ES2321322T3 - Glicopetidos inmunogenicos para el diagnostico de infecciones por microorganismos patogenos. - Google Patents
Glicopetidos inmunogenicos para el diagnostico de infecciones por microorganismos patogenos. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento in vitro para el diagnóstico de la tuberculosis, caracterizado porque consta de los pasos de: - poner en contacto una muestra biológica de un paciente probablemente infectado por Mycobacterium tuberculosis con un glicopéptido que consiste en la SEQ ID NO:3, derivada de la proteína Apa de M. tuberculosis, y - detectar los linfocitos T CD4+ que reconocen dicho glicopéptido.
Description
Glicopéptidos inmunogénicos para el diagnóstico
de infecciones por microorganismos patógenos.
La presente invención se refiere a un
glicopéptido derivado de la proteína Apa de M. tuberculosis,
que puede utilizarse para el diagnóstico de la tuberculosis.
La infección por M. tuberculosis es una
de las infecciones más graves en la medicina humana. Concretamente,
entre un 5% y un 10% de individuos infectados por M.
tuberculosis que tienen una respuesta inmune normal desarrollan
una enfermedad grave (tuberculosis); la frecuencia es incluso mayor
en individuos que tienen una deficiencia en su respuesta inmune
(infección por VIH, tratamiento con inmunosupresores, etc.).
Entre las diversas técnicas actualmente
disponibles para el diagnóstico de la tuberculosis, se pueden
mencionar:
- -
- la producción de cultivos puros de M. tuberculosis, que es la manera más rigurosa de diagnosticar la tuberculosis con certeza. Es una técnica moderadamente sensible que permite el diagnóstico en 2 de cada 3 casos de tuberculosis pulmonar. Los resultados están disponibles sólo después de un tiempo de espera mínimo de 3 a 4 semanas, algunas veces sólo después de realizar un cultivo durante 2 meses. El uso de técnicas de cultivo empleando precursores marcados hace posible acortar estos tiempos de espera, que sin embargo siguen siendo considerables. Esta detección de M. tuberculosis mediante cultivo requiere una muestra que contenga los bacilos, que a veces es difícil de obtener incluso para la tuberculosis pulmonar, en la cual no se obtiene confirmación biológica en aproximadamente 1 de cada 3 casos. Algunas veces, este examen requiere una intervención médica especializada (punción lumbar del fluido cerebroespinal o biopsia de nodo linfático) para formas extra-pulmonares de la enfermedad.
- -
- las técnicas microbiológicas basadas en la genética molecular (PCR) se enfrentan al mismo requisito de obtener una muestra que contenga bacterias. Además, algunas veces estas técnicas no resultan útiles, debido a la presencia, en la muestra, de inhibidores de la reacción PCR, el origen de los cuales es imposible de controlar. No han sido validadas en la práctica.
- -
- actualmente, no hay ningún diagnóstico del suero que tenga una sensibilidad y una especificidad compatibles con el uso diagnóstico.
- -
- la reacción a la tuberculina muestra que un individuo está sensibilizado, ha sido infectado por M. tuberculosis o ha sido inmunizado con BCG. La tuberculina es, de hecho, una mezcla de antígenos de M. tuberculosis y es por lo tanto incapaz de hacer una distinción entre una infección por M. tuberculosis y una inmunización con BCG, debido a la gran cantidad de reacciones cruzadas entre los antígenos de la vacuna y la M. tuberculosis. Además, esta reacción a la tuberculina no hace posible distinguir una tuberculosis, que es una enfermedad activa, de una infección por M. tuberculosis.
Para combatir la tuberculosis más eficazmente,
sería sensato tener herramientas de diagnóstico específicas.
La proteína denominada Apa,
MPT-32 ó complejo antígeno 45/47 kDa, es una
glicoproteína secretada de M. tuberculosis, que está
codificada por el gen Rv 1860 (Laqueyrerie et al.,
Infect. Immun. 1995, 63:4003-4010). Se ha descrito
que esta molécula Apa de M. tuberculosis contiene de 6 a 9
residuos de manosa unidos, mediante un enlace glicosídico del tipo
\alpha-(1,2), a 4 residuos de treonina (T_{10}, T_{18},
T_{27} y T_{277}) de la siguiente manera: una dimanosa
(T_{10} y T_{18}), una manosa (T_{27}), una manosa, una
dimanosa o una trimanosa (T_{277}), (Dobos et al., J.
Bacteriol., 1996, 178, 2498-2506).
