ES2323562T3 - Amplificacion y deteccion de la expresion ebv-barf1 para el diagnostico del carcinoma nasofaringeo. - Google Patents
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Abstract
Método para identificar carcinoma nasofaríngeo asociado con EBV en una muestra tumoral, que comprende: - amplificar, empleando la técnica NASBA de amplificación basada en la transcripción, una secuencia diana dentro de uno o más ARN de dicha muestra tumoral transcritos a partir de los nucleótidos 165504-166166 de la región que se expande en el marco de lectura de BARF1; - detección de los productos amplificados e identificación del carcinoma nasofaríngeo asociado a EBV.
Description
Amplificación y detección de la expresión
EBV-BARF1 para el diagnóstico del carcinoma
nasofaríngeo.
El invento presente está relacionado con los
oligonucleótidos que pueden emplearse en la amplificación y
detección del ARNm del virus de Epstein Barr (EBV, del inglés
Epstein Barr Virus). Además, se proporciona un método para el
diagnóstico del carcinoma nasofaríngeo asociado a EBV.
Los oligonucleótidos, de acuerdo con el invento
presente, son particularmente adecuados para la detección de la
expresión génica de EBV en las células circulantes de sangre
periférica, en muestras de tejido humano (tumores) y en secciones
finas de las mismas empleando técnicas de amplificación "en
solución" o de amplificación "in situ".
El virus de Epstein-Barr (EBV)
es un herpesvirus humano ubicuo que se descubrió por primera vez en
asociación con la forma africana (endémica o e) del linfoma de
Burkitt (BL). Posteriormente, el virus se encontró también asociado
con el carcinoma nasofaríngeo (NPC) y se mostró que era el agente
causante de la mononucleosis infecciosa (IM). La infección
normalmente ocurre durante la infancia temprana, dando como
resultado generalmente una manifestación subclínica, ocasionalmente
con síntomas leves. Sin embargo, la infección durante la
adolescencia o en la etapa adulta puede dar lugar a IM
caracterizada por la presencia de linfocitos atípicos en la
periferia. La mayor parte de estos linfocitos son linfocitos T; sin
embargo, incluidos entre ellos está una pequeña población de
linfocitos B infectados por EBV. La infección de linfocitos B puede
llevarse a cabo también in vitro. Tales células se
transforman y proliferan de forma indefinida en cultivo y se han
denominado "inmortalizadas", "infectadas de forma
latente" o "transformadas en el crecimiento". Que se sepa,
todos los individuos que se infectan con EBV permanecen infectados
de forma latente de por vida. Esto se refleja por la presencia
continua a lo largo de la vida de cantidades pequeñas de células B
transformadas positivas para el genoma de EBV entre los linfocitos
circulantes de sangre periférica y por el continuo, aunque
periódico, desprendimiento de virus en la orofaringe.
En la gran mayoría de los casos la infección por
EBV da como resultado una enfermedad linfoproliferativa que puede
ser temporalmente debilitante, pero que siempre es benigna y
autolimitante. En algunos individuos inmunodeprimidos, sin embargo,
el resultado puede ser linfoproliferación incontrolada que induce
malignidad verdadera. Esto ocurre en individuos que están
inmunodeprimidos intencionadamente, especialmente en niños que
reciben trasplantes de órganos y son tratados con ciclosporina A, u
oportunísticamente, como en el caso de individuos infectados con
VIH, o genéticamente, como en el caso de los varones afectados que
portan el gen XLP (síndrome linfoproliferativo ligado al X). En
estos casos los tumores resultantes derivan de la proliferación
policlonal de células B infectadas por EBV. Además, en tales
pacientes se detecta la replicación epitelial incontrolada del virus
en las lesiones de la leucoplaquia oral vellosa. Por tanto, la
respuesta inmune juega un papel central en el control de la
infección por
EBV.
EBV.
Durante muchos años las líneas celulares
derivadas del linfoma de Burkitt (BL) y las células B de sangre
periférica transformadas por EBV, también denominadas líneas
celulares linfoblastoides (LCL), se consideraron el sistema
prototipo modelo para el estudio de la transformación y oncogénesis
mediada por EBV.
Durante los últimos años se ha determinado la
secuencia completa de ADN de la cepa del virus prototipo,
B95-8. El análisis de esta secuencia ha dado como
resultado la identificación de más de 80 marcos abiertos de lectura
(Baer et al., Nature 310; 207-211 (1984)). La
nomenclatura de los marcos de lectura del EBV está basada en su
posición en el genoma del virus. Los nombres comienzan con las
iniciales del fragmento de restricción BamH1 o EcoR1 donde comienza
la expresión. El tercer carácter del nombre si L o R, dependiendo de
si la expresión es hacia la izquierda (L, del inglés leftward) o
hacia la derecha (R, del inglés rightward) en el mapa
estándar (así BLLF2 es el segundo marco de lectura hacia la
izquierda en el fragmento de restricción L de BamH1).
Básicamente, se han observado tres patrones de
transcripción génica diferentes en las diversas malignidades
asociadas a EBV. Estos patrones se llaman latencia de tipo I, tipo
II y tipo III, aunque los datos recientes muestran la presencia de
transcritos adicionales que complican este sistema de tipificación.
La latencia de tipo I se caracteriza por la expresión del Antígeno
1 Nuclear del Epstein Barr (EBNA-1; BKRF1) y de los
pequeños ARN no codificantes del Epstein Barr temprano ARN 1 y 2
(EBER-1 y EBER-2). Más
recientemente, se ha encontrado un nuevo grupo de transcritos
(BAFR0), con capacidad potencial para codificar proteínas en
numerosos marcos de lectura abierta pequeños incluidos dentro de
estos transcritos, en todas las células que expresan el patrón de
latencia de tipo I. La latencia de tipo II se caracteriza por la
expresión de la Proteína 1 Latente de Membrana
(LMP-1; BNFL1) y LMP-2A/-2B (BNRF1),
además de los transcritos del tipo 1 mencionados anteriormente. Los
transcritos LMP2 sólo pueden expresarse cuando el genoma vírico está
en la forma circular covalentemente cerrada, dado que estos
transcritos cruzan las repeticiones terminales sobre el genoma
vírico y no pueden formarse cuando el genoma vírico está en su
estado "lítico" linear. La latencia de tipo III se caracteriza
por la expresión de los antígenos nucleares EBNA-2,
EBNA-3A, EBNA-3B,
EBNA-3C y EBNA-4 (también
denominados EBNA-2, -3, -4, -6 y -5,
respectivamente), además de los transcritos del programa tipo II. La
expresión de los diferentes programas de transcripción asociados a
la latencia está influida por los parámetros de la célula
hospedante, tales como el nivel de metilación y diferenciación
celular. En consecuencia, la expresión del gen EBV puede verse
empezar desde diferentes lugares del promotor, dependiendo del
estado de metilación del genoma vírico.
