ES2273748T3 - Alfa-l-iduronidasa recombinante, procedimientos para producir y purificar la misma y procedimientos para tratar enfermedades causadas por su deficiencia. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para purificar una enzima a-L-iduronidasa recombinante o sus fragmentos biológicamente activos o sus mutantes, para igualar o superar una pureza del 99%, que comprende las etapas siguientes: (a) recuperar y filtrar el líquido obtenido de un cultivo de células transformadas con ácidos nucleicos que codifican dicha a-L-iduronidasa recombinante; (b) ajustar el pH del líquido a un pH ácido, seguido por filtración a través de un filtro comprendido entre 0, 2 y 0, 54 micras; (c) hacer pasar el líquido a través de una columna de azul sepharose FF para capturar dicha a-L-iduronidasa; (d) hacer pasar el eluado a través de una columna de sepharose quelante de cobre para eliminar las proteínas contaminantes; (e) hacer pasar el eluado a través de una columna de fenil sepharose para reducir el colorante Cibacron azul residual filtrado y los iones de cobre transportados a partir de las columnas previas; y (f) concentrar y filtrar la a-L-iduronidasa recombinante purificada eluída a partir dela misma.

Description

\alpha-L-iduronidasa recombinante, procedimientos para producir y purificar la misma y procedimientos para tratar enfermedades causadas por su deficiencia.

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la biología molecular enzimología, bioquímica y medicina clínica. En particular, la presente invención proporciona una \alpha-L-iduronidasa recombinante, procedimientos de producción a gran escala y purificación de la enzima \alpha-L-iduronidasa recombinante humana de tipo comercial, y procedimientos para tratar ciertos trastornos genéticos que incluyen la deficiencia en \alpha-L-iduronidasa y la mucopolisacaridosis I
(MPS I).

Antecedentes de la invención

Los hidratos de carbono juegan diversos importantes papeles en el funcionamiento de los organismos vivientes. Además de sus funciones metabólicas, los hidratos de carbono son componentes estructurales del organismo humano unidos covalentemente a numerosas otras sustancias como las proteínas y los lípidos (denominados glucoconjugados). Por ejemplo, los tejidos conjuntivos humanos y las membranas celulares comprenden proteínas, hidratos de carbono y una matriz de proteoglicanos. La parte de hidratos de carbono de esta matriz de proteoglicanos proporciona importantes propiedades a la estructura del cuerpo.

Una deficiencia genética de la enzima lisosómica \alpha-L-iduronidasa que fragmenta a los hidratos de carbono, provoca un trastorno del almacenamiento lisosómico denominado mucopolisacaridosis I (MPS I) (Neufeld y Muenzer, págs. 1565-1587, en The Metabolic Basis of Inherited Disease, Eds,. C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, y D. Valle, McGraw-Hill, New York (1989)). En una forma grave, a MPS I se le conoce con el nombre de síndrome de Hurler y se asocia con múltiples problemas tales como retardo mental, enturbiamiento de la córnea, características faciales toscas, enfermedad cardíaca, enfermedad respiratoria, agrandamiento del hígado y del bazo, hernias y rigidez de las articulaciones. Los pacientes que padecen el síndrome de Hurler mueren habitualmente antes de los 10 años de edad. En una forma intermedia conocida como síndrome de Hurler-Scheie, la función mental no está generalmente gravemente afectada, pero los problemas físicos pueden conducir a la muerte a los diez o los veinte años de edad. El síndrome de Scheie es la forma más leve de MPS I. Es compatible con un período de vida normal, pero la rigidez de las articulaciones, el enturbiamiento corneal y las enfermedades de las válvulas cardíacas causan problemas significativos.

La frecuencia de MPS I se calcula que es de 1:100.000 según un estudio en British Columbia de todos los recién nacidos (Lowry, et al, Human Genetics 85:389-390 (1990)) y 1:70.000 según un estudio irlandés (Nelson, Human Genetics 101:355-358 (1990)). Parece que no existe una predilección étnica para esta enfermedad. Es probable que mundialmente la enfermedad esté poco diagnosticada, porque el paciente muera de una complicación antes de que se haya realizado el diagnóstico, o porque las formas más leves del síndrome pueden confundirse con artritis o perderse completamente. El rastreo efectivo de los recién nacidos respecto a MPS I encontrará probablemente algunos pacientes previamente no detectados.

Excepto para algunos pacientes que reúnen las condiciones necesarias para el trasplante de médula ósea, no existen terapias significativas disponibles para todos los pacientes de MPS I. Hobbs, et al, (Lancet 2:709-712 (1981)) informó en primer lugar de que el trasplante de médula ósea trató con éxito a un paciente de Hurler. A partir de entonces, estudios clínicos en diversos centros de trasplante han mostrado mejoría en la enfermedad física y un enlentecimiento o estabilización en la disminución del desarrollo, si se lleva a cabo tempranamente. (Whitley, et al., Am. J. Med. Genet. 46:209-218 (1993); Vellodi, et al., Arch. Dis. Child. 76:92-99 (1997); Peters, et al., Blood 91:2601-2608 (1998); Guffon, et al., J. Pediatrics 133:119-125 (1998). Sin embargo, la mortalidad y la morbosidad, y la necesidad de donantes emparejados de médula, limita la utilidad de los trasplantes de médula ósea. Una terapia alternativa disponible para todos los pacientes afectados proporcionaría un importante gran avance en el tratamiento y manejo de esta enfermedad.

La terapia de reemplazamiento enzimático se ha considero una terapia potencial para MPS I, después del descubrimiento de que la \alpha-L-iduronidasa puede corregir el defecto enzimático en las células Hurler en cultivo, pero el desarrollo de la terapia humana ha sido técnicamente inviable hasta la fecha. En el proceso de corrección, la enzima que contiene un residuo de manosa-6-fosfato es absorbida en las células mediante endocitosis mediada por receptores y es transportada a los lisosomas donde elimina a los sustratos almacenados, heparan sulfato y dermatan sulfato. La aplicación de esta terapia al hombre no ha sido posible previamente debido a las fuentes inadecuadas de la \alpha-L-iduronidasa en los tejidos.

Para la terapia enzimática de la \alpha-L-iduronidasa en MPS I, se ha requerido una fuente recombinante de la enzima para obtener aprovisionamientos terapéuticamente suficientes de la enzima. El ADNc para la enzima canina se clonó en 1991 (Stoltzfus, et al, J. Biol. Chem. 267:6570-6575 (1992) y para la enzima humana en el mismo año. (Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9695-9699 (1991), Moskowitz, et al., FASEB J 6: A77 (1992)). Después de la clonación de ADNc para la \alpha-L-iduronidasa, la producción de cantidades adecuadas de \alpha-L-iduronidasa recombinante permitió el estudio de la terapia de reemplazamiento enzimático en la MPS I canina. (Kakkis, et al., Protein Expr. Purif. 5:225-232 (1994)). Los estudios de reemplazamiento enzimático en el modelo MPS I canino demostraron que la \alpha-L-iduronidasa recombinante administrada intravenosamente se distribuía ampliamente y reducía el almacenamiento lisosómico de muchos tejidos (Shull, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:12937-12941 (1994); Kakkis et al, Biochem. Mol. Med. 58:156-167 (1996)).

Sumario de la invención

En resumen, la presente invención muestra un procedimiento para producir en masa \alpha-L-iduronidasa recombinante, con la pureza apropiada para permitir su producción a gran escala, para la utilización por parte del paciente, a largo plazo, de la terapia enzimática. En una forma de realización amplia, el procedimiento comprende la etapa de transfectar un ADNc que codifica la totalidad o parte de una \alpha-L-iduronidasa en una célula apropiada para su expresión. En algunas formas de realización, se utiliza un ADNc que codifica una \alpha-L-iduronidasa completa, preferentemente una \alpha-L-iduronidasa humana. Sin embargo, en otras formas de realización, puede utilizarse un ADNc que codifica un fragmento biológicamente activo o un mutante suyo. Específicamente, pueden llevarse a cabo una o más sustituciones aminoácidas siempre que se conserve o potencie la actividad enzimática de la enzima. En otras formas de realización preferidas, se utiliza un vector para transferir el ADNc a una célula apropiada o a una progenie celular para su expresión. En una forma de realización particularmente preferida, el ADNc se ttransfecta a una célula ovárica del hámster chino, para crear la progenie celular 2.131. En otras formas de realización, todavía, el procedimiento de producción muestra una o más de las características siguientes, que han demostrado niveles de producción particularmente altos: (a) el pH del cultivo de crecimiento celular puede disminuirse hasta alrededor de 6,5 a 7,0, preferentemente hasta alrededor de 6,8-7,0 durante el proceso de producción, (b) durante cada período de 24 horas, pueden cambiarse de 2 a 3,5 volúmenes del cultivo mediante perfusión continua, (c) la saturación de oxígeno puede optimizarse hasta alrededor del 40%, pero puede ser tan alta como del 80%, (d) pueden utilizarse inicialmente en el medio microportadores de celulosa macroporosa con el 5% del suero aproximadamente, para producir una masa celular, seguido por una rápida inundación a un medio libre de proteínas para la producción, (e) un medio bajo en proteínas o libre de ellas tal como un producto PF-CHO de JRH Biosciences, puede optimizarse para incluir cantidades suplementarias de uno o más ingredientes seleccionados del grupo formado por: glutamato, aspartato, glicina, ribonucleósidos, y desoxiribonucleósidos; (f) un cultivo de una suspensión en un recipiente con agitación, puede perfundirse en un proceso continuo para producir iduronidasa.

En formas de realización preferidas, la presente invención caracteriza una progenie celular ovárica de hámster chino tal como la progenie celular 2.131, que produce estable y fiablemente cantidades de \alpha-L-iduronidasa que permiten la utilización terapéutica de la enzima. En algunas formas de realización preferidas, la progenie celular puede contener más de una copia de un constructo de expresión. En formas de realización más preferidas, incluso, la progenie celular expresa \alpha-L-irudinasa recombinante en cantidades de por lo menos de 20 microgramos por 10^{7} células por día.

En formas de realización preferida, la presente invención caracteriza un vector de expresión que comprende un elemento promotor/potenciador del citomegalovirus, un intrón del extremo 5', formado por un intrón Ca murino, un ADNc que codifica la totalidad o un fragmento o mutante de una \alpha-L-iduronidasa, y un sitio de poliadenilación 3' de la hormona de crecimiento bovina. Asimismo, el ADNc que codifica la totalidad o un fragmento o un mutante de una \alpha-L-iduronidasa tiene una longitud de 2,2 kb. Este vector de expresión puede transfectarse en, por ejemplo, una proporción de 50 a 1, con cualquier vector de selección habitual apropiado tal como pSV2NEO, para potenciar inserciones múltiples de la copia. Alternativamente, la amplificación génica puede utilizarse para inducir múltiples inserciones de la copia.

La actividad específica de la \alpha-L-iduronidasa según la presente invención es superior a 200.000 unidades por milígramo de proteínas. Preferentemente, es superior a 240.000 unidades aproximadamente por milígramo de proteínas. El peso molecular de la \alpha-L-iduronidasa de la presente invención es aproximadamente de 82.000 daltons, correspondiendo 70.000 daltons, aproximadamente, a aminoácidos, y alrededor de 12.000 daltons, a hidratos de carbono.

