BRPI0015533B1 - enzima alfa-l-iduronidase humana recombinante, composição farmacêutica compreendendo a mesma e método para sua purificação - Google Patents

Abstract

IDURONIDASE-ALFA-L RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA SUA PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO E MÉTODOS PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS CAUSADAS POR DEFICIÊNCIAS DA MESMA. A presente invenção provê uma iduronidase-alfa-L humana recombinante e fragmentos biologicamente ativos e mutantes da mesma, métodos para produzir e purificar, em grande escala, a enzima de iduronidase-alfa-L humana, recombinante e do tipo comercial bem como métodos para tratar certos distúrbios genéticos incluindo deficiência de iduronidase-alfa-L e mucopolissacaridose I (MPS I).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção pertence ao campo de biologia molecular, enzimologia, bioquímica e medicina clínica. Em particular, a presente invenção provê uma a-L-iduronidase recombinante humana, métodos de produção em grande escala e purificação de enzima de a-L-iduronidase recombinante humana do tipo comercial, e métodos para tratar certos distúrbios genéticos incluindo deficiência de a-L-iduronidase e mucopo- lissacaridose I (MPS I).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os carboidratos desempenham diversos papéis impor-tantes no funcionamento de organismos vivos. Além de seus papéis metabólicos, os carboidratos são componentes estruturais do corpo humano covalentemente ligados a inúmeras outras entidades como proteínas e lipídeos (denominados glico- conjugados). Por exemplo, os tecidos conectivos humanos e membranas celulares compreendem proteínas, carboidratos e uma matriz de proteoglicanos. A porção de carboidratos dessa matriz de proteoglicanos fornece propriedades importantes para a estrutura do corpo.

Uma deficiência genética da enzima a-L- iduronidase, lisossômica, de clivagem de carboidratos causa um distúrbio de armazenamento lisossômico conhecido como mu- copolissacaridose I (MPS I) (Neufeld e Muenzer, pág. 1565 - 1587, em The Metabolic Basis of Inherited Disease, Eds., C.R. Scriver, A.L. Beuadet, W.S. Sly, e D. Valle, McGraw- Hill, Nova York (1989)) . Em uma forma grave, MPS I é comu- mente conhecido como sindrome de Hurler e é associada a múltiplos problemas como retardo mental, turvação da córnea, características faciais grosseiras, doença cardíaca, doença respiratória, aumento de baço e fígado, hérnias e rigidez das articulações. Os pacientes que sofrem de síndrome de Hurler normalmente morrem antes dos 10 anos de idade. Em uma forma intermediária conhecida como síndrome de Hurler- Scheie, a função mental não é genericamente afetada de forma grave, porém problemas físicos podem levar à morte na faixa de adolescência até a faixa dos 20 anos. A síndrome de S- cheie é a forma mais branda de MPS I. É compatível com uma duração de vida normal, porém a rigidez das articulações, turvação da córnea e doença da válvula do coração causam problemas significativos.

Calcula-se a frequência de MPS I como sendo 1:100.000, de acordo com uma pesquisa em British Columbia, de todos os recém-nascidos (Lowry, e outros, Human Genetics 85: 389-390 (1990)) e 1:70.000 de acordo com um estudo da Irlanda (Nelson, Human Genetics 101: 355-358 (1990)). Parece não haver predileção étnica por esta doença. É provável que no mundo inteiro a doença seja subdiagnosticada porque o paciente morre de uma complicação antes do diagnóstico ser feito ou porque as formas mais brandas da síndrome podem ser confundidas com artrite ou totalmente não detectadas. O exame eficaz de recém-nascidos em relação a MPS I provavelmente encontraria alguns pacientes previamente não detectados.

Exceto por alguns pacientes que qualificam para transplante de medula óssea, não há terapia significativa disponível para todos os pacientes com MPS I. Hobbs e outros (Lancet 2: 709 - 712 (1981)) reportaram primeiramente que o transplante de medula óssea tratou com sucesso um paciente com síndrome de Hurler. Desde aquela época, estudos clínicos em vários centros de transplante mostraram melhora em doença física e diminuição ou estabilização de declínio de desenvolvimento se realizado no início. (Whitley, e outros, Am. J. Med. Genet. 46: 209-218 (1993); Vellodi, e outros, Arch. Dis. Child. 76: 92-99 (1997); Peters e outros, Blood 91: 2601-2608 (1998); Guffon, e outros, J. Pediatrics 133: 119 - 125 (1998)) . Contudo a morbidez e mortalidade significativas, e a necessidade de medula óssea em combinação, limita a utilidade de transplantes de medula óssea. Uma terapia alternativa disponível para todos os pacientes afetados forneceria um avanço importante no tratamento e controle dessa doença.

A terapia de substituição de enzima foi considerada uma terapia em potencial para MPS I após a descoberta de que cc-L-iduronidase pode corrigir o defeito enzimático em células Huler em cultura, porém o desenvolvimento de terapia humana tem sido tecnicamente não exeqüível até o presente momento. No processo corretivo, a enzima contendo um resíduo de manose-6-fosfato é absorvida em células através da endo- citose mediada por receptor e transportada para as lisosso- mas onde remove os substratos armazenados, heparan sulfato e dermatan sulfato. A aplicação dessa terapia em seres huma nos não foi previamente possível devido a fontes inadequadas de a-L-iduronidase em tecidos.

Para terapia com enzima de a-L-iduronidase em MPS I, uma fonte recombinante de enzima tem sido necessária para se obter suprimentos terapeuticamente suficientes da enzima. 0 cDNA para a enzima canina foi clonado em 1991 (Stoltzfus, e outros, J. Biol . Chem. 267: 6570 - 6575 (1992) e para a enzima humana no mesmo ano. (Scott, e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88: 9695-9699 (1991), Moskowitz, e outros, FASEB J 6: A77 (1992)) . Após a clonagem de cDNA para a-L- iduronidase, a produção de quantidades adequadas de a-L- iduronidase recombinante permitiu o estudo de terapia de substituição de enzimas em MPS I canino. (Kakkis, e outros, Protein Expr. Purif. 5; 225-232 (1994)). Os estudos de substituição de enzima no modelo MPS I canino demonstraram que a-L-iduronidase recombinante administrada por via intravenosa foi distribuída amplamente e reduziu armazenamento lisos- sômico de muitos tecidos. (Shull, e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91: 12937-12941 (1994); Kakkis e outros, Biochem. Mol. Med. 58: 156-167 (1996)).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção apresenta um método para produção em massa de a-L-iduronidase recombinante humana em quantidades de grande escala com pureza apropriada para permitir a produção em grande escala para uso a longo prazo da terapia de enzimas em pacientes. Em uma modalidade ampla, o método compreende a etapa de transfectar um cDNA codificando toda ou parte de uma a-L-iduronidase em uma célula adequada para a expressão da mesma. Em algumas modalidades, um cDNA codificando uma a-L-iduronidase completa é utilizada, preferivelmente uma a-L-iduronidase humana. Contudo, em outras modalidades, um cDNA codificando um fragmento biologicamente ativo ou mutante do mesmo pode ser utilizado. Especificamente, uma ou mais substituições de aminoá- cidos pode ser feita enquanto preserva ou aumenta a atividade biológica da enzima. Em outras modalidades preferidas, um vetor de expressão é utilizado para transferir o cDNA para uma célula ou linhagem de células adequada para expressão do mesmo. Em uma modalidade particularmente preferida, o cDNA é transfectado em uma célula de ovário de hamster Chinês para criar a linhagem de células 2.131. Ainda em outras modalidades preferidas, o procedimento de produção apresenta uma ou mais das seguintes características que demonstraram níveis de produção particularmente elevados: (a) o pH da cultura de crescimento de célula pode ser reduzido para aproximadamente 6,5 a 7,0, preferivelmente aproximadamente 6,8 - 7,0 durante o processo de produção, (b) tantos quantos 2 a 3,5 volumes de cultura do meio podem ser trocados durante cada período de 24 horas por perfusão contínua, (c) saturação de oxigênio pode ser otimizada até aproximadamente 40% porém pode ser tão elevada quanto 80%, (d) microportadores de celulose ma- croporosos com aproximadamente 5% de soro no meio inicial- mente, podem ser utilizados para produzir massa de células seguida por uma mudança de lavagem rápida para meio sem proteínas para produção, (c) um meio sem proteínas ou com baixo teor de proteínas como um produto PF-CHO de JRH Biosciences pode ser otimizado para incluir quantidades suplementares de um ou mais ingredientes selecionados do grupo que consiste em: glutamato, aspartato, glicina, ribonucleosídeos, e deso- xirribonucleosídeos; (f) uma cultura de suspensão em tanque agitado pode ser perfundida em um processo contínuo para produzir iduronidase.

Em um segundo aspecto, a presente invenção provê uma linhagem de células transfectada que apresenta a capacidade de produzir a-L-iduronidase em quantidades as quais permitem o uso da enzima terapeuticamente. Em modalidades preferidas, a presente invenção apresenta uma linhagem de células de ovário de hamster Chinês recombinante como a linhagem de células 2.131 que produz de forma estável e confiável quantidades de α-L-iduronidase as quais permitem o uso da enzima terapeuticamente. Em algumas modalidades preferidas, a linhagem de células pode conter mais de 1 cópia de uma construção de expressão. Em modalidades ainda mais preferidas, a linhagem de células expressa a-L-iduronidase recombinante em quantidades de pelo menos 20 microgramas por 107 células por dia.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção provê vetores novos adequados para produzir a-L-iduronidase em quantidades que permitem o uso da enzima terapeuticamente. Em modalidades preferidas, a presente invenção apresenta um vetor de expressão que compreende um elemento intensifica- dor/promotor de citomegalovírus, um íntron 5' consistindo em um íntron de Ca de murino, um cDNA codificando todo ou um fragmento ou mutante de uma a-L-iduronidase, e um local de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino 3' . Tam- bém, preferivelmente o cDNA codificando todo ou um fragmento ou mutante de uma a-L-iduronidase tem aproximadamente 2.2 kb em comprimento. Este vetor de expressão pode ser transfecta- do, por exemplo, em uma razão de 50 pra 1 com qualquer vetor de seleção comum apropriado como pSV2NEO, para aumentar inserções de cópias múltiplas. Alternativamente, a ampliação de gene pode ser utilizada para induzir inserções de cópias múltiplas.

Em um quarto aspecto, a presente invenção provê a- L-iduronidase nova produzida de acordo com os métodos da presente invenção e desse modo presente em quantidades que permitem o uso da enzima de forma terapêutica. A atividade específica da a-L-iduronidase de acordo com a presente in-venção excede 200.000 unidades por miligrama de proteína. Preferivelmente, excede aproximadamente 240.000 unidades por miligrama de proteína. 0 peso molecular da a-L-iduronidase da presente invenção é de aproximadamente 82.000 daltons, aproximadamente 70.000 daltons sendo aminoácidos, e aproxi-madamente 12.000 daltons sendo carboidratos.

