ES2326076T3 - Procedimiento de proteccion de un grupo tiol en un anticuerpo. - Google Patents

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Abstract

Un método para protección de un grupo tiol en un anticuerpo que tiene un radical de cisteína libre, que comprende la adición de un compuesto que tiene un enlace disulfuro en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia sobre la actividad del anticuerpo, donde el compuesto que tiene un enlace disulfuro en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia sobre la actividad del anticuerpo es cistina, homocistina, ácido lipoico, glutation oxidado o disulfuro de glutation.

Description

Procedimiento de protección de un grupo tiol en un anticuerpo.
Campo industrial
La presente invención se refiere a un método para la formación de manera efectiva y eficaz un anticuerpo por protección de un grupo tiol en un anticuerpo que tiene un radical de cisteína libre.
Antecedentes de la invención
Se sabe que cuando están presentes radicales de cisteína libres en una proteína, se forma un enlace disulfuro entre moléculas a través de los grupos tiol de los radicales de cisteína libres causando la polimerización de las proteínas. Además, se sabe también que el grupo tiol del radical de cisteína libre es apto para generar reacción de intercambio con el enlace disulfuro formado en una molécula o entre moléculas, y los radicales cisteína libres son aptos para sufrir cierta modificación.
Dado que tal polimerización, modificación o intercambio interfiere con la formación de una estructura de orden superior preferible de una proteína o genera un cambio en el punto activo de la proteína, puede ser causa de reducción de actividad de la proteína.
La reacción del radical de cisteína libre antes descrita tiene lugar frecuentemente en el tiempo de la purificación o conservación de una proteína. Para evitar tal reacción, se ha llevado a cabo convencionalmente un método en que el pH de una solución de proteína se mantiene en condición ácida. o se le añade un antioxidante tal como cisteína, 2-mercaptoetanol. ditiotreitol, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido ascórbico o similares (Seikagaku Jiten (Biochemical Dictionary), 3ª edición, editado por Tokyo Kagaku Dojin, página 182b).
Sin embargo, para mantener el pH de una solución de proteína en la condición ácida, los disolventes y agentes tampón que se pueden utilizar en la purificación de la proteína son limitados, de manera que se considera que tal limitación da por resultado una reducción de la eficacia de la purificación. Además, la adición de un antioxidante a un disolvente o agente tampón en el tiempo de la purificación o conservación tiene también el problema de no poder obtenerse suficiente efecto del control de reacción, no poder evitarse la polimerización después de la separación del antioxidante, o similar.
Según esto, se puede considerar el desarrollo de un método en que el grupo tiol de un radical de cisteína quede protegido por su modificación con un cierto compuesto. Entre los ejemplos de reactivo para modificar el grupo tiol de un radical de cisteína de una proteína se incluyen 1) agentes oxidantes tales como 5',5-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), sulfuro de 2,2'(4,4')-dipiridilo, ácido tetratiónico, 2,6-diclorofenolindofenol (DCIP) y glutation oxidado, 2) agentes que forman mercáptido tal como ácido p-mercuribenzoico (PMB) y ácido p-mercuribenzosulfónico (PMBS), y 3) agentes alquilantes tales como ácido yodoacético, yodoacetamida y N-etilmaleimida (NEM) (Seikagaku. Jiten (Biochemical Dictionary), 3ª edición, editado por Tokyo Kagaku Dojin, p. 182b). Sin embargo, dado que estos se utilizan con el propósito de modificar un grupo tiol de una enzima SH o similar que requiere un grupo tiol como factor esencial para su actividad, cuando se utiliza tal reactivo con la intención de proteger un grupo tiol libre que no está implicado en la actividad de una proteína, el resultado es por el contrario la obstrucción de la formación de estructura de orden superior de la proteína, lo que ejerce frecuentemente una influencia sobre la actividad de la proteína. Por otra parte, incluso en el caso que no ejerza influencia en la actividad de una proteína, a veces aparece el problema, cuando la proteína se usa como medicamento, de tener que eliminar a fondo el reactivo remanente. Según esto, cuando se utiliza tal reactivo con el propósito de proteger el grupo tiol libre en una proteína, se prefiere utilizar los que pueden emplearse como aditivos farmacéuticos.
Además, cuando se produce una proteína para aplicarla a un medicamento, se prefiere utilizar un medio de cultivo libre de suero, sin utilizar suero. Sin embargo, cuando no se utiliza suero en el cultivo de células animales, esto frecuentemente da lugar al caso de que no puede aportarse el suplemento de componentes necesario para mantener suficientemente las funciones de la célula de manera que no puede asegurarse una proteína suficientemente útil, y también da lugar a que la proteína producida cambie delicadamente físicamente, bioquímicamente o biológicamente de la proteína de interés, dando lugar a problemas como, por ejemplo, la formación de un polímero y similares.
Referencia no de patente
Seikagaku Jiten (Biochemical Dictionary), 3ª edición, editado por Tokyo Kagaku Dojin, p. 182b.
Patente europea EP-A- 0 943 690 se refiere a un método industrial de producción de activina A humana que comprende el re-plegado de una activina A humana modificada producida por un microorganismo en activina A humana de la forma natural que tiene actividad biológica.
La Patente internacional WO 90/13310 se refiere al tratamiento de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) con disulfuros orgánicos, preferiblemente disulfuro de glutation o con compuestos inorgánicos de función similar que da por resultado una composición de bFGF de estabilidad potenciada y resistencia a multimerización.
La Patente estadounidense US 6.342.585 se refiere a un método para formar un disulfuro mixto de proteínas recombinantes por solubilización con un agente desnaturalizante en la presencia de un componente disulfuro y adición entonces de un componente disulfuro y un agente desnaturalizante a una concentración suficiente para formar un disulfuro mixto.
Descripción de la invención
Los objetos de la presente invención son los de establecer un método para formar eficiente y eficazmente una proteína por protección de un grupo tiol en una proteína que tiene un radical de cisteína libre, y proporcionar un medicamento que contiene la proteína. Según la invención, la proteína mencionada a lo largo de la solicitud es un anticuerpo.
Según esto, los autores de la presente invención han completado la presente invención llevando a cabo estudios sobre los agentes para protección del radical de cisteína libre y estudios sobre las condiciones de reacción, y por resolución de tales problemas a través de un análisis en profundidad de los productos de reacción.