Los inventores han demostrado previamente que
esta proteína, que representa sólo el 2% de las proteínas secretadas
por los bacilos del grupo de la tuberculosis (M.
tuberculosis, M. bovis y BCG) en cultivos, es un
antígeno inmunodominante que es reconocido de manera muy eficaz por
los linfocitos T CD4+ específicos que se obtienen a partir de
animales infectados por M. tuberculosis o inmunizados con BCG
(Romain et al., Inf. Immun., 1999, 67,
5567-5572; Horn et al., J. Biol. Chem., 1999,
274, 32023-32030). En estos mismos estudios, los
inventores también demostraron que la manosilación de la Apa era
esencial para la actividad antigénica de esta proteína.
Los inventores también han demostrado
previamente (Solicitud de Patente Internacional PCT WO 02/50108 y
Solicitud de Patente Estadounidense 2004/0171523) que los residuos
de oligomanosa de las cadenas laterales de la proteína Apa en la
forma nativa, producida por M. tuberculosis o por BCG viva,
juegan un papel en la constitución de los epítopos T glicosilados
(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2) reconocidos selectivamente por animales
inmunizados con la bacteria viva. Los glicopéptidos que consisten
en estos epítopos T glicosilados tienen una actividad antigénica
por lo menos igual a, si no mayor que, la proteína nativa
desglicosilada, la proteína recombinante producida en E.
coli o los antígenos convencionales (cultivos de dichos
microorganismos vivos atenuados, mezclas de antígenos preparados a
partir de dichos cultivos o péptidos no glicosilados) puesto que son
reconocidos por un mayor número de linfocitos T específicos de
bacilos vivos del grupo de la tuberculosis (M. tuberculosis
o BCG). Concretamente, tras la inmunización con bacilos vivos del
grupo de la tuberculosis, se encuentran muchos más linfocitos T
específicos para los glicopéptidos que consisten en estos epítopos T
glicosilados que linfocitos T específicos para los péptidos no
glicosilados con las mismas secuencias.
Los inventores han descubierto ahora que otro
glicopéptido Apa 1-39 (SEQ ID NO:3) en el que los
residuos de treonina en las posiciones 10, 18 y 27 están unidos a
una dimanosa, a una dimanosa, a una manosa, respectivamente
(Thr_{10,18}(\alpha-D-man-(1-2)-\alpha-D-man-(1-2)),Thr_{27}((\alpha-D-man-(1-2))
es capaz de diferenciar a los individuos sanos vacunados con BCG de
los pacientes con tuberculosis activa en un ensayo de linfocitos T
CD4+ y por lo tanto resulta útil para el diagnóstico de la
tuberculosis activa o de primo-infecciones por
tuberculosis.
Un aspecto de la presente invención es un
glicopéptido caracterizado porque consiste en la secuencia SEQ ID
NO:3.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento in vitro para el diagnóstico de la
tuberculosis, caracterizado porque consta de los pasos de:
- -
- poner en contacto una muestra biológica de un paciente probablemente infectado por Mycobacterium tuberculosis con un glicopéptido que consiste en la SEQ ID NO:3, derivada de la proteína Apa de M. tuberculosis, y
- -
- detectar los linfocitos T CD4+ que reconocen dicho glicopéptido.
La detección de los linfocitos T CD4+ se lleva a
cabo mediante cualquier técnica inmunológica convencional que mida
la respuesta de las células T a un antígeno, siendo esta técnica
conocida por los expertos en la materia. Ventajosamente, dicha
detección se lleva a cabo mediante un ensayo de proliferación de
linfocitos o un ensayo de citoquinas (proteína o ARNm).
El ensayo de proliferación puede basarse en la
Extinción de la Fluorescencia Específica de Célula (CSFE) o en la
incorporación de timidina tritiada. El ensayo de citoquinas se puede
llevar a cabo mediante ELISPOT, tinción intracelular de citoquinas,
ELISA o RT-PCR. Las citoquinas que son sometidas al
ensayo incluyen: IFN-\gamma,
IL-2, IL-4, IL-5,
IL-10, IL-12,
IL-15.
La muestra biológica es una suspensión celular
que contiene células T CD4+ positivas. Ventajosamente, es una
suspensión de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). En
dicha muestra biológica, las células CD8+ positivas pueden estar
agotadas o puede estar pre-enriquecida con
linfocitos T mediante un paso preliminar de cultivo in vitro
de las células en presencia del glicopéptido según la invención.
Según una forma de realización preferente de
dicho procedimiento, se pone en contacto una muestra biológica de
dicho paciente probablemente infectado por M. tuberculosis,
preferentemente una suspensión PBMCs, con dicho glicopéptido, y se
detectan los linfocitos T CD4+ que reconocen dicho glicopéptido
mediante un ensayo de proliferación de linfocitos o un ensayo de
citoquinas.