Em um quinto aspecto, a presente invenção apresenta um método novo para purificar a-L-iduronidase. De acordo com uma primeira modalidade, uma massa de células pode ser cultivada em aproximadamente 5% de meio contendo soro, seguido por uma mudança para um meio de produção sem proteínas modificado sem nenhuma adaptação significativa para produzir um material de partida com atividade específica elevada, para purificação. Em uma modalidade preferida, um a cro- matografia de coluna de três etapas pode ser utilizada para purificar a enzima. Tal cromatografia de coluna de três etapas pode incluir o uso de uma cromatografia de sefarose azul FF, sefarose de quelação Cu++ e uma cromatografia de sefarose de fenila HP. Em outra modalidade preferida, uma etapa de tratamento de pB ácido é utilizado para inativar vírus em potencial sem prejudicar a enzima. Colunas de Concanavalina A-Sefarose, Heparina-Sefarose e Sephacryl 200 são removidas e colunas de quelação de cobre e Sefarose-Azul adicionadas para aumentar a capacidade do processo de purificação em grande escala, reduzir lixiviáveis indesejáveis inadequados para uso a longo prazo em pacientes e melhorar a pureza do produto.

Em um sexto aspecto, a presente invenção apresenta métodos novos de tratar doenças causadas todas ou em parte por uma deficiência em a-L-iduronidase. Em uma modalidade, este método apresenta a administração de uma a-L-iduronidase recombinante ou um fragmento biologicamente ativo ou mutante do mesmo individualmente ou em combinação com um portador farmaceuticamente adequado. Em outras modalidades, este método apresenta a transferência de um ácido nucléico codifi-cando toda ou parte de uma iduronidase-alfa-L para uma ou mais células hospedeiras in vivo. Modalidades preferidas incluem otimizar a dosagem para as necessidades do organismo a ser tratado, preferivelmente mamíferos ou seres humanos, a fim de melhorar efetivamente os sintomas da doença. Em modalidades preferidas, a doença é Mucopolissacaridose I (MPS I), sindrome de Hurler, sindrome de Hurler-Scheie ou sindro- me de Scheie.

Em um sétimo aspecto, a presente invenção apresenta novas composições farmacêuticas que compreendem a-L- iduronidase útil para tratar uma doença causada totalmente ou em parte por uma deficiência em a-L-iduronidase. Tais composições podem ser adequadas para administração em diversos modos como parenteral, tópica, intranasal, inalação ou administração oral. Compreendidas no escopo deste aspecto estão modalidades que apresentam seqüências de ácidos nu- cléicos codificando totalmente ou uma parte de uma a-L- iduronidase que pode ser administrada in vivo em células afetadas por uma deficiência de a-L-iduronidase.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 representa as seqüências de aminoácidos deduzidas e nucleotídeos de cDNA codificando a-L-iduronidase (SEQ ID NOS: 1 e 2) . São fornecidos nucleotídeos de 1 até 6200. Aminoácidos são fornecidos iniciando com a primeira metionina no quadro de leitura aberto.

A figura 2 representa os resultados de cursos de SDS-PAGE de eluato obtido de acordo com os procedimentos como descrito abaixo. 0 painel superior mostra os resultados de SDS-PAGE de a-L-iduronidase purificada (3 microgramas) e contaminantes do esquema de purificação/produção revelado em Kakkis, e outros, Protein Expr. Purif. 5: 225-232 (1994). No painel inferior, os resultados de SDS-PAGE de a-L- iduronidase purificada com contaminantes de um processo de purificação/produção anterior não publicado (pedido de pa- tente U.S. números de série 09/078.209 e 09/170.977) mencionado como o método de Carson nas Faixas 2 (7,5 microgramas de a-L-iduronidase) e Faixa 3 (5,0 microgramas de a-L- iduronidase) são comparados com aquele do processo de puri- 5 ficação/produção da presente invenção mencionado como o Processo Galli (Faixa 4 5 microgramas de a-L-iduronidase) . A faixa 1 contém o marcador de peso molecular. A figura 2 mostra que o método de produção/purificação Galli da presente invenção fornece um produto de a-L-iduronidase altamente pu- 10 rificado com menos contaminantes em comparação com os esque-mas de produção/purificação anteriores.

A figura 3 demonstra o nível de produção de a- iduronidase durante um período de 30 dias, durante cujo tempo as células são mudadas no 5o dia de um meio contendo soro 15 para um meio sem soro. A produção de a-iduronidase foi caracterizada por: 1 ausência de necessidade de adaptação quando as células são mudadas de meio contendo soro para sem soro em 100200 (painéis superior e inferior) com um aumento ininterrupto em produtividade (painel superior); 2 nível elevado de produção em excesso de 4 mg por litro (1000 por ml) em um meio sem proteínas (painel inferior) ; e 3 um reforço na produção de a-iduronidase com eventos de indução de butirato (painel inferior).

A figura 4 demonstra uma redução no volume do fí- 25 gado durante terapia com enzimas em pacientes com MPS I.

A figura 5 demonstra excreção urinária de GAG durante terapia com enzimas.

A figura 6 demonstra extensão de cotovelo e joelho em HAC002 durante terapia com enzimas.

A figura 7 demonstra flexão do ombro até 104 semanas em quatro pacientes com limitação máxima durante terapia com enzimas.

A figura 8 demonstra melhora em apnéia do sono antes e após seis semanas de terapia.

A figura 9 demonstra a melhora em apnéias e hipop- néias durante sono com terapia de enzimas em cada paciente individual.

A figura 10 demonstra a melhora em testes de função pulmonar antes e após 12 e 52 semanas de terapia com enzimas em um paciente.

A figura 11 demonstra velocidade de crescimento aumentado em altura com terapia de enzimas.

A figura 12 mostra o grau de contaminação por Proteína de Ovário de Hamster Chinês (CHOP) e grau de pureza de oc-L-iduronidase, produzido por 1 método de Carson, um processo de produção/purificação anterior não publicado (pedido de patente U.S. nos. de série 09/078.209 e 09.170.977 e 2 método de Galli, o processo de produção/purificação da presente invenção. Desse modo, a figura 12 mostra que cc-L- iduronidase produzida e purificada pelo método de Galli possui um grau mais elevado de pureza e grau mais baixo de contaminação por CHOP em comparação com aquele do método de Carson.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção apresenta um método para produzir a-L-iduronidase em quantidades que permitem o uso da enzima de forma terapêutica. Em geral, o método apresenta a transformação de uma linhagem de células adequada com o cDNA codificando toda a-L-iduronidase ou um fragmento biologicamente ativo ou mutante da mesma. Aqueles versados no estado da técnica podem preparar construções de expressão diferentes daquelas expressamente descritas aqui para produção ótima de a-L-iduronidase em linhagens de células adequadas transfectadas com a mesma. Adicionalmente, técnicos versados podem facilmente projetar fragmentos de cDNA codificando fragmentos biologicamente ativos e mutantes da a-L-iduronidase de ocorrência natural que possuem atividade biológica igual ou similar à enzima de comprimento total de ocorrência natural.

Para criar uma fonte recombinante para a-L- iduronidase, uma série grande de vetores de expressão pode ser construída e testada em relação à expressão de um cDNA de a-L-iduronidase. Com base em experimentos de transfecção transientes, bem como transfecções estáveis, uma construção de expressão pode ser identificada que fornece um nível de expressão particularmente elevado. Em uma modalidade da presente invenção, uma linhagem de células 2.131 de hamster Chinês desenvolvida por transfecção da construção de expressão de a-L-iduronidase e seleção para um clone de expressão elevada fornece expressão de nível particularmente elevado. Tal linhagem de células de hamster Chinês de acordo com esta modalidade da presente invenção pode secretar aproximadamente 5.000 a 7.000 vezes mais α-L-iduronidase do que normal. A a-L-iduronidase produzida desse modo pode ser adequadamente processada, absorvida em células com afinidade elevada e é corretiva em relação a células com deficiência de a-L- iduronidase, como aquelas de pacientes que sofrem da Sindrome de Hurler.

O método para produzir a-L-iduronidase em quantidades que permitem o uso da enzima de forma terapêutica, apresenta um processo de produção especificamente projetado para produção em massa de enzima do tipo comercial, em que a qualidade da enzima foi considerada aceitável para adminis-tração a seres humanos por autoridades reguladoras de vários países. A produção em grande escala de enzima do tipo comercial necessita de modificações na escala de cultura de células, em sistemas microportadores e no esquema de purificação. Em modalidades preferidas, a escala de cultura de células é aumentada de 45 litros para 110 ou mais litros, com uma mudança para perfusão contínua. 0 aumento em escala é necessário para produzir material suficiente para produção potencial em grande escala para uso a longo prazo em pacientes. de acordo com modalidades preferidas de tal processo, microportadores são utilizados como uma superfície graduável de baixo custo na qual crescem células aderentes. Em modali-dades particularmente preferidas, tais microportadores são macroporosos e são especificamente compostos de carboidratos modificados como celulose, por exemplo, contas de Cytopore fabricadas por Pharmacia. Microportadores de celulose ma- croporosos permitem fixação melhorada das células e fornecem maior área superficial para fixação, o que se espera que forneça uma densidade aumentada de células durante o processo de cultura. Espera-se que densidades mais altas de células aumentem a produtividade. Em modalidades preferidas, colunas de heparina-Sefarose e Sephacryl 2000 são substituídas por colunas de quelação de Cobre e Sefarose-Azul para aumentar a capacidade do processo de purificação em grande escala e melhorar a pureza do produto. Em uma modalidade particularmente preferida, a coluna de quelação de cobre é utilizada para reduzir contaminantes de proteínas de células de ovário de hamster Chinês a níveis muito baixos apropriados para distribuição em grande escala. Com o uso de modalidades do presente método apresentando modificações e indução descrito abaixo, pode-se produzir aproximadamente 15 mg por litro de cultura por dia, ou mais em densidade de cultivo de pico, iniciando com um sistema de cultura de 110 litros.

De acordo com outras modalidades preferidas do método para produzir oc-L-iduronidase de acordo com a presente invenção, um sistema de cultura é otimizado. Em uma primeira modalidade, o pH de cultura é reduzido para aproximadamente 6,5 a 7,0, preferivelmente a aproximadamente 6,7 7,0durante o processo de produção. Uma vantagem de tal pH é aumentar o acúmulo de enzimas lisossômicas que são mais estáveis em pH acídico. Em uma segunda modalidade, tantos quantos 2 a 3,5 volumes de cultura do meio podem ser mudados durante cada período de 24 horas por perfusão contínua. Uma vantagem deste procedimento é aumentar a taxa de secreção de α-L-iduronidase recombinante e capturar enzima mais ativa. Em uma terceira modalidade, saturação de oxigênio é otimizada em aproximadamente 40%. Em uma quarta modalidade, microportadores macroporosos com aproximadamente 5% de soro inicialmente no meio, são utilizados para produzir uma massa de células seguida por uma mudança de lavagem rápida para um meio sem proteína para produção (figura 3) . Em uma quinta modalidade, um meio de crescimento sem proteínas, como um produto PF-CHO da JRH Biosciences, pode ser otimizado para incluir quantidades suplementares de um ou mais ingredientes selecionados do grupo que consiste em: glutamato, aspartato, glicina, ribonucleosídeos e desoxirribonucleosídeos. Em uma sexta modalidade, tantos quantos 2 a 3,5 volumes de cultura do meio podem ser trocados durante cada período de 24 horas por perfusão contínua. Tal processo de indução pode fornecer um aumento de aproximadamente duas vezes em produção sem alterar significativamente o processamento pós-translação.