Según esto, la presente invención es tal como se define en las reivindicaciones 1-14.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que muestra el efecto de inhibición de la polimerización de un F(ab')_{2} de anticuerpo GAH por cultivo libre de suero y la influencia del pH.
La Figura 2 es un gráfico que muestra el efecto de inhibición de la polimerización de un F(ab')_{2} de anticuerpo GAH por cultivo libre de suero y la influencia de la temperatura de reacción.
La Figura 3 es un gráfico que muestra el efecto de inhibición de la polimerización de un (F(ab')_{2} de anticuerpo GAH por cultivo libre de suero y la influencia de la concentración de cisteína.
La Figura 4 es un gráfico que muestra un cromatograma de intercambio de catión antes de la activación de un anticuerpo GH completo.
La Figura 5 es un gráfico que muestra un cromatograma de intercambio de catión después de la activación de un anticuerpo GAH completo purificado.
La Figura 6 es un gráfico que muestra un cromatograma de intercambio de catión después del tratamiento de inhibición de la polimerización de un anticuerpo GAH completo purificado.
La Figura 7 es un gráfico que muestra un cromatograma de intercambio de catión de un anticuerpo GAH completo purificado desalificado y concentrado después de tratamiento de inhibición de polimerización de un anticuerpo GAH completo purificado.
La Figura 8 es un gráfico que muestra el cromatograma de intercambio de catión F(ab')_{2} de anticuerpo GAH purificado.
El mejor modo de llevar a cabo la invención
La presente invención se describe a continuación con detalle.
En la presente invención, los compuestos que tienen un enlace disulfuro en la molécula y que no ejercen substancialmente influencia en la actividad de la proteína son cistina, homocistina, ácido lipoico, glutation oxidado y disulfuro de glutation, prefiriéndose la cistina. Puede servir de ejemplo también un método en el que los compuestos que tienen grupos tiol en las moléculas y no ejercen substancialmente ninguna influencia sobre la actividad de la proteína se añaden simultánea o separadamente.
En la presente invención, entre los ejemplos del compuesto que tiene un grupo tiol en la molécula y no ejerce substancialmente ninguna influencia sobre la actividad de la proteína se incluyen cisteína, homocisteína, glutation y ácido dihidrolipoico, y es particularmente preferida la cisteína.
En la presente invención, la expresión "el compuesto que no ejerce substancialmente influencia sobre la actividad de la proteína" significa que no incrementa ni reduce la actividad de la proteína. Como la proteína es un anticuerpo, puede ser un ejemplo un caso en el cual la reactividad de la reacción antígeno-anticuerpo no se incrementa.
La proteína de la presente invención se caracteriza porque tiene un radical de cisteína libre en su estructura molecular. El término "libre", tal como aquí se emplea significa un estado en que el radical de cisteína que tiene un electrón desparejado, es inestable y es alto en reactividad. Además, es más preferible que el grupo tiol del radical de cisteína sea alto en reactividad.
Con respecto al grupo tiol de la presente invención, puede servir de ejemplo el caso en que esté implicado directa o indirectamente en la actividad de la proteína, siendo más preferido el caso con implicación directa. Ejemplos de la actividad de la proteína tal como aquí se emplea incluyen la reactividad en una reacción antígeno-anticuerpo y la reactividad en una reacción de enzima. Entre los ejemplos de implicación directa se incluye el caso en que la actividad de la proteína se reduce cuando el grupo tiol es modificado con, por ejemplo, un reactivo modificador. Por otra parte, un ejemplo de implicación directa es el caso en que la actividad de la proteína se reduce debido a la interrupción de la formación de la estructura de orden más alto por modificación del grupo tiol.
Como protección en la presente invención, un ejemplo puede ser la inhibición de la polimerización, modificación o intercambio que ejerce una influencia substancial sobre la actividad de la proteína. Más específicamente, entre los ejemplos se incluye la inhibición de la formación de un polímero debido a la formación de un enlace disulfuro entre proteínas vía grupos tiol, inhibición de la modificación de un radical de cisteína libre, e inhibición de la reacción de intercambio con un enlace disulfuro formado en una molécula o entre moléculas por los grupos tiol de los radicales de cisteína libres. La inhibición de formación de un polímero debido a la formación de un enlace disulfuro entre proteínas vía grupos tiol es más preferido. En este caso, tiene lugar una reacción de intercambio tiol-disulfuro de la reacción dada a continuación a través de la reacción de un compuesto que tiene un enlace disulfuro, tal como cistina, con el grupo tiol de una proteína que tiene un radical libre cisteína.
(I)Pr-SH + R-S-S-R \hskip0,3cm \rightarrow \hskip0,3cm Pr-S-S-R + R-SH
(Pr representa una proteína y R representa un radical distinto a los grupos funcionales).
Según esto, dado que el Pr-S-S-R formado por la reacción está establemente presente incluso después de la eliminación de R-S-S-R, se inhibe la reacción vía Pr-SH, tal como polimerización de proteínas.
Además, en tal método, el compuesto que tiene un enlace disulfuro en la molécula y no ejerce substancialmente influencia sobre la actividad de la proteína puede añadirse en cualquier estadio de tiempo de la producción de proteína. Por ejemplo, cuando esto se lleva a cabo utilizando un anticuerpo GAH mostrado en los siguientes Ejemplos, los ejemplos incluyen los métodos en que se añade cistina a los productos finales purificados de F(ab')_{2} (Ejemplos 1 a 3) o inmediatamente después de la activación del anticuerpo completo (Ejemplos 4 a 6).
En los métodos de la presente invención se utiliza un disolvente. Aunque el disolvente no está particularmente limitado, se prefiere un líquido capaz de dar lugar a intercambio del grupo tiol de un radical de cisteína en una proteína con disulfuro de cistina. Específicamente, es adecuado un agente tampón de débilmente ácido a alcalino, preferiblemente un agente tampón de neutro a ligeramente alcalino.