La presente invención caracteriza (o muestra) un nuevo procedimiento para purificar la \alpha-L-iduronidasa. Según una primera forma de realización, una masa celular puede desarrollarse en un medio que contiene suero al 5%, seguido por un cambio a un medio modificado para la producción, libre de proteínas, sin ninguna adaptación significativa para producir un material para iniciar una actividad altamente específica para la purificación. En una forma de realización preferida, puede utilizarse una columna cromatográfica de tres fases para purificar la enzima. Dicha columna cromatográfica de tres fases puede incluir la utilización de FF sepharose azul, una fase cromatográfica sepharose quelante de Cu^{++}, y una fase cromatográfica HP de fenil sepharose. En otra forma de realización preferida, se utiliza una fase de tratamiento con pH ácido para inactivar los virus potenciales sin dañar a la enzima. Las columnas de concanavalina A-Sepharose, Heparina-Sepharose y Sephacril 200 son eliminadas, añadiéndose las columnas Azul-Sepharose y quelante de cobre para aumentar la capacidad del proceso de purificación a gran escala, para reducir filtraciones iinapropiadas no deseadas para la utilización (del producto) a largo plazo por parte del paciente, y para mejorar la pureza del producto.

En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para purificar una enzima \alpha-L-iduronidasa recombinante o sus fragmentos o mutantes biológicamente activos en una cuantía igual o superior al 99% aproximadamente, que comprende las etapas siguientes:

(a)

recuperar y filtrar el líquido obtenido a partir de un cultivo de células transformado con ácidos nucleicos que codifican dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante;

(b)

ajustar el pH del líquido hasta un pH ácido, seguido por filtración a través de un filtro de 0,2-0,54 micras;

(c)

hacer pasar el líquido a través de una columna cromatográfica FF sepharose azul, para capturar dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante;

(d)

hacer pasar el eluado a través de una columna cromatográfica de sepharose quelante de cobre para eliminar las proteínas contaminantes;

(e)

hacer pasar el eluado a través de una columna cromatográfica de fenil sepharose para reducir el colorante azul Cibacron filtrado residual y los iones de cobre llevados por las columnas previas; y

(f)

concentrar y filtrar a partir de la misma la \alpha-L-iduronidasa recombinante.

Preferentemente, dicha columna FF de azul sepharose se utiliza para purificar dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante de siete a diez veces.

Preferentemente, dicho procedimiento comprende la utilización de glicerol al 10% en todos los tampones, para aumentar la recuperación cuantitativa de dicha \alpha-L-iduronidasa o fragmentos o mutantes suyos.

Preferentemente, dicha fase de sepharose quelante de cobre se lleva a cabo sobre una matriz FF de sepharose quelante de cobre.

Preferentemente, dicha fase de columna de fenil sepharose se realiza sobre una matriz cromatográfica de alto rendimiento de fenil-sepharose.

Preferentemente, dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante purificada o sus fragmentos o mutantes tiene una actividad específica superior a 240.000 unidades por miligramo de proteína.

Preferentemente, dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante purificada o sus fragmentos o mutantes comprende uno o más residuos de manosa-6-fosfato.

Preferentemente, dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante purificada o sus fragmentos o mutantes comprende un residuo de manosa-6-fosfato unido en la posición 3 y un residuo de manosa-6-fosfato unido en la posición 6.

Preferentemente, dicha \alpha-L-idorunidasa recombinante purificada o sus fragmentos o mutantes posee una semivida biológica en el interior de una célula de aproximadamente 5 días.

Preferentemente, dicho cultivo de células es un cultivo de células CHO. Preferentemente, dicho cultivo de células CHO es un cultivo de la progenie celular 2.131 de células CHO.

Preferentemente dichas células son cultivadas en un medio de cultivo sin proteínas, que posee un pH comprendido entre 6,8 y 7,0, suplementándose dicho medio con 7,6 mg/l de timidina, 13,6 mg/l de hipoxantina, 375 \mug/ml de G418 y suero bovino fetal al 5%.

Preferentemente, dichas células crecen hasta confluencia con una densidad comprendida entre 2,0 x 10^{5} a 2,5 x 10^{5} células por ml.

Preferentemente, dicho medio de dichas células que han crecido hasta confluencia se recupera mediante perfusión continua.

Preferentemente, dicha perfusión continua comprende el intercambio comprendido entre 2 a 3,5 volúmenes del cultivo de dicho medio durante 24 horas.

Preferentemente, la producción de dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante o fragmento o mutante suyo es potenciada suplementando dicho medio con butirato sódico durante 12 horas para inducir la expresión génica de dicha \alpha-L-iduronidasa o fragmento o mutante suyo.

Preferentemente, dicho butirato sódico se elimina de dicho medio 12 horas después de la inducción inicial con dicho butirato sódico.

Preferentemente, dicha producción de \alpha-L-iduronidasa recombinante o de fragmentos o mutantes suyos se vuelve a inducir con butirato sódico cada 48 horas durante un período de producción proteica de 21 días.

Preferentemente, dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante o fragmentos o mutantes suyos comprende la secuencia aminoácida de los residuos 26 a 653 de SEC ID nº 2.

Preferentemente, la \alpha-L-iduronidasa es una \alpha-L-iduronidasa humana de la SEC ID nº 2.

Descripción de las figuras

La figura 1 representa las secuencias nucleótidas y las aminoácidas deducidas del ADNc que codifica la \alpha-L-iduronidasa (SEC ID nº 1 y 2). Se proporcionan los nucleótidos 1 a 6200. Se proporcionan los aminoácidos que empiezan con la primera metionina en el marco abierto de lectura.

La figura 2 representa los resultados de los procesamientos SDS-PAGE del eluado obtenido según los procedimientos tal como se describen a continuación. El cuadro superior muestra los resultados SDS-PAGE obtenidos de la \alpha-L-iduronidasa purificada (3 microgramos) y de los contaminantes del esquema de producción/purificación dado a conocer en, et al, Protein Expr. Purif, 5:225-232 (1994). En el cuadro inferior, los resultados de SDS-PAGE de la \alpha-L-iduronidasa purificada con contaminantes de un proceso de producción/purificación anterior no publicado (Solicitud de patente US nº de serie 09/078.209 y nº 09/170.977) al que se hace referencia como el procedimiento Carson en los carriles 2 (7,5 microgramos de \alpha-L-iduronidasa) y 3 (5,0 microgramos de \alpha-L-iduronidasa), se comparan con los del proceso de producción/purificación de la presente invención, al que se hace referencia como el proceso Galli (carril 4, 5 microgramos de \alpha-L-iduronidasa). El carril 1 contiene el marcador del peso molecular. La Figura 2 muestra que el procedimiento Galli de producción/purificación de la presente invención produce un producto de \alpha-L-iduronidasa muy purificado con menos contaminantes, comparado con los anteriores esquemas de producción/purificación.

La Figura 3 demuestra el nivel de producción de la \alpha-L-iduronidasa durante un período de 30 días, durante el cual las células se cambiaron en el día 5 desde un medio que contenía suero a un medio sin suero. La producción de \alpha-L-iduronidasa se caracterizó por: (1) ausencia de la necesidad de adaptación, cuando las células se cambian desde un medio que contiene suero a uno que no lo contiene a 100200 (cuadros superior e inferior) con un aumento ininterrumpido en la productividad (cuadro superior); (2) un alto nivel de producción superior a 4 mg por litro (1000 por ml) en un medio sin proteínas (cuadro inferior); y (3) una potenciación en la producción de la a-iduronidasa con eventos de inducción de butirato (cuadro inferior).

La Figura 4 demuestra una disminución en el volumen hepático durante la terapia enzimática en pacientes MPS I.

La Figura 5 demuestra la excreción urinaria de GAG durante la terapia enzimática.

La Figura 6 demuestra la extensión del codo y de la rodilla en HACOO2 durante la terapia enzimática.

La Figura 7 demuestra la flexión del hombro a las 104 semanas en cuatro pacientes con la máxima restricción, durante la terapia enzimática.

La Figura 8 demuestra la mejoría en la apnea del sueño antes y después de seis semanas de terapia.

La Figura 9 demuestra la mejoría en las apneas e hipoapneas durante el sueño, con la terapia enzimática en cada paciente individual.

La Figura 10 demuestra la mejoría en los ensayos de función pulmonar antes y después de 12 y 52 semanas de terapia enzimática e en un paciente.

La Figura 11 demuestra un aumento en la velocidad del crecimiento en altura con la terapia enzimática.

La Figura 12 muestra el grado de contaminación por la proteína Ovárica del Hámster Chino (CHOP) y el grado de pureza de la \alpha-L-iduronidasa, producida por (1) el procedimiento Carson, un proceso de purificación/producción anterior no publicado (Solicitud de Patente US nº de serie 09/078.209 y 09/170.977 y (2) el procedimiento Galli, el proceso de purificación/producción de la presente invención. Así, la Figura 12 muestra que la \alpha-L-iduronidasa producida y purificada mediante el procedimiento galli posee un grado más alto de pureza y un grado menor de contaminación CHOP en comparación con el del procedimiento Carson.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, la presente invención caracteriza un procedimiento para producir \alpha-L-iduronidasa en cantidades que permiten utilizar terapéuticamente la enzima. En general, el procedimiento se refiere a la transformación de una progenie celular apropiada con el ADNc que codifica la totalidad de la \alpha-L-iduronidasa o de un fragmento biológicamente activo o de un mutante suyo. Los expertos en la técnica pueden preparar constructos de expresión distintos que los descritos expresamente en la presente memoria para la producción óptima de la \alpha-L-iduronidasa en progenies celulares apropiadas transfectadas a continuación. Además, los expertos en la técnica pueden fácilmente diseñar fragmentos de ADNc que codifiquen fragmentos biológicamente activos y mutantes de la \alpha-L-iduronidasa que se encuentra naturalmente que posean la misma o una actividad biológica similar que la enzima de longitud completa que se encuentra de modo natural.

Para crear una fuente recombinante para la \alpha-L-iduronidasa, pueden construirse grandes series de vectores de expresión y ensayarlos respecto a la expresión de un ADNc de la \alpha-L-iduronidasa. Basándose en experimentos de transfección transitoria, así como de transfecciones estables, puede identificarse un constructo de expresión que proporcione un nivel particularmente alto de expresión. En una forma de realización de la presente invención, una progenie celular 2.131 de un hámster chino desarrollada mediante transfección del constructo de expresión de la \alpha-L-iduronidasa y la selección de un clon de alta expresión, proporciona un nivel de expresión particularmente alto. Dicha progenie celular del hámster chino según esta forma de realización de la presente invención, puede secretar alrededor de 5.000 a 7.000 veces más \alpha-L-iduronidasa que lo normal. La \alpha-L-Iduronidasa producida de ese modo, puede procesarse adecuadamente, absorberse en las células con una alta afinidad, siendo correctora para las células deficitarias en \alpha-L-iduronidasa, tal como las de los pacientes que padecen el síndrome de Hurler.

