ES2324727T3 - Alfa-l-iduronidasa recombinante y procedimientos para el tratamiento de las enfermedades causadas por las deficiencias de la misma. - Google Patents
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Abstract
Enzima alfa-L-iduronidasa humana recombinante, que comprende los aminoácidos 26 a 653 de la figura 1, con una pureza igual o superior a 99%.
Description
\alpha-L-iduronidasa
recombinante y procedimientos para el tratamiento de las
enfermedades causadas por las deficiencias de la misma.
La presente invención pertenece al campo de la
biología molecular enzimología, bioquímica y medicina clínica. En
particular, la presente invención proporciona una
\alpha-L-iduronidasa recombinante,
procedimientos de producción a gran escala y purificación de la
enzima \alpha-L-iduronidasa
recombinante humana de tipo comercial, y procedimientos para tratar
ciertos trastornos genéticos que incluyen la deficiencia en
\alpha-L-iduronidasa y la
mucopolisacaridosis I
(MPS I).
(MPS I).
Los hidratos de carbono juegan diversos
importantes papeles en el funcionamiento de los organismos
vivientes. Además de sus funciones metabólicas, los hidratos de
carbono son componentes estructurales del organismo humano unidos
covalentemente a numerosas otras sustancias como las proteínas y los
lípidos (denominados glucoconjugados). Por ejemplo, los tejidos
conjuntivos humanos y las membranas celulares comprenden proteínas,
hidratos de carbono y una matriz de proteoglicanos. La parte de
hidratos de carbono de esta matriz de proteoglicanos proporciona
importantes propiedades a la estructura del cuerpo.
Una deficiencia genética de la enzima lisosómica
\alpha-L-iduronidasa que fragmenta
a los hidratos de carbono, provoca un trastorno del almacenamiento
lisosómico denominado mucopolisacaridosis I (MPS I) (Neufeld y
Muenzer, págs. 1565-1587, en The Metabolic Basis
of Inherited Disease, Eds,. C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S.Sly,
y D.Valle, McGraw-Hill, New York (1989)). En una
forma grave, a MPS I se le conoce con el nombre de síndrome de
Hurler y se asocia con múltiples problemas tales como retardo
mental, enturbiamiento de la córnea, características faciales
toscas, enfermedad cardíaca, enfermedad respiratoria, agrandamiento
del hígado y del bazo, hernias y rigidez de las articulaciones. Los
pacientes que padecen el síndrome de Hurler mueren habitualmente
antes de los 10 años de edad. En una forma intermedia conocida como
síndrome de Hurler-Scheie, la función mental no
está generalmente gravemente afectada, pero los problemas físicos
pueden conducir a la muerte a los diez o los veinte años de edad.
El síndrome de Scheie es la forma más leve de MPS I. Es compatible
con un período de vida normal, pero la rigidez de las
articulaciones, el enturbiamiento corneal y las enfermedades de las
válvulas cardíacas causan problemas significativos.
La frecuencia de MPS I se calcula que es de
1:100.000 según un estudio en British Columbia de todos los recién
nacidos (Lowry, et al, Human Genetics 85:
389-390 (1990)) y 1:70.000 según un estudio irlandés
(Nelson, Human Genetics 101: 355-358
(1990)). Parece que no existe una predilección étnica para esta
enfermedad. Es probable que mundialmente la enfermedad esté poco
diagnosticada, porque el paciente muera de una complicación antes
de que se haya realizado el diagnóstico, o porque las formas más
leves del síndrome pueden confundirse con artritis o perderse
completamente. El rastreo efectivo de los recién nacidos respecto a
MPS I encontrará probablemente algunos pacientes previamente no
detectados.
Excepto para algunos pacientes que reunen las
condiciones necesarias para el trasplante de médula ósea, no
existen terapias significativas disponibles para todos los pacientes
de MPS I. Hobbs, et al, (Lancet 2:
709-712 (1981)) informó en primer lugar de que el
trasplante de médula ósea trató con éxito a un paciente de Hurler.
A partir de entonces, estudios clínicos en diversos centros de
trasplante han mostrado mejoría en la enfermedad física y un
enlentecimiento o estabilización en la disminución del desarrollo,
si se lleva a cabo tempranamente.(Whitley, et al., Am. J.
Med. Genet. 46: 209-218 (1993); Vellodi,
et al., Arch. Dis. Child. 76: 92-99
(1997); Peters, et al., Blood 91:
2601-2608 (1998); Guffon, et al., J.
Pediatrics 133: 119-125 (1998). Sin embargo,
la mortalidad y la morbosidad, y la necesidad de donantes
emparejados de médula, limita la utilidad de los trasplantes de
médula ósea. Una terapia alternativa disponible para todos los
pacientes afectados proporcionaría un importante gran avance en el
tratamiento y manejo de esta enfermedad.
La terapia de reemplazamiento enzimático se ha
considero una terapia potencial para MPS I, después del
descubrimiento de que la
\alpha-L-iduronidasa puede
corregir el defecto enzimático en las células Hurler en cultivo,
pero el desarrollo de la terapia humana ha sido técnicamente
inviable hasta la fecha. En el proceso de corrección, la enzima que
contiene un residuo de
manosa-6-fosfato es absorbida en las
células mediante endocitosis mediada por receptores y es
transportada a los lisosomas donde elimina a los sustratos
almacenados, heparan sulfato y dermatan sulfato. La aplicación de
esta terapia al hombre no ha sido posible previamente debido a las
fuentes inadecuadas de la
\alpha-L-iduronidasa en los
tejidos.
Para la terapia enzimática de la
\alpha-L-iduronidasa en MPS I, se
ha requerido una fuente recombinante de la enzima para obtener
aprovisionamientos terapéuticamente suficientes de la enzima. El
ADNc para la enzima canina se clonó en 1991 (Stoltzfus, et
al, J. Biol. Chem. 267:6570-6575
(1992) y para la enzima humana en el mismo año. (Scott, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
88:9695-9699 (1991), Moskowitz, et al.,
FASEB J 6: A77 (1992)). Después de la clonación de ADNc
para la \alpha-L-iduronidasa, la
producción de cantidades adecuadas de
\alpha-L-iduronidasa recombinante
permitió el estudio de la terapia de reemplazamiento enzimático en
la MPS I canina. (Kakkis, et al., Protein Expr. Purif.
5:225-232 (1994)). Los estudios de
reemplazamiento enzimático en el modelo MPS I canino demostraron que
la \alpha-L-iduronidasa
recombinante administrada intravenosamente se distribuía
ampliamente y reducía el almacenamiento lisosómico de muchos tejidos
(Shull, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:
12937-12941 (1994); Kakkis et al,
Biochem. Mol. Med. 58:156-167
(1996)).
Según un primer aspecto de la presente invención
se proporciona una enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante, que comprende los aminoácidos 26 a 653 de la figura
1, con una pureza igual a o superior a 99%.
En una forma de realización la enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante es una forma enzimática de elevada absorción que (a)
comprende residuos de
manosa-6-fosfato en las posiciones 3
y 6 de los azúcares unidos a N y (b) muestra una afinidad de
absorción inferior a 30 unidades de enzima por ml o inferior a 2
nM.
En otra forma de realización la enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante presenta una vida media en el interior de las células
de aproximadamente cinco días.
En otra forma de realización la enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante resulta sustancialmente correctora de los trastornos
de almacenamiento de glicosaminoglicano causados por la deficiencia
de iduronidasa.
En otra forma de realización la enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante presenta una actividad específica superior a
aproximadamente 240.000 unidades por miligramo de proteína.
Según un segundo aspecto de la presente
invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende
la enzima \alpha-L-iduronidasa
humana recombinante en combinación con un portador farmacéuticamente
adecuado.
En una forma de realización la composición
farmacéutica comprende una solución de cloruro sódico, un tampón y
polisorbato 80.
En otra forma de realización la enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante está presente en la composición farmacéutica a una
concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml y aproximadamente 125.000
unidades por ml.
En una forma de realización la solución de
cloruro sódico se encuentra a una concentración de aproximadamente
150 mM.
En otra forma de realización el tampón es un
tampón de fosfato sódico a una concentración de aproximadamente 100
mM, y pH 5,4-5,9.
En otra forma de realización la composición
farmacéutica, tras la dilución en la forma de dosificación, contiene
albúmina humana a una concentración de por lo menos aproximadamente
1 mg/ml.
En una forma de realización, el pH de la
solución es mantenido a aproximadamente 5,8.
En una forma de realización, el polisorbato 80
es mantenido a 0,001%.
La presente invención muestra un procedimiento
para producir en masa
\alpha-L-iduronidasa recombinante,
con la pureza apropiada para permitir su producción a gran escala,
para la utilización por parte del paciente, a largo plazo, de la
terapia enzimática. En una forma de realización amplia, el
procedimiento comprende la etapa de transfectar un ADNc que
codifica la totalidad o parte de una
\alpha-L-iduronidasa en una célula
apropiada para su expresión. En algunas formas de realización, se
utiliza un ADNc que codifica una
\alpha-L-iduronidasa completa,
preferentemente una
\alpha-L-iduronidasa humana. Sin
embargo, en otras formas de realización, puede utilizarse un ADNc
que codifica un fragmento biológicamente activo o un mutante suyo.
Específicamente, pueden llevarse a cabo una o más sustituciones
aminoácidas siempre que se conserve o potencie la actividad
enzimática de la enzima. En otras formas de realización preferidas,
se utiliza un vector para transferir el ADNc a una célula apropiada
o a una progenie celular para su expresión. En una forma de
realización particularmente preferida, el ADNc se transfecta a una
célula ovárica del hámster chino, para crear la progenie celular
2.131. En otras formas de realización, todavía, el procedimiento de
producción muestra una o más de las características siguientes, que
han demostrado niveles de producción particularmente altos: (a) el
pH del cultivo de crecimiento celular puede disminuirse hasta
alrededor de 6,5 a 7,0, preferentemente hasta alrededor de
6,8-7,0 durante el proceso de producción, (b)
durante cada período de 24 horas, pueden cambiarse de 2 a 3,5
volúmenes del cultivo mediante perfusión continua, (c) la
saturación de oxígeno puede optimizarse hasta alrededor del 40%,
pero puede ser tan alta como del 80%, (d) pueden utilizarse
inicialmente en el medio microportadores de celulosa macroporosa
con el 5% del suero aproximadamente, para producir una masa celular,
seguido por una rápida inundación a un medio libre de proteínas
para la producción, (e) un medio bajo en proteínas o libre de ellas
tal como un producto PF-CHO de JRH Biosciences,
puede optimizarse para incluir cantidades suplementarias de uno o
más ingredientes seleccionados del grupo formado por: glutamato,
aspartato, glicina, ribonucleósidos, y desoxiribonucleósidos; (f)
un cultivo de una suspensión en un recipiente con agitación, puede
perfundirse en un proceso continuo para producir iduronidasa.
Se describe un línea celular transfectada que
muestra la capacidad de producir
\alpha-L-iduronidasa en cantidades
que permiten utilizar la enzima terapéuticamente. En las formas de
realización preferidas, la presente invención caracteriza una
progenie celular ovárica de hámster chino tal como la progenie
celular 2.131, que produce estable y fiablemente cantidades de
\alpha-L-iduronidasa que permiten
la utilización terapéutica de la enzima. En algunas formas de
realización preferidas, la progenie celular puede contener más de
una copia de un constructo de expresión. En formas de realización
más preferidas, incluso, la progenie celular expresa
\alpha-L-irudinasa recombinante
en cantidades de por lo menos de 20 microgramos por 10^{7} células
por día.
Se describen los vectores adecuados para
producir \alpha-L-iduronidasa en
cantidades que permiten utilizar la enzima terapéuticamente. En las
formas de realización preferida, la presente invención caracteriza
un vector de expresión que comprende un elemento
promotor/potenciador del citomegalovirus, un intrón del extremo 5',
formado por un intrón Ca murino, un ADNc que codifica la totalidad o
un fragmento o mutante de una
\alpha-L-iduronidasa, y un sitio
de poliadenilación 3' de la hormona de crecimiento bovina. Asimismo,
el ADNc que codifica la totalidad o un fragmento o un mutante de
una \alpha-L-iduronidasa tiene una
longitud de 2,2 kb. Este vector de expresión puede transfectarse
en, por ejemplo, una proporción de 50 a 1, con cualquier vector de
selección habitual apropiado tal como pSV2NEO, para potenciar
inserciones múltiples de la copia. Alternativamente, la
amplificación génica puede utilizarse para inducir múltiples
inserciones de la copia.
La presente invención proporciona nueva
\alpha-L-iduronidasa producida
según los procedimientos de la presente invención y presente por lo
tanto en cantidades que permiten utilizar la enzima
terapéuticamente. La actividad específica de la
\alpha-L-iduronidasa según la
presente invención es superior a 200.000 unidades por milígramo de
proteínas. Preferentemente, es superior a 240.000 unidades
aproximadamente por milígramo de proteínas. El peso molecular de la
\alpha-L-iduronidasa de la
presente invención es aproximadamente de 82.000 daltons,
correspondiendo 70.000 daltons, aproximadamente, a aminoácidos, y
alrededor de 12.000 daltons, a hidratos de carbono.
