ES2325482T3 - Tratamiento de semillas transgenicas de maiz con pesticidas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para proteger una planta transgénica de maíz contra el daño causado por la alimentación de un insecto, comprendiendo el procedimiento proporcionar una semilla para la planta transgénica de maíz, semilla que comprende un gen que codifica una proteína insecticida Cry3; y tratar la semilla con insecticida de imidacloprida o de teflutrina en una cantidad desde 200 gramos hasta 500 gramos de ingrediente activo por 100 kilogramos de semilla.
Description
Tratamiento de semillas transgénicas de maíz con
pesticidas.
La presente invención versa, en general, acerca
del control de plagas que provocan daños a las plantas de maíz por
sus actividades de alimentación, y más en particular acerca del
control de dichas plagas de las plantas de maíz mediante la
combinación de una semilla de maíz que tiene un evento transgénico y
el tratamiento de dicha semilla con un pesticida antes de que sea
plantada la semilla.
Los insectos y artrópodos relacionados destruyen
anualmente un 15% estimado de cosechas agrícolas en los Estados
Unidos e incluso más que eso en los países en vías de desarrollo.
Además, las malas hierbas competidoras y las plantas parasitarias y
saprofíticas son responsables de aún más pérdidas potenciales de
producción.
Parte de este daño ocurre en la tierra cuando
los patógenos de plantas, los insectos y otras plagas endémicas de
la tierra atacan a la semilla después de haber sido plantada. En la
producción de maíz, la mayoría del resto del daño es causado por
gusanos de las raíces - plagas de insectos que se alimentan o dañan
de otra manera las raíces de las plantas; y por orugas podadoras,
barrenadores europeos del maíz, y otras plagas que se alimentan o
dañan las partes de la planta situadas por encima de la superficie
del suelo. Las descripciones generales del tipo y los mecanismos de
ataque de las plagas a las cosechas agrícolas son proporcionadas,
por ejemplo, por Metcalf, en Destructive and Useful Insects,
(1962); y por Agrios en Plant Pathology, 3ª ed., Academic Press
(1988).
El maíz es la cosecha de cereal más importante
en la región medio oeste de los Estados Unidos. Entre las plagas de
insectos más importantes del maíz en esta región es la forma
larvaria de tres especies de escarabajos Diabrotica. Estas
incluyen el gusano de las raíces del maíz occidental, Diabrotica
vergifera vergifera Leconte, el gusano de las raíces del maíz
septentrional, Diabrotica berberi Smith y Diabrotica
berberi Lawrence, y el gusano de las raíces del maíz
meridional, Diabrotica undecimpunctata howardi Barber. De
hecho, se utiliza más insecticida para el control del gusano de las
raíces del maíz que para cualquier otra plaga del maíz, y la
superficie total tratada es mayor que para cualquier otra plaga en
los Estados Unidos.
Los gusanos de las raíces del maíz (CRW)
sobreviven el invierno en la etapa de huevo en los campos donde se
cultivó maíz la temporada anterior. Los huevos eclosionan entre
finales de mayo y junio. Si no sigue una cosecha de maíz a otra del
año anterior, las larvas morirán. En consecuencia, el impacto del
gusano de las raíces del maíz se siente más directamente en las
zonas en las que la cosecha de maíz sigue sistemáticamente a otra
cosecha de maíz anterior, como es típico de muchas zonas en la
región del medio oeste de los Estados Unidos.
Después de eclosionar, las larvas pasarán por
tres etapas o fases larvarias, durante las que se alimentan del
sistema de raíces del maíz. Se requieren aproximadamente tres
semanas para que se complete la etapa larvaria. El daño causado al
sistema de raíces del maíz por la alimentación de las larvas es la
causa principal de pérdidas de cosechas de maíz debida al gusano de
las raíces del maíz. Las plantas de maíz que se caen y se implantan
en el campo después del debilitamiento o destrucción de una parte
considerable del sistema de raíces son la causa de una porción
considerable de esta pérdida, dado que este maíz implantado no puede
ser cosechado por medio de maquinaria mecanizada convencional y es
dejado en el campo.
Después de que se haya completado el desarrollo
larvario, las larvas se transforman en crisálidas inmóviles, y de
ahí en los escarabajos adultos que emergen de la tierra durante el
verano, dependiendo el periodo de aparición de la ubicación de
crecimiento. Después de la aparición, los escarabajos adultos se
alimentan durante aproximadamente dos semanas antes de que las
hembras comienzan a poner huevos. La máxima actividad de los
adultos se da en el Cinturón de maíz de los EE. UU. durante finales
de julio y principios de agosto en los campos plantados con maíz un
año tras otro, pero la actividad puede culminar más tarde en los
campos de maíz de primer año o de maduración tardía. Los
escarabajos de los gusanos de las raíces comienzan a poner huevos
en los campos de maíz aproximadamente dos semanas después de haber
emergido. (Para más información, véase, por ejemplo, Corn
Rootworms, Field Crops Pest Management Circular #16, Ohio Pest
Management & Survey Program, The Ohio State University,
Extension Division, Columbus, Ohio; disponible en línea en
www.ag.ohio-state.edu/\simohioline/icm-fact/fc-16.html,
13 de septiembre de 2000; y McGahen et al., Corn Insect Control:
Corn Rootworm, PENpages número 08801502, hoja informativa
disponible en la Universidad Estatal de Pensilvania, State College,
Pensilvania, 1989).
En la práctica convencional agrícola actual, en
los casos en los que una cosecha de maíz sigue a otra cosecha de
maíz, es normal que se aplique un insecticida para proteger el
sistema de raíces del maíz de una alimentación severa por las
larvas de gusanos de las raíces. La práctica convencional es atacar
a los escarabajos adultos o atacar a las larvas. Ejemplos de
formulaciones convencionales de tratamiento para escarabajos adultos
incluyen la aplicación de insecticidas de carbarilo (por ejemplo,
SEVEN® 80S con 1,121 - 1,242 kg de activo/hectárea); fenvalerato o
esfenvalerato (por ejemplo, PYDRIN® 2.4EC con 1,121 \times
10^{-1} hasta 2,242 \times 10^{-1} kg de activo/hectárea, o
ASANA® 0.66EC con 3,363 \times 10^{-2} hasta 5,605 \times
10^{-2} kg de activo/hectárea); malatión (57% E con 1,009 kg de
activo/hectárea); permetrina (por ejemplo, AMBUSH® 2.0EC con 1,121
\times 10^{-1} hasta 2,242 \times 10^{-1} kg de
activo/hectárea o POUNCE® 3.2EC con 1,121 \times 10^{-1} hasta
2,242 \times 10^{-1} kg de ingrediente activo/hectárea); o
PENNCAP-M® con 2,803 \times 10^{-1} hasta 5,605
\times 10^{-1} kg de activo/hectárea.
Para tratar las larvas de CRW, la práctica
convencional es aplicar un insecticida para tierra bien durante la
plantación o después de la misma, pero preferentemente tan cerca de
la eclosión como sea posible. Los tratamientos convencionales
incluyen insecticidas de carbofurano (por ejemplo, FURADAN® 15G con
0,744 kg/hilera de 1 km); cloropirifos (por ejemplo, LORSBAN® 15G
con 0,744 kg/hilera de 1 km); fonofos (por ejemplo, DYFONATE® 20G
con 0,418 hasta 0,558 kg/hilera de 1 km); forato (por ejemplo,
THIMET® 20G con 0,558 kg/hilera de 1 km); terbufos (por ejemplo,
COUNTER® 15G con 0,744 kg/hilera de 1 km); o teflutrina (por
ejemplo, FORCE® 3G con 0,372 hasta 0,465 kg/hilera de 1 km).
Se sabe que muchos de los pesticidas químicos
enumerados anteriormente son perjudiciales para los seres humanos y
los animales en general. El daño medioambiental que causan estos
pesticidas se ve agravado a menudo debido a la práctica de aplicar
los pesticidas mediante pulverización foliar o una aplicación
directa a la superficie de la tierra. La deriva del viento, la
filtración y el derrame pueden causar la migración de una gran parte
del pesticida fuera de la zona deseada de actividad y sobre aguas
superficiales y en contacto directo con pájaros, animales y seres
humanos.
Debido a la preocupación acerca del impacto de
los pesticidas químicos sobre la salud pública y la salud del medio
ambiente, se han llevado a cabo esfuerzos significativos para
encontrar formas de reducir la cantidad de pesticidas químicos que
se utilizan. Recientemente, mucho de este esfuerzo se ha centrado en
el desarrollo de cosechas transgénicas que están diseñadas para
expresar toxicantes para insectos, derivados de microorganismos.
Por ejemplo, la patente U.S. nº 5.877.012 otorgada a Estruch et
al. desvela la clonación y expresión de proteínas de proteínas
de dichos organismos como Bacillus, Pseudomonas, Clavibacter
y Rhizobium en plantas para obtener plantas transgénicas con
resistencia a dichas plagas como orugas podadoras negras, gardamas,
varios barrenadores y otras plagas de insectos. La publicación
WO/EP97/07089 por parte de Privalle et al. enseña la
transformación de monocotiledoneas, como el maíz, con una peroxidasa
que codifica una secuencia recombinante de ADN para la protección
de la planta contra la alimentación por barrenadores del maíz,
gusanos de la mazorca y orugas podadoras. Jansens et al., en
Crop Sci., 37(5): 1616-1624 (1997), informó
de la producción de maíz transgénico que contenía un gen que
codifica una proteína cristalina de Bacillus thuringiensis
(Bt) que controlaba ambas generaciones del barrenador europeo del
maíz. Las patentes U.S. n^{os} 5.625.136 y 5.859.336 otorgadas a
Koziel et al. informaron de que la transformación de maíz con
un gen de B. thuringiensis que codificaba
endotoxinas-delta proporcionó al maíz transgénico
una resistencia mejorada al barrenador europeo del maíz. En Crop
Science, 35(2): 550 - 557 (1995), Armstrong et al.
proporcionaron un informe exhaustivo de pruebas de campo de maíz
transgénico que expresaba una proteína insecticida de B.
thuringiensis.