El procedimiento para producir \alpha-L-iduronidasa en cantidades que permitan utilizar la enzima terapéuticamente, se refiere a un proceso de producción diseñado específicamente para producir en masa la enzima de tipo comercial, en el que la calidad de la enzima se ha considerado aceptable por las autoridades reguladoras de varios países para administrarla al ser humano. La producción a gran escala de la enzima de tipo comercial necesita modificaciones en la escala del cultivo celular, sistemas de microtransporte, y un esquema de purificación. En formas de realización preferidas, la escala de cultivo celular aumenta desde 45 litros a 110 litros o más, con un cambio para la perfusión continua. El aumento en la escala es necesario para producir suficiente material para la producción potencial a gran escala, para una utilización en el paciente a largo plazo. Según formas de realización preferidas de dicho proceso, los microportadores se utilizan como una superficie escalable de bajo coste sobre la que crecen células adherentes. En formas de realización particularmente preferidas, tales microportadores son macroporosos y están compuestos específicamente de hidratos de carbono modificados, tales como celulosa, por ejemplo, perlas Cytopore fabricadas por Pharmacia. Los microportadores de celulosa macroporosa permiten la mejoría de la unión celular y proporcionan un área superficial más grande para la unión, que se espera produzca un aumento en la densidad celular durante el proceso del cultivo. Se espera que altas densidades celulares aumenten la productividad. En formas de realización preferidas, las columnas de heparina-Sepharose y de Sephacryl 200 son reemplazadas con Azul-Sepharose y columnas de quelantes de cobre para aumentar la capacidad del proceso de purificación a gran escala y mejorar la pureza del producto. En una forma de realización particularmente preferida, la columna quelante del cobre se utiliza para reducir los contaminantes proteicos celulares ováricos del hasmter chino a niveles muy bajos, apropiados para la distribución a gran escala. Utilizando formas de realización del presente procedimiento que lleva a cabo modificaciones y la inducción que se describe más adelante, pueden producirse aproximadamente 15 mg por litro de cultivo por día, o más cuando se alcanza la máxima densidad del cultivo, empezando con un sistema de cultivo de 110 litros.

Según otras formas de realización preferidas del procedimiento para producir \alpha-L-iduronidasa según la presente invención, se optimiza un sistema de cultivo. En una primera forma de realización, el pH del cultivo se disminuye hasta 6,5-7,0 aproximadamente, preferentemente hasta 6,7-7,0 aproximadamente durante el proceso de producción. Una ventaja de dicho pH es que potencia la acumulación de enzimas lisosómicas que son más estables a pHs ácidos. En una segunda forma de realización, pueden cambiarse durante cada 24 horas, mediante perfusión continua, tanto como entre 2 y 3,5 volúmenes del cultivo del medio. Una ventaja de este procedimiento es potenciar la velocidad de secreción de la \alpha-L-iduronidasa recombinante y capturar más enzima activa. En una tercera forma de realización, la saturación del oxígeno se optimiza en un 40% aproximadamente. En una cuarta forma de realización, se utilizan microportadores macroporosos con un 5% de suero aproximadamente en el medio, para producir una masa celular, seguido por un rápido cambio de lavado a un medio sin proteínas para la producción (Figura 3). En una quinta forma de realización, un medio de crecimiento sin proteínas, tal como un producto PF-CHO de JRH Biosciencies, puede optimizarse para incluir cantidades suplementarias de uno o más ingredientes seleccionados del grupo formado por glutamato, aspartato, glicina, ribonucleósidos, y desoxiribonucleósidos. En una sexta forma de realización, pueden cambiarse durante cada período de 24 horas mediante perfusión continua entre 2 y 3,5 volúmenes de cultivo del medio. Dicha proceso de inducción puede proporcionar alrededor de un aumento doble en la producción sin alterar significativamente el procesamiento postraduccional.

Formas de realización preferidas del procedimiento para producir \alpha-L-iduronidasa según la presente invención caracterizan uno, más de uno, o todas las optimizaciones descritas en la presente memoria y pueden utilizarse tal como se describen más edetalladamente a continuación. El procedimiento de producción de la presente invención puede, por tanto, proporcionar un procedimiento de cultivo de producción que presenta las siguientes características:

1. Un cultivo basado en microportadores que utilizan perlas microportadoras macroporosas fabricadas con celulosa modificada o un equivalente suyo, se utiliza preferentemente en matraces de cultivo a gran escala con agitación elevada o un equivalente suyo. La unión de las células a estas perlas puede obtenerse cultivando en un suero bovino fetal al 5%, añadido a DME/F12 (1:1) o en un medio sin proteínas, modificado con ingredientes que incluyen ribonucleósidos, desoxiribonucléosidos, piruvato, aminoácidos no esenciales, y HEPES. Después de alrededor de 3-6 días, en este medio, se comenzó un procedimiento de lavado en el que el medio sin proteínas reemplaza al medio que contiene suero a una velocidad de perfusión creciente que depende del contenido en glucosa y de las condiciones del cultivo. A continuación, y durante el período de cultivo restante, las células se cultivan en un medio sin proteínas. La utilización de un medio sin proteínas en la producción enzimática es beneficiosa para reducir el riesgo de exposición a la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) y de otros agentes biológicos infecciosos tales como virus, para los pacientes que estén siendo tratados con la enzima, en el que el riesgo de BSE o de otros agentes dañinos depende de la cuantía de la exposición potencial del suero. En estudios publicados anteriormente, los transportadores utilizados para que las células se desarrollaran, eran microportadores de gelatina bovina, utilizados en una cantidad de 1 g por litro o 100 veces la concentración del producto. La filtración del 1% de la proteína gelatina a partir de los microportadores representará una contaminación relativa del 100% y contribuye por tanto al riesgo del BSE. De este modo, los nuevos transportadores son dextrano o basados en celulosa, y están formados por hidratos de carbono y materiales no derivados de animales.

La Figura 3 muestra que las células crecen hasta cierta densidad en un medio que contiene suero al 5% y que se cambia entonces sin ninguna adaptación a un medio sin proteínas. La Figura 3 muestra específicamente que: 1) Las células sobreviven y continúan produciendo iduronidasa cuando cambian sin adaptación. Al contrario, otros estudios sugerirían que la adaptación a un medio sin proteínas es necesaria. En el procedimiento de la presente invención, la producción enzimática continua a niveles comparables al medio que contiene suero. 2) La \alpha-L-iduronidasa producida en un medio sin proteínas conserva un nivel de producción superior a 4 mg por litro o a 1.000 unidades por ml. 3) La \alpha-L-iduronidasa producida en un medio sin proteínas posee una alta absorción, indicando que el cambio en el medio, y, por tanto, un cambio en los hidratos de carbono que se suministran a las células, no afecta de modo adverso al carácter de alta captación de la enzima. Se produjeron y liberaron de esta forma ocho lotes de \alpha-L-iduronidasa, con un valor máximo medio de absorción menor que 2 nM en todos los lotes.

2. Las condiciones del cultivo se conservan preferentemente con un oxígeno disuelto del 40% de la saturación del aire, a un pH de 6,8-7,0 aproximadamente y a una temperatura de alrededor de 35-37ºC. Esto puede alcanzarse utilizando una unidad de control, controlando la unidad y sondas apropiadas, tales como las producidas por Applikon® o Mettler®. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que esto puede obtenerse fácilmente mediante sistemas de control equivalentes preparados por otros fabricantes. Una saturación del aire de alrededor de 40% conduce a una mejora en la secreción de \alpha-L-iduronidasa, aunque puede utilizarse una saturación del aire de hasta el 80%. Sin embargo, aumentos ulteriores en el oxígeno, por encima del 80%, hasta, por ejemplo, una saturación del aire del 90%, no proporcionan una potenciación significativa de la secreción. El oxígeno disuelto puede suministrarse mediante rociado continuo de oxígeno utilizando un tubo rociador grande abierto de 5 micras de acero inoxidable, o su equivalente. Un pH de 6,8-7,0 aproximadamente es óptimo para la acumulación de la enzima a \alpha-L-iduronidasa. La enzima es particularmente inestable a pHs no superiores a 7,0. Por debajo de un pH de alrededor de 6,7, la tasa de secreción puede disminuir, particularmente por debajo de un pH de alrededor de 6,5. El cultivo se conserva por tanto de modo óptimo entre un pH de alrededor de 6,8-7,0.

3. El medio de cultivo productor puede constituir una forma modificada del medio propietario disponible comercialmente de JRH Biosciences denominado Excell PF CHO. Este medio soporta niveles de secreción equivalentes a los del suero que utiliza una progenie celular, tal como la progenie celular 2.131. Puede ser modificado preferentemente para incluir un pH ácido de alrededor de 6,8-7,0 (I 0,1) y tamponado con HEPES a 7,5 mM o 15 mM. El medio puede contener entre 0,05 y 0,1% de Pluronics F-68 (BASF), un surfactante no iónico o un equivalente suyo que tiene la ventaja de proteger a las células de fuerzas de cizalla asociadas con el rociado. El medio puede contener además un suplemento que es importante para aumentar la productividad del medio respecto a otros medios sin proteínas que están actualmente disponibles. Los expertos en la técnica entenderán fácilmente que la selección del medio de cultivo puede optimizarse continuamente según las formas de realización comerciales particulares disponibles en pintos particulares en el tiempo. Dichos cambios no abarcan más que la experimentación de rutina y tienen la intención de formar `parte del alcance de la presente invención.

4. El medio de producción puede analizarse utilizando un analizador de aminoácidos que compare el medio empleado con el medio inicial. Dichos análisis han demostrado que la progenie celular 2.131 vacía un medio PF CHO estándar de glicina, glutamato y aspartato hasta un nivel de alrededor del 10% de la concentración inicial. La complementación de estos aminoácidos a niveles más altos puede dar lugar a una potenciación de la densidad del cultivo y a una productividad que puede conducir a un producción 2-3 veces más alta que la basal. Los expertos en la técnica apreciarán que otras progenies celulares dentro del alcance de la presente invención, pueden ser igualmente útiles para producir la \alpha-L-iduronidasa según este procedimiento. Por tanto, pueden requerirse más o menos nutrientes de complementación para optimizar el medio. Dichas optimizaciones tienen la intención de entrar a formar parte del alcance de la presente invención y pueden llevarse a la práctica sin una experimentación excesiva.

5. El medio puede complementarse con los cuatro ribonucleósidos y los cuatro desoxiribonucleósidos, cada uno en una cantidad de aproximadamente 10 mg/litro, para apoyar a la progenie celular deficitaria en dihidrofolato reductasa 2.131. Los expertos en la técnica apreciarán que otras progenies celulares que forman parte del alcance de la presente invención, pueden ser igualmente útiles para producir la \alpha-L-iduronidasa según este procedimiento. Por tanto, pueden requerirse más o menos ribonucleósidos y desoxiribonucleósidos para optimizar el medio, y pueden utilizarse fuentes alternativas de purinas y pirimidinas para la síntesis del ácido nucleico, tales como la hipoxantina y la timidina. Dichas optimizaciones tienen la intención de entrar a formar parte del alcance de la presente invención, y pueden llevarse a la práctica sin una experimentación excesiva.