La asociación de la expresión de diferentes
perfiles de transcripción vírico del tipo de latencia con las
numerosas malignidades asociadas a EBV se ha determinado
recientemente mediante análisis de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa en Transcripción Reversa (RT-PCR) del ARN
derivado de muestras de biopsias tumorales o por análisis de
librerías de ADNc hechas a partir de ARNm poliadenilado, aislado
selectivamente a partir de tejido tumoral o de líneas celulares
tumorales y LCL propagadas in vitro (incluidas en ratones
injertados (desnudos)). Empleando este tipo de análisis, se
encuentra la latencia de tipo I en células tumorales de BL in
vivo y en líneas celulares de BL esporádico in vitro. La
latencia de tipo II se encuentra en NPC, en casos positivos para
EBV de Linfoma de Hodgkin, en células T, células NK y células B
esporádicas de linfoma no Hodgkin (T-/NK-/B-NHL) y
en carcinomas tímicos y parotídeos en el hospedante
inmunocompetente, mientras que los patrones de latencia de tipo III
se encuentran en la mayoría de líneas BL y LCL mantenidas in
vitro y en las linfoproliferaciones premalignas y el linfoma
inmunoblástico que se observan principalmente en los individuos
inmunocomprometidos. En estas últimas poblaciones se encuentra
también el liomiosarcoma esporádico que puede expresar el patrón de
tipo II, mientras que los carcinomas gástricos de pacientes no
comprometidos se encontró que expresaban más bien un patrón de
latencia de tipo I. Aún no hay consenso acerca del patrón de
transcripción exacto de la célula B infectada verdaderamente latente
que pueda detectarse en el portador de EBV sano. Dependiendo del
método empleado para el aislamiento de estas células B infectadas de
forma latente, se han encontrado los transcritos de
EBNA-1, EBER y LMP-2, pero también
se han descrito patrones que incluyen solamente
EBNA-1 o solamente EBER más
LMP-2.
Deberíamos darnos cuenta que estos patrones
diferentes de transcripción de los genes víricos (latentes) en las
células B y en el tejido tumoral en realidad representan la
transcripción de material (tumoral) "a granel" y no reflejan
necesariamente el patrón de expresión de cada célula (tumoral)
individual. Mediante el análisis inmunohistoquímico (IH) de
secciones finas de varios tumores asociados a EBV empleando
anticuerpos monoclonales para productos génicos asociados a
latencia definida de EBV, tal como EBNA-1,
EBNA-2 y LMP-1, está emergiendo una
imagen diferente. En estudios recientes, empleando la metodología IH
se encontró que la mayoría de las células tumorales en el SIDA y en
el linfoma inmunoblástico asociado a postrasplante exhiben un patrón
compatible con la latencia de tipo I (sólo detectables
EBER-1/-2 y EBNA-1), mientras que
una minoría expresan latencia de tipo II (EBNA-1
más LMP-1) o una nueva forma de latencia
caracterizada por la coexpresión de EBNA-1 y
EBNA-2 (Oudejans et al., Am. J. Pathol. 147
(1995) 923-933). Sólo raramente se observaron
células que coexpresan EBNA-2 y
LMP-1, lo que sería indicativo de latencia del tipo
III. Esto podría significar que la imagen clásica de expresión
génica viral asociada con las diferentes enfermedades malignas
ligadas a EBV debe revisarse para incorporar estos hallazgos más
detallados.
De hecho está emergiendo una imagen aún más
diferenciada a medida que se encuentran genes codificados por EBV
claramente diferentes expresados en diferentes enfermedades
asociadas a EBV. Ocasionalmente se detectan productos génicos
virales que previamente se consideraban pertenecientes a la fase
lítica (precoz) del ciclo de vida del virus, probablemente
derivados de células tumorales ocasionales que cambian a replicación
viral lítica bajo la influencia de influencias locales. Este
fenómeno puede observarse claramente en el carcinoma nasofaríngeo
(NPC) donde el cambio a replicación lítica en pequeños nidos de
células tumorales se asocia con diferenciación celular según,
revela la formación de filamentos de citoqueratina.
Alternativamente, tales productos génicos líticos pueden derivar de
tumores infiltrantes y células B diferenciadas que portan genomas
virales latentes o de células endoteliales locales y epiteliales
especializadas que pueden volverse productivamente infectadas por
EBV.
Además de los productos génicos asociados a la
latencia y de la expresión génica claramente ligada a la replicación
viral lítica local, se ha encontrado que algunos genes virales que
normalmente se considera que pertenecen al grupo de los genes
tempranos de EBV se expresan en tumores seleccionados asociados a
EBV. Estos genes incluyen homólogos virales de genes celulares que
pueden tener una función en la patogenia de ciertas malignidades de
EBV; p. ej., BHRF1, el homólogo de Bcl-2 humano que
proporciona resistencia a la apoptosis y que se expresa casi
exclusivamente en B-NHL, o BARF1, un homólogo del
ICAM-1 celular, expresado en NPC y OHL, pero no en
HD ni otros linfomas, o BCRF1, el homólogo viral de la
IL-10 humana que puede conferir actividad
inmunomoduladora local encontrado principalmente en el linfoma
inmunoblástico de pacientes inmunocomprometidos, o BDLF2, que tiene
cierta homología con la ciclina B1 celular y puede funcionar
superando el control del ciclo celular normal.
Además, los genes que median eficazmente el
cambio desde la expresión génica latente hasta el ciclo lítico
in vitro pueden expresarse in vivo sin inducción del
ciclo lítico completamente detectable, una situación denominada
expresión génica lítica restringida o abortiva.
Por tanto, al nivel monocelular, la expresión
génica de EBV no está distribuida homogéneamente a través del tumor
y diferentes poblaciones de células tumorales podrían expresar
patrones (ligeramente) diferentes de genes de EBV. De este modo,
además de analizar la expresión génica de EBV en extractos de ácidos
nucleicos preparados a partir de muestras completas de biopsia
tumoral, se precisa información de la expresión génica viral a
nivel monocelular para describir con precisión la actividad
transcripcional del genoma EBV en las células tumorales.
Se ha sugerido que el cambio a la expresión
génica lítica puede estar relacionado positivamente al éxito de la
terapia, ya que tales células son menos resistentes a la apoptosis y
son más inmunógenas, siendo de este modo más sensibles a la terapia
con fármacos/radiación y a la vigilancia (inmune) y a los mecanismos
de reparación del hospedante. De este modo, además de analizar los
transcritos génicos asociados a la latencia, la detección precisa y
la cuantificación relativa de los productos génicos virales líticos
codificados por EBV en el tumor son de relevancia diagnóstica y
pronóstica.
