JP6386678B2 - 二本鎖ｒｎａの断片化方法およびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、二本鎖RNAの断片化方法、およびそれを利用した配列決定に関する。本発明はRNAウイルスの全長ゲノムの配列決定や、既知または未知のウイルスの検出に用いることができる。本発明は、ライフサイエンスおよび医療等の分野で有用である。

ウイルスの検出および探索は、ウイルスの生態学的役割を理解するため、およびウイルス感染を制御するために重要である。従来のウイルス検出方法としては、抗原抗体反応を利用して特定のウイルスタンパク質を検出することによる方法、および特定のウイルス遺伝子の塩基配列を検出することによる方法がある。またRNAシーケンシング（RNA sequencing, RNA-Seq）は、RNAウイルスメタゲノミクスのための一般的な方法であり、広くRNAウイルスの同定や探索のために使用されてきている。この方法は、試料に含まれる核酸配列を網羅的に解読し、解読結果中に、既知のウイルス配列または既知のウイルスと相同性が高い配列（未知のウイルス配列と予想される）を検出するものである。

一方、DNAは生物の遺伝情報のほとんど全てを担う分子であり、DNAシーケンシングは遺伝情報を解析するための基本手段となっている。シーケンサーを用いたDNAシーケンシングのための前処理は、主として次の段階からなる。（1）サンプルからのDNAの抽出、（2）DNAの断片化、（3）DNA末端へのアダプター配列の付加、（4）DNAの増幅。DNAの断片化には、超音波装置やネブライザーを用いた物理破砕処理法が用いられている。物理的な切断は、塩基配列に依存せず、DNA をバイアス無しにランダムに断片化することができる点で、配列解析用のDNA断片の調製に適している。超音波装置による断片化に関しては、非特許文献1において、ウイルスの二本鎖RNAに対して適用されている。非特許文献1は、二本鎖RNAウイルスによるインターフェロン誘導への断片化の効果に関するものである。

断片化に際し、切断末端のリン酸基の有無は、DNA増幅のためのアダプター配列の付加のために重要である。特許文献1は、酵素の検出方法のために、核酸分子の3’末端からリン酸基を除去する切方法を提案するが、配列解析を目的としたものではない。特許文献1は、詳細には、核酸分子にまたは核酸分子から化学的部分を付加または除去し、それによって、新規の検出可能な核酸分子が得られるように伸長する能力を核酸分子に付与することができる試料中の酵素を検出するための方法であって、酵素が存在するかどうか試験する試料を、核酸分子と相互作用させるステップと、酵素の存在下でのみ得られた新規の核酸分子を検出することによって、酵素が核酸分子と相互作用するかどうか試験するステップとを含む方法を提案する。ここで好ましくは、酵素は、核酸分子から末端リン酸を除去することができるホスファターゼであり、除去する末端リン酸は核酸分子の3’末端に存在するものである。

特表2008−545384号公報

J gen. Virol. (1974), 23, 191-195, Effect of fragmentation on interferon induction by double stranded virus RNA

従来のウイルス検出方法を実施するためには、ウイルスタンパク質に特異的な抗体、または目的のウイルスの遺伝子配列に特異的な核酸プライマーが必要である。そのため適用されるウイルスには限りがあり、またこれらの方法では事前情報のない未知のウイルスを検出することはできない。また、従来のRNAシーケンシングで得られる解析結果の多くが目的としない細胞由来の配列であり、ウイルス由来と考えられる配列は、試料や解析条件により大きく異なることがあるが、通常1％以下である。このような効率の悪さを改善するために、種々の改良が検討されてきているが、原理上、効率を向上することは、作業を煩雑にし、バイアスを発生させる。したがって未知のウイルス配列を検出可能であり、かつ効率的にウイルスの検出や探索が行える方法があれば望ましい。

地球上には、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA（ssRNA）および二本鎖RNA（dsRNA）の、4つの核酸種が存在する。これらのうち、細胞は二本鎖DNAおよび一本鎖RNAを有するが、ウイルスは一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNAおよびdsRNAを有する。すなわち、一本鎖DNAと二本鎖RNAは、ウイルス特異的な核酸種である。また、多くのRNAウイルスはライフサイクルの中でdsRNA状態をとる時期があるが、健康体の植物、動物や真菌類の細胞にはdsRNAはほとんど含まれない。そのため、dsRNAのみを抽出・精製し、配列解析を行えば、RNAウイルスについて解析できることとなる。

またシーケンシングに先立ち、適切なサイズにまでdsRNAをランダムに断片化し、増幅することができれば、RNAウイルスの全長ゲノム配列の決定のために有利である。

本発明は、以下を提供する。
［1］ RNA配列の決定方法であって：
対象二本鎖RNA（dsRNA）をランダムに断片化し、dsRNA断片を得る工程；
得られたdsRNA断片を逆転写反応とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に供し、対応するDNA断片を得る工程；および
得られたDNA断片を配列解析操作に供し、配列を決定する工程
を含む、方法。
［2］ 逆転写反応が、dsRNA断片の3’末端から開始されるものである、1に記載の方法。
［3］ 対象dsRNAの断片化が、機械的、酵素的、または化学的断片化による、1または2に記載の方法。
［4］ 対象dsRNAの断片化が、超音波処理による機械的断片化である、3に記載の方法。
［5］ 対象dsRNAの断片化が、得られるdsRNA断片の3’末端にリン酸基を残さないものである、1〜4のいずれか1項に記載の方法。
［6］ さらに、dsRNA断片の3’末端にループプライマーを連結し、プライマー連結dsRNA断片を得る工程を含み、
得られたプライマー連結dsRNA断片を逆転写反応とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に供する、5に記載の方法。
［7］ 対象dsRNAが、RNAウイルスに由来する、1〜6のいずれか1項に記載の方法。
［8］ RNAウイルスの完全長ゲノム配列を決定するための、7に記載の方法。
［9］ 未知のRNAウイルスの配列を決定するための、7に記載の方法。
［10］ 得られたdsRNA断片が、1000〜4000塩基長である、1〜9のいずれか1項に記載の方法。
［11］ DNA断片の製造方法であって：
対象dsRNAをランダムに断片化し、dsRNA断片を得る工程；および
得られたdsRNA断片を逆転写反応とそれに続くPCRに供し、対応するDNA断片を得る工程
を包む、製造方法。
［12］ 対象dsRNAが、RNAウイルスに由来する、11に記載の方法。
［13］ ウイルスの解析方法であって：
試料中のdsRNAを、DNAおよび一本鎖RNAから分離し、精製されたdsRNAを得る工程；
得られた精製dsRNAをランダムに断片化し、dsRNA断片を得る工程；
dsRNA断片を逆転写反応とそれに続くPCRに供し、対応するDNA断片を得る工程；
得られたDNA断片を配列解析操作に供し、配列を決定する工程；および
決定した配列に基づき、試料中のウイルスの有無および／または特徴を解析する工程
を含む、方法。
［14］ 試料が、生物または環境に由来する、13に記載の方法。