La concentración del compuesto de adición que tiene un enlace disulfuro en la molécula y no ejerce substancialmente influencia sobre la actividad de la proteína no está particularmente limitada, pero en el caso de cistina, por ejemplo, se prefiere una concentración de cistina capaz de dar lugar a intercambio del grupo tiol de radical de cisteína de una proteína con disulfuro de cistina. Específicamente, es adecuada una concentración de 0,01 a 100 mM, preferiblemente de 0,1 a 10 mM.
Aunque la concentración de proteína no está particularmente limitada, se prefiere una concentración capaz de dar lugar a intercambio del grupo tiol de un radical de cisteína de una proteína con disulfuro de un compuesto que tiene un enlace disulfuro en la molécula y no ejerce substancialmente influencia sobre la actividad de la proteína. Específicamente, es adecuada una concentración de 0,01 a 1.000 mg/ml, preferiblemente de 0,1 a 100 mg/ml.
Aunque la temperatura de reacción no está particularmente limitada, se prefiere, por ejemplo, una temperatura capaz de dar lugar a intercambio del grupo tiol de un radical de cisteína de una proteína con disulfuro de cistina como compuesto que tiene enlace disulfuro en la molécula y no ejerce substancialmente ninguna influencia sobre la actividad de la proteína. Específicamente, es adecuada una temperatura de -20 a 60ºC, preferiblemente de 0ºC a 50ºC.
Además, incluso cuando un compuesto que tiene un grupo tiol, tal como cisteína, está presente junto con una proteína en tal método, tiene lugar la reacción de (I) por la adición de cistina en exceso. Por ejemplo, como se describe en WO 03/048357, respecto a una proteína producida utilizando un medio libre de suero, se da el caso en que no puede asegurarse una proteína con suficiente actividad debido a suministro insuficiente de componentes necesarios para mantener funciones de la célula que produce proteína. En ese caso, se puede llevar a cabo un tratamiento de la proteína con cisteína o similar, pero, como se muestra en los siguientes Ejemplos, la inhibición de la polimerización de anticuerpo GAH se puede llevar a cabo también inmediatamente después de la activación del anticuerpo completo por cisteína (Ejemplo 4).
Entre los ejemplos de polimerización de la presente invención se incluyen un cambio en la estructura de una proteína a orden más alto, un cambio en la actividad de la proteína, y formación de un dímero, un trímero y similar, que tiene lugar cuando la proteína forma un enlace disulfuro intermolecular vía grupos tiol. Se prefiere un cambio en la actividad de proteína y formación de dímero y trímero, y más preferida es la formación de un dímero y un
trímero.
Entre los ejemplos de la modificación en la presente invención se incluye un cambio en la estructura de una proteína a orden más alto, un cambio en la actividad de la proteína y similar, que tiene lugar cuando un compuesto capaz de ejercer una influencia substancial sobre la actividad se une al grupo tiol de una proteína que tiene un radical de cisteína libre. Preferiblemente, puede servir de ejemplo un cambio en la actividad de proteína.
Entre los ejemplos de intercambio de la presente invención se incluyen un cambio en la estructura de una proteína a un orden más alto, un cambio en la actividad de la proteína y similares, que tiene lugar cuando el grupo tiol de una proteína que tiene un radical cisteína libre forma un enlace tiol-disulfuro en una molécula o entre moléculas de la proteína. Preferiblemente, el ejemplo es un cambio en la actividad de la proteína.
La proteína recombinante de la presente invención es un anticuerpo.
Entre los ejemplos del anticuerpo de la presente invención se incluyen anticuerpos completos (anticuerpo completo, en toda su longitud), fragmentos de anticuerpo (fragmentos de anticuerpo tales como F(ab'), F(ab')_{2} y scFv (anticuerpo de una sola cadena)) y derivados de anticuerpo, y el más preferido es anticuerpo F(ab')_{2}.
Un ejemplo de anticuerpo monoclonal de la presente invención es un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID Nos.: 1, 2 y 3 en la Lista de Secuencias en su región hipervariable de cadena pesada, y las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID Nos.: 4, 5 y 6 en la Lista de Secuencias en su región hipervariable de cadena ligera. Generalmente estas secuencias de aminoácidos están contenidas, respectivamente, en tres regiones hipervariables de cada cadena de la cadena pesada y cadena ligera, en el orden de SEQ ID Nos.: 1, 2 y 3 y SEQ ID Nos.: 4, 5 y 6 comenzando desde el lado de terminal N. La región hipervariable determina la especificidad de la inmunoglobulina como anticuerpo y la afinidad de unión de un determinante antigénico con el anticuerpo, y se llama también región determinante de la complementariedad. Según esto, las regiones distintas a esta región hipervariable pueden derivar de otro anticuerpo. Es decir, en los anticuerpos monoclonales que pueden emplearse en la presente invención, se incluyen aquellos en que la modificación parcial de aminoácidos, tal como sustitución, inserción, supresión o adición, se realiza dentro de un intervalo en el que no se deteriora la actividad de unión (reactividad) con antígenos.
Ejemplos más específicos incluyen un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la sentencia de aminoácidos representada por SEQ ID No.:7 en la Lista de Secuencias y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No.: 8 en la Lista de Secuencias, es decir el anticuerpo GAH. El anticuerpo GAH es un anticuerpo monoclonal humano que se une específicamente a cánceres analizados selectivamente basándose en la reactividad con cáncer gástrico y cáncer del intestino grueso (EP526700 o EP520499), y este anticuerpo se puede obtener por preparación de hibridomas derivados de linfocitos derivados de paciente de cáncer con células de mieloma de ratón, y seleccionando un hibridoma que tiene las secuencias de aminoácido especificadas antes descritas, o puede prepararse también por técnicas de ingeniería genética (EP520499).
Cuando se compara con la posición de cisteína en secuencias de aminoácidos humanas conocidas convencionalmente, el anticuerpo GAH se caracteriza por la cisteína en posición 32 en SEQ ID No.:7 de la Lista de Secuencias. Es decir, se considera que es una cisteína libre que no está implicada en la formación de enlace disulfuro en la molécula. Dado que el radical de cisteína corresponde a la posición 4ª en la secuencia mostrada en SEQ ID No.:1 de la Lista de Secuencias y está situada en una región hipervariable de cadena pesada, se considera que está implicada en la unión con su antígeno.