Además de su uso en el diagnóstico y
monitorización específicos de las malignidades, según se describe
anteriormente, el análisis de la expresión génica viral puede ser
de relevancia en el diagnóstico diferencial de la leucoplaquia oral
vellosa, que se caracteriza por la expresión de genes virales
líticos en ausencia de expresión detectable de
EBNA-1 y EBER y para el diagnóstico de
linfoproliferaciones de células B agudas y crónicas/persistentes
que pueden tener una progresión autolimitante o no maligna.
Todos estos hallazgos apuntan a la relevancia de
la determinación precisa del tipo y nivel de expresión génica viral
para el diagnóstico de las malignidades y linfoproliferaciones
premalignas asociadas a EBV.
Además de, o en lugar del análisis de la
expresión de genes virales en el tumor u otras muestras de tejido
afectadas, la detección y cuantificación de las células (tumorales)
infectadas por el virus en la circulación y el análisis de la
expresión génica viral en estas células puede proporcionar un medio
más accesible de diagnóstico molecular, no sólo aplicable para la
detección de células tumorales circulantes en pacientes ya afectados
o para propósitos de escrutinio preventivo en pacientes en riesgo,
tales como los pacientes postrasplante y con SIDA y otros
individuos inmunocomprometidos, sino también relevante para
monitorizar el(los) efecto(s) de la terapia
antitumoral.
Aparte de medir la carga de tumor asociado a
EBV, que puede llevarse a cabo cuantificando el nivel de ADN viral
en una muestra de paciente particular, el análisis cualitativo y
cuantitativo de la transcripción génica viral es esencial para el
diagnóstico diferencial y el pronóstico y puede ser relevante para
determinar las estrategias terapéuticas de intervención.
El análisis molecular empleando ácido nucleico o
reactivos inmunológicos precisa de conocimiento detallado de las
moléculas diana involucradas, especialmente con respecto a la
variedad de cepa/epítopo. La selección de segmentos de genes y
epítopos que están sumamente conservados entre las diferentes cepas
y aislados de EBV es de crucial importancia para el diseño y
desarrollo de reactivos diagnósticos que pueden aplicarse para el
diagnóstico clínico mundial, según se indica anteriormente. Por otro
lado, el análisis de mutaciones, deleciones o inserciones dentro de
los productos génicos virales específicos que conducen a la
expresión de proteínas con funciones potenciales modificadas puede
ser de valor para los estudios epidemiológicos y patógenos y puede
tener relevancia diagnóstica potencial. Por ejemplo, la variedad de
la cepa de EBV puede determinarse especialmente mediante análisis
de la secuencia de los genes 2 y 3 del Antígeno Nuclear de Epstein
Barr (EBNA, del inglés Epstein Barr Nuclear Antigen), la
cual contiene secuencias específicas que permiten la diferenciación
en cepas de EBV de tipos A y B, siendo la cepa B relativamente más
frecuente en el linfoma asociado a SIDA y en ciertas partes del
mundo. Por otro lado, se han descrito variaciones de secuencia (en
particular, las mutaciones puntuales y las deleciones) para los
genes que codifican EBNA-1, Proteína Latente de
Membrana (LMP)-1, LMP-2 y ZEBRA, de
los cuales la variante de deleción específica de 30 pb de
LMP-1 se ha vinculado a un fenotipo oncogénico más
agresivo.
Shih-Lammali et al.,
Journal of Medical Virology, vol 49, págs. 7-14,
describen el análisis de la expresión de varios genes del virus de
Epstein-Barr tales como EBNA1, EBNA2, LMP1, LMP2,
BARF0, BZLF1, BALF5, BALF2, BARF1 y BALF4 en casos nasofaríngeos
del norte de África.
Wei et al., Oncogene, págs.
3073-3081, describen el establecimiento de una línea
celular epitelial de riñón de mono empleando el marco abierto de
lectura de BARF1 del virus de Epstein-Barr.
Tanner et al., Journal of Infectious
Diseases, vol. 175, págs. 38-46, describen las
respuestas citotóxicas de los anticuerpos y celulares dependientes
de anticuerpo frente a la proteína del marco abierto de lectura 1
hacia la derecha de BamH1 del virus de Epstein-Barr
en los trastornos asociados a EBV.
Se requiere disponer de técnicas para analizar
específicamente el ADN viral y el ARN y la proteína expresada, para
un diagnóstico preciso. Un ejemplo de una técnica para la
amplificación de un segmento diana de ADN es la llamada "reacción
en cadena de la polimerasa" (PCR). La PCR en combinación con los
grupos de cebadores apropiados es adecuada para detectar el ADN
viral, mientras que la inmunohistoquímica combinada con los
reactivos de anticuerpos apropiados es el método de elección para
visualizar las proteínas virales asociadas al tumor. Los números
elevados de copias de ARN viral pueden detectarse mediante
hibridación in situ de ARN, según se aplica rutinariamente
para detectar EBER-1 y -2, que se expresan en
números de copias extremadamente elevados en virtualmente todos los
tumores asociados a EBV. La detección de números de copias bajos del
ARNm vírico requiere de técnicas más sensibles como
RT-PCR y Amplificación Basada en la Secuencia del
Ácido Nucleico (NASBA, del inglés Nucleic Acid Sequence Based
Amplification). La aplicación de la RT-PCR se
encuentra seriamente dificultada por la necesidad de ARNm empalmado
al objeto de permitir la expresión génica viral en un trasfondo de
ADN viral, limitando por tanto su uso a solamente un grupo
seleccionado de genes virales empalmados. Además, la necesidad de
temperaturas elevadas en la parte de PCR de la reacción
RT-PCR limita seriamente su aplicación para
planteamientos de diagnóstico
in situ.
in situ.
Otra desventaja de la RT-PCR es
el requerimiento de lugares de empalme dentro del transcrito de
interés para excluir la amplificación del ADN genómico y el hecho
de que es una reacción de dos etapas.
Estas limitaciones se superan empleando el
método NASBA para analizar la expresión del ARNm vírico tanto en
extractos tisulares como mediante análisis in situ a nivel
monocelular. NASBA permite la amplificación selectiva del ARNm
vírico específico del exón o del marco de lectura en un trasfondo de
ADN viral y permite la visualización de la expresión del ARNm
(vírico) en secciones finas del tejido tumoral sin afectar a la
morfología celular (NASBA in situ). Ya que NASBA no está
limitado por la necesidad de elegir grupos de cebadores específicos
que se extienden sobre las secuencias de intrón, pueden emplearse
cebadores y sondas específicos de exón. NASBA también permite
análisis más simples y ampliamente aplicables de variaciones
genéticas en genes virales expresados. Empleando NASBA, el ARN, pero
no el ADN genómico, se amplifica independientemente de los sitios de
empalme.