本発明により、効率的に、数万塩基長を超える長いdsRNA分子から千塩基程度の短いdsRNA分子の配列を従来よりも均一に決定することができる。特に、ウイルスの配列解析等において重要であり、かつ従来技術では得ることが難しい、RNAゲノムの両末端付近の配列も決定することができる。詳細には、本発明の手法はdsRNAウイルスとssRNAウイルスに由来するdsRNAを対象とするため、dsRNAの両鎖に存在する3’末端配列を決定することで、元のRNAウイルスの5’末端付近の配列も決定することができる。
また本発明により、RNAウイルスのゲノムの3’末端に対応する配列を含む、RNAウイルスゲノムに対応するDNA断片が製造される。
また本発明により、効率的にRNAウイルスの探索を行うことができる。
さらに本発明により、既知または未知のRNAウイルスの全長ゲノム配列を決定することができる。

FLDS法を既知dsRNAウイルス（MoCV1-A）のゲノム配列決定に用いた際のマッピング結果。試料として、5本のdsRNA (3554, 3250, 3074, 3043, 2879 nt)から成るRNAウイルスである、Magnaporthe oryzae chrysovirus 1 strain A (MoCV1-A)に感染しているイネいもち病菌（Magnaporthe oryzae）を用い、FLDSの性能を評価した。得られた配列データをつなぎ合わせることで、MoCV1-Aの全長ゲノム配列を再構築することができた。また、分節ゲノムそれぞれの末端領域ではCoverageが中央領域よりも高くなる傾向が見られた。 個々のウイルスごとの配列出現頻度比較。個々のウイルス配列に由来するリードが、RNA-seqおよびFLDSデータ中に出現する頻度を比較した。RNA-seqデータから1リード以上が検出されたウイルス配列37個をプロットした結果、大部分のウイルスは出現頻度が100倍以上に上昇していた。■で示した2本鎖RNAウイルスと同様、△で示した1本鎖RNAウイルスに関しても、5例中4例でFLDSによる濃縮が有効であることが示された。 RNA-seqおよびFLDSの比較。（a）RNA-seqにおいても十分なリード数が得られた3ウイルス配列についてcoverageの変動の大きさを比較するため、変動係数（準偏差 を平均で割った値の百分率表示）を算出した。その結果、FLDSでは変動係数が低くなる傾向、つまりより均一なcoverageが得られる傾向が見られた。■: 2本鎖RNAウイルス、△: 1本鎖RNAウイルス。（b〜c）RNA-seqおよびFLDSで得られたウイルスリードのcoverageを比較した。 海水から得られたRNAウイルス候補配列（地点名: Jam）。本発明の方法を用いた解析例では、705本のdsRNA由来と考えられる全長配列が得られた。半数以上の全長配列は既知RNAウイルス遺伝子と有意な配列相同性を有しておらず、新規RNAウイルス配列に加え、多数の完全に新規なRNAウイルス候補配列が得られた。本発明の方法は、得られたコンティグが既知RNAウイルス遺伝子と有意な配列相同性を有していなくても、完全に新規なRNAウイルスの存在を検知することができる。以下の図において同じ。 海水から得られたRNAウイルス候補配列（地点名: Jam）。 海水から得られたRNAウイルス候補配列（地点名: St.73）。 海水から得られたRNAウイルス候補配列（地点名: St.79）。 海水から得られたRNAウイルス候補配列（地点名: St.97）。 海水から得られたRNAウイルス候補配列（地点名: St.122）。

発明を実施するための態様

本発明および本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、特に記載した場合を除き、IUPAC-IUBの規定[IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature、 Eur. J. Biochem.、 138: 9(1984)]、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」(特許庁編)、および本技術分野において慣用されている表現に従っている。
数値範囲を「X〜Y」で表すときは、特に記載した場合を除き、両端の値XおよびYを含む。

本発明は、RNA配列の決定方法を提供する。本発明の方法は、下記の工程を含む。
（1）対象dsRNAをランダムに断片化し、dsRNA断片を得る工程；
（2）dsRNA断片を逆転写反応とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に供し、対応するDNA断片を得る工程；および
（3）得られたDNA断片を配列解析操作に供し、配列を決定する工程。

[工程1：dsRNAの断片化工程]
<dsRNA分子の精製>
工程1では、対象dsRNAが断片化されるが、対象dsRNAは断片化前または後に、精製することができる。精製は、対象dsRNAが含まれる試料からまず全核酸種を抽出する工程と、得られた抽出物から、他の核酸種を分離する工程とにより行うことができる。dsRNAの他の核酸種からの分離は種々の方法で行いうるが、例えばヒドロキシアパタイトまたはセルロース等への特異的な吸着、フェノールを用いてのdifferential extraction、または種々のヌクレア−ゼに対する感受性の違い等を利用して行うことができる。

例えば、精製は次のようにして行うことができる。対象dsRANを含む試料から従来法により全核酸種を抽出した後、得られた抽出液をセルロースカラムを通し、dsRNAをセルロースに吸着させる。必要に応じ洗浄操作を経て、適切な溶出用緩衝液を用いた溶出操作を行う。得られた溶出液には、必要に応じ、dsRNA以外の他の核酸種を分解するために有効な条件下でヌクレアーゼを作用させてもよい。

精製は、4つの核酸種を分離して取得するタンデムクロマトグラフィー法（Syun-ichi Urayama et. al., A New Fractionation and Recovery Method of Viral Genomes Based on Nucleic Acid Composition and Structure Using Tandem Column Chromatography, Microbes and Environments Vol. 30 (2015) No. 2 p. 199-203）を用いて行ってもよい。

<ランダム断片化>
核酸の「ランダム（な）断片化」とは、特に記載した場合を除き、塩基配列または位置に依存しない、定められない様式での断片化をいう。対象dsRNAのランダム断片化は、機械的、酵素的、または化学的に行うことができる。断片化の程度（得られるdsRNA断片のサイズ）は、続く工程が実施でき、本発明の目的が達成できる限り、特に限定されないが、いずれの断片化手段であっても、得られるdsRNA断片の平均サイズは、例えば150〜5000bpであり、好ましくは300〜3000bpであり、より好ましくは1000〜2000bpである。

（機械的断片化）
機械的な断片化は、DNAの断片化のための既存の装置を用い、DNAの断片化のための条件を適宜応用して行うことができる。機械化による断片化の例は、音波（例えば、超音波）による処理、細いキャピラリーまたは穴に対象dsRNAを通すことによる流体力学的な剪断処理、dsRNAの噴霧化による処理が挙げられる。断片の平均的大きさを一定に調節することが比較的容易であり、後述するように、リン酸基のない3’末端を作ることができる点で、超音波による処理が好ましい。

超音波による処理は、例えば次のように行うことができる：まず、断片化のための対象dsRNAを適切な緩衝液に溶解する。dsRNAの量（または濃度）は、特に限定されず、比較的少ない量、例えば電気泳動では検出できない量のdsRNAにも本発明が適用できていることを確認している。ここではdsRNA溶液を既存の超音波破砕機で処理し、適当なサイズにまで断片化する。断片化は、150bp〜20000bpの範囲で高度に制御して行うことができるが、本発明のためには、例えば150〜5000bpであり、好ましくは300〜3000bpであり、より好ましくは1000〜2000bpにまで断片化する。超音波処理の条件は、予備実験により決めておくことができる。超音波処理は、温度上昇を防ぐため、必要に応じ、冷却しながらおこなうことができる。断片化処理後、必要に応じ、電気泳動等の手段を用いて、断片化したdsRNAのサイズを確認することができる。得られたdsRNA断片は、必要に応じエタノール沈殿等の手段を用いて濃縮した後に適切な溶媒に再溶解する。得られたdsRNA断片溶液の濃度を確認し、必要に応じ、適当な濃度に調整する。