Se sabía que las
endotoxinas-\delta Bt de tipo salvaje tenían una
actividad baja contra los insectos coleópteros, y Kreig et
al., en 1983, informó del primer aislamiento de una variedad
tóxica coleóptera de B. thuringiensis. (Véase la patente
U.S. nº 4.766.203). Las patentes U.S. n^{os} 4.797.279 y
4.910.016, también desvelaron variedades de tipo salvaje e híbridos
de B. thuringiensis que produjeron proteínas que tenían algo
de actividad coleóptera. Sin embargo, más recientemente, parecen
prometedores procedimientos más precisos de ingeniería genética en
el desarrollo de proteínas modificadas de B. thuringiensis
que tienen niveles significativamente mayores de actividad contra
los gusanos de las raíces del maíz que las producidas por sus
antecesoras de tipo salvaje. (Véase, por ejemplo, el documento WO
99/31248 otorgado a Ecogen, Inc. y la empresa Monsanto).
Sin embargo, no se sabe en la actualidad si
cualquier evento transgénico por sí solo será lo suficientemente
efectivo para proteger al maíz de los daños causados por gusanos de
las raíces del maíz en campos muy infestados que están dedicados al
maíz en serie. De hecho, el control total del daño provocado por
gusanos de las raíces del maíz por cualquier evento transgénico por
sí solo puede no ser deseable a largo plazo, por el potencial
desarrollo de variedades resistentes de la plaga objetivo.
Otra alternativa de las formas convencionales de
la aplicación del pesticida es el tratamiento de las semillas de la
planta con pesticidas. Se ha empleado durante algún tiempo el uso de
fungicidas para proteger a las semillas de los ataques después de
ser plantadas, y el uso de niveles bajos de insecticidas para la
protección, por ejemplo, de la semilla de maíz de los elatéridos.
El tratamiento de las semillas con pesticidas tiene las ventajas de
proporcionar la protección de las semillas, mientras que se minimiza
la cantidad de pesticida que se requería y se limita la cantidad de
contacto con el pesticida y el número de distintas aplicaciones de
campo que eran necesarias.
En la patente U.S. nº 5.696.144, por ejemplo, se
proporcionan otros ejemplos del control de plagas mediante la
aplicación de insecticidas directamente a la semilla de la planta,
que desvela que el barrenador europeo del maíz causó menos daño de
alimentación a las plantas de maíz cultivadas a partir de semillas
tratadas con un compuesto de 1-arilpirazol a una
tasa de 500 g por quintal de semilla que las plantas de control
cultivadas a partir de semillas sin tratar. Además, la patente U.S.
nº 5.876.739 otorgada a Turnblad et al. (y su antecesora, la
patente U.S. nº 5.849.320) desvela un procedimiento para controlar
los insectos endémicas de la tierra, lo que implica tratar las
semillas con un revestimiento que contiene uno o más aglutinantes
poliméricos y un insecticida. Esta referencia proporciona una lista
de insecticidas que identifica como candidatos para su uso en este
revestimiento y también nombra un número de insectos objetivo
potenciales. Sin embargo, aunque la patente 5.876.739 expone que el
tratamiento de la semilla de maíz con un revestimiento que contiene
un insecticida en particular protege a las raíces del maíz del daño
causado por el gusano de las raíces del maíz, no indica ni sugiere
de otra manera que dicho tratamiento pueda ser utilizado con
semillas que tengan un evento transgénico.
El tratamiento de la semilla que tiene un evento
transgénico con pesticidas de compuestos nitroimino o nitroguanidino
ha sido mencionado (véase, por ejemplo, el documento WO 99/35913) y
el documento WO 99/35910, sin embargo, no se han encontrado
directrices acerca de la utilidad o eficacia potencial de dichos
tratamientos, ni los detalles de cómo se podrían efectuar dichos
tratamientos -como las cantidades de ingrediente activo que serían
necesarias por unidad de cantidad de semilla- y ningún ejemplo que
pudiera dar motivos para creer que los tratamientos propuestos
proporcionaría en realidad una protección adecuada.
Por lo tanto, aunque los desarrollos recientes
en la ingeniería genética de las plantas han mejorado la capacidad
para proteger a las plantas de las plagas sin utilizar pesticidas
químicos, y aunque dichas técnicas como el tratamiento de las
semillas con pesticidas han reducido los efectos perjudiciales de
los pesticidas en el medio ambiente, aún continúan habiendo
numerosos problemas que limitan la aplicación con éxito de estos
procedimientos bajo condiciones reales del campo. En consecuencia,
sería útil proporcionar un procedimiento mejorado para la
protección de las plantas, especialmente de plantas de maíz, contra
el daño provocado por la alimentación de las plagas. Sería
particularmente útil si dicho procedimiento redujese la tasa
requerida de aplicación de pesticidas químicos convencionales, y
también si limitase el número de las distintas operaciones de
requeridas en los campos para la plantación y el cultivo de la
cosecha.
La presente invención está dirigida hacia un
procedimiento novedoso para proteger una planta transgénica de maíz
contra el daño causado por la alimentación de un insecto,
comprendiendo el procedimiento proporcionar una semilla para la
planta transgénica de maíz, semilla que comprende un gen que
codifica una proteína insecticida Cry3 y tratar la semilla con
insecticida de imidacloprida o teflutrina en una cantidad desde 200
gramos hasta 500 gramos de ingrediente activo por 100 kilogramos de
la semilla.
La presente invención también está dirigida
hacia una semilla de una planta transgénica de maíz que proporciona
una mayor resistencia a la planta resultante de maíz contra el daño
causado por la alimentación de un insecto, que comprende un gen que
codifica una proteína insecticida Cry3 y tratar la semilla con
insecticida de imidacloprida o teflutrina en una cantidad desde 200
gramos hasta 500 gramos de ingrediente activo por 100 kilogramos de
la semilla.
La presente invención también está dirigida
hacia una semilla transgénica novedosa que ha sido tratada por
medio del procedimiento de la presente invención.
Por lo tanto, entre las diversas ventajas que se
descubrió que se consiguen mediante la presente invención, se puede
señalar la provisión de un procedimiento mejorado para la protección
de las plantas, especialmente de plantas de maíz, del daño causado
por la alimentación de las plagas; la provisión de dicho
procedimiento, que reduciría la tasa requerida de aplicación de
pesticidas químicos convencionales; y también la provisión de dicho
procedimiento, que limitaría el número de las distintas operaciones
de que eran requeridas en los campos para la plantación y
cultivación de la cosecha.
Conforme a la presente invención, se ha
descubierto que se puede proteger a las plantas de maíz contra el
daño causado por la alimentación de una o más plagas por medio de un
procedimiento como se ha descrito anteriormente. Se ha descubierto
que la combinación de un evento transgénico que tiene una actividad
contra los gusanos de las raíces del maíz y el tratamiento de la
semilla como se ha descrito anteriormente proporciona de forma
imprevista ventajas sinérgicas a las semillas que tienen dicho
tratamiento, incluyendo una eficacia superior de forma imprevista
para la protección contra el daño a la planta resultante de maíz por
el gusano de las raíces del maíz. En particular, se descubrió que
las semillas de maíz que tenían un evento transgénico que causaba
la producción de la endotoxina CryBb.11231 en combinación con el
tratamiento de dichas semillas con imidacloprida era superior de
forma imprevista o al evento transgénico por sí solo, o al
tratamiento por sí solo de dichas semillas con imidacloprida, para
proteger a las plantas resultantes de maíz contra niveles más
severos de daño causado por gusanos de las raíces del maíz - niveles
de daño que se sabe reducen la producción de maíz.
Se sabe de plantas y de semillas de maíz que han
sido diseñadas para incluir genes exógenos derivados de Bacillus
thuringiensis que codifica la expresión de
endotoxinas-\delta Cry3 que tienen una actividad
contra las plagas coleópteras, al igual que procedimientos para el
tratamiento de las semillas (incluso algunas semillas transgénicas)
con pesticidas. Sin embargo, hasta la presente invención, no se
había comprendido que se podían utilizar ciertas cantidades
efectivas de ciertos pesticidas para tratar las semillas de maíz que
tienen dichos eventos Cry3, resultando en que la combinación sería
efectiva, y preferentemente, de forma imprevista, superior, al
aumentar la eficacia tanto del pesticida como del evento
transgénico, y proporcionaría las ventajas adicionales de aumentar
la capacidad para igualar la actividad pesticida contra la presión
de la plaga, disminuir el coste del tratamiento y/o de la
aplicación, aumentar la seguridad de la manipulación de las
semillas, y disminuir el impacto medioambiental del evento o del
pesticida, o de
ambos.
ambos.
En particular, se ha descubierto en las
realizaciones preferidas que el tratamiento de la invención de
semillas transgénicas de maíz que son capaces de expresar ciertas
proteínas Cry3Bb modificadas proporcionaba de forma imprevista una
protección superior contra los gusanos de las raíces del maíz.