Se describe un nuevo procedimiento para
purificar \alpha-L-iduronidasa.
Según una primera forma de realización, una masa celular puede
desarrollarse en un medio que contiene suero al 5%, seguido por un
cambio a un medio modificado para la producción, libre de
proteínas, sin ninguna adaptación significativa para producir un
material para iniciar una actividad altamente específica para la
purificación. En una forma de realización preferida, puede
utilizarse una columna cromatográfica de tres fases para purificar
la enzima. Dicha columna cromatográfica de tres fases puede incluir
la utilización de FF sepharose azul, una fase cromatográfica
sepharose quelante de Cu^{++}, y una fase cromatográfica HP de
fenil sepharose. En otra forma de realización preferida, se utiliza
una fase de tratamiento con pH ácido para inactivar los virus
potenciales sin dañar a la enzima. Las columnas de concanavalina
A-Sepharose, Heparina-Sepharose y
Sephacril 200 son eliminadas, añadiéndose las columnas
Azul-Sepharose y quelante de cobre para aumentar la
capacidad del proceso de purificación a gran escala, para reducir
filtraciones iinapropiadas no deseadas para la utilización (del
producto) a largo plazo por parte del paciente, y para mejorar la
pureza del producto.
Se describen los procedimientos para el
tratamiento de enfermedades causadas totalmente o en parte por la
deficiencia de
\alpha-L-iduronidasa. En una forma
de realización, este procedimiento muestra la administración de una
\alpha-L-iduronidasa recombinante
o un fragmento biológicamente activo o mutante de la misma sola o
en combinación con un portador farmacéuticamente adecuado. En otras
formas de realización, este procedimiento muestra la transferencia
de un ácido nucleico que codifica la totalidad o parte de una
\alpha-L-iduronidasa en una o más
células huésped in vivo. Las formas de realización comprenden
la optimización de la dosis a las necesidades del organismo que se
va a tratar, preferentemente mamíferos o humanos, para mejorar
eficazmente los síntomas de la enfermedad. En las formas de
realización preferidas, la enfermedad es mucopolisacaridosis I (MPS
I), síndrome de Hurler, síndrome de Hurler-Scheie o
síndrome de Scheie.
Se describen composiciones farmacéuticas que
comprenden \alpha-L-iduronidasa
útil para el tratamiento de una enfermedad causada totalmente o en
parte por la deficiencia de la
\alpha-L-iduronidasa. Dichas
composiciones pueden resultar adecuadas para la administración de
varias maneras, como administración parenteral, tópica, intranasal,
por inhalación u oral. Las formas de realización que muestran
secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o parte de
una \alpha-L-iduronidasa que
pueden ser administradas in vivo en las células afectadas
por una deficiencia de
\alpha-L-iduronidasa están
comprendidas en el alcance de este aspecto.
La figura 1 representa las secuencias
nucleótidas y las aminoácidas deducidas del ADNc que codifica la
\alpha-L-iduronidasa (SEC ID nº 1
y 2). Se proporcionan los nucleótidos 1 a 6200. Se proporcionan los
aminoácidos que empiezan con la primera metionina en el marco
abierto de lectura.
La figura 2 representa los resultados de los
procesamientos SDS-PAGE del eluado obtenido según
los procedimientos tal como se describen a continuación. El cuadro
superior muestra los resultados SDS-PAGE obtenidos
de la \alpha-L-iduronidasa
purificada (3 microgramos) y de los contaminantes del esquema de
producción/purificación dado a conocer en, et al, Protein Expr.
Purif, 5:225-232 (1994). En el cuadro
inferior, los resultados de SDS-PAGE de la
\alpha-L-iduronidasa purificada
con contaminantes de un proceso de producción/purificación anterior
no publicado (Solicitud de patente US nº de serie 09/078.209 y nº
09/170.977) al que se hace referencia como el procedimiento Carson
en los carriles 2 (7,5 microgramos de
\alpha-L-iduronidasa) y 3 (5,0
microgramos de
\alpha-L-iduronidasa), se
comparan con los del proceso de producción/purificación de la
presente invención, al que se hace referencia como el proceso Galli
(carril 4, 5 microgramos de
\alpha-L-iduronidasa). El carril 1
contiene el marcador del peso molecular. La Figura 2 muestra que el
procedimiento Galli de producción/purificación de la presente
invención produce un producto de
\alpha-L-iduronidasa muy
purificado con menos contaminantes, comparado con los anteriores
esquemas de producción/purificación.
La Figura 3 demuestra el nivel de producción de
la \alpha-L-iduronidasa durante un
período de 30 días, durante el cual las células se cambiaron en el
día 5 desde un medio que contenía suero a un medio sin suero. La
producción de
\alpha-L-iduronidasa se
caracterizó por: (1) ausencia de la necesidad de adaptación, cuando
las células se cambian desde un medio que contiene suero a uno que
no lo contiene a 100200 (cuadros superior e inferior) con un
aumento ininterrumpido en la productividad (cuadro superior); (2) un
alto nivel de producción superior a 4 mg por litro (1000 por ml) en
un medio sin proteínas (cuadro inferior); y (3) una potenciación en
la producción de la a-iduronidasa con eventos de
inducción de butirato (cuadro inferior).
La Figura 4 demuestra una disminución en el
volumen hepático durante la terapia enzimática en pacientes MPS
I.
La Figura 5 demuestra la excreción urinaria de
GAG durante la terapia enzimática.
La Figura 6 demuestra la extensión del codo y de
la rodilla en HACOO2 durante la terapia enzimática.
La Figura 7 demuestra la flexión del hombro a
las 104 semanas en cuatro pacientes con la máxima restricción,
durante la terapia enzimática.
La Figura 8 demuestra la mejoría en la apnea del
sueño antes y después de seis semanas de terapia.
La Figura 9 demuestra la mejoría en las apneas e
hipoapneas durante el sueño, con la terapia enzimática en cada
paciente individual.
La Figura 10 demuestra la mejoría en los ensayos
de función pulmonar antes y después de 12 y 52 semanas de terapia
enzimática e en un paciente.
La Figura 11 demuestra un aumento en la
velocidad del crecimiento en altura con la terapia enzimática.
La Figura 12 muestra el grado de contaminación
por la proteína Ovárica del Hámster Chino (CHOP) y el grado de
pureza de la \alpha-L-iduronidasa,
producida por (1) el procedimiento Carson, un proceso de
purificación/producción anterior no publicado (Solicitud de Patente
US nº de serie 09/078.209 y 09/170.977 y (2) el procedimiento
Galli, el proceso de purificación/producción de la presente
invención. Así, la Figura 12 muestra que la
\alpha-L-iduronidasa producida y
purificada mediante el procedimiento galli posee un grado más alto
de pureza y un grado menor de contaminación CHOP en comparación con
el del procedimiento Carson.
Se describe un procedimiento para producir
\alpha-L-iduronidasa en
cantidades que permiten utilizar la enzima terapéuticamente. En
general, el procedimiento se refiere a la transformación de una
progenie celular apropiada con el ADNc que codifica la totalidad de
la \alpha-L-iduronidasa o de un
fragmento biológicamente activo o de un mutante suyo. Los expertos
en la técnica pueden preparar constructos de expresión distintos
que los descritos expresamente en la presente memoria para la
producción óptima de la
\alpha-L-iduronidasa en progenies
celulares apropiadas transfectadas a continuación. Además, los
expertos en la técnica pueden fácilmente diseñar fragmentos de ADNc
que codifiquen fragmentos biológicamente activos y mutantes de la
\alpha-L-iduronidasa que se
encuentra naturalmente que posean la misma o una actividad biológica
similar que la enzima de longitud completa que se encuentra de modo
natural.
Para crear una fuente recombinante para la
\alpha-L-iduronidasa, pueden
construirse grandes series de vectores de expresión y ensayarlos
respecto a la expresión de un ADNc de la
\alpha-L-iduronidasa. Basándose en
experimentos de transfección transitoria, así como de
transfecciones estables, puede identificarse un constructo de
expresión que proporcione un nivel particularmente alto de
expresión. En una forma de realización de la presente invención,
una progenie celular 2.131 de un hámster chino desarrollada mediante
transfección del constructo de expresión de la
\alpha-L-iduronidasa y la
selección de un clon de alta expresión, proporciona un nivel de
expresión particularmente alto. Dicha progenie celular del hámster
chino según esta forma de realización de la presente invención,
puede secretar alrededor de 5.000 a 7.000 veces más
\alpha-L-iduronidasa que lo
normal. La \alpha-L-Iduronidasa
producida de ese modo, puede procesarse adecuadamente, absorberse en
las células con una alta afinidad, siendo correctora para las
células deficitarias en
\alpha-L-iduronidasa, tal como las
de los pacientes que padecen el síndrome de Hurler.
El procedimiento para producir
\alpha-L-iduronidasa en cantidades
que permitan utilizar la enzima terapéuticamente, se refiere a un
proceso de producción diseñado específicamente para producir en masa
la enzima de tipo comercial, en el que la calidad de la enzima se
ha considerado aceptable por las autoridades reguladoras de varios
países para administrarla al ser humano. La producción a gran
escala de la enzima de tipo comercial necesita modificaciones en la
escala del cultivo celular, sistemas de microtransporte, y un
esquema de purificación. En formas de realización preferidas, la
escala de cultivo celular aumenta desde 45 litros a 110 litros o
más, con un cambio para la perfusión continua. El aumento en la
escala es necesario para producir suficiente material para la
producción potencial a gran escala, para una utilización en el
paciente a largo plazo. Según formas de realización preferidas de
dicho proceso, los microportadores se utilizan como una superficie
escalable de bajo coste sobre la que crecen células adherentes. En
formas de realización particularmente preferidas, tales
microportadores son macroporosos y están compuestos específicamente
de hidratos de carbono modificados, tales como celulosa, por
ejemplo, perlas Cytopore fabricadas por Pharmacia. Los
microportadores de celulosa macroporosa permiten la mejoría de la
unión celular y proporcionan un área superficial más grande para la
unión, que se espera produzca un aumento en la densidad celular
durante el proceso del cultivo. Se espera que altas densidades
celulares aumenten la productividad. En formas de realización
preferidas, las columnas de heparina-Sepharose y de
Sephacryl 200 son reemplazadas con Azul-Sepharose y
columnas de quelantes de cobre para aumentar la capacidad del
proceso de purificación a gran escala y mejorar la pureza del
producto. En una forma de realización particularmente preferida, la
columna quelante del cobre se utiliza para reducir los contaminantes
proteicos celulares ováricos del hasmter chino a niveles muy bajos,
apropiados para la distribución a gran escala. Utilizando formas de
realización del presente procedimiento que lleva a cabo
modificaciones y la inducción que se describe más adelante, pueden
producirse aproximadamente 15 mg por litro de cultivo por día, o más
cuando se alcanza la máxima densidad del cultivo, empezando con un
sistema de cultivo de 110 litros.
Según otras formas de realización preferidas del
procedimiento para producir
\alpha-L-iduronidasa según la
presente invención, se optimiza un sistema de cultivo. En una
primera forma de realización, el pH del cultivo se disminuye hasta
6,5-7,0 aproximadamente, preferentemente hasta
6,7-7,0 aproximadamente durante el proceso de
producción. Una ventaja de dicho pH es que potencia la acumulación
de enzimas lisosómicas que son más estables a pHs ácidos. En una
segunda forma de realización, pueden cambiarse durante cada 24
horas, mediante perfusión continua, tanto como entre 2 y 3,5
volúmenes del cultivo del medio. Una ventaja de este procedimiento
es potenciar la velocidad de secreción de la
\alpha-L-iduronidasa recombinante
y capturar más enzima activa. En una tercera forma de realización,
la saturación del oxígeno se optimiza en un 40% aproximadamente. En
una cuarta forma de realización, se utilizan microportadores
macroporosos con un 5% de suero aproximadamente en el medio, para
producir una masa celular, seguido por un rápido cambio de lavado a
un medio sin proteínas para la producción (Figura 3). En una quinta
forma de realización, un medio de crecimiento sin proteínas, tal
como un producto PF-CHO de JRH Biosciencies, puede
optimizarse para incluir cantidades suplementarias de uno o más
ingredientes seleccionados del grupo formado por glutamato,
aspartato, glicina, ribonucleósidos, y desoxiribonucleósidos. En
una sexta forma de realización, pueden cambiarse durante cada
período de 24 horas mediante perfusión continua entre 2 y 3,5
volúmenes de cultivo del medio. Dicha proceso de inducción puede
proporcionar alrededor de un aumento doble en la producción sin
alterar significativamente el procesamiento postraduccional.