Entre los ejemplos de medio libre de suero en la presente invención se incluyen aquellos medios que no contienen sueros tales como suero bovino (fetal) en los componentes del medio. Entre los ejemplos se incluyen el medio libre de suero CD CHO (fabricado por Invitrogen) y ExCell 325-PF (fabricado por JRH) descritos en los ejemplos siguientes, y similares.
La presente invención proporciona un medicamento que comprende, como ingrediente activo un anticuerpo obtenido por el método de la presente invención, por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende la substancia antes descrita y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y proporciona una preparación terapéutica que tiene diversas formas de dosificación. El término "farmacéuticamente aceptable" significa que no tienen lugar efectos secundarios indeseables, tales como náuseas, vértigo y mareo, acompañando a la administración, respuesta inmune frente a una preparación farmacéutica durante el tiempo de su administración frecuente. Además, un anticuerpo preparado por unión de una sustancia, tal como una toxina, a la proteína de la presente invención se puede utilizar también como medicamento. Entre los ejemplos se incluyen aquellos en los que se une un anticuerpo a liposoma, en que se encapsula un agente tal como un agente antitumor, por ejemplo doxorubicina (EP526700, EP520499 y EP1174126). El liposoma que contiene sustancia anti-neoplásica unida a anticuerpo puede obtenerse como preparaciones farmacéuticas por los métodos convencionales conocidos tales como método de deshidratación (WO88/06441), un método en el que se utiliza como soluciones por adición de un agente estabilizante (JP-A-64-9931), un método de liofilización (JP-A-64-9931) y se puede administrar a pacientes por un método tal como administración intravascular o administración tópica. La dosis se puede seleccionar opcionalmente en respuesta a las clases de sustancia anti-neoplásica como el ingrediente activo, y cuando se administra liposoma encapsulada con doxorubicina, por ejemplo, se puede utilizar a una dosis de 50 mg/kg o menos, preferiblemente 10 mg/kg o menos, más preferiblemente 5 mg/kg o menos, en términos de la cantidad de ingrediente activo.
Ejemplos
La presente invención se describe con detalle a continuación sobre la base de Ejemplos, pero la presente invención no queda limitada a los siguientes Ejemplos sin sobrepasar su esencia.
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Ejemplo 1 de producción
F(ab')_{2} de anticuerpo GAH por cultivo libre de suero (1) Producción de anticuerpo completo de anticuerpo GAH (citado de aquí en adelante como "anticuerpo GAH completo") en un medio de cultivo libre de suero
Se preparó un medio de cultivo por disolución de 4 mmoles de glutamina (fabricada por SIGMA) y 10 mg de insulina (fabricada por SIGMA) en 1 litro de cada uno de los medios libres de suero: CD CHO (fabricado por Invitrogen) y ExCell 325-PF (fabricado por JRH) y se llevo a cabo filtración aséptica de la solución utilizando un filtro de 0,22 \mum en la parte de encima de un frasco (fabricado por Corning Coaster). El medio de células así preparado se cargó asépticamente en un matraz giratorio de 1 litro de capacidad (fabricado por Belco) que ha sido esterilizado por anticipado utilizando un autoclave (fabricado por Sakura Seiki), y el matraz se dispuso sobre un dispositivo de control de cultivos (fabricado por Biott) para ajustar la temperatura a 37ºC, y la concentración de oxígeno disuelto a 3,0 mg/l, el pH a 7,4 y la velocidad de agitación a 60 rpm.
Un anticuerpo recombinante que produce célula CHO 1-6R (véanse Ejemplos de EP520499) cultivada por anticipado utilizando un frasco giratorio (fabricado por Falcon) se trató con tripsina para desprender las células, se descartó el sobrenadante después de la centrifugación y las células se lavaron dos veces con el correspondiente medio libre de suero. Después de esto, se suspendieron las células en el correspondiente medio libre de suero y se inocularon asépticamente en un matraz giratorio de 1 litro de capacidad para que comenzase el cultivo. Después de la inoculación, se realizó la toma de muestras y se midió la densidad de células viables y la relación de supervivencia utilizando un hemocitómetro para encontrar que había, respectivamente, CD CHO: 1,09x10^{5} células/ml y 82,3%, ExCell 325-PF: 0,87x10^{5} células/ml y 84,1%.
El cultivo se completó al cabo de 353 horas de la inoculación, y se recuperó el medio de cultivo. El medio de cultivo se centrifugó (3.000 rpm, 20 minutos) y luego se filtró utilizando un filtro de 0,22 \mum encima de un frasco para obtener aproximadamente 800 ml de un volumen sin purificar.
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(2) Purificación del anticuerpo completo GAH desde el volumen sin purificar obtenido por cultivo libre de suero
Se dividió en dos aproximadamente 800 ml de cada uno de los volúmenes sin purificar obtenidos en (1) y se sometió a purificación por cromatografía en columna utilizando columna XK16 (diámetro interno 16 mm, fabricada por Amersham Bioscience) rellena con 14,3 ml de resina Prosep-A (fabricada por Millipore). Se introdujeron como alimentación el volumen sin purificar y un agente tampón en la columna a una velocidad de flujo de 14,3 ml/minuto, se llevaron a cabo aplicación y lavado por un modo de flujo descendente, y la elución y regeneración por un modo de flujo ascendente. La composición del agente tampón para lavado, elución y regeneración era de tampón acetato 40 mM que contenía NaCl 40 mM teniendo los valores respectivos de pH de 6,0, 4,0 y
2,7.
De los volúmenes sin purificar de CD CHO y ExCell 325-PF, se obtuvieron, respectivamente, 47,2 y 50,8 ml de soluciones que contenían anticuerpo completo (pH 4,0). Cuando se midieron las cantidades del anticuerpo en esta solución por fotometría de absorción ultravioleta, eran de 57 mg y 48 mg, respectivamente.
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(3) Tratamiento de activación de anticuerpo completo GAH
En relación con el método de tratamiento de activación, se puede utilizar WO 03/048357 como referencia.