Otro aspecto de la presente invención es un kit
para el diagnóstico de la tuberculosis, caracterizado porque consta
de un glicopéptido que consiste en la SEQ ID NO:3, como se ha
definido anteriormente.
La siguiente descripción se refiere a ejemplos
de implementación de la presente invención y también a los
diagramas adjuntos en los que:
- la Figura 1 representa la síntesis del
glicopéptido Apa 1-39
Thr_{10,18}((\alpha-D-man-(1-2)-\alpha-D-man-(1-2)),Thr_{27}(\alpha-D-man-(1-2).
- la Figura 2 ilustra la proliferación de
linfocitos CD4+ en sujetos vacunados (controles) o en pacientes con
tuberculosis (pacientes), en presencia del glicopéptido SEQ ID NO:3
derivado de la Apa, mediante comparación con la Apa nativa o
desglicosilada, y proteínas estándares purificadas de M.
tuberculosis (PPD), medidas por la Extinción de la
Fluorescencia Específica de Célula (CSFE). El análisis estadístico
se lleva a cabo con la prueba de Mann-Whitney (un
valor de p < 0,05 corresponde a una diferencia significativa
entre los pacientes y los controles). Se indica la proporción de
pacientes que son considerados positivos en el ensayo.
- la Figura 3 ilustra la proliferación de
linfocitos CD4+ en sujetos vacunados (controles) o en pacientes con
tuberculosis (pacientes), en presencia del glicopéptido SEQ ID NO:3
derivado de la Apa, mediante comparación con proteínas estándares
purificadas de M. tuberculosis (PPD), medidas por la
Extinción de la Fluorescencia Específica de Célula (CSFE). El
análisis estadístico se lleva a cabo con la prueba de
Mann-Whitney (un valor de p < 0,05 corresponde a
una diferencia significativa entre los pacientes y los controles).
Se indica la proporción de pacientes que son considerados positivos
en el ensayo.
Ejemplo
1
Se sintetizó el glicopéptido Apa
1-39 (SEQ ID NO:3) por el procedimiento de fase
sólida (Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, a practical approach,
W.C. Chan and P.D. White, 2000, Oxford University press) en un
sintetizador de péptidos totalmente automatizado (Pioneer®, APPLIED
BIOSYSTEMS), utilizando la química del fluorenilmetiloxicarbonil
(Fmoc). Partiendo de 0,1 mmoles de resina
Fmoc-PAL-PEG-PS
(APPLIED BIOSYSTEMS), se realizó la elongación de paso por paso de
la cadena peptídica dos veces, utilizando aminoácidos Fmoc activados
con HATU/DIEA (4 equivalentes). Se incorporaron una vez
Treonina_{10,18} dimanosilada (compuesto 2, Figura 1) y
Treonina_{27} monomanosilada (compuesto 1, Figura 1), utilizando
Dhbt-OH como nucleófilo auxiliar (4 equivalentes;
Jansson et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans I, 1992,
1699-1707). Estas uniones se realizaron manualmente
y se controló la finalización de la reacción mediante la prueba de
ninhidrina de Kaiser (Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, a
practical approach, W.C. Chan and P.D. White, 2000, Oxford
University press). Rendimientos del ensamblaje de la cadena
peptídica: 81% (1,01 g de resina del péptido). A continuación se
sometió la resina del péptido a un tratamiento con TFA/TIS/H_{2}O
95/2,5/2,5 (10 ml/g de resina, durante 2 horas, a temperatura
ambiente) para suministrar el glicopéptido crudo (326 mg,
rendimiento: 72%). La purificación por Cromatografía Líquida de
Media Presión (MPLC) en una columna de preparación Nucleoprep de 20
\mum C18 100 \ring{A} utilizando un gradiente lineal de 50% a
100% de acetonitrilo en TFA acuoso al 0,08% durante 50 minutos a una
velocidad de flujo de 25 ml/min proporcionó el glicopéptido puro
todavía conteniendo el grupo protector en los residuos de manosa
(160 mg, rendimiento de la purificación: 49%). Se consiguió la
desprotección de los grupos acetil y benzoílo de la manosa mediante
metóxido de sodio según el protocolo conocido (Jansson et
al., J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1992,
1699-17072). La purificación final se realizó en una
columna de semi preparación C18 300 \ring{A} de 5 \mum
utilizando un gradiente lineal de 10% a 25% de acetonitrilo en TFA
acuoso al 0,08% durante 20 minutos a una velocidad de flujo de 6
ml/min.
