgSO_{4} y se evaporaron a presión reducida. El residuo se
purificó por cromatografía en columna (1 x 20 cm). El compuesto del
título, eluido con metanol al 2% en DCM, se obtuvo en forma de un
aceite (0,223 g, al 31,6%). ES-MS, m/z 351,95
(M-1).
^{1}H RMN [CDCl_{3}]: 1,29 (3H, CH_{3}, t,
J 7,2), 3,81 (2H, OCH_{2}, t, J 4,4), 3,90 (1H, OCH_{2},
H_{a}, m), 4,04 (1H, OCH_{2}, H_{b}, m),
4,13-4,27 (6H, ArOCH_{2}, OCH_{2} y
OCH_{2}C(O) ), 4,95 (1H, CH-N_{3}, m),
7,19 (1H, Ar-H, dd, J 1,7 y 8,3), 7,40 (1H,
Ar-H, t, J 7,8), 7,63 (1H,
Ar-H, s) y 7,76 (1H, Ar-H, d,
J 7,6).
Se agitó ácido
3-[2-azido-2-(2-etoxicarbonilmetoxi-etoxi)-etoxi]-benzoico
(0,212 g, 0,6 mmol) con carbonato de
N,N'-disuccinimidilo (0,184 g, 0,72 mmol) y DMAP
(0,088 g, 0,72 mmol) en THF seco (1 ml) a temperatura ambiente.
Después de 10 minutos, se añadió la sal del ácido trifluoroacético
de
N-(2-amino-etil)-2,2,2-trifluoro-acetamida
(0,194 g, 0,72 mmol) seguida de diisopropiletilamina (DIPEA) (0,251
ml, 1,44 mmol). Después, la mezcla de reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 17 horas. Todos los disolventes se
evaporaron a presión reducida y los residuos se repartieron entre
DCM (50 ml) y NaH_{2}PO_{4} (1 N, 50 ml). La fase acuosa se
extrajo adicionalmente con DCM (2 x 25 ml). Todos los extractos de
DCM se combinaron, se secaron sobre MgSO_{4} y se evaporaron a
presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en
columna (1 x 20 cm). El compuesto del título, eluido con metanol al
1% en DCM, se obtuvo en forma de un aceite (0,255 g, al 86,6%).
ES-MS, m/z 490,10 (M-1).
^{1}H RMN [CDCl_{3}]: 1,28 (3H, CH_{3}, t,
J 7,1), 3,60 (2H, CH_{2}N, m), 3,69 (2H, CH_{2}N, m),
3,80 (2H, OCH_{2}, t, J 4,3), 3,86 (1H, OCH_{2}, H_{a},
m), 4,04 (1H, OCH_{2}, H_{b}, m), 4,10-4,25
(6H, ArOCH_{2}, OCH_{2} y OCH_{2}C(O), m), 4,92 (1H,
CH-N_{3}, m), 6,85 (1H, NH, a), 7,09 (1H,
Ar-H, m), 7,37 (3H, Ar-H, m) y 7,96
(1H, NH, a).
Se agitó éster etílico del ácido
(2-{2-[3-(2-amino-etilcarbamoil)-fenoxi]-1-azido-etoxi}-etoxi)-acético
(0,196 g, 0,4 mmol) con hidróxido sódico acuoso 4 M (1 ml, 4 mmol)
y etanol (1 ml) a temperatura ambiente. Después de 2 h, todos los
disolventes se retiraron a presión reducida y el residuo se disolvió
en 15 ml de agua. La solución se extrajo con DCM (2 x 15 ml). Los
extractos de DCM se desecharon y la fase acuosa se acidificó con
HCl 1 N a un valor de pH de 2. Después, la solución se extrajo de
nuevo con DCM (3 x 15 ml). Los extractos de DCM se desecharon y la
fase acuosa se neutralizó con NaOH 1 N a un valor de pH de 8 y
después se evaporó a presión reducida a sequedad. Los sólidos de
color blanco se trituraron con DCM/MeOH (v/v; 1:1, 2 x 25 ml).