Modalidades particularmente preferidas do método para produzir a-L-iduronidase de acordo com a presente invenção apresentam uma, mais de uma ou todas as otimizações descritas aqui e podem ser empregadas como descrito em mais detalhes abaixo. O método de produção da presente invenção pode fornecer, portanto, um processo de cultura de produção tendo as seguintes características:

1. Uma cultura baseada em microportador utilizando contas de microportador macroporoso feitas de celulose modificada ou um equivalente da mesma é preferivelmente utilizado em frascos de cultura de grande escala com agitação sus- pensa ou um equivalente dos mesmos. A fixação de células a estas contas pode ser obtida por cultura em um soro bovino fetal a 5%, pode ser adicionado a DME/F12 1:1 ou um meio sem proteínas modificado com ingredientes incluindo ribonucleo- sídeos, desoxirribonucleosídeos, piruvato, aminoácidos não essenciais e HEPES. Após aproximadamente 3-6 dias nesse mei- o, um procedimento de lavagem é iniciado no qual o meio sem proteína substitui o meio contendo soro em uma taxa de per- fusão crescente dependendo do teor de glicose e da condição de cultura. Subsequentemente, e por todo o período de cultura restante, as células são cultivadas em um meio sem proteína. 0 uso de um meio sem proteína em produção de enzimas é vantajoso para reduzir o risco de exposição de encefalopatia espongiforme bovina (BSE) e outros agentes biológicos infecciosos como vírus para pacientes sendo tratados com a enzima, onde o risco de BSE ou outros agentes prejudiciais depende da quantidade de exposição potencial de soro. Em estudos publicados anteriores, os portadores utilizados para cultivar as células eram microportadores de gelatina bovina, utilizados em 1 grama por litro ou 100 vezes a concentração do produto. Lixiviação de 1% da proteína de gelatina dos microportadores representaria uma contaminação relativa de 100% e desse modo contribui para o risco de BSE. Desse modo, novos portadores são dextrano ou baseados em celulose e consistem em carboidratos, e materiais não derivados de animais . A figura 3 mostra que as células são cultivadas a uma densidade em meio contendo soro a 5% e a seguir mudadas sem nenhuma adaptação para um meio sem proteínas. A figura 3 mostra especificamente que: 1) as células sobrevivem e continua a produzir iduronidase quando mudadas sem adaptação. Em contraste, outros estudos sugeririam que é necessária a 5 adaptação a um meio sem proteínas. No método da presente invenção, a produção de enzimas continua em níveis comparáveis ao meio contendo soro. 2) oc-L-iduronidase produzida em um meio sem proteínas retém um nível de produção que excede 4 mg por litro ou 1.000 unidades por ml. 3) oc-L-iduronidase 10 produzido em um meio sem proteínas tem elevada absorção que indica que a mudança em meio e, consequentemente, uma mudança em carboidratos sendo alimentados para as células, não afeta adversamente o caráter de absorção elevada da enzima. Oito lotes de cc-L-iduronidase foram produzidos e liberados 15 desse modo com um valor meio máximo de absorção menor do que 2nM em todos os lotes.

2. As condições de cultura são preferivelmente mantidas em um oxigênio dissolvido de 40% de saturação de ar em um pH de aproximadamente 6,8-7,0 e em uma temperatura de 20 aproximadamente 35-37°C. Isto pode ser obtido utilizando uma unidade de controle, unidade de monitoração e sondas apropriadas como aquelas produzidas por Applikon® ou Mettler®. Contudo, técnicos versados prontamente reconhecerão que isto pode ser facilmente obtido por sistemas de controle equiva- 25 lentes produzidos por outros fabricantes. Uma saturação de ar de aproximadamente 40% resulta em secreção melhorada de cc-L-iduronidase até 80% de saturação de ar pode ser utilizada. Contudo, aumentos adicionais em oxigênio até, por exemplo, 90% de saturação de ar, não fornecem secreção significativamente aumentada acima de 80% de saturação de ar. O oxigênio dissolvido pode ser fornecido por pulverização intermitente ou contínua, de oxigênio, utilizando um pulverizador com abertura maior ou de aço inoxidável de 5 microns, ou equivalente do mesmo. Um pH de aproximadamente 6,8-7,0 é ideal para o acúmulo da enzima de a-L-iduronidase. A enzima é particularmente instável em pHs acima de aproximadamente 7,0. Abaixo de um pH de aproximadamente 6,7, a taxa de secreção pode diminuir, particularmente abaixo de um pH de aproximadamente 6,5. A cultura é portanto mantida de forma ideal entre um pH de aproximadamente 6,8-7,0.

3. O meio de cultura de produção pode ser uma forma modificada do meio de propriedade da JHR Bioscien- ces, comercialmente disponível, denominado Exceli PF CHO. Este meio suporta níveis de secreção equivalentes àquele de soro utilizando uma linhagem de células como a linhagem de células 2.131. Pode ser preferivelmente modificado para incluir um pH acídico de aproximadamente 6,8-7,0 (± 0,1), e tamponado com HEPES a 7,5 mM ou 15 mH. O meio pode conter 0,05 a 0,1% de Pluronics F-68 (BASF), um agente tensoativo não iônico ou um equivalente do mesmo que apresenta a vantagem de proteger as células contra folhas de cisalhamento associadas à pulverização. 0 meio pode conter ainda um suplemento de propriedade que é importante para aumentar a produtividade do meio em relação a outros meios sem proteínas que são atualmente disponíveis. Aqueles versados no estado da técnica compreenderão prontamente que a escolha de meio de cultura pode ser otimizada continuamente de acordo com modalidades comerciais específicas disponíveis em pontos específicos de tempo. Tais mudanças não abrangem mais do que experimentação de rotina e pretendem estar compreendidas no âmbito da presente invenção.

4. O meio de produção pode ser analisado utilizando um analisador de aminoácidos comparando meio usado com meio de partida. Tais análises demonstraram que a linhagem de células 2.131 esgota um meio PF CHO padrão de glicina, glutamato e aspartato a um nível em torno de 10% da concentração de partida. A suplementação desses aminoácidos até níveis mais elevados pode resultar em densidade e produtividade aumentadas de cultura que podem levar a uma produção 2- 3 vezes mais alta do que em linha de base. Técnicos versados reconhecerão que outras linhagens de células compreendidas no âmbito da presente invenção podem ser igualmente úteis para produzir cc-L-iduronidase de acordo com o presente método. Conseqüentemente, uma quantidade maior ou menor de nutrientes suplementares pode ser necessária para otimizar o meio. Tais otimizações pretendem estar compreendidas no âmbito da presente invenção e podem ser postas em prática sem experimentação indevida.

5. O meio pode ser suplementado com os quatro ri- bonucleosídeos e quatro desoxirribonucleosídeos cada um em aproximadamente 10 mg/litro para suportar a linhagem de células 2.131, deficiente em diidrofolato redutase. Técnicos versados reconhecerão que outras linhagens de células compreendidas no âmbito da presente invenção podem ser igual mente úteis para produzir a-L-iduronidase de acordo com o presente método. Consequentemente, uma quantidade maior ou menor de ribonucleosídeos e desoxirribonucleosídeos pode ser necessária para otimizar o meio, e fontes alternativas de purinas e pirmidinas para síntese de ácido nucléico podem ser utilizadas como hipoxantina e timidina. Tais otimizações pretendem estar compreendidas no âmbito da presente invenção e podem ser postas em prática sem experimentação indevida.

6. Após alcançar confluência em aproximadamente 3- 6 dias de cultura, uma taxa de aumento de perfusão contínua é iniciada. Uma mudança de meio pode ser realizada, por exemplo, utilizando um tubo de alimentação inclinado construído e posicionado para permitir absorção de meio sem remoção dos microportadores mesmo enquanto a cultura é agitada. Bombeando para fora meio através do tubo de alimentação inclinado, microportadores assentam dentro do corpo do tubo no interior da cultura e não são removidos da cultura durante a troca do meio. Desse modo, os microportadores com a massa de células são separados de sobrenadante contendo a enzima.

7. O movimento rápido e freqüente do meio foi mostrado por estudos de produtividade como resultando em coleta total melhorada de enzimas da cultura de células. Menos mo-vimento de meio resulta em menor produção total de enzimas em uma base diária. Com o uso da perfusão de 2-3,5 volumes de cultura por dia, as células podem ser mantidas em excelente condição com altos graus de viabilidade e nível elevado de produtividade.

8. A produção de cc-L-iduronidase pode ser aumentada pelo uso de indução por butirato de sódio de expressão de gene (figura 3). Vinte lotes de a-L-iduronidase foram produzidos utilizando indução por butirato em concentração 2nM com 2/3 lavagem a cada 12 horas após indução e nova indução a cada 48 horas por um período de produção de 21 dias. Na figura 3, as setas verticais na parte inferior indicam eventos de indução por butirato. Cada indução acionou um reforço em concentração de α-L-iduronidase no meio. Estudos sistemáticos de uma linhagem de células 2.131 demonstraram que aproximadamente 2 mM de butirato pode ser aplicado e resulta em aproximadamente uma indução de du-as ou mais vezes de produção de enzima com efeitos mínimos sobre o processamento de carboidratos. Níveis mais baixos de butirato não foram mostrados como tendo tão boa indução, e níveis substancialmente mais elevados podem resultar em indução mais elevada, porém diminuindo a afinidade da enzima produzida para células de pacientes que sofrem de deficiência de a-L-iduronidase. A indução por butirato realizada in vitro a 2mM por 24 horas ou 5 mM, uma concentração mais co- mumente utilizada resultou em absorções que excedem 3 nM ou 40 U/ml, ou uma média de três vezes o valor observado em lotes de produção. Além disso, os tempos comumente utilizados de 24 ou mais horas e concentração de 5 mM eram tóxicos para células produtoras de a-L-iduronidase e resultaram em desprendimento e perda de massa de células. Os resultados sugerem que indução de duas ou mais vezes resulta em menos processamento dos carboidratos e me- nosadição de fosfato à enzima, bem como aumento de toxicidade. Com relação ao processamento de carboidratos e a adição de grupos de fosfato, a importância de manose-6-fosfato em terapia de substituição de enzimas é demonstrada pelas observações de que a remoção do fosfato de duas enzimas li- sossômicas, glicosidase e galactosamina 4-sulfatase leva à absorção diminuída (Van de Ploeg, e outros, J. Clin. Invest. 87: 513-518 (1991); Crawley, e outros, J. Clin. Invest. 97: 1864-1873 (1996)). Além disso, enzima com baixo teor de fosfato (Van Hove, e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 65- 70 (1996) requer 1.000 unidades por ml para experimentos de absorção (quase 100 vezes utilizado para iduronidase) e doses eficazes em modelos de animal requerem 14 mg/kg, ou 28 vezes a dose utilizada com iduronidase contendo elevado teor de fosfato (Kikuchi, e outros, J. Clin. Invest. 101: 827-833 (1998)) . Um aspecto particularmente preferido do método invenção utiliza adição de 2 mM butirato a cada 48 horas ao sistema de cultura. Esta modalidade resulta em indução de aproximadamente duas vezes de produção de enzima utilizando este método sem efeito significativo sobre a afinidade de absorção da enzima (absorção-K menor do que 30 U/ml ou 2.0 mM) .

9. Em um segundo aspecto, a presente invenção pro vê uma linhagem de células transfectada, que possui a capacidade exclusiva de produzir a-L-iduronidase em quantidades, que permitem o uso terapêutico da enzima. Em modalidades preferidas, a presente invenção apresenta uma linhagem de células de ovário de hamster Chinês recombinante como a li- nhagem de células 2.131 que produz de forma estável e segura, quantidades de α-L-iduronidase. Em modalidades preferidas, a linhagem de células pode conter mais de 1 cópia de uma construção de expressão compreendendo um promotor de CMV, um íntron de Ca, um cDNA de a-L-iduronidase humana, e uma seqüência de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino. Em modalidades ainda mais preferidas, a linhagem de células expressa a-L-iduronidase em quantidades de pelo menos aproximadamente 20-40 microgramas por 107 células por dia em uma forma com absorção elevada, adequadamente processada apropriada para terapia de substituição de enzimas. De acordo com modalidades preferidas deste aspecto da invenção, a linhagem de células transfectada adaptada para produzir a- L-iduronidase em quantidades que permitem o uso da enzima de forma terapêutica, possui uma ou mais das seguintes características :

1. A linhagem de células de modalidades preferidas é derivada de uma linhagem de células-mãe onde as células são passadas em cultura até que tenham adquirido um tamanho menor e taxa de crescimento mais rápida e até que se fixem facilmente a substratos.