（酵素的断片化）
ここでいう酵素的断片化は、塩基配列に依存せず、dsRNA をバイアスなしにランダムに、目的のサイズにまで断片化することができる方法を指す。酵素的断片化は、超音波破砕装置などの特殊な装置を要しない点で好ましい方法である。切断は既存の酵素、 例えばRNase III系（Dicer等）（http://www.amsbio.com/Recombinant-Human-Turbo-Dicer-Enzyme-Kit--siRNA.aspx、http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFFiles/6147_j.pdf）、RNaseV1系（"RNase V1 preferentially cleaves phosphodiester bonds 3'of double-stranded RNA" Kertesz, Michael, et al. "Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast." Nature 467.7311 (2010): 103-107.）はdsRNAをランダムに切断可能だと考えられ、本発明に用いることができる。酵素的断片化によって得られるdsRNA断片の末端が突出末端であれば、必要に応じ、平滑化してもよい。なお、RNaseIIIの切断産物の3'末端はヒドロキシ基である（Meister, Gunter, and Thomas Tuschl. "Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA." Nature 431.7006 (2004): 343-349.）。

酵素による断片化処理は、例えば次のように行うことができる：適切な溶媒に溶解したdsRNAを準備し、用意した酵素ミックスを加えてよく混合した後、断片化上有効な温度（例えば、30〜45℃）で反応を開始する。反応時間は、例えば37℃でインキュベートする場合であって、100〜1000bpの断片を得たい場合は、15〜25分とすることができる。反応時間を長くすることにより、より小さいサイズのdsRNA断片を得ることができ、反応時間を短くすることにより、より大きいサイズのdsRNA断片を得ることができる。反応に供するdsRNAが少ない場合等、反応時間をより長くすることが好ましいことがある。通常、EDTAを添加することにより、反応を停止することができる。断片化処理後、必要に応じ、電気泳動等の手段を用いて、断片化したdsRNAのサイズを確認することができる。

（化学的断片化）
DNAの化学的断片化は、既存の手段により実施することができる。既存の手段の例は、酸もしくはアルカリ触媒性加水分解、金属イオンおよび複合体による加水分解、ヒドロキシルラジカル処理または放射線処理が挙げられる。化学的断片化の例には、熱による断片化も含まれる。熱断片化は、例えば、約40℃以上で行われる。当業者であれば、pHおよび／または塩濃度のような、温度以外のパラメーターが切断に影響を及ぼすことを理解し、種々の条件を設計しうる。例えば、熱断片化の条件は、95℃（約80℃〜100℃の温度範囲）で低塩緩衝液（L−TE緩衝液）中で中性pH（pH6．0〜9．0）を包含する。

（3’末端にリン酸基を残さない断片）
好ましい態様の一つにおいては、断片化は、3’末端にリン酸基を残さない手段で行われる。リン酸基のない3’末端、すなわち3’−水酸基は、一般的なRNAリガーゼ（http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100003136、http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php?pGMPID=0206003を参照）により、5'-リン酸基を有する核酸とリン酸ジエステル結合でつなぐことができるので、後述するプライマーとの連結が容易だからである。一般的なRNAリガーゼは、3’−水酸基と5'-リン酸基以外の組み合わせ、例えば3'-リン酸基と5'-水酸基、3'-水酸基と5'-水酸基、3'-ダイデオキシヌクレオチドと5'-リン酸基、3'-水酸基と5'-三リン酸等とは反応せず、連結しない。

工程1により得られたdsRNA断片は、次いで工程2に供される。

[工程2：逆転写およびPCR]
<3’末端からの逆転写>
工程2では、工程1で得られたdsRNA断片が逆転写反応に供され、次いでPCRにより、工程1で得られたdsRNA断片に対応するDNA断片を得る。本工程は、より詳細には、dsRNAの変性（一本鎖化）、プライマーを用いた逆転写、RNA鎖の分解、DNAポリメラーゼによるDNA増幅を含む。

逆転写反応に使用されるプライマーは、使用される酵素反応条件において鋳型RNAから逆転写の起点となるものであれば特に限定されないが、鋳型RNAの3’末端より逆転写が開始できるものを用いることが好ましい。ウイルスの解析等において重要であり、かつ従来技術では得ることが難しい、RNA3'末端配列を含む逆転写産物を得ることができるからである。3’末端より逆転写が開始できるプライマーの例には、鋳型RNAの3’末端に付加して用いられるループプライマー、鋳型RNAの3’末端へのpoly(A)ヌクレオチドの付加ともに用いられるオリゴdT プライマー、terminal deoxynucleotide transferaseによるd(G)、d(T)もしくはd(C)の付加とともに用いられる対応するプライマー、および鋳型RNAの3'末端への単純な一本鎖DNAアダプターの付加とともに用いられる対応するプライマーが含まれる。好ましい態様の一つにおいては、ループプライマーが用いられる。鋳型RNAの3’末端へのプライマーや特定配列の付加は、当業者であれば公知の任意の方法により実施できる。

一般に、プライマーの設計は、通常、Tm値、各プライマー領域の末端安定性、GC含量、二次構造の4つに留意して行われる。また、プライマーダイマーの生成を防ぐために、3'末端が相補的にならないように設計される。本発明に使用するプライマーにおいても同様である。本発明においては、既存のプライマーを利用してもよい。

ループプライマーを用いる場合、ループを形成する部分は、20〜80塩基長になるように設計することができ、必要に応じ、〜100、または〜120まで拡げてもよい。全体の長さは、例えば40〜200塩基長であり、好ましくは50〜100塩基長である。ポリA部分やアダプターに対して用いるプライマーの場合、長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは6塩基長以上であり、より好ましくは9塩基長以上である。DNA合成の観点からは、好ましくは100塩基長以下であり、より好ましくは30塩基長以下である。

なお、以下では、本発明をループプライマーを用いた場合を例に説明することがあるが、当業者であれば、その説明を適宜他のプライマーを用いた場合に適用して理解することができる。また、dsRNAのランダム断片化およびループプライマーの使用を含むdsRNAの配列の決定方法を特に、FLDS（fragmented and loop primer ligated dsRNA sequencing）と称することがある。

ループプライマーの付加、またはポリ（A)ヌクレオチドもしくは一本鎖DNAアダプターの付加は、通常、dsRNAに対して行われ、次いでdsRNAの変性（一本鎖化）のための反応が行われる。dsRNAの変性のための条件は、当業者であれば適宜設定できる。数百〜5000bp程度に断片化されたdsRNA であれば、通常、90〜98℃における数秒〜数分間の処理の後、急冷することにより、行うことができる。