Formas de realización preferidas del
procedimiento para producir
\alpha-L-iduronidasa según la
presente invención caracterizan uno, más de uno, o todas las
optimizaciones descritas en la presente memoria y pueden utilizarse
tal como se describen más detalladamente a continuación. El
procedimiento de producción de la presente invención puede, por
tanto, proporcionar un procedimiento de cultivo de producción que
presenta las siguientes características:
1. Un cultivo basado en microportadores que
utilizan perlas microportadoras macroporosas fabricadas con celulosa
modificada o un equivalente suyo, se utiliza preferentemente en
matraces de cultivo a gran escala con agitación elevada o un
equivalente suyo. La unión de las células a estas perlas puede
obtenerse cultivando en un suero bovino fetal al 5%, añadido a
DME/F12 (1:1) o en un medio sin proteínas, modificado con
ingredientes que incluyen ribonucleósidos, desoxiribonucléosidos,
piruvato, aminoácidos no esenciales, y HEPES. Después de alrededor
de 3-6 días, en este medio, se comenzó un
procedimiento de lavado en el que el medio sin proteínas reemplaza
al medio que contiene suero a una velocidad de perfusión creciente
que depende del contenido en glucosa y de las condiciones del
cultivo. A continuación, y durante el período de cultivo restante,
las células se cultivan en un medio sin proteínas. La utilización
de un medio sin proteínas en la producción enzimática es beneficiosa
para reducir el riesgo de exposición a la encefalopatía
espongiforme bovina (BSE) y de otros agentes biológicos infecciosos
tales como virus, para los pacientes que estén siendo tratados con
la enzima, en el que el riesgo de BSE o de otros agentes dañinos
depende de la cuantía de la exposición potencial del suero. En
estudios publicados anteriormente, los transportadores utilizados
para que las células se desarrollaran, eran microportadores de
gelatina bovina, utilizados en una cantidad de 1 g por litro o 100
veces la concentración del producto. La filtración del 1% de la
proteína gelatina a partir de los microportadores representará una
contaminación relativa del 100% y contribuye por tanto al riesgo
del BSE. De este modo, los nuevos transportadores son dextrano o
basados en celulosa, y están formados por hidratos de carbono y
materiales no derivados de animales.
La Figura 3 muestra que las células crecen hasta
cierta densidad en un medio que contiene suero al 5% y que se
cambia entonces sin ninguna adaptación a un medio sin proteínas. La
Figura 3 muestra específicamente que: 1) Las células sobreviven y
continúan produciendo iduronidasa cuando cambian sin adaptación. Al
contrario, otros estudios sugerirían que la adaptación a un medio
sin proteínas es necesaria. En el procedimiento de la presente
invención, la producción enzimática continua a niveles comparables
al medio que contiene suero. 2) La
\alpha-L-iduronidasa producida en
un medio sin proteínas conserva un nivel de producción superior a 4
mg por litro o a 1.000 unidades por ml. 3) La
\alpha-L-iduronidasa producida en
un medio sin proteínas posee una alta absorción, indicando que el
cambio en el medio, y, por tanto, un cambio en los hidratos de
carbono que se suministran a las células, no afecta de modo adverso
al carácter de alta captación de la enzima. Se produjeron y
liberaron de esta forma ocho lotes de
\alpha-L-iduronidasa, con un valor
máximo medio de absorción menor que 2 nM en todos los lotes.
2. Las condiciones del cultivo se conservan
preferentemente con un oxígeno disuelto del 40% de la saturación
del aire, a un pH de 6,8-7,0 aproximadamente y a una
temperatura de alrededor de 35-37ºC. Esto puede
alcanzarse utilizando una unidad de control, controlando la unidad
y sondas apropiadas, tales como las producidas por Applikon® o
Mettler®. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán
fácilmente que esto puede obtenerse fácilmente mediante sistemas de
control equivalentes preparados por otros fabricantes. Una
saturación del aire de alrededor de 40% conduce a una mejora en la
secreción de
\alpha-L-iduronidasa, aunque puede
utilizarse una saturación del aire de hasta el 80%. Sin embargo,
aumentos ulteriores en el oxígeno, por encima del 80%, hasta, por
ejemplo, una saturación del aire del 90%, no proporcionan una
potenciación significativa de la secreción. El oxígeno disuelto
puede suministrarse mediante rociado continuo de oxígeno utilizando
un tubo rociador grande abierto de 5 micras de acero inoxidable, o
su equivalente. Un pH de 6,8-7,0 aproximadamente es
óptimo para la acumulación de la enzima a
\alpha-L-iduronidasa. La enzima es
particularmente inestable a pHs no superiores a 7,0. Por debajo de
un pH de alrededor de 6,7, la tasa de secreción puede disminuir,
particularmente por debajo de un pH de alrededor de 6,5. El cultivo
se conserva por tanto de modo óptimo entre un pH de alrededor de
6,8-7,0.
3. El medio de cultivo productor puede
constituir una forma modificada del medio propietario disponible
comercialmente de JRH Biosciences denominado Excell PF CHO. Este
medio soporta niveles de secreción equivalentes a los del suero que
utiliza una progenie celular, tal como la progenie celular 2.131.
Puede ser modificado preferentemente para incluir un pH ácido de
alrededor de 6,8-7,0 (I 0,1) y tamponado con HEPES a
7,5 mM o 15 mM. El medio puede contener entre 0,05 y 0,1% de
Pluronics F-68 (BASF), un surfactante no iónico o un
equivalente suyo que tiene la ventaja de proteger a las células de
fuerzas de cizalla asociadas con el rociado. El medio puede
contener además un suplemento que es importante para aumentar la
productividad del medio respecto a otros medios sin proteínas que
están actualmente disponibles. Los expertos en la técnica entenderán
fácilmente que la selección del medio de cultivo puede optimizarse
continuamente según las formas de realización comerciales
particulares disponibles en pintos particulares en el tiempo. Dichos
cambios no abarcan más que la experimentación de rutina y tienen la
intención de formar parte del alcance de la presente invención.
4. El medio de producción puede analizarse
utilizando un analizador de aminoácidos que compare el medio
empleado con el medio inicial. Dichos análisis han demostrado que
la progenie celular 2.131 vacía un medio PF CHO estándar de
glicina, glutamato y aspartato hasta un nivel de alrededor del 10%
de la concentración inicial. La complementación de estos
aminoácidos a niveles más altos puede dar lugar a una potenciación
de la densidad del cultivo y a una productividad que puede conducir
a un producción 2-3 veces más alta que la basal. Los
expertos en la técnica apreciarán que otras progenies celulares
dentro del alcance de la presente invención, pueden ser igualmente
útiles para producir la
\alpha-L-iduronidasa según este
procedimiento. Por tanto, pueden requerirse más o menos nutrientes
de complementación para optimizar el medio. Dichas optimizaciones
tienen la intención de entrar a formar parte del alcance de la
presente invención y pueden llevarse a la práctica sin una
experimentación excesiva.
5. El medio puede complementarse con los cuatro
ribonucleósidos y los cuatro desoxiribonucleósidos, cada uno en una
cantidad de aproximadamente 10 mg/litro, para apoyar a la progenie
celular deficitaria en dihidrofolato reductasa 2.131. Los expertos
en la técnica apreciarán que otras progenies celulares que forman
parte del alcance de la presente invención, pueden ser igualmente
útiles para producir la
\alpha-L-iduronidasa según este
procedimiento. Por tanto, pueden requerirse más o menos
ribonucleósidos y desoxiribonucleósidos para optimizar el medio, y
pueden utilizarse fuentes alternativas de purinas y pirimidinas para
la síntesis del ácido nucleico, tales como la hipoxantina y la
timidina. Dichas optimizaciones tienen la intención de entrar a
formar parte del alcance de la presente invención, y pueden llevarse
a la práctica sin una experimentación excesiva.
6. Después de alcanzar la confluencia a los
3-6 días aproximadamente del cultivo, se inició un
tasa creciente de perfusión continua. Puede llevarse a cabo un
cambio en el medio, por ejemplo, utilizando un tubo alimentador
inclinado construido y en posición para permitir la absorción del
medio sin quitar los microportadores, incluso mientras el cultivo
se agita. Bombeando hacia afuera el medio a través del tubo
alimentador inclinado, los microportadores se fijan en el interior
del cuerpo del tubo, dentro del cultivo y no se quitan de éste
durante el cambio el medio. De esta manera, los microportadores con
la masa celular se separan del subrenadante que contiene la
enzima.
7. El rápido y frecuente recambio del medio se
ha mostrado mediante estudios de productividad para dar lugar a una
mejora en la recuperación total de la enzima a partir del cultivo
celular. Un menor recambio del medio da lugar a una producción
total menor de la enzima en base diaria. Utilizando la perfusión de
2-3,5 volúmenes del cultivo por día, las células se
pueden mantener en condiciones excelentes con altos grados de
viabilidad y un alto nivel de productividad.
8. La producción de
\alpha-L-iduronidasa puede
potenciarse utilizando la inducción de la expresión génica por el
butirato sódico (Figura 3). Veinte lotes de
\alpha-L-iduronidasa se produjeron
utilizando la inducción del butirato a una concentración de 2 nM
con 2/3 lavados cada 12 horas después de la inducción, y la
reinducción cada 48 horas durante un período de producción de 21
días. En la Figura 3, las flechas verticales en la parte inferior
indican los eventos de inducción debidos al butirato. Cada inducción
puso en marcha un aumento de la concentración de la
\alpha-L-iduronidasa en el
medio.
Estudios sistemáticos de una progenie celular
2.131 demostraron que alrededor de 2 mM de butirato pueden aplicarse
y dan lugar a una inducción aproximadamente doble, o mayor de la
producción enzimática, con efectos mínimos en el procesamiento de
los hidratos de carbono. Asimismo, niveles más bajos de butirato no
han mostrado producir la inducción, y niveles sustancialmente más
altos pueden dar lugar a una inducción mayor, pero disminuyendo la
afinidad de la enzima producida para las células de pacientes que
padecen la deficiencia de
\alpha-L-iduronidasa. La
inducción por el butirato se llevó a cabo in vitro a una
concentración de 2 mM durante 24 horas o a 5 mM, y una
concentración utilizada más habitualmente dio lugar a absorciones
superiores a 3 nM o 40 U/ml, o un promedio de tres veces el valor
observado en los lotes de producción. Además, los tiempos
habitualmente utilizados de 24 horas o más, y la concentración de 5
mM fueron tóxicos para las células productoras de la
\alpha-L-iduronidasa, dando lugar
a desprendimiento y pérdida de la masa celular.
Los resultados sugieren que la inducción doble o
mayor da lugar a un procesamiento menor de los hidratos de carbono
y menos adición de fosfato a la enzima, así como una toxicidad
creciente. Con respecto al procesamiento de los hidratos de carbono
y a la adición de los grupos fosfato, la importancia de la
manosa-6-fosfato en la terapia de
reemplazamiento enzimático está demostrada por las observaciones de
que la eliminación del fosfato de dos enzimas lisosómicas,
glucosidasa y
galactosamina-4-sulfatasa conduce a
una absorción disminuida (Van der Ploeg, et al., J. Clin.
Invest. 87: 513-518 (1991); Crawley,
et al., J. Clin. Inves.
97:1864-1873 (1996)). Además, la enzima con
baja fosfatasa (Van Hove, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93: 65-70 (1996) necesita 1.000
unidades por ml para experimentos de absorción (cerca de las 100
veces utilizadas para la iduronidasa), requiriendo las dosis
efectivas en los modelos animales 14 mg/kg, o 28 veces la dosis
utilizada con la iduronidasa conteniendo cantidades altas de fosfato
(Kikuchi, et al., J. Clin. Invest.
101:827-833 (1998)).
Un aspecto particularmente preferido del
procedimiento de la invención, utiliza una adición de 2 mM butirato
cada 48 horas al sistema de cultivo. Esta forma de realización da
lugar aproximadamente a una doble inducción de la producción
enzimática utilizando este procedimiento sin efecto significativo en
la afinidad de absorción de la enzima (absorción de K de menos de 30
U/ml o 2,0 mM).
9. Se describe una línea celular transfectada,
que presenta la única capacidad de producir
\alpha-L-iduronidasa en
cantidades que permiten utilizar la enzima terapéuticamente. En
formas de realización preferidas, la presente invención caracteriza
una progenie celular ovárica recombinante del hámster chino tal como
la progenie celular 2.131 que de forma estable y fiable produce
cantidades de
\alpha-L-iduronidasa. En formas de
realización preferidas, la progenie celular puede contener más de
una copia de un constructo de expresión que comprende un promotor
CMV, un intrón Ca, un ADNc
\alpha-L-iduronidasa humano, y una
secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.
En incluso más formas de realización preferidas, la progenie celular
expresa la \alpha-L-iduronidasa
en cantidades de por lo menos de alrededor de 20-40
microgramos por 10^{7} células por día en una forma de alta
absorción, procesada apropiadamente, apropiada para la terapia de
reemplazamiento enzimático. Según formas de realización preferidas
de este aspecto de la invención, la progenie celular transfectada
adaptada para producir la a- L-iduronidasa en
cantidades que permiten la utilización terapéutica de la enzima,
posee una o más de las características siguientes:
- 1.