Utilizando Centricon 30 (fabricado por Amicon), se concentraron 20 mg de cada una de las soluciones del anticuerpo completo obtenido en (2) utilizando medio CD CHO y medio EXCELL 325-PF a aproximadamente 1,7 ml. Se añadieron los reactivos a 250 \mul (que corresponden a 3 mg) de este líquido para obtener una composición de agente tampón Tris-HCl 30 mM (pH 9) que contenía cloruro de sodio 1,6M, L-cisteína 2 mM y ácido ascórbico 12 mM en las concentraciones finales, y la composición se ajustó a aproximadamente 10 ml. Este líquido se dejó reposar a la temperatura ambiente durante 16 horas y luego se ajustó a pH 4 por adición de ácido trifluoroacético. El líquido se concentró utilizando Centricon 30, y la composición líquida se reemplazó por ácido acético al
0,05%.
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(4) Preparación de F(ab')2 por tratamiento con pepsina del anticuerpo completo después del tratamiento de activación, y su purificación
La muestra tratada por activación obtenida en (3) se ajustó a pH 4,0 y se digirió entonces con pepsina. Es decir, se añadió pepsina (fabricada por SIGMA) a lo anterior a una concentración de 1,2 mg/g de GAH, seguido de filtración aséptica utilizando filtro Mylex (fabricado por Milipore, 0,22 \mum) y se agitó suavemente entonces durante 17 horas bajo calentamiento a 37ºC.
Después de la digestión con pepsina, se purificó un (Fab')_{2} de anticuerpo GAH utilizando cromatografía de columna de intercambio catiónico. Es decir, se rellenó la columna XK16 se rellenó con 15,3 ml de una resina de intercambio catiónico SP-Sepharose FF (fabricada por Amersham Bioscience), y se le aplicó el líquido que contenía anticuerpo después de la digestión de pepsina. Después, se llevó a cabo un lavado utilizando tampón acetato 40 mM (pH 4,0) que contenía NaCl 20 mM, y el pico del anticuerpo se fraccionó mientras se incrementaba la concentración de sal. La velocidad de flujo era 1,58 ml/min. Los volúmenes de las muestras de CD CHO y ExCell 325-PF eran 10,5 ml y 11,6 ml, respectivamente.
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Ejemplo 1
Inhibición de la polimerización de F(ab')_{2} de anticuerpo GAH por cultivos libres de suero (influencia del pH de la reacción)
Se intentó la inhibición de la polimerización en el F(ab')_{2} de anticuerpo GAH después del tratamiento de la activación obtenida de acuerdo con el Ejemplo 1 de producción utilizando medio ExCell 325-PF.
Se añadió una solución de cistina a una solución de (F(ab')_{2} de anticuerpo GAH preparada a una concentración de aproximadamente 5 mg/ml, a una concentración final de 1 mM. En este caso, la solución de cistina se utilizó disolviendo cistina en ácido clorhídrico 0,5 N a una concentración de 40 mM.
Esta solución se dividió en dos, se añadió 1/4 de volumen de tampón fosfato de sodio 1 M (pH 7,5) a uno de ellos (pH final 7,5), no se añadió nada al otro (pH final 4,7) y se utilizaron como solución tratada de pH 7,5 con adición de cistina y solución tratada de pH 4,7 con adición de cistina, respectivamente.
Estas soluciones a las que se había añadido cistina y una solución a la que no se había añadido cistina se dejaron reposar a 37ºC durante 3 horas, y después se separó la cistina utilizando una membrana de ultrafiltración de corte de peso molecular nominal de 30 K, y el disolvente se reemplazó por tampón acetato 20 mM (pH 4,7). Utilizando este estadio como inicial, se llevó a cabo análisis de cromatografía HPLC de filtración de gel. A continuación, se mezcló cada una de estas soluciones con ¼ de volumen de tampón fosfato de sodio (pH 7,5) (pH final 7.5), seguido de reposo a 37ºC durante 45 minutos, y se llevó a cabo análisis de cromatografía HPLC de filtración de
gel.
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Condiciones de HPLC de filtración de gel
Detector:
Fotómetro de absorción ultravioleta (longitud de onda de medida: 215 nm).
Columna:
TSKgel G3000SW_{XL} (aproximadamente 8 mm de diámetro interno x aproximadamente 4 cm de longitud) fabricada por Tosoh.
Pre-columna:
TSKgel guardacolumna SWXL (aproximadamente 6 mm de diámetro interior x aproximadamente 4 cm de longitud) fabricada por Tosoh.
Temp. de columna:
temperatura constante de alrededor de 25ºC.
Fase móvil:
tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0)/sulfato de sodio 300 mM.
Velocidad flujo:
0,3 ml/minuto.
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Los resultados se muestran en la Figura 1. Al principio, el contenido de monómero era 86 a 87% en cada una de las soluciones: solución sin añadir cistina, solución tratada de pH 4,7 con cistina añadida y solución tratada de pH 7,5 con cistina añadida. Cuando estos tres tipos de soluciones se ajustaron a pH 7,5 y se dejaron reposar a 37ºC durante 45 minutos, el contenido de monómero de la solución sin añadir cistina se redujo a 73%, mientras que el de la solución tratada de pH 4,7 con cistina añadida era del 78% mostrando una ligera inhibición de polimerización. Además, de que el de la solución tratada de pH 7,5 con cistina añadida era del 87%, se inhibía completamente la
polimerización.
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De estos resultados se deduce que el pH de la reacción en el tiempo de la adición de cistina era bueno en el intervalo neutro como en el ácido.
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Ejemplo 2
Inhibición de la polimerización de F(ab')_{2} de anticuerpo GAH por cultivos libres de suero (influencia de la temperatura de reacción)
Se intentó la inhibición de la polimerización sobre el (F(ab')_{2} de anticuerpo GAH después del tratamiento de activación de acuerdo con el Ejemplo de Producción 1 utilizando medio ExCell 325-PF.
Se añadió una solución de cistina a una solución de F(ab')_{2} de anticuerpo GAH preparada a una concentración de aproximadamente 5 mg/ml, a una concentración final 1mM. En este caso, se utilizó la solución de cistina preparada por disolución de cistina en ácido clorhídrico 0,5N a una concentración de 40 mM.
Esta solución se mezcló con 1/4 de volumen de tampón fosfato de sodio 1M (pH 7.5) (pH final 7.5) se dividió en dos partes, y una de las partes se dejó reposar a 37ºC durante 3 horas y la otra a 4ºC durante un día entero y una noche. Se utilizaron como solución tratada, de 37ºC, con cistina añadida y solución tratada, de 4ºC, con cistina añadida, respectivamente.