逆転写反応（cDNA鎖の合成）は、付加されたループプライマーまたは付加配列とプライマーとの組み合わせを利用して行われる。使用される酵素は、RNAを鋳型としたDNA合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（AMV RTase）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（MMLV RTase）、ラウス関連ウイルス2逆転写酵素（RAV−2 RTase）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つDNAポリメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属細菌由来DNAポリメラーゼ、Tth（Thermus thermophilus）DNAポリメラーゼ等あるいは好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼが好ましく、B．st（Bacillus stearothermophilus）由来DNAポリメラーゼ（Bst DNAポリメラーゼ）、さらにBca（Bacillus caldotenax）由来DNAポリメラーゼが好ましい。逆転写酵素活性を有する酵素は、目的の活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。

逆転写反応のための条件は、当業者であれば、用いる酵素に応じて適宜設定できる。数百〜5000bp程度の長さのRNAを鋳型とする場合であれば、逆転写反応は、例えば30〜50℃で、数十分〜数時間により実施でき、続いて60〜80℃で数分〜数十分処理することにより、酵素を不活性化できる。逆転写反応により、RNA-DNAハイブリッドが形成される。

得られたRNA-DNAハイブリッドのRNA鎖は、化学的手法または適切な酵素等により分解してもよい。化学的手法による場合、例えば溶液をアルカリ性にした後、加熱することによりRNAのみを分解することができる。酵素を用いる場合、使用される酵素は、典型的にはリボヌクレアーゼH（Ribonuclease H, RNAse H）である。この酵素は非特異的なエンドヌクレアーゼであり、加水分解によってRNA切断を触媒する。RNAse Hは5'末端リン酸化物を生じる。RNA分解のための条件は、当業者であれば用いる酵素に応じて適宜設定できる。例えば30〜50℃で、数十分〜数時間により実施でき、続いて60〜80℃で数分〜数十分処理することにより、酵素を不活性化できる。逆転写反応の後またはRNAse H 処理の後に、余剰の鋳型RNA鎖を除去する操作を行ってもよい。RNA-DNAハイブリッドのRNA鎖の分解により、一本鎖DNAを得ることができる。

RNA-DNAハイブリッドのRNA鎖分解の効果はPCR の初期変性により代替できる場合がある。したがって、RNAseHを用いてRNAを分解する反応を行う代わりに、続くPCR反応の初めの変性を、DNAとRNAのハイブリッドが強固であることを考慮して、反応時間を長めに設定することとしてもよい。

RNA-DNAハイブリッドのRNA鎖分解により得られた一本鎖DNAは、必要に応じ脱塩および濃縮工程に供することができる。一本鎖DNAは、いったん高温とした後に徐々に温度を下げることによりアニールさせることができ、場合によりDNAポリメラーゼで処理された後、二本鎖のcDNAを得ることができる。二本鎖cDNAは、続くPCR反応により、増幅される。

<PCR反応>
本発明に適用されるPCR反応は、同種の目的で利用される種々のものを適用することができる。PCR反応は、通常、二本鎖鋳型DNAの一本鎖への変性、プライマーのアニール、およびプライマーからの相補鎖合成（伸長）のステップにより実施することができる。また、本発明に適用されるPCRのための条件は、当業者であれば適宜設計することができるが、例えば変性（80〜98℃、数分）、アニーリングおよびポリメラーゼによる伸長反応（65〜75℃、数分）からなる処理を5〜50サイクルを行うことによる。この処理の後、小分子のcDNAやプライマーダイマーを除くための処理をおこなってもよい。PCR反応により、dsRNA断片に対応する、増幅された二本鎖DNA断片は、続く配列決定工程に供される。PCR産物は、適当な精製方法、例えば、マイクロコン−100のようなPCR産物精製用の分子ふるいに供して、精製したのちに配列決定工程に供してもよい。

[工程3：配列を決定する工程]
<配列データの取得>
配列決定工程は、PCR産物である各DNA断片からの塩基配列データの取得と、それらの配列データを処理することによる全長配列の解析とを含む。
DNA断片からの塩基配列データの取得には、既存のシーケンサーを使用することができる。また、市販のシーケンシングキットを用いてもよい。好ましい態様の一つにおいて、塩基配列の決定には次世代シーケンサーと呼ばれる、相補鎖DNAを合成しながら読み取りを行う（Sequencing By Synthesis, SBS. Bentley et al. (2008) Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature 456: 53-59）ための手段が用いられる。

次世代シーケンサーによる配列決定工程は、通常、サンプル調製、クラスター形成、シーケンシング、およびデータ解析のステップを含む。サンプル調製は、シーケンサーで配列を解析するためのライブラリーを作製するステップであり、通常、DNAの200〜600bpへの断片化、アダプター配列とプライマー配列の付加、必要に応じ、DNAが由来する試料を識別するためのインデックスの付加を含む。サンプル調製のためには、用いるシーケンサーに応じた各種のキットが市販されており、本発明においても利用することができる。クラスター形成は、調製したDNAライブラリーを シーケンスの際に検出可能な充分量に増やす目的で行う増幅ステップである。典型的には、クラスター作製は フローセルと呼ばれるガラス基板上で行われる。SBS法によるシーケンシングは、塩基配列に依存する蛍光を読み取るためのステップである。SBS法は、サンガー法の改良法であり、蛍光標識され、かつ3'末端に保護基を有するために鎖伸長がそれ以上は行われない4種の塩基を用いて行われる。4種の塩基は蛍光の種類で識別される。データ解析は、データを綜合して塩基配列を得るステップである。

次世代シーケンサーによる配列決定のための情報は、例えばIllumina Technologies(www.illumina.com)から入手可能であり、またWO2004/018497、WO2004/018493、WO2004/050915、WO2004/076692、WO2005/021786、WO2005/047301、WO2005/065814、WO2005/068656、WO2005/068089、WO2005/078130を参照することができる。

次世代シーケンサーにより、1ランあたり少なくとも1000リード（読み取った断片）、1ランあたり少なくとも10,000リード、1ランあたり少なくとも100,000リード、1ランあたり少なくとも500,000リード、または1ランあたり少なくとも1,000,000リードを生成することができる。また1リードあたり約30塩基長の配列データ、約40塩基長の配列データ、約50塩基長の配列データ、約60塩基長の配列データ、約70塩基長の配列データ、約80塩基長の配列データ、約90塩基長の配列データ、約100塩基長の配列データ、約110塩基長の配列データ、約120塩基長の配列データ、約150塩基長の配列データ、約200塩基長の配列データ、約250塩基長の配列データ、約300塩基長の配列データ、約350塩基長の配列データ、約400塩基長の配列データ、約450塩基長の配列データ、約500塩基長の配列データ、約550塩基長の配列データ、約600塩基長の配列データ、約650塩基長の配列データ、または約700塩基長の配列データ、またはそれ以上を生成することができる。