2. A linhagem de células de modalidades preferidas é transfectada com um vetor de expressão contendo o elemento intensificador/promotor de citomegalovírus, um íntron 5' consistindo em íntron de Ca de murino entre os exons 2 e 3, um cDNA humano com aproximadamente 2,2 kb em comprimento, e um local de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino 3'. Este vetor de expressão pode ser transfectado, por exem- pio, em uma razão de 50 para 1 com qualquer vetor de seleção comum apropriado como pSV2NEO. 0 vetor de seleção pSV2NEO por sua vez confere resistência G418 em células transfecta- das com sucesso. Em modalidades particularmente preferidas, uma razão de aproximadamente 50 para 1 é utilizada uma vez que esta razão aumenta a aquisição de múltiplas inserções de número de cópia. De acordo com uma modalidade onde a linhagem de células 2.131 de ovário de hamster Chinês é fornecida, há pelo menos 1 cópia do vetor de expressão para a-L- iduronidase. Tal linhagem de células demonstrou a capacidade de se produzir grandes quantidades de a-L-iduronidase humana (mínimo de 20 microgramas por 10 milhões de células por dia). Modalidades particularmente preferidas como a linhagem de células 2.131 possuem a capacidade de produzir enzima adequadamente processada que contém oligossacarídeos liga- dos-N contendo cadeias com elevado teor de manose modificadas com fosfato na posição 5 em quantidade suficiente para produzir uma enzima com elevada afinidade (absorção-K menor do que 3 nM).

3. A enzima produzida das linhagens de células da presente invenção como a linhagem de células 2.131 de ovário de hamster Chinês é rapidamente assimilada nas células, elimina armazenagem de glicosaminoglicano e tem uma meia-vida de aproximadamente 5 dias em células de pacientes que sofrem de deficiência de a-L-iduronidase.

4. A linhagem de células de modalidades preferidas como a linhagem de células 2.131 adapta-se a cultura em grande escala e produz estavelmente a-L-iduronidase huma na sob estas condições. As células de modalidades preferidas são capazes de crescer e secretar α-L-iduronidase no pH ácido de aproximadamente 6,6 a 7,0 no qual pode ocorrer acúmulo aumentado de a-L-iduronidase.

5. Modalidades particularmente preferidas da linhagem de células de acordo com a invenção, como a linhagem de células 2.131 são capazes de secretar a-L-iduronidase humano em níveis que excedem 2.000 unidades por ml (8 micro- gramas por ml) colhidas duas vezes por dia ou que excedem 15 mg por litro de cultura por dia utilizando um meio sem proteína especialmente formulado.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção provê vetores novos adequados para produzir a-L-iduronidase em quantidades que permitem o uso terapêutico da enzima. A produção de quantidades adequadas de a-L-iduronidase recombinante é um pré-requisito crítico para estudos sobre a estrutura da enzima bem como para terapia de substituição de enzimas. As linhagens de células de acordo com a presente invenção permitem a produção de quantidades significativas de a-L-iduronidase recombinante que é adequadamente processada para absorção. A expressão em excesso em células de ovário de hamster Chinês (CHO) foi descrita por três outras enzimas lisossômicas, a-galactosidase (loannou, e outros, J. Cell. Biol. 119: 1137-1150 (1992)), iduronato 2-sulfatase (Bieli- cki, e outros, Biochem. J. 289: 241 - 246 (1993)), e N- acetilgalactosamine 4-sulfatase (Amson, e outros, Biochem. J. 284: 789-794 (1992)), utilizando uma variedade de promotores e, em um caso, ampliação. A presente invenção apresen- ta uma linhagem de células CHO com deficiência de diidrofo- lato redutase, porém de acordo com modalidades preferidas da invenção a ampliação é desnecessária. Adicionalmente, a presente invenção provê um nível elevado de expressão da a-L- 5 iduronidase humana utilizando o intensificador/promotor de gene inicial imediato de CMV.

A presente invenção apresenta em modalidades preferidas, um vetor de expressão que compreende um elemento intensificador/promotor de citomegalovírus, um íntron 5' 10 consistindo no íntron Ca de murino derivado do gene Ca de imunoglobulina de cadeia longa de murino entre exons 2 e 3, um cDNA humano com aproximadamente 2,2 kb em comprimento, e um local de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino 3'. Este vetor de expressão pode ser transfectado, por exem- 15 pio, em uma razão de 50 para 1 com qualquer vetor de seleção comum apropriado como pSV2NEO. O vetor de seleção como pSN2NEO por sua vez confere resistência G418 em células transfectadas com sucesso. Em modalidades particularmente preferidas, uma razão de aproximadamente 50 para 1 de vetor 20 de expressão para vetor de seleção é utilizada uma vez que esta razão aumenta a aquisição de múltiplas inserções de número de cópia. De acordo com uma modalidade onde a linhagem de células 2.131 de ovário de hamster Chinês é fornecida, há aproximadamente 10 cópias do vetor de expressão para a-L- 25 iduronidase. Tal construção de expressão demonstrou a capacidade de produzir quantidades grandes de a-L-iduronidase humana (mínimo de 20 microgramas por 10 milhões de células por dia) em uma linhagem de células adequada como uma linhagem de células 2.131 de ovário de hamster Chinês.

Em um quarto aspecto, a presente invenção provê a- L-iduronidase nova produzida de acordo com os métodos da presente invenção e desse modo presente em quantidades que permitem o uso terapêutico da enzima. Os métodos da presente invenção produzem uma a-L-iduronidase substancialmente pura que é adequadamente processada e em forma de absorção elevada, apropriada para terapia de substituição de enzimas e eficaz em terapia in vivo.

A atividade específica da a-L-iduronidase de acordo com a presente invenção excede aproximadamente 200.000 unidades por miligrama de proteína. Preferivelmente, excede aproximadamente 240.000 unidades por miligrama de proteína utilizando os métodos de ensaio originais para atividade e concentração de proteínas. Um ensaio validado novo para a mesma enzima com unidades expressas como micromoles por min. demonstra uma atividade de 100 unidades/ml (faixa de 70-130) e uma concentração de proteína por absorvência a 280 nM de 0,7 mg/ml (0,6 - 0,8) com uma atividade específica média de 143 unidades por mg. O peso molecular da a-L-iduronidase de comprimento total da presente invenção é de aproximadamente 82.000 daltons compreendendo aproximadamente 70.000 daltons de aminoácidos e 12.000 daltons de carboidratos. A enzima recombinante da presente invenção é passado por endocitose ainda mais eficientemente do que foi anteriormente reportado para uma preparação parcialmente purificada de enzima urinária. A enzima recombinante de acordo com a presente invenção é eficaz para reduzir o acúmulo de GAG S-rotulado radioativo em fibroblastos com deficiência de oc-L-iduronidase, indicando que é transportado para lisossomas, o local de armazenagem de GAG. A concentração notavelmente baixa de oc-L- iduronidase necessária para tal correção (correção meio- máxima a 0,7 pM) pode ser muito importante para o sucesso da terapia de substituição de enzima.

O cDNA humano de a-L-iduronidase prevê uma proteína de 653 aminoácidos e um peso molecular esperado de 70.000 daltons apôs divagem de peptídeo de sinal. O sequenciamento de aminoácidos revela alanina 26 no término-N fornecendo uma proteína esperada de 29 aminoácidos. a-L-iduronidase recom- binante humana tem uma Histidina na posição 8 da proteína madura. A sequência de proteína prevista compreende seis locais de modificação de oligossacarídeo ligados-N em potencial. Todos estes podem ser modificados na proteína recombi- nante. Os terceiro e sexto locais foram demonstrados como contendo um ou mais resíduos de manose 6-fosfato responsáveis por absorção de afinidade elevada em células. O peptídeo seguinte corresponde a aminoácidos 26-45 de a-L- iduronidase recombinante humana com uma alanina término-N e a seguinte seqüência (SEQ. ID NO. 2): ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala- arg-ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg

A expressão em excesso da a-L-iduronidase da presente invenção não resulta em secreção generalizada de outras enzimas lisossômicas que dependem de alvo manose-6-P. A a-L-iduronidase recombinante secretada é similar à enzima secretada normal em muitos aspectos. Seu tamanho molecular, encontrado em várias determinações como sendo 77, 82, 84, e 89 kDa, é comparável a 87 kDa, encontrado para fator de correção urinária (Barton e outros, J. Biol. Chem. 246: 7773 - 7779 (1971) ) e a 76 kDa e 82 kDa, encontrados para enzima secretada por fibroblastos humanos cultivados (Myerowitz, e outros, J. Biol. Chem. 256: 3044-3048 (1991); Taylor, e outros, Biochem. J 274: 263-268 (1991)). As diferenças compreendidas nos e entre os estudos são atribuídas à imprecisão das medições. O padrão de processamento intracelular da enzima recombinante, uma redução lenta em tamanho molecular e a aparição eventual de uma faixa adicional menor em 9 kDa é igual como para a enzima de fibroblasto humano. Esta faixa mais rápida surge por divagem proteolítica de 80 aminoácidos N-terminais.

Em um quinto aspecto, a presente invenção apresenta um método novo para purificar cc-L-iduronidase. Em modalidades preferidas, a presente invenção apresenta um método para purificar a-L-iduronidase recombinante que foi otimizada para produzir uma purificação rápida e eficiente com resinas de cromatografia de validação e fácil operação de carga, lavagem e eluição. 0 método de purificar a-L-iduronidase da presente invenção envolve uma série de tapas de cromatograf ia de coluna, que permitem purificação de rendimento elevado de enzima do meio de produção sem proteína. Especificamente, colunas de Concanavalina A-Sefarose, Heparina- Sefarose e Sephacryl 200 foram substituídas por colunas de Azul-Sefarose e de quelação de Cobre para aumentar a capaci- dade de um processo de purificação em grande escala, reduzir lixiviáveis e melhorar a pureza do produto. Lectina de Con- canavalina A é freqüentemente utilizada para ligar enzima em uma etapa de purificação inicial no estudo publicado anterior, e é uma lectina de proteína derivada de plantas. Conca- navalina A ê conhecida por lixiviar de colunas e contaminar preparados de enzimas lisossômicas. Tal lixiviação poderia causar ativação de células T em pacientes tratados e consequentemente é considerada inadequada para administração humana (Furbish, e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 35460-3563 (1977)). Desse modo, o uso de Concanavalina A é evitado no presente esquema de purificação. Em um estudo anterior, a a-L-iduronidase de fígado humano poderia não ser recuperada de colunas de fenila sem elevadas concentrações de desnaturação de detergente (1% Triton X100). Conseqüente- mente, uma coluna de fenila não foi utilizada em um esquema de purificação publicado desta enzima (Clements, e outros, Eur. J. Biochem. 152: 21-28 (1985) . A enzima de fígado humana endógena é altamente modificada dentro das lisossomas por hidrolases que removem ácido siálico e resíduos de fosfato e protease que entalham a enzima. Em contrate, a expressão em excesso de a-L-iduronidase recombinante faz com que 50% da enzima seja secretada em vez de transportada para a lisosso- ma (Zhao, e outros, J. Biol. Chem. 272: 22758-22765 (1997). Consequentemente, iduronidase recombinante terá um conjunto completo de ácido siálico e resíduos de fosfato, que levam a um grau mais elevado de solubilidade em água e afinidade mais baixa com a coluna de fenila. A hidrofilicidade aumen- tada permite que a enzima seja eluída sob condições de não- desnaturação utilizando as soluções com baixo teor de sal em torno de 150-700 mM de NaCl. Esta característica da enzima recombinante permite que a mesma seja purificada em grande escala sem o uso de detergentes. a-L-iduronidase recombinante expresso em excesso em uma linhagem de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), foi purificado até quase homogeneidade após um processo de cromatografia de coluna em 3 etapas. A primeira coluna envolve uma etapa de cromatografia de afinidade utilizando Azul Sefarose 6 FF. O eluato de Azul Sefarose 6 FF é a seguir purificado adicionalmente por outra etapa de cromatograf ia de afinidade utilizando Sefarose FF de Quelação Cu++. O polimento final da enzima altamente purificada é obtido por cromatografia de interação hidrofóbica utilizando Alto Desempenho de Sefarose Fenila (HP) . 0 rendimento total varia de 45 a 55 por cento e a pureza do produto final é > 99%. O processo é robusto, reprodutível e graduável para fabricação em grande escala. A enzima purificada foi caracterizada com relação a sua atividade enzimática utilizando um substrato baseado em fluorescência, e sua absorção funcional por células de fibroblasto. A enzima foi caracterizada também para especificidade de substrato, perfis de carboidratos, e perfis de focalização isoelétrica (IEF).