Finalmente se obtuvo el péptido Apa
1-39
Thr_{10,18}(\alpha-D-man-(1-2)-\alpha-D-man-(1-2)),Thr_{27}(\alpha-D-man-(1-2)
puro con un rendimiento del 33% (40 mg), resultando en un
rendimiento global del 9%.
Se estimó la masa en 4373,25\pm0,43
g.mol^{-1} (esperado: 4373,73), mediante espectrometría por spray
de iones.
Se midió un tiempo de retención de 15,65
mediante un equipo analítico HPLC (columna analítica Nucleosil C18
300 \ring{A} 4,6 X 150 mm de 5 \mum, gradiente lineal de 10% a
25% de acetonitrilo en TFA acuoso al 0,08% durante 20 minutos a una
velocidad de flujo de 1 ml/min).
Ejemplo
2
Todos los anticuerpos monoclonales son de
BECKMAN COULTER: CD45/CD4/CD8/CD3 (# 6607013);
CD8-PC5 (# 6607011); CD4-ECD (#
6604727); CD25-RD1 (# 6604422);
CD45RO-PE (# IM1307); CD45RA-ECD (#
IM2711); TCR PAN-PC5 \alpha\beta (# IM2661);
TCR PAN-PC5 \gamma\delta (# IM2662);
CD3-PE (#IM1282); Flow Count (# 7547053); Immunoprep
(# 7546999).
Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica mediante centrifugación en gradiente de Ficoll, según
los protocolos estándares. Se determinaron la numeración de las
células mononucleares, y la determinación de los porcentajes de
linfocitos T, T CD4+ y T CD8+, mediante citometría de flujo,
utilizando un panel de anticuerpos, dirigido contra los siguientes
antígenos de superficie celular: CD45, CD4, CD8 y CD3.
Se cultivaron las células mononucleares aisladas
durante seis días en RPMI (GIBCO) con suero AB (VALBIOTECH) al 20%
como suplemento, a 37ºC, en una incubadora de CO_{2} al 9%, en
presencia o en ausencia de uno de los siguientes preparados de
antígenos:
- -
- PPD: proteínas purificadas estándares de M. tuberculosis (10 mg/ml)
- -
- Apa nativa (10 \mug/ml)
- -
- Apa desglicosilada (10 \mug/ml)
- -
- Péptido sintético glicosilado SEQ ID NO:3 (2 \mug/ml). El glicopéptido SEQ ID NO:3 es uno de los glicopéptidos definidos por la SEQ ID NO:1, en la que los residuos de treonina en las posiciones 10, 18 y 27 de la SEQ ID NO:1 están unidos a una dimanosa, una dimanosa, una manosa, respectivamente (Thr_{10,18}(\alpha-D-man-(1-2)-\alpha-D-man-(1-2)),Thr_{27}(\alpha-D-man-(1-2)).
Se realizó la estimulación por triplicado.
Se incubaron células previamente marcadas con
CSFE, según las instrucciones del fabricante (BIOPROBES) y
estimuladas o no, con los distintos preparados de antígenos,
durante 30 min a temperatura ambiente, con las siguientes
combinaciones de anticuerpos:
CD3-PE/CD4-ECD/CD8-PC5;
CD45-RA-ECD/CD45-RO-PE/TCR\alpha\betab-PC5;
CD25-PE/TCR\delta-PC5 y se
fijaron con paraformaldehido al 2% en PBS. Se evaluó la
proliferación de linfocitos T CD4+ midiendo la pérdida de
fluorescencia CFSE mediante citometría de flujo.
Se incubaron las células estimuladas o no, con
los diferentes preparados de antígenos, durante 18 h en presencia
de 1 \mug Ci^{3}H-timidina, en RPMI + suero AB
al 10%. Las células fueron a continuación lisadas y se midió la
incorporación de la ^{3}H-timidina en las células
mediante conteo por escintilación de radiación beta.
Dos días después de la estimulación con los
diferentes preparados de antígenos, se recogió el sobrenadante del
cultivo y se sometieron las citoquinas
(IFN-\gamma, IL-2,
IL-4, IL-5, IL-10,
IL-12, IL-15) a un ensayo mediante
ELISA utilizando los kits comerciales.
Se sometieron a ensayo doce individuos sanos
vacunados con BCG (controles) y 18 pacientes con tuberculosis
(individuos infectados por M. tuberculosis que presentaban
los síntomas clínicos de la enfermedad de la tuberculosis). Se
analizaron los resultados con la prueba U de
Mann-Whitney, una alternativa no paramétrica más
sensible que la prueba t para muestras independientes. Un valor de p
< 0,05 corresponde a una diferencia significativa entre los
grupos de controles y pacientes.