Se separó la cistina de estos dos tipos de soluciones y una solución sin cistina añadida utilizando una membrana de ultrafiltración de corte de peso molecular nominal de 30 K, y el disolvente se reemplazó por tampón acetato 20 mM (pH 4,7). Utilizando este estadio como inicial, se llevó a cabo análisis de HPLC de filtración de gel. A continuación, se mezclaron cada uno de estos tres tipos de soluciones con ¼ de volumen de tampón fosfato de sodio 1M (pH 7,5) (pH final 7,5), seguido de reposo a 37ºC durante 45 minutos, y después se llevó a cabo el análisis por HPLC de filtración de gel.
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Condiciones de la HPLC de filtración de gel
Las mismas que en el Ejemplo 1.
Los resultados se muestran en la Figura 2. Inicialmente, el contenido de monómero era de 86 a 87% en cada una de las soluciones: solución sin cistina añadida, solución tratada de 37ºC con cistina añadida y solución tratada de 4ºC con cistina añadida. Cuando estas soluciones se ajustaron a pH 7,5 y se dejaron reposar a 37ºC durante 45 minutos, el contenido de monómero de la solución sin cistina añadida se redujo a 73%, mientras que el de la solución tratada de 37º con cistina añadida era 87% y el de la solución tratada de 4ºC con cistina añadida era 86%, inhibiéndose la polimerización completamente en ambos casos.
De estos resultados se deduce que la temperatura de reacción en el momento de la adición de cistina era o bien 37ºC o 4ºC.
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Ejemplo 3
Inhibición de polimerización de F(ab')_{2} de anticuerpo GAH por cultivo libre de suero (influencia de concentración de cistina)
Se intentó la inhibición de polimerización sobre F(ab')_{2} de anticuerpo GAH después de tratamiento de activación obtenida de acuerdo con el Ejemplo de Producción empleando medio ExCell 325-PF.
Se añadió una solución de cistina a una solución de F(ab')_{2} de anticuerpo GAH preparada a una concentración de aproximadamente 5 mg/ml, a una concentración final de 1 mM ó 0,54 mM. En este caso, la solución de cistina se utilizó por disolución de cistina en ácido clorhídrico 0,5N a una concentración de 40 mM o 20 mM..
Cada una de estas soluciones se mezclaron con ¼ de volumen de tampón fosfato de sodio 1M (pH 7,5) (pH final 7,5), y se utilizaron como tratamiento 1 mM y tratamiento 0,5 mM, respectivamente.
Estos dos tipos de soluciones y una solución sin cistina añadida se dejaron reposar a 4ºC durante un día y una noche completos, y se separó entonces la cistina utilizando una membrana de ultrafiltración de corte de peso molecular nominal de 30 K, y el disolvente se reemplazó por tampón acetato 20 mM (pH 4,7). Utilizando este estadio como inicial, se llevó a cabo análisis por HPLC de filtración de gel. A continuación, se mezcló cada una de estas soluciones con ¼ de volumen de tampón fosfato de sodio 1 M (pH 7,5) (pH final 7,5), se dejó reposar a 37ºC durante 45 minutos, y se llevó a cabo entonces análisis de HPLC de filtración de gel.
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Condiciones de HPLC de filtración de gel
Las mismas que en el Ejemplo 1.
Los resultados se muestran en la Figura 3. Inicialmente, el contenido de monómero era 86 a 87% en cada una de las soluciones: la solución sin cistina añadida y la solución 1 mM con cistina añadida, mientras que la solución de cistina añadida 0,5 mM tenía un valor ligeramente inferior a 84%. Cuando estas soluciones se ajustaron a pH 7,5 y se dejaron reposar a 37ºC durante 45 minutos, se redujo el contenido de monómero de la solución sin cistina añadida a 73%, mientras el de la solución con cistina añadida 1 mM era 86% y el de la solución de cistina añadida 0,5 mM era 84%, no mostrando ninguna cambio del inicial.
De estos resultados se deduce que el efecto inhibidor de polimerización era ligeramente más alto por adición de cistina a concentración 1 mM que a la concentración de 0,5 mM.
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Ejemplo de producción 2
Preparación de anticuerpo completo GAH en medio de cultivo libre de suero
Se preparó un medio de cultivo celular por disolución de un medio libre de suero ExCell 325-PF (JRH) en 30 litros en total de agua mili-Q, se disolvieron 4 mM de glutamina (fabricada por SIGMA), 1,6 g/l de bicarbonato de sodio (fabricado por Invitrogen) y 10 mg/l de insulina (fabricada por SIGMA) en lo anterior y llevando a cabo filtración aséptica de la solución utilizando un filtro Milli-pack 40 de 0,22 \mum (fabricado por Millipore). En un fermentador de 50 litros de capacidad (fabricado por Biott) que había sido esterilizado previamente utilizando un autoclave (fabricado por Sakura Seiki), se cargaron asépticamente 4 litros del medio celular así preparado y la vasija se conectó a un dispositivo de control del cultivo (fabricado por Biott).
Se cultivó por anticipado un anticuerpo recombinante GAH que producía célula CHO 1-6R (véanse Ejemplos de WO 03/048357) en un matraz rotatorio de 7 litros de capacidad (volumen de trabajo: 6 litros) (fabricado por Belco) utilizando un medio libre de suero ExCell 324-PF. y el volumen total del medio de cultivo se inoculó asépticamente a un fermentador de 50 litros de capacidad. Después, se llevó a cabo el cultivo suplementando la vasija con 5 litros del medio libre de suero ExCell 325-PF al cabo de 1 día, 15 litros al cabo de 2 días y 1 litro al cabo de 4 días.
El cultivo se completó al cabo de 307 horas de la inoculación y se recuperó el medio de cultivo. Se separaron las células del medio de cultivo con Prostack (fabricado por Millipore) y después se filtró utilizando un Millipack 40 de 0,22 \mum para obtener aproximadamente 26 litros de un volumen sin purificar.