- La progenie celular de las formas de realización preferidas se deriva de una progenie celular parental en la que las células se hacen pasar por un cultivo hasta que han adquirido un tamaño más pequeño y una tasa de crecimiento más rápida y hasta que se unen fácilmente a los substratos.
- 2.
- La progenie celular de las formas de realización preferidas se transfecta con un vector de expresión que contiene un elemento potenciador/promotor del citomegalovirus, un intrón 5', formado por el intrón Ca murino entre los exones 2 y 3, un ADNc humano de alrededor de 2,2 kb de longitud, y un sitio de poliadenilación 3' de la hormona de crecimiento bovina. Este vector de expresión puede transfectarse en, por ejemplo, una proporción de 50 a 1 con cualquier vector de selección habitual apropiado, tal como pSV2NEO. El vector de selección pSV2NEO confiere a su vez resistencia a G418 en las células transfectadas con éxito. En formas de realización particularmente preferidas, se utiliza una proporción de alrededor de 50 a 1, pues esta proporción potencia la adquisición de múltiples inserciones del número de copias. Según una forma de realización en la que se proporciona la progenie celular 2.131 del ovario del hámster chino, existe por lo menos una copia del vector de expresión para la \alpha-L-iduronidasa. Dicha progenie celular ha demostrado la capacidad para producir grandes cantidades de la \alpha-L-iduronidasa humana (mínimo 20 microgramos por 10 millones de células por día). Formas de realización particularmente preferidas tales como la progenie celular 2.131 posee la capacidad para producir la enzima procesada apropiadamente que contiene oligosacáridos unidos a N que contienen cadenas altas de manosa modificadas con fosfato en la posición 6, en una cantidad suficiente para producir una enzima con una alta afinidad (absorción -K de menos de 3 nM).
- 3.
- La enzima producida a partir de las progenies celulares de la presente invención, tales como una progenie celular 2.131 del ovario del hámster chino, es rápidamente asimilada en las células, elimina el almacenamiento de glucosaminoglicano y posee una vida media de alrededor de 5 días en las células de pacientes que padecen una deficiencia de la \alpha-L-iduronidasa.
- 4.
- La progenie celular de las formas de realización preferida, tal como una progenie celular 2.131, se adapta a un cultivo a gran escala y produce establemente la \alpha-L-iduronidasa humana bajo estas condiciones. Las células de las formas preferidas de realización son capaces de crecer y secretar \alpha-L-iduronidasa a el pH ácido de alrededor de 6,6 a 7,0, al cual puede tener lugar la potenciación en la acumulación de \alpha-L-iduronidasa.
- 5.
- Formas de realización particularmente preferidas de la pprogenie celular según la invención, tal como una progenie celular 2.131 son capaces de secretar la \alpha-L-iduronidasa a niveles que sobrepasan las 2.000 unidades por ml (8 mocrogramos por ml) que se recuperan dos veces al día o que sobrepasan 15 mg por litro del cultivo por día, utilizando un medio libre de proteínas especialmente formulado.
Se describen vectores adecuados para producir
\alpha-L-iduronidasa en
cantidades que permiten utilizar la enzima terapéuticamente. La
producción de cantidades apropiadas de la
\alpha-L-iduronidasa recombinante
constituye un prerequisito crítico para los estudios en la
estructura de la enzima, así como para la terapia de
reemplazamiento enzimático. Las progenies celulares según la
presente invención permiten la producción de cantidades
significativas de la
\alpha-L-iduronidasa recombinante
que es procesada apropiadamente para la absorción. La
sobreexpresión en las células ováricas del hámster chino (CHO) se ha
descrito para otros tres enzimas lisosómicos, la
a-galactosidasa (Ioannou, et al, J. Cell
Biol. 119: 1137-1150 (1992)), iduronato
2-sulfatasa (Bielicki, et al, Biochem.
J. 289: 241-246 (1993)), y
N-acetilgalactosamina 4-sulfatasa
(Amson et al, Biochem. J. 284:789-794
(1992), utilizando una variedad de promotores y, en un caso, la
amplificación. La presente invención caracteriza una progenie
celular CHO deficitaria en dihidrofolato-reductasa,
pero según las formas de realización preferida de la invención, la
amplificación no es necesaria. Además, la presente invención
proporciona un alto nivel de expresión de la a-L
iduronidasa utilizando el promotor/potenciador del gen temprano
inmediato de CMV.
La presente invención caracteriza en formas de
realización preferidas, un vector de expresión que comprende un
elemento promotor/potenciador del citomegalovirus, un intrón del
extremo 5' formado por el intrón C\alpha murino derivado del gen
C\alpha de la inmunoglobulina murina de cadena larga entre los
exones 2 y 3, un ADNc humano de alrededor de 2,2 kb de longitud, y
un sitio de poliadenilación 3' de la hormona bovina de crecimiento.
Este vector de expresión puede ser transfectado en, por ejemplo, una
proporción de 50 a 1 con cualquier vector de selección habitual
apropiado tal como pSV2NEO. El vector de selección pSV2NEO confiere
a su vez resistencia a G418 en las células transfectadas con éxito.
En formas de realización particularmente preferidas, sse utiliza
una proporción de alrededor de 50 a 1, vector de expresión a vector
de seleción, pues esta proporción potencia la adquisición de
múltiples inserciones del número de copias. Según una forma de
realización en la que se proporciona la progenie celular 2.131 del
ovario del hámster chino, existen por lo menos diez copias del
vector de expresión para la
\alpha-L-iduronidasa. Dicho
constructo de expresión ha demostrado la capacidad para producir
grandes cantidades de la
\alpha-L-iduronidasa humana
(mínimo 20 microgramos por 10 millones de células por día) en una
progenie celular apropiada tal como la progenie celular 2.131 del
ovario del hámster chino.
Según un aspecto, la presente invención
proporciona nueva
\alpha-L-iduronidasa producida
según los procedimientos de la presente invención y presente por
lo tanto en cantidades que permiten utilizar la enzima
terapéuticamente. Los procedimientos de la presente invención
producen una \alpha-L-iduronidasa
sustancialmente pura que se procesa apropiadamente y en forma de
alta absorción, apropiada para la terapia de reemplazamiento
enzimático y efectiva en la terapia in vivo.
La actividad específica de la
\alpha-L-iduronidasa según la
presente invención supera aproximadamente las 200.000 unidades por
milígramo de proteína. Preferentemente, supera aproximadamente las
240.000 unidades por milígramo de proteína, utilizando los
procedimientos originales de ensayo para la actividad y la
concentración proteica. Un nuevo ensayo validado para la misma
enzima con unidades expresadas como micromoles por min, demuestra
una actividad de 100 unidades/ml (intervalo de
70-130) y una concentración proteica por absorbancia
a 280 nM de 0,7 mg/ml (0,6-0,8), con una actividad
específica promedio de 143 unidades por mg. El peso molecular de la
\alpha-L-iduronidasa de longitud
total de la presente invención, es de alrededor de 82.000 daltons,
que comprenden alrededor de 70.000 de aminoácidos y 12.000 de los
hidratos de carbono. La enzima recombinante de la presente
invención sufre endocitosis, más eficientemente incluso que lo que
previamente se ha informado para una preparación parcialmente
purificada de la enzima urinaria. La enzima recombinante según la
presente invención es efectiva para reducir la acumulación del GAG
marcado radioactivamente con S en los fibroblastos deficientes en
\alpha-L-iduronidasa, indicando
que se transporta a los lisosomas, el sitio del almacenamiento de
GAG. La concentración notablemente baja de la
\alpha-L-iduronidasa necesaria
para dicha corrección (corrección máxima-media a
0,7 pM) puede ser muy importante para el éxito de la terapia de
reemplazamiento enzimático.
El ADNc humano de la
\alpha-L-iduronidasa predice una
proteína de 653 aminoácidos y un peso molecular esperado de 70.000
daltons después de la fragmentación del péptido señal. La
secuenciación aminoácida revela la alanina 26 en el extremo N,
dando lugar a una proteína esperada de 629 aminoácidos. La
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante posee una histidina en posición 8 de la proteína
madura. La secuencia proteica predicha comprende seis sitios
potenciales de modificación de oligosacáridos unidos a N. Todos e
estos pueden modificarse en la proteína recombinante. Se ha
demostrado que el tercer y el sexto sitios contienen uno o más
residuos de manosa 6-fosfato responsables de la
alta absorción por afinidad en las células. El péptido siguiente
corresponde a los aminoácidos 26-45 de la
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante, con una alanina N-terminal y la
siguiente secuencia (SEC ID nº: 2):
- ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala-arg- ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg
La sobreexpresión de la
\alpha-L-iduronidasa de la
presente invención no da lugar a una secreción generalizada de
otras enzimas lisosómicas que dependen del marcaje con
manosa-6-P. La
\alpha-L-iduronidasa recombinante
secretada es similar, en muchos sentidos, a la enzima normal
secretada. Su tamaño molecular, que en varias determinaciones se ha
encontrado ser de 77, 82, 84 y 89 kDa, es comparable a 87 kDa,
encontrado para el factor urinario de corrección (Barton et
al, J. Biol. Chem. 246: 7773-7779
(1971)), y a 76 kDa y 82 kDa, encontrados para la enzima secretada
por fibroblastos humanos cultivados (Myerowitz, et al. J.
Biol. Chem. 256: 3044-3048 (1991); Taylor
et al, Biochem J 274:263-268 (1991).
Las diferencias en y entre los estudios se atribuyen a la falta de
precisión de las mediciones. El patrón de procesamiento intracelular
de la enzima recombinante, una disminución lenta en el tamaño
molecular y la aparición eventual de una banda adicional más pequeña
que 9 kDa es lo mismo que para la enzima de los fibroblastos
humanos. Esta banda más rápida se produce debido a la fragmentación
proteolítica de los aminoácidos 80 N-terminales.
La presente invención caracteriza un nuevo
procedimiento para purificar la
\alpha-L-iduronidasa. En formas
de realización preferidas, la presente invención caracteriza un
procedimiento para purificar la
\alpha-L-iduronidasa recombinante
que se ha optimizado para producir una purificación rápida y
eficiente con resinas cromatográficas capaces de ser validadas y
fáciles de cargar, lavar y eluir. El procedimiento de purificar la
\alpha-L- iduronidasa de la presente invención
implica una serie de etapas en columnas cromatográficas, que
permiten la purificación con un alto rendimiento de la enzima, a
partir del medio de producción libre de proteínas. Específicamente,
las columnas de Concavalina A-Sepharose, de
Heparina-Sepharose y de Sephacryl 200, se
reemplazaron con las columnas de Azul-Sepharose y
quelantes de cobre para aumentar la capacidad de un proceso de
purificación a gran escala, para reducir filtraciones y mejorar la
pureza del producto. La Concavalina A lectina se utiliza a menudo
para unir la enzima en una etapa inicial de purificación en el
estudio publicado anteriormente, y es una proteína lectina derivada
de plantas. La Concavalina A se conoce por filtrarse a partir de las
columnas y contaminar las preparaciones enzimáticas lisosómicas.
Dicha filtración podría causar la activación de las células T en
los pacientes tratados y por tanto, se considera inapropiada para la
administración humana (Furbish, et al, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74: 3560-3563 (1977). Así, en este
esquema de purificación, se evita la utilización de Concavalina A.
En un estudio previo, la
\alpha-L-iduronidasa hepática
humana no se pudo recuperar de columnas fenilo sin altas
concentraciones de detergente de desnaturalización (Triton X100 al
1%). Por tanto, no se utilizó una columna fenilo en un esquema de
purificación publicado de esta enzima (Clements, et al, Eur.
J. Biochem 152: 21-28 (1985). La enzima
hepática endógena humana es altamente modificada en el interior de
los lisosomas por las hidrolasas que eliminan los residuos de ácido
siálico y de fosfato y las proteasas, que mellan a la enzima. Al
contrario, la sobreexpresión de la
\alpha-L-iruronidasa recombinante
causa que el 50% de la enzima se secrete más que se transporte al
lisosoma (Zhao, et al, J. Biol. Chem 272:
22758-22765 (1997). Por tanto, la iduronidasa
recombinante mostrará un despliegue completo de residuos de ácido
siálico y de fosfato, que llevarán a un grado más alto de
solubilidad acuosa y a una afinidad menor para la columna fenilo.
El aumento de la hidrofilicidad permite que la enzima se eluya bajo
condiciones no desnaturalizantes utilizando las soluciones bajas en
sales de alrededor de 150-700 mM NaCl. Esta
característica de la enzima recombinante permite que sea purificada
en gran escala sin la utilización de detergentes.
