ES2316147T3 - Anticuerpos monoclonales que bloquean la union de ligando con el receptor cd22 en las celulas b maduras. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION CONCIERNE A UNA SERIE DE NUEVOS ANTICUERPOS MONOCLONICOS DIRIGIDOS CONTRA CD22, UN MIEMBRO RESTRINGIDO DE LINAJE B DE LA SUPERFAMILIA DE LAS IG QUE SIRVE COMO UN RECEPTOR DE ADHESION EXPRESADO POR LINFOCITOS B MADUROS Y ESTA DESTINADO A FUNCION EN LA REGULACION DE ACTIVACION DE CELULA B. LOS ANTICUERPOS (MAB) MONOCLONICOS BLOQUEAN ESPECIFICAMENTE ADHESION (80-100%) DE ERITROCITOS Y LEUCOCITOS A CELULAS COS TRANFIXIONADAS CON CDNA DE CD22 Y TAMBIEN IDENTIFICAR UNA REGION DE CD22 DISTINTA DE AQUELLAS DEFINIDAS POR CD22 MAB PREVIAMENTE DESCRITAS. LA INVENCION TAMBIEN INCLUYE COMPOSICIONES TERAPEUTICAS QUE INCLUYEN CANTIDADES TERAPEUTICAMENTE EFECTIVAS DE UN POLIPEPTIDO QUE COMPRENDE EL LIGANTE CD22 O PORCION DE EL O DE UN POLIPEPTIDO QUE COMPRENDE LOS DOS PRIMEROS DOMINIOS DE TIPO TERMINALES AMINO DE IG DE CD22, O EL LIGANTE QUE ENLAZA LA PORCION DE EL. LOS ANTICUERPOS Y POLIPEPTIDOS DE LA INVENCION ENCUENTRAN APLICACION EN METODOS TERAPEUTICOS PARA TRATAMIENTO DE HUMANOSPARA RETARDAR O BLOQUEAR FUNCION ADHESIVA DE CD22, PARTICULARMENTE EN ENFERMEDADES AUTOINMUNES.
Description
Anticuerpos monoclonales que bloquean la unión
de ligando con el receptor CD22 en las células B maduras.
La invención se refiere a anticuerpos
monoclonales. Como resultará evidente de la siguiente descripción,
los inventores proporcionan anticuerpos que bloquean la adhesión de
los eritrocitos y leucocitos con el receptor CD22 en las células B
maduras.
La proliferación y diferenciación de las células
B es un proceso complejo dirigido y regulado a través de
interacciones con otros muchos tipos de células. Entre las moléculas
específicas de las células B implicadas en este proceso, se cree
que CD22 juega un papel significativo debido a que es una molécula
de adhesión de las células B que puede funcionar en interacciones
homotípicas o heterotípicas (Stamenkovic y col., Nature 344:74
(1990); Wilson y col., J. Exp. Med. 173:137 (1991); Stamenkovic y
col., Cell 66:1133 (1991)). La proteína CD22 se expresa en el
citoplasma del progenitor B y en las células pre-B
(Dörken y col., J. Immunol. 136:4470 (1986); Dörken y col.,
"Expression of cytoplasmic CD22 en B-cell
ontogeny". En Leukocyte Typing III. White Cell Differentiation
Antigens. McMichael y col., eds., Oxford University Press, Oxford,
p. 474 (1987); Schwarting y col., Blood 65:974 (1985); Mason y
col., Blood 69:836 (1987)), pero se encuentra únicamente en la
superficie de las células B maduras, estando presente al mismo
tiempo como IgD superficial (Dörken y col., J. Immunol. 136:4470
(186)). La expresión de CD22 aumenta tras la activación y desaparece
con la diferenciación adicional (Wilson y col., J. Exp. Med.
173:137 (1991); Dörken y col., J. Immunol. 136:4470 (1986)). En los
tejidos linfoides, CD22 se expresa mediante las células B del manto
folicular y la zona marginal, pero solo débilmente mediante las
células B del centro germinal (Dörken y col., J. Immunol. 136:4470
(1986); Ling y col., "B-cell and plasma antigens:
new and previously defined clusters" en leukocyte Typing III.
White Cell Differentiation Antigens, McMichael y col., eds., Oxford
University Press, Oxford, p. 302 (1987)). Sin embargo, la
hibridación in situ revela la expresión más fuerte del ARNm
de CD22 en el interior del centro germinal y la expresión más débil
en la zona del manto (Wilson y col., J. Exp. Med. 173:137 (1991)).
CD22 está probablemente implicada en la regulación de la activación
de las células B debido a que se ha encontrado que la unión del mAb
de CD22 con las células B in vitro aumenta tanto el
incremento del calcio libre intracelular como la proliferación
inducida tras el entrecruzamiento de la Ig superficial (Pezzutto y
col., J Immunol. 138:98 (1987); Pezzutto y col., J. Immunol.
140:1791 (1988)). Otros estudios han determinado, sin embargo, que
el aumento de la proliferación inducida anti-Ig es
moderado (Dörken y col., J. Immunol. 136:4470 (1986)). CD22 se
fosforila constitutivamente, pero el nivel de fosforilación aumenta
tras el tratamiento de las células con PMA (Boue y col., J. Immunol.
140:192 (1988). Además, una forma soluble de CD22 inhibe la
activación mediada por CD3 de las células T humanas, sugiriendo que
CD22 puede ser importante en las interacciones células T- células B
(Stamenkovic y col., Cell 66:1133 (1991)).
Se ha aislado el ADNc que codifica la proteína
CD22 por dos grupos de investigación diferentes, revelando que la
proteína es un miembro de la superfamilia de Ig homólogas de la
glicoproteína asociada a mielina (MAG), antígeno carcinoembriónico
(CEA), y molécula de adhesión a células neurales
(N-CAM) (Stamenkovic y col., Nature 344:74 (1990);
Wilson y col., J. Exp. Med. 173:137 (1991)). El primer ADNc de CD22
aislado codifica una proteína con 5 regiones extracelulares
similares a Ig que media en la unión de monocitos y eritrocitos a
las células COS transfectadas con el ADNc (Stamenkovic y col.,
Nature 344:74 (1990)). Un segundo ADNc de CD22 aislado codifica una
región extracelular de 7 regiones similares a Ig y una cola
citoplásmica que tiene una secuencia COOH diferente que es 23
aminoácidos más larga que la secuencia COOH del primer ADNc aislado
(Wilson y col., J. Exp. Med. 173:137 (1991)). Este ADNc de CD22 de
longitud completa codifica una proteína con una región con NH_{2}
terminal único similar a V y 6 regiones de tipo C, que media en la
unión de los linfocitos T y B con las células COS transfectadas
(Stamenkovic y col., Nature 344:74 (1990). Wilson y col., J. Exp.
Med. 173:137 (1991)). La traducción in vitro de un ADNc de
CD22 de longitud completa genera una proteína de 95.000 M, y la
porción extracelular predicha de la molécula tiene 12 emplazamientos
de glicosilación enlazados con N (Wilson y col., J. Exp. Med.
173:137 (1991)), que es coherente para una proteína de 140.000
M_{r}. Se ha informado que la especie de 7 regiones similar a Ig
de CD22 es un ligando específico de células B para CD45RO en los
linfocitos T y un receptor de la
\alpha2,6-sialiltransferasa, CDw75, en los
linfocitos B (Stamenkovic y col., Cell 66:1133 (1991)).
Los estudios de inhibición de la unión
competitiva usando mAb prototipo marcado con ^{125}I en un
radioinmunoensayo celular (CRIA) en la línea celular JOK1 ha
revelado cinco epitopos diferentes reconocidos mediante 12
anticuerpos monoclonales anti-CD22 ensayados. Dos
epitopos independientes se representan mediante el mAb de HD39,
HD239, S-HCL1, y BL9 (epitopo A) y OTH228 (epitopo
E). Otros tres epitopos representados por el mAb de HD6 (epitopo
B), mAb de To15, G28-7 (epitopo C), y mAb de
BL-3C4 (epitopo D) parecen estar estrechamente
relacionados entre sí debido a que algunos mAb mostraron reacciones
de superposición. Los anticuerpos OM-124 y 3G5
reaccionan con ambos epitopos B y C mientras que el mAb de IS7
reacciona probablemente con ambos epitopos B y D
(Schwartz-Albiez y col., "The carbohydrate moiety
of the CD22 antigen can be modulated by inhibitors of the
glycosylation pathway". En Leukocyte Typing IV. White Cell
Differentiation Antigens. Knapp y col., eds., Oxford University
Press, Oxford, p. 65 (1989)).
Se ha informado que las células COS
transfectadas con un ADNc de CD22 que carece de las regiones 3 y 4
similares a Ig expresan los epitopos A y D de CD22 y carecen de los
epitopos B, C y E (Stamenkovic y col., Nature 344:74 (1990). En
ensayos de roseta usando este ADNc para transfectar células COS, el
mAb que se une al epitopo A (S-HCL1) bloquea la
unión de RBC mientras que no bloquea la unión del mAb con el epitopo
D (BL-3C4). Por el contrario, la preincubación de
células COS transfectadas con cualquiera del mAb del antiepitopo A
(S-HCL1) o antiepitopo D (BL-3C4)
fracasa en el bloqueo de la adhesión celular de monocitos, pero
cuando ambos anticuerpos se usan en conjunción, se observó un
bloqueo parcial. Estos resultados sugieren que diferentes epitopos
de CD22 participan en la adhesión de eritrocitos y monocitos y que
se pueden reconocer diferentes ligandos por cada epitopo
(Stamenkovic y col., Nature 344: 74 (1990)).
Sería claramente ventajoso un mAb adicional que
presente capacidad para bloquear completamente la unión de CD22 con
todos los tipos de leucocitos. Dicho mAb podría usarse en
procedimientos terapéuticos para tratar pacientes para retardar o
bloquear la función de las células B, particularmente en la
enfermedad autoinmune.