Todos los sólidos se retiraron por filtración y los filtrados se
combinaron y se evaporaron a presión reducida para dar una goma. La
goma se añadió a MeOH al 10% en DCM al 10% (15 ml) y los sólidos
insolubles de color blanco se retiraron por filtración. Los
filtrados se evaporaron a presión reducida para dar la sal
monosódica del compuesto del título en forma de un polvo incoloro
(0,135 g, al 86,6%). ES-MS, m/z 368,00 (M+1).
^{1}H RMN [D_{2}O]: 3,01 (2H,
CH_{2}NH_{2}, t, J 6,0), 3,51 (2H, CH_{2}N, t, J
6,0), 3,62 (2H, OCH_{2}, m), 3,77 (1H, OCH_{2}, H_{a}, m),
3,80 (2H, CH_{2}C(O), s), 3,96 (1H, OCH_{2}, H_{b,}
m), 4,19 (2H, ArOCH_{2}, d, J 4,3), 5,01 (1H,
CH-N_{3}, t, J 4,5), 7,13 (1H,
Ar-H, d, J 7,9) y 7,25-7,39
(3H, Ar-H, m).
El Cy3 mono N-hidroxisuccinimida éster
disponible en el mercado (5 mg, 6,53 \mumol) y el ácido
[2-{2-[3-(2-amino)-etilcarbamoil)-fenoxi]-1-azido-etoxi}-etoxi)-acético
(7,2 mg, 19,6 \mumol) se agitaron juntos en DMF seca. Se añadió
DIPEA (6,82 \mul, 39,2 \mumol). Después de 2 h de agitación a
temperatura ambiente, todos los disolventes se evaporaron a presión
reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa [gradiente de
HPLC: A, TEAB 0,1 M al 100%; B, MeCN al 100%; 0-2
min, B al 5% (flujo de 2-10 ml/min);
2-19 min, B al 5-45% (flujo de 10
ml/min); 19-21 min, B al 45-95%
(flujo de 10 ml/min); 21-24 min, B al 95% (flujo de
10 ml/min); 24-26 min, B al 95-5%
(flujo de 10 ml/min); 26-30 min, B al 5% (flujo de
10-2 ml/min)]. El compuesto del título con un tiempo
de retención de 17,85 minutos se obtuvo en forma de un sólido de
color rosa (4,93 \mumol, al 75,5%, cuantificación a 550 nm en
agua). ES-MS, m/z 488,95 [(M/2)-1].
La ^{1}H RMN en D_{2}O indicó aproximadamente 1,8 contraiones de
trimetilamonio.
^{1}H RMN [D_{2}O]: 1,15 (16,2H, CH_{3}
(Et_{3}N), t, J 7,2), 1,21 (3H, CH_{3}, t, J 7,1),
1,47 (2H, CH_{2}, m), 1,55 (2H, CH_{2}, m), 1,58 (6H, 2 x
CH_{3}, s), 1,61 (6H, 2 x CH_{3}, s), 2,10 (2H,
CH_{2}C(O), t, J 6,5), 3,06 (10,8H, CH_{2}
(Et_{3}N, c, J 7,2), 3,23 (2H, CH_{2}N, t, J
5,5), 3,32 (2H, CH_{2}N, t, J 5,8), 3,56 (2H, OCH_{2},
m), 3,67-3,78 (3H, OCH_{2}, H_{a} y CH_{2}N,
m), 3,79 (2H, OCH_{2}C(O), s), 3,85-3,97
(3H, OCH_{2}, H_{b} y CH_{2}N, m), 3,98 (2H, ArOCH_{2}, d,
J 4,4), 4,85 (1H, CH-N_{3}, t, J
4,3), 6,14 (1H, =CH, d, J 13,4), 6,19 (1H, =CH, d, J
13,4), 6,90 (1H, Ar-H, m), 7,10-7,19
(5H, Ar-H, m), 7,69 (2H, Ar-H, d,
J 8,4), 7,73 (1H, Ar-H, s), 7,77 (1H,
Ar-H, s) y 8,36 (1H, =CH, t, J 13,4).