Los resultados del ensayo de proliferación de
los linfocitos T CD4+ basado en la disolución de CSFE se presentan
en las Figuras 2 y 3.
La estimulación con PPD no permite diferenciar
la respuesta de los pacientes vacunados y de los pacientes con
tuberculosis.
El antígeno Apa nativo estimula más
frecuentemente la respuesta de los pacientes en comparación con los
controles vacunados (8 positivos/18 pacientes); esta diferencia
entre los grupos se pierde con el antígeno desglicosilado.
En cambio, el péptido Apa glicosilado estimula
los linfocitos T CD4+ de la mayoría de los pacientes (13/18 (Figura
2); 14/19 (Figura 3)) y no estimula los linfocitos T CD4+ de los
controles.
Por lo tanto, el glicopéptido resulta útil para
el diagnóstico de la tuberculosis activa o para
primo-infecciones por M. tuberculosis, en un
ensayo de proliferación de T CD4+ o en un ensayo de producción de
citoquinas.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet WO 0250108 A
- \bullet US 20040171523 A
\bulletLAQUEYRERIE et al.
Infect. Immun., 1995, vol. 63,
4003-4010
\bulletDOBOS et al. J.
Bacteriol., 1996, vol. 178,
2498-2506
\bulletROMAIN et al. Inf.
Immun., 1999, vol. 67, 5567-5572
\bulletHORN et al. J. Biol.
Chem., 1999, vol. 274, 32023-32030
\bullet W.C. CHAN; P.D. WHITE.
Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, a practical approach. Oxford
University press, 2000
\bulletJANSSON et al. J.
Chem. Soc., Perkin Trans I, 1992,
1699-1707
\bulletJANSSON et al. J.
Chem. Soc., Perkin Trans I, 1992,
1699-17072
<110> INSTITUT PASTEUR
\hskip1cmMARCHAL, Gilles
\hskip1cmROMAIN, Felix
\hskip1cmPEACHER, Pascale
\hskip1cmBALEUX, Françoise
\hskip1cmSCOTT-ALGARA, Daniel
\hskip1cmMULARD, Laurence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> GLICOPÉPTIDOS INMUNOGÉNICOS PARA EL
DIAGNÓSITICO DE INFECCIONES POR MICROORGANISMOS PATÓGENOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 226PCT86bis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión Patentin 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SECUENCIA ARTIFICIAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GLICOPÉPTIDO SINTÉTICO DERIVADO DE
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlace glicosídico a un disacárido ó
a un trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
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<223> Enlace glicosídico a un disacárido ó
a un trisacárido
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlace glicosídico a un disacárido ó
a un trisacárido
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<220>
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<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amidación
\newpage
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<400> 1
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\hskip1cm
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<210> 2
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<211> 26
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<212> PRT
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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL
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<223> GLICOPÉPTIDO SINTÉTICO DERIVADO DE
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
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<221> MOD_RES
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<222> (1)..(1)
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<223> acetilación
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (17)..(17)
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<223> Enlace glicosídico a un disacárido ó
a un trisacárido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\hskip1cm
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<210> 3
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<211> 39
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<212> PRT
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<213> SECUENCIA ARTIFICIAL
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<220>
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<223> glicopéptido sintético derivado de
Mycobacterium tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
alfa-D-man-(1-2)-alfa-D-man-(1-2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
alfa-D-man-(1-2)-alfa-D-man-(1-2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
alfa-D-man-(1-2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
Claims (6)
1. Procedimiento in vitro para el
diagnóstico de la tuberculosis, caracterizado porque consta
de los pasos de:
- -
- poner en contacto una muestra biológica de un paciente probablemente infectado por Mycobacterium tuberculosis con un glicopéptido que consiste en la SEQ ID NO:3, derivada de la proteína Apa de M. tuberculosis, y
- -
- detectar los linfocitos T CD4+ que reconocen dicho glicopéptido.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha detección se lleva a cabo mediante un ensayo de
proliferación de linfocitos.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha detección se lleva a cabo mediante un ensayo de
citoquinas.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha muestra biológica consiste
en células mononucleares de sangre periférica.
5. Kit para el diagnóstico de la tuberculosis,
caracterizado porque consta de por lo menos un glicopéptido
que consiste en la SEQ ID NO:3, derivada de M. tuberculosis,
como se define en la reivindicación 1.
6. Glicopéptido caracterizado porque
consiste en la secuencia SEQ ID NO:3.
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