El documento
WO-A-93/05814 desvela supuestamente
una sustancia que se une a un ligando específico de CD22\beta,
bloqueando de esta manera la unión de una célula B que soporta
CD22\beta con el ligando.
De acuerdo con un primer aspecto se proporciona
un anticuerpo monoclonal que:
- \quad
- se produce mediante una línea celular de hibridoma seleccionada entre el grupo constituido por HB22-7 (ATCC NºHB 11347), HB22-22 (ATCC NºHB 11348) y HB22-23 (ATCC NºHB11349); o
- \quad
- se une al mismo determinante antigénico que un anticuerpo monoclonal producido mediante una línea celular de hibridoma seleccionada entre el grupo constituido por HB22-7 (ATCC NºHB 11347), HB22-22 (ATCC NºHB 11348) y HB22-23 (ATCC NºHB 11349); o
un fragmento Fab, F(ab')_{2} o Fv o
conjugado de un anticuerpo monoclonal producido mediante una línea
celular de hibridoma seleccionada entre el grupo constituido por
HB22-7 (ATCC NºHB11347), HB22-22
(ATCC NºHB 11348) y HB22-23 (ATCC NºHB 11349).
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con un aspecto alternativo de esta
invención, los inventores proporcionan una línea celular continua
que produce un anticuerpo monoclonal que se une al mismo
determinante antigénico que un anticuerpo monoclonal producido
mediante una línea celular de hibridoma seleccionada entre
HB-22-7 (ATCC NºHB 11347)
HB22-22 (ATCC NºHB 11348) y HB22-33
(ATCC NºHB 11349).
La invención proporciona, en un aspecto
alternativo adicional de la misma, una línea celular de hibridoma
seleccionada entre HB22-7 (ATCC NºHB 11347,
HB22-22 (ATCC NºHB 11348) y HB22-23
(ATCC NºHB 11349).
Se proporciona, en una forma de realización de
la invención, una composición terapéutica que comprende una
sustancia vehículo farmacéuticamente aceptable o anticuerpo
monoclonal de acuerdo con la presente invención.
Los inventores describen a continuación
anticuerpos monoclonales, HB22, que identifican una región del
receptor CD22 que es distinta de aquella definida por los
anticuerpos monoclonales CD22 anteriormente descritos (mAb). Los
inventores han encontrado que los mAb HB22 son ubicuos en las clases
IgA, IgG (específicamente las subclases 2a y 2b), e IgM. Los mAb
HB22 bloquean específicamente la adhesión (80%-100%) de una amplia
variedad de tipos de células, que incluyen los glóbulos rojos de la
sangre, los linfocitos T, linfocitos B, monocitos y neutrófilos,
con CD22. Por tanto, estos anticuerpos pueden ser útiles en
procedimientos terapéuticos para el tratamiento de pacientes para
retardar o bloquear la activación de las células T, concretamente en
la enfermedad autoinmune.
La mayor parte de las enfermedades autoinmunes
son el resultado de, o están agravadas por, la producción de
anticuerpos reactivos con tejidos corporales normales. Todos los
anticuerpos se producen por las células B tras la estimulación y
activación del antígeno. Por tanto, el bloqueo de la función de CD22
puede ser crítico para la adhesión de las células B normales que
incluyen anticuerpos autoreactivos. Esto podría aliviar el
mecanismo de la enfermedad o las características clínicas asociadas
con muchos síndromes autoinmunes, incluyendo glomerulonefritis,
síndrome de Goodspature, vasculitis necrotizante, linfadenitis,
periarteritis nodosa, lupus sistémico eritematoso y artritis,
púrpura trombocitopénico, agranulocitosis, anemias hemolíticas
autoinmunes, reacciones inmunes contra los antígenos anteriores que
incluyen los grupos sanguíneos A-B-O
fetales durante el embarazo, miastenia grave, diabetes resistente a
la insulina, enfermedad de Graves, y respuestas alérgicas y tumores
de las células B humanas.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las formas
de realización preferidas de la misma, tomadas en conjunción con los
dibujos que la acompañan en los que:
La Fig. 1 muestra la unión de diversos tipos de
células y líneas celulares con células COS no transfectadas, con
células COS transfectadas con ADNc de CD22, y con células
transfectadas en presencia de un ejemplo de un anticuerpo
monoclonal de acuerdo con la invención;
La Fig. 2 muestra las curvas de dosis respuesta
para tres mAb de la invención en comparación con el mAb de CD22
anteriormente descrito, HD239;
La Fig. 3 muestra la especificidad del epitopo
de mAb de CD22 de la técnica anterior;
La Fig. 4 muestra el bloqueo de la unión del mAb
HB22-7 con las células Daudi mediante el mAb de CD22
de la invención en comparación con el mAb de CD22 anteriormente
aislado;
Las Figs. 5A y 5B muestran el bloqueo de las
células T y la unión de las células Ramos, respectivamente, con el
ADNc de CD22 de células COS transfectadas mediante diversos mAb en
la forma fluida de ascites en comparación con el bloqueo mediante
el mAb CD45RO de UCHL-1 aislado de fluido de
ascites;
La Fig. 6 muestra la sensibilidad del ligando de
CD22 al tratamiento con neuraminidasa;
Las Figs. 7A-7C muestra la
hibridación de las isoformas CD22 generadas a partir de diferentes
líneas de células B con sondas que corresponden a la segunda y
quinta regiones similares a Ig de CD22, la segunda región de CD22,
y la unión de las regiones 3 y 4, respectivamente;
Las Figs. 7D y 7E muestran la expresión de las
isoformas CD22 de la superficie celular mediante líneas de células
Daudi y BJAB, respectivamente;
La Fig. 8 muestra un dibujo esquemático de las
formas truncadas de CD22; y
La Fig. 9 muestra el motivo de aminoácido
conservado propuesto implicado en la unión de la integrina con los
miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores describen a continuación una
serie de anticuerpos monoclonales nuevos (mAb), designados HB22,
que bloquean específicamente la adhesión celular a CD22, un receptor
de la adhesión expresado por los linfocitos B maduros, y
procedimientos terapéuticos que emplean el mAb. Se puede usar el mAb
HB22 para retardar o bloquear la función de adhesión de CD22,
concretamente en la enfermedad autoinmune, tal como se ha descrito
anteriormente.
Se pueden preparar los anticuerpos monoclonales
de los inventores mediante técnicas de fusión del hibridoma o
mediante técnicas que utilizan tecnologías de inmortalización
mediante el virus de Epstein Barr (EBV) (para producir mAb humanos)
tal como son bien conocidas por las personas expertas en la
técnica.
Estas técnicas implican la inyección de un
inmunógeno (por ejemplo, antígeno purificado o células o extractos
celulares que transportan el antígeno) en un animal (por ejemplo, un
ratón) con el fin de estimular una respuesta inmune deseada (es
decir, la producción de anticuerpos) en este animal. En el ejemplo
ilustrativo del presente documento, se usó como inmunógeno una
línea de células pre-B de ratón, transfectada de
manera estable con un ADNc de CD22 de longitud completa. Se
inyectaron las células, por ejemplo, en un ratón y, tras un tiempo
suficiente, se sacrificó el ratón y se pudieron derivar las células
productoras de anticuerpos somáticos de los nódulos linfáticos,
bazos y sangre periférica de los animales preparados. Se prefieren
las células de bazo. Los linfocitos de ratón proporcionan un
porcentaje mayor de fusiones estables con los mielomas de ratón
descritos a continuación. Es también posible el uso de rata, conejo,
rana, oveja y otras células somáticas de mamíferos. Los cromosomas
de las células de bazo que codifican las inmunoglobulinas deseadas
se inmortalizan fusionando las células del bazo con las células de
mieloma, en general en presencia de un agente de fusión tal como
politilenglicol (PEG). Se puede usar cualquiera de las numerosas
líneas celulares de mieloma como una pareja de fusión de acuerdo
con las técnicas estándar, por ejemplo, las líneas de mieloma
P3-NS1/1-Ag4-1,
P3-x63-Ag8.653 o
Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están
disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC),
Rockville, MD.
Las células resultantes, que incluyen los
hibridomas deseados, se hacen crecer a continuación en un medio
selectivo, tal como medio HAT, en el que las células de mieloma
parental o los linfocitos no fusionados mueren eventualmente.
Únicamente sobreviven las células de hibridoma y se pueden hacer
crecer bajo condiciones de dilución limitantes para obtener clones
aislados. Se seleccionan los sobrenadantes de los hibridomas para
la presencia del anticuerpo de especificidad deseada, por ejemplo,
mediante técnicas de inmunoensayo usando el antígeno que se ha
usado para la inmunización. A continuación se pueden subclonar los
clones positivos bajo condiciones de dilución limitantes y se puede
aislar el anticuerpo monoclonal producido. Existen diversos
procedimientos convencionales para el aislamiento y la purificación
de los anticuerpos monoclonales con el fin de liberarlos de otras
proteínas y otros contaminantes. Los procedimientos comúnmente
usados para purificar anticuerpos monoclonales incluyen
precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio
iónico, y cromatografía de afinidad (véase, por ejemplo; Harlow y
col., Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, pp. 1-726, 1988). Se pueden propagar
in vitro o in vivo (en fluido de ascites) los
hibridomas producidos de acuerdo con estos procedimientos usando las
técnicas conocidas en la técnica (véase, generalmente, Fink y col.,
más arriba, en la página 123, Fig. 6-1).
Generalmente, la línea celular individual se
puede propagar in vitro, por ejemplo en recipientes de
cultivo de laboratorio, y se puede cosechar el medio de cultivo que
contiene altas concentraciones de un anticuerpo monoclonal
específico único mediante decantación, filtración o centrifugación.