Además, se cree que dichas combinaciones también son efectivas para
proteger a las plantas de maíz que están brotando contra el daño
causado por las orugas podadoras negras. También se cree que las
semillas de la presente invención tienen la propiedad de disminuir
el coste del uso de pesticidas, porque se puede utilizar menos
pesticida para obtener una cantidad requerida de protección que si
no se utilizase el procedimiento innovador. Además, debido a que se
utiliza menos pesticida y debido a que se aplica antes de la
plantación y sin una aplicación específica en los campos, se cree
que por lo tanto el procedimiento objeto es más seguro para el
operario y para el medio ambiente, y es potencialmente menos caro
que los procedimientos convencionales.
Cuando se dice que algunos efectos son
"sinérgicos", se quiere decir que incluyen los efectos
sinérgicos de la combinación de la combinación del evento
transgénico y del pesticida en la actividad pesticida (o eficacia).
Sin embargo, no se pretende que dichos efectos sinérgicos estén
limitados a la actividad pesticida, sino que deberían incluir
también dichas ventajas imprevistas como el aumento del alcance de
actividad, un perfil de actividad ventajoso en relación al tipo y
la cantidad de reducción del daño, una disminución del coste del
pesticida y de su aplicación, una disminución de la distribución del
pesticida en el medio ambiente, una exposición disminuida al
pesticida del personal que produce, manipula y planta las semillas
de las plantas de maíz, y otras ventajas conocidas por los expertos
en la técnica.
La presente invención también proporciona una
ventaja de aumentar la capacidad para igualar la actividad pesticida
contra la presión de la plaga. Esto hace referencia a la capacidad
para diseñar la combinación del evento transgénico y del
tratamiento del pesticida de forma que la semilla o la planta
resultante esté provista de una actividad pesticida efectiva
durante el periodo en el que la intensidad de la alimentación de la
plaga objetivo sobre la semilla o la planta alcanza su máximo. A
título de ejemplo, cuando se aplica un pesticida como imidacloprida
o teflutrina a una semilla de maíz que tiene un evento transgénico
contra los gusanos de las raíces del maíz, se puede aplicar el
pesticida en un revestimiento diseñado para proporcionar una
liberación controlada del pesticida. Se puede seleccionar la tasa
de liberación de forma que el pesticida proporcione protección
contra dichas otras plagas como, por ejemplo, la oruga podadora
negra, en la etapa posterior al brote del maíz, mientras que el
evento transgénico proporciona una protección contra los gusanos de
las raíces del maíz en una etapa posterior del desarrollo de la
planta - cuando es necesaria dicha protección.
Según se utilizan en el presente documento, los
términos "efecto pesticida" y "actividad pesticida" o
"actividad" hacen referencia a un efecto tóxico contra una
plaga. La expresión "actividad contra (una o más) plagas"
también tiene el mismo significado. Cuando se dice que una semilla
o una planta está "protegida contra el daño causado por la
alimentación de una o más plagas", se quiere decir que dicha
semilla o planta posee una característica que tiene una acción
directa o indirecta sobre una o más plagas que tiene como resultado
un daño reducido causado por la alimentación de dicha plaga o
plagas en las semillas, raíces, tallos y follaje de las plantas que
tienen dicha característica en comparación con el daño causado por
la alimentación bajo las mismas condiciones a plantas que no tienen
dicha característica. Dichas acciones directas o indirectas incluyen
inducir la muerte de la plaga, repeler la plaga de las semillas,
raíces, tallos y/o follaje de la planta, inhibir la alimentación de
la plaga con las semillas, las raíces, los tallos y/o el follaje de
la planta, o la puesta de sus huevos en los mismos, e inhibir o
prevenir la reproducción de la plaga.
La expresión "actividad insecticida" tiene
el mismo significado que actividad pesticida, excepto que está
limitado a aquellos casos en los que la plaga es un insecto. Salvo
cuando se señala específicamente, cuando se utiliza el término
"pesticida" en el presente documento, ese término hace
referencia a un pesticida químico que se suministra externamente a
la semilla, y no se quiere decir que incluya agentes activos
producidos por la semilla en particular o por la planta que crece
de la semilla en particular. Sin embargo, se pueden utilizar las
expresiones "actividad pesticida" y "actividad
insecticida" haciendo referencia a la actividad de cualquiera de
los dos, o de ambos, de entre un pesticida suministrado externamente
y/o un agente producido por la semilla o por la planta.
Una característica de la presente invención es
una semilla de una planta transgénica de maíz. Según se utiliza en
el presente documento, la expresión "planta transgénica de
maíz" significa una planta de maíz o progenie de la misma
derivada de una célula o protoplasto transformado de una planta de
maíz, en la que el ADN de la planta contiene una molécula exógena
de ADN introducida que no estaba presente originalmente en una
planta nativa, no transgénica de la misma variedad.
La semilla transgénica de maíz es una que
contiene un gen exógeno que codifica una proteína pesticida. Las
proteínas pesticidas de este tipo están descritas por Schnepf et
al., en Microbiology & Molecular Biology Reviews, 62: 775 -
806 (1998), y por French-Constant y Bowen, en CMSL
Cell. Mol. Life Sci., 57: 828 - 833 (2000). En una aplicación de la
invención, la proteína pesticida es una proteína insecticida.
Se prefiere que la semilla contenga un gen
exógeno derivado a partir de una variedad de Bacillus
thuringiensis, y en particular, se prefiere que el gen exógeno
sea uno que codifique una endotoxina-\delta
insecticida derivada de B. thuringiensis. Dichas
endotoxinas-\delta son descritas en el documento
WO 99/31248 y en la patente U.S. nº 6.063.597, e incluyen las
toxinas Cry3. Los segmentos de ácido nucleico que codifican
proteínas cristalinas modificadas de B. thuringiensis,
tóxicas para los coleópteros, que son útiles en la presente
invención se describen en la patente U.S. nº 6.060.594, y las
plantas transgénicas resistentes a insectos, que incluyen
secuencias de ácido nucleico que codifican dichas proteínas
insecticidas son analizadas en la patente U.S. nº 6.023.013. Se
prefiere que las endotoxinas-\delta de la presente
invención incluyan las proteínas Cry3B, y aún se prefiere más que
las endotoxinas-\delta incluyan las proteínas
Cry3Bb activas en los coleópteros. La nomenclatura de las proteínas
cristalinas insecticidas de B. thuringiensis fue expuesta
por Höfte y Whitely, Microbiol. Rev., 53: 242-255,
1989. Esta nomenclatura ha sido revisada, y se puede encontrar la
nomenclatura revisada en
http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/index.html.
En el presente documento se utilizará la nomenclatura revisada para
describir las características del evento transgénico y las
proteínas de las endotoxinas-\delta codificadas
por el evento transgénico.
Cuando se utiliza en el presente documento la
expresión "evento transgénico", se quiere decir que dicha
expresión hace referencia al ADN diseñado genéticamente que se ha
descrito anteriormente, pero que también incluye la o las proteínas
que son codificadas por el gen modificado. Por lo tanto, un evento
transgénico en una semilla de maíz, o en una planta de maíz,
incluye la capacidad para expresar una proteína. Cuando se dice que
un "evento transgénico tiene actividad contra una plaga", se
debe comprender que es la proteína la que está codificada por el
gen que tiene realmente dicha actividad cuando se expresa la
proteína y se pone en contacto con la plaga.
El documento WO 99/31248 y la patente U.S. nº
6.063.597 describen procedimientos para diseñar genéticamente genes
de endotoxinas-\delta de B. thuringiensis
de forma que se puedan expresar las
endotoxinas-\delta modificadas. Las
endotoxinas-\delta modificadas difieren de las
proteínas de tipo salvaje al tener sustituciones, adiciones o
eliminaciones específicas de aminoácidos en comparación con las
proteínas producidas por el organismo de tipo salvaje. En el
presente documento, dichas endotoxinas-\delta
modificadas son identificadas mediante el uso de un asterisco (*),
o mediante referencia a una proteína específica por su número de
identificación. Por lo tanto, una
endotoxina-\delta Cry3 modificada genéticamente se
expresaría como Cry3*, ejemplos de lo cual incluyen la
Cry3Bb.11231, y la Cry3Bb.11098.
Se descubrió que algunas de las
endotoxinas-\delta modificadas que fueron
descritas en el documento WO 99/31248 y en la patente U.S. nº
6.063.597 tenían una actividad mejorada contra insectos coleópteros,
y en particular contra Diabrotica spp., incluyendo los
gusanos de las raíces del maíz. Según se utiliza en el presente
documento, la expresión "actividad mejorada" hace referencia a
la mayor actividad insecticida de una toxina modificada en
comparación con la actividad de la misma toxina sin las
modificaciones de aminoácidos cuando se prueban a ambas bajo las
mismas condiciones. En particular, se descubrió que las
endotoxinas-\delta Cry3* tenían una actividad
mejorada contra los gusanos de las raíces del maíz, y por lo tanto
son preferidas para su uso en la presente invención. Más preferidas
son las endotoxinas-\delta Cry3B*, y aún más
preferidas las endotoxinas-\delta Cry3Bb*.
Eventos transgénicos incluso aún más preferidos son los que
comprenden la capacidad para expresar las
endotoxinas-\delta modificadas que están listadas
en la siguiente tabla. También se muestran en la tabla las
variedades transgénicas de B. thuringiensis que incluyen
genes para la expresión de las endotoxinas novedosas respectivas, y
la fecha y el número de acceso de su depósito en el Agricultural
Research Service Collection (NRRL) en 1815 N. University Street,
Peoria, Illinois, 91904.