De acuerdo a sus patrones de empalme, pueden
distinguirse cuatro tipos de transcritos de EBV:
Transcritos que están ampliamente empalmados en
una región no codificante, pero no en la región codificante, como
los transcritos de EBNA1 (Kerr et al., Virol;
187:189-201 (1992)).
Transcritos que están empalmados en el dominio
codificante, como LMP1 y LMP2 (Laux et al., J Gen Virol; 70:
3079-84 (1989)).
Transcritos que no están empalmados en absoluto,
como los transcritos EBER1 y EBER2 (Clemens, Mol Biol Reports; 17:
81-92 (1993)).
Transcritos de los que se desconocen sus
patrones de empalme. Estos son transcritos simplemente
"tempranos", como BARF1 (Zhang et al., J Virol;
62(2): 1862-9 (1988)), BDLF2 y BCRF1 (Vieira
et al., PNAS; 88(4): 1172-6
(1991)).
Brink et al., Journal of Clinical
Microbiology, vol 36, págs. 3164-9, describen un
método para analizar los transcritos con empalmes y sin empalmes de
los virus de Epstein-Barr latentes y su comparación
con la transcriptasa reversa.
El invento presente se refiere a la detección de
ciertos ARNm de EBV y proporciona los oligonucleótidos adecuados
para su usa en la amplificación y en la subsiguiente detección de
estos ARNm. Los lugares de unión de los oligonucleótidos de acuerdo
con el invento presente están localizados en el siguiente gen BARF1
de EBV, caracterizado por la nomenclatura de Baer et al.,
Nature, vol. 310, págs. 207-211, 1984.
Se describen oligonucleótidos que son de
10-35 nucleótidos de longitud y comprenden al menos
un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del
grupo que consiste en:
EBNA-1, [los nucleótidos
107950-109872 que se extienden sobre el marco de
lectura de BKRF1],
EBER-1, [los nucleótidos
6629-6795 que se extienden sobre el marco de
lectura],
LMP-1, [los nucleótidos
169474-169207 que se extienden sobre el marco de
lectura de BNFL1],
LMP-2, [los exones 2, 3, 4, 5,
6, 7 y 8 que se extienden sobre los nucleótidos
58-272, 360-458,
540-788, 871-951,
1026-1196, 1280-1495 y
1574-1682, respectivamente],
vIL10, [los nucleótidos
8675-10184 que se extienden sobre el marco de
lectura de BCRF1],
BARF1, [los nucleótidos
165504-166166 que se extienden sobre el marco de
lectura], o
BDLF2, [los nucleótidos
132389-131130 que se extienden sobre el marco de
lectura], en los que todos los números de nucleótidos que se
extienden sobre el marco de lectura están de acuerdo con Baer et
al., 1984.
Se describen los oligonucleótidos que son de
10-35 nucleótidos de longitud y comprenden al menos
un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del
grupo que consiste en:
Se describe un oligonucleótido enlazado a una
secuencia de promotor adecuado.
Se describe un par de oligonucleótidos, para la
amplificación de una secuencia diana dentro de la secuencia del
virus de Epstein Barr, para usar como un grupo, que comprende:
El término "oligonucleótido", como se
emplea en la presente memoria, se refiere a una molécula que
comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos tales
como cebadores y sondas.
El término "cebador", como se emplea en la
presente memoria, se refiere a un oligonucleótido natural (p. ej.,
como un fragmento de restricción) o producido sintéticamente, que es
capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis de un
producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra
de ácido nucleico (secuencia modelo o diana) cuando se coloca bajo
las condiciones adecuadas (p. ej., tampón, sal, temperatura y pH)
en presencia de los nucleótidos y de un agente para la
polimerización del ácido nucleico, tal como una polimerasa
dependiente de ADN o dependiente de ARN. Un cebador debe ser lo
suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de
extensión en presencia de un agente para la polimeración. Un cebador
típico contiene al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud
de una secuencia substancialmente complementaria (P1) u homóloga
(P2) a la secuencia diana, pero en cierto modo se prefieren
cebadores más largos. Habitualmente los cebadores contienen
aproximadamente 15-26 nucleótidos, pero también
pueden emplearse cebadores más largos.
Normalmente, un grupo de cebadores consistirá en
al menos dos cebadores, un cebador en 3' y otro en 5', los cuales
juntos definen el amplificado (la secuencia que se amplificará
empleando dichos cebadores).
Los oligonucleótidos de acuerdo con el invento
también pueden enlazarse a una secuencia promotora. El término
"secuencia promotora" define una región de una secuencia de un
ácido nucleico que es reconocida específicamente por una polimerasa
de ARN que se une a una secuencia reconocida e inicia el proceso de
transcripción mediante la cual se produce un transcrito de ARN. En
principio, puede emplearse cualquier secuencia promotora para la
que haya una polimerasa conocida y disponible que sea capaz de
reconocer el inicio de la secuencia. Promotores conocidos y útiles
son aquellos que son reconocidos por ciertas polimerasas de ARN de
bacteriófagos tales como el bacteriófago T3, T7 o SP6.
Se entiende que los oligonucleótidos
consistentes en las secuencias del presente invento pueden contener
deleciones, adiciones y/o substituciones menores de bases de ácidos
nucleicos, hasta el punto de que tales alteraciones no afectan
negativamente al rendimiento ni al producto obtenido de forma
significativa.
Se describen oligonucleótidos que tienen
10-35 nucleótidos de longitud y comprenden al menos
un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del
grupo que consiste en:
provistos de un marcaje detectable.
Dichos oligonucleótidos pueden emplearse para detectar el
amplificado generado usando los oligonucleótidos de acuerdo con el
presente
invento.
Una secuencia de oligonucleótido empleada como
sonda de detección puede marcarse con un resto detectable. Se
conocen varios restos marcados en la técnica. Dicho resto puede, por
ejemplo, ser un compuesto radiactivo, una enzima detectable (p.
ej., peroxidasa de rábano (HRP, del inglés horse radish
peroxidase)) o cualquier otro resto capaz de generar un señal
detectable tal como una señal colorimétrica, fluorescente,
quimioluminiscente o electoquimioluminiscente. Los sistemas de
análisis preferidos en los que se emplean dichos marcajes son
análisis basados en electroquimioluminiscencia (ECL) o análisis
basados en ensayo en gel ligado a enzimas (ELGA).
El invento presente se dirige a un método según
se define en la reivindicación 1.