<配列データ処理>
配列データ処理は、数百塩基長のDNAの断片からの配列データに基づき、より長い、好ましくは全長の遺伝子または全長ゲノムの配列を再構築するために行われる。配列データ処理のために、各種のプログラムが開発されており、本発明のためにも使用することができる。配列データ処理は、通常、シーケンサーからのデータ群のインポート、配列データアダプターおよびプライマー等の余分な配列データのトリミング、低品質の配列領域の除去、リード配列データのアセンブル、の各ステップを含む。配列のアセンブルは、2つ（de-novo: 読み取った断片をアセンブルして、それまでに未知のゲノム配列の再構築する、およびマッピング: 既存のゲノム配列を参照配列として、それにリードをマッピングする）の方法に大別できるが、本発明ではいずれも好適に実施できる。

<作用・効果、利点等>
上記の本発明のRNA配列の決定方法により、効率的に、数万塩基長を超える長いdsRNA分子から千塩基程度の短いdsRNA分子の配列を従来よりも均一に配列を決定することができる。特に、ウイルスの配列解析等において重要であり、かつ従来技術では得ることが難しい、RNAゲノムの両末端付近の配列も決定することができる。詳細には、本発明の手法はdsRNAウイルスとssRNAウイルスに由来するdsRNAを対象とするため、dsRNAの両鎖に存在する3’末端配列を決定することで、元のRNAウイルスの5’末端付近の配列も決定することができる。ウイルスゲノムの末端配列は重要な情報を含んでおり、それを確実に取得できることは、有利である。

また、ウイルスが有する分節ゲノムの末端配列は、多くの場合、分節間で保存されている。分節ゲノムの内、一つの分節が同一性検索でウイルス様配列と推定されるものの、他の分節は既知のウイルス配列と相同性を示さなかった場合、末端配列が共通していればこれらの分節が同一のウイルス由来であると推定することができる。つまり、既知のウイルス配列と同一性を示さない未知の分節も、本発明によりウイルスと同定できる可能性がある。

[本発明の応用、他の態様など]
<ウイルスの解析>

本発明の方法は、RNAウイルスの完全長ゲノム配列を決定するために用いることができる。また未知のRNAウイルスの配列を決定するために用いることができる。
本発明の方法によりdsRNAの配列が決定されるが、多くのRNAウイルスはライフサイクルの中でdsRNA状態をとる時期がある一方で、健康体の植物、動物や真菌類の細胞にはdsRNAはほとんど含まれない。したがってdsRNAの存在はウイルスの存在を表し、決定されたdsRNAの配列はウイルス解析のために用いることができる。ウイルスの解析は、ウイルスの検出、および既知のウイルスとの配列比較による特徴づけ、等を含む。

本発明のウイルスの解析方法は、少なくとも次の工程を含む：
・試料中のdsRNAを、DNAおよび一本鎖（ssRNA）から分離し、精製されたdsRNAを得る工程；
・得られた精製dsRNAをランダムに断片化し、dsRNA断片を得る工程；
・dsRNA断片を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）に供し、対応するDNA断片を得る工程；
・得られたDNA断片を配列解析操作に供し、配列を決定する工程；および
・決定した配列に基づき、試料中のウイルスの有無および／または特徴を解析する工程。
上述のRNA配列の決定方法に関して述べた説明は、ウイルスの解析方法においてもあてはまる。

<新規RNAウイルス、その全長配列>
本発明はまた、本発明の方法で見いだされた31の新規なポリヌクレオチド（全長配列）、該ポリヌクレオチドのいずれかで構成される22個のウイルスゲノム、および該ウイルスゲノムを含んでなるウイルスを提供する。本発明はまた、本発明の方法で見いだされた718本の新規なウイルス由来のポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドのいずれかで構成されるウイルスゲノム、および該ウイルスゲノムを含んでなるウイルスを提供する。具体的には、本発明は以下を提供する。

下記の（A）、（B）または（C）のポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドで構成されるウイルスゲノム、または該ウイルスゲノムを含んでなるウイルス：
（A）配列番号1〜31、および配列番号34〜751の何れかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（B）（A）に記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ（A)に記載のポリヌクレオチドのいずれかで構成されるウイルスゲノムを含んでなるウイルスと分類学上同一である変異ウイルスのゲノムを構成可能な、ポリヌクレオチド；
（C）（A）に記載のポリヌクレオチドと高い同一性を有し、かつ（A)に記載のポリヌクレオチドのいずれかで構成されるウイルスゲノムを含んでなるウイルスと分類学上同一である変異ウイルスのゲノムを構成可能な、ポリヌクレオチド。なお配列表中、<212>に記載された配列のタイプDNAは、RNAと読み替えることができ、配列中のtはuと読み替えることができる。

配列番号1〜31のポリヌクレオチドについて、ウイルス名、塩基長および分類を下表にまとめた。表中、配列番号1、2、23、27および29は、ゲノム構造が新規のウイルスまたは動物病原ウイルスと同じ科のウイルスである。

本発明でポリヌクレオチドに関し、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」というときは、特に記載した場合を除き、いずれのポリヌクレオチドにおいても、ハイブリダイゼーションの条件は、Molecular Cloning． A Laboratory Manual． 2nd ed．（Sambrook et al．，Cold Spring Harbor Laboratory Press）およびHybridization of Nucleic Acid Immobilization on Solid Supports（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138，267−284（1984））の記載に従い、取得しようとするポリヌクレオチドに合わせて適宜選定することができる。例えば85％以上の同一性を有するDNAを取得する場合、2倍濃度のSSC溶液および50％ホルムアミドの存在下、45℃でハイブリダイゼーションを行った後、0．1倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、60℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。また90％以上の同一性を有するDNAを取得する場合、2倍濃度のSSC溶液および50％ホルムアミドの存在下、50℃でハイブリダイゼーションを行った後、0．1倍濃度のSSC溶液）を用い、65℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。

本発明で塩基配列（ヌクレオチド配列ということもある。）に関し、同一性というときは、特に記載した場合を除き、2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で共有する一致したヌクレオチドの個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×100で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al．，J．Mol．Biol．215（1990）403−410に記載されるNBLASTおよびXBLASTプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラム（例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。

本明細書において、塩基配列の同一性し、「高い」とは、特に記載した場合を除き、少なくとも70％、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは97．5％以上さらに好ましくは99％以上の配列同一性を有することを指す。

<DNA断片の製造方法>
本発明はまた、DNA断片の製造方法も提供する。この方法は、少なくとも下記の工程を含む：
・対象dsRNAをランダムに断片化し、dsRNA断片を得る工程；および
・得られたdsRNA断片を逆転写反応とそれに続くPCRに供し、対応するDNA断片を得る工程。
この方法により得られたDNA断片は、
上述のRNA配列の決定方法に関して述べた説明は、ウイルスの解析方法においてもあてはまる。

<試料>
本発明においては、対象dsRANを含む試料が用いられるが、試料はあらゆる生物または環境に由来するものから調製される。試料は、例えば、ウイルス、微生物、植物、または動物、それらの一部（例えば、器官もしくは臓器、細胞等）、それらから得られたもの（例えば、抽出液、体液、排泄物、等、それらの生活圏の一部（例えば、培養液、水系環境、土壌、空気等）でありうる。生物は、健常な状態にある場合と、疾患または何らかの病的な状態にある場合とがありうる。

試料の具体例として、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物および細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物および動物のような核酸含有試料、ウイルスまたは細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水、海水、および温泉水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であってもよい。このような調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、mRNAを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたDNAあるいはRNA等の核酸等も好適に使用できる。