También se ha descubierto que un uso preferido
de la presente invención es para reducir el daño causado por la
alimentación de la plaga cuando se utiliza en combinación con
semillas que tienen eventos transgénicos que tienen ciertos niveles
de efectividad contra dicha plaga. Para ilustrar qué niveles de
efectividad son los preferidos, el siguiente ejemplo utilizará el
procedimiento de Iowa para la clasificación de raíces (Hills y
Peters, J. Econ. Entomol., 64: 764-765, 1971), que
mide el daño causado a las raíces del maíz por la alimentación de
los gusanos de las raíces del maíz en una escala de 1 - 6. En la
clasificación, 1 = ningún daño o únicamente unas pocas cicatrices
causadas por la alimentación; 2 = cicatrices evidentes causadas por
la alimentación pero no se comió ninguna raíz hasta menos de 3,81
\times 10^{-2} m de la planta; 3 = se comieron varias raíces
hasta menos de 3,81 \times 10^{-2} m de la planta, pero nunca se
destruye el equivalente de un nodo completo de raíces; 4 = un nodo
de raíces destruido por completo; 5 = dos nodos de raíces destruidos
por completo; y 6 = tres o más nodos de raíces destruidos. Se
define una raíz destruida como una raíz que ha sido podada hasta
menos de 3,81 \times 10^{-2} m de la base. Las raíces podadas no
tienen por qué originarse de un único nodo, pero todas las raíces
podadas deben ser iguales al equivalente de un nodo completo para
contar como un nodo destruido.
Según se utiliza en el presente documento, un
evento transgénico se encuentra en el intervalo preferente del
nivel de efectividad contra una plaga objetivo si ese evento reduce
el daño causado por la alimentación de esa plaga una cierta
cantidad en comparación con la misma cosecha sin el evento
transgénico, pero no previene sustancialmente todo el daño causado
por la plaga objetivo. Por ejemplo, si el 10% del maíz transgénico
sufrió daño causado por los gusanos de las raíces del maíz de 4 o
más en la escala Iowa de 1 - 6, mientras que el 80% del maíz no
transgénico sufrió un daño de 4 o más, entonces se podría decir que
el daño al maíz transgénico fue del (10/80) \times 100 = 12,5%
del daño del maíz no transgénico. Para los fines de la presente
invención, se comprenderá que un evento transgénico en el maíz se
encuentra en el intervalo preferente del nivel de efectividad si el
maíz que tiene dicho evento sufre desde aproximadamente el 5% hasta
aproximadamente el 50% del daño sufrido por el maíz no transgénico
debido a la misma plaga bajo las mismas condiciones. Es más
preferente que el maíz que tiene dicho evento transgénico sufra
desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 40% del daño
sufrido por el maíz no transgénico causado por la misma plaga bajo
las mismas condiciones, incluso más preferentemente el daño va
desde aproximadamente el 15% hasta aproximadamente el 30%, y aún más
preferentemente el daño va desde aproximadamente el 20% hasta
aproximadamente el 30% del daño sufrido por el maíz no transgénico
causado por la misma plaga bajo las mismas condiciones. Según se
utiliza en el presente documento, cuando se utiliza el término
"aproximadamente" para describir el grado de daño al maíz, se
debe comprender que el grado de daño puede ser superior o inferior
a los límites descritos hasta en un 1% o un 2% y aún considerarse
que está en los intervalos descritos. A título de ejemplo, un nivel
de daño del 4,5% sería considerado como de "aproximadamente el
5%".
Sin desear estar restringidos a esta o a
cualquier otra teoría, se cree que el tratamiento pesticida de la
semilla puede proporcionar ventajas significativas cuando se combina
con un evento transgénico que proporciona una protección que está
en el intervalo de efectividad preferente contra una plaga objetivo.
Además, se cree que hay situaciones bien conocidas por los expertos
en la técnica, en las que es ventajoso tener dichos eventos
transgénicos en el intervalo preferente de efectividad.
La presente invención también incluye semillas y
plantas que tienen más de un evento transgénico. Dichas
combinaciones son denominadas como eventos transgénicos
"apilados". Estos eventos transgénicos apilados pueden ser
eventos que están dirigidos a la misma plaga objetivo, o pueden
estar dirigidos a distintas plagas objetivo. En un procedimiento
preferente, una semilla que tiene la capacidad para expresar una
proteína Cry 3 también tiene la capacidad para expresar al menos
otra proteína insecticida que es distinta de una proteína Cry 3.
En otro procedimiento preferente, la semilla que
tiene la capacidad para expresar una proteína Cry 3 también tiene
un evento transgénico que proporciona una tolerancia herbicida. Se
prefiere más que el evento transgénico que proporciona la
tolerancia herbicida sea un evento que proporciona resistencia al
glifosato, N-(fosfonometil) glicina, incluyendo la forma salina de
isopropilamina de dicho herbicida; se prefiere aún más el evento
transgénico que es efectivo para proporcionar resistencia de las
plantas y las semillas al herbicida ROUNDUP READY® disponible en
Monsanto Co., St. Louis, Misuri.
En el presente procedimiento, se trata una
semilla de maíz que tiene un evento transgénico con un
pesticida.
El piretroide sintético utilizado en la presente
invención es teflutrina.
Preferentemente, el cloronicotinilo utilizado en
la composición objeto es imidacloprida
(1-[(6-cloro-3-piridinil)metil]-N-nitro-2-imidazolidinimina,
CAS RN 138261-41-3).
Cuando se describe un insecticida en el presente
documento, se debe comprender que se pretende que la descripción
también incluya las formas salinas del insecticida al igual que
cualquier forma isomérica y/o tautomérica del insecticida que
exhiba la misma actividad insecticida que la forma del insecticida
que se describe.
Los insecticidas que son útiles en el presente
procedimiento pueden ser de cualquier grado o pureza que estén
aprobados en la industria como dicho insecticida. Se pueden tolerar
otros materiales que acompañan a los insecticidas en preparados
comerciales como impurezas en los procedimientos y en las
composiciones objeto, siempre que los otros materiales no
desestabilicen la composición ni reduzcan ni destruyan
significativamente la actividad de cualquiera de los componentes
del insecticida o del evento transgénico contra la plagas o plagas
objetivo. Una persona con un grado normal de dominio de la técnica
de la producción de insecticidas puede identificar fácilmente
aquellas impurezas que pueden ser toleradas y aquellas que no.
Se ha descubierto que el presente procedimiento
es útil para proteger semillas y plantas contra insectos.
La plaga de insectos objetivo para la presente
invención incluye insectos del orden Coleoptera, por ejemplo,
Agriotis spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema
tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp.,
Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa
decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus
spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes
spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga
spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma
spp.
Se ha descubierto que la presente invención es
particularmente efectiva cuando la plaga de insecto es una
Diabrotica spp., y especialmente cuando la plaga es
Diabrotica virgifera, Diabrotica barberi, o Diabrotica
undecimpunctata.
En el procedimiento de la presente invención, se
aplica el pesticida a una semilla transgénica de maíz. Aunque se
cree que se puede aplicar el presente procedimiento a una semilla
transgénica de maíz en cualquier estado fisiológico, se prefiere
que la semilla se encuentre en un estado lo suficientemente durable
para que no sufra ningún tipo de daño durante el procedimiento del
tratamiento. Típicamente, la semilla sería una semilla que ha sido
cosechada del campo; extraída de la planta; y separada de cualquier
mazorca, tallo, cáscara externa, y pulpa que la rodea u otro
material de la planta que no sea semilla. Preferentemente, la
semilla también sería biológicamente estable hasta el punto de que
el tratamiento no causaría ningún daño biológico a la semilla. Por
ejemplo, en una realización, se puede aplicar el tratamiento a la
semilla de maíz que ha sido cosechada, limpiada y secada hasta un
contenido de humedad por debajo de aproximadamente el 15% en peso.
En una realización alternativa, la semilla puede ser una que ha
sido secada y luego preparada con agua y/u otro material y luego
vuelta a secar antes o durante el tratamiento con el pesticida.
Dentro de las limitaciones que se acaban de describir, se cree que
el tratamiento puede aplicarse a la semilla en cualquier momento
entre la cosecha de la semilla y la siembra de la semilla. Según se
utiliza en el presente documento, se pretende que la expresión
"semilla no sembrada" incluye una semilla en cualquier periodo
entre la cosecha de la semilla y la siembra de la semilla en la
tierra para el propósito de la germinación y el crecimiento de la
planta.
Cuando se dice que la semilla no sembrada está
"tratada" con el pesticida, no se quiere decir que dicho
tratamiento incluya aquellas prácticas en las que se aplica el
pesticida a la tierra, en vez de a la semilla. Por ejemplo, no se
considera que dichos tratamientos como la aplicación del pesticida
en capas, capas "T", o en surcos, al mismo tiempo que se
siembra la semilla estén incluidos en la presente invención.
El pesticida, o la combinación de pesticidas,
pueden ser aplicado "puro", es decir, sin ninguna dilución ni
componentes adicionales presentes. Sin embargo, el pesticida se
aplica típicamente a las semillas en forma de una formulación de
pesticida. Esta formulación puede contener uno o más componentes
deseables incluyendo, sin estar limitados a ellos, diluyentes
líquidos, aglutinantes para servir como una matriz para el
pesticida, rellenos para proteger a las semillas durante
condiciones de tensión, y plastificantes para mejorar la
flexibilidad, adhesión y/o extendibilidad del revestimiento.