La
\alpha-L-iduronidasa recombinante
que se sobreexpresa en una progenie celular del ovario del hámster
chino (CHO), se ha purificado hasta casi homogeneidad, después de un
proceso de cromatografía en columna en 3 fases. La primera columna
implica una fase de cromatografía de afinidad utilizando Azul
Sepharose 6 FF. El eluado Azul Sepharose 6FF se purifica entonces
ulteriormente mediante otra fase de cromatografía de afinidad
utilizando Sepharose FF quelante de cobre. El pulido final de la
enzima altamente purificada se alcanza mediante la cromatografía de
interacción hidrofóbica utilizando Fenil Sepharose de Alta
Resolución (HP). El rendimiento total oscila entre 45 y 55 por
ciento y la pureza del producto final es superior al 99%. El proceso
es resistente, reproducible, y escalable para una fabricación a
gran escala. La enzima purificada se ha caracterizado respecto a su
actividad enzimática utilizando un sustrato basado en la
fluorescencia, y en su absorción funcional por las células
fibroblásticas. La enzima se ha caracterizado, asimismo, por la
especificidad del sustrato, perfiles de los hidratos de carbono, y
perfiles del enfoque isoeléctrico (IEF).
Formas de realización particularmente preferidas
del procedimiento para purificar la
\alpha-L-iduronidasa, según la
presente invención, caracterizan más que una o la totalidad de las
optimizaciones, según las formas de realización particulares
siguientes. El procedimiento de purificación de la presente
invención puede proporcionar, por tanto, una
\alpha-L-iduronidasa que posea las
características descritas en la presente memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema del proceso de purificación
de la
\alpha-L-iduronidasa
1. Ajuste de pH /Filtración: El pH del líquido
recuperado y filtrado (HF) se ajusta a 5,3 con 1 M H_{3}PO_{4},
filtrándose entonces a través de un filtro de 0,45 \mu (por
ejemplo, Sartoclean, Sartorius).
2. Cromatografía con Azul Sepharose FF: Esta
etapa de cromatografía de afinidad sirve para capturar iduronidasa
para reducir el volumen y purificar la iduronidasa aproximadamente
de siete a diez veces.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Cromatografía FF Sepharose de quelación de
Cu++: La etapa de cromatografía de afinidad de quelación de Cu++ es
muyefectiva para eliminar algunas proteínas CHO contaminantes La
inclusión de glicerol al 10% en todos los tampones parece que es
crucial para la recuperación cuantitativa de la iduronidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Cromatografía Fenil Sepharose HP: Fenil
Sepharose se utiliza como la última etapa para purificar
ulteriormente el producto, así como para reducir el colorante azul
Cibacron residual filtrado y los iones de cobre pospuestos a partir
de las columnas previas.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Ultrafiltración (UF)/Diafiltración
(DF)/Formulación final: La iduronidasa purificada se concentró y
diafiltró hasta una concentración final de 1 mg/ml en tampón de
formulación (150 mM NaCl, 100 mM NaPO_{4}, pH 5,8), utilizando un
sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) (por ejemplo,
Sartocon Slice de Sartorius). La enzima se esteriliza entonces
filtrando a través de un filtro de 0,2 micras (por ejemplo, acetato
de celulosa o polisulfona), rellenando con ella viales
estériles.
6. Caracterización de la iduronidasa purificada:
Análisis de la pureza enzimática utilizando SDS-PAGE
teñido con Azul de Coomassie o Plata, llevando a cabo el análisis
de transferencia Western. Análisis de la actividad enzimática
utilizando como sustrato el 4 MU-sulfato. Análisis
de la absorción funcional utilizando el ensayo de células
fibroblásticas. Análisis de hidratos de carbono mediante FACE.
Análisis de los perfiles IEF.
La enzima, purificada de esta forma, se mostró
que contenía residuos de
manosa-6-fosfato en cantidad
suficiente en las posiciones 3 y 6 de los azúcares unidos a N, para
dar lugar a una afinidad de absorción de la enzima menor de 30
unidades por ml (menos de 2 nM). La enzima es sustancialmente
correctora para los trastornos del almacenamiento de los
glicosaminoglicanos causados por la deficiente idorunidasa y posee
una vida media biológica en el interior de las células de 5 días
aproximadamente.
Esquemas anteriores de la purificación de la
\alpha-L-iduronidasa (Kakkis et
al, en Protein Expr. Purif,
5:225-232 (1994); Kakkis et al.,
Biochem. Mol. Med 58: 156-167 (1996);
solicitud de patente US, nº 09/078.209 y 09/170.977) produjeron
grados de pureza entre el 90% y menos que el 99%, que no es óptimo
para la administración humana a largo plazo (Véase la Figura 12).
(Éstas y la totalidad de las otras patentes US en la presente
memoria se incorporan específicamente a la presente memoria como
referencia en su totalidad). El tratamiento con la
\alpha-L-iduronidasa recombinante
humana con una pureza mínima del 97% se asoció con algunas
reacciones clínicas, específicamente urticaria en 5 pacientes y
activación del complemento en 4 pacientes. Todos los pacientes
demostraron una reacción a una proteína que es un contaminante traza
para la \alpha-L-iduronidasa.
(Figura 2). A causa de que esta proteína existe tanto en el producto
final como en el sobrenadante sin suero de la progenie celular CHO,
la proteína extraña se origina muy probablemente de las células
CHO. Las proteínas habituales que parecen activar la respuesta
clínica alérgica son de aproximadamente 60k Daltons y de 50 Daltons
respectivamente, que son demasiado pequeñas para ser iduronidasa
humana recombinante. Cuatro pacientes desarrollaron una reacción
inmune a la \alpha-L-iduronidasa
por lo menos transitoriamente, así como a las proteínas de las
células huéspedes del ovario del hámster chino. Está claro que
aunque incluso la enzima utilizada para tratar a los pacientes esté
altamente purificada, el grado de purificación es importante para
reducir la respuesta inmune a los contaminantes. La Figura 2
(SDS-PAGE) y la Figura 12 (ensayo CHOP) demuestran
que la \alpha-L-iduronidasa
producida y purificada mediante el esquema de
producción/purificación de la presente invención, posee un grado de
pureza más alto y un grado más bajo de contaminación por CHOP en
comparación con el de los procedimientos anteriores de
producción/purificación. Así, una pureza superior al 97% es
adecuada para el uso del paciente, siendo deseable y preferibles
niveles más altos de pureza. Tal como se muestra en la Figura 12,
el esquema optimizado de purificación describo anteriormente alcanza
un grado de pureza que es superior a un 99% y reduce de forma
importante las proteínas de las células huésped del ovario del
hámster chino a menos del 1%, tal como se determina por el ensayo de
la Proteína Ovárica del Hámster Chino (CHOP).
Se describen procedimientos para el tratamiento
de las enfermedades causadas totalmente o en parte por una
deficiencia de la
\alpha-L-iduronidasa. La
\alpha-L-iduronidasa recombinante
proporciona terapia de reemplazamiento enzimático en un modelo
canino de MPS 1. Este modelo canino es deficitario en
\alpha-L-iduronidasa, debido a
una mutación genética y es similar al MPS I humano. A 11 perros se
administró intravenosamente
\alpha-L-iduronidasa
apropiadamente procesada y purificada. En los perros tratados con
dosis semanales entre 25.000 y 125.000 unidades por kg durante 0,5,
3, 6, ó 13 meses, la enzima se absorbió en diversos tejidos y
disminuyó el almacenamiento lisosómico en muchos tejidos. El
tratamiento a largo plazo de la enfermedad se asoció con una mejoría
clínica en la rigidez de las articulaciones, conducta, pelaje, y
crecimiento. Dosis más altas de la terapia (125.000 unidades por kg
por semana) dieron lugar a una mejora en la eficacia, incluyendo la
normalización de la excreción urinaria de GAG además de una mejoría
clínica más rápida en el comportamiento, rigidez de las
articulaciones y pelaje.
La terapia enzimática a dosis incluso más
pequeñas de 25.000 unidades (0,1 mg/kg/semana) dio lugar a una
distribución enzimática significativa a algunos tejidos,
disminuyendo el almacenamiento de GAG. Si se continuaba durante 1
año, algunos efectos clínicos fueron evidentes en términos de
aumento de la actividad, tamaño y apariencia saludable. La terapia
con esta dosis no mejoró otros tejidos que constituyen sitios
importantes para la enfermedad en esta entidad, tales como el
cartílago y el cerebro. Dosis más altas de 125.000 unidades (0,5
mg/kg) administradas 5 veces durante dos semanas demuestran que
puede obtenerse una mejoría en la penetración tisular, y que en tan
poco tiempo como 2 semanas, se obtuvo un efecto terapéutico a este
nivel tisular. Durante 15 meses, en dos perros, se han completado
con este aumento de dosis. Estos perros MPS I muestran una mejoría
clínica significativa y disminuciones sustanciales en la excreción
urinaria de GAG, cerca de su intervalo normal. La terapia enzimática
no ha mostrado toxicidad bioquímica o clínica significativas, salvo
la reacción inmune controlada por las técnicas alteradas de
administración. La terapia enzimática a su dosis semanal más alta es
efectiva para mejorar algunas características clínicas de MPS I y
disminuir el almacenamiento sin toxicidad significativa.
En un séptimo aspecto, la presente invención
muestra nuevas composiciones farmacéuticas que comprenden
\alpha-L-iduronidasa humana útil
para el tratamiento de una deficiencia de la
\alpha-L-iduronidasa. La enzima
recombinante se puede administrar de diversas maneras tales como
administración parenteral, tópica, intranasal, por inhalación u
oral. Otro aspecto de la invención consiste en proporcionar la
administración de la enzima formulándola con un portador
farmacéuticamente aceptable, que puede ser sólido, semisólido,
líquido, o una cápsula que puede ingerirse. Los ejemplos de las
composiciones farmacéuticas comprenden comprimidos, gotas como las
gotas nasales, composiciones para la aplicación tópica tales como
ungüentos, jaleas, cremas y suspensiones, aerosoles para su
inhalación, pulverizador nasal, y liposomas. Habitualmente la enzima
recombinante comprende entre 0,01 y 99% o entre 0,01 y 99% en peso
de la composición, por ejemplo, entre 0,01 y 20% para las
composiciones destinadas a su inyección y entre 0,1 y 50% para las
composiciones destinadas a su administración oral.
Para producir las composiciones farmacéuticas en
esta forma de unidades de dosificación para la aplicación oral que
contienen una enzima terapéutica, la enzima se puede mezclar con un
sólido, un portador pulverulento, por ejemplo lactosa, sacarosa,
sorbitol, manitol, un almidón tal como almidón de patata, almidón de
maíz, amilopectina, polvo de laminaria o polvo de pulpa de cítrico,
un derivado de la celulosa o gelatina y puede asimismo comprender
lubricantes tal como estearato cálcico o magnésico o Carbowax® u
otras ceras de polietilenglicol y ser sometida a compresión para
formar comprimidos o núcleos para grageas. Si resultan necesarias
las grageas, los núcleos pueden ser recubiertos por ejemplo con
soluciones de azúcar concentrado que pueden contener goma arábiga,
talco y/o dióxido de titanio, o alternativamente con un agente
formador de película disuelto en disolventes orgánicos fácilmente
volátiles o las mezclas de los disolventes orgánicos. Se pueden
añadir sustancias colorantes a estos recubrimientos, por ejemplo,
para distinguir entre los diferentes contenidos de la sustancia
activa. Para la composición de las cápsulas de gelatina blandas
constituidas por gelatina y, por ejemplo, glicerol como
plastificante, o cápsulas cerradas similares, la sustancia activa se
puede mezclar con Carbowax® o un aceite adecuado, por ejemplo
aceite de sésamo, aceite de oliva, o aceite de arachis. Las cápsulas
de gelatina duras pueden contener granulados de la sustancia activa
con portadores pulverulentos, sólidos, tal como lactosa, sacarosa,
sorbitol, manitol, almidones tales como almidón de patata, almidón
de maíz o amilopectina, derivados de la celulosa o gelatina, y
pueden comprender asimismo estearato magnésico o ácido esteárico
como lubricantes.
Las enzimas terapéuticas objeto de la invención
pueden asimismo ser administradas parenteralmente por inyección
intravenosa, intramuscular o subcutánea o mediante implante
subcutáneo de liberación sostenida. En la inyección subcutánea,
intramuscular e intravenosa, la enzima terapéutica (el principio
activo) se puede disolver o dispersar en un vehículo portador
líquido. Para la administración parenteral, el material activo puede
ser mezclado de manera adecuada con un vehículo aceptable,
preferentemente de la variedad de aceite vegetal tal como aceite de
cacahuete, aceite de semilla de algodón y similares. Pueden ser
utilizados otros vehículos parenterales tales como composiciones
orgánicas que utilizan solketal, glicerol, formal, y formulaciones
parenterales acuosas.
Para la aplicación parenteral por inyección, las
composiciones pueden comprender una solución acuosa de una sal
farmacéuticamente aceptable soluble en agua de los ácidos activos
según la invención, preferentemente en una concentración de
0,01-10%, y opcionalmente asimismo un agente
estabilizante y/o sustancias tampón en solución acuosa. Las
unidades de dosificación de la solución pueden estar ventajosamente
comprendidas en ampollas.