Modalidades particularmente preferidas do método para purificar a-L-iduronidase de acordo com a presente invenção apresentam mais de uma ou todas as otimizações de acordo com as seguintes modalidades específicas. O método de purificação da presente invenção pode fornecer portanto uma a-L-iduronidase a-L-iduronidase purificada tendo as características descritas aqui.

Esboço do Processo de Purificação de a-L- iduronidase Colher Líquido Ajustar pH para 5,3/0,2 μ de Filtração Cromatografia de Azul Sefarose FF Cromatografia de Sefarose FF de Quelação Cu+ + Cromatografia de Sefarose Fenil HP Formulação final/DF/UF

1. Filtração/ajuste de pH: O pH do fluido de coleta filtrado (HF) é ajustado para 5,3 com 1 M H3PO4 e a seguir filtrado através de um filtro de 0,45 μ (por exemplo Sartoclean, Sartorius).

2. Cromatografia de Azul Sefarose FF: Esta etapa de cromatografia de afinidade serve para capturar iduronidase a fim de reduzir o volume e purificar iduronidase aproximadamente de sete a dez vezes. Capacidade de carga: 4 mg/ml (total de proteína por ml de resina) Tampão de equilíbrio: 10 mM NaPO4, pH 5,3 Tampão de lavagem: 400 mM NaCl, 10 mM NaPO4, pH 5,3 Tampão de eluição: 0.8 M NaCl, 10 mM NaPO4, pH 5,3 Tampão de regeneração: 2 M NaCl, 10 mM NaP04, pH 5,3 Rendimento: 70-85%

3. Cromatografia de Sefarose FF de quelação Cu++: A etapa de cromatografia de afinidade de quelação Cu++ é muito eficaz para remover parte de proteínas CHO de contaminação. A inclusão de glicerol a 10% em todos os tampões parece ser crucial para a recuperação quantitativa de iduroni- dase. Capacidade de carga: 4 mg/ml (total de proteína por ml de resina) Tampão de equilíbrio: 10 mM NaPO4, pH 5,3 Tampão de lavagem: 400 mM NaCl, 10 mM NaPO4, pH 5,3 Tampão de eluição: 0.8 M NaCl, 10 mM NaPO4, pH 5,3 Tampão de regeneração: 2 M NaCl, 10 mM NaPO4, pH 5,3 vezes de purificação: 7-10 Rendimento: 70-85% Capacidade de carga: 2 mg/ml Tampão de equilíbrio: 1 mM NaCl, 2 5 mM NaAc, pH 6,0, glicerol a 10% Tampão de lavagem: 1 M NaCl, 2 5 mM NaAc, pH 4,0, glicerol a 10% Tampão de eluição: 1 M NaCl, 25 mM NaAc, pH 3,7, glicerol a 10% Tampão de regeneração: 1 M NaCl, 5 0 mM EDTA, pH 8,0 Rendimento: 8 0 %

4. Cromatografia de Sefarose Fenil HP: Sefarose fenil é utilizado como a última etapa para purificar adicionalmente o produto bem como reduzir corante azul Cibacron lixiviado residual e íon Cu++ transportado de colunas anteriores . Capacidade de carga: 1 mg/ml Tampão de equilíbrio: 2 M NaCl, 10 mM NaPO4 , pH 5,7 Tampão de lavagem: 1.5 M NaCl, 10 mM NaPO 4, pH 5,7 Tampão de eluição: 0.7 M NaCl, 10 mM NaPO 4, pH 5,7 Tampão de regeneração: 0 M NaCl, 10 mM NaPO4 , pH 5,7 vezes de purificação: 1,5 Rendimento: 90%

5. Formulação final/diafiltração (DF) / Ultrafil- tração (UF) : A iduronidase purificada é concentrada e dia- filtrada até uma concentração final de 1 mg/ml no tampão de formulação (150 mM NaCl, 100 mM NaPO4, pH 5,8) utilizando um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF) (por exemplo Sartocon Slice da Sartorius) . A enzima é esterilizada a seguir por filtração através de um filtro de 0,2 micron (por exemplo acetato de celulose ou polissulfona) e enchido em frascos estéreis.

6. Caracterização de Iduronidase purificada: A a- nálise de pureza de enzima utilizando SDS-PAGE colorido com Azul Coomassie ou Prata e análise de mancha ocidental. Análise de atividade enzimática utilizando 4UM-sulfato como substrato. Análise de absorção funcional utilizando ensaio de células de fibroblasto. Análise de carboidratos por FACE. Análise de perfis IEF.

A enzima purificada desse modo mostrou conter re-síduos de manose-6-fosfato de quantidade suficiente em posi-ções 3 e 6 dos açúcares ligados-N para fornecer a afinidade de absorção de enzima menor do que 30 unidades por ml (menos de 2 nM) de enzima. A enzima é substancialmente corretiva para distúrbios de armazenagem de glicosaminoglicano causados por deficiência de iduronidase e tem uma meia-vida dentro das células de aproximadamente 5 dias.

Antes dos esquemas de purificação de a-L- iduronidase (Kakkis, e outros, Protein Expr. Purif. 5: 225- 232 (1994); Kakkis, e outros, Biochem. Mol. Med. 58: 156-167 (1996); pedidos de patente U.S. nos. 09/078.209 e 09/170.977) produziram graus de pureza entre 90% e menos de 99%, o que não é ideal para administração humana a longo prazo (vide a tabela 1). (Estas e todas as outras patentes U.S. são especificamente incorporadas aqui como referência em sua totalidade). O tratamento com a-L-iduronidase recombinante humana com uma pureza mínima de 97% foi associada a algumas reações clínicas, especificamente urticária em 5 pacientes, e ativação de complemento em 4 pacientes. Todos os pacientes demonstraram uma reação a uma proteína que é con- taminante residual à a-L-iduronidase (figura 2). Como esta proteína existe tanto no produto final como no sobrenadante de linhagem de células CHO vazias sem soro, a proteína estranha se origina mais provavelmente da célula CHO. As proteínas comuns que parecem estar ativando a resposta alérgica clínica têm aproximadamente 60kDaltons e 50kDaltons respec-tivamente, que são demasiadamente pequenas para ser iduroni-dase humana recombinante. Quatro pacientes desenvolveram uma reação imune à a-L-iduronidase pelo menos de forma tran- 5 siente tão bem quanto às proteínas hospedeiras de células de ovário de hamster Chinês. É evidente que embora a enzima utilizada para tratar pacientes seja altamente purificada, o grau de purificação é importante para reduzir a resposta i- mune a contaminantes. A figura 2 (SDS-PAGE) e a tabela 1 10 (ensaio CHOP) demonstram que a-L-iduronidase produzido e pu-rificado pelo esquema de produção/purificação da presente invenção tem um grau mais elevado de pureza e grau mais baixo de contaminação por CHOP em comparação com aqueles dos métodos anteriores de produção/purificação. Desse modo, uma 15 pureza maior do que 97% é adequada para uso de paciente, níveis mais elevados de pureza são desejáveis e preferíveis.

Como mostrado na tabela 1, o esquema de purificação otimizado descrito acima obtém um grau de pureza que é maior do que 99% e reduz, de modo importante, as proteínas hospedeiras de 20 células de ovário de hamster Chinês a menos de 1 por cento, como determinado pelo ensaio de Proteína de Ovário de Hamster Chinês (CHOP).

Em um sexto aspecto, a presente invenção apresenta novos métodos de tratar doenças causadas todas ou em parte 25 por uma deficiência em a-L-iduronidase. a-L-iduronidase recombinante provê terapia de substituição de enzimas em um modelo canino de MPS 1. Este modelo canino é deficiente em a-L-iduronidase devido a uma mutação genética e é si- milar a MPS 1 humano. cc-L-iduronidase purificado, adequadamente processado foi administrado por via intravenosa em 11 cães. Nos cães tratados com doses semanais de 25.000 a 125.000 unidades por kg por 0,5 3, 6 ou 13 meses, a enzima foi absorvida em uma variedade de tecidos e diminuiu a armazenamento lisossômico em muitos tecidos. O tratamento a longo prazo da doença foi associado à melhora clínica em conduta, rigidez das articulações, pele e crescimento. Doses mais elevadas de terapia (125.000 unidades por kg por semana) resultam em melhor eficácia, incluindo normalização de excreção urinária de GAG além de melhora clínica mais rápida em conduta, rigidez das articulações e pele.

A terapia com enzimas em doses mesmo pequenas de 25.000 unidades (0,1 mg/kg/semana) resultou em distribuição significativa de enzimas para alguns tecidos e reduções em armazenagem de GAG. Se continuada por mais de 1 ano, alguns efeitos clínicos foram evidentes em termos de atividade aumentada, tamanho e aparência geral de saúde. A terapia nesta dose não melhorou outros tecidos que são locais importantes para doença nesta entidade como cartilagem e cérebro. Doses mais elevadas de 125.000 unidades (0,5 mg/kg) fornecidas 5 vezes durante duas semanas demonstram que pode-se obter penetração melhorada no tecido, e um efeito terapêutico no nível do tecido foi realizado em um período tão curto quanto 2 semanas. Os estudos nesta dose aumentada foram concluídos em dois cães por 15 meses. Estes cães com MPS I estão mostrando melhora clínica significativa e reduções substanciais em excreção urinária de GAG na faixa quase normal. Fora uma rea ção imune controlada por técnicas de administração alteradas, a terapia com enzimas não mostrou toxicidade bioquímica ou clínica significativa. A terapia com enzimas nesta dose semanal mais elevada é eficaz para melhorar algumas características clínicas de MPS I e reduzir armazenagem sem toxicidade significativa.