Alternativamente, se puede potenciar el resultado del anticuerpo
monoclonal inyectando una muestra del hibridoma en un animal
histocompatible del tipo usado para proporcionar las células
somáticas y de mieloma para la fusión original. Los tumores que
segregan el anticuerpo monoclonal específico producen el desarrollo
del híbrido celular fusionado en el animal inyectado. Los fluidos
corporales del animal, tales como el fluido o el suero de ascites,
proporcionan anticuerpos monoclonales en elevadas concentraciones.
Tal como se ha discutido por Cole y col., más arriba, cuando se
usan hibridomas humanos o hibridomas de EBV, es necesario evitar el
rechazo del xenoinjerto inyectado en animales tales como ratones.
Se pueden usar ratones inmunodeficientes o desnudos o se puede pasar
el hibridoma en primer lugar por ratones desnudos irradiados en
forma de tumor subcutáneo sólido, cultivado in vitro, y a
continuación inyectarse intraperitonealmente en ratones desnudos
irradiados preparados prístinos, que desarrollan tumores de ascites
que segregan grandes cantidades de anticuerpos monoclonales humanos
específicos (véase Cole y col., más arriba).
Para algunas aplicaciones terapéuticas pueden
ser preferibles anticuerpos quiméricos
(ratón-humano) o monoclonales humanos a los
anticuerpos de murino, debido a que los pacientes tratados con
anticuerpos de ratón generan anticuerpos humano antiratón, (Shawler
y col., J. Immunol. 135:1530-35 (1985)). Se pueden
producir anticuerpos monoclonales ratón-humano
quiméricos reactivos con el antígeno de CD22, por ejemplo, mediante
técnicas recientemente desarrolladas para la producción de
anticuerpos quiméricos (Oi y col., Biotechnologies
4(3):214-221 (1986); Liu y col., Proc. Natl.
Acad. Sci: (EE.UU.) 84:3439-43 (1987)). De acuerdo
con esto, los genes que codifican para las regiones constantes de
las moléculas del anticuerpo HB22 de murino se sustituyen con genes
humanos que codifican las regiones constantes de un anticuerpo con
actividad biológica apropiada (tal como la capacidad para activar
el complemento humano y mediar la citotoxicidad celular dependiente
de anticuerpo (ADCC)).
De acuerdo con una forma de realización
preferida, los anticuerpos, designados mAb HB22, se produjeron
mediante técnicas de hibridoma usando una línea 300.19 de células
pre-B de ratón transfectada de manera estable con
ADNc de CD22 de longitud completa, como inmunógeno, tal como se
describe con más detalle a continuación. Los hibridomas HB22
individuales que producen anticuerpos HB22 se identifican como
HB22-7, HB22-22,
HB22-23, y HB22-33. Los mAb
HB-22 producidos por los hibridomas relacionados
anteriormente son del isotipo IgG2b, IgGa, IgG2a, e IgM,
respectivamente. Los anticuerpos presentan una inhibición muy fuerte
de la unión de una amplia variedad de tipos de células con el
receptor CD22 superficial celular, una propiedad que no se había
demostrado en el anti-mAb de CD22 aislado
anteriormente (Stamenkovic y col., Cell 66:1133 (1991)).
Debería entenderse que la presente invención
abarca el anticuerpo HB22 descrito anteriormente y cualquier
fragmento del mismo que contenga la región de unión activa del
mismo, tal como los fragmentos Fab, F(ab')_{2} y Fv. Se
puede producir dicho fragmento a partir del anticuerpo HB22 usando
las técnicas bien establecidas en la técnica (véase, por ejemplo,
Rousseaux y col., en Methods Enzymol., 121:663-69
Academic Press, (1986)).
Adicionalmente, la presente invención abarca los
anticuerpos que son capaces de unirse con los mismos determinantes
antigénicos que el anticuerpo HB22 ya identificado y que compiten
con estos anticuerpos HB22 para la unión en dichos emplazamientos.
Estos incluyen los anticuerpos que tienen la misma especificidad
antigénica que el anticuerpo HB22, pero difieren en el origen o el
isotipo de la especie. Por ejemplo, se pueden construir la clase,
el isotipo y otras variantes del anticuerpo usando cambios de clase
recombinantes y técnicas de fusión conocidas en la técnica (véase,
por ejemplo, Thammana y col., Eur. J. Immunol. 13:614 (1983); Spira
y col., J. Immunol. Meth. 74:307-15 (1984);
Neuberger y col., Nature, 312:604-08 (1984); y Oi y
col., más arriba)). De esta manera, los anticuerpos quiméricos u
otros anticuerpos recombinantes (por ejemplo, anticuerpo fusionado
a una segunda proteína tal como una linfoquina) que tiene la misma
especificidad de bloqueo del ligando que el anticuerpo HB22, entran
dentro del alcance de esta invención.
Se puede usar el mAb de H22 para aislar y
caracterizar el ligando de CD22 y para identificar las regiones
funcionales de unión con el ligando en CD22. Como se describirá con
más detalle a continuación, se ha usado CD22 como sonda para
identificar y caracterizar adicionalmente el(los)
epitopo(s) reconocido(s) por los anticuerpos.
Se pueden usar terapéuticamente los anticuerpos
quiméricos u otros anticuerpos o polipéptidos HB22 recombinantes,
como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, se puede unir una
proteína de fusión que comprende al menos la región de unión al
antígeno de un anticuerpo HB22 con una porción de una segunda
proteína vehículo. Similarmente, se pueden unir polipéptidos con
proteínas vehículo. Adicionalmente, se puede formar un anticuerpo
HB22 quimérico en el que la región de unión al antígeno del mAb
puede unirse a porciones o fragmentos de una molécula de Ig humana.
Además, se pueden usar las técnicas recombinantes conocidas en la
técnica para construir anticuerpos biespecíficos en los que una de
las especificidades de la unión del anticuerpo es la de HB22 (véase,
por ejemplo, Pat. de los EE.UU. Nº4.474.893).
Es evidente por tanto que la presente invención
abarca composiciones, combinaciones y procedimientos farmacéuticos
para bloquear la función de adhesión de CD22. Por ejemplo, la
invención incluye composiciones farmacéuticas para uso en el
tratamiento de la enfermedad autoinmune que comprenden una cantidad
farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo HB22 definido en el
presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las
composiciones pueden contener el anticuerpo HB22, no modificado,
conjugado con una segunda proteína o porción de proteína o en forma
recombinante (por ejemplo, HB22 quimérico o biespecífico). Las
composiciones pueden incluir adicionalmente otros anticuerpos o
conjugados.
Las composiciones de anticuerpos de los
inventores se pueden administrar usando modos convencionales de
administración que incluyen, pero no se limitan a, intravenosa,
intraarterial, intraperitoneal, oral, intralinfática o
intramuscular. Se prefiere la administración intravenosa. Las
composiciones pueden estar en una variedad de formas de
dosificación, dependiendo la forma preferida del modo de
administración y la aplicación terapéutica. La dosificación y los
modos de administración óptimos para un paciente individual pueden
determinarse fácilmente mediante protocolos convencionales. Una
dosificación eficaz de suero de las composiciones de anticuerpo de
esta invención puede estar en el intervalo de entre aproximadamente
1 a aproximadamente 100 \mug/ml, y preferiblemente 10 \mug/ml,
dando como resultado 1 mg/kg de peso corporal del paciente.
Se aislaron los anticuerpos monoclonales
preferidos en un estudio llevado a cabo para determinar la
distribución y naturaleza biomecánica del(de los)
ligando(s) de CD22. Se analizó la distribución del(de
los) ligando(s) de CD22 usando un panel de tipos celulares y
líneas celulares diferentes que se examinaron para su capacidad de
unirse a las células COS transfectadas transitoriamente con un ADNc
de CD22 de longitud completa (COS-CD22). Se
llevaron a cabo los ensayos de adhesión 48 h después de la
transfección del ADNc, y se examinaron las células COS
transfectadas para la presencia de rosetas celulares. Muchos de los
leucocitos y líneas celulares se unieron a las células COS tanto
transfectadas como no transfectadas cuando se llevaron a cabo los
ensayos a temperatura ambiente o a 37ºC. Sin embargo, la formación
de roseta específica de CD22 con las células
COS-CD22 fue similar a 4º y a 37ºC, por lo que los
ensayos de adhesión se llevaron a cabo a 4ºC para eliminar la unión
celular no específica y mediada por integrina (CD11/CD18). Tal como
se muestra en la Tabla I, las células T de la sangre y las células
B del bazo se unen con avidez a las células COS-CD22
mientras que no se unen a las células COS transfectadas con el
vector sólo. Adicionalmente, las células COS transfectadas con el
ADNc de CD22 de longitud completa fueron capaces de mediar en la
unión de monocitos y eritrocitos tal como se había demostrado
anteriormente para un ADNc de CD22 truncado (Stamenkovic y col.,
Nature 344:74 (1990)). Aunque no se ha informado anteriormente, tal
como se muestra en la Fig. 1, los neutrófilos expresan también
el(los) ligando(s) CD22 ya que la unión de los
neutrófilos a células COS transfectadas con ADNc de CD22 fue
extensiva. Todas las líneas celulares pre-B y B
examinadas se unen a las células COS transfectadas con CD22
(NALM-6, Daudi, Raji, Ramos, BJAB, Arent y CESS);
se unen dos de las cuatro líneas de células T (CEM y Jurkat); se une
la línea celular de eritroleucemia K562; y no se une la línea de
células mielomonocíticas HL-60. De manera
interesante, la línea de células pre-B de ratón,
300.19, enlaza también específicamente con las células transfectadas
con ADNc de CD22 humano, sugiriendo que los ligandos CD22 humano y
de ratón son estructuralmente similares. La especificidad de la
unión para las diferentes células y líneas celulares se demostró
bloqueando la unión con un mAb de CD22 producido de nuevo. En
referencia a la Fig. 1, puede observarse que en presencia del mAb de
CD22 HB22-23 (a 5 \mug/ml), la unión de las
células T de la sangre, células B de Daudi, monocitos, glóbulos
rojos (RBC), y neutrófilos con las células COS transfectadas fue muy
reducida.