以下に開示される技術は、本発明の態様の一つを、実験により裏付ける目的で示されたものであることは、当業者により理解される。本願による権利範囲は、特許請求の範囲に基づき解釈され、この実施例の項に記載された態様に留まらない。

[Material & Methods]
<Magnaportheoryzae chrysovirus 1 strain A>
Magnaporthe oryzae chrysovirus 1 strain A (MoCV1-A)に感染しているイネいもち病菌S-0412-II 1aをYG液体培地（0.5 % yeast extract、2 % glucose）に植菌し、25℃にて2週間、60 r.p.mで往復振盪培養した。（本菌はベトナム産のイネいもち病菌で取り扱いには許可が必要なため、許可を持っている東京農工大学の寺岡教授の下で行った。また、MoCV1-Aについては関連する特許または特許出願がある（例えば、EP2679675、US2011-0020289等）。

<珪藻試料>
珪藻コロニーは2014年4月に東京湾の潮だまり(35.3405°N, 139.6396°E)からサンプリングした。 コロニーは蒸留水で洗浄後、-80℃にて保管した。

<dsRNA の精製と断片化>
dsRNA精製はOkada et al.を一部改変して行った。試料を液体窒素存在下、乳鉢で破砕し、全核酸を抽出した。セルロース粉末（Cellulose D; ADVANTEC, Tokyo, Japan）を詰めたマイクロスピンカラム（(empty Bio-spin column; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA）を用いてdsRNAを2度精製した。（MoCV1-A試料に関してはここまで東京農工大学で行った。）溶出した核酸溶液を調整し（終濃度：57 mM CH₃COONa, 9.5 mM MgCl₂, 1.9 mM ZnSO₄, 189 mM NaCl）、DNAseI (amplification grade, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)とS1 nuclease (Invitrogen)を37 °Cで2時間処理した。得られたdsRNA溶液を調製し（終濃度：90 mM CH₃COONa, 15 mM MgCl₂, 3 mM ZnSO₄, 300 mM NaCl）、RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)にてdsRNAを回収した。

回収したdsRNAにShortCut RNAse III (NEB Japan, Tokyo, Japan)添付の10× ShortCut bufferと10× MnClを1×になるように加えた。溶液をSnap-Cap microTUBEに入れ、Covaris S220 (Woburn, MA, USA)（条件：35 sec run, peak power 140.0 W, duty factor 2.0 %, and 200 cycles/burst）にてdsRNAを断片化した。これを2等分し、ShotCut RNAse III (NEB)を添加したサンプルとしていないサンプルを作成し、37℃で40分間保持した。その後ZymoClean Gel RNA Recovery Kit (ZymoResearch, Orange, CA).を用いてdsRNAを回収した。なお、この実験では100ng程度のdsRNAを使用し、断片化はおよそ1500bpに切断するためのものとして予め決定した条件で行った。

<cDNA合成と増幅>
Potgieter, et al. ("Improved strategies for sequence-independent amplification and sequencing of viral double-stranded RNA genomes." Journal of General Virology 90.6 (2009): 1423-1432. )に記載の方法に従い、PC3-T7ループプライマー (5'- p-GGA TCC CGG GAA TTC GGT AAT ACG ACT CAC TAT ATT TTT ATA GTG AGT CGT ATT A-OH-3'(SEQ ID NO:1))を断片化dsRNAにライゲーションした。ライゲーション後のdsRNAはMinElute Gel Extraction Kit (Qiagen)により濃縮・精製した。終濃度15%(v/v)となるようDMSOを加えた後、95℃で3分熱処理し、氷上で急冷した。付加したループプライマー部分をプライマー代わりとし、Superscript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)を用いて逆転写反応を行った。DNA-RNAハイブリッドのRNAを除去後、対応するDNAをMinElute PCR cleanup kit (Qiagen)により濃縮・精製した。得られたDNAは95℃から50度まで徐々に温度を下げることで、相補配列を持つDNAとアニーリングさせた。KOD-plus Neo (Toyobo, Osaka, Japan) PCR溶液のヒートアクチベーション後、アニーリング済みDNAを加えて68℃で維持することで完全な2本鎖DNAとした。以降PC2プライマー（5’- CCGAATTCCCGGGATCC-3'）を用いて下記の条件でPCR反応によるDNAの増幅を行った。96℃2分; [98℃ 10秒, 68℃ 2分]18サイクル。増幅産物に含まれるプライマー等の低分子産物はSPRIselect reagent kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)を用いて除去した。

<全RNA抽出、cDNA合成、ライブラリー構築>
TRIzol Plus RNA Purification Kit (Invitrogen)を用いて珪藻コロニーより全RNAを抽出した。得られたRNA画分をDNaseI (Takara, Otsu, Japan)で処理することで、残存するDNAを除去した。RNAに対応する配列を有するdsDNAはPrimeScript Double Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)によりランダムプライマー（9塩基）を用いて合成した。得られたdsDNAはQubit dsDNA HS Kitを用いて定量した。

<Illumina を用いたシーケンス解析>
cDNAをCovaris S220 (Woburn, MA, USA)（4℃、Snap-Cap microTUBE、55秒, peak power 175.0 W、 duty factor 5.0 %、cycles/burst 200 cycles）を用いて超音波にて断片化した。イルミナシークエンスライブラリーはKAPA Hyper Prep Kit Illumina platforms (Kapa Biosystems, Woburn, MA, USA)を用い、添付の手法に従い構築した。ライブラリーはKAPA library quantification kit (Kapa Biosystems)を用いて定量した。得られたライブラリーをIllumina MiSeq platforms (San Diego, CA, USA)を用いてペアエンドシークエンス解析を行った。

<配列データ処理>
シークエンシング解析により得られた生配列はCLC Genomics Workbench (CLC Bio, Aarhus, Denmark)を用いて取り扱った。低クオリティー配列、およびシークエンスアダプターやPC2プライマー配列、コントロールとして添加したPhiX配列、実験上の混入配列（0.05%以下）を除去した。残った配列をde novo アッセンブルし、この配列を元にTablet viewerを用いてマニュアルでコンティグの確認および伸長を行った。最終的には得られたコンティグ中、平均覆度（average coverage）が10以上、最低覆度が3以上、1000塩基長以上のものを以降の解析に供した。特に優先する配列が10リード以上一定の位置で終了していた場合は、その部位をコンティグの末端と認定した。この認定が正しことは、トリミング前のこれら配列には末端配列直後にPC2配列が存在することからも支持された。（ただし、塩基長にバリエーションを有するpolyA配列を持つウイルスは除く。）コンティグ間の比較解析により70-9-%の配列同一性を有するコンティグが見つかった場合にはそれら配列は同一ウイルス種の異なるゲノムタイプとした。90％以上の配列同一性を有するコンティグが見つかった場合には、それら配列は同一ゲノムタイプの配列として優占するコンティグ配列のみを解析に使用した。アッセンブル配列の取り扱いにはGenetyx-MAC software version 17.0.0 (Genetyx Corp., Tokyo, Japan)を用いた。small subunit rRNAの取得にはEMIRGEを使用した。