Em um sétimo aspecto, a presente invenção apresenta composições farmacêuticas novas compreendendo a-L- iduronidase humana útil para tratar uma deficiência em a-L- iduronidase. A enzima recombinante pode ser administrada em diversos modos como parenteral, tópico, intranasal, inalação ou administração oral. Outro aspecto da invenção é prover a administração da enzima formulando a mesma com um veículo farmaceuticamente aceitável, o qual pode ser sólido, semi- sólido, líquido ou uma cápsula para deglutição. Os exemplos de composições farmacêuticas incluem comprimidos, gotas como gotas nasais, composições para aplicação tópica como ungüen- tos, geleias, cremes e suspensões, aerossóis para inalação, pulverização nasal e lipossomas. Normalmente a enzima recombinante compreende entre 0,01 e 99% ou entre 0,01 e 99% em peso da composição, por exemplo, entre 0,01 e 20% para composições destinadas à injeção e entre 0,1 e 50% para composições destinadas à administração oral.

Para produzir composições farmacêuticas nesta forma de unidades de dosagem para aplicação oral contendo uma enzima terapêutica, a enzima pode ser misturada com um sólido, veículo pulverulento, por exemplo lactose, sacarose, sorbitol, manitol, um amido como amido de batata, amido de milho, amilopectina, pó laminaria ou pó de polpa cítrica, um derivado de celulose ou gelatina e também pode incluir lubrificantes como magnésio ou estearato de cálcio ou um Carbowax® ou outras ceras de polietileno glicol e comprimidos para formar comprimidos ou núcleos para drágeas. Se forem necessárias drágeas, os núcleos podem ser revestidos por e- xemplo com soluções de açúcar concentrado que podem conter goma arábica, talco e/ou dióxido de titânio, ou alternativamente com um agente formador de película dissolvido em solventes orgânicos facilmente voláteis ou misturas de solventes orgânicos. Corantes podem ser adicionados a estes revestimentos, por exemplo, para distinguir entre teores diferentes de sustância ativa. Para a composição de cápsulas de gelatina mole consistindo em gelatina e, por exemplo, glicerol como um plastificante, ou cápsulas fechadas similares, a substância ativa pode ser misturada com um Carbowax® ou um óleo adequado, por exemplo óleo de gergelim, óleo de oliva ou óleo araquis. Cápsulas de gelatina dura podem conter granulados da substância ativa com veículos pulverulentos, sólidos como lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos como amido de batata, amido de milho ou amilopectina, deri-vados de celulose ou gelatina, e também podem incluir estearato de magnésio ou ácido esteárico como lubrificantes.

Enzimas terapêuticas da presente invenção também podem ser administradas por via parenteral como por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa ou por implante subcutâneo de liberação contínua. Em injeção subcutânea, intramuscular e intravenosa, a enzima terapêutica (o ingre- diente ativo) pode ser dissolvido ou disperso em um veículo portador líquido. Para administração parenteral, o material ativo pode ser adequadamente misturado com um veículo aceitável, preferivelmente da variedade de óleo vegetal como um óleo de amendoim, óleo de semente de algodão e similar. Outros veículos parenterais como composições orgânicas utilizando solcetal, glicerol, formal e formulações parenterais aquosas também podem ser utilizados.

Para aplicação parenteral por injeção, as composições podem compreender uma solução aquosa de um sal farma- ceuticamente aceitável solúvel em água dos ácidos ativos de acordo com a invenção, desejavelmente em uma concentração de 0,01 - 10%, e opcionalmente também um agente estabilizador e/ou substâncias de tampão em solução aquosa. Unidades de dosagem da solução podem ser vantajosamente encerradas em ampolas.

Quando enzimas terapêuticas são administradas na forma de um implante subcutâneo, o composto é suspenso ou dissolvido em um material lentamente disperso conhecido daqueles versados no estado da técnica, ou administrado em um dispositivo que libera lentamente o material ativo através do uso de uma força de acionamento constante como uma bomba osmótica. Em tais casos, a administração durante um período prolongado de tempo é possível.

Para aplicação tópica, as composições farmacêuticas têm adequadamente a forma de um ungüento, gel, suspensão, creme ou similar. A quantidade de substância ativa pode variar, por exemplo, entre 0,05 - 20% em peso da substân cia ativa. Tais composições farmacêuticas para aplicação tópica podem ser preparadas em um modo conhecido pela mistura da substância ativa com materiais portadores conhecidos como isopropanol, glicerol, parafina, álcool de estearila, polietileno glicol, etc. 0 portador farmaceuticamente aceitável também pode incluir um promotor de absorção química conhecido. Os exemplos de promotores de absorção são, por exemplo, dimetilacetamida (patente U.S. no. 3.472.931), tri- cloro etanol ou trifluoroetanol (patente U.S. no. 3.891.757), certos álcoois e misturas dos mesmos (patente britânica no. 1.001.949). Um material portador para aplicação tópica à pele intata também é descrito no relatório de patente britânica no. 1.464.975, que revela um material portador consistindo em um solvente que compreende 40-70% (v/v) de isopropanol e 0-60% (v/v) de glicerol, o restante, caso haja, sendo um constituinte inerte de um diluente não excedendo 40% do volume total do solvente.

A dosagem na qual as composições farmacêuticas contendo enzima terapêutica são administradas pode variar em uma ampla faixa e dependerá de vários fatores como a gravidade da doença, a idade do paciente, etc., e pode ter de ser individualmente ajustada. Uma faixa possível para a quantidade de enzima terapêutica que pode ser administrada por dia é aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 2000 mg ou aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2000 mg.

As composições farmacêuticas contendo a enzima terapêutica podem ser adequadamente formuladas de modo que forneçam doses compreendidas nessas faixas, como unidades de dosagem única ou como unidades de múltiplas dosagens.

Além de conter uma enzima terapêutica (ou enzimas terapêuticas) , as presentes formulações podem conter um ou mais substratos ou co-fatores para a reação catalisada pela enzima terapêutica nas composições. As composições contendo enzimas terapêuticas também podem conter mais de uma enzima terapêutica.

A enzima recombinante empregada nos presentes mé todos e composições também pode ser administrada por meio de transformação de células do paciente com ácidos nucléicos que codificam a a-L-iduronidase recombinante. A sequência de ácidos nucléicos desse modo codificada pode ser incorporada em um vetor para transformação em células do indivíduo a ser tratado. Modalidades preferidas de tais vetores são aqui descritas. 0 vetor pode ser projetado de modo a integrar-se nos cromossomos do indivíduo, por exemplo, vetores retrevi rais, ou replicarem autonomamente nas células hospedeiras.

Vetores contendo codificação de seqüências de nucleotídeos de a-L-iduronidase podem ser projetados de modo a fornecer expressão contínua ou regulada da enzima. Adicionalmente, o vetor genético que codifica a enzima pode ser projetado de modo a integrar-se estavelmente no genoma da célula ou para estar presente apenas de modo transiente. A metodologia geral de terapia genética convencional pode ser aplicada a seqüências de polinucleotídeos que codificam a-L-iduronidase. Técnicas convencionais de terapia genética foram extensamente examinadas. (Friedman, Science 244: 1275-1281 (1989); Ledley, J. Inherit. Metab. Dis. 13: 587-616 (1990); To- soshev, e outros, Curr Opinions Biotech 1:55-61 (1990)) .

Um método particularmente preferido de administrar a enzima recombinante é por via intravenosa. Uma composição particularmente preferida compreende a-L-iduronidase recombinante, solução salina normal, tampão de fosfato para manter o pH em aproximadamente 5,8 e albumina humana. Esses ingredientes podem ser fornecidos nas seguintes quantidades : a-L-iduronidase 0,05 - 0,2 mg/ml ou 12.500 50.000 unidades por ml Solução de cloreto de sódio 150 mM em uma bolsa IV, volume total de 50-250 cm3 Tampão de fosfato de sódio 10-50 mM, pH 5,8 Albumina humana 1 mg/ml Tendo sido descrita a invenção, os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar a presente invenção como ilustração, não como limitação.

EXEMPLO 1 Produção de a-L-iduronidase recombinante

Técnicas padrão como aquelas descritas por Sambro- ok e outros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1987)) podem ser utilizadas para clonar cDNA codificando α- L-iduronidase humana. o cDNA de α-L-iduronidase humana previamente clonado foi subclonado em PRCCMV (InVitrogen) como um fragmento de Hindlll-Xbal de urn subclone bluescript KS. Um cassete de íntron derivado do intron Cot de imunoglobuli- na de murino entre exons 2 e 3 foi construído utilizando ampliação PCR de bases 788-1372 (Tucker, e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7684-7688 (1991) do clone pRIR14.5 (Kakkis, e outros, Nucleic Acids Res. 16:7796 (1988)). 0 cassete incluía 136 bp da extremidade 3' de exon 2 e 242 bp da extremidade 5' de exon 3, que permaneceriam no cDNA ade- 5 quadamente fixadas. Não há sequência de ATG presente na região de codificação do cassete de íntron. O cassete de intron foi clonado no sítio Hindi II 5' do cDNA de a-L- iduronidase. O gene neo foi deletado por digestão com í i . / Xhol seguido por recircularização do vetor para fazer

Um frasco do banco de células de trabalho é descongelado e colocado em três frascos T225 em DME/F12 ou PF- CHO mais suplementos, mais FBS a 5% e 500 μg/ml de G418. Após 2-5 dias, as células são passadas utilizando tripsina- 15 EDTA para um frasco giratório de 1 litro no mesmo meio por 2-5 dias. As células são então transferidas para dois frascos giratórios de 3 litros por 2-5 dias, seguido por quatro ■' frascos giratórios de 8 litros por 2-5 dias. O inoculo dos frascos giratórios de 8 litros é adicionado a dois biorrea- 20 tores de tanque agitado de 10 0 litros Applikon® com um volume de trabalho de 80-90 litros. Microportadores de celulose macroporosos são adicionados em 2 gramas por litro (160 gramas), com PF-CHO ou DME/F12 mais suplementos, FBS a 5% e 500 μg/ml de G418 em um volume final de 80-90 litros. O 25 frasco é agitado por um acionamento aéreo com um propulsor marítimo. A cultura é monitorada em relação à velocidade de agitação, temperatura, DO e sondas de pH e controlou o sistema de controle Applikon® com uma interface PC. Os para- metros são controlados nos pontos estabelecidos ou faixa, 35-37 °C dependendo das condições de cultura, 40% de saturação de ar, e pH de 6,95, utilizando uma coberta de aquecimento, pulverizador de oxigênio e bomba de base. A cultura é incubada por 3-5 dias em cujo tempo a cultura esta emergindo do crescimento de fase log em 1-3 x 106 células por ml. Posteriormente, perfusão é iniciada em uma taxa crescente com meio PF-CHO (com modificações personalizadas, JRH Biosciences). Os quatro primeiros dias de coleta (faixa de 3-5 dias) são separados como "lavagem". A coleta após é o início do curso de produção. A produção continua com trocas de meio de tanto quanto 2-3,5 volumes de cultura por dia por 20-36 dias. A cultura pode ser estendida por 40 ou mais dias. A cultura é monitorada em relação à temperatura, pH e DO em uma base contínua. A purificação da enzima prossegue como descrito acima. 0 meio de produção coletado contendo iduronidase é acidificado a seguir até pH 5,3, filtrado a- través de um filtro de 0,2 micron e purificado utilizando cromatografia de Azul-Sepharose. A enzima purificada de múltiplos ciclos de cromatografia de Azul-Sefarose é a seguir agrupada e aplicada em uma coluna de quelação de cobre e e- luída com glicerol no tampão em um pH de 3,7. A enzima é retida no pH acídico para inativar vírus em potencial. 0 elua- to de coluna de cobre é ajustado a seguir para pH 5,7 e 2 M NaCl e carregado na coluna de fenil Sefarose. A enzima é eluída em 0,7 M NaCl. O eluato é concentrado e diafiltrado em um tampão de formulação de 150 mM NaCl, 100 mM NaPO4, pH 5,8. A enzima é filtrada através de um filtro de 40 nM para remover vírus em potencial e o filtrado ajustado para 0,001% de polisorbato 80. A enzima em volume é filtrada a seguir e colocada em frascos de vidro Tipo 1 de 5 cm3 apropriados para produtos farmacêuticos injetáveis, fechados com rolha e tampados.