Se conocen varias técnicas para amplificar
ácidos nucleicos en este campo. Un ejemplo de una técnica para
amplificar un segmento diana de ADN es la llamada "reacción en
cadena de la polimerasa" (PCR). Con la técnica de PCR el número
de copias de un segmento diana particular se incrementa
exponencialmente con un número de ciclos. Se emplean un par de
cebadores y en cada ciclo un cebador de ADN se empareja al sitio 3'
de cada una de las dos cadenas de la secuencia diana de ADN de
doble cadena. Los cebadores se extienden con una polimerasa de ADN
en presencia de varios mononucleótidos para generar de nuevo ADN de
doble cadena. Las cadenas del ADN de doble cadena se separan entre
sí por desnaturalización térmica y cada cadena sirve de molde para
el apareamiento de los cebadores y la subsiguiente elongación en el
siguiente ciclo. El método de PCR se ha descrito en Saiki et
al., Science 230, 135, 1985 y en las Patentes Europeas nº EP
200362 y EP 201184.
Otra técnica para la amplificación de ácidos
nucleicos es el llamado sistema de amplificación basado en la
transcripción (TAS, del inglés transcription based amplification
system). El método TAS se describe en la Solicitud de Patente
Internacional nº WO 88/10315. Las técnicas de amplificación basadas
en la transcripción habitualmente comprenden el tratar el ácido
nucleico diana con dos oligonucleótidos, uno de los cuales comprende
una secuencia promotora para generar un molde que incluye un
promotor funcional. Se transcriben múltiples copias de ARN de dicho
molde y puede servir de base para amplificación adicional.
Un método de amplificación basado en la
transcripción isotérmica continuada es el procedimiento denominado
NASBA ("NASBA"), según se describe en la Patente Europea nº EP
329822. NASBA incluye el uso de la polimerasa T7 de ARN para
transcribir múltiples copias de ARN a partir de un molde que incluye
un promotor T7.
Para la amplificación de ARN (como con el método
de acuerdo con el invento) se emplea la tecnología NASBA. Si se
emplea RT-PCR para la detección de transcritos
virales, se necesita diferenciar los productos de PCR derivados de
ARNm y ADN. Para los transcritos empalmados, como el ARNm de IEA,
puede emplearse la estructura exón-intrón. Sin
embargo, las especies de ARNm que codifican las proteínas
estructurales tardías son casi exclusivamente codificadas por
transcritos no empalmados. Puede emplearse tratamiento con ADNasa
previamente a la RT-PCR (Bitsch A, et al., J
Infect Dis, 167, 740-743, 1993; Meyer T, et
al., Mol Cell Probes, 8, 261-271, 1994), pero
en ocasiones no logra eliminar suficientemente el ADN contaminante
(Bitsch A, et al., 1993).
Al contrario que la RT-PCR,
NASBA, que se basa en la transcripción del ARN por la polimerasa T7
del ARN (Kievits et al., J Virol Meth,
35:273-86), no necesita diferenciar entre los
productos de amplificación derivados del ARN y del ADN dado que sólo
emplea ARN como su principal diana. NASBA permite la amplificación
específica de dianas de ARN incluso en un trasfondo de ADN.
Este método se empleó para el análisis de los
transcritos de EBV en las muestras de sangre total de los individuos
infectados por VIH.
Los kits de ensayo para la detección de EBV en
las muestras clínicas también se describen. Un kit de ensayo
conforme al invento puede comprender un par de oligonucleótidos
conforme al invento y una sonda que comprende un oligonucleótido
conforme al invento. Tal kit de ensayo puede comprender
adicionalmente reactivos de amplificación adecuados tales como
polimerasas de ADN y/o ARN y mononucleótidos. Los kits de ensayo que
pueden emplearse con el método de acuerdo con el invento pueden
comprender los oligonucleótidos conforme al invento para la
amplificación y la subsiguiente detección de secuencias de ARN
específicas de EBV.
El invento se ilustra adicionalmente mediante
los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de un gran panel de líneas celulares BL
y LCL crecidas en cultivo obtenidas a partir de diferentes partes
del mundo y de muestras frescas de biopsias tumorales de una
variedad de tejidos tumorales positivos para EBV, se determinó la
secuencia de nucleótidos específica del marco de lectura de BKRF1 y
se alineó con la secuencia B95-8 prototipo. De
forma sorprendente, de estos datos se volvió aparente que los
aislados de campo de EBV estaban bastante más conservados cuando se
alineaban entre sí que cuando se comparaban con la secuencia
B95-8, haciendo a este último más bien una cepa
mutante. Además, se observaron ciertas mutaciones que fueron más
comunes entre las secuencias derivadas de NPC y LCL obtenidas del SE
de Asia, mientras que otras mutaciones fueron más comunes entre los
aislados derivados de LCL y BL de África central, indicativo de
diferencias regionales de cepas. En los diferentes analizados de
LCL, las líneas transformadas de B95-8 podían
discriminarse claramente de las LCL derivadas de las líneas
transformadas (= crecimiento espontáneo) por virus endógeno.
Estos análisis también revelaron áreas
específicas dentro de la secuencia de BKRF1 que estaban altamente
conservadas entre todos los aislados estudiados. Estas regiones se
emplearon para buscar las secuencias que podrían aplicarse para la
amplificación de ARNm sensitiva y específica del exón de BKRF1
empleando NASBA.
A partir de muchas secuencias candidatas
seleccionadas dentro de las regiones conservadas de BKRF1, se
sintetizaron cuatro grupos de cebadores y una sonda de detección
correspondiente y se utilizaron para determinar la sensibilidad
absoluta y relativa de amplificación empleando transcritos
run-off generados in vitro y una serie
de diluciones de células B positivas para el genoma de EBV (células
JY) preparadas en un número fijo (n = 50.000) de células B
negativas para el genoma EBV (células BJAB o RAMOS).
En estos experimentos, empleando el protocolo
"estándar" de NASBA (véase a continuación), se encontró
que podía conseguirse la amplificación más sensible y específica de
las secuencias de ARNm específicas de BKRF1 empleando los cebadores
de EBNA1-1.2 y 2.1, con SEQ. ID. No.: 2 y SEQ. ID.
No.: 3, combinados con la sonda de detección con SEQ. ID. No.:
5.
La Figura 1 ilustra los resultados de una
reacción típica de NASBA empleando dos combinaciones de grupos de
cebadores derivados de la secuencia BKRF1. La primera combinación
(1.2 con 2.1), que daba un producto de amplificación específico de
203 pb, permite la detección de 10 células JY infectadas por EBV en
un trasfondo de 50.000 células RAMOS negativas para EBV.