Cuando las enzimas terapéuticas son
administradas en forma de un implante subcutáneo, el compuesto es
suspendido o disuelto en un material de dispersión lenta conocido
por los expertos en la materia, o administrado en un dispositivo
que libera lentamente el material activo mediante la utilización de
una fuerza de accionamiento constante tal como una bomba osmótica.
En tales casos, resulta posible la administración durante un periodo
de tiempo prolongado.
Para la aplicación tópica, las composiciones
farmacéuticas resultan adecuadas en forma de un ungüento, gel,
suspensión, crema o similar. La cantidad de sustancia activa puede
estar comprendida, por ejemplo, entre 0,05 y 20% en peso de la
sustancia activa. Dichas composiciones farmacéuticas para la
aplicación tópica se pueden preparar de una manera conocida
mezclando la sustancia activa con materiales portadores conocidos
tales como isopropanol, glicerol, parafina, alcohol estearílico,
polietilenglicol, etc. El portador farmacéuticamente aceptable
puede comprender asimismo un promotor de la absorción químico
conocido. Los ejemplos de promotores de la absorción son, por
ejemplo, dimetilacetamida (patente US nº 3.472.931), tricloroetanol
o trifluoroetanol (patente US nº 3.891.757), determinados alcoholes
y las mezclas de los mismos (patente británica nº 1.001.949). Un
material portador para la aplicación tópica a la piel intacta es
asimismo descrito en la memoria de patente británica nº 1.464.975,
que da a conocer un material portador constituido por un disolvente
que comprende isopropanol al 40 a 70% (v/v) y glicerol al 0 a 60%
(v/v), siendo el balance, si existe, un constituyente inerte de un
diluyente que no sobrepasa 40% del volumen total del solvente.
La dosis a la que las composiciones
farmacéuticas que contienen la enzima terapéutica son administradas
puede estar comprendida en un amplio intervalo y dependerá de
diversos factores tales como la gravedad de la enfermedad, la edad
del paciente, etc., y puede deber ser ajustada individualmente. Un
intervalo posible para la cantidad de enzima terapéutica que debe
ser administrada diariamente es de aproximadamente 0,1 mg a
aproximadamente 2.000 mg o aproximadamente 1 mg a aproximadamente
2.000 mg.
Las composiciones farmacéuticas que contienen la
enzima terapéutica pueden ser formuladas de manera adecuada de
manera que proporcionen dosis comprendidas en estos intervalos, como
unidades de dosificación única o como unidades de dosificación
múltiple. Además de contener una enzima terapéutica (o enzimas
terapéuticas), las formulaciones objeto pueden contener uno o más
sustratos o cofactores para la reacción catalizada mediante la
enzima terapéutica en las composiciones. Las composiciones que
contienen las enzimas terapéuticas pueden contener asimismo más de
una enzima terapéutica.
La enzima recombinante utilizada en los
procedimientos y composiciones objeto puede ser asimismo
administrada mediante células del paciente transformadas con ácidos
nucleicos que codifican la
\alpha-L-iduronidasa recombinante.
La secuencia de ácido nucleico así codificada se puede incorporar
al vector para la transformación en las células del sujeto que se
va a tratar. Las formas de realización preferidas de dichos vectores
son descritas en la presente memoria. El vector puede estar
concebido de manera que sea integrado en los cromosomas del sujeto,
por ejemplo, vectores retrovirales, o para la replicación de manera
autónoma en las células huésped. Los vectores que contienen las
secuencias de nucleótidos de
\alpha-L-iduronidasa codificante
pueden ser concebidos para proporcionar la expresión continua o
regulada de la enzima. Además, el vector genético que codifica la
enzima puede estar concebido para integrarse de manera estable en el
genoma celular o para estar únicamente presente temporalmente. La
metodología general de la terapia genética convencional puede ser
aplicada a las secuencias de polinucleótido que codifican la
\alpha-L-iduronidasa. Las técnicas
de terapia genética convencional han sido muy estudiadas.
(Friedman, Science 244:1275-1281
(1989); Ledley, J. Inherit. Metab. Dis.
13:587-616 (1990); Tososhev, et al.,
Curr Opinions Biotech. 1:55-61
(1990)).
Un procedimiento particularmente preferido para
la administración de la enzima recombinante es la ruta intravenosa.
Una composición particularmente preferida comprende
\alpha-L-iduronidasa recombinante,
solución salina normal, tampón de fosfato para mantener el pH a
aproximadamente 5,8 y albúmina humana. Estos ingredientes pueden
estar previstos en las cantidades siguientes:
Habiendo descrito la invención, se ofrecen los
ejemplos siguientes para ilustrar la invención, no mediante la vía
de la limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las técnicas estándar tales como las descritas
por Sambrook, et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y.
(1987)), pueden utilizarse para clonar ADNc que codifica la
\alpha-L-iduronidasa humana. El
ADNc de la \alpha-L-iduronidasa
clonado previamente se subclonó en PRCCMV (InVitrogen) como un
fragmento HindIII-XbaI a partir de un subclon
bluescript KS. Se construyó un cassette intron derivado del intron
Cot de la inmunoglobulina murina entre los exones 2 y 3, utilizando
la amplificación PCR de las bases 788-1372 (Tucker
et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:
7684-7688 (1991) del clon pRIR14.5 (Kakkis, et
al., Nucleic Acids Res. 16: 7796 (1988)). El casette
incluía 136 pares de bases del extremo 33' del exon 2 y 242 pares
de bases del extremo 5' del exon 3, que permanecerían en el ADNc
apropiadamente empalmado. No se encuentran secuencias ATG en la
región codificante del casette intron. El casette intron se clonó
en el sitio HindIII 5' del ADNc de la
\alpha-L-iduronidasa. El neo gen
se sometió a deleción mediante digestión con XhoI seguido por la
recircularización del vector para obtener pCMVhldu.
Se descongeló un vial del banco celular de
pruebas y se situó en tres matraces T225 en suplementos DME/F12 o
PF-CHO, más FBS al 5% y 500 \mug/ml de G418.
Después de 2-5 días, las células se pasaron,
utilizando tripsina-EDTA, a un matraz centrifugador
de 3 litros en el mismo medio durante 2-5 días. Las
células se transfirieron entonces a dos matraces centrifugadores de
3 litros durante 2-5 días, seguido por 4 matraces
centrifugadores de 8 litros durante 2-5 días. El
inóculo de los matraces centrifugadores de 8 litros se añadió a dos
bioreactores tanque Applikon® de 110 litros con agitación, con un
volumen de trabajo de 80-90 litros. Se añadieron
microportadores de celulosa macroporosa a 2 gramos por litro (160
gramos), con suplementos de PF-CHO o DME/F12, FBS al
5%, y 500 \mug/ml de G418 con un volumen final de
80-90 litros. E El matraz se agitó mediante una
propulsión elevada con un agitador marino. El cultivo se monotorizó
respecto a velocidad de agitación, temperatura, sondas de DO y PH,
y el sistema de control Applikon® se controló con una interfaz de
PC. Los parámetros se controlaron en las posiciones de ajuste o
intervalos de: 35-37º dependiendo de las condiciones
del cultivo, 40% de saturación del aire, y pH de 6,95, utilizando
un manto de calentamiento, un rociador de oxígeno y una bomba basal.
El cultivo se incubó durante 3-5 días en cuyo
tiempo el cultivo surgió de la fase logarítmica de crecimiento a
1-3 x 10^{6} células por ml. Por tanto, la
perfusión se inició con una velocidad creciente con el medio
PF-CHO (con modificaciones habituales, JHR
Biosciences). Los primeros cuatro días de recuperación (intervalo
de 3-5 días) se dejaron a un lado como
"arrastre". La recuperación, por tanto, es el comienzo del
procesamiento de la producción. La producción continua con cambios
en el medio de volúmenes del cultivo del orden de entre 2 y 3,5 por
día durante 20-36 días. El cultivo podía extenderse
durante 40 días o más. El cultivo se controló continuamente
respecto a la temperatura, pH y DO. La purificación de la enzima
tuvo lugar tal como se ha descrito anteriormente. El medio de
producción recuperado que contiene iduronidasa se acidificó entonces
hasta pH 5,3 se filtró a través de un filtro de 0,2 micras y se
purificó utilizando cromatografía de Azul-Sepharose.
La enzima purificada a partir de múltiples rondas de cromatografía
se juntó y se aplicó a una columna quelante de cobre y se eluyó con
glicerol en el tampón a un pH de 3,7. La enzima se mantuvo a un pH
ácido para inactivar virus potenciales. El eluado de la columna de
cobre se ajustó entonces a un pH de 5,7 y 2 M NaCl y se cargó en la
columna de efenil Sepharose. La enzima se eluyó a 0,7 M NaCl. Se
concentró el eluado y se filtró en un tampón de formulación de 150
mM NaCl, 100 mM NaPO_{4}, pH 5,8. La enzima se filtró a través de
un filtro de 40 nM para eliminar virus potenciales y el filtrado se
ajustó a polisorbato 80 al 0,001%. Con la enzima formulada y
esterilizada en su conjunto se rellenaron contenedores estériles de
polietileno. La mayor parte de la enzima se filtró entonces y con
ella se rellenaron viales de vidrio de tipo 1 de 5 cc, apropiados
para formas farmacéuticas inyectables, se taponaron y se
taparon.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los bioreactores que utilizan suspensiones
celulares únicas, la serie de siembras se prepara tal como se
describe anteriormente en el Ejemplo 1. La utilización de una única
suspensión celular simplifica la preparación e inoculación del
bioreactor. El bioreactor se inocula con células en medio DMEM/F12
(25% del volumen del reactor) y JRH 325 modificado (25% del volumen
del reactor). A las 48 horas, se añade medio igual al 50% del
volumen de trabajo del reactor. La perfusión (y la recuperación) se
empieza cuando la densidad celular alcanza 1,0 e^{6} y el medio
de perfusión es el mismo descrito antes.
La administración intravenosa a corto plazo de
\alpha-L-iduronidasa recombinante
humana purificada a 9 perros y 6 gatos con MPS I ha mostrado una
absorción significativa de una emzima en diversos tejidos, con una
recuperación estimada del 50% o más en los tejidos 24 horas después
de una dosis única. Aunque el hígado y el bazo absorben la cantidad
más grande de las enzimas, y muestran la mejor mejoría en la
patología, en muchos, pero no en todos los tejidos se ha observado
mejoría en la patología y en el contenido de glucosaminoglicanos. En
particular, el cartílago, el cerebro y las válvulas cardíacas no
mostraron una mejoría significativa. La mejoría clínica se observó
en un perro único con un tratamiento a largo plazo de 13 meses, pero
otros estudios se han limitado a 6 meses o menos. Todos los perros
y la mayoría de los gatos que recibieron la enzima humana
recombinante desarrollaron anticuerpos respecto al producto humano.
Los anticuerpos IgG son del tipo de activación del complemento
(equivalentes probablemente a la IgG canina). Este fenómeno se
observa también en por lo menos el 13% de los pacientes de Gaucher
tratados con alglucerasa. Se ha observado proteinuria en un perro
que puede relacionarse con la enfermedad de complejos inmunes. No
se ha observado ningún otro efecto de los anticuerpos en los otros
animales tratados. No se observó toxicidad específica en estudios de
laboratorio clínico (contajes sanguíneos completos, electrolitos,
BLJN/creatinina, enzimas hepáticos, análisis de orina), que han sido
por otra parte
normales.
normales.
La terapia enzimática a incluso dosis pequeñas
de 25.000 unidades (0,1 mg/kg/semana) dio lugar a una distribución
enzimática significativa para algunos tejidos y descensos en el
almacenamiento de GAG. Si se continuaba durante 1 año, se
evidenciaron efectos clínicos significativos de la terapia, en
términos de actividad, tamaño y apariencia completa de salud. La
terapia con esta dosis no mejoró otros tejidos que son sitios
importantes para la enfermedad, como el cartílago y el cerebro.
Dosis más altas que 125.000 unidades (0,5 mg/kg) administradas 5
veces durante dos semanas, demostraron que puede alcanzarse una
mejoría en la penetración tisular, obteniéndose en un tiempo tan
corto como 2 semanas un efecto terapéutico a nivel tisular. Durante
seis meses hasta la fecha, se llevaron a cabo estudios con este
aumento de dosis en dos perros. Estos perros MPS I muestran una
significativa mejoría clínica y disminuciones sustanciales en la
excreción urinaria de GAG en el intervalo normal. La terapia
enzimática, aparte de una reacción inmune controlada por técnicas
alteradas de administración, no ha mostrado una toxicidad clínica o
bioquímica significativa. la terapia enzimática en su dosis semanal
más alta, es efectiva para mejorar algunas características clínicas
de MPS I y disminuir el almacenamiento sin una toxicidad
significativa.