Además, para formulaciones aceitosas de pesticida que contienen
poco o ningún relleno, puede ser deseable añadir a la formulación
desecantes como carbonato cálcico, caolín o arcilla bentonita,
perlita, tierra diatomácea o cualquier otro material adsorbente. El
uso de dichos componentes en los tratamientos de semillas es
conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente U.S. nº
5.876.739. El experto en la técnica puede seleccionar fácilmente
los componentes deseables para ser utilizados en la formulación del
pesticida dependiendo del tipo de semilla que vaya a ser tratada y
el pesticida seleccionado en particular. Además, se pueden utilizar
las formulaciones comerciales que se pueden conseguir fácilmente de
pesticidas conocidos, como se demuestra en los ejemplos a
continuación.
Las semillas también pueden ser tratadas con uno
o más de los siguientes ingredientes: otros pesticidas, incluyendo
compuestos que actúan únicamente bajo tierra; fungicidas, como
captán, tiram, metalaxilo, (metoxam = isómero resuelto de
metalaxilo), fludioxonilo, oxadixilo, e isómeros de cada uno de esos
materiales, y similares; herbicidas, incluyendo compuestos
seleccionados de entre carbamatos, tiocarbamatos, acetamidas,
triacinas, dinitroanilinas, éteres de glicerol, piridacinonas,
uracilos, fenoxis, ureas y ácidos benzoicos; acondicionadores para
herbicidas como benzoxazina, derivados de benzhidrilo,
N,N-dialil dicloroacetamida, diversos dihaloacilos,
compuestos de oxazolidinilo y de tiazolidinilo, etanona, compuestos
anhídridos naftálicos, y derivados de oximas; fertilizantes; y
agentes de control biológico como bacterias y hongos que se dan
naturalmente o recombinantes del género Rhizobium, Bacillus,
Pseudomonas, Serratia, Trichoderma, Glomus, Gliocladium y hongos
micorrizales. Estos ingredientes pueden ser añadidos como una capa
aparte en la semilla o, de manera alternativa, pueden ser añadidos
como parte de la composición del pesticida.
Preferentemente, la cantidad de la composición
novedosa o de otros ingredientes utilizada en el tratamiento de
semillas no debería inhibir la generación de la semilla ni causar
daño fitotóxico a la semilla.
La formulación del pesticida que se utiliza para
tratar la semilla transgénica de maíz en la presente invención
puede tener la forma de una suspensión; emulsión; mezcla de
partículas en un medio acuoso (por ejemplo, agua); polvo
humectable; gránulos humectables (fluibles en seco); y gránulos
secos. Si se formula como una suspensión o mezcla, la concentración
del ingrediente activo en la formulación es preferentemente desde
aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 99% en peso (p/p),
preferentemente entre 5-40%.
Como se ha mencionado anteriormente, se pueden
incorporar otros ingredientes convencionales inactivos o inertes en
la formulación. Dichos ingredientes inertes incluyen, pero no están
limitados a: agentes convencionales de fijación, agentes de
dispersión como la metilcelulosa (Methocel A15LV o Methocel A15C,
por ejemplo, hacen de agentes combinados de dispersión/fijación
para su uso en tratamientos de semillas), alcohol de polivinilo
(por ejemplo, Elvanol 51-05), lecitina (por ejemplo,
Yelkinol P), dispersantes poliméricos (por ejemplo,
polivinilpirrolidona/acetato de vinilo PVP/VA
S-630), espesantes (por ejemplo, espesantes de
arcilla como Van Gel B para mejorar la viscosidad y reducir el
asentamiento de las suspensiones de partículas), estabilizadores de
emulsiones, tensioactivos, compuestos anticongelantes (por ejemplo,
urea), tintes, colorantes, y similares. Se pueden encontrar
ingredientes inertes adicionales útiles en la presente invención en
McCutcheon's, vol. 1, "Emulsifiers and Detergents", MC
Publishing Company, Glen Rock, Nueva Jersey, EE. UU., 1996. Se
pueden encontrar ingredientes inertes adicionales útiles en la
presente invención en McCutcheon's, vol. 2, "Functional
Materials", MC Publishing Company, Glen Rock, Nueva Jersey, EE.
UU.,
1996.
1996.
Los pesticidas y las formulaciones de pesticidas
de la presente invención pueden ser aplicados a las semillas por
medio de cualquier metodología estándar de tratamiento de semillas,
incluyendo su mezcla en un recipiente (por ejemplo, una botella o
una bolsa), aplicación mecánica, mezcla en tambor, pulverización e
inmersión. Se puede utilizar cualquier material convencional activo
o inerte para poner a las semillas en contacto con los pesticidas
conforme a la presente invención, tal como materiales convencionales
de revestimiento con películas, incluyendo, sin estar limitados a
ellos, materiales de revestimiento con películas de base acuosa como
Sepiret (Seppic, Inc., Fairfield, Nueva Jersey) y Opacoat (Berwind
Pharm. Services, Westpoint, Pensilvania).
Los pesticidas objeto pueden ser aplicados como
un componente de un revestimiento para semillas. Los procedimientos
y las composiciones de revestimiento para semillas conocidos en la
técnica son útiles cuando son modificados por la adición de una de
las realizaciones de la combinación de pesticidas de la presente
invención. Dichos procedimientos y aparatos de revestimiento para
su aplicación se desvelan en, por ejemplo, las patentes U.S.
n^{os} 5.918.413, 5.891.246, 5.554.445, 5.389.399, 5.107.787,
5.080.925, 4.759,945 y 4.465.017. Las composiciones de
revestimiento para semillas se desvelan, por ejemplo, en las
patentes U.S. n^{os} 5.939.356, 5.882.713, 5.876.739, 5.849.320,
5.834.447, 5.791.084, 5.661.103, 5.622.003, 5.580.544, 5.328.942,
5.300.127, 4.735.015, 4.634.587, 4.383.391, 4.372.080,
4.339.456, 4.272.417 y 4.245.432, entre otras.
4.339.456, 4.272.417 y 4.245.432, entre otras.
Los revestimientos útiles de semillas contienen
uno o más aglutinantes y al menos una de las combinaciones objeto
de pesticidas.
Los aglutinantes útiles en la presente invención
comprenden preferentemente un polímero adhesivo que puede ser
natural o sintético y que no tiene efecto fitotóxico sobre la
semilla que va a ser revestida. El aglutinante puede estar
seleccionado de entre acetatos de polivinilo; copolímeros de acetato
de polivinilo; copolímeros de etileno vinil acetato (EVA);
alcoholes de polivinilo; copolímeros de alcohol de polivinilo;
celulosas, incluyendo etilcelulosas, metilcelulosas,
hidroximetilcelulosas, hidroxipropilcelulosas y
carboximetilcelulosa; polivinilpirolidonas; polisacáridos,
incluyendo almidón, almidón modificado, dextrinas, maltodextrinas,
alginato y quitosanos; grasas; aceites; proteínas, incluyendo
gelatina y zeinas; gomas arábigas; lacas; cloruro de vinilideno y
copolímeros de cloruro de vinilideno; lignosulfonatos de calcio;
copolímeros acrílicos; polivinilacrilatos; óxido de polietileno;
polímeros y copolímeros de acrilamida; acrilato de polihidroxietilo,
monómeros de metilacrilamida; y policloropreno.
Se prefiere que el aglutinante esté seleccionado
de forma que pueda servir como una matriz para los pesticidas
objeto. Aunque todos los aglutinantes desvelados anteriormente
pueden ser útiles como una matriz, el aglutinante específico
dependerá de las propiedades de la combinación de los pesticidas. El
término "matriz", según se utiliza en el presente documento,
significa una fase sólida continua de uno o más compuestos
aglutinantes en los cuales están distribuidos uno o más de los
pesticidas objeto como una fase discontinua. Opcionalmente, también
pueden estar presentes en la matriz un relleno y/u otros
componentes. Se debe comprender que el término matriz incluye lo
que puede ser visto como el sistema de matriz, un sistema de
depósito o un sistema microencapsulado. En general, un sistema de
matriz consiste en pesticidas de la presente invención y un relleno
disperso de manera uniforme en un polímero, mientras que un sistema
de depósito consiste en una fase aparte que comprende los
pesticidas objeto, que está disperso físicamente en una fase
polimérica circundante, limitante de la tasa. La microencapsulación
incluye el revestimiento de pequeñas partículas o gotitas de
líquido, pero también las dispersiones en una matriz sólida.
La cantidad de aglutinante en el revestimiento
puede variar, pero estará en el intervalo de 0,01 hasta 25% del
peso de la semilla, más preferentemente entre 0,05 y 15%, y aún más
preferentemente entre 0,1% y 10%.
Como se ha mencionado anteriormente, la matriz
puede incluir un relleno. El relleno puede ser un absorbente o un
relleno inerte, como los conocidos en la técnica, y puede incluir
serrines, arcillas, carbón activado, azúcares, tierra diatomácea,
harinas de cereales, sólidos inorgánicos de grano fino, carbonato
cálcico, y similares. Las arcillas y los sólidos inorgánicos, que
pueden ser utilizados, incluyen bentonita cálcica, caolín,
caolinita, talco, perlita, mica, vermiculita, sílices, polvo de
cuarzo, montmorilonita y mezclas de los mismos. Los azúcares, que
pueden ser útiles, incluyen dextrina y maltodextrina. Las harinas de
cereales incluyen harina de trigo, harina de avena y harina de
cebada.