6. Después de alcanzar la confluencia a los 3-6 días aproximadamente del cultivo, se inició un tasa creciente de perfusión continua. Puede llevarse a cabo un cambio en el medio, por ejemplo, utilizando un tubo alimentador inclinado construido y en posición para permitir la absorción del medio sin quitar los microportadores, incluso mientras el cultivo se agita. Bombeando hacia afuera el medio a través del tubo alimentador inclinado, los microportadores se fijan en el interior del cuerpo del tubo, dentro del cultivo y no se quitan de éste durante el cambio el medio. De esta manera, los microportadores con la masa celular se separan del subrenadante que contiene la enzima.

7. El rápido y frecuente recambio del medio se ha mostrado mediante estudios de productividad para dar lugar a una mejora en la recuperación total de la enzima a partir del cultivo celular. Un menor recambio del medio da lugar a una producción total menor de la enzima en base diaria. Utilizando la perfusión de 2-3,5 volúmenes del cultivo por día, las células se pueden mantener en condiciones excelentes con altos grados de viabilidad y un alto nivel de productividad.

8. La producción de \alpha-L-iduronidasa puede potenciarse utilizando la inducción de la expresión génica por el butirato sódico (Figura 3). Veinte lotes de \alpha-L-iduronidasa se produjeron utilizando la inducción del butirato a una concentración de 2 nM con 2/3 lavados cada 12 horas después de la inducción, y la reinducción cada 48 horas durante un período de producción de 21 días. En la Figura 3, las flechas verticales en la parte inferior indican los eventos de inducción
debidos al butirato. Cada inducción puso en marcha un aumento de la concentración de la \alpha-L-iduronidasa en el medio.

Estudios sistemáticos de una progenie celular 2.131 demostraron que alrededor de 2 mM de butirato pueden aplicarse y dan lugar a una inducción aproximadamente doble, o mayor de la producción enzimática, con efectos mínimos en el procesamiento de los hidratos de carbono. Asimismo, niveles más bajos de butirato no han mostrado producir la inducción, y niveles sustancialmente más altos pueden dar lugar a una inducción mayor, pero disminuyendo la afinidad de la enzima producida para las células de pacientes que padecen la deficiencia de \alpha-L-iduronidasa. La inducción por el butirato se llevó a cabo in vitro a una concentración de 2 mM durante 24 horas o a 5 mM, y una concentración utilizada más habitualmente dio lugar a absorciones superiores a 3 nM o 40 U/ml, o un promedio de tres veces el valor observado en los lotes de producción. Además, los tiempos habitualmente utilizados de 24 horas o más, y la concentración de 5 mM fueron tóxicos para las células productoras de la \alpha-L-iduronidasa, dando lugar a desprendimiento y pérdida de la masa celular.

Los resultados sugieren que la inducción doble o mayor da lugar a un procesamiento menor de los hidratos de carbono y menos adición de fosfato a la enzima, así como una toxicidad creciente. Con respecto al procesamiento de los hidratos de carbono y a la adición de los grupos fosfato, la importancia de la manosa-6-fosfato en la terapia de reemplazamiento enzimático está demostrada por las observaciones de que la eliminación del fosfato de dos enzimas lisosómicas, glucosidasa y galactosamina-4-sulfatasa conduce a una absorción disminuida (Van der Ploeg, et al., J. Clin. Invest. 87: 513-518 (1991); Crawley, et al., J. Clin. Inves. 97:1864-1873 (1996)). Además, la enzima con baja fosfatasa (Van Hove, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 65-70 (1996) necesita 1.000 unidades por ml para experimentos de absorción (cerca de las 100 veces utilizadas para la iduronidasa), requiriendo las dosis efectivas en los modelos animales 14 mg/kg, o 28 veces la dosis utilizada con la iduronidasa conteniendo cantidades altas de fosfato (Kikuchi, et al., J. Clin. Invest. 101:827-833 (1998)).

Un aspecto particularmente preferido del procedimiento de la invención, utiliza una adición de 2 mM butirato cada 48 horas al sistema de cultivo. Esta forma de realización da lugar aproximadamente a una doble inducción de la producción enzimática utilizando este procedimiento sin efecto significativo en la afinidad de absorción de la enzima (absorción de K de menos de 30 U/ml o 2,0 mM).

9. En formas de realización preferidas, la presente invención caracteriza una progenie celular ovárica recombinante del hámster chino tal como la progenie celular 2.131 que de forma estable y fiable produce cantidades de \alpha-L-iduronidasa. En formas de realización preferidas, la progenie celular puede contener más de una copia de un constructo de expresión que comprende un promotor CMV, un intrón Ca, un ADNc \alpha-L-iduronidasa humano, y una secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. En incluso más formas de realización preferidas, la progenie celular expresa la \alpha-L-iduronidasa en cantidades de por lo menos de alrededor de 20-40 microgramos por 10^{7} células por día en una forma de alta absorción, procesada apropiadamente, apropiada para la terapia de reemplazamiento enzimático. Según formas de realización preferidas de este aspecto de la invención, la progenie celular transfectada adaptada para producir la \alpha-L-iduronidasa en cantidades que permiten la utilización terapéutica de la enzima, posee una o más de las características siguientes:

1.

La progenie celular de las formas de realización preferidas se deriva de una progenie celular parental en la que las células se hacen pasar por un cultivo hasta que han adquirido un tamaño más pequeño y una tasa de crecimiento más rápida y hasta que se unen fácilmente a los substratos.

2.

La progenie celular de las formas de realización preferidas se transfecta con un vector de expresión que contiene un elemento potenciador/promotor del citomegalovirus, un intrón 5', formado por el intrón Ca murino entre los exones 2 y 3, un ADNc humano de alrededor de 2,2 kb de longitud, y un sitio de poliadenilación 3' de la hormona de crecimiento bovina. Este vector de expresión puede transfectarse en, por ejemplo, una proporción de 50 a 1 con cualquier vector de selección habitual apropiado, tal como pSV2NEO. El vector de selección pSV2NEO confiere a su vez resistencia a G418 en las células transfectadas con éxito. En formas de realización particularmente preferidas, se utiliza una proporción de alrededor de 50 a 1, pues esta proporción potencia la adquisición de múltiples inserciones del número de copias. Según una forma de realización en la que se proporciona la progenie celular 2.131 del ovario del hámster chino, existe por lo menos una copia del vector de expresión para la \alpha-L-iduronidasa. Dicha progenie celular ha demostrado la capacidad para producir grandes cantidades de la \alpha-L-iduronidasa humana (mínimo 20 microgramos por 10 millones de células por día). Formas de realización particularmente preferidas tales como la progenie celular 2.131 posee la capacidad para producir la enzima procesada apropiadamente que contiene oligosacáridos unidos a N que contienen cadenas altas de manosa modificadas con fosfato en la posición 6, en una cantidad suficiente para producir una enzima con una alta afinidad (absorción -K de menos de 3 nM).

3.

La enzima producida a partir de las progenies celulares de la presente invención, tales como una progenie celular 2.131 del ovario del hámster chino, es rápidamente asimilada en las células, elimina el almacenamiento de glucosaminoglicano y posee una vida media de alrededor de 5 días en las células de pacientes que padecen una deficiencia de la \alpha-L-iduronidasa.

4.

La progenie celular de las formas de realización preferida, tal como una progenie celular 2.131, se adapta a un cultivo a gran escala y produce establemente la \alpha-L-iduronidasa humana bajo estas condiciones. Las células de las formas preferidas de realización son capaces de crecer y secretar \alpha-L-iduronidasa a el pH ácido de alrededor de 6,6 a 7,0, al cual puede tener lugar la potenciación en la acumulación de \alpha-L-iduronidasa.

5.

Formas de realización particularmente preferidas de la progenie celular según la invención, tal como una progenie celular 2.131 son capaces de secretar la \alpha-L-iduronidasa a niveles que sobrepasan las 2.000 unidades por ml (8 mocrogramos por ml) que se recuperan dos veces al día o que sobrepasan 15 mg por litro del cultivo por día, utilizando un medio libre de proteínas especialmente formulado.

La producción de cantidades apropiadas de la \alpha-L-iduronidasa recombinante constituye un prerequisito crítico para los estudios en la estructura de la enzima, así como para la terapia de reemplazamiento enzimático. Las progenies celulares según la presente invención permiten la producción de cantidades significativas de la \alpha-L-iduronidasa recombinante que es procesada apropiadamente para la absorción. La sobreexpresión en las células ováricas del hámster chino (CHO) se ha descrito para otros tres enzimas lisosómicos, la a-galactosidasa (Ioannou, et al, J. Cell Biol. 119: 1137-1150 (1992)), iduronato 2-sulfatasa (Bielicki, et al, Biochem. J. 289: 241-246 (1993)), y N-acetilgalactosamina 4-sulfatasa (Amson et al, Biochem. J. 284:789-794 (1992), utilizando una variedad de promotores y, en un caso, la amplificación. La presente invención caracteriza una progenie celular CHO deficitaria en dihidrofolato-reductasa, pero según las formas de realización preferida de la invención, la amplificación no es necesaria. Además, la presente invención proporciona un alto nivel de expresión de la a-L iduronidasa utilizando el promotor/potenciador del gen temprano inmediato de CMV.

La presente invención caracteriza en formas de realización preferidas, un vector de expresión que comprende un elemento promotor/potenciador del citomegalovirus, un intrón del extremo 5' formado por el intrón C\alpha murino derivado del gen C\alpha de la inmunoglobulina murina de cadena larga entre los exones 2 y 3, un ADNc humano de alrededor de 2,2 kb de longitud, y un sitio de poliadenilación 3' de la hormona bovina de crecimiento. Este vector de expresión puede ser transfectado en, por ejemplo, una proporción de 50 a 1 con cualquier vector de selección habitual apropiado tal como pSV2NEO. El vector de selección pSV2NEO confiere a su vez resistencia a G418 en las células transfectadas con éxito. En formas de realización particularmente preferidas, se utiliza una proporción de alrededor de 50 a 1, vector de expresión a vector de seleción, pues esta proporción potencia la adquisición de múltiples inserciones del número de copias. Según una forma de realización en la que se proporciona la progenie celular 2.131 del ovario del hámster chino, existen por lo menos diez copias del vector de expresión para la \alpha-L-iduronidasa. Dicho constructo de expresión ha demostrado la capacidad para producir grandes cantidades de la \alpha-L-iduronidasa humana (mínimo 20 microgramos por 10 millones de células por día) en una progenie celular apropiada tal como la progenie celular 2.131 del ovario del hámster chino.

Los procedimientos de la presente invención producen una \alpha-L-iduronidasa sustancialmente pura que se procesa apropiadamente y en forma de alta absorción, apropiada para la terapia de reemplazamiento enzimático y efectiva en la terapia in vivo.