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(2) Purificación de anticuerpo completo GAH de volumen sin purificar obtenido por cultivo libre de suero
Una porción de 17 litros de volúmenes sin purificar obtenidos en (1) se dividió en 12 porciones y se sometió a purificación por cromatografía en columna utilizando columna XK16 (diámetro interior 16 mm, fabricada por Amersham Bioscience) rellena con 14,3 ml de resina Prosep-A (fabricada por Millipore) obteniéndose así aproximadamente 1,7 g de anticuerpo completo GAH.
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Ejemplo 4
Tratamiento de activación y tratamiento de inhibición de la polimerización de anticuerpo completo GAH
Se diluyó una porción de 640 ml de la solución de anticuerpo completo obtenido en el Ejemplo 2 de Producción con solución 40 mM de ácido acético-acetato de sodio (pH 4,0) que contenía cloruro de sodio 40 mM a una concentración de anticuerpo de 1 mg/ml. Los reactivos se añadieron a esta solución de anticuerpo para obtener una composición de tampón Tris-HCl 30 mM (pH 9,0) que contenía cloruro de sodio 1,0 M, L-cisteína 2 mM y ácido ascórbico 12 mM como concentraciones finales. Este líquido se ajustó a PH 7,5 con solución acuosa de hidróxido de sodio 5N, y se agitó suavemente entonces a temperatura ambiente durante 3 horas para completar la reacción de activación. Se sacó como muestra una pequeña porción del mismo, y se añadió un reactivo a la solución de anticuerpo remanente a una concentración final de cistina de 4 mM. Después se ajustó a pH 7,5 con solución acuosa de hidróxido de sodio 5N, y se agitó entonces suavemente a temperatura ambiente durante 2 horas para llevar a cabo un tratamiento de inhibición de la polimerización. Se ajustó luego el pH de lo anterior a 4,0 con ácido clorhídrico 6 N, y se llevó a cabo desalificación y concentración utilizando una membrana de ultrafiltración de corte de peso molecular de 30 kDa (Hydrosalt, fabricada por Sartorius) hasta que la conductividad eléctrica se hizo de 0,6 S/m. La muestra tomada después de la reacción de activación se sometió a desalificación y concentración utilizando una membrana de ultrafiltración de corte de peso molecular nominal 30 kDa (Saltocon, fabricada por Sartorius) sin llevar a cabo tratamiento de inhibición de polimerización.
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Ejemplo 5
Análisis fisicoquímico de anticuerpo completo GAH por HPLC
Utilizando la solución de anticuerpo completo GAH obtenida en el Ejemplo 4, se llevó a cabo la cromatografía de líquidos de intercambio catiónico para comparar cromatogramas antes y después del tratamiento de inhibición de polimerización.
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Condiciones de operación
Detector:
Fotómetro de absorción ultravioleta (longitud de onda de medida: 280 nm).
Columna:
TSKgel CM-5PW (7,5 de diámetro interior x 7,5 cm de longitud) fabricada por Tosoh.
Temperatura columna:
Temperatura constante de alrededor de 30ºC.
Fase móvil A.
Tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0).
Fase móvil B
Tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0)/cloruro de sodio 0,5M.
Alimentación de fases móviles:
Control del gradiente de densidad (véase la siguiente Tabla 1).
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TABLA 1
1 
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Velocidad de flujo:
1,0 ml/min.
Los cromatogramas obtenidos de las muestras tomadas antes de la reacción de activación, después de completada la reacción de activación, después del tratamiento de inhibición de la polimerización y después de desalificación y concentración, se compararon para el anticuerpo completo GAH purificado, con los resultados mostrados en la Figura 4 a Figura 7.
El cromatograma de antes de la activación es del tipo inactivo debido a la presencia de un gran número de especies moleculares originadas desde la heterogeneidad como se muestra en la Figura 4, pero se vuelve un cromatograma de GAH tipo activo cuando se lleva a cabo la reacción de activación como muestra la Figura 5. Después de esto, no pueden encontrarse diferencias del cromatograma tras la reacción de activación en el cromatograma después de llevado a cabo el tratamiento de la presente invención como muestra la Figura 6. Además, no se pueden encontrar cambios cuando se lleva a cabo el tratamiento de desalificación y concentración como se muestra en la Figura 7.
De estos resultados, se puede ver, por comparación de cromatogramas, que el tratamiento de la presente invención no ejerce influencia sobre la actividad de anticuerpo GAH.
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Ejemplo 6
Análisis de la cantidad de polimerización de anticuerpo GAH completo por HPLC de filtración de gel
Utilizando la solución de anticuerpo GAH completo obtenido en el Ejemplo 4, se llevó a cabo un análisis por HPLC de filtración de gel para comparar cantidades de un monómero del anticuerpo antes y después del tratamiento de inhibición de la polimerización. Las condiciones de operación son las mismas que las del Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos de las muestras sacadas antes de la reacción de activación, después de completada la reacción de activación, después del tratamiento de inhibición de polimerización y después de desalificación y concentración, se muestran en la Tabla 2, cuando el tratamiento de la presente invención se aplicaba o no aplicaba al anticuerpo GAH completo purificado.
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TABLA 2
2
El anticuerpo GAH completo purificado al que no se aplicó el tratamiento de la presente invención forma polímero en gran cantidad en la etapa de desalificación y concentración. Por otra parte, en el caso de anticuerpo GAH completo purificado al que se aplica el tratamiento de la presente invención, el contenido de monómero aumenta tras tratamiento de activación aunque sea ligeramente, y no se forma polímero en la etapa de desalificación y concentración.
Basándose en este resultado, se ha encontrado que el tratamiento de la presente invención incrementa el contenido de monómero e inhibe la formación de polímero al mismo tiempo.
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Ejemplo 7
Formación de F(ab')_{2} del anticuerpo completo por digestión con pepsina después de su reacción de activación y tratamiento de inhibición de polimerización (tratamiento de la presente invención) y purificación del mismo
Se tomó una porción de 150 ml de una muestra desde la solución obtenida en el Ejemplo 4 y se digirió con pepsina. Es decir, se añadió pepsina (fabricada por SIGMA) a la misma a una concentración de 1,2 mg/g de GAH, seguido de filtración aséptica utilizando un filtro en la parte de encima de un frasco (Corning Coaster, 0,22 \mum) y se agitó suavemente entonces durante 19 horas bajo calentamiento a 37ºC.