EXEMPLO 2

Para biorreatores utilizando suspensões de célula única, o grupo de sementes é preparado como descrito acima no Exemplo 1. A utilização de uma suspensão de célula única simplifica preparação de biorreator e inoculação. O biorrea- tor é inoculado com células em meio DMEM/F12 (25% do volume do reator) e JRH 325 modificado (25% do volume do reator). O meio igual a 50% do volume do reator de trabalho é adicionado durante 48 horas. A perfusão (e coleta) é iniciada quando a densidade de célula atinge 1.0 e6 e o meio de perfusão é igual ao descrito acima.

EXEMPLO 3

A administração intravenosa a curto prazo de a-L- iduronidase recombinante humana em 9 cães com MPS I e em 6 gatos com MPS I mostrou absorção significativa de uma enzima em uma variedade de tecidos com uma recuperação estimada de 50% ou mais em tecidos 24 horas após uma dose única. Embora o fígado e o baço absorvam a maior quantidade de enzimas, e tenham o melhor aperfeiçoamento patológico, as melhoras em patologia e teor de glicosaminoglicano foram observadas em muitos, porém não em todos os tecidos. Em particular, a cartilagem, cérebro e válvula de coração não apresentaram melhora significativa. A melhora clínica foi ob- servada em um único cão em tratamento a longo prazo por 13 meses, porém outros estudos foram limitados a 6 ou menos meses. Todos os cães, e a maioria dos gatos, que receberam enzima humana recombinante desenvolveram anticorpos ao pro- duto humano. Os anticorpos IgG são do tipo de ativação de complemento (equivalente IgG canino provável). Este fenômeno também é observado em pelo menos 13% de pacientes Gaucher tratados com alglucerase. Proteinúria foi observada em um cão que pode estar relacionada à doença de complexo imunoló- gico. Nenhum outro efeito dos anticorpos foi observado nos outros animais tratados. A toxicidade específica não foi observada e estudos de laboratório clínicos (contagens completas de sangue, eletrólitos, BLJN/creatinina, enzimas de fígado, urinálise) foram, de outro modo, normais.

A terapia com enzimas em doses mesmo pequenas de 25.000 unidades (0,1 mg/kg/semana) resultou em distribuição significativa de enzimas para alguns tecidos e reduções em armazenagem de GAG. Se continuada por mais de 1 ano, os e- feitos clínicos significativos da terapia eram evidentes em termos de atividade, tamanho e aparência geral de saúde. A terapia nessa dose não melhorou outros tecidos que são locais importantes para doença nesta entidade como cartilagem e cérebro. Doses mais elevadas de 125.000 unidades (0,5 mg/kg) dadas 5 vezes durante duas semanas demonstram que a penetração melhorada do tecido pode ser obtida e um efeito terapêutico no nível do tecido foi realizado em um período tão curto quanto 2 semanas. Os estudos nesta dose aumentada são contínuos em dois cães por seis meses até a presente da- ta. Esses cães com MPS I estão mostrando melhora clínica significativa e reduções substanciais em excreção urinária de GAG na faixa normal. Fora uma reação imune controlada por técnicas de administração alteradas, a terapia de enzimas não mostrou toxicidade bioquímica ou clínica significativa. A terapia com enzimas nesta dose semanal mais elevada é eficaz para melhorar algumas características clínicas de MPS I e reduzir armazenagem sem toxicidade significativa.

Os resultados desses vários estudos em cães com MPS I e um estudo em gatos com MPS I mostram que a a-L- iduronidase recombinante humana é segura. Embora estes mesmos resultados forneçam base lógica significativa de que esta enzima recombinante deva ser eficaz para tratar deficiência de a-L-iduronidase, eles não preveem os benefícios clínicos ou os riscos imunológicos em potencial de terapia de enzimas em seres humanos.

EXEMPLO 4

O cDNA humano de a-L-iduronidase prevê uma proteína de 653 aminoácidos e um peso molecular esperado de 70.000 daltons após clivagem de peptídeo de sinal. O sequenciamento de aminoácidos revela alanina 26 no término-N fornecendo uma proteína esperada de 629 aminoácidos. a-L-iduronidase recombinante humana tem uma Histidina na posição 8 da proteína madura. A seqüência de proteína prevista compreende seis sítios de modificação de oligossacarídeos ligados-N em potencial . Todos estes sítios são modificados na proteína recombinante . Os terceiro e sexto sítios foram demonstrados como contendo um ou mais resíduos de manose 6-fosfato responsáveis por absorção de afinidade elevada em células.

Este peptídeo corresponde a Aminoácidos 26-45 de a-L-iduronidase Recombinante Humana com uma alanina término- N e a seguinte seqüência (SEQ ID NO. 2): ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala- arg-ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg

A enzima recombinante tem um peso molecular aparente de 82.000 daltons em SDS-PAGE devido a modificações de carboidratos. α-L-iduronidase recombinante humana purificada foi seqüenciada pela instalação de Sequenciamento de Proteína UCLA. Prefere-se administrar a enzima recombinante por via intravenosa. α-L-iduronidase recombinante humana foi fornecida para o experimento clínico em frascos de polipro- pileno de 10 ml em uma concentração de 100.000-200.000 unidades por ml. A forma de dosagem final da enzima utilizada no experimento clínico inclui a-L-iduronidase recombinante humana, solução salina normal e 100 mM de tampão de fosfato em pH 5,8. Estas são preparadas em uma bolsa de solução salina normal. Polisorbato 80 em uma concentração final de 0,001% foi adicionado à formulação para estabilizar a proteína contra cisalhamento, desse modo evitando precipitação nos frascos de produto final.

EXEMPLO 5 Efeitos de administração intravenosa de a-L- iduronidase em pacientes com Mucopolissacaridose I

Com base nos estudos de clonagem de cDNA codifi cando α-L-iduronidase (Scott e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 9695-99 (1991); Stoltzfus, e outros, J. Biol. Chem. 267: 6570-75 (1992)) e estudos animais mostrando efeitos de a-L-iduronidase para reduzir armazenamento lisossômi- 10 co em muitos tecidos (Shull, e outros, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 91: 12937-41 (1994); Kakkis e outros, Biochem. Mol. Med. 58: 156-67 (1996), um estudo de 52 semanas foi realizado para avaliar a segurança e eficácia clínica de administração intravenosa de a-L-iduronidase altamente purificado 15 em dez pacientes com mucopolissacaridose I (MPS I). a-L-iduronidase humana recombinante foi produzida e purificada até mais do que 97-99%. Pacientes demonstraram manifestações clínicas típicas do distúrbio e diagnóstico foi confirmado por determinação bioquímica de deficiência de a-L-iduronidase em leucócitos.

Os pacientes receberam a-L-iduronidase humana recombinante (diluída em solução salina normal com 0,1% de albumina de soro humano) por via intravenosa em uma dose de 125.000 unidades por kg (utilizando ensaio original e definição de unidade): 3.000 unidades por kg foram fornecidos durante a primeira hora, e S1.000 unidades por kg em cada uma das duas horas seguintes. A dose de 125.000 unidades por kg é equivalente a 100 unidades SI por kg utilizando o ensaio novo. As infusões foram prolongadas até 4-6 horas em pacientes que tinham reações de hipersensibilidade.

Na linha de base e em 6, 12, 26 e 52 semanas dependendo da avaliação, os pacientes foram submetidos a exames incluindo histórico, exames físicos por especialistas, ecocardiografia, EKG, MRI, polisonografia (semanas 0 e 26), investigação esquelética (semanas 0, 26, 52) faixa de medições de movimentos, fotografias corneais, e biópsia da pele (semana 0) para estabelecer culturas de fibroblastos para determinação de enzima e genotipificação. A faixa de medições de movimento foi realizada com um goniómetro e a faixa ativa máxima (iniciada pelo paciente) foi registrada para cada movimento. A flexão dos ombros é o movimento do cotovelo anteriormente do lado do corpo e a extensão de joelho e cotovelo representa tornar reta a articulação. Graus de restrição representam a diferença entre a faixa de movimento máxima e normal para idade e o valor medido. Polisonografia foi realizada de acordo com as diretrizes da American Thora- cic Society e eventos apnéicos (cessação de fluxo aéreo oro- nasal por 10 ou mais segundos) , eventos hipopnéicos (fluxo aéreo oro-nasal diminuído em 50% ou mais com dessaturação de 2% ou mais, ou evidência de excitação), minutos abaixo de 89% de saturação de oxigênio e tempo total de sono registrados entre as medições padrão exigidas. Desses dados um índice de apnéia/hipopnéia foi calculado dividindo-se o número total de eventos apnéicos e hipopnéicos pelo número de horas de sono. Os estudos bioquímicos incluíram medição de atividade de enzimas em leucócitos e limpezas de mucosa bucal, níveis de glicosaminoglicano urinário, e testes em relação a anticorpos de soro para a-L-iduronidase humana recombinante (ELISA e mancha ocidental). Os volumes de órgãos foram determinados por análise de dados de imagem digital MRI utilizando software de estação de trabalho Advantage Windows da General Electric. O volume do órgão foi medido em mililitros e foi convertido em peso considerando uma densidade de 1 grama por ml. A excreção de glicosaminoglicano urinária foi ensaiada por uma adaptação de um método publicado. Manchas ocidentais western e ensaios ELISA em relação a anticorpos para a-L-iduronidase humana recombinante foram realizados por métodos padrão. Ácidos urônicos e N-sulfato de glicosa- minoglicanos urinários foram analisados pelos métodos orcinol, carbazol e MBTH, e por separações eletroforéticas.

Todos os pacientes receberam infusões semanais de a-L-iduronidase humana recombinante administradas por 52 semanas. A atividade média de a-L-iduronidase em leucócitos foi de 0,04 unidades por mg antes do tratamento e quando medida em média de 7 dias após uma infusão (isto é, imediatamente antes da infusão seguinte), 4,98 unidades por mg, ou 15,0 por cento de normal. A atividade de enzimas não foi detectável em limpezas bucais antes do tratamento, porém 7 dias após infusões atingiu um nível de 1 por cento do normal.

O volume do fígado diminuiu de 19 a 3 7 por cento da linha de base em 9 pacientes e 5 por cento em um paciente em 52 semanas; a redução média foi de 25,0 por cento (n=10, P<0,001). Pela 26a semana, o tamanho do fígado estava normal para o peso corpóreo e idade em 8 pacientes (figura 1). Em 2 pacientes (pacientes 6 e 9) com o maior tamanho de fígado relativo na linha de base, o tamanho do fígado estava próximo ao normal na 52a semana (3,2 e 3,3 por cento de peso corpóreo, respectivamente). O tamanho do baço diminuiu em 8 pacientes de 13 a 42 por cento da linha de base (redução média de 20 por cento em 10 pacientes, P<0,001).