La actividad específica de la \alpha-L-iduronidasa según la presente invención supera aproximadamente las 200.000 unidades por milígramo de proteína. Preferentemente, supera aproximadamente las 240.000 unidades por milígramo de proteína, utilizando los procedimientos originales de ensayo para la actividad y la concentración proteica. Un nuevo ensayo validado para la misma enzima con unidades expresadas como micromoles por min, demuestra una actividad de 100 unidades/ml (intervalo de 70-130) y una concentración proteica por absorbancia a 280 nM de 0,7 mg/ml (0,6-0,8), con una actividad específica promedio de 143 unidades por mg. El peso molecular de la \alpha-L-iduronidasa de longitud total de la presente invención, es de alrededor de 82.000 daltons, que comprenden alrededor de 70.000 de aminoácidos y 12.000 de los hidratos de carbono. La enzima recombinante de la presente invención sufre endocitosis, más eficientemente incluso que lo que previamente se ha informado para una preparación parcialmente purificada de la enzima urinaria. La enzima recombinante según la presente invención es efectiva para reducir la acumulación del GAG marcado radioactivamente con S en los fibroblastos deficientes en \alpha-L-iduronidasa, indicando que se transporta a los lisosomas, el sitio del almacenamiento de GAG. La concentración notablemente baja de la \alpha-L-iduronidasa necesaria para dicha corrección (corrección máxima-media a 0,7 pM) puede ser muy importante para el éxito de la terapia de reemplazamiento enzimático.

El ADNc humano de la \alpha-L-iduronidasa predice una proteína de 653 aminoácidos y un peso molecular esperado de 70.000 daltons después de la fragmentación del péptido señal. La secuenciación amnoácida revela la alanina 26 en el extremo N, dando lugar a una proteína esperada de 629 aminoácidos. La \alpha-L-iduronidasa humana recombinante posee una histidina en posición 8 de la proteína madura. La secuencia proteica predicha comprende seis sitios potenciales de modificación de oligosacáridos unidos a N. Todos e estos pueden modificarse en la proteína recombinante. Se ha demostrado que el tercer y el sexto sitios contienen uno o más residuos de manosa 6-fosfato responsables de la alta absorción por afinidad en las células. El péptido siguiente corresponde a los aminoácidos 26-45 de la \alpha-L-iduronidasa humana recombinante, con una alanina N-terminal y la siguiente secuencia (SEC ID nº: 2):

ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala-arg-ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg

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La sobreexpresión de la \alpha-L-iduronidasa de la presente invención no da lugar a una secreción generalizada de otras enzimas lisosómicas que dependen del marcaje con manosa-6-P. La \alpha-L-iduronidasa recombinante secretada es similar, en muchos sentidos, a la enzima normal secretada. Su tamaño molecular, que en varias determinaciones se ha encontrado ser de 77, 82, 84 y 89 kDa, es comparable a 87 kDa, encontrado para el factor urinario de corrección (Barton et al, J. Biol. Chem. 246:7773-7779 (1971)), y a 76 kDa y 82 kDa, encontrados para la enzima secretada por fibroblastos humanos cultivados (Myerowitz, et al. J. Biol. Chem. 256:3044-3048 (1991); Taylor et al, Biochem J 274:263-268 (1991). Las diferencias en y entre los estudios se atribuyen a la falta de precisión de las mediciones. El patrón de procesamiento intracelular de la enzima recombinante, una disminución lenta en el tamaño molecular y la aparición eventual de una banda adicional más pequeña que 9 kDa es lo mismo que para la enzima de los fibroblastos humanos. Esta banda más rápida se produce debido a la fragmentación proteolítica de los aminoácidos 80 N-terminales.

La presente invención caracteriza un nuevo procedimiento para purificar la \alpha-L-iduronidasa. En formas de realización preferidas, la presente invención caracteriza un procedimiento para purificar la \alpha-L-iduronidasa recombinante que se ha optimizado para producir una purificación rápida y eficiente con resinas cromatográficas capaces de ser validadas y fáciles de cargar, lavar y eluir. El procedimiento de purificar la \alpha-L-iduronidasa de la presente invención implica una serie de etapas en columnas cromatográficas, que permiten la purificación con un alto rendimiento de la enzima, a partir del medio de producción libre de proteínas. Específicamente, las columnas de Concavalina A-Sepharose, de Heparina-Sepharose y de Sephacryl 200, se reemplazaron con las columnas de Azul-Sepharose y quelantes de cobre para aumentar la capacidad de un proceso de purificación a gran escala, para reducir filtraciones y mejorar la pureza del producto. La Concavalina A lectina se utiliza a menudo para unir la enzima en una etapa inicial de purificación en el estudio publicado anteriormente, y es una proteína lectina derivada de plantas. La Concavalina A se conoce por filtrarse a partir de las columnas y contaminar las preparaciones enzimáticas lisosómicas. Dicha filtración podría causar la activación de las células T en los pacientes tratados y por tanto, se considera inapropiada para la administración humana (Furbish, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 3560-3563 (1977). Así, en este esquema de purificación, se evita la utilización de Concavalina A. En un estudio previo, la \alpha-L-iduronidasa hepática humana no se pudo recuperar de columnas fenilo sin altas concentraciones de detergente de desnaturalización (Triton X100 al 1%). Por tanto, no se utilizó una columna fenilo en un esquema de purificación publicado de esta enzima (Clements, et al, Eur. J. Biochem 152:21-28 (1985). La enzima hepática endógena humana es altamente modificada en el interior de los lisosomas por las hidrolasas que eliminan los residuos de ácido siálico y de fosfato y las proteasas, que mellan a la enzima. Al contrario, la sobreexpresión de la \alpha-L-iruronidasa recombinante causa que el 50% de la enzima se secrete más que se transporte al lisosoma (Zhao, et al, J. Biol. Chem 272:22758-22765 (1997). Por tanto, la iduronidasa recombinante mostrará un despliegue completo de residuos de ácido siálico y de fosfato, que llevarán a un grado más alto de solubilidad acuosa y a una afinidad menor para la columna fenilo. El aumento de la hidrofilicidad permite que la enzima se eluya bajo condiciones no desnaturalizantes utilizando las soluciones bajas en sales de alrededor de 150-700 mM NaCl. Esta característica de la enzima recombinante permite que sea purificada en gran escala sin la utilización de detergentes.

La \alpha-L-iduronidasa recombinante que se sobreexpresa en una progenie celular del ovario del hámster chino (CHO), se ha purificado hasta casi homogeneidad, después de un proceso de cromatografía en columna en 3 fases. La primera columna implica una fase de cromatografía de afinidad utilizando Azul Sepharose 6 FF. El eluado Azul Sepharose 6FF se purifica entonces ulteriormente mediante otra fase de cromatografía de afinidad utilizando Sepharose FF quelante de cobre. El pulido final de la enzima altamente purificada se alcanza mediante la cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando Fenil Sepharose de Alta Resolución (HP). El rendimiento total oscila entre 45 y 55 por ciento y la pureza del producto final es superior al 99%. El proceso es resistente, reproducible, y escalable para una fabricación a gran escala. La enzima purificada se ha caracterizado respecto a su actividad enzimática utilizando un sustrato basado en la fluorescencia, y en su absorción funcional por las células fibroblásticas. La enzima se ha caracterizado, asimismo, por la especificidad del sustrato, perfiles de los hidratos de carbono, y perfiles del enfoque isoeléctrico
(IEF).

Formas de realización particularmente preferidas del procedimiento para purificar la \alpha-L-iduronidasa, según la presente invención, caracterizan más que una o la totalidad de las optimizaciones, según las formas de realización particulares siguientes. El procedimiento de purificación de la presente invención puede proporcionar, por tanto, una \alpha-L-iduronidasa que posea las características descritas en la presente memoria.

1

1. Ajuste de pH /Filtración: El pH del líquido recuperado y filtrado (HF) se ajusta a 5,3 con 1 M H_{3}PO_{4}, filtrándose entonces a través de un filtro de 0,45 µ (por ejemplo, Sartoclean, Sartorius).

2. Cromatografía con Azul Sepharose FF: Esta etapa de cromatografía de afinidad sirve para capturar iduronidasa para reducir el volumen y purificar la iduronidasa aproximadamente de siete a diez veces.

Capacidad de carga:	4 mg/ml (proteínas totales por ml de resina)
Tampón de equilibración:	10 mM NaPO_{4}, pH 5,3
Tampón de lavado:	400 mM NaCl, 10 mM NaPO_{4}, pH 5,3
Tampón de elución:	0,8 M NaCl, 10 mM NaPO_{4}, pH 5,3
Tampón de regeneración:	2 M NaCl,10 mM NaPO_{4}, pH 5,3
Campo de purificación:	7-10
Rendimiento:	70-85%

3. Cromatografía FF Sepharose de quelación de Cu++: La etapa de cromatografía de afinidad de quelación de Cu++ es muyefectiva para eliminar algunas proteínas CHO contaminantes La inclusión de glicerol al 10% en todos los tampones parece que es crucial para la recuperación cuantitativa de la iduronidasa.

Capacidad de carga:	2 mg/ml
Tampón de equilibración:	1 M NaCl, 25 mM NaAc, pH 6,0, glicerol al 10%
Tampón de lavado:	1 M NaCl, 25 mM NaAc, pH 4,0, Glicerol al 10%
Tampón de elución:	1 M NaCl, 25 mM NaAc, pH 3,7, Glicerol al 10%
Tampón de regeneración:	1 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 8,0
Campo de purificación:	2-5
Rendimiento:	80%

4. Cromatografía Fenil Sepharose HP: Fenil Sepharose se utiliza como la última etapa para purificar ulteriormente el producto, así como para reducir el colorante azul Cibacron residual filtrado y los iones de cobre pospuestos a partir de las columnas previas.

Capacidad de carga:	1 mg/ml
Tampón de equilibración:	2 M NaCl,10 mM NaPO_{4}, pH 5,7%
Tampón de lavado:	1,5 M NaCl,10 mM NaPO_{4}, pH 5,7,%
Tampón de elución:	0,7 M NaCl, 10 mM NaPO_{4}, pH 5,7,
Tampón de regeneración:	0 M NaCl, 10 mM NaPO_{4} pH 5,7
Campo de purificación:	1,5
Rendimiento:	90%

5. Ultrafiltración (UF)/Diafiltración (DF)/Formulación final: La iduronidasa purificada se concentró y diafiltró hasta una concentración final de 1 mg/ml en tampón de formulación (150 mM NaCl, 100 mM NaPO_{4}, pH 5,8), utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) (por ejemplo, Sartocon Slice de Sartorius). La enzima se esteriliza entonces filtrando a través de un filtro de 0,2 micras (por ejemplo, acetato de celulosa o polisulfona), rellenando con ella viales estériles.

6. Caracterización de la iduronidasa purificada: Análisis de la pureza enzimática utilizando SDS-PAGE teñido con Azul de Coomassie o Plata, llevando a cabo el análisis de transferencia Western. Análisis de la actividad enzimática utilizando como sustrato el 4 MU-sulfato. Análisis de la absorción funcional utilizando el ensayo de células fibroblásticas. Análisis de hidratos de carbono mediante FACE. Análisis de los perfiles IEF.

La enzima, purificada de esta forma, se mostró que contenía residuos de manosa-6-fosfato en cantidad suficiente en las posiciones 3 y 6 de los azúcares unidos a N, para dar lugar a una afinidad de absorción de la enzima menor de 30 unidades por ml (menos de 2 nM). La enzima es sustancialmente correctora para los trastornos del almacenamiento de los glicosaminoglicanos causados por la deficiente idorunidasa y posee una vida media biológica en el interior de las células de 5 días aproximadamente.