Los resultados de estos diversos estudios en los
perros con MPS I y en un estudio en gatos con MPS I, muestran que
la \alpha-L-iduronidasa
recombinante humana es segura. Aunque estos mismos resultados
proporcionan razones para pensar que esta enzima recombinante sería
efectiva para tratar la deficiencia en
\alpha-L-iduronidasa, no
pronostican los beneficios clínicos o los riesgos inmunológicos
potenciales de la terapia enzimática en el hombre.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc humano de la
\alpha-L-iduronidasa pronostica
una proteína de 653 aminoácidos y peso molecular esperado de 70.000
daltons después de la escisión del péptido señal. La secuenciación
aminoácida revela la alanina 26 en el extremo N, dando lugar a una
proteína esperada de 629 aminoácidos. La
\alpha-L-iduronidasa recombinante
humana tiene una histidina en la posición 8 de la proteína madura.
La secuencia proteica pronosticada comprende seis sitios
potenciales de modificación del oligosacárido unido a N. Todos estos
sitios son modificados en la proteína recombinante. Se ha
demostrado que el tercer y el sexto sitios contienen uno o más
residuos de manosa 6-fosfato, responsables de la
absorción de alta afinidad en las células.
Este péptido corresponde a los aminoácidos
26-45 de la
\alpha-L-hirudinasa recombinante
humana con una alanina N-terminal y la secuencia
siguiente (SEC ID nº 2):
- ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala-arg-ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg
La enzima recombinante posee un peso molecular
aparente de 82.000 daltons en SDS-PAGE, debido a las
modificaciones de los hidratos de carbono. La
\alpha-L-iduronidasa recombinante
humana purificada se ha secuenciado por el Servicio de
Secuenciación proteica de UCLA. Se prefiere administrar la enzima
recombinante de forma intravenosa. La
\alpha-L-iduronidasa recombinante
humana se administró para ensayos clínicos en viales de
polipropileno de 10 ml a una concentración de
100.000-200.000 unidades por ml. La forma final de
dosificación de la enzima que se utilizó en el ensayo clínico
incluye \alpha-L-iduronidasa
recombinante humana, solución salina normal, y tampón de 100 mM
fosfato a pH 5,8. Estos se preparan en un recipiente de solución
salina normal. Se añadió polisorbato 80 a una concentración final
de 0,001 a la formulación, para estabilizar la proteína contra su
fragmentación, evitando por tanto la precipitación en los viales del
producto acabado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en estudios de clonación del ADNc que
codifica la \alpha-L-iduronidasa
(Scott, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:9695-99 (1991); Stoltzfus, et al, J. Biol.
Chem. 267: 6570-75 (1992)) y los estudios animales
que muestran los efectos de la
\alpha-L-iduronidasa para reducir
el almacenamiento lisosómico en muchos tejidos (Shull, et
al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 91:12937-41
(1994); Kakkis, et al. Biochem. Mol. Med.
58:156-67 (1996)), se realizó un estudio de 52
semanas para evaluar la seguridad y la eficacia clínica de la
administración intravenosa de
\alpha-L-iduronidasa altamente
purificada en diez pacientes con mucopolisacaridosis I (MPS I).
La
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante se produjo y purificó en un porcentaje superior al
97-99%. Los pacientes demostraban manifestaciones
clínicas típicas del trastorno y el diagnóstico se confirmó mediante
determinación bioquímica de la deficiencia de la
\alpha-L-iduronidasa en los
leucocitos.
Se administró intravenosamente a los pacientes
la \alpha-L-iduronidasa humana
recombinante (diluida en solución salina normal con albúmina sérica
humana al 0,1%), a una dosis de 125.000 unidades por kg (utilizando
el ensayo original y la definición de unidad);se administraron
3.000 unidades por kg durante la primera hora, y 61.000 unidades
por kg en cada una de las dos horas siguientes. La dosis de 125.000
unidades por kg es equivalente a 100 unidades SI por kg utilizando
el nuevo ensayo. Las infusiones se prolongaron hasta
4-6 horas en pacientes que presentaban reacciones de
hipersensibilidad.
Con valores basales y a las 6, 12, 26 y 52
semanas, dependiendo de la evaluación, los pacientes experimentaron
exámenes que incluían la historia, examen físico por especialistas,
ecocardiografía, EKG, MRI, polisomnografía (semanas 0 y 26), examen
del esqueleto (semanas 0, 26, 52), intervalo de mediciones del
movimiento, fotografías corneales, y biopsia de la piel (semana 0)
para establecer cultivos de fibroblastos para la determinación
enzimática y genotipado. El ámbito de mediciones del movimiento se
llevó a cabo con un goniómetro y para cada movimiento, se registró
el máximo ámbito activo (iniciado por el paciente). La flexión del
hombro es movimiento del codo anteriormente del lado del cuerpo y
la extensión del codo y de la rodilla representan el estiramiento
de la articulación. Los grados de restricción representan la
diferencia entre el ámbito máximo normal de movimiento para la edad
y el valor medido. La polisomnografía se llevó a cabo según las
normas de la American Thoracic Society y los eventos apneicos (cese
del flujo oro-nasal durante 10 segundos o más), los
eventos hipopneicos (disminución del flujo
oro-nasal en un 50% o más con una desaturación del
2% o más, o evidencia de despertar), los minutos (transcurridos)
con una saturación del 89% de oxígeno, y tiempo total de sueño, se
registraron entre las mediciones estándar requeridas. A partir de
estos datos se calculó un índice apnea/hipopnea dividiendo el
número total de eventos apneicos e hipopneicos por el número de
horas de sueño. Los estudios bioquímicos incluyeron la medida de la
actividad enzimática en los leucocitos y raspados de la mucosa
bucal, niveles de glucosaminoglicano urinario y los ensayos para
los anticuerpos séricos para la
\alpha-L-iduronidasa (ELISA y
transferencia Western). Los volúmenes de órganos se determinaron
mediante análisis de datos de la imagen digital MRI utilizando un
software de puesto de trabajo de Advantage Windows de General
Electric. El volumen orgánico se midió en mililitros y se convirtió
a peso considerando una densidad de 1 gramo por ml. La excreción de
glucosaminoglicano urinario se ensayó mediante una adaptación del
procedimiento publicado. Las transferencias Western y los ensayos
ELISA para los anticuerpos para la
\alpha-L-iduronidasa se llevaron a
cabo mediante procedimientos estándar. Los ácidos urónicos y el
N-sulfato de los glucosaminoglicanos urinarios se
analizaron mediante los procedimientos del orcinol, carbazol o
MBTH, y mediante separaciones electroforéticas.
Todos los pacientes recibieron semanalmente
infusiones de \alpha-L-iduronidasa
humana recombinante administrada durante 52 semanas. La actividad
promedio de la
\alpha-L-iduronidasa en los
leucocitos fue de 0,04 unidades por mg antes del tratamiento y
cuando se midió 7 días de promedio después de una infusión (es
decir, inmediatamente antes de la próxima infusión), de 4,98
unidades por mg, o un porcentaje del 15,0% de lo normal. la
actividad enzimática no pudo detectarse en los raspados bucales
antes del tratamiento, pero 7 días después de las infusiones,
alcanzó un nivel del 1% de lo normal.
El volumen hepático disminuyó entre un 19 y un
37 por ciento a partir del valor basal en 9 pacientes y un 5% en un
paciente a las 52 semanas;la disminución promedio fue del 25,0%
(n=10, p< 0,001). A las 26 semanas, el tamaño del hígado era
normal para el peso corporal y la edad en 8 pacientes (Figura 1). En
2pacientes (pacientes 6 y 9), con el tamaño hepático relativo más
voluminoso en valores basales, el tamaño hepático estaba cerca de
lo normal a las 52 semanas (3,2 y 3,3 por ciento de peso corporal,
respectivamente). El tamaño del bazo disminuyó en 8 pacientes en un
13 al 42%, tomando como referencia los datos basales (disminución
promedio de 20% en 10 pacientes, p<0,001). La excreción de
glucosaminoglicano urinario disminuyó rápidamente en 3 a 4 semanas
y en 8-12 semanas había bajado entre el 60 y el 80%
del valor basal. A las 52 semanas, la reducción promedio era del
63% (intervalo 53-74; p<0,001). Ocho de diez
pacientes presentaban una reducción del 75% o más de la cantidad
basal de glucosaminoglicano urinario que excedía del límite superior
de la cantidad normal para la edad. Los resultados se confirmaron
mediante ensayo de ácidos urónicos y del N-sulfato
(un ensayo específico para el heparan sulfato). Los estudios de
electroforesis de la orina detectaron una reducción significativa
en la excreción de heparan sulfato y dermatán sulfato,pero en todos
los pacientes, persistió algún exceso en la excreción de dermatan
sulfato.
La altura promedio aumentó 6,0 cm (5,2%) en 6
pacientes prepuberales (Tabla 2) y su velocidad promedio de
crecimiento en altura aumentó desde 2,8 cm/año a 5,2 cm/año durante
el tratamiento (p=0,011). Para la totalidad de los 10 pacientes, el
peso corporal promedio aumentó 3,2 kg (8,8%) y el aumento promedio
fue de 4,2 kg (17,1%) para los 6 pacientes prepuberales (Tabla 2).
En estos 6 pacientes, la velocidad promedio pretratamiento del peso
aumentó desde 1,7 kg por año a 3,8 kg por año durante el tratamiento
(p=0,04).
La flexión de los hombros (moviendo el codo
anteriormente) aumentó en 6 de 8 individuos que se evaluaron
basalmente con una mejoría promedio para los hombros izquierdo y
derecho de 28º y de 26º, respectivamente (p <0,002; Figura 2).
La extensión del codo y la extensión de la rodilla aumentaron en una
media de 7,0º (p <0,03) y 3,2º (p=0,10), respectivamente, en los
10 pacientes (Figura 2).
El análisis de la mejoría en pacientes
individuales reveló que las articulaciones más limitadas mostraban
la mejoría más importante. Por ejemplo, en los valores basales, los
pacientes 5,9 y 10 no podían flexionar sus hombros (mover
anteriormente el codo) más allá de 100º, que aumentó entre el 21º y
el 51º después del tratamiento. De modo similar, los pacientes 2 y
9 mostraron un aumento sustancial en la extensión de la rodilla.
Los cambios en el ámbito del movimiento se acompañaron por un
aumento en las actividades físicas informadas por el paciente,
tales como ser capaz de lavarse la cabeza, sostener una hamburguesa
normalmente, colgarse de las estructuras de barras para juegos
infantiles, y practicar mejor deportes.
Siete pacientes mostraron una disminución en los
sucesos apneicos e hipoapneicos desde 155 a 60 por noche, después
del tratamiento (una disminución del 61%), con un cambio en el
índice promedio apnea/hipoapnea (número total de eventos por hora)
de 2,1 a 1,0. Tres pacientes mostraban apneas clínicamente
significativas y todos mejoraron durante el tratamiento. En el
paciente 2, el índice apnea/hipoapnea disminuyó desde 4,5 en los
valores basales a 0,4 a las 26 semanas, y el tiempo total de
desaturación del oxígeno disminuyó desde 48 minutos a 1 minuto por
noche. El paciente 6 necesitaba por la noche una terapia continua de
presión positiva de las vías aéreas antes del tratamiento, debido a
una desaturación importante (61 minutos con una saturación inferior
al 89% con una presión continua positiva de las vías aéreas en 368
minutos de sueño), pero a las 52 semanas, el paciente toleró el
estudio del sueño sin CPAP, mostrando una desaturación inferior al
89% sólo 8 minutos durante 332 minutos de sueño. El paciente 9
mostraba un índice apnea/hipoapnea de 9,5 que disminuyó hasta 4,0 a
las 26 semanas. El paciente 8 empeoró con un índice apnea hipoapnea
de 0,1, que aumentó a 3,1 a las 26 semanas y a 9,3 a las 52
semanas, debido a causas que no estaban claras. Ocho de los diez
pacientes o sus familias informaron de una mejoría en la
respiración, y 5 de 7 mostraron una respiración nocturna más
tranquila, una mejora en la calidad del sueño y una disminución en
la somnolencia diurna.
La clasificación funcional de la New York Heart
Association se determinó mediante entrevistas seriadas a los
pacientes. La totalidad de los 10 pacientes informaron de una
mejoría en una o dos clases, pero no se dieron datos objetivos
significativos de estudios ecocardiográficos para verificar un
beneficio cardíaco directo. Las clasificaciones de mejoría
funcional pueden reflejar mejorías en otros aspectos de la
enfermedad MPS I más que en la función cardíaca. Comparando los
valores basales con los obtenidos a las 52 semanas de tratamiento,
la ecocardiografía demostró una disminución en la insuficiencia
tricuspídea o en la insuficiencia pulmonar en 4 pacientes, pero en
dos (pacientes 2 y 7) mostraron un empeoramiento de la insuficiencia
mitral. En los valores basales, el paciente 6 mostró aleteo
auricular y síntomas clínicos de insuficiencia cardíaca incluyendo
dísnea en reposo y edema periférico. A las 12 semanas, mostraba un
ritmo sinusal normal con bloqueo de primer grado, resolviéndose su
disnea en reposo y su edema con fóvea.