Se agitó ácido
[2-(1-azido-2-{3-[2-(6-Cy3-hexanoilamino)-etilcarbamoil]-fenoxi}-etoxi)-etoxi]-acético
(2 \mumol) con carbonato de N,N'-disuccinimidilo
(0,563 mg, 2,2 \mumol) y DMAP (0,269 mg, 2,2 \mumol) en DMF seca
(1 ml) a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, toda la
mezcla de reacción se añadió a una solución de la sal
tri-n-butilamonio de
[5-(3-amino-prop-1-inil)]-3'-azidometoxi-dUTP
(6 \mumol, preparada por la evaporación de una solución acuosa de
[5-(3-amino-prop-1-inil)]-3'-azidometoxi-dUTP
con tri-n-butil amina (72 \mul, 300 \mumol). La mezcla
de reacción se sonicó durante 5 minutos y después se agitó a
temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla de reacción se diluyó
con TEAB 0,1 M enfriado (10 ml) y la solución resultante se aplicó
en una columna corta de DEAE A-25 (1 x 10 cm). La
columna se eluyó inicialmente con tampón TEAB 0,1 M (50 ml) y
después con tampón 1,0 M (50 ml). Los eluatos de TEAB 1,0 M se
recogieron y se evaporaron a presión reducida. El residuo se
coevaporó con MeOH (2 x 10 ml) y después se purificó mediante HPLC
semipreparativa. [gradiente de HPLC: A, TEAB 0,1 M al 100%; B, MeCN
al 100%; 0-2 min, B al 5% (flujo de
2-5 ml/min); 2-14 min, B al
5-20% (flujo de 5 ml/min); 14-20
min, B al 20-23% (flujo de 5 ml/min);
20-22 min, B al 23-95% (flujo de 5
ml/min); 22-25 min, B al 95% (flujo de 5 ml/min);
25-26 min, B al 95-5% (flujo de 5
ml/min); 26-30 min, B al 5% (flujo de
5-2 ml/min)]. El producto con un tiempo de retención
de 19,2 min se recogió y se evaporó a presión reducida y el residuo
se coevaporó con metanol (3 x 5 ml) para dar el compuesto del título
en forma de la sal trietilamonio (1,22 \mumol, cuantificación a
\lambda_{550} en tampón TEAB 0,1 M, al 61,1%). La ^{1}H RMN
en D_{2}O indicó aproximadamente siete contraiones de
trietilamonio.
^{1}H RMN [D_{2}O]: 1,14 (63H, CH_{3}
(Et_{3}N), t, J 7,3), 1,23 (3H, CH_{3}, t, J 7,1),
1,49 (2H, CH_{2}, m), 1,55 (2H, CH_{2}, m), 1,60 (6H, 2 x
CH_{3}, s), 1,62 (6H, 2 x CH_{3}, s), 1,95-2,07
(1H, H_{a}-2', m), 2,13 (2H, CH_{2}C(O),
t, J 6,7), 2,17-2,27 (1H,
H_{b}-2', m), 3,05 (42H, CH_{2} (Et_{3}N), c,
J 7,3), 3,27 (2H, CH_{2}N, t, J 5,7), 3,37 (2H,
CH_{2}N, t, J 5,8), 3,55-3,79 (5H, m),
3,80-4,10 (11H, m), 4,15 (1H, H-4',
m), 4,38 (1H, H-3', m), 4,80 (1H,
H-3', m), 4,80 (2H, OCH2-N_{3},
s), 4,88 (1H, CH-N_{3}, m), 5,95 (1H,
H-1', c, J 7,6), 6,13 (1H, =CH, d, J
13,4), 6,20 (1H, =CH, d, J 13,4), 6,84 (1H,
Ar-H, d, J 7,3), 7,05-7,24
(5H, Ar-H, m), 7,60-7,80 (5H,
Ar-H y H-6, m) y 8,35 (1H, =CH, t,
J 13,4).
^{31}P RMN [D_{2}O]: -20,82 (^{\beta}P,
m), -10,07 (^{\alpha}P, d, J 16,2) y -4,90 (^{\gamma}P,
d, J 18,9).