El relleno está seleccionado de forma que
proporcionará un microclima apropiado a la semilla, por ejemplo, se
utiliza el relleno para aumentar la tasa de carga de los
ingredientes activos y para ajustar la liberación controlada de los
ingredientes activos. El relleno puede ayudar en la producción o en
el procedimiento del revestimiento de la semilla. La cantidad de
relleno puede variar, pero generalmente el peso de los componentes
de relleno se encontrará en el intervalo de 0,05 al 75% del peso de
la semilla, más preferentemente entre el 0,1 y el 50%, y aún más
preferentemente entre el 0,5 y el 15%.
Los pesticidas que son útiles en el
revestimiento son aquellos pesticidas que se describen en el
presente documento. La cantidad de pesticida que se utiliza para el
tratamiento de la semilla variará dependiendo del tipo de semilla y
del tipo de ingredientes activos, pero el tratamiento comprenderá
poner las semillas en contacto con una cantidad de la combinación
de pesticidas que es efectiva como pesticida. Cuando la plaga
objetivo son insectos, esa cantidad será una cantidad del
insecticida que es efectiva como insecticida. Según se utiliza en
el presente documento, una cantidad efectiva como insecticida
significa aquella cantidad de insecticida que matará las plagas de
insectos en un estado larvario o de crisálida de su desarrollo, o
que reducirá o retrasará sistemáticamente la cantidad de daño
producido por las plagas de insectos.
En general, la cantidad de teflutrina que se
aplica a la semilla en el tratamiento variará desde 10 g hasta 2000
g del ingrediente activo del pesticida por 100 kg del peso de la
semilla. Preferentemente, la cantidad de pesticida estará en el
intervalo de 50 g hasta 1000 g de activo por 100 kg de semilla, más
preferentemente entre el intervalo de 200 g hasta 500 g de activo
por 100 kg de peso de semilla. De manera alternativa, se ha
descubierto que es preferible que la cantidad preferente de
imidacloprida sea de entre 200 y 500 g del ingrediente activo por
100 kg de la semilla.
En las realizaciones preferidas de la presente
invención, el evento transgénico comprende la capacidad para
expresar una proteína Cry3Bb.11231 o una proteína Cry3Bb.11098, y el
pesticida está seleccionado de entre imidacloprida o
teflutrina.
Los pesticidas que se utilizan en el tratamiento
no deben inhibir la germinación de la semilla y deberían ser
eficaces en la protección de la semilla y/o de la planta durante ese
momento del ciclo de la vida del insecto objetivo en la que causa
daños a la semilla o a la planta. En general, el revestimiento será
eficaz durante aproximadamente 0 a 120 días después de la
siembra.
Los pesticidas de la invención objeto pueden ser
aplicados a la semilla en forma de un revestimiento. El uso de un
revestimiento es particularmente efectivo para acomodar cargas
elevadas de pesticida, como pueden ser requeridas para tratar
plagas típicamente resistentes, como los gusanos de las raíces del
maíz, mientras que al mismo tiempo se previene una fitotoxicidad
inaceptable debido al aumento de la carga de pesticida.
Opcionalmente, se puede utilizar un
plastificante en la formulación del revestimiento. Los
plastificantes se utilizan típicamente para fabricar la película
que está formada por la capa del revestimiento más flexible, para
mejorar la adhesión y la extendibilidad, y para mejorar la velocidad
del tratamiento. Una flexibilidad mejorada de la película es
importante para minimizar el picado, la rotura o el desconchado
durante los procedimientos de almacenamiento, manipulación o
siembra. Se pueden utilizar muchos plastificantes, sin embargo, los
plastificantes útiles incluyen polietilenglicol, glicerol,
butilbencilftalato, benzoatos de glicol y compuestos relacionados.
El intervalo del plastificante en la capa de revestimiento estará en
el intervalo desde 0,1 hasta 20% en peso.
Cuando el pesticida utilizado en el
revestimiento es una formulación de tipo aceitosa y hay presente
poco o nada de relleno, puede ser útil acelerar el procedimiento de
secado al secar la formulación. Este paso opcional puede llevarse a
cabo por medios bien conocidos en la técnica y pueden incluir la
adición de carbonato cálcico, caolín o arcilla bentonita, perlita,
tierra diatomácea, o cualquier material absorbente que sea añadido
preferentemente al mismo tiempo con la capa pesticida de
revestimiento para absorber el aceite o el exceso de humedad. La
cantidad de carbonato cálcico o de los compuestos afines necesaria
para proporcionar de manera efectiva un revestimiento seco estará
en el intervalo de 0,5 al 10% del peso de la semilla.
Los revestimientos formados con el pesticida son
preferentemente del tipo que son capaces de efectuar una tasa lenta
de liberación del pesticida mediante difusión o movimiento a través
de la matriz al medio circundante.
Además de la capa de revestimiento, la semilla
puede ser tratada con uno o más de los siguientes ingredientes:
otros pesticidas incluyendo fungicidas y herbicidas;
acondicionadores para los herbicidas; fertilizantes y/o agentes de
control biológico. Estos ingredientes se pueden añadir como una capa
aparte o, de manera alternativa, se pueden añadir en la capa
pesticida de revestimiento.
La formulación pesticida puede ser aplicada a
las semillas utilizando técnicas y máquinas convencionales de
revestimiento, como técnicas de lecho fluidizado, el procedimiento
que emplea molinos de muelas horizontales, recipientes rotostáticos
para el tratamiento de semillas, y revestidoras de tambor. También
pueden ser útiles otros procedimientos, como lechos efervescentes.
Se pueden clasificar previamente las semillas por tamaño antes de
su revestimiento. Después del revestimiento, normalmente se secan
las semillas y luego son transferidas a una calibradora para ser
clasificadas por tamaño. Dichos procedimientos son conocidos en la
técnica.
Las semillas tratadas con pesticida también
pueden estar envueltas con una película de sobrerrecubrimiento para
proteger el revestimiento pesticida. Dichos sobrerrecubrimientos son
conocidos en la técnica y pueden ser aplicados utilizando técnicas
convencionales de revestimiento de lecho fluidizado y de película en
tambor.
En otra realización de la presente invención, se
puede poner un pesticida en una semilla, o sobre la misma, mediante
el uso de imprimación de matriz sólida. Por ejemplo, se puede
mezclar una cantidad del pesticida con un material de matriz sólida
y luego se puede colocar en contacto con el material de matriz
sólida durante un periodo para permitir que se introduzca el
pesticida en la semilla. Entonces, se puede separar la semilla
opcionalmente del material de matriz sólida y ser almacenada o
usada, o se puede almacenar o plantar directamente la mezcla del
material de matriz sólida. Los materiales de matriz sólida que son
útiles en la presente invención incluyen poliacrilamida, almidón,
arcilla, sílice, alúmina, tierra, arena, poliurea, poliacrilato, o
cualquier otro material capaz de absorber o adsorber el pesticida
durante un tiempo y liberar ese pesticida en o sobre la semilla. Es
útil asegurarse de que el pesticida y el material de matriz sólida
son compatibles entre sí. Por ejemplo, el material de matriz sólida
debería ser escogido de forma que pueda liberar el pesticida a una
tasa razonable, por ejemplo durante un periodo de minutos, horas o
días.
Adicionalmente, la presente invención plasma la
inhibición como otro procedimiento de tratamiento de la semilla con
el pesticida. Por ejemplo, se puede combinar una semilla de planta
durante un periodo de tiempo con una disolución que comprende desde
el 1% en peso hasta el 75% en peso del pesticida en un disolvente
como el agua. Preferentemente, la concentración de la disolución es
desde el 5% en peso hasta el 50% en peso, más preferentemente desde
el 10% en peso hasta el 25% en peso. Durante el periodo en el que se
combina la semilla con la disolución, la semilla absorbe (embebe)
una porción del pesticida. Opcionalmente, se puede agitar la mezcla
de la semilla de planta y la disolución, por ejemplo mediante
agitación, volteado, mezcla en tambor u otros medios. Después del
imbibición, se puede separar la semilla de la disolución y ser
secada opcionalmente, por ejemplo mediante golpecitos o secada al
aire.
En aún otra realización, se puede mezclar un
pesticida en polvo directamente con la semilla. Opcionalmente, se
puede utilizar un agente de fijación para adherir el polvo a la
superficie de la semilla. Por ejemplo, se puede mezclar una
cantidad de semillas con un agente de fijación y agitarlas
opcionalmente para promover un revestimiento uniforme de la semilla
con el agente de fijación. Entonces, la semilla revestida con el
agente de fijación puede ser mezclada con el pesticida en polvo. Se
puede agitar la mezcla, por ejemplo mediante tambor, para fomentar
el contacto del agente de fijación con el pesticida en polvo,
provocando de ese modo que el pesticida en polvo se pegue a la
semilla.
La presente invención también proporciona una
semilla transgénica de maíz que ha sido tratada con un pesticida
por medio del procedimiento descrito anteriormente.
Las semillas tratadas de la presente invención
pueden ser utilizadas para la propagación de las plantas de maíz de
la misma forma que las semillas de maíz tratadas de forma
convencional. Las semillas tratadas pueden ser almacenadas,
manipuladas, sembradas y cultivadas de la misma forma que cualquier
otra semilla tratada con pesticida. Se deberían tomar medidas
apropiadas de seguridad para limitar el contacto de la semilla
tratada con seres humanos, materiales de alimentos o de piensos,
agua y aves y animales salvajes o domésticos.