La totalidad de los 10 pacientes informaron de
una falta de resistencia y de limitaciones en las actividades
diarias antes del tratamiento, pero la tolerancia al ejercicio no se
ensayó formalmente. Durante el tratamiento, todos los pacientes
mejoraron y a las 26 semanas, muchos podía andar más, correr y hacer
deporte. Los pacientes 3, 4 y 5 informaron de la resolución de
dolores de cabeza incapacitantes después del tratamiento durante
6-12 semanas.
Varios pacientes informaron de una disminución
en la fotofobia o de la irritación de la conjuntiva. La agudeza
visual mejoró en un paciente (20/1000 a 20/200) en un ojo y
modestamente en otros 2.
Los resultados de este estudio indican que la
administración intravenosa de la
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante altamente purificada de la presente invención da lugar
a una mejoría clínica y bioquímica en pacientes con
Mucopolisacaridosis I. La normalización del tamaño hepático y la
casi normalización de la e excreción urinaria de glucosaminoglicano
está de acuerdo con los datos procedentes de estudios en perros con
Mucopolisacaridosis I, que demostraron la eliminación del
almacenamiento en el hígado y la disminución en la excreción
urinaria de glucosaminoglicano en un tiempo tan corto como 2
semanas.
Las reacciones de hipersensibilidad a las
infusiones de la
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante dieron menos graves que lo pronosticado por los
estudios en perros. Aunque importante en algunos pacientes, la
urticaria recurrente se pudo controlar con premedicación y ajustes
en la velocidad de infusión. Los anticuerpos específicos a la
\alpha-L-iduronidasa se detectaron
en 4 pacientes con una activación del complemento habitualmente
subclínica, y tanto los anticuerpos como la activación del
complemento disminuyeron con el tiempo. Respuestas inmunes
similares mediadas por IgG se han constatado previamente en
pacientes con la enfermedad de Gaucher tratados con
glucocerebrosidasa, aunque los sucesos fueron más frecuentes en
nuestros pacientes. Los pacientes de Mucopolisacaridosis I con un
genotipo nulo pueden presentar una respuesta inmune mayor que la
observada en estos 10 pacientes, ninguno de los cuales tenía
ninguna.
De este modo, la
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante puede reducir el almacenamiento lisosómico y mejora
algunos aspectos de la enfermedad clínica de la Mucopolisacaridosis
I.
La invención, y la forma y procedimiento de
utilizarla, se describen ahora en tales términos exactos, concisos,
claros y completos, que permitan a cualquier experto en la técnica
al cual pertenece, llevarla a la práctica y utilizarla.
<110> BIOMARIN PHARMACEUTICAL INC
\hskip1cmHARBOR-UCLA RESEARCH AND EDUCATION INSTITUTE
\hskip1cmHENSTRAND, JOHN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120>
\alpha-L-IDURONIDASA RECOMBINANTE
Y PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES CAUSADAS
POR LAS DEFICIENCIAS DE LA MISMA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 00800005100PC00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PENDIENTE DE CONCESIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<141> PENDIENTE DE CONCESIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/439,923
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-11-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para la versión de Windows
3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1558)...(3510)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 650
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (13)
1. Enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante, que comprende los aminoácidos 26 a 653 de la figura
1, con una pureza igual o superior a 99%.
2. Enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante según la reivindicación 1, que es una forma de enzima
de elevada absorción que (a) comprende residuos de
manosa-6-fosfato en las posiciones 3
y 6 de los azúcares unidos a N y (b) muestra una afinidad de
absorción inferior a 30 unidades de enzima por ml o inferior a 2
nM.
3. Enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante según la reivindicación 1 ó 2, que presenta una vida
media en el interior de las células de aproximadamente cinco
días.
4. Enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante según la reivindicación 3, que es sustancialmente
correctora para los trastornos de almacenamiento de
glicosaminoglicano causados por la deficiencia de iduronidasa.
5. Enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, con una
actividad específica superior a aproximadamente 240.000 unidades
por miligramo de proteína.
6. Composición farmacéutica que comprende la
enzima \alpha-L-iduronidasa humana
recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en
combinación con un portador adecuado farmacéuticamente.
7. Composición farmacéutica según la
reivindicación 6, que comprende además una solución de cloruro
sódico, un tampón y polisorbato 80.
8. Composición farmacéutica según la
reivindicación 6 ó 7, en la que dicha enzima
\alpha-L-iduronidasa humana
recombinante está presente a una concentración de aproximadamente
0,5 mg/ml y aproximadamente 125.000 unidades por ml.
9. Composición farmacéutica según la
reivindicación 7 u 8, en la que dicha solución de cloruro sódico
está a una concentración de aproximadamente 150 mM.
10. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 9, en la que dicho tampón es un tampón de
fosfato sódico a una concentración de aproximadamente 100 mM, y pH
5,4-5,9.
11. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 10, en la que tras la dilución en la forma
de dosificación la albúmina humana está presente a una concentración
de por lo menos aproximadamente 1 mg/ml.
12. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 11, en la que el pH de dicha solución es
mantenido a aproximadamente 5,8.
13. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 12, en la que dicho polisorbato 80 es
mantenido a 0,001%.
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Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6569661B1 (en) * | 1999-11-12 | 2003-05-27 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Recombinant α-L-iduronidase, methods for producing and purifying the same and methods for treating diseases caused by deficiencies thereof |
| US6585971B1 (en) * | 1999-11-12 | 2003-07-01 | Harbor-Ucla Research And Education Institute | Recombinant α-L-iduronidase, methods for producing and purifying the same and methods for treating disease caused by deficiencies thereof |
| US7749971B2 (en) * | 2001-02-20 | 2010-07-06 | Bedwell David M | Aminoglycoside treatment for lysosomal storage diseases |
| US7629309B2 (en) | 2002-05-29 | 2009-12-08 | Zystor Therapeutics, Inc. | Targeted therapeutic proteins |
| US7560424B2 (en) | 2001-04-30 | 2009-07-14 | Zystor Therapeutics, Inc. | Targeted therapeutic proteins |
| US7485314B2 (en) * | 2002-05-06 | 2009-02-03 | Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center | Induction of antigen specific immunologic tolerance |
| US20050026823A1 (en) | 2003-06-20 | 2005-02-03 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Use of the chaperone receptor-associated protein (RAP) for the delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues |
| KR20060123702A (ko) * | 2003-08-21 | 2006-12-04 | 큐 세라퓨틱스, 아이엔씨. | 리소좀성 축적병에서 결핍된 리소좀 효소전구체의 지속된분비를 위한 유전자 변형 체세포 |
| US7442372B2 (en) | 2003-08-29 | 2008-10-28 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues |
| MXPA03011987A (es) | 2003-12-19 | 2005-06-23 | Osio Sancho Alberto | Metodo para el tratamiento de la presbicia induciendo cambios en el poder y fisiologia corneal. |
| US9062126B2 (en) | 2005-09-16 | 2015-06-23 | Raptor Pharmaceuticals Inc. | Compositions comprising receptor-associated protein (RAP) variants specific for CR-containing proteins and uses thereof |
| US8105788B2 (en) * | 2005-12-08 | 2012-01-31 | The University Of British Columbia | Mucopolysaccharidosis (MPS) diagnostic methods, systems, kits and assays associated therewith |
| KR20100015786A (ko) * | 2007-03-21 | 2010-02-12 | 랩터 파마슈티컬 인코포레이티드 | 환형의 수용체-연관된 단백질(ｒａｐ) 펩티드 |
| MX354993B (es) | 2007-07-09 | 2018-03-28 | Genentech Inc | Prevención de reducción de enlaces de disulfuro durante la producción recombinante de polipéptidos. |
| EP2093085B1 (en) * | 2008-02-21 | 2012-05-02 | Fiat Group Automobiles S.p.A. | Glass supporting assembly for a motor vehicle door with an unframed upper edge |
| US20110223147A1 (en) | 2008-05-07 | 2011-09-15 | Zystor Therapeutics, Inc. | Lysosomal targeting peptides and uses thereof |
| ES2758827T3 (es) | 2009-06-17 | 2020-05-06 | Biomarin Pharm Inc | Formulaciones para enzimas lisosómicas |
| WO2012101671A1 (en) * | 2011-01-25 | 2012-08-02 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for production of human recombinant iduronate 2-sulfatase |
| DE102011102170B4 (de) | 2011-05-20 | 2024-06-06 | Vitesco Technologies GmbH | Einspritzvorrichtung zur Einspritzung eines Fluids |
| HUE051632T2 (hu) | 2012-06-19 | 2021-03-29 | Univ Florida | Betegségek kezelésére szolgáló készítmények és eljárások |
| CN104823100B (zh) | 2012-08-10 | 2020-04-24 | 奥西奥公司以约利亚健康公司名义经营 | 隐形眼镜和为个体的眼睛测定隐形眼镜的适配的方法 |
| SG10201707319UA (en) * | 2013-03-15 | 2017-10-30 | Univ Pennsylvania | Compositions and methods for treating mpsi |
| WO2017136500A1 (en) | 2016-02-03 | 2017-08-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type i |
| KR20250022877A (ko) * | 2017-01-31 | 2025-02-17 | 리젠엑스바이오 인크. | 완전히-인간 글리코실화된 인간 알파-l-이두로니다아제(idua)를 이용한 뮤코다당증 1형의 치료 |
| AU2018298133A1 (en) | 2017-07-06 | 2020-01-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | AAV9-mediated gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type I |
| WO2019060662A1 (en) | 2017-09-22 | 2019-03-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | GENE THERAPY FOR THE TREATMENT OF MUCOPOLYSACCHARIDOSE TYPE II |
| CN107699590A (zh) * | 2017-10-13 | 2018-02-16 | 成都中医药大学 | 一种制备重组人α‑L‑艾杜糖醛酸酶的方法 |
| US20220023434A1 (en) | 2018-12-19 | 2022-01-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Bifunctional Molecules for Lysosomal Targeting and Related Compositions and Methods |
| CN110577559B (zh) * | 2019-08-19 | 2023-02-17 | 江西科技师范大学 | α-L-艾杜糖醛酸酶测定用荧光糖苷酶底物的合成方法 |
| WO2022145449A1 (ja) * | 2021-01-04 | 2022-07-07 | 国立大学法人徳島大学 | ライソゾームを標的とした新規ｄｄｓの開発 |
| JP7791517B2 (ja) * | 2021-01-04 | 2025-12-24 | 国立大学法人徳島大学 | ライソゾームを標的とした新規ｄｄｓの開発 |
| CN115109790A (zh) * | 2021-03-23 | 2022-09-27 | 北京据德医药科技有限公司 | 一种重组a-L-艾杜糖醛酸普酶及其制备方法 |
| JP2024524614A (ja) | 2021-07-14 | 2024-07-05 | ライシア セラピューティクス， インコーポレイテッド | Ａｓｇｐｒ細胞表面受容体結合化合物及びコンジュゲート |
| CN114181318B (zh) * | 2021-11-08 | 2023-08-01 | 四川大学 | 一种组织特异性表达穿透血脑屏障的idua融合蛋白的重组腺相关病毒及应用 |
| CN115161284B (zh) * | 2022-07-04 | 2024-07-09 | 无锡多宁生物科技有限公司 | 一种lmh悬浮细胞复苏培养方法及其应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL281225A (es) | 1961-07-20 | |||
| GB1029548A (en) | 1963-07-17 | 1966-05-11 | Amagasaki Iron & Steel Mfg Co | Corrugated roofing sheet |
| US3472931A (en) | 1969-01-17 | 1969-10-14 | Foster Milburn Co | Percutaneous absorption with lower alkyl amides |
| US3891757A (en) | 1971-11-11 | 1975-06-24 | Alza Corp | Anaesthetic topical and percutaneous administration with selected promoters |
| US5270051A (en) | 1991-10-15 | 1993-12-14 | Harris Donald H | Enzyme-orthokeratology |
| US6149909A (en) | 1995-06-23 | 2000-11-21 | Women's And Children's Hospital | Synthetic α-L-iduronidase and genetic sequences encoding same |
| CA2099503C (en) | 1991-11-14 | 2007-10-09 | Hamish Steele Scott | Synthetic alpha-l-iduronidase and genetic sequences encoding same |
| US5278051A (en) * | 1991-12-12 | 1994-01-11 | New York University | Construction of geometrical objects from polynucleotides |
| ES2326705T3 (es) | 1995-09-14 | 2009-10-16 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Produccion de enzimas lisosomicas en sistemas de expresion basados en plantas. |
| GB9807464D0 (en) | 1998-04-07 | 1998-06-10 | Pharming Bv | Purification of human acid µ-glucosidase |
| AU4072499A (en) | 1998-05-13 | 1999-11-29 | Harbor-Ucla | Recombinant (alpha)-l-iduronidase, methods for producing and purifying the same and methods for treating diseases caused by deficiencies thereof |
-
1999
- 1999-11-12 US US09/439,923 patent/US6426208B1/en not_active Expired - Lifetime
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