Tomar 15 \mul de perlas recubiertas con
estreptavidina Dynabeads® M-280 (Dynal Biotech),
eliminar el tampón de almacenamiento y lavar 3 veces con 150 \mul
de tampón TE (Tris.HCl pH 8, 10 mM y EDTA, 1 mM). Resuspender en
37,5 \mul de tampón B & W (Tris-HCl 10 nM pH
7,5, EDTA 1 mM y NaCl 2,0 M), añadir 10 \mul de ADN en horquilla
marcado con ^{32}P biotinilado y añadir 27,5 \mul de agua. Dejar
reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Eliminar el
tampón y lavar las perlas 3 veces con 100 \mul de tampón TE.
75 \mul de reacción, Tris.HCl pH 8,8 50 mM,
Tween-20 al 0,01%, MgSO_{4} 4 mM, MnCl_{2}, 0,2
mM, añadir FFN 2 \muM y polimerasa 100 nM (Thermococcus
sp. 9ºN exo ^{-}Y409V A485L suministrado por New England
Biolabs). Después, esta solución se añade a las perlas, se mezcla
minuciosamente y se incuba a 65ºC tomando muestras de 5 \mul a
los 3 y 10 minutos y deteniendo con 5 \mul de tampón de carga de
gel (xileno cianol -solución de colorante azul de bromofenol, Sigma
Aldrich). La mezcla de reacción se retira de las perlas restantes y
las perlas se lavan 3 veces con 100 \mul de tampón TE.
Una muestra se retiró de la reacción de
incorporación y se añadió a 1 \muM de dNTP (0,25 \muM cada uno).
Esto se detuvo después de 10 minutos añadiendo 5 \mul de tampón
de carga de gel.
Se añaden 50 \mul de sal trisódica de
Tris-(2-carboximetil)fosfina (TCEP) 0,1 M a
las perlas y se mezclan minuciosamente. La muestra se incubó
después a 65ºC durante 15 minutos. La solución de desbloqueo se
retira y las perlas se lavan tres veces con 100 \mul de tampón
TE. Las perlas se resuspendieron después en 50 \mul de TE y se
retiró una muestra de 5 \mul y 5 \mul de tampón de carga de
gel.
20 \mul de reacción, Tris.HCl pH 8,8 50 mM,
Tween-20 al 0,01%, MgSO_{4} 4 mM, MnCl_{2}, 4
mM, MnCl_{2}, 0,4 mM, añadir FFN 2 \muM y polimerasa 100 nM
(Thermococcus sp. 9ºN exo ^{-}Y409V A485L suministrado por
New England Biolabs). Esta solución se añade después a las perlas y
se mezcla minuciosamente y se incuba a 65ºC tomando muestras de 5
\mul en los minutos 3 y 10 y deteniendo con 5 \mul de tampón de
carga de gel.
Una muestra se extrajo de la reacción de
incorporación y se añadió a 1 \muM de dNTP (0,25 \muM cada uno).
Esto se detuvo después de 10 minutos añadiendo 5 \mul de tampón
de carga de gel.
Antes de cargar las muestras en un gel de
secuenciación desnaturalizante de acrilamida al 12% se añadieron a
cada muestra 0,5 \mul de EDTA (0,5 M) y se calientan después a
95ºC durante 10 minutos.
Claims (60)
1. Un nucleótido o nucleósido que tiene una base
unida a un marcador detectable por un enlazador escindible,
caracterizado por que el enlazador escindible contiene un
resto seleccionado del grupo que comprende:
en el que X se selecciona del grupo
que comprende O, S, NH y NQ donde Q es un grupo alquilo
C_{1-10} sustituido o no sustituido, Y se
selecciona del grupo que comprende O, S, NH y N(alilo), T es
hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-10} sustituido
o no sustituido y * indica dónde se conecta el resto a la parte
restante del nucleótido o
nucleósido.
2. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que X es O o S.
3. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que Y es O o S.
4. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Y es O.
5. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el resto
puede estar presente en el nucleótido o nucleósido en cualquiera de
dos orientaciones.
6. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la base
es una purina o una pirimidina.
7. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el
enlazador se une a la posición 5 de una pirimidina o a la posición 7
de una purina.
8. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la base
es una desazapurina.
9. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el
nucleótido tiene un resto azúcar ribosa o desoxirribosa.
10. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que el azúcar ribosa o desoxirribosa
comprende un grupo protector hidroxilo unido al átomo de oxígeno 2'
o 3'.
11. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que se pueden usar las mismas condiciones
químicas para efectuar la escisión del enlazador escindible y para
eliminar el grupo protector hidroxilo.
12. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el
nucleótido es un desoxirribonucleótido trifosfato.
13. El nucleótido o nucleósido de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el
marcador detectable es un fluoróforo.
14. Un oligonucleótido que comprende uno o más
nucleótidos como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13.
15. El oligonucleótido de acuerdo con la
reivindicación 14, en el que al menos un nucleótido está presente
en una posición terminal en dicho oligonucleótido.
\newpage
16. Un método para escindir un enlazador que
contiene un resto seleccionado del grupo que comprende:
en el que X se selecciona del grupo
que comprende O, S, NH y NQ donde Q es un grupo alquilo
C_{1-10} sustituido o no sustituido, Y se
selecciona del grupo que comprende O, S, NH y N(alilo), T es
hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-10} sustituido
o no sustituido y * indica dónde se conecta el resto a la parte
restante de un nucleótido o nucleósido, estando presente dicho
enlazador en un nucleótido o nucleósido y conectando la base del
mismo a un marcador detectable, comprendiendo dicho método poner en
contacto el nucleótido o nucleósido con un catalizador de metal de
transición basado en fosfina soluble en
agua.
17. El método de acuerdo con la reivindicación
16, en el que el metal de transición se selecciona del grupo que
comprende platino, paladio, rodio, rutenio, osmio e iridio.
18. El método de acuerdo con la reivindicación
16, en el que el metal de transición es paladio.
19. Un método para escindir un enlazador que
contiene un resto seleccionado del grupo que comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el que X se selecciona del grupo
que comprende O, S, NH y NQ donde Q es un grupo alquilo
C_{1-10} sustituido o no sustituido, T es
hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-10} sustituido o
no sustituido y * indica dónde se conecta el resto a la parte
restante de un nucleótido o nucleósido, estando presente dicho
enlazador en un nucleótido o nucleósido y conectando la base del
mismo a un marcador detectable, comprendiendo dicho método poner en
contacto el nucleótido o nucleósido con una fosfina soluble en
agua.
20. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 19, en el que dicha fosfina es una
triaril fosfina derivatizada o una trialquil fosfina
derivatizada.
21. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 20, en el que dicha fosfina es una
triaril fosfina derivatizada con una o más funcionalidades
seleccionadas del grupo que comprende amino, hidroxilo, carboxilo y
sulfonato.
22. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 21, en el que la fosfina soluble en agua
se selecciona del grupo que comprende
3,3',3''-fosfinidinotris-(ácido bencenosulfónico) o
tris-(2-carboxietil)-fosfina y sus
sales.
23. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 19, en el que dicha fosfina contiene uno
o más átomos de nitrógeno.
24. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 23, en el que X es O o S.
25. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 25, en el que Y es O o S.
26. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 25, en el que Y es O.
27. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 26, en el que los restos pueden estar
presentes en el nucleósido o nucleótido en cualquiera de dos
orientaciones.
28. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 27, en el que dicho marcador se detecta antes
de que se escinda dicho enlazador.
29. El método de la reivindicación 28, donde
dicho método incluye la escisión del enlazador en un nucleótido que
se incorpora en un oligonucleótido.
30. El método de la reivindicación 29, en el que
dicho nucleótido incorporado está presente en una posición terminal
en dicho oligonucleótido.
31. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 30, en el que la base es una purina o una
pirimidina.
32. El método de la reivindicación 31, en el que
el enlazador se une a la posición 5 de una pirimidina o a la
posición 7 de una purina.
33. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 32, en el que la base es una
desazapurina.
34. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 33, en el que el nucleótido tiene un
resto azúcar ribosa o desoxirribosa.
35. El método de acuerdo con la reivindicación
34, en el que el azúcar ribosa o desoxirribosa comprende un grupo
protector hidroxilo unido al átomo de oxígeno 2' o 3'.
36. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 35, en el que el nucleótido es un
desoxirribonucleótido trifosfato.
37. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 36, en el que el marcador detectable es
un fluoróforo.
38. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 29 a 37, en el que la etapa de incorporación
se efectúa mediante una transcriptasa inversa, una transferasa
terminal o una polimerasa.