Las células y/o las muestras de tejidos
positivas y negativas para EBV se trataron de forma rutinaria con
tampón de lisis de NASBA según se describe en otra parte. Las
reacciones de NASBA se llevaron a cabo según se describe por
Kievits et al., empleando 100 ng de ARN total por reacción (a
menos que se mencione lo contrario). Las soluciones acuosas de ARN
derivadas de célula/tejido se obtuvieron con el método de
aislamiento basado en sílice (Boom et al., Patente Europea
nº 0389063 B1: patente de EE.UU. nº 5.234.809) y se emplearon
directamente en la reacción de NASBA. Los precipitados de
isopropanol de ARN-EBER1, según se obtuvieron
mediante el método de ARNzol (Cinna Biotex) se centrifugaron en una
centrífuga Eppendorf a 14.000 rpm durante 30 minutos. El sedimento
de ARN se lavó con etanol al 70%, se secó al vacío durante
10-15 minutos y se disolvió en agua sin ARNasa.
Cinco microlitros (\mul) de cada muestra se mezclaron con 4 \mul
de tampón NN 5x (200 mM de Tris pH 8,5, 60 mM de MgCl2, 350 mM de
KCl, 20 mM de DTT, 5 mM de cada dNTP, 10 mM de rATP, rUTP, rCTP y
7,5 mM de rGTP, 2,5 mM de ITP), 4 \mul de mezcla de cebador (1
\muM de cada cebador en DMSO al 75%) y 2 \mul de agua sin
ARNasa. Las muestras se calentaron a 65ºC durante 5 minutos, se
dejaron enfriar hasta 41ºC tras lo que 5 \mul de mezcla de enzima
(6,5 mM de sorbitol, 3,4 \mug de BSA, 0,08 U de ARNasaH
(Pharmacia), 32,0 U de ARN polimerasa T7 (Pharmacia) y 6,44 U de
AMV-RT (Pharmacia)). La reacción se incubó a 41ºC
durante 90 minutos. Los productos de reacción se evaluaron mediante
electroforesis en gel empleando agarosa al 1,5% en TBE. Los
productos de NASBA se transfirieron desde los geles hasta los
filtros de nilón (Quiabrane, Quiagen, Chatsworth, CA, EE.UU.) vía
transferencia capilar en 10x SSC y se hibridaron a sondas
específicas de oligonucleótidos marcados en el extremo con
\gamma^{32}P empleando procedimientos estándares. La
radioactividad se detectó empleando una película
XAR-1 de Kodak.
De forma similar, los estudios de comparación de
secuencia y optimización de cebador permitieron seleccionar grupos
específicos de reactivos para la detección de ARNm codificante de
EBV para LMP-1, LMP-2,
EBER-1 y otras dianas de genes de EBV. Para algunas
dianas los resultados se muestran en la Figura 2, paneles
A-D.
Los paneles A y B de la Figura 2 muestran los
resultados de las reacciones de NASBA para LMP-1 y
LMP-2 en series de dilución de células JY positivas
para EBV en 50.000 células RAMOS negativas para EBV, según se
describe para EBNA1.
Los datos indican que el grupo de cebador 1.1
específico de LMP-1 (SEQ. ID. No.: 12) combinado con
2.1 (SEQ. ID. No.: 14), que da un producto de 248 pb, permite la
detección de ARNm equivalente a 1-10 células JY en
un trasfondo de 50.000 células RAMOS negativas para EBV. El grupo
1.2 de LMP-2 (SEQ. ID. No.: 18) combinado con 2.1
(SEQ. ID. No.: 19), que da un producto de 196 pb, permite la
detección clara de 1 célula JY en presencia de 50.000 células
RAMOS, lo que es ligeramente mejor que la combinación del grupo 1.1
de LMP-2 (SEQ. ID. No.: 17) con 2.2 (SEQ. ID. No.:
20), que da un producto de 226 pb.
El panel C de la Figura 2 muestra los resultados
de los análisis de NASBA para determinar la sensibilidad analítica
de EBER-1. Estos resultados muestran que la
combinación de cebadores de EBER 1.1 (SEQ. ID. No.: 6) con 2.2
(SEQ. ID. No.: 7), que da un producto de 140 pb, permite la
detección de 100 moléculas de ARN empleando los transcritos
run-off de ARN generados in vitro.
El panel D de la Figura 2 muestra los resultados
de NASBA de EBER1 con ARN aislado a partir de series de dilución de
células JY en 50.000 células RAMOS, lo que indica que
aproximadamente pueden detectarse 100 equivalentes de células JY.
Debido a la pérdida de moléculas de ARN de pequeño tamaño durante el
procedimiento de aislamiento de sílice, se detecta
insensibilidad.
La optimización del método de aislamiento del
ARN o de las condiciones de la reacción de NASBA, tales como la
concentración de DMSO, KCl o Betaína
(N,N,N-trimetiglicina), puede mejorar la
sensibilidad de la detección de ARN específico de EBV sin afectar a
su especificidad.
La Figura 3A muestra la comparación de dos
métodos de aislamiento de ARN para aislar los ARN de EBER1 de bajo
peso molecular, los cuales están presentes en gran abundancia en las
células transformadas por EBV como las JY, pero que no se aíslan
con gran eficacia mediante el método de sílice de Boom et al.
Se emplearon cantidades estandarizadas de transcritos
run-off de 170 pb generados in vitro como
entrada para aislar ARN empleando los métodos de aislamiento de
ARNzol (Cinna Biotex) y Boom. El ARN aislado se empleó como entrada
para el NASBA con los cebadores 1.1 (SEQ. ID. No.: 6) y 2.2 (SEQ.
ID. No.: 7) dando un producto de 140 pb. Los resultados muestran
que el método del ARNzol da como resultado un nivel de extracción
10-100 veces más eficaz de este ARN pequeño de
EBER1.
El método del ARNzol es más eficaz en aislar las
pequeñas moléculas de EBER1 que el método de Boom, aunque esto no
aplica para las moléculas de ARN que exceden de 500 pb (datos no
mostrados).
Además, la eficiencia de amplificación de ARN
específico durante NASBA puede mejorarse mediante la adición de
sustancias químicas, bien para mejorar la procesividad de las
enzimas implicadas (KCl o MgCl2) o para disminuir la formación de
estructuras secundarias en el ARN amplificado y diana (Betaína o
DMSO).
La Figura 3B muestra la influencia de la
variación en la concentración de KCl, según se aplica a la detección
específica de transcritos de ARN de BDLF2 específicos de EBV en
extractos de ARN estandarizados de 100 células JY en 50.000 células
RAMOS. Las concentraciones de KCl entre 40-60 mM son
óptimas para este transcrito (Fig. 3B), mientras que para la
mayoría de otras dianas fue de 60-70 mM.