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Aunque se han postulado CD45RO, CDw75 y el
propio CD22 para representar los ligandos de CD22, como se muestra
en la Tabla I, la adhesión celular no se correlaciona estrictamente
con la expresión de estas moléculas. Por ejemplo, la línea de
células pre-B de NALM-6 y la línea
de células T Jurkat, que no expresan estas moléculas, se unen
específicamente con las células COS transfectadas. Estos resultados
sugieren que otros ligandos además de CD45RO, CDw75 y CD22
participan en la adhesión medida por CD22.
Se produjo un panel de 33 nuevos mAb de CD22
para examinar adicionalmente la adhesión mediada por CD22, tal como
se describe con más detalle a continuación. Se seleccionó cada mAb
como reactivo con las células L transfectadas con ADNc de CD22
(línea celular de fibroblastos) y células 300.19 transfectadas de
ratón, pero no con células parentales no transfectadas.
Adicionalmente, se hizo reaccionar el mAb con las líneas de células
DAUDI y BJAB, pero no con la línea de células Jurkat. Además, se
hizo reaccionar el mAb con únicamente una porción pequeña de
linfocitos de la sangre (5-10%) coherente con su
reconocimiento de CD22 en las células B. Tal como se muestra en la
Tabla II, cuatro de los 33 mAb, HB22-7,
HB22-22, HB22-23 y
HB22-33, bloquearon completamente
(80-100%) la unión de las células Daudi, Raji y
Jurkat con las células COS-CD22. Otros cuatro mAb,
HB22-5, HB22-13,
HB22-24 y HB22-28, bloquearon
parcialmente la adhesión (20-80%) y 25 mAb tuvieron
poco o ningún efecto sobre la unión celular con las células
COS-CD22. Se seleccionaron los mAb
HB22-7, HB22-22,
HB22-23 y HB22-33 como formas de
realización representantes del anticuerpo monoclonal de acuerdo con
la invención.
La capacidad del mAb de los inventores para
inhibir la unión de los glóbulos rojos (RBC) con las células
COS-CD22 fue un indicador más sensible de lo que
puede ser la capacidad de bloqueo, ya que el mAb que bloqueaba sólo
parcialmente la unión de la línea de células B podría bloquear
completamente la unión de RBC. Sin embargo, el fluido sobrenadante
del hibridoma contenía por sí mismo una sustancia inhibidora ya que
el fluido sobrenadante añadido durante los ensayos de unión en
ausencia del mAb añadido bloqueó la unión de RBC con las células
COS-CD22. Cuando las células
COS-CD22 se trataron en primer lugar con fluido
sobrenadante, lavadas a continuación antes del ensayo, únicamente
el mAb que bloqueó la unión de la línea celular con las células COS
bloqueó la unión de RBC. Se examinó cada mAb a una concentración de
dos a seis veces mayor que la requerida para la tinción de
inmunofluorescencia óptima, de tal manera que el fracaso de la mayor
parte del mAb en bloquear la unión no se puede atribuir a las bajas
concentraciones de mAb.
Se seleccionaron los cuatro mAb capaces de
bloquear completamente (80-100%) la línea celular y
la unión de RBC con las células COS transfectadas con CD22 como
aquellos que serían más útiles para retrasar o evitar la función de
CD22 y, de esta manera, como formas de realización preferidas de los
anticuerpos de acuerdo con la invención.
Se purificaron los mAb HB22-7,
HB22-23 y HB22-33 y se usaron para
determinar la cantidad de mAb de CD22 necesaria para bloquear la
función del receptor CD22. Tal como se muestra en la Fig. 2, estos
tres mAb fueron similares en su capacidad de bloquear la unión de
las células Daudi con las células COS-CD22,
inhibiendo HB22-33 ligeramente más en múltiples
experimentos. En promedio, estos tres mAb a concentraciones de 10
\mug/ml inhibieron la adhesión en un 96%, 5 \mug/ml en un 92%,
1 \mug/ml en un 76% y 0,5 \mug/ml en un 56%. Por el contrario,
el mAb HD239 de CD22 purificado, descrito anteriormente no tuvo
efectos significativos sobre la unión de las células Daudi con las
células COS-CD22.
Se examinó también la capacidad de otros mAb de
CD22 anteriormente descritos para inhibir la adhesión. Tal como se
muestra en la Tabla II, de los 11 mAb examinados, únicamente el mAb
To15 inhibió parcialmente (\sim60%) la adhesión de las células
Daudi con las células CO-CD22. Debido a que el mAb
de To15 estaba sólo disponible como fluido de ascites, se incubaron
las células Daudi con el mAb, se lavaron y las células tratadas se
examinaron para su capacidad de unirse a las células
COS-CD22. De nuevo, el mAb To15 inhibió la adhesión
de la línea celular en un \sim60%. Los mAb de HD39 y HD239 fueron
capaces de inhibir la unión de RBC como fluido de ascites, pero el
mAb purificado a 5 \mug/ml no tuvo efecto inhibidor significativo.
Sin embargo, los mAb purificados de 3G5 y 1S7 bloquearon
completamente la adhesión de RBC sugiriendo que este mAb puede
interferir parcialmente con la función de CD22.
Debido a que la mayor parte de tipos de
leucocitos se une con las células COS-CD22, se
examinó la capacidad del mAb de CD22 individual de la invención
para bloquear la unión. En referencia a la Tabla II, se puede
observar que cada mAb de CD22 de HB22-7,
HB22-22, HB22-23 y
HB22-33 bloqueó completamente la unión de las
células DAUDI y RAJI, la línea de células T Jurkat y RBC con las
células COS-CD22. Similarmente, tal como se muestra
en la Fig. 1, el mAb HB22-23 bloqueó completamente
la unión de las células T, línea de células B, neutrófilos,
monocitos y eritrocitos con las células COS-CD22.
Estos resultados sugieren que cada uno de estos tipos de células se
une a través de la región idéntica de CD22.
Se caracterizaron la(s) región(es)
en CD22 que median la unión del ligando mediante estudios de
inhibición cruzada de mAb usando el mAb que bloqueaba CD22 y un
panel de mAb (el mAb de laboratorio) que identifica cinco epitopos
diferentes en CD22 (epitopos A, B, C, D, y E)
(Schwartz-Albiez y col., "The carbohydrate moiety
of the CD22 antigen can be modulated by inhibitors of the
glycosylation pathway". Las especificidades de la unión del mAb
de laboratorio se representan gráficamente en la Fig. 3. En
Leukocyte Typing IV. White Cell Differentiation Antigens,
Knapp y col., eds., Oxford University Press, Oxford, p. 65 (1989)).
Tres de los mAb de los inventores que bloquean CD22,
HB22-7, HB22-22, y
HB22-23 se unen a epitopos muy próximos a los
propios epitopos de CD22. Tal como se muestra en la Tabla III y la
Fig. 4, cada uno de estos mAb es capaz de bloquear en cruzado la
unión de los otros dos. En referencia a la Fig. 4, se muestra el
bloqueo de la unión del mAb HB22-7 con las células
Daudi mediante mAb de CD22. Se trataron las células Daudi con el mAb
HB22-7 marcado con biotina sola (control) o después
de que se hubieron tratado las células con concentraciones de
saturación de mAb HB22-7, HB22-22,
HD39, Tol5 o BL-3C4 sin marcar. A continuación se
trataron las células con avadina-FITC para evaluar
la unión del mAb HB22-7 marcado. Se evaluó la
tinción celular mediante análisis de citometría de flujo y la
tinción con avadina-FITC únicamente se muestra como
una línea punteada en el primer panel. Se muestran los resultados
en una escala logarítmica de dos décadas y la capacidad del mAb de
ensayo para inhibir la unión del HB22-7 marcado se
proporciona entre paréntesis como% de inhibición. De los mAb
ensayados, únicamente el mAb HB22-7 por sí mismo y
el HB22-22 fueron capaces de bloquear la unión del
mAb HB22-7 marcado.
Estos tres nuevos mAb de CD22 se unen a una
región cercana al epitopo identificado por el mAb
HB22-33 ya que también bloquean su unión (tal como
se muestra en la Tabla III), aunque no en el mismo elevado nivel.
Estos epitopos son distintos de los epitopos definidos por el mAb
de CD22 anteriormente caracterizado (Fig. 3) ya que pocos de estos
mAb inhibieron la unión del mAb HB22. Sin embargo, la región de CD22
que predominantemente media la unión del ligando se puede localizar
en proximidad cercana a una región que solapa los epitopos B, C y D
ya que, tal como se muestra en la Tabla III, el único mAb que
bloquea significativamente la unión de los mAb
HB22-7 y HB22-22 fue el mAb que
define parcialmente los epitopos B, C y D. En experimentos
adicionales, el mAb HB22-22 fue capaz de bloquear
también la unión del mAb G28-7 (56% de inhibición) y
1S7 (41%), pero no los mAb HD6 (2%), 3G5 (25%),
BL-3C4 (0%), y OTH228 (0%). Únicamente la unión del
mAb HB22-23 fue inhibida significativamente por la
unión de los diversos mAb de CD22 anteriormente caracterizados. Sin
embargo, debido a que el mAb HB22-33 es del isotipo
IgM, su gran tamaño podría hacer más fácilmente susceptible el
bloqueo mediante un mAb unido anteriormente. El epitopo
HB22-33 es probable que se localice próximo al
epitopo B debido a que los mAb 3G5 (99% de inhibición) y 1S7 (99%)
bloquearon la unión de HB22-33, mientras que los mAb
HD6 (13%), G28-7 (42%), BL-3C4 (0%)
y OTH288 (0%) inhibieron sólo parcialmente la unión. Estos
resultados sugieren que una región única de CD22, que puede
contener más de un epitopo, media la actividad de unión del
ligando.