Después de la digestión con pepsina, se purificó F(ab')_{2} de anticuerpo GAH utilizando cromatografía de columna de intercambio catiónico. Es decir, la columna XK16 se rellenó con 15,3 ml de resina de intercambio catiónico SP-Sepharose HP (fabricada por Amersham Bioscience) y se le aplicó el líquido que contenía anticuerpo después de la digestión con pepsina. Después se llevó a cabo un lavado utilizando tampón acetato 40 mM (pH 4,0) que contenía NaCl 20 mM, y se fraccionó el pico del anticuerpo mientras se incrementaba gradualmente la concentración de sal. La velocidad de flujo era 4,17 ml/minuto.
Después de esto, se ajustó la mezcla a pH 7,0 llevando a cabo intercambio del agente tampón a agente tampón fosfato 5 mM (pH 4,0) utilizando Saltocon de corte de peso molecular nominal de 30 kDa y entonces se purificó un F(ab')_{2} de anticuerpo GAH por cromatografía en columna de intercambio de anión. Es decir, se rellenó la columna XK16 con 31 ml de resina de intercambio de anión Q.Sepharose FF (fabricada por Amersham Bioscience), se le aplico la solución que contenía anticuerpo después intercambio de agente tampón y se fraccionó el pico del anticuerpo. Se ajustó luego la mezcla a pH 4,0 y la concentración de anticuerpo a aproximadamente 5 mg/ml utilizando Saltocon de corte de peso molecular de 30 kDa para obtener así un F(ab')_{2} de anticuerpo GAH purificado.
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Ejemplo 8
Análisis fisicoquímico de F(ab')_{2} de anticuerpo GAH por HPLC y medida de la cantidad de polímero
Se llevó a cabo cromatografía de líquidos de intercambio de catión por aplicación del F(ab')_{2} de anticuerpo GAH obtenido en el Ejemplo 7 a TSKgel CM-5PW (7,5 mm de diámetro interior, 7.5 cm en longitud; fabricado por Tosoh). Las condiciones de operación son las mismas que las mostradas en el Ejemplo 4.
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Los resultados se muestran en la Figura 8.
Se ha confirmado por este resultado que el anticuerpo así obtenido es del tipo activo, y el tratamiento de la presente invención no ejerce influencia sobre la actividad de anticuerpo a través del proceso de purificación.
Además, el F(ab')_{2} de anticuerpo GAH obtenido en el Ejemplo 7 se sometió a la medida de cantidades de monómero utilizando un método de HPLC de filtración de gel.
Las condiciones de operación son las mismas que se muestran en el Ejemplo 1.
Como resultado, el contenido de monómero era 93,8%, lo que revelaba que se había obtenido el anticuerpo que satisfacía suficientemente la especificación de purificación. Además, se confirmó que el tratamiento de la presente invención inhibía la formación de polímero a través del proceso de purificación completo, y se encontró que se lograba un mejoramiento nítido del rendimiento de purificación.
Aplicabilidad industrial
En la presente invención, es posible establecer un método para formar efectiva y eficazmente un anticuerpo por protección del grupo tiol en un anticuerpo que tiene un radical de cisteína libre, y proporcionar un medicamento que comprende el anticuerpo.
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<110> Mitsubishi Pharma Corporation
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<120> El método de protección de grupos tiol en proteínas
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<130> 03044WO0
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<150> JP 2002-370822
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<151> 2002-12-20
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<160> S
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<210> 1
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<223> Inventor: Kenji, Sasaki; Yasuhiko, Katsumura
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<400> 1
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3 
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<210> 2
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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4 
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<210> 3
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 3
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5 
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<210> 4
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 4
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6 
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<210> 5
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 5
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7 
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<210> 6
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 6
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8 
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<210> 7
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<211> 119
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 7
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9 
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<210> 8
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<211> 114
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 8
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10

Claims (14)

1. Un método para protección de un grupo tiol en un anticuerpo que tiene un radical de cisteína libre, que comprende la adición de un compuesto que tiene un enlace disulfuro en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia sobre la actividad del anticuerpo, donde el compuesto que tiene un enlace disulfuro en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia sobre la actividad del anticuerpo es cistina, homocistina, ácido lipoico, glutation oxidado o disulfuro de glutation.
2. El método según la reivindicación 1 que es para inhibir una reacción de polimerización de anticuerpos vía grupos tiol.
3. El método según la reivindicación 1 que es para inhibir la modificación de un anticuerpo.
4. El método según la reivindicación 1 que es para inhibir una reacción de intercambio de un grupo tiol en un anticuerpo con un enlace disulfuro formado en la molécula o entre las moléculas del anticuerpo.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el compuesto que tiene un enlace disulfuro en la molécula y no ejerce sustancialmente ninguna influencia sobre la actividad del anticuerpo es cistina.
6. El método para proteger un grupo tiol en un anticuerpo que tiene un radical de cisteína libre según la reivindicación 1, que comprende la adición del compuesto que tiene enlace disulfuro en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia sobre la actividad del anticuerpo simultánea o separadamente desde un compuesto que tiene un grupo tiol en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia sobre la actividad del anticuerpo, donde el compuesto que tiene un grupo tiol en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia en la actividad del anticuerpo es cisteína, homocisteína, glutation o ácido dihidrolipoico.
7. El método según la reivindicación 6, donde el compuesto que tiene grupo tiol en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia sobre la actividad del anticuerpo es cisteína.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el anticuerpo es un anticuerpo F(ab')_{2}.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
10. El método según la reivindicación 9, donde el anticuerpo monoclonal tiene un grupo tiol en su región variable.
11. El método según la reivindicación 9 o 10, donde el anticuerpo monoclonal tiene un radical de cisteína en su región variable.
12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde el anticuerpo monoclonal comprende las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID Nos: 1, 2 y 3 en la Lista de Secuencias en su región hipervariable de cadena pesada, y las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID Nos: 4. 5 y 6 en la Lista de Secuencias en su región hipervariable de cadena ligera.
13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No. 7 en la Lista de Secuencias y una reacción variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No: 8 en la Lista de Secuencias.
14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el anticuerpo se produce utilizando una célula cultivada en un medio libre de suero.
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