Las realizaciones preferidas de la invención se
describen en los siguientes ejemplo. En el presente documento serán
evidentes otras realizaciones dentro del alcance de las
reivindicaciones para un experto en la técnica a partir de la
consideración de la especificación o la práctica de la invención
como se revela en el presente documento.
Los siguientes ejemplos describen realizaciones
preferidas de la invención. Serán evidentes otras realizaciones
dentro del alcance de las reivindicaciones del presente documento
para un experto en la técnica a partir de la consideración de la
especificación o la práctica de la invención como se revela en el
presente documento. Se pretende que la especificación, junto con
los ejemplos, sea considerada únicamente ejemplar, estando el
ámbito y el espíritu de la invención indicados por las
reivindicaciones que siguen a los ejemplos. En los ejemplos, todos
los porcentajes son dados con respecto al peso, a no ser que se
indique lo contrario.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Producción de semillas de maíz que tienen un
evento transgénico efectivo contra los gusanos de las raíces del
maíz y el tratamiento de dicha semilla con imidacloprida (Gaucho®) y
teflutrina (Raze®).
Se prepararon semillas de maíz para expresar la
endotoxina Cry3Bb.11231 o Cry3Bb.11098 de Bacillus
thuringiensis mediante los procedimientos descritos para estos
eventos respectivos en el documento WO 99/31248.
Se trataron las semillas de maíz de la misma
especie híbrida, con o sin los eventos transgénicos respectivos,
bien con imidacloprida (disponible como GAUCHO® en Bayer Corp.) o
con teflutrina (disponible como RAZE® en
Wilbur-Ellis Co., Great Falls, Montana, Walla Walla,
Washington) como sigue. Se preparó una formulación para el
tratamiento de semillas del pesticida deseado al mezclar una
cantidad medida con agua como vehículo y al aplicar la formulación
durante un minuto a temperatura ambiente a un peso medido de
semillas de maíz en un recipiente rotostático para el tratamiento
de semillas. Se calcularon los pesos respectivos de la preparación
del pesticida y de las semillas de maíz para proporcionar la tasa
deseada de tratamiento del pesticida en la semilla. Se mezcló el
pesticida en una cantidad de agua suficiente como para permitir una
distribución eficiente de la formulación a todas las semillas en el
lote mientras que se minimizó la pérdida de la formulación del
tratamiento gracias a la falta de absorción de la formulación por
las semillas. Se permitió que las semillas tratadas reposasen sin
estar tapadas durante al menos cuatro horas antes de ser
plantadas.
Cuando se trataron las semillas con
imidacloprida, se mezcló perfectamente una cantidad suficiente de
Gaucho® 600 FS (que contiene un 48,7% en peso de imidacloprida;
disponible en Gustafson LLC) en agua para formar una formulación de
tratamiento de semillas, y se aplicó la formulación a un peso de
semillas de maíz para proporcionar niveles de tratamiento de 300
gramos de imidacloprida por 100 kg de semilla (0,75 mg de
imidacloprida/grano), o de 400 gramos de imidacloprida por 100 kg
de semilla (1,0 mg de imidacloprida/grano).
Cuando se trataron las semillas con teflutrina,
se mezcló perfectamente una cantidad suficiente de Raze® 2.5 FS
(que contiene un 26,8% en peso de teflutrina; disponible en
Wilbur-Ellis Co.) en agua para formar una
formulación de tratamiento de semillas, y se aplicó la formulación
a un peso de semillas de maíz para proporcionar niveles de
tratamiento de 300 gramos de teflutrina activa por 100 kg de semilla
(0,75 mg de teflutrina/grano).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Pruebas de campo para la determinación de la
eficacia del evento transgénico Cry3Bb.11231 en semillas de maíz en
combinación con los tratamientos de pesticida contra los gusanos de
las raíces del maíz para semillas contra los gusanos de las raíces
del maíz occidentales y septentrionales.
Se llevaron a cabo pruebas de campo conforme a
los protocolos pertinentes y en conformidad con los requerimientos
de notificación del USDA. El propósito de las pruebas era determinar
la eficacia del evento transgénico Cry3Bb.11231 en semillas de maíz
en combinación con tratamientos contra los gusanos de las raíces del
maíz para semillas contra los gusanos de las raíces del maíz
occidentales y septentrionales.
Para cada ubicación de cultivo seleccionada, el
diseño del terreno incluía lo siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron las siguientes combinaciones de
tratamiento para semillas para cada área de cultivo:
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo todos los tratamientos de las
semillas como se describe en el Ejemplo 1. En el tratamiento de
semillas números 1 y 2, se utilizó Gaucho® para una protección
contra elatéridos, pero a niveles lo suficientemente bajos como
para que no se espere tener ningún efecto sobre los gusanos de las
raíces del maíz (es decir, a un nivel de tratamiento de
aproximadamente 60 g de activo/100 kg de semilla o 0,16 mg de
activo/grano), de lo contrario, la semilla que recibió el
tratamiento número 2 únicamente tenía un evento transgénico
Cry3Bb.11231 y ningún tratamiento de pesticida que podría esperarse
que fuera efectivo contra los gusanos de las raíces del maíz.
Para las semillas que tenían tratamientos
numerados 3 a 5, se aplicaron los pesticidas por medio de los
procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Para las semillas que
tenían tratamientos numerados 6 y 7, se aplicó Force® 3G y Lorsban®
15G disponibles comercialmente a la tierra en una capa de 1,27
\times 10^{-1} m en el momento de la siembra. Se muestran los
niveles de aplicación y están en los intervalos recomendados para
una práctica estándar comercial.
Las semillas de maíz que iban a ser probadas
fueron plantadas y cultivadas en cuatro ubicaciones distintas en
cuatro Estados del medio oeste en el cinturón del maíz de los
Estados Unidos conforme al protocolo descrito anteriormente.
La determinación del daño causado por los
gusanos de las raíces del maíz se llevó a cabo conforme al siguiente
protocolo. En las etapas V4 - V6, se llevó a cabo una evaluación de
primera toma al contar el número de plantas por hectárea. En la
etapa VT-R1, se llevó a cabo una evaluación del daño
causado por los gusanos de las raíces del maíz mediante
procedimientos bien conocidos en la industria, y se informó del daño
causado por los gusanos de las raíces del maíz conforme al sistema
de clasificación Iowa 1 - 6. En este sistema, se recuperaron y se
puntuaron los sistemas de raíces de 10 plantas de maíz por terreno
utilizando la escala de clasificación 1 - 6, en la que: 1 = ningún
daño o únicamente unas pocas cicatrices causadas por la
alimentación, 2 = cicatrices evidentes causadas por la alimentación
pero no se comió ninguna raíz hasta menos de 3,81 \times 10^{-2}
m de la planta, 3 = se comió al menos una raíz hasta menos de 3,81
\times 10^{-2} m de la planta, pero nunca se destruye un nodo
completo de raíces, 4 = un nodo de raíces comido hasta menos de 3,81
\times 10^{-2} m de la planta, 5 = dos nodos (círculos) de
raíces comidos hasta menos de 3,81 \times 10^{-2} m de la
planta, 6 = tres nodos (círculos) de raíces comidos hasta menos de
3,81 \times 10^{-2} m de la planta.
De los datos de la Tabla 1(A), se puede
ver que las semillas transgénicas que fueron tratadas bien con
imidacloprida o con teflutrina a cualquier nivel fueron más
resistentes al daño causado por los gusanos de las raíces del maíz
que las semillas transgénicas sin dicho tratamiento de pesticida.
Además, todos los tratamientos combinados (de evento transgénico
además del tratamiento de pesticida) fueron más eficaces que el
tratamiento convencional en capas superficiales bien con FORCE® o
con LORSBAN®.
Por lo tanto, se puede concluir que el
tratamiento de una semilla de maíz que tiene un evento transgénico
bien con imidacloprida o bien con teflutrina proporciona una
resistencia mejorada con respecto a la proporcionada bien por el
evento transgénico por sí solo, o la semilla isohíbrida que también
ha recibido un tratamiento estándar de pesticida de capas
superficiales en el momento de la plantación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Pruebas de campo para la determinación de la
eficacia del evento transgénico Cry3Bb.11231 en semillas de maíz en
combinación con los tratamientos de imidacloprida para semillas
contra los gusanos de las raíces del maíz occidentales y
septentrionales.
Se llevó a cabo una prueba de campo conforme a
los protocolos pertinentes y en conformidad con los requerimientos
de notificación del USDA. El propósito de la prueba era determinar
la eficacia del evento transgénico Cry3Bb.11231 en semillas de maíz
en combinación con tratamientos contra los gusanos de las raíces del
maíz para semillas utilizando imidacloprida.
Para cada ubicación de cultivo seleccionada, el
diseño del terreno incluía lo siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron las siguientes combinaciones de
tratamiento para semillas para cada área de cultivo:
Se llevaron a cabo todos los tratamientos de las
semillas como se describe en el Ejemplo 1. En el tratamiento de
semillas número 1 y 2, se utilizó Gaucho® para una protección contra
elatéridos, pero a niveles lo suficientemente bajos para que no se
espere que haya ningún efecto sobre los gusanos de las raíces del
maíz (es decir, a un nivel de tratamiento de aproximadamente 60 g
de activo/100 kg de semilla o 0,16 mg de activo/grano), de lo
contrario, la semilla que recibió el tratamiento número 2 únicamente
tenía un evento transgénico Cry3Bb.11231 y ningún tratamiento de
pesticida que podría esperarse que fuera efectivo contra los gusanos
de las raíces del maíz.