Esquemas anteriores de la purificación de la \alpha-L-iduronidasa (Kakkis et al, en Protein Expr. Purif, 5:225-232 (1994); Kakkis et al., Biochem. Mol. Med 58:156-167 (1996); solicitud de patente US, nº 09/078.209 y 09/170.977) produjeron grados de pureza entre el 90% y menos que el 99%, que no es óptimo para la administración humana a largo plazo (Véase la Figura 12). El tratamiento con la \alpha-L-iduronidasa recombinante humana con una pureza mínima del 97% se asoció con algunas reacciones clínicas, específicamente urticaria en 5 pacientes y activación del complemento en 4 pacientes. Todos los pacientes demostraron una reacción a una proteína que es un contaminante traza para la \alpha-L-iduronidasa. (Figura 2). A causa de que esta proteína existe tanto en el producto final como en el sobrenadante sin suero de la progenie celular CHO, la proteína extraña se origina muy probablemente de las células CHO. Las proteínas habituales que parecen activar la respuesta clínica alérgica son de aproximadamente 60k Daltons y de 50 Daltons respectivamente, que son demasiado pequeñas para ser iduronidasa humana recombinante. Cuatro pacientes desarrollaron una reacción inmune a la \alpha-L-iduronidasa por lo menos transitoriamente, así como a las proteínas de las células huéspedes del ovario del hámster chino. Está claro que aunque incluso la enzima utilizada para tratar a los pacientes esté altamente purificada, el grado de purificación es importante para reducir la respuesta inmune a los contaminantes. La Figura 2 (SDS-PAGE) y la Figura 12 (ensayo CHOP) demuestran que la \alpha-L-iduronidasa producida y purificada mediante el esquema de producción/purificación de la presente invención, posee un grado de pureza más alto y un grado más bajo de contaminación por CHOP en comparación con el de los procedimientos anteriores de producción/purificación. Así, una pureza superior al 97% es adecuada para el uso del paciente, siendo deseable y preferibles niveles más altos de pureza. Tal como se muestra en la Figura 12, el esquema optimizado de purificación describo anteriormente alcanza un grado de pureza que es superior a un 99% y reduce de forma importante las proteínas de las células huésped del ovario del hámster chino a menos del 1%, tal como se determina por el ensayo de la Proteína Ovárica del Hámster Chino (CHOP).

La \alpha-L-iduronidasa recombinante proporciona terapia de reemplazamiento enzimático en un modelo canino de MPS 1. Este modelo canino es deficitario en \alpha-L-iduronidasa, debido a una mutación genética y es similar al MPS I humano. A 11 perros se administró intravenosamente \alpha-L-iduronidasa apropiadamente procesada y purificada. En los perros tratados con dosis semanales entre 25.000 y 125.000 unidades por kg durante 0,5, 3, 6, ó 13 meses, la enzima se absorbió en diversos tejidos y disminuyó el almacenamiento lisosómico en muchos tejidos. El tratamiento a largo plazo de la enfermedad se asoció con una mejoría clínica en la rigidez de las articulaciones, conducta, pelaje, y crecimiento. Dosis más altas de la terapia (125.000 unidades por kg por semana) dieron lugar a una mejora en la eficacia, incluyendo la normalización de la excreción urinaria de GAG además de una mejoría clínica más rápida en el comportamiento, rigidez de las articulaciones y pelaje.

La terapia enzimática a dosis incluso más pequeñas de 25.000 unidades (0,1 mg/kg/semana) dio lugar a una distribución enzimática significativa a algunos tejidos, disminuyendo el almacenamiento de GAG. Si se continuaba durante 1 año, algunos efectos clínicos fueron evidentes en términos de aumento de la actividad, tamaño y apariencia saludable. La terapia con esta dosis no mejoró otros tejidos que constituyen sitios importantes para la enfermedad en esta entidad, tales como el cartílago y el cerebro. Dosis más altas de 125.000 unidades (0,5 mg/kg) administradas 5 veces durante dos semanas demuestran que puede obtenerse una mejoría en la penetración tisular, y que en tan poco tiempo como 2 semanas, se obtuvo un efecto terapéutico a este nivel tisular. Durante 15 meses, en dos perros, se han completado con este aumento de dosis. Estos perros MPS I muestran una mejoría clínica significativa y disminuciones sustanciales en la excreción urinaria de GAG, cerca de su intervalo normal. La terapia enzimática no ha mostrado toxicidad bioquímica o clínica significativas, salvo la reacción inmune controlada por las técnicas alteradas de administración. La terapia enzimática a su dosis semanal más alta es efectiva para mejorar algunas características clínicas de MPS I y disminuir el almacenamiento sin toxicidad significativa.

Pueden diseñarse vectores que contienen secuencias nucleótidas que codifican la \alpha-L-iduronidasa, de modo que proporcionen una expresión continua o regulada de la enzima. Además, el vector genético que codifica la enzima puede diseñarse de forma que se integre establemente en el genoma celular o sólo para estar presente de manera transitoria.

Habiendo descrito la invención, se ofrecen los ejemplos siguientes para ilustrar la invención, no mediante la vía de la limitación.

Ejemplo 1 Producción de \alpha-L-iduronidasa recombinante

Las técnicas estándar tales como las descritas por Sambrook, et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y. (1987)), pueden utilizarse para clonar ADNc que codifica la \alpha-L-iduronidasa humana. El ADNc de la \alpha-L-iduronidasa clonado previamente se subclonó en PRCCMV (InVitrogen) como un fragmento HindIII-XbaI a partir de un subclon bluescript KS. Se construyó un cassette intron derivado del intron Cot de la inmunoglobulina murina entre los exones 2 y 3, utilizando la amplificación PCR de las bases 788-1372 (Tucker et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:7684-7688 (1991) del clon pRIR14.5 (Kakkis, et al., Nucleic Acids Res. 16:7796 (1988)). El casette incluía 136 pares de bases del extremo 33' del exon 2 y 242 pares de bases del extremo 5' del exon 3, que permanecerían en el ADNc apropiadamente empalmado. No se encuentran secuencias ATG en la región codificante del casette intron. El casette intron se clonó en el sitio HindIII 5' del ADNc de la \alpha-L-iduronidasa. El neo gen se sometió a deleción mediante digestión con XhoI seguido por la recircularización del vector para obtener pCMVhldu.

Se descongeló un vial del banco celular de pruebas y se situó en tres matraces T225 en suplementos DME/F12 o PF-CHO, más FBS al 5% y 500 \mug/ml de G418. Después de 2-5 días, las células se pasaron, utilizando tripsina-EDTA, a un matraz centrifugador de 3 litros en el mismo medio durante 2-5 días. Las células se transfirieron entonces a dos matraces centrifugadores de 3 litros durante 2-5 días, seguido por 4 matraces centrifugadores de 8 litros durante 2-5 días. El inóculo de los matraces centrifugadores de 8 litros se añadió a dos bioreactores tanque Applikon® de 110 litros con agitación, con un volumen de trabajo de 80-90 litros. Se añadieron microportadores de celulosa macroporosa a 2 gramos por litro (160 gramos), con suplementos de PF-CHO o DME/F12, FBS al 5%, y 500 \mug/ml de G418 con un volumen final de 80-90 litros. E El matraz se agitó mediante una propulsión elevada con un agitador marino. El cultivo se monotorizó respecto a velocidad de agitación, temperatura, sondas de DO y PH, y el sistema de control Applikon® se controló conuna interfaz de PC. Los parámetros se controlaron en las posiciones de ajuste o intervalos de: 35-37º dependiendo de las condiciones del cultivo, 40% de saturación del aire, y pH de 6,95, utilizando un manto de calentamiento, un rociador de oxígeno y una bomba basal. El cultivo se incubó durante 3-5 días en cuyo tiempo el cultivo surgió de la fase logarítmica de crecimiento a 1-3 x 10^{6} células por ml. Por tanto, la perfusión se inició con una velocidad creciente con el medio PF-CHO (con modificaciones habituales, JHR Biosciences). Los primeros cuatro días de recuperación (intervalo de 3-5 días) se dejaron a un lado como "arrastre". La recuperación, por tanto, es el comienzo del procesamiento de la producción. La producción continua con cambios en el medio de volúmenes del cultivo del orden de entre 2 y 3,5 por día durante 20-36 días. El cultivo podía extenderse durante 40 días o más. El cultivo se controló continuamente respecto a la temperatura, pH y DO. La purificación de la enzima tuvo lugar tal como se ha descrito anteriormente. El medio de producción recuperado que contiene iduronidasa se acidificó entonces hasta pH 5,3 se filtró a través de un filtro de 0,2 micras y se purificó utilizando cromatografía de Azul-Sepharose. La enzima purificada a partir de múltiples rondas de cromatografía se juntó y se aplicó a una columna quelante de cobre y se eluyó con glicerol en el tampón a un pH de 3,7. La enzima se mantuvo a un pH ácido para inactivar virus potenciales. El eluado de la columna de cobre se ajustó entonces a un pH de 5,7 y 2 M NaCl y se cargó en la columna de efenil Sepharose. La enzima se eluyó a 0,7 M NaCl. Se concentró el eluado y se filtró en un tampón de formulación de 150 mM NaCl, 100 mM NaPO_{4}, pH 5,8. La enzima se filtró a través de un filtro de 40 nM para eliminar virus potenciales y el filtrado se ajustó a polisorbato 80 al 0,001%. Con la enzima formulada y esterilizada en su conjunto se rellenaron contenedores estériles de polietileno. La mayor parte de la enzima se filtró entonces y con ella se rellenaron viales de vidrio de tipo 1 de 5 cc, apropiados para formas farmacéuticas inyectables, se taponaron y se taparon.

Ejemplo 2

Para los bioreactores que utilizan suspensiones celulares únicas, la serie de siembras se prepara tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. La utilización de una única suspensión celular simplifica la preparación e inoculación del bioreactor. El bioreactor se inocula con células en medio DMEM/F12 (25% del volumen del reactor) y JRH 325 modificado (25% del volumen del reactor). A las 48 horas, se añade medio igual al 50% del volumen de trabajo del reactor. La perfusión (y la recuperación) se empieza cuando la densidad celular alcanza 1,0 e^{6} y el medio de perfusión es el mismo descrito antes.

Ejemplo 3

La administración intravenosa a corto plazo de \alpha-L-iduronidasa recombinante humana purificada a 9 perros y 6 gatos con MPS I ha mostrado una absorción significativa de una emzima en diversos tejidos, con una recuperación estimada del 50% o más en los tejidos 24 horas después de una dosis única. Aunque el hígado y el bazo absorben la cantidad más grande de las enzimas, y muestran la mejor mejoría en la patología, en muchos, pero no en todos los tejidos se ha observado mejoría en la patología y en el contenido de glucosaminoglicanos. En particular, el cartílago, el cerebro y las válvulas cardíacas no mostraron una mejoría significativa. La mejoría clínica se observó en un perro único con un tratamiento a largo plazo de 13 meses, pero otros estudios se han limitado a 6 meses o menos. Todos los perros y la mayoría de los gatos que recibieron la enzima humana recombinante desarrollaron anticuerpos respecto al producto humano. Los anticuerpos IgG son del tipo de activación del complemento (equivalentes probablemente a la IgG canina). Este fenómeno se observa también en por lo menos el 13% de los pacientes de Gaucher tratados con alglucerasa. Se ha observado proteinuria en un perro que puede relacionarse con la enfermedad de complejos inmunes. No se ha observado ningún otro efecto de los anticuerpos en los otros animales tratados. No se observó toxicidad específica en estudios de laboratorio clínico (contajes sanguíneos completos, electrolitos, BLJN/creatinina, enzimas hepáticos, análisis de orina), que han sido por otra parte normales.