<系統解析>
RNAウイルスで共通に保存されているRNA依存RNA合成酵素RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)のアミノ酸配列を元に各ウイルスの系統関係を推定した。de novoアッセンブルされたコンティグ中の推定アミノ酸配列および既知RNAウイルスのRdRp配列のマルチプルアライメントはClustalX 2.0 および MEGA5ソフトウェアを使用して作製した。マルチプルアライメントに基づく系統推定にはMrBayes 3.2.3を使用し、アミノ酸置換モデルにはRtREV+I+G+Fを使用した。

[既知ウイルスを用いたFLDSの性能評価]
試料として、Magnaporthe oryzae chrysovirus 1 strain A (MoCV1-A)に感染しているイネいもち病菌（Magnaporthe oryzae）を用い、FLDSの性能を評価した。なお、MoCV1-Aは、5本のdsRNA (3554, 3250, 3074, 3043, 2879 nt)から成るRNAウイルスである。

得られた配列データをつなぎ合わせることで、MoCV1-Aの全長ゲノム配列を再構築することができた。再構築されたMoCV1-A配列は、データベース（DNA Data Bank of Japan、http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html）上で公開されているMoCV1-A配列（AB560761〜AB560764およびAB700631）とほぼ一致した（> 99.9%）。また、分節ゲノムそれぞれの末端領域ではCoverageが中央領域よりも高くなる傾向が見られた（図1参照）。

FLDSにより、dsRNA分子の全長配列を決定することができた。また、FLDSに拠れば、一般にRNA分子の末端配列決定に使われるRACE法等は不要であった。この方法により、重要な情報を含む末端配列の確実な取得が、期待できることが分かった。また末端配列が共通していれば、それらの分節が同一のウイルス由来であると推定することができるから、既知のウイルス配列とは同一性を示さない未知の分節もウイルスと同定できる可能性がある。

[環境試料からのRNAウイルス探索]
（1） 珪藻の群体1gの試料中に含まれるRNAウイルスを探索した。得られた配列データから再構築された配列より、42本をウイルス配列と認定した。うち31本は全長配列が得られており、ここから22個のウイルスゲノム（全て新種）が再構成された（表2参照）。●を付した配列はデータベース上に相同性を有する既知配列が存在しなかったが、ゲノム末端配列や近縁ウイルスのゲノム構造を基に、ウイルスゲノムの一部であると決定した。

（2−1） 次いで、一般にRNAウイルス探索に利用されるRNA-seq法とFLDSを比較した。再構築された42本のウイルス配列に対してそれぞれの解析で得られたリードをマッピングした結果、FLDSでは98.2%のリードがマッピングされたのに対し、RNA-seqでは0.3%に留まった（表3参照）。また、RNA-seqデータのみを用いてウイルスゲノムを再構築した場合、6本の部分配列が得られるのみだった。RNA-seqデータでのみ検出されるウイルスは存在しなかった。

（2−2） 個々のウイルス配列に由来するリードが、RNA-seqおよびFLDSデータ中に出現する頻度を比較した（図2参照）。RNA-seqデータから1リード以上が検出されたウイルス配列37個をプロットした結果、大部分のウイルスは出現頻度が100倍以上に上昇していた。△で示した1本鎖RNAウイルスに関しても、5例中4例でFLDSによる濃縮が有効であることが示された。

（2−3） RNA-seqおよびFLDSで得られたウイルスリードのcoverageを比較した（図3参照）。RNA-seqにおいても十分なリード数が得られた3ウイルス配列についてcoverageの変動の大きさを比較するため、変動係数（準偏差 を平均で割った値の百分率表示）を算出した。その結果、FLDSでは変動係数が低くなる傾向、つまりより均一なcoverageが得られる傾向が見られた。

[海水からのRNAウイルス探索]
・実験方法
＜海水試料採取とウイルス粒子精製＞
計５地点 [Jam, St73, St79, St97, St122]（下表参照）より海洋表層水をサンプリングした。各地点2Lの海水を孔径0.2μmのセルロースアセテートメンブレンフィルターでろ過し、フィルターは-80℃にて保管した。ろ液に含まれるウイルス粒子はJohn et al.（"A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation." Environmental microbiology reports 3.2 (2011): 195-202.）に記載の方法に従い濃縮し、保管した。ウイルス濃縮試料を溶解後、さらに塩化セシウム密度勾配遠心（274,000 g、48時間）に供し、密度1.30-1.48 （g/cm3）の領域を回収、濃縮することで精製ウイルス粒子を得た。

＜核酸抽出とRNA精製＞
セルロースアセテートメンブレンフィルター上の細胞をフィルターごと液体窒素存在下、乳鉢で破砕し、Urayama et al.（"FLDS: a comprehensive dsRNA sequencing method for intracellular RNA virus surveillance." Microbes and Environments 31.1 (2016): 33.）に従い全核酸を抽出した。精製ウイルス粒子も同様の核酸抽出液に溶解し、全核酸を抽出した。これら全核酸溶液からdsRNAおよびssRNAをUrayama et al.（"A new fractionation and recovery method of viral genomes based on nucleic acid composition and structure using tandem column chromatography." Microbes and Environments 30.2 (2015): 199.）に従い分画した。
得られたdsRNAは珪藻の場合に準じてセルロース粉末（Cellulose D; ADVANTEC, Tokyo, Japan）を詰めたマイクロスピンカラム（empty Bio-spin column; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA）を用いて2度精製した。溶出した核酸溶液を調整し（終濃度：57 mM CH3COONa, 9.5 mM MgCl2, 1.9 mM ZnSO4, 189 mM NaCl）、DNaseI (amplification grade, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)とS1 nuclease (Invitrogen)を37℃で2時間処理した。得られたdsRNA溶液を調製し（終濃度：90 mM CH3COONa, 15 mM MgCl2, 3 mM ZnSO4, 300 mM NaCl）、RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)にてdsRNAを回収した。さらに、Nuclease-free waterを用いて溶出したdsRNA溶液を調整し（終濃度：200 mM NaCl, 20 mM Tri-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA pH 8.0）、珪藻の場合に準じてdsRNAを断片化した。

＜cDNA合成と増幅＞
Potgieter, et al. ("Improved strategies for sequence-independent amplification and sequencing of viral double-stranded RNA genomes." Journal of General Virology 90.6 (2009): 1423-1432. )に記載の方法に従い、U2 primer (5'- p-GAC GTA AGA ACG TCG CAC CA-p-3' 配列番号32) を断片化dsRNAにライゲーションした。ライゲーション後のdsRNAはMinElute Gel Extraction Kit (Qiagen)により濃縮・精製した。U2-comp primer (5'- OH-TGG TGC GAC GTT CTT ACG TC-OH-3'配列番号33)を用い、SMARTer RACE 5'/3' Kit (TaKaRa, Japan)により逆転写反応を行った。DNA-RNAハイブリッドのRNAを除去後、U2-comp primerとUPM primer（SMARTer RACE 5'/3' Kit添付）を用いてcDNAをPCR増幅した。PCRにはKOD-plus Neo (Toyobo, Osaka, Japan)を使用し、以下の条件で行った。96℃2分; [98℃ 10秒,、60℃ 15秒、68℃ 2分]30-35サイクル。増幅産物に含まれるプライマー等の低分子産物はSPRIselect reagent kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)を用いて除去した。