A excreção de glicosaminoglicano urinário diminuiu rapidamente em 3 a 4 semanas e em 8-12 semanas tinha caído em 60-80 por cento da linha de base. Na 52a semana, a redução média era de 63 por cento (faixa de 53-74; p<0,001) . Oito de dez pacientes tiveram uma redução de 75 ou mais por cento da quantidade de linha de base de glicosaminoglicano urinário em excesso do limite superior de normal para a idade. Os resultados foram confirmados por ensaio de ácidos u- rônicos e N-sulfato (um teste específico para heparan sulfato) . Os estudos de eletroforese de urina detectaram uma redução significativa em sulfato de heparan e excreção de der- matan sulfato porém alguma excreção em excesso de sulfato de dermatan persistiu em todos os pacientes.

A altura média aumentou 6,0 cm (5,2 por cento) nos 6 pacientes pré-púberes (Tabela 2) e sua velocidade de crescimento médio de altura aumentou de 2,8 cm/ano para 5,2 cm/ano durante o tratamento (P=0,011). Para todos os 10 pacientes, o peso corpóreo médio aumentou 3,2 kg (8,8 por cento) e o aumento médio foi de 4,2 kg (17,1 por cento) para os 6 pacientes pré-púberes (Tabela 2) . Nesses 6 pacientes, a velocidade de crescimento médio de peso pré-tratamento aumentou de 1,7 kg por ano para 3,8 kg por ano durante tratamento (P=0,04).

A flexão dos ombros (movendo o cotovelo anteriormente) aumentou em 6 dos 8 indivíduos avaliados na linha de base com uma melhora média para os ombros direito e esquerdo de 28° e 26°, respectivamente (P < 0,002; figura 2) . A extensão do cotovelo e extensão do joelho aumentou em uma média de 7,0° (P < 0,03) e 3,2° (P=0,10), respectivamente, nos 10 pacientes (figura 2).

A análise da melhora em pacientes individuais revelou que a maioria das articulações limitadas tiveram o maior aperfeiçoamento. Por exemplo na linha de base, pacientes 5, 9 e 10 não podiam flexionar seus ombros (mover o cotovelo anteriormente) além de 100°, o que aumentou 21° a 51° após tratamento. Similarmente, os pacientes 2 e 9 tiveram um aumento substancial em extensão de joelho. As mudanças na faixa de movimento foram acompanhadas por aumentos reportados por paciente em atividades físicas como ser capaz de la- var seus cabelos, segurar normalmente um hambúrguer, se pendurar em barras e praticar esportes de forma melhor.

Sete pacientes tiveram redução em eventos de ap- néia e hipopnéia de 155 a 60 por noite após tratamento (uma diminuição de 61 por cento) com uma alteração em índice médio de apnéia/hipopnéia (número total de eventos por hora) de 2,1 para 1,0. Três pacientes tinham apnéia do sono clinicamente significativa e todos os três melhoraram durante tratamento. No paciente 2, o índice de apnéia/hipopnéia diminuiu de 4,5 na linha de base para 0,4 em 2 6 semanas e um tempo total de dessaturação de oxigênio reduzido de 48 minutos para 1 minuto por noite. O paciente 6 necessitou de terapia de pressão de vias aéreas positiva contínua durante a noite antes do tratamento devido à dessaturação grave (61 minutos abaixo de 89 por cento de saturação com pressão de vias aéreas positiva contínua em 368 minutos de sono), porém pela 52 a semana, o paciente tolerou o estudo do sono sem CPAP e dessaturado abaixo de 89 por cento por apenas 8 minutos durante 322 minutos de sono. 0 paciente 9 teve um índice de apnéia hipopnéia de 9,5 que diminuiu para 4,0 em 26 semanas. 0 paciente 8 piorou com um índice de apnéia hipopnéia de 0,1 aumentando para 3,1 em 26 semanas e 9,3 em 52 semanas por motivos não evidentes. Oito de dez pacientes ou suas famílias reportaram respiração melhorada, e 5 de 7 observaram respiração mais silenciosa durante a noite, qualidade melhorada de sono e redução de sonolência durante o dia.

A classificação funcional da New York Heart Association foi determinada por entrevistas de pacientes em sé- rie. Todos os 10 pacientes reportaram melhoras em uma ou duas classes porém não houve dados objetivos significativos de estudos ecocardiográficos para verificar o benefício cardíaco direto. As marcações funcionais melhoradas podem refletir aperfeiçoamentos em outros aspectos da doença MPS I em vez de função cardíaca. Na comparação da linha de base com 52 semanas de tratamento, ecocardiografia demonstrou regurgitação tricúspide ou regurgitação pulmônica diminuída em 4 pacientes porém dois pacientes (pacientes 2 e 7) tiveram piora de regurgitação mitral. Na linha de base, o paciente 6 teve flutter atrial e sinais clínicos de falha cardíaca incluindo dispnéia em descanso e edema periférico. Pela 12a semana, ele apresentou ritmo sinus normal com bloqueio de primeiro grau e sua dispnéia em descanso e edema formador de sulco resolvidos.

Todos os 10 pacientes reportaram falta de resistência e limitações de atividades diárias antes do tratamento por a tolerância a exercício não foi formalmente testada. Durante tratamento, todos os pacientes melhoraram e pela 26a semana, muitos foram capazes de andar mais, correr e praticar esportes. Os pacientes 3, 4 e 5 reportaram a resolução de dores de cabeça incapacitadoras severas após tratamento por 6-12 semanas.

Vários pacientes reportaram irritação conjuntival ou fotofobia diminuída. A acuidade visual melhorou em um paciente (20/1000 a 20/200 em um olho) e modestamente em 2 ou tros .

Os resultados deste estudo indicam que a administração intravenosa da a-L-iduronidase humana recombinante altamente purificada da presente invenção resultam em melhora clínica e bioquímica em pacientes com Mucopolissacaridose I. A normalização do tamanho do fígado e quase normalização de excreção de glicosaminoglicano urinário são compatíveis com dados de estudos em cães com Mucopolissacaridose I, que demonstrou clearance de armazenagem no fígado e excreção diminuída de glicosaminoglicano urinário em um período tão curto quanto 2 semanas.

Reações de hipersensibilidade às infusões de a-L- iduronidase humana recombinante foram menos severas do que previsto de estudos em cães. Embora importante em alguns pacientes, urticária recorrente foi controlável com pré- medicação e ajustes em taxa de infusão. Anticorpos específicos para a-L-iduronidase foram detectados em 4 pacientes com ativação de complemento normalmente subclínica, e tanto os anticorpos como a ativação de complemento diminuíram com o tempo. Respostas imunes mediadas por IgG similares foram previamente observadas em pacientes com doença de Gaucher tratados com glucocerebrosidase, embora os eventos fossem mais freqüentes em nosso pacientes. Pacientes com mucopolissacaridose I com um genótipo nulo podem ter uma resposta imune maior do que nesses 10 pacientes, nenhum dos quais tem um nulo.

Desse modo, a-L-iduronidase humana recombinante pode reduzir armazenamento lisossômico e melhora alguns as pectos de doença clínica de Mucopolissacaridose I. 58

A invenção, e o modo e processo de fazer e utilizar a mesma, são agora descritos em termos completos, claros, concisos e exatos de modo a permitir que qualquer pessoa versada no estado da técnica à qual se refere, faça e use a mesma. Deve ser entendido que o acima descreve moda-lidades preferidas da presente invenção e que modificações podem ser feitas na mesma sem se afastar do espírito ou âmbito da presente invenção como exposto nas reivindicações. Para destacar de forma particular e reivindicar distintamen- te a matéria considerada como invenção, as seguintes reivin-dicação concluem este relatório descritivo. Tabela 1.

Velocidade de contaminação d® proteína hospedeira entre ® processo de galli anterior ® o novo fenteainaçto á/& proteína hospedeira de ovário de hasater gdiipês wr ensaio- ELISA

Claims (19)

1. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA por compreender uma enzima a-L-iduronidase humana recombinante em combinação com um veiculo farmaceuticamente adequado, a referida enzima a-L-iduronidase recombinante opcionalmente compreendendo os aminoácidos 26 a 653 da SEQ ID NO: 2 e a falta dos aminoácidos 1 a 26 da SEQ ID NO: 2, tendo uma pureza igual a ou maior do que 99%, em que a enzima a-L- iduronidase recombinante: (a) é uma forma da enzima de alta absorção a qual: (a) compreende residues de manose-6-fosfato nas posições 3 e 6 dos açúcares N-ligados e (b) exibe uma afinidade de absorção de menos de 30 unidades de enzima por mL ou menos de 2 nM, (b) possui uma vida média dentro das células de aproximadamente 5 dias, (c) é substancialmente corretiva para distúrbios de armazenamento de glicosaminoglican causados por deficiência de iduronidase, e/ou (d) tem uma atividade especifica maior do que aproximadamente 240.000 unidades por miligrama de proteina.

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA por compreender ainda uma solução de cloreto de sódio, um tampão e polisorbato 80.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida enzima a-L-iduronidase humana recombinante está presente em uma concentração de 0,1 mg/mL a 0,7 mg/mL e de 25.000 unidades por mL a 125.000 unidades por mL.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida solução de cloreto de sódio está em uma concentração de aproximadamente 150 mM.

5. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido tampão é um tampão de fosfato de sódio em uma concentração de aproximadamente 100 mM, e pH 5,4-5,9.

6. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que após diluição na forma de dosagem, a referida albumina humana está presente em uma concentração de pelo menos aproximadamente 1 mg/mL.

7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o pH da referida solução é mantido em aproximadamente 5,8.

8. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido polisorbato 80 é mantido a 0,001%.

9. Método de purificar uma a-L-iduronidase humana recombinante conforme definida na reivindicação 1 até igual a ou maior do que aproximadamente 99% de pureza, CARACTERIZADO por compreender as etapas de: a) colher e filtrar fluido obtido de uma cultura de células transformada com ácidos nucléicos que codificam a referida a-L-iduronidase humana; b) ajustar o pH do fluido até um pH acidico, seguido por filtração através de um filtro de 0,2 micron a 0,54 micron; c) passar o fluido através de uma coluna de azul sefarose FF para capturar a referida a-L-iduronidase humana; d) passar o fluido através de uma coluna de sefarose de quelação de cobre para remover proteínas de CHO de contaminação; e) passar o fluido através de uma coluna de fenil sefarose para reduzir corante azul Cibacron lixiviado residual e ions de cobre transportados das colunas anteriores; e f) concentrar e diafiltrar a a-L-iduronidase purificada.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida coluna de azul sefarose FF é utilizada para purificar a referida. a-L- iduronidase humana de sete a dez vezes.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido método compreende utilizar glicerol a 10% em todos os tampões para aumentar a recuperação quantitativa da referida a-L-iduronidase humana.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida etapa de sefarose de quelação de cobre é realizada em uma matriz de sefarose de quelação de cobre FF.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida etapa de coluna de fenil sefarose é realizada em uma matriz cromatográfica de alta performance de fenil sefarose.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida a-L-iduronidase humana recombinante purificada possui uma atividade especifica maior do que 240.000 unidades por miligrama de proteina.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida a-L-iduronidase humana recombinante purificada compreende um ou mais residues de manose-6-fosfato.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida a-L-iduronidase humana recombinante purificada compreende um residue de manose-6-fosfato ligado na posição 3 e um residuo de manose-6-fosfato ligado na posição 6.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida a-L-iduronidase humana recombinante purificada possui uma vida média dentro da célula de aproximadamente 5 dias.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida cultura de células é uma cultura de células CHO.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida cultura de células CHO é uma cultura de células CHO de linhagem celular 2.131.

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