Se ha propuesto que CD45RO sea un ligando de
CD22 en las células T y que CDw75 sea un ligando de CD22 en las
células B (Stamenkovic y col., Cell 66: 1133 (1991)). Este hallazgo
se baso principalmente en la capacidad de UCHL-1
(mAb CD45RO) y mAb CDw75 de bloquear la unión de los linfocitos con
las células COS-CD22. En un esfuerzo para confirmar
estos hallazgos, se transfectaron células COS con un ADNc de CD22 de
longitud completa y se examinaron para la capacidad de diferentes
mAb de bloquear la unión de los linfocitos T con las células
transfectadas. Tal como se informó, el mAb CD45RO en forma de fluido
de ascites fue capaz de bloquear completamente la unión de las
células T de la sangre con las células COS-CD22. Sin
embargo, tal como se muestra en la Fig. 5A, el
UCHL-1 purificado aislado a partir del fluido de
ascites inhibidor no inhibió la unión de las células T. Se
examinaron dos lotes diferentes de UCHL-1 antes de
la purificación a partir de fluido de ascites y después de la
purificación en diez experimentos independientes con resultados
idénticos. En ninguno de los experimentos el UCHL-1
purificado a partir de 1 a 50 \mug/ml tuvo ningún efecto sobre la
unión de las células T con las células COS-CD22.
Este fluido de ascites fue capaz de inhibir la adhesión mediada por
CD22 que se observó también durante aproximadamente la mitad de las
preparaciones de fluido de ascites examinadas, incluyendo mAb
reactivo con CD26, CD29, CD3 y CD4. De manera importante, algunos
mAb no relacionados en forma de ascites bloquearon parcial o
completamente la unión posterior de las células T con las células
COS-CD22 cuando se añadieron directamente en los
pocillos de ensayo a diluciones entre 1:100 y 1:500, incluyendo el
mAb que no reacciona con las células diana en el ensayo. Por
ejemplo, la línea de células B Ramos no expresa CD45RO, y asimismo
el UHCL-1 de fluido de ascites inhibió > 75% de
la unión de las células Ramos con las células
COS-CD22 (fig. 5B). El fluido de ascites de
UHCL-1 bloqueó también el enlace de otras células
CD45RO negativas (DAUDI y RBC) a las células
COS-CD22. Para determinar adicionalmente si las
sustancias inhibidoras estaban contenidas en el fluido de ascites,
las células se trataron con fluido de ascites de
UHCL-1 y se lavaron antes de añadirse a las células
COS-CD22. En la mayor parte de los casos, este
tratamiento eliminó completamente la actividad inhibidora del
fluido de ascites sugiriendo la presencia de un factor soluble en el
fluido de ascites que bloquea la unión de CD22 con su ligando. El
factor soluble en el fluido de ascites puede muy bien ser una forma
soluble del ligando superficial celular de CD22.
La pérdida de actividad bloqueante del
UCHL-1 purificado no puede atribuirse a una pérdida
de la afinidad del mAb por CD45RO durante el procedimiento de
purificación debido a que las preparaciones de mAb purificado
generaron modelos idénticos de tinción de inmunofluorescencia cuando
se compararon con el fluido de ascites a partir del cual se
derivaron. Se evaluó la capacidad de tinción de las células
mononucleares de la sangre del "lote A" de
UCHL-1 que se muestra en la Fig. 4: el fluido de
ascites (diluido 1:400; \sim10 \mug/ml, 43% de los positivos
celulares) y el mAb purificado a partir de fluido de ascites (10
\mug/ml, 41% de positivos celulares). Todas las diluciones
comparables de UCHL-1 de fluido de ascites y mAb
purificado proporcionaron resultados idénticos cuando se evaluaron
para la tinción de inmunofluorescencia indirecta con análisis de
citometría de flujo. El mAb UCHL-1 purificado a 0,4
\mug/ml siguió tiñendo el 44% de las células. Se obtuvieron
resultados idénticos para el "lote B" de UCHL-1
de fluido de ascites y el mAb purificado. Además, el mAb
UCHL-1 purificado permitió eficazmente la
eliminación completa de las células T CD45RO^{+} a partir de las
poblaciones de células T usando perlas inmunomagnéticas recubiertas
de Ig de cabra anti-ratón indicando que las
preparaciones de mAb purificado no perdieron su afinidad por el
antígeno. Estos resultados sugieren con fuerza que algunas
preparaciones de fluido de ascites contienen sustancia(s)
inhibidora(s) de la función de CD22 y que el mAb de
UCHL-1 no inhibe la interacción entre las células T
y COS-CD22 de una manera específica. Además, el
suero de ternero fetal contiene sustancias inhibidoras que
bloquearon la adhesión de RBC a las células
COS-CD22. FCS a un 5% no bloquea la adhesión de
RBC, pero a un 10% bloqueó -20% de la unión de RBC, a un 20% bloqueó
un 70-80% de la unión de RBC y a un 40% bloqueó el
100% de la adhesión de RBC a las células
COS-CD22.
Se ha propuesto también que CDw75 sea un ligando
de CD22 (Stamenkovic y col., Cell 66:1133 (1991)). Aunque el mAb
CDw75 purificado no estuvo disponible para examinar esta
característica directamente, es posible que los efectos observados
anteriormente de este mAb sobre la adhesión mediada por CD22 sean
también el resultado de los efectos del fluido de ascites. Por
tanto, las células Daudi CDw75^{+} se trataron con diluciones de
fluido de ascites que contenían concentraciones de saturación de mAb
de CDw75 (HH1, HH2 y OKB-4) un mAb de CD76
(CRIS-4) u otro mAb (HB-6) que
identifica las estructuras de carbohidratos similares a CDw75 (Bast
y col., J. Cell Biol. 116:423 (1992)). A continuación se lavaron dos
veces las células tratadas con mAb antes de añadirse a los ensayos
de adhesión con células COS-CD22. El tratamiento de
las líneas de células B con este mAb no tuvo efecto sobre la unión
de la línea de células, mientras que el tratamiento de las células
COS con el mAb de CD22-23 con el lavado subsiguiente
bloqueó completamente la unión de las células Daudi con las células
COS. Por tanto, no parece que CDw75 sea un ligando de CD22.
Se ha informado también que la transfección de
\alpha2,6-sialil-transferasa en
células COS confiere un fenotipo adhesivo novedoso que permite la
unión de CD22 recombinante soluble (Stamenkovic y col., Cell 68:1003
(1992)). Se examinó esto transfectando células COS con la
\beta-galactosidasa
\alpha2,6-sialiltransferasa que genera la
expresión de los determinantes de los carbohidratos CDw75, CD76 y
HB-6 sobre la superficie de las células COS (Bast y
col., J. Cell Biol. 116:423 (1992)). Aunque la transfección de las
células COS con este ADNc indujo la expresión de CDw75, CD76 y
HB-6 tal como se muestra anteriormente, no dio como
resultado una unión detectable de las células CD22^{+} incluyendo
las células Raji, Daudi, y BJAB. De esta manera, la sobreexpresión
en células COS de los restos de ácido siálico unidos a \alpha2,6,
incluyendo CDw75, no es suficiente para mediar la adhesión de las
líneas de células B CD22^{+}, sugiriendo que la unión de la
proteína CD22 recombinante tal como se ha informado anteriormente
puede únicamente ser una interacción de baja avidez.
Debido a que el receptor anteriormente informado
como ligando de CD22 sobre las células B, CDw75 (Stamenkovic y
col., Cell 66:1133 (1991)), es un determinante superficial celular
sialilado (Bast y col., J. Cell Biol. 116:423 (1992)), se examinó
el efecto de la neuraminidasa sobre la función de CD22. Tal como se
muestra en la Fig. 6, el tratamiento de las células Daudi con
neuraminidasa (0,1 U/ml) inhibió completamente (98 \pm 2%) la
unión de estas células con las células COS-CD22. Por
el contrario, el tratamiento de las células COS-CD22
con neuraminidasa no tuvo efecto sobre la unión de las células
Daudi. La unión de las células T de la sangre, células Jurkat, Raji
y Ramos y RBC con las células COS-CD22 se eliminó
también mediante el tratamiento de las células con neuraminidasa
(> 90% de inhibición), mostrando que el ligando de CD22 sobre
múltiples linajes celulares se sialila. De esta manera, aunque la
sialilación del ligando de CD22 fue esencial para la adhesión, la
sialilación de CD22 sobre las células COS no lo fue. Adicionalmente,
si se preincuban las células Daudi con cada uno de los mAb de CD22
de la invención y se lavan antes de añadirse a las células
COS-CD22, el mAb no bloquea la unión de las células
Daudi a las células COS-CD22, aunque el
pretratamiento similar de las células COS-CD22 con
mAb bloqueante inhibió completamente el enlace con Daudi. Estos
hallazgos sugieren que CD22 no actúa como su propio contrarreceptor
homotípico para la adhesión de las células B.
Para determinar si el receptor de CD22 era una
integrina, se llevaron a cabo los ensayos de adhesión sin cationes
divalentes presentes. Se fijaron suavemente las células
COS-CD22 durante \sim1 min en formaldehído al 2%
(v/v) y se lavaron con PBS libre de Ca^{++}/Mg^{++} que
contenía EGTA o EDTA 10 mM y antes de añadirse a las células Daudi
que se habían lavado de manera similar. Este tratamiento no tuvo
efecto detectable sobre la unión de Daudi en comparación con las
células tratadas con DMEM. Adicionalmente, la presencia de múltiples
mAb anti-integrina a niveles de saturación no
bloqueó la unión de Daudi, incluyendo el mAb dirigido contra CD11a,
CD18, CD29, CD49d, CD49e, CD49f, y CD31. Por tanto, parece que el
ligando de CD22 puede representar una nueva estructura superficial
no reconocida anteriormente como implicada en la adhesión
celular.
Se han aislado dos isoformas del ADNc de CD22,
sugiriendo que las células B pueden expresar múltiples isoformas de
CD22 generadas a través de ayustamiento alternativo de un gen único,
eliminando la tercera y cuarta regiones similares a Ig.