39. El método de la reivindicación 38, en el que
la polimerasa es un Thermococcus sp.
40. El método de la reivindicación 39, en el que
Thermococcus sp. es 9ºN o un mutante simple o un doble
mutante del mismo.
41. El método de la reivindicación 40 en el que
el doble mutante es -Y409V A485L.
42. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 29 a 41, en el que el marcador detectable y/o
el enlazador escindible es de un tamaño suficiente para evitar la
incorporación de un posterior nucleótido en el oligonucleótido
naciente.
43. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 29 a 42, en el que el nucleótido incorporado
contiene un grupo de bloqueo de OH 3' que sirve para evitar la
incorporación de cualquier otro nucleótido.
44. El método de acuerdo con la reivindicación
43, en el que las mismas condiciones químicas usadas para efectuar
la escisión del enlazador escindible sirven para eliminar el grupo
de bloqueo de OH 3'.
45. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 29 a 44, en el que la etapa de detección
permite la identificación del nucleótido incorporado.
46. Un método para determinar la identidad de un
nucleótido en un polinucleótido diana monocatenario que
comprende:
- (a)
- proporcionar uno o más de los nucleótidos A, G, C y T o U en los que cada uno de dichos nucleótidos tiene una base que está unida a un marcador distinto detectable por medio de un enlazador de acuerdo con la reivindicación 1, siendo escindible dicho enlazador con una fosfina soluble en agua; y un polinucleótido naciente complementario al polinucleótido diana, siendo uno de dichos nucleótidos proporcionados adecuado para incorporación en dicho polinucleótido naciente;
- (b)
- incorporar el nucleótido adecuado para la incorporación en dicho polinucleótido naciente; y
- (c)
- realizar un método como se define en la reivindicación 45.
47. El método de acuerdo con la reivindicación
46, en el que las etapas (a) y (b) se repiten una o más veces para
que se determine la identidad de una pluralidad de bases en el
polinucleótido diana.
48. Un método de acuerdo con la reivindicación
46 o la reivindicación 47, en el que la etapa (a) comprende poner
en contacto secuencialmente los nucleótidos proporcionados con la
diana.
49. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 46 a 48, en el que la etapa (a) comprende al
menos una subetapa de proporcionar uno de dichos cuatro
nucleótidos.
50. Un método de acuerdo con la reivindicación
49, en el que la etapa (a) comprende además, después de dicha
subetapa, proporcionar simultáneamente o secuencialmente los otros
tres nucleótidos.
51. Un método de acuerdo con la reivindicación
50, en el que dichos otros tres nucleótidos se añaden
secuencialmente o proporcionando los mismos al mismo tiempo o dos
simultáneamente y después el restante o uno de los tres y después
los dos restantes simultáneamente.
52. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 46 a 48, en el que la etapa (a) comprende al
menos una subetapa de proporcionar dos de dichos cuatro
nucleótidos.
53. Un método de acuerdo con la reivindicación
52, en el que la etapa (a) comprende además, después de dicha
subetapa, proporcionar los otros dos nucleótidos simultáneamente o
secuencialmente.
54. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 46 a 48, en el que la etapa (a) comprende al
menos una subetapa de proporcionar tres de dichos cuatro
nucleótidos.
55. Un método de acuerdo con la reivindicación
54, en el que la etapa (a) comprende además, después de dicha
subetapa, proporcionar el nucleótido restante de dichos cuatro
nucleótidos.
56. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 46 a 48, en el que la etapa (a) comprende
proporcionar todos de dichos cuatro nucleótidos y ponerlos en
contacto simultáneamente con la diana.
57. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 46 a 56, en el que cualquier nucleótido no
incorporado se elimina antes de la proporción de otro
nucleótido(s) y/o la realización de la etapa (c).
58. Un método de acuerdo con la reivindicación
57, en el que la etapa (c) se efectúa sin nucleótidos inadecuados
que se habían proporcionado después de la proporción de dicho
nucleótido adecuado.
59. Uso de un nucleótido como se define en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en un método de
secuenciación Sanger o de tipo Sanger.
60. Un método para usar un nucleótido de la
reivindicación 1, donde dicho método incluye un método de
secuenciación Sanger o de tipo Sanger.
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