La terapia enzimática a incluso dosis pequeñas de 25.000 unidades (0,1 mg/kg/semana) dio lugar a una distribución enzimática significativa para algunos tejidos y descensos en el almacenamiento de GAG. Si se continuaba durante 1 año, se evidenciaron efectos clínicos significativos de la terapia, en términos de actividad, tamaño y apariencia completa de salud. La terapia con esta dosis no mejoró otros tejidos que son sitios importantes para la enfermedad, como el cartílago y el cerebro. Dosis más altas que 125.000 unidades (0,5 mg/kg) administradas 5 veces durante dos semanas, demostraron que puede alcanzarse una mejoría en la penetración tisular, obteniéndose en un tiempo tan corto como 2 semanas un efecto terapéutico a nivel tisular. Durante seis meses hasta la fecha, se llevaron a cabo estudios con este aumento de dosis en dos perros. Estos perros MPS I muestran una significativa mejoría clínica y disminuciones sustanciales en la excreción urinaria de GAG en el intervalo normal. La terapia enzimática, aparte de una reacción inmune controlada por técnicas alteradas de administración, no ha mostrado una toxicidad clínica o bioquímica significativa. la terapia enzimática en su dosis semanal más alta, es efectiva para mejorar algunas características clínicas de MPS I y disminuir el almacenamiento sin una toxicidad significativa.

Los resultados de estos diversos estudios en los perros con MPS I y en un estudio en gatos con MPS I, muestran que la \alpha-L-iduronidasa recombinante humana es segura. Aunque estos mismos resultados proporcionan razones para pensar que esta enzima recombinante sería efectiva para tratar la deficiencia en \alpha-L-iduronidasa, no pronostican los beneficios clínicos o los riesgos inmunológicos potenciales de la terapia enzimática en el hombre.

Ejemplo 4

El ADNc humano de la \alpha-L-iduronidasa pronostica una proteína de 653 aminoácidos y peso molecular esperado de 70.000 daltons después de la escisión del péptido señal. La secuenciación aminoácida revela la alanina 26 en el extremo N, dando lugar a una proteína esperada de 629 aminoácidos. La \alpha-L-iduronidasa recombinante humana tiene una histidina en la posición 8 de la proteína madura. La secuencia proteica pronosticada comprende seis sitios potenciales de modificación del oligosacárido unido a N. Todos estos sitios son modificados en la proteína recombinante. Se ha demostrado que el tercer y el sexto sitios contienen uno o más residuos de manosa 6-fosfato, responsables de la absorción de alta afinidad en las células.

Este péptido corresponde a los aminoácidos 26-45 de la \alpha-L-hirudinasa recombinante humana con una alanina N-terminal y la secuencia siguiente (SEC ID nº 2):

ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala-arg-ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg

La enzima recombinante posee un peso molecular aparente de 82.000 daltons en SDS-PAGE, debido a las modificaciones de los hidratos de carbono. La \alpha-L-iduronidasa recombinante humana purificada se ha secuenciado por el Servicio de Secuenciación proteica de UCLA. Se prefiere administrar la enzima recombinante de forma intravenosa. La \alpha-L-iduronidasa recombinante humana se administró para ensayos clínicos en viales de polipropileno de 10 ml a una concentración de 100.000-200.000 unidades por ml. La forma final de dosificación de la enzima que se utilizó en el ensayo clínico incluye \alpha-L-iduronidasa recombinante humana, solución salina normal, y tampón de 100 mM fosfato a pH 5,8. Estos se preparan en un recipiente de solución salina normal. Se añadió polisorbato 80 a una concentración final de 0,001 a la formulación, para estabilizar la proteína contra su fragmentación, evitando por tanto la precipitación en los viales del producto acabado.

Formulación final del vial que se utiliza habitualmente

Componente	Composición
\alpha-L-iduronidasa	Diana a 0,7 mg/ml o 100 (nuevas) unidades por ml.
solución de cloruro sódico	150 mM
tampón de fosfato sódico	100 mM, pH 5,8
polisorbato 80	0,001%

Forma final de dosificación utilizada en el tratamiento de los pacientes

Componente	Composición
\alpha-L-iduronidasa	dilución de 5-12 veces de la concentración del vial
solución de cloruro sódico	tampón de 50 mM fosfato sódico 100-250 cc bolsa intravenosa
albúmina humana	1 mg/ml

Ejemplo 5 Efectos de la administración intravenosa de \alpha-L-iduronidasa en pacientes con mucopolisacaridosis I

Basándose en estudios de clonación del ADNc que codifica la \alpha-L-iduronidasa (Scott, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9695-99 (1991); Stoltzfus, et al, J. Biol. Chem. 267:6570-75 (1992)) y los estudios animales que muestran los efectos de la \alpha-L-iduronidasa para reducir el almacenamiento lisosómico en muchos tejidos (Shull, et al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 91:12937-41 (1994); Kakkis, et al. Biochem. Mol. Med. 58:156-67 (1996)), se realizó un estudio de 52 semanas para evaluar la seguridad y la eficacia clínica de la administración intravenosa de \alpha-L-iduronidasa altamente purificada en diez pacientes con mucopolisacaridosis I (MPS I).

La \alpha-L-iduronidasa humana recombinante se produjo y purificó en un porcentaje superior al 97-99%. Los pacientes demostraban manifestaciones clínicas típicas del trastorno y el diagnóstico se confirmó mediante determinación bioquímica de la deficiencia de la \alpha-L-iduronidasa en los leucocitos.

Se administró intravenosamente a los pacientes la \alpha-L-iduronidasa humana recombinante (diluida en solución salina normal con albúmina sérica humana al 0,1%), a una dosis de 125.000 unidades por kg (utilizando el ensayo original y la definición de unidad);se administraron 3.000 unidades por kg durante la primera hora, y 61.000 unidades por kg en cada una de las dos horas siguientes. La dosis de 125.000 unidades por kg es equivalente a 100 unidades SI por kg utilizando el nuevo ensayo. Las infusiones se prolongaron hasta 4-6 horas en pacientes que presentaban reacciones de hipersensibilidad.

Con valores basales y a las 6, 12, 26 y 52 semanas, dependiendo de la evaluación, los pacientes experimentaron exámenes que incluían la historia, examen físico por especialistas, ecocardiografía, EKG, MRI, polisomnografía (semanas 0 y 26), examen del esqueleto (semanas 0, 26, 52), intervalo de mediciones del movimiento, fotografías corneales, y biopsia de la piel (semana 0) para establecer cultivos de fibroblastos para la determinación enzimática y genotipado. El ámbito de mediciones del movimiento se llevó a cabo con un goniómetro y para cada movimiento, se registró el máximo ámbito activo (iniciado por el paciente). La flexión del hombro es movimiento del codo anteriormente del lado del cuerpo y la extensión del codo y de la rodilla representan el estiramiento de la articulación. Los grados de restricción representan la diferencia entre el ámbito máximo normal de movimiento para la edad y el valor medido. La polisomnografía se llevó a cabo según las normas de la American Thoracic Society y los eventos apneicos (cese del flujo oro-nasal durante 10 segundos o más), los eventos hipopneicos (disminución del flujo oro-nasal en un 50% o más con una desaturación del 2% o más, o evidencia de despertar), los minutos (transcurridos) con una saturación del 89% de oxígeno, y tiempo total de sueño, se registraron entre las mediciones estándar requeridas. A partir de estos datos se calculó un índice apnea/hipopnea dividiendo el número total de eventos apneicos e hipopneicos por el número de horas de sueño. Los estudios bioquímicos incluyeron la medida de la actividad enzimática en los leucocitos y raspados de la mucosa bucal, niveles de glucosaminoglicano urinario y los ensayos para los anticuerpos séricos para la \alpha-L-iduronidasa (ELISA y transferencia Western). Los volúmenes de órganos se determinaron mediante análisis de datos de la imagen digital MRI utilizando un software de puesto de trabajo de Advantage Windows de General Electric. El volumen orgánico se midió en mililitros y se convirtió a peso considerando una densidad de 1 gramo por ml. La excreción de glucosaminoglicano urinario se ensayó mediante una adaptación del procedimiento publicado. Las transferencias Western y los ensayos ELISA para los anticuerpos para la \alpha-L-iduronidasa se llevaron a cabo mediante procedimientos estándar. Los ácidos urónicos y el N-sulfato de los glucosaminoglicanos urinarios se analizaron mediante los procedimientos del orcinol, carbazol o MBTH, y mediante separaciones electroforéticas.

Todos los pacientes recibieron semanalmente infusiones de \alpha-L-iduronidasa humana recombinante administrada durante 52 semanas. La actividad promedio de la \alpha-L-iduronidasa en los leucocitos fue de 0,04 unidades por mg antes del tratamiento y cuando se midió 7 días de promedio después de una infusión (es decir, inmediatamente antes de la próxima infusión), de 4,98 unidades por mg, o un porcentaje del 15,0% de lo normal. la actividad enzimática no pudo detectarse en los raspados bucales antes del tratamiento, pero 7 días después de las infusiones, alcanzó un nivel del 1% de lo normal.

El volumen hepático disminuyó entre un 19 y un 37 por ciento a partir del valor basal en 9 pacientes y un 5% en un paciente a las 52 semanas;la disminución promedio fue del 25,0% (n = 10, p< 0,001). A las 26 semanas, el tamaño del hígado era normal para el peso corporal y la edad en 8 pacientes (Figura 1). En 2pacientes (pacientes 6 y 9), con el tamaño hepático relativo más voluminoso en valores basales, el tamaño hepático estaba cerca de lo normal a las 52 semanas (3,2 y 3,3 por ciento de peso corporal, respectivamente). El tamaño del bazo disminuyó en 8 pacientes en un 13 al 42%, tomando como referencia los datos basales (disminución promedio de 20% en 10 pacientes, p<0,001). La excreción de glucosaminoglicano urinario disminuyó rápidamente en 3 a 4 semanas y en 8-12 semanas había bajado entre el 60 y el 80% del valor basal. A las 52 semanas, la reducción promedio era del 63% (intervalo 53-74; p<0,001). Ocho de diez pacientes presentaban una reducción del 75% o más de la cantidad basal de glucosaminoglicano urinario que excedía del límite superior de la cantidad normal para la edad. Los resultados se confirmaron mediante ensayo de ácidos urónicos y del N-sulfato (un ensayo específico para el heparan sulfato). Los estudios de electroforesis de la orina detectaron una reducción significativa en la excreción de heparan sulfato y dermatán sulfato,pero en todos los pacientes, persistió algún exceso en la excreción de dermatan sulfato.