Similarmente, el análisis de inmunoemborronado Northern del ARNm de
las líneas de células B ha revelado un transcripto mayor de 3,4 kb
y diversos transcriptos más pequeños (Wilson y col., J. Exp. Med.
173:137 (1991)). Con el fin de examinar el papel de diferentes
isoformas de CD22, se generaron ADNc de CD22 de diferentes líneas
de células B, amplificadas mediante la PCR y analizadas mediante
análisis de inmunoemborronado Southern. En referencia a la Fig. 7A,
se identificaron tres bandas específicas cuando se amplificó el ADNc
usando oligonucleótidos que corresponden a las secuencias en el
interior de la segunda y quinta regiones similares a Ig de CD22:
una banda predominante de \sim900 pb, y bandas de \sim600 y
\sim350 pb. La banda mayor corresponde a la forma de longitud
completa de CD22 mientras que las dos bandas más pequeñas
corresponden a las formas de las regiones 3 y/o 4 que carecen de
CD22. Esto se confirmó mediante el análisis de inmunoemborronado
Southern, tal como se muestra en la Fig. 7B, debido a que se
hibridaron las tres bandas con una sonda que correspondía a la
segunda región de CD22. Únicamente la banda más grande se hibridó
con una sonda dirigida contra las uniones de las regiones 3 y 4
(Fig. 7C). Además, la secuenciación de nucleótidos de la banda más
pequeña reveló uniones de ayustamiento idénticas a las ya descritas
(Stamenkovic y col., Nature 344:74 (1990)). La digestión con la
endonucleasa de restricción de 16 subclones de ADNc independientes
que contenían el producto de la PCR de tamaño intermedio indicó que
esta banda corresponde, en todos los casos, a una isoforma de CD22
que carece de la cuarta región similar a Ig. La amplificación de la
PCR del ADNc de CD22 de longitud completa usando los mismos
cebadores generados únicamente por la banda más grande indicó que
los cebadores no se unieron de manera inapropiada con las otras
regiones del ADNc de CD22 y que generaron bandas de ADN falsas. El
mismo modelo de bandas y de hibridación se encontró en las 7 líneas
de células B analizadas, incluyendo la línea NALM-6
de células pre-B que expresa CD22 sólo
intracitoplásmicamente. No se observaron bandas con la línea HSB2
de células T. Por tanto, parece que aunque las isoformas del ARNm
que representan variantes de ayustamiento del CD22 existente no
parecen restringirse a líneas específicas de células B.
Se llevaron a cabo estudios de
inmunoprecipitación para determinar si se expresaron las diferentes
isoformas de CD22 sobre la superficie celular. Se usaron el mAb
HD39, que reconoce el epitopo A, el mAb 3G5 que reconoce los
epitopos B y C, y el mAb HB22-23 que reconoce la
región de unión con el ligando de CD22 para inmunoprecipitar CD22
de las líneas BJAB y Daudi de células B. En referencia a las Figs.
7D y 7E, los tres mAb generaron el mismo modelo de proteínas
inmunoprecipitadas, precipitando solo una banda de \sim145.000
M_{r} de la línea BJAB de células B y dos bandas de \sim145.000
y \sim139.000 M_{r} de la línea Daudi de células B. Tal como se
muestra en la Fig. 7D, la banda de 139.000 M_{r} expresada por las
células Daudi representó una porción menor de la proteína marcada y
precipitó por los tres mAb con eficiencias similares. Debido a que
ambas isoformas de CD22 se observan en condiciones reductoras y no
reductoras y que se informó que los epitopos B y C están ausentes
en la isoforma más corta de CD22 (Stamenkovic y col., Cell
66:1133 (1991)), la especie de 135.000 M más corta de CD22
no precipitaría mediante el mAb de 3G5 si se generara mediante el
ARNm que carece de las regiones 3 y 4 similares a Ig. Por tanto,
parece que una especie de proteína única de CD22 se expresa sobre
la superficie celular y que el mAb que bloquea la función mediada
por CD22 precipita cuantitativa y cualitativamente las proteínas
similares tales como las que no bloquean la función
de CD22.
de CD22.
Debido a que las células Daudi expresaron dos
isoformas de CD22 y las células BJAB expresan sólo una única
isoforma detectable, se analizaron ambos tipos de células mediante
inmunofluorescencia indirecta con todos los mAb de CD22
relacionados en la Tabla II con el análisis de citometría de flujo
subsiguiente. En todos los casos, cada mAb tiñó ambas líneas
celulares a niveles similares. Por tanto, es muy poco probable que
cualquiera de los mAb usados en este estudio identifique los
epitopos presentes en la isoforma menor de CD22 que no se
encuentren en la isoforma dominante.
Los estudios de expresión de la isoforma CD22
informados anteriormente sugirieron que la región de unión del
ligando de CD22 se localiza en el interior de las regiones
aminoterminales similares a Ig del receptor. Además, otros estudios
(Stamenkovic y col., Cell 66:1133 (1991)) han demostrado que se
requirieron las tres regiones aminoterminales similares a Ig de
CD22 para la unión de mAb con los epitopos A, B, C, y E y para la
unión de una línea de células T (Molt-4) y de
células B (Daudi). La construcción y expresión de formas truncadas
de CD22 con únicamente la primera región similar a Ig de CD22 no une
ninguno de los mAb de CD22 en sus estudios de identificación de
loas epitopos A, B, C, D, y E o da como resultado la unión celular.
La expresión de las primeras dos regiones similares a Ig dio como
resultado la unión del mAb del epitopo A, pero no la unión celular.
Por tanto, sus estudios sugirieron que la tercera región similar a
Ig fue esencial para la reactividad de la mayor parte del mAb y
para la unión celular.
Para examinar qué regiones de CD22 contenían los
epitopos identificados por el mAb HB22 y qué regiones mediaron en
la unión celular, se creó una forma truncada de la molécula de CD22
que carece de la primera región similar a Ig. Se produjo esta forma
truncada introduciendo un único nuevo emplazamiento de restricción
(EcoR V) al inicio de la primera región similar a Ig del ADNc de
CD22 usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Usando
otros emplazamientos de restricción convenientes en el interior del
ADNc de CD22 de longitud completa, se ligaron conjuntamente tres
piezas de ADN: 1) un fragmento Hind III/EcoR V que codifica la
secuencia líder de CD22; 2) un fragmento Hind III/Kpn grande que
contiene el vector pSP64 y el extremo 3' de CD22; y 3) un fragmento
Stu I/Kpn I partiendo del inicio de la segunda región similar a Ig y
que contiene el resto del ADNc de CD22. Esta nueva forma truncada
del ADNc de CD22 que carece de la primera región similar a Ig
(CD22\Delta1) se subclonó en el vector de expresión PMT2.
Similarmente, se generaron dos formas truncadas del ADNc de CD2 que
carecen de la 3ª y 4ª regiones similares a Ig
(CD22\Delta3-4) y la 4ª región (CD22\Delta4)
usando los productos PCR de la transcriptasa inversa que
corresponden a dos variantes de ayustamiento de CD22 tal como se
muestra en la Fig. 7a. Se usaron los emplazamientos de restricción
Nco I únicos presentes en el ADNc de CD22 para colocar los
fragmentos truncados generados por la PCR en el ADNc de longitud
completa, eliminando por tanto la 3ª y 4ª regiones, y la 4ª región.
A continuación se subclonaron estos ADNc de CD22 en PMT2. En la
Fig. 8 se muestran los dibujos esquemáticos de las formas truncadas
de CD22.
Se transfectaron células COS con el ADNc de CD22
truncado (CD22\Delta1, CD22\Delta3-4 y
CD22\Delta4) y con un ADNc de CD22 de longitud completa. Después
de 48 horas de cultivo, se fijaron las células COS transfectadas y
se evaluaron para la unión del mAb de CD22 usando los diferentes mAb
de CD22 y el antisuero de Ig anti-ratón conjugado
con peroxidasa. Todos los mAb se unieron a las células COS
transfectadas con el ADNc de CD22 (Tabla IV). Sin embargo, la mayor
parte de los mAb HB22 no se unieron a las células transfectadas con
CD22\Delta1, indicando que estos mAb se unen a los epitopos en el
interior de la primera región similar a Ig o a los epitopos
dependientes de la primera región similar a Ig. Además, se perdió
debido a la eliminación la unión de los mAb HB22-7,
HB22-22, HB22-23 y
HB22-33 que bloquea completamente la función del
receptor CD22 eliminando la primera región similar a Ig. Además, se
ensayó también la unión de dos de los mAb HB22 que bloquean
parcialmente la adhesión mediada por CD22 demostrando que este mAb
era también dependiente de la primera región similar a Ig. Por el
contrario, dos de los mAb de laboratorio anteriormente descritos que
inhibieron parcialmente la unión de CD22 con los glóbulos rojos de
la sangre se unieron a las células transfectadas con el ADNc de
CD22\Delta1 y CD22\Delta4, no uniéndose además con las células
COS que expresaban CD22\Delta3-4, demostrando que
este mAb se unía a los epitopos de la región 3 o relacionados con la
región 3. Además, el mAb To15, que bloqueó parcialmente la adhesión
de los leucocitos a CD22, se unió a las células transfectadas con el
ADNc de CD22\Delta1, no uniéndose además a las células COS que
expresan CD22\Delta3-4 o CD22\Delta4, sugiriendo
que este mAb se une a la región 4. Por tanto, es probable que todos
los receptores CD22 que bloquean la actividad asociada con este mAb
muy probablemente sean el resultado de la presencia del factor de
bloqueo asociado al fluido de ascites y que no sea el propio mAb el
que tenga la actividad de bloqueo. A partir de estos estudios,
parece que todo mAb de CD22 bloquea la unión del ligando con la
primera región similar a Ig o con los epitopos que se asocian con
la primera región similar a Ig (Véase el resumen en la Tabla V).