＜Illumina を用いたシーケンス解析＞
珪藻の場合に準じて行った。

＜配列データ処理＞
シークエンシング解析により得られた生配列よりアダプター配列と低クオリティー配列をTrimmomatic version 0.32 (Bolger et al. "Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data." Bioinformatics (2014): btu170)を用いて除去した。cDNA合成および増幅に使用したプライマー配列はCutadapt version 1.9.1 (Martin. "Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads." EMBnet. journal 17.1 (2011): pp-10) を用いて除去した。コントロールとして添加したPhiX配列、実験上の混入配列はBowtie2 version 2.2.5 (Langmead & Salzberg. "Fast gapped-read alignment with Bowtie 2." Nature methods 9.4 (2012): 357-359) を用いて除去した。50塩基長以下の配列をTrimmomatic version 0.32により除去し、以降の解析に使用した。

得られた配列をCLC Genomics Workbench (CLC Bio, Aarhus, Denmark) を用いてde novo アッセンブルした。average coverageが3以上のアッセンブル配列を元にTablet viewer version 1.14.10.20 (Milne et al. "Tablet-next generation sequence assembly visualization." Bioinformatics 26.3 (2010): 401-402)とPRICE version 1 .2 (Ruby et al. "PRICE: software for the targeted assembly of components of (Meta) genomic sequence data." G3 (Bethesda). (2013): 20;3(5):865-80)を用いてマニュアルでコンティグの確認および伸長を行った。最終的には得られたコンティグ中、平均覆度（average coverage）が10以上、最低覆度が3以上、500塩基長以上のものを以降の解析に供した。特に優先する配列が10リード以上一定の位置で終了していた場合は、珪藻の場合と同様、その部位をコンティグの末端と認定した。

・結果
＜RNAウイルス探索＞
５地点、各2Lの計10Lの海水試料よりRNAウイルスを探索した。得られた配列データから再構築された配列より、656個の新規RdRp遺伝子が検出され、少なくとも656のRNAウイルスが存在することが明らかになった。また、これらRNAウイルスの一部は、既知の非レトロRNAウイルス44ファミリー中27ファミリーのウイルスと相同性を示し、既知の非レトロRNAウイルスの半数以上についてその近縁種が海水に生息していることが明らかになった（下表b参照）。これまでに175Lの海水を対象として行われてきたRNAウイルス研究では、7ファミリーのRNAウイルスしか検出されておらず（下表a参照）、当該手法が非常に効率的なRNAウイルス探索手法であることが示された。

＜全長配列を用いた完全未知RNAウイルスの推定＞
当該手法は、得られたコンティグが既知RNAウイルス遺伝子と有意な配列相同性を有していなくても、完全に新規なRNAウイルスの存在を検知することができる。本解析では705本のdsRNA由来と考えられる全長配列が得られた（配列番号34〜738）。半数以上の全長配列は既知RNAウイルス遺伝子と有意な配列相同性を有しておらず、多数のRNAウイルス候補配列が得られた（図4〜9）。

[高温酸性温泉の環境微生物]
・実験方法
＜温泉試料採取＞
これまでRNAウイルスが見出されていないアーキアが優先していると推定される九州雲仙の高温酸性温泉水を孔径0.2μmのセルロースアセテートメンブレンフィルターでろ過し、フィルターを-80℃にて保管した。

＜核酸抽出とdsRNA精製＞
珪藻試料に準じて行った。

＜cDNA合成と増幅＞
海水試料に準じて行った。

＜Illumina を用いたシーケンス解析＞
海水試料に準じて行った。

＜配列データ処理＞
海水試料に準じて行った。

・結果
＜RNAウイルス探索＞
得られたコンティグのなかに、既知RNAウイルス配列と有意な相同性を示すものは見出されなかった。

＜全長配列を用いた完全未知RNAウイルスの推定＞
13本のdsRNA由来と考えられる全長配列が得られ、全リードの48%がこれらの配列にマッピングされた。Blastxを用いた相同性検索では有意な値を示さなかったが、一部のコンティグにはRdRpにおいて高度に保存されているGDDモチーフが検出された。また、13本中8本は両末端の配列がコンティグ間で保存されており、塩基長情報を加味するとこれら8本のコンティグは2分節からなる4種のRNAウイルスに由来することが予想された（配列番号739〜751）。以上の結果から、アーキアにもRNAウイルスが存在していることが強く示唆された。

Claims (13)

1. RNA配列の決定方法であって：
   対象二本鎖RNA（dsRNA）をランダムに断片化し、dsRNA断片を得る工程；
   得られたdsRNA断片を逆転写反応とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に供し、対応するDNA断片を得る工程であって、鋳型RNAの3'末端から逆転写を開始することを含む工程；および
   得られたDNA断片を配列解析操作に供し、配列を決定する工程
   を含む、方法。
2. 得られたdsRNA断片から対応するDNA断片を得る工程が、逆転写反応の鋳型となるRNAの3'末端にループプライマー、ポリ（A)ヌクレオチド、若しくは一本鎖DNAアダプターを連結し；そして連結または付加した部分を利用して3'末端より逆転写を開始することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 対象dsRNAの断片化が、機械的、酵素的、または化学的断片化による、請求項1または2に記載の方法。
4. 対象dsRNAの断片化が、超音波処理による機械的断片化である、請求項3に記載の方法。
5. 対象dsRNAの断片化が、得られるdsRNA断片の3’末端にリン酸基を残さないものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
6. 対象dsRNAが、RNAウイルスに由来する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
7. RNAウイルスの完全長ゲノム配列を決定するための、請求項6に記載の方法。
8. 未知のRNAウイルスの配列を決定するための、請求項6に記載の方法。
9. 得られたdsRNA断片が、1000〜4000塩基長である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
10. DNA断片の製造方法であって：
    対象dsRNAをランダムに断片化し、dsRNA断片を得る工程；および
    得られたdsRNA断片を逆転写反応とそれに続くPCRに供し、対応するDNA断片を得る工程であって、鋳型RNAの3'末端から逆転写が開始できるプライマーを用い、3'末端より逆転写を開始することを含む工程
    を包む、製造方法。
11. 対象dsRNAが、RNAウイルスに由来する、請求項10に記載の方法。
12. ウイルスの解析方法であって：
    試料中のdsRNAを、DNAおよび一本鎖RNAから分離し、精製されたdsRNAを得る工程；
    得られた精製dsRNAをランダムに断片化し、dsRNA断片を得る工程；
    dsRNA断片を逆転写反応とそれに続くPCRに供し、対応するDNA断片を得る工程であって、鋳型RNAの3'末端から逆転写が開始できるプライマーを用い、3'末端より逆転写を開始することを含む工程；
    得られたDNA断片を配列解析操作に供し、配列を決定する工程；および
    決定した配列に基づき、試料中のウイルスの有無および／または特徴を解析する工程
    を含む、方法。
13. 試料が、生物または環境に由来する、請求項12に記載の方法。