Además, como se muestra en la Figura 3C, la
adición de hasta 600 mM de betaína a la mezcla de reacción de NASBA
mejoró enormemente la detección de ARN específico de EBV del gen
BCRF1, que codifica el homólogo vírico de IL10
(v-IL10) que muestra formación de estructura
secundaria significativa (datos no mostrados). En este caso el ARN
se aisló a partir de células RAJI positivas para EBV inducidas por
30 mM de butirato.
Dado que en individuos sanos portadores de EBV,
el ADN de EBV puede estar presente en células B circulantes
infectadas de forma latente y en infiltrantes de tejido y en
viriones secretados en los fluidos corporales por células B o
epiteliales productoras esporádicas de virus, la detección de ARN
específico de virus, referida a los diferentes programas de
latencia de EBV, puede proporcionar un medio de diagnóstico de
actividad viral aberrante en el hospedante, ligado a formación de
tumor. El nivel de transcritos de ARN viral en tejidos y fluidos
corporales de portadores sanos se considera demasiado bajo para su
detección sin purificación de células B, ya que se estima que sólo
1 en 10^{5}-10^{6} células B alberga EBV en
estos casos. Por tanto, la detección de ARN viral en células o
tejidos no purificados se considera de valor diagnóstico y
pronóstico en los casos de enfermedades (malignas) que se sospecha
asociadas a EBV. NASBA proporciona una herramienta excelente y
única para el análisis de actividad transcripcional viral en
material humano, ya que permite la detección directa de cualquier
especie de ARN viral no influenciada por la presencia de genoma de
ADN viral. Dado que se considera que EBNA1 se expresa en todos los
estadios de la infección por EBV, su detección sería un reflejo
directo de la presencia y actividad transcripcional vírica. A partir
de una serie de biopsias tumorales congeladas positivas y negativas
para EBV se cortaron secciones de 4 micras y se trataron
directamente con tampón de lisis de NASBA para liberar los ácidos
nucleicos, que fueron más tarde aislados sobre bolas de
sílice.
sílice.
La calidad del ARN aislado se controló mediante
detección de las bandas de ARN ribosómico 18S/28S tras
electroforesis en agarosa al 1% y más tarde se analizó la presencia
del ARNm U1A que codifica la proteína humana U1A del RNPsn
expresada constitutivamente. El ARNm del EBNA1 de EBV se detectó
mediante NASBA empleando el grupo de cebadores 1.2 y 2.1
específicos de BKRF1, según se describe en la Figura 1 y mediante
RT-PCR empleando cebadores específicos localizados
alrededor del sitio de especia Q/U/K, según se refiere en otra
parte. Los resultados de este análisis se relacionan en la Tabla 1,
la cual muestra claramente que NASBA permite la detección específica
de las secuencias de ARNm de EBNA-1 en extractos
derivados de tejidos tumorales humanos positivos para EBV, con
mayor sensibilidad que la RT-PCR e incluso permite
la detección en muestras con calidad de ARN inferior o con agentes
inhibidores de la RT-PCR.
En una segunda serie de experimentos se analizó
la presencia de ARN del EBNA1 de EBV en extracciones de cervicales
recogidas para la detección de Papillomavirus humano, algunas
de las cuales contienen ADN de EBV según se determinó mediante PCR
de ADN de EBV empleando cebadores derivados de la región
BAM-W. La presencia y calidad del ARN de las
células del hospedante se controló como se indica anteriormente. Los
resultados están indicados en la Tabla 2, lo que muestra que no se
detectó ARN de EBV en estas muestras a pesar de la presencia de ADN
de HPV (no mostrado) y de ADN de EBV. Esto demuestra la
especificidad de NASBA para EBV.
Dado que las malignidades asociadas a EBV están
caracterizadas por distintos patrones de transcripción de los genes
víricos, asociados con, pero no limitados a, programas de latencia
conocidos, el análisis diferencial de la actividad transcripcional
viral en tejido o fluidos corporales humanos puede ser de
importancia diagnóstica. Como se indica en la Figura 5, NASBA
proporciona una herramienta excelente para este propósito como se
demuestra en este ejemplo por la detección diferencial de
transcritos virales derivados de los genes BARF1 y LMP2.
Para la detección y análisis de la transcripción
de genes específicos de EBV en diferentes tumores humanos, se
extrajo el ARN de tejidos a partir de cortes finos de 4 \mum de
material de tumor congelado disuelto en tampón de lisis de NASBA
empleando el método Boom.
La Figura 4A y 4B muestra los resultados de la
detección del ARN específico de virus derivado de los genes BARF1 y
LMP2 respectivamente, empleando las combinaciones de cebadores 1.2
de BARF1 (SEQ. ID. No.: 23) más 2.1 de BARF1 (SEQ. ID. No.: 24),
que rinden un producto de 252 pb detectable mediante una sonda
marcada con \gamma^{32}P específica de BARF1 (SEQ. ID. No.: 26)
y combinaciones de 1.2 de LMP2 (SEQ. ID. No.: 18) y 2.1 de LMP1
(SEQ. ID. No.: 19), que rinde un producto de 196 pb según se muestra
en la Figura 2. Los resultados indican que la transcripción de
BARF1 es específica para NPC e indetectable en HD, mientras que el
gen LMP2 se transcribe en ambos tipos de tumores.
Estos resultados ilustran el uso del análisis de
NASBA en la detección y diferenciación específica de la actividad
transcripcional de EBV en material de biopsia humana obtenida de
pacientes con distintas malignidades asociadas a EBV.
Dado que la transcripción de genes de EBV puede
variar en las células tumorales individuales y puede ser diferente
en células B infiltrantes de tumor y en células epiteliales
diferenciadas frente a las células malignas del entorno de muestras
de tejido humano, es importante analizar la expresión génica de EBV
a nivel monocelular.
Además, el análisis de la expresión génica
específica de hospedante inducida por virus en las células
infectadas (transformadas), pero también en los tejidos normales de
alrededor y en los linfocitos infiltrantes en el tumor, puede ser
de relevancia para entender la patogénesis viral y las respuestas
del hospedante al virus. El análisis de los transcritos génicos en
los extractos celulares no proporciona información al nivel
monocelular y las técnicas de (RT-)PCR en su mayoría no son muy
compatibles con la preservación de la morfología celular requerida
para el examen histológico.
NASBA, en virtud de la ausencia de ciclo a
temperatura elevada, no destruye el tejido ni la morfología celular
durante la reacción de amplificación y, por tanto, es muy adecuado
para la detección in situ de transcritos poco abundantes
virales y de las células hospedantes y para la expresión génica
relacionada con la síntesis de productos secretados por el
hospedante y víricos que eluden la detección inmunocitoquímica.