La altura promedio aumentó 6,0 cm (5,2%) en 6 pacientes prepuberales (Tabla 2) y su velocidad promedio de crecimiento en altura aumentó desde 2,8 cm/año a 5,2 cm/año durante el tratamiento (p = 0,011). Para la totalidad de los 10 pacientes, el peso corporal promedio aumentó 3,2 kg (8,8%) y el aumento promedio fue de 4,2 kg (17,1%) para los 6 pacientes prepuberales (Tabla 2). En estos 6 pacientes, la velocidad promedio pretratamiento del peso aumentó desde 1,7 kg por año a 3,8 kg por año durante el tratamiento (p = 0,04).

La flexión de los hombros (moviendo el codo anteriormente) aumentó en 6 de 8 individuos que se evaluaron basalmente con una mejoría promedio para los hombros izquierdo y derecho de 28º y de 26º, respectivamente (p <0,002; Figura 2). La extensión del codo y la extensión de la rodilla aumentaron en una media de 7,0º (p <0,03) y 3,2º (p = 0,10), respectivamente, en los 10 pacientes (Figura 2).

El análisis de la mejoría en pacientes individuales reveló que las articulaciones más limitadas mostraban la mejoría más importante. Por ejemplo, en los valores basales, los pacientes 5,9 y 10 no podían flexionar sus hombros (mover anteriormente el codo) más allá de 100º, que aumentó entre el 21º y el 51º después del tratamiento. De modo similar, los pacientes 2 y 9 mostraron un aumento sustancial en la extensión de la rodilla. Los cambios en el ámbito del movimiento se acompañaron por un aumento en las actividades físicas informadas por el paciente, tales como ser capaz de lavarse la cabeza, sostener una hamburguesa normalmente, colgarse de las estructuras de barras para juegos infantiles, y practicar mejor deportes.

Siete pacientes mostraron una disminución en los sucesos apneicos e hipoapneicos desde 155 a 60 por noche, después del tratamiento (una disminución del 61%), con un cambio en el índice promedio apnea/hipoapnea (número total de eventos por hora) de 2,1 a 1,0. Tres pacientes mostraban apneas clínicamente significativas y todos mejoraron durante el tratamiento. En el paciente 2, el índice apnea/hipoapnea disminuyó desde 4,5 en los valores basales a 0,4 a las 26 semanas, y el tiempo total de desaturación del oxígeno disminuyó desde 48 minutos a 1 minuto por noche. El paciente 6 necesitaba por la noche una terapia continua de presión positiva de las vías aéreas antes del tratamiento, debido a una desaturación importante (61 minutos con una saturación inferior al 89% con una presión continua positiva de las vías aéreas en 368 minutos de sueño), pero a las 52 semanas, el paciente toleró el estudio del sueño sin CPAP, mostrando una desaturación inferior al 89% sólo 8 minutos durante 332 minutos de sueño. El paciente 9 mostraba un índice apnea/hipoapnea de 9,5 que disminuyó hasta 4,0 a las 26 semanas. El paciente 8 empeoró con un índice apnea hipoapnea de 0,1, que aumentó a 3,1 a las 26 semanas y a 9,3 a las 52 semanas, debido a causas que no estaban claras. Ocho de los diez pacientes o sus familias informaron de una mejoría en la respiración, y 5 de 7 mostraron una respiración nocturna más tranquila, una mejora en la calidad del sueño y una disminución en la somnolencia diurna.

La clasificación funcional de la New York Heart Association se determinó mediante entrevistas seriadas a los pacientes. La totalidad de los 10 pacientes informaron de una mejoría en una o dos clases, pero no se dieron datos objetivos significativos de estudios ecocardiográficos para verificar un beneficio cardíaco directo. Las clasificaciones de mejoría funcional pueden reflejar mejorías en otros aspectos de la enfermedad MPS I más que en la función cardíaca. Comparando los valores basales con los obtenidos a las 52 semanas de tratamiento, la ecocardiografía demostró una disminución en la insuficiencia tricuspídea o en la insuficiencia pulmonar en 4 pacientes, pero en dos (pacientes 2 y 7) mostraron un empeoramiento de la insuficiencia mitral. En los valores basales, el paciente 6 mostró aleteo auricular y síntomas clínicos de insuficiencia cardíaca incluyendo dísnea en reposo y edema periférico. A las 12 semanas, mostraba un ritmo sinusal normal con bloqueo de primer grado, resolviéndose su disnea en reposo y su edema con fóvea.

La totalidad de los 10 pacientes informaron de una falta de resistencia y de limitaciones en las actividades diarias antes del tratamiento, pero la tolerancia al ejercicio no se ensayó formalmente. Durante el tratamiento, todos los pacientes mejoraron y a las 26 semanas, muchos podía andar más, correr y hacer deporte. Los pacientes 3, 4 y 5 informaron de la resolución de dolores de cabeza incapacitantes después del tratamiento durante 6-12 semanas.

Varios pacientes informaron de una disminución en la fotofobia o de la irritación de la conjuntiva. La agudeza visual mejoró en un paciente (20/1000 a 20/200) en un ojo y modestamente en otros 2.

Los resultados de este estudio indican que la administración intravenosa de la \alpha-L-iduronidasa humana recombinante altamente purificada de la presente invención da lugar a una mejoría clínica y bioquímica en pacientes con Mucopolisacaridosis I. La normalización del tamaño hepático y la casi normalización de la e excreción urinaria de glucosaminoglicano está de acuerdo con los datos procedentes de estudios en perros con Mucopolisacaridosis I, que demostraron la eliminación del almacenamiento en el hígado y la disminución en la excreción urinaria de glucosaminoglicano en un tiempo tan corto como 2 semanas.

Las reacciones de hipersensibilidad a las infusiones de la \alpha-L-iduronidasa humana recombinante dieron menos graves que lo pronosticado por los estudios en perros. Aunque importante en algunos pacientes, la urticaria recurrente se pudo controlar con premedicación y ajustes en la velocidad de infusión. Los anticuerpos específicos a la \alpha-L-iduronidasa se detectaron en 4 pacientes con una activación del complemento habitualmente subclínica, y tanto los anticuerpos como la activación del complemento disminuyeron con el tiempo. Respuestas inmunes similares mediadas por IgG se han constatado previamente en pacientes con la enfermedad de Gaucher tratados con glucocerebrosidasa, aunque los sucesos fueron más frecuentes en nuestros pacientes. Los pacientes de Mucopolisacaridosis I con un genotipo nulo pueden presentar una respuesta inmune mayor que la observada en estos 10 pacientes, ninguno de los cuales tenía ninguna.

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De este modo, la \alpha-L-iduronidasa humana recombinante puede reducir el almacenamiento lisosómico y mejora algunos aspectos de la enfermedad clínica de la Mucopolisacaridosis I.

La invención, y la forma y procedimiento de utilizarla, se describen ahora en tales términos exactos, concisos, claros y completos, que permitan a cualquier experto en la técnica al cual pertenece, llevarla a la práctica y utilizarla. Debe entenderse que lo anterior describe formas de realización preferidas de la presente invención y que pueden llevarse a cabo modificaciones sin alejarse del alcance de la presente invención, tal como se expone en las reivindicaciones. Para puntualizar de modo particular y reivindicar claramente el objeto que se considera como invención, las siguientes reivindicaciones finalizan la presente exposición.

Claims (19)

1. Procedimiento para purificar una enzima \alpha-L-iduronidasa recombinante o sus fragmentos biológicamente activos o sus mutantes, para igualar o superar una pureza del 99%, que comprende las etapas siguientes:

(a)

recuperar y filtrar el líquido obtenido de un cultivo de células transformadas con ácidos nucleicos que codifican dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante;

(b)

ajustar el pH del líquido a un pH ácido, seguido por filtración a través de un filtro comprendido entre 0,2 y 0,54 micras;

(c)

hacer pasar el líquido a través de una columna de azul sepharose FF para capturar dicha \alpha-L-iduronidasa;

(d)

hacer pasar el eluado a través de una columna de sepharose quelante de cobre para eliminar las proteínas contaminantes;

(e)

hacer pasar el eluado a través de una columna de fenil sepharose para reducir el colorante Cibacron azul residual filtrado y los iones de cobre transportados a partir de las columnas previas; y

(f)

concentrar y filtrar la \alpha-L-iduronidasa recombinante purificada eluída a partir de la misma.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha columna azul sepharose FF se utiliza para purificar dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante entre siete y diez veces.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende la utilización de glicerol al 10% en todos los tampones para aumentar la recuperación cuantitativa de dicha \alpha-L-iduronidasa o de sus fragmentos o mutantes.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha etapa de Sepharose quelante de cobre se lleva a cabo en una matriz Sepharose FF quelante de cobre.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha etapa de la columna de fenil sepharose se lleva a cabo en una matriz fenil-Sepharose de cromatografía de Alta Resolución.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante purificada o sus fragmentos o mutantes, posee una actividad específica superior a 240.000 unidades por miligramo de proteína.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante purificada o sus fragmentos o mutantes, comprende uno o más residuos de manosa-6-fosfato.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante purificada o sus fragmentos o mutantes, comprende un residuo de manosa-6-fosfato unido a la posición 3 y un residuo de manosa-6-fosfato unido a la posición 6.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante purificada o sus fragmentos o mutantes posee una vida media en el interior de una célula de 5 días aproximadamente.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho cultivo de células es un cultivo de células CHO.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho cultivo de células CHO es un cultivo de células CHO de la progenie 2.131.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichas células son cultivadas en un medio de cultivo libre de proteínas con un pH comprendido entre 6,8 y 7,0, suplementándose dicho medio con 7,6 mg/l de timidina, 13,6 mg/l de hipoxantina, 375 \mug/ml de G418 y suero bovino fetal al 5%.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dichas células crecen hasta confluencia a una densidad comprendida entre 2,0 x 10^{5} a 2,5 x 10^{5} células por ml.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho medio de dichas células en confluencia es recuperado mediante perfusión continua.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicha perfusión continua comprende el intercambio comprendido entre 2 a 3,5 volúmenes de cultivo de dicho medio cada 24 horas.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la producción de dicha \alpha-L-iduronidasa o sus fragmentos o mutantes, es potenciada suplementando dicho medio con butirato sódico durante 12 horas para inducir la expresión génica de dicha \alpha-L-iduronidasa o de sus fragmentos o mutantes.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho butirato sódico es eliminado de dicho medio 12 horas después de la inducción inicial con dicho butirato sódico.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicha producción de \alpha-L-iduronidasa recombinante o de sus fragmentos o mutantes, es reinducida con butirato sódico cada 48 horas durante un período de producción de proteínas de 21 días.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha \alpha-L-iduronidasa recombinante o sus fragmentos o mutantes comprende la secuencia aminoácida de los residuos 26 a 653 de SEC ID
nº: 2.

20 Procedimiento según la reivindicación 19, en el que la \alpha-L-iduronidasa recombinante es una \alpha-L-iduronidasa humana de SEC ID nº: 2.