Se evaluó también la capacidad de unión a los
leucocitos de los mutantes de truncamiento CD22 para determinar qué
regiones median la adhesión celular. Las células COS transfectadas
con el ADNc de CD22, CD22\Delta3-4 y
CD22\Delta4 de longitud completa soportaron la adhesión a niveles
equivalentes de dos líneas de células B (Raji y BJAB), una línea de
células T (RX) y los glóbulos rojos. Por el contrario, las células
COS que expresan CD22\Delta1 no median ninguna unión celular.
Estos resultados demuestran que la adhesión mediada por CD22
requiere de la primera región similar a Ig, pero no de las 3ª y 4ª
regiones. Además, en combinación con los resultados obtenidos con
la función bloqueante del mAb HB22 que bloquea la función, estos
resultados indican que la región de unión del ligando de la
molécula de CD22 se localiza en la primera región. Sin embargo, es
posible que exista una contribución de la segunda región similar a
Ig en la unión celular.
Que la región de unión al ligando de CD22 se
localiza en el interior de la primera región similar a Ig de CD22
está apoyado por estudios independientes en los que se han
identificado residuos en el interior de un motivo de aminoácido
conservado que se encuentra en el interior de las regiones de unión
celular de la molécula 1 de adhesión intercelular
(ICAM-1), ICAM-2,
ICAM-3, y la molécula de adhesión vascular celular
(VCAM-1) (Vonderheide y col., enviado para su
publicación). En estos estudios, los inventores caracterizaron
emplazamientos de unión a un antígeno muy tardío
(VLA)-4 en VCAM-1 basándose en la
supresión de la región y en los mutantes de sustitución de
aminoácidos, de forma similar a la estrategia anteriormente usada
más arriba para CD22 y a la anteriormente usada para identificar
los emplazamientos de unión del receptor en ICAM-1
para sus receptores de integrina LFA-1 y
Mac-1. En una serie de experimentos, se analizaron
los mutantes de supresión de la región de VCAM e ICAM para la
expresión y unión a la célula linfoide, y se compararon con las
formas de tipo natural. Se determinaron también las especificidades
de región del mAb anti-VCAM-1 y
anti-ICAM y se compararon con la capacidad del mAb
para inhibir la unión celular. En una segunda serie de experimentos,
las mutaciones de sustitución de aminoácidos se dirigieron a las
regiones de unión al ligando. Los resultados de los inventores no
solo demostraron unos emplazamientos independientes de unión a
VLA-4 en la región 1 y en la región 4 de
VCAM-1, sino que demostraron también una función
crítica de unión para los residuos en el interior de una secuencia
conservada de cinco aminoácidos que se encuentra también en la
región 1 y en la región 4 así como en otras diversas regiones de
ICAM (Fig. 9 y SEC DE ID N^{os}: 1-11). Los
autores proponen que la unión de integrina a estas regiones
similares a Ig dependen de la expresión de este motivo conservado, y
que las secuencias no conservadas adicionales en las regiones de
unión de VCAM-1 e ICAM-1 confieren
especificidad a la unión de la integrina con el ligando apropiado.
En relación a estos estudios, los inventores han tomado la
información obtenida en este estudio y la han aplicado a todas las
regiones similares a Ig en CD22, únicamente la primera región
similar a Ig de CD22 contenía este motivo conservado (Fig. 9 y SEC
DE ID N^{os}: 1-11) coherente con todos los datos
anteriores en que esta región media en las propiedades de adhesión
de CD22. Que este motivo esté presente en el interior de CD22 y
esté completamente conservado implica que CD22 puede unirse mediante
una integrina o un receptor de adhesión similar. Sin embargo, estos
resultados indican que es probable que las regiones específicas en
el interior de la primera región similar a Ig de CD22 confieran las
propiedades de adhesión a esta molécula.
Se puede aislar y seleccionar fácilmente mAb
adicional en gran cantidad. Por ejemplo, tras el procedimiento de
aislamiento informado en el presente documento en Materiales y
Procedimientos, se pueden generar anticuerpos monoclonales
adicionales, que son potencialmente útiles. Estos mAb candidatos se
pueden seleccionar en un ensayo funcional tal como se describe en
el presente documento, que determina la capacidad del mAb candidato
para bloquear (más de un 80%) la adhesión de los leucocitos a las
células COS transfectadas con ADNc de CD22. Se puede usar cualquier
otro tipo de línea celular de ensayo estándar (por ejemplo, células
CHO o L de ratón) en dicho ensayo. Alternativamente, se puede unir
la proteína CD22 recombinante a una matriz o superficie insoluble
como agente de ensayo. Ya que se ha determinado que el mAb de los
inventores bloquea la adhesión de las células T, células B,
monocitos, neutrófilos, glóbulos rojos y sus respectivas líneas
celulares o tumores en el receptor CD22 cuando se toma el estándar
de bloqueo como mayor de un 80%, se puede usar cualquier tipo
celular de leucocito como célula de ensayo en un ensayo de
selección.
Los mAb de los inventores de cualquier isotipo
son útiles con objetivos de estandarización y comparación. Para uso
terapéutico, se emplea preferiblemente el mAb del isotipo IgA o IgG.
Los anticuerpos del isotipo IgM, aunque útiles para muchos
objetivos descritos en el presente documento, no son generalmente
útiles como agentes terapéuticos debido a su baja afinidad general
por el antígeno, dificultades en el aislamiento, capacidad para
activar el complemento tras la unión del antígeno, y dificultad en
la modificación. Por tanto, aunque los mAb análogos a
HB22-33 son útiles como reactivos de investigación y
serían útiles para la caracterización del ligando de CD22, son
generalmente menos útiles para aplicaciones terapéuticas.
Anticuerpos. Se generaron treinta y tres
mAb reactivos con CD22 mediante la fusión de células de mieloma
NS-1 con células de bazo de ratones Balb/c
inmunizados tres veces con una línea de células
pre-B de ratón, 300.19, transfectada de manera
estable con un ADNc de CD22 de longitud completa. Los hibridomas que
producen mAb reactivo con células L de ratón transfectadas con ADNc
de CD22, pero no con células no transfectadas, se clonaron dos
veces y se usaron para generar sobrenadante o fluido de ascites. Se
determinaron los isotipos de mAb usando el Kit de Isotipificación
de Anticuerpo Monoclonal de Ratón (Amersham, Arlington Heights, IL).
Se purifico el mAb de IgG usando el Kit Affi-Gel
Protein A MAPS II (Bio-Rad, Richmond, CA). Se
precipitó el mAb HB22-33 (IgM) que contenía la
fracción de euglobulina del fluido de ascites mediante diálisis
extensiva frente a agua destilada y se demostró que era mAb
esencialmente puro mediante el análisis SDS-PAGE. Se
obtuvieron otros mAb de CD22, HD39, HD239, S-HCL1
(Leu-14), BL9, OM124, 3G5, To15,
G28-7, IS7, BL-3C4 y OTH228 del
Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation
Antigens (Dörken y col., "B-cell antigens:
CD22". En Leukocyte Typing IV. White Cell Differentiation
Antigens, Knapp y col., eds., Oxford University Press, Oxford, p. 63
(1989)). Otros mAb usados incluyen: el mAb de
UCHL-1 (CD45RO, hibridoma facilitado por el Dr.
Peter C. L. Beverley, Imperial Cancer Research Fund. Londres, UK)
(Smith y col., Immunology. 58:63 (1986)); los mAb 1F7 (CD26), 4B4
(CD29), RW2-4B6 (CD3) y 19Thy-5D7
(CD4) (facilitado por el Dr. Stuart Schlossman,
Dana-Farber Cancer Inst., Boston, Ma); y los mAb
BF2 (VLA cadena \alpha4, CDw49d), 2G6 (VLA cadena \alpha5,
CDw49e), 2C3A (VLA cadena \alpha6, CDw49f) y 1F11 (CD31,
PECAM-1) facilitado por el Dr. Chikao Morimoto
(Dana-Farber Cancer Inst.); y el mAb de 10F12
(CD18) y 2F12 (CDIIa) facilitado por el Dr. Jerry Ritz
(Dana-Farber Cancer Inst.). El mAb CDw75 procedía
del Fourth International Leukocyte Differentiation Antigen Workshop
(Dörken y col., "B-cell antigens: CDw75". En
"Leukocyte Typing IV. White Cell Differentiation Antigens".
Knapp y col., eds. Oxford University Press, Oxford, p. 109 (1989).
Excepto donde se indica, se usaron todos los mAb como fluido de
ascites diluido (1:200 a 1:400).
Células. Se aislaron células
mononucleares de sangre periférica mediante centrifugación en
gradiente de densidad Ficoll-Hypaque de sangre
heparinizada obtenida de donantes sanos de acuerdo con los
protocolos aprobados por el Human Use Committee of
Dana-Farber Cancer Inst. Se aislaron linfocitos T de
la sangre a partir de células mononucleares desprovistas de células
adherentes mediante formación de roseta con eritrocitos de oveja
(Pellegrino y col., Clin. Immunol. Immunopathol. 3:324 (1975)) y
CD2^{+} fue mayor de 98% según se determinó mediante tinción de
inmunoflorescencia indirecta y análisis de citometría de flujo. Se
aislaron los linfocitos B a partir de bazo humano mediante
supresión de las células de roseta con RBC de oveja y fueron >
95% de CD20^{+}. Se aislaron los monocitos mediante incubación de
células mononucleares de la sangre en placas de plástico durante 1
h a 37ºC y se cosecharon las células adherentes (\sim98% de
CD15^{+}) mediante rascado. Se aislaron los neutrófilos de la
sangre (\sim98% de CD15^{+}) mediante centrifugación en Medio de
Resolución Mono-Poli (Flow Laboratories, McLean,
Va) y se aislaron los RBC a parir de los aglomerados de glóbulos
rojos tras sedimentación Ficoll-Hypaque de la
sangre.