Las malignidades asociadas a EBV se caracterizan
por distintos patrones de transcripción de los genes virales,
asociados con los diferentes programas de latencia indicados
anteriormente.
El diagnóstico diferencial empleando el análisis
del patrón de la actividad transcripcional viral en los tejidos o
fluidos corporales humanos es de importancia diagnóstica
clínica.
La diferenciación entre linfoma y malignidades
epiteliales agresivas ricas en linfocitos tales como el cáncer
gástrico (GC), el carcinoma nasofaríngeo (NPC), también llamadas
epiteliomas, es de importancia clara a la vista de las opciones
terapéuticas.
La disponibilidad de un marcador específico para
la vida epitelial de EBV sería de un beneficio obvio. Como muestra
la Figura 6, la transcripción del ARN de BARF1 se detecta de forma
específica en el cáncer gástrico (GC), el carcinoma nasofaríngeo
(NPC), pero no en la enfermedad de Hodgkin (HD) positiva para EBV ni
en linfoma no Hodgkin de células T (T-NHL) o tejidos
control.
La transcripción de BARF1 proporciona, por
tanto, un marcador específico para el diagnóstico diferencial de
las malignidades epiteliales asociadas con EBV.
NASBA proporciona una herramienta excelente para
este propósito, como se demuestra en este ejemplo.
Para la detección y el análisis de la
transcripción de genes específicos de EBV en diferentes tumores
humanos, el ARN se extrajo a partir de cortes de 10 \mum de
material tumoral congelado disuelto en tampón de lisis de NASBA
empleando el método de Boom basado en sílice.
La Figura 6 muestra los resultados de la
detección mediada por NASBA del ARN específico de virus derivado
del gen BARF1, empleando las combinaciones de cebadores 1.2 de BARF1
(Seq. ID 23) más 2.1 de BARF1 (Seq. ID 24), que rindió un producto
de 252 pb detectable mediante una sonda marcada con \gamma^{32}P
específica para BARF1 (Seq. ID 26).
El control positivo (+ con) contiene ARN de una
línea celular de linfoma de Burkitt Louckes negativa para EBV
transfectada de forma estable con el gen BARF1.
El control negativo (- con) consiste en ARN
aislado de carcinoma gástrico negativo para EBV.
También se incluye ARN de la línea RAMOS de
células B negativas para EBV como control de la especificidad. Las
calles marcadas HD y T-NHL representan el análisis
de BARF1 con ARN aislado a partir de linfoma de Hodgkin positivo
para EBV (HD) y linfoma no Hodgkin de células T positivo para EBV
(T-NHL), respectivamente, que ambos mostraron
proteína EBER RISH y LMP1 específica de EBV mediante tinción in
situ y expresión de ARN de EBNA1, LMP1 y LMP2 mediante NASBA
sobre la misma muestra de ARN extraído.
Las muestras de carcinoma nasofaríngeo (NPC) y
ambos carcinomas gástricos (GC) fueron positivos para EBV mediante
el análisis EBER RISH sobre secciones de tejido congelado.
Todas las muestras tienen ARN de buena calidad
como se define por una reacción positiva al ARN de U1A.
Los resultados indican que la transcripción de
BARF1 es específica para NPC y GC, y es indetectable en HD ni
T-NHL positivos para EBV.
Figura 1. Ilustra los resultados de una reacción
típica de NASBA empleando dos combinaciones de grupos de cebadores
derivados de la secuencia BKRF1.
Figura
2.
Los paneles A y B muestran los resultados de las
reacciones NASBA para LMP-1 y LMP-2
en series de diluciones de células JY positivas para EBV en 50.000
células RAMOS negativas para EBV, según se describe para EBNA1.
El panel C muestra los resultados de los ensayos
NASBA para determinar la sensibilidad analítica de
EBER-1.
El panel D muestra los resultados de NASBA de
EBER1 con ARN aislado a partir de series de dilución de células JY
en 50.000 células RAMOS, lo que indica que aproximadamente 100
equivalentes de células JY pueden detectarse.
Figura 3A. Muestra la comparación de los dos
métodos de aislamiento de ARN para el aislamiento de los ARN de
EBER1 de pequeño tamaño.
Figura 3B. Muestra la influencia de la variación
de la concentración de KCl según se aplica a la detección
específica de los transcritos de ARN de BDLF2 específicos para
EBV.
Figura 3C. Muestra la influencia de la adición
de betaína a la mezcla de reacción de NASBA, según se aplica a la
detección específica de los transcritos de ARN de BCRF1 específicos
para EBV.
Figura 4A y 4B. Muestra los resultados para la
detección del ARN específico de virus derivado de los genes BARF1 y
LMP2, respectivamente.
Figura 5. Muestra el resultado de la detección
NASBA in situ de la expresión génica específica de
LMP-2 en células JY, preparadas en agarosa, fijadas
con formalina y embebidas en parafina empleando procedimientos
histológicos estándares.
Figura 6. Muestra los resultados de la detección
mediada por NASBA del ARN específico de virus derivado del gen
BARF1, empleando las combinaciones de cebadores 1.2 de BARF1 (Seq.
ID 23) más 2.1 de BARF1 (Seq. ID 24), lo que rinde un producto de
252 pb detectable mediante una sonda específica de BARF1 marcada con
\gamma^{32}P (Seq. ID 26).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: AKZO NOBEL N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Velperweg 76
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Arnhem
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Países Bajos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Oligonucleótidos para la amplificación y detección de ácido nucleico del virus Epstein Barr (EBV).
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 36
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR EL ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release nº1.0, Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: de cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN: 13
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: de cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus Epstein-Barr
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
Claims (3)
1. Método para identificar carcinoma
nasofaríngeo asociado con EBV en una muestra tumoral, que
comprende:
- -
- amplificar, empleando la técnica NASBA de amplificación basada en la transcripción, una secuencia diana dentro de uno o más ARN de dicha muestra tumoral transcritos a partir de los nucleótidos 165504-166166 de la región que se expande en el marco de lectura de BARF1;
- -
- detección de los productos amplificados e identificación del carcinoma nasofaríngeo asociado a EBV.
2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en
el que los pares de oligonucleótidos empleados en la amplificación
son un par de oligonucleótidos específicos para
BARF-1 que consisten en:
- 1.2,
- 5' -GGCTGTCACCGCTTTCTTGG- 3' [SEQ. ID. No.: 23], y
- 2.1,
- 5' -AGTGTTGGCACTTCTGTGG- 3' [SEQ. ID. No.: 24] proporcionada con una secuencia promotora de la polimerasa T7
- \quad
- 5' -aattctaatacgactcactataggg- 3'.
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