Para las semillas que tenían tratamientos
numerados 3 a 5, se aplicaron los pesticidas por medio de los
procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Para las semillas que
tenían tratamientos numerados 6 y 7, se aplicó Force® 3G y Lorsban®
15G disponibles comercialmente a la tierra en una capa de 1,27
\times 10^{-1} m en el momento de la siembra. Se muestran los
niveles de aplicación y están en los intervalos recomendados para
una práctica estándar comercial.
Las semillas de maíz que iban a ser probadas
fueron plantadas y cultivadas en cuatro ubicaciones distintas en
cuatro estados del medio oeste en el cinturón del maíz de los
Estados Unidos conforme al protocolo descrito anteriormente.
La determinación del daño causado por los
gusanos de las raíces del maíz se llevó a cabo conforme al protocolo
descrito en el Ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos mostraron que tanto el evento
transgénico por sí solo como el tratamiento de semillas únicamente
con imidacloprida proporcionó algo de nivel de protección contra el
daño causado por los gusanos de las raíces del maíz por encima del
control isohíbrido sin tratar. A mayores niveles de daño (es decir,
niveles de daño 4 - 6), el maíz que tenía el evento transgénico
sufrió 4,7% del daño que el del control no transgénico. Dado que el
4,7% podría ser considerado ser aproximadamente el 5%, se consideró
que el evento Cry3Bb.11231 estaba en un intervalo preferido de
efectividad de aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 50%
del daño del control no transgénico.
El tratamiento de las semillas con imidacloprida
únicamente con 400 g/100 kg fue efectivo contra el daño causado por
los gusanos de las raíces del maíz, pero la efectividad de la
imidacloprida fue menor que la efectividad del evento transgénico
por sí solo. La combinación del tratamiento con imidacloprida de la
semilla transgénica fue más efectivo contra el daño causado por los
gusanos de las raíces que el tratamiento de pesticida por sí solo o
que el evento transgénico por sí solo. Además, la combinación de
Cry3Bb.11231 con imidacloprida con 400 g/100 kg de semilla
proporcionó una mejor protección que el tratamiento comercial
estándar bien de FORCE® o bien de LORSBAN® aplicado como una capa
superficial en el momento de la plantación.
Las ventajas del presente tratamiento de la
semilla transgénica con imidacloprida incluyen la simplificación de
la plantación, al eliminar el requerimiento de una aplicación
separada del pesticida. Además, la plantación es más fácil y
segura, dado que el plantador no tiene que manipular un pesticida
concentrado.
La combinación del tratamiento de semilla con
imidacloprida con las semillas de maíz que tienen un evento
transgénico Cry3Bb.11231 fue probada para una sinergia posible a un
nivel de daño causado por los gusanos de las raíces de 3 - 6. En la
primera prueba, mostrada en la Tabla 2(A), se determinó el
porcentaje de las plantas probadas que tenían niveles de daño de 3
a 6, en la escala de Iowa de 1 - 6, para el control y para las
semillas tratadas con el pesticida en dos niveles, y para las
semillas que tenían el evento transgénico, solo en combinación.
Entonces, se utilizó la siguiente fórmula para calcular un "umbral
de sinergia":
(%\ de\ Cry3Bb
. 11231\ de\ control)*(%\ de\ tratamiento\ con\ imidacloprida\ de\
control)/100.
Se comparó este umbral con el porcentaje de
control para la combinación del tratamiento (es decir, Cry3Bb.11231
con imidacloprida con 400 g/100 kg). Si el porcentaje de la
combinación del tratamiento era inferior al umbral, entonces se
concluía que había sinergia. Si el porcentaje de la combinación del
tratamiento era superior al umbral, entonces se concluía que no se
demostraba la sinergia para esa combinación.
Se creyó que la medición del daño causado por
los gusanos de las raíces a niveles de daño elevados (es decir,
niveles 3 - 6) es un indicador útil que correlatos con una pérdida
de producción subsiguiente debido a dicho daño. La razón para esto
es que el daño causado por los gusanos de las raíces a niveles 1 y 2
rara vez causa que las plantas de maíz se caigan y se implanten, y
no se cree que tal pérdida mínima de raíz reduzca el número ni el
peso de granos por espiga. Sin embargo, el daño a las raíces a
niveles de 3 y superiores causa cada vez más implantación y pérdida
de producción. Por lo tanto, se cree que el daño total de los
niveles 3 - 6 (y en algunos casos, 4 - 6 y 5 y 6), proporciona una
indicación útil del efecto del daño causado por los gusanos de las
raíces del maíz sobre la producción subsiguiente de maíz.
Este análisis indicó que la combinación del
evento transgénico CryBb.11231 del maíz con el tratamiento de la
semilla con imidacloprida con 400 g/100 kg fue sinérgica y eficaz de
forma imprevista contra el daño causado por los gusanos de las
raíces del maíz a un nivel 3 - 6. En consecuencia, se concluyó que
la combinación del evento transgénico con el tratamiento de las
semillas con imidacloprida proporcionó ventajas significativas con
respecto al uso de cualquiera de los procedimientos por sí solos, y
que dicha protección fue superior de forma imprevista en términos
de eficacia contra el daño severo causado por los gusanos de las
raíces del maíz.
También se creyó que era digno de mención que la
combinación de imidacloprida y del evento proporcionó una
protección contra un daño severo causado por los gusanos de las
raíces del maíz a niveles que eran mucho mejores que los
proporcionados por ya sea por FORCE® o por LORSBAN® aplicados en
capas superficiales.
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Ejemplo
4
Pruebas de campo para la determinación de la
eficacia del evento transgénico Cry3Bb.11231 en semillas de maíz en
combinación con tratamientos de semilla con pesticida de teflutrina
contra gusanos de las raíces del maíz occidentales y
septentrionales.
Se podría llevar a cabo una prueba de campo para
la determinación de la eficacia de la combinación del evento
transgénico Cry3Bb.11231 en semillas de maíz con teflutrina
(disponible como RAZE® en Wilbur-Ellis Company)
conforme al mismo protocolo que se describe en el Ejemplo 3, salvo
que se sustituiría teflutrina por imidacloprida en cada caso en el
que se utilizase a niveles que se esperaba que fuesen efectivos
contra los gusanos de las raíces del maíz (por ejemplo, a niveles
de más de 60 g/100 kg de semilla). Si se desea, sería permisible
continuar el uso de imidacloprida a niveles de 60 g/100 kg, o
menos, para la protección contra elatéridos.
Sería de esperar que la combinación del
tratamiento de semillas con teflutrina junto con un evento
transgénico en semillas de maíz que tienen efectividad contra los
gusanos de las raíces del maíz proporcionaría una protección
sinérgica similar a la mostrada en el Ejemplo 3 para la combinación
de imidacloprida y Cry3Bb.11231.
Se pretende que la presentación de las
referencias en el presente documento sea simplemente para resumir
las afirmaciones hechas por sus autores y no se admite que ninguna
referencia constituya una técnica anterior. Los solicitantes se
reservan el derecho a impugnar la exactitud y la pertinencia de las
referencias citadas.
En vista de lo anterior, se podrá observar que
se logran las diversas ventajas de la invención y se consiguen
otros resultados ventajosos.
Claims (9)
1. Un procedimiento para proteger una planta
transgénica de maíz contra el daño causado por la alimentación de
un insecto, comprendiendo el procedimiento
proporcionar una semilla para la planta
transgénica de maíz, semilla que comprende un gen que codifica una
proteína insecticida Cry3;
y
tratar la semilla con insecticida de
imidacloprida o de teflutrina en una cantidad desde 200 gramos hasta
500 gramos de ingrediente activo por 100 kilogramos de semilla.
2. El procedimiento conforme a la reivindicación
1, en el que la proteína insecticida es una proteína Cry3*.
3. El procedimiento conforme a la reivindicación
2, en el que la proteína Cry3* es una proteína Cry3B*.
4. El procedimiento conforme a la reivindicación
4, en el que la proteína Cry3B* está seleccionada del grupo
constituido por Cry3Bb.11231 y Cry3Bb.11098.
5. El procedimiento conforme a la reivindicación
1, en el que la semilla que tiene la capacidad para expresar una
proteína Cry 3 también tiene la capacidad para expresar al menos
otra proteína insecticida que es distinta de una proteína Cry
3.
6. El procedimiento conforme a la reivindicación
1, en el que la semilla que tiene la capacidad para expresar una
proteína insecticida Cry 3 también tiene un evento transgénico que
proporciona tolerancia a los herbicidas.
7. El procedimiento conforme a la reivindicación
6, en el que el evento transgénico que proporciona una tolerancia a
los herbicidas proporciona tolerancia contra el glifosato.
8. Una semilla de una planta transgénica de maíz
que ha sido tratada por medio del procedimiento de la reivindicación
1 que proporciona una resistencia mejorada a la planta resultante
de maíz contra el daño causado por la alimentación de un insecto,
en la que la semilla contiene un gen que codifica una proteína
insecticida Cry3 y en la que la semilla ha sido tratada con
insecticida de imidacloprida o teflutrina en una cantidad desde 200
gramos hasta 500 gramos de ingrediente activo por 100 kilogramos de
semilla.
9. La semilla de la reivindicación 22, en la que
el evento transgénico es una proteína Cry3Bb.11231 o Cry3Bb.11098
derivada de Bacillus thuringiensis.
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