Se cultivaron líneas celulares en medios RPMI
1640 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) suplementados con
FCS al 10%, L-glutamina, estreptomicina y
penicilina. Se produjeron células transfectadas con ADNc de manera
estable usando un ADNc de CD22 de longitud completa clonado en el
emplazamiento BamH I del vector retrovírico pZipNeoSV(X)
(Cepko y col., Cell 37:1053 (1984)). Se transfectaron una línea de
células pre-B de ratón (300.19) y una línea celular
de fibroblasto (L) con este vector mediante electroporación con
selección posterior de transfectantes estables usando G418
(Gibco-BRL). Se identificaron las células
resistentes al antibiótico que expresaban CD22 mediante tinción de
inmunofluorescencia indirecta y se seleccionaron los clones que
expresaban elevados niveles de CD22.
Análisis de inmunofluorescencia. Se llevó
a cabo el análisis de inmunofluorescencia indirecta tras lavar las
células dos veces. Se analizaron las suspensiones de células viables
para la expresión del antígeno superficial mediante incubación
durante 20 min en hielo con el mAb apropiado como fluido de ascites
diluido a la concentración óptima para la inmunotinción. Tras el
lavado, se trataron las células durante 15 min a 4ºC con anticuerpos
Ig de cabra anti-ratón conjugados con FITC
(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL). Se llevaron a
cabo análisis de inmunofluorescencia de color único en un citómetro
de flujo Epics Profile (Coulter Electronics, Hialeah, FL). Se
analizaron diez mil células en cada ejemplo y todos los histogramas
se muestran en una escala logarítmica de tres décadas.
Ensayos de adhesión. Se transfectaron
células COS con un ADNc de CD22 de longitud completa en el vector de
expresión CDM8 (Wilson y col., J. Exp. Med. 173:137 (1991))
mediante el procedimiento DEAE-dextrano. Después de
24 h, se tripsinizaron las células y se transfirieron a placas de 35
mm (Falcon-Becton Dickinson, Lincoln Park, NY) y se
cultivaron durante 24 horas más. Las células y las líneas celulares
que se van a usar en el ensayo de adhesión se lavaron y volvieron a
suspender con DMEM (Gibco-BRL) sin suero y se
incubaron con las células COS transfectadas (2 x 10^{6} células
por placa de 35 mm) durante 30 min a 4ºC. Se eliminaron las células
que no se unieron a las células COS mediante lavado extensivo con
DMEM y se fijaron las rosetas celulares en DMEM que contenía
formalina al 2% (v/v). Se cuantificó la unión de las células de
ensayo con las células COS-CD22 de dos maneras:
mediante recuento del número de células de ensayo unidas por campo
de células COS indicando por tanto el número promedio de células
unidas por célula COS o determinando el número promedio de células
de ensayo unidas por célula COS formadora de roseta. En ambos casos,
se contaron por ensayo un mínimo de 200 células COS.
Para los experimentos de bloqueo de la adhesión
celular, se preincubaron células COS transfectadas con ADNc con
concentraciones diferentes de mAb de CD22 purificado a 4ºC durante
30 min antes de lavarse dos veces con DMEM. Las células o líneas
celulares de ensayo se lavaron dos veces con DMEM, se incubaron con
el mAb apropiado a 4ºC durante 30 min, se lavaron de nuevo con DMEM
y se añadieron a las placas que contenían las células COS. En
algunos casos, se añadieron los mAb de ensayo a las placas de
cultivo durante los ensayos de adhesión tal como se indica en las
leyendas de las figuras. Se llevó a cabo el tratamiento con
neuraminidasa incubando las células COS-CD22 o de
ensayo con 0,1 U/ml de neuraminidasa de Vibrio collar
(Calbiochem, La Jolla, CA) a 37ºC durante 30 min.
Radiomarcado de las células. Se lavaron
dos veces las células BJAB o Daudi (5 x 10^{7} en 200 \mul de
PBS) con PBS frío y se marcó la superficie con ^{125}I usando un
procedimiento de Bolton-Hunter modificado (Thompson
y col., Biochem, 26:743 (1987)). De manera breve, se añadió
Sulfo-SHPP (1 \mug por 10^{6} células) a un
tubo de vidrio recubierto con Iodogen (Pierce, Rockford, IL) (100
\mug/tubo) seguido por la adición de 1 mCi de ^{125}I
(NEN-DuPont, Boston, MA). A continuación se
añadieron las células y se dejaron incubar durante 30 min a
temperatura ambiente con agitación ocasional. Se eliminó por lavado
el ^{125}I libre con PBS frío antes de la lisis celular.
Análisis de inmunoprecipitación. Se
lisaron las células radiomarcadas a 4ºC en 1 ml de tampón de lisis
que contenía Triton X-100 al 1% (v/v) (Sigma
Chemical Co., San Luis, MO), NaCl 150 mM, trietanolamina 10 mM, pH
7,8, EDTA 0,5 mM, NaN_{3} al 0,1% (p/v), 0,2 mg/ml de inhibidor de
tripsina de soja, 0,2 \mug/ml de leupeptina, 0,2 \mug/ml de
pepstatina, 100 U/ml de tripsina inhibidora de aprotinina, PMSF 1
mM, y yodoacetamida 20 mM según se describe (Tedder y col., Molec.
Immunol. 25:1321 (1988)). Se retiraron los materiales insolubles en
detergente y los núcleos mediante centrifugación a 10.000 rpm
durante 25 min a 4ºC. A continuación se preclarificó el lisado
durante 3 h con 50 \mul de una suspensión al 50% de Proteína
G-Sefarosa 4B (Pharmacia-LKB
Biotechnology, Piscataway, NJ) y 1 \mul de fluido de ascites que
contenía un mAb no reactivo. Se dividieron los lisados en partes
iguales y se precipitaron durante la noche a 4ºC con 2 \mul de
tres mAb de CD22 diferentes o el mAb de CD3 control como fluido de
ascites más 30 \mul de Proteína A-Sefarosa. Se
lavaron los inmunocomplejos con tampones alternativos RIPA alto en
sal y RIPA bajo en sal dos veces cada uno y una vez con PBS. Las
muestras inmunoprecipitadas se hirvieron durante 5 min en 50 \mul
de tampón muestra (Tris-HCl 0,1 M, pH 6,8, que
contenía glicerol en 10 v/v y SDS al 1%), se sometieron a
electroforesis sobre un gel SDS-PAGE al 10%, se
secaron y se autoradiografiaron. Se determinó M_{r} usando
marcadores de peso molecular estándar preteñidos
(Gibco-BRL).
Experimentos de bloqueo cruzado del mAb.
Se incubaron en primer lugar células BJAB (1 x 10^{6}) con 10
veces las concentraciones de saturación del mAb de CD22 de ensayo
como fluido de ascites diluido (1:100) durante 30 min en hielo.
Tras la incubación, se añadió un segundo mAb de CD22 biotinilado a
una concentración óptima para la tinción de inmunofluorescencia.
Tras 30 min de incubación adicional, se lavaron las células dos
veces con PBS y se incubaron durante 30 min con avidina marcada con
fluorocromo (Sigma). Tras lavar las células dos veces, se evaluó la
tinción de inmunofluorescencia inmediatamente mediante análisis de
citometría de flujo.
En otros experimentos, se trataron células BJAB
con el mAb HB22-22 y HB22-33 a 10
veces las concentraciones de saturación, seguido por la incubación
con seis de los mAb de laboratorio a concentraciones óptimas para
la inmunotinción. Se evaluó la reactividad de los mAb de laboratorio
mediante la tinción de las células con anticuerpos específicos de
IgG cabra anti-ratón marcados con FITC (Sigma) que
no reaccionaron con HB22-22 y
HB22-33. Se evaluó la tinción de inmunofluorescencia
como anteriormente.
Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc. Se
aisló ARN mediante una modificación del procedimiento
ácido-guanidinio-fenol-cloroformo
de etapa única de las líneas de células B según se ha descrito
(Sleasman y col., Eur. J. Immunol. 20:1357 (1990)). Se llevó a cabo
la síntesis de ADNc en un volumen de 20 \mul que contenía 1 \mug
de ARN celular total, 200 U de Superscript RNasa H^{-}
transcriptasa inversa (BRL, Gaithersburg, MD), dNTP 1 mM (cada uno),
20 U de RNasin (Promega, Madison, WI), y 100 pmoles de hexámero
aleatorio (Pharmacia-LKB), en
Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, DTT 10 mM, y
MgCl_{2} 3,0 mM. Tras 60 minutos de incubación a 45ºC y
desnaturalización a 95ºC, se añadió la mitad de la mezcla de
reacción a 90 \mul del tampón de dilución de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) (KCl 50 mM, Tris-HCl
10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM y gelatina al 0,001%) que contenía
30 pmoles de un cebador de oligonucleótido de sentido directo (5'
TCAAG TTCTCCCCACAGTGGAGTC), SEC DE ID Nº: 12 homóloga con una
secuencia de nucleótidos en la segunda región similar a Ig, 30
pmoles de un cebador de oligonucleótidos de sentido contrario (5'
ACCAACTATTACAACGTGCGCAGG), SEC DE ID Nº: 13 que se encuentra en la
región 5 similar a Ig, y polimerasa Taq (2,5 U,
Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT). Se
superpuso a la mezcla de reacción un aceite mineral y se llevó a
cabo la amplificación durante 35 ciclos en un ciclador térmico
Perkin-Elmer como sigue: 1 min a 94ºC, 1 min a 65ºC
y 1 min a 72ºC.
Los oligonucleótidos sintéticos usados para el
análisis de inmunoemborronado Southern fueron un oligonucleótido de
sentido directo del interior de la región 2 similar a Ig (5'
GAAGTTCCTCTCCAATGACACG), SEC DE ID Nº: 14m y un oligonucleótido de
sentido directo en el borde de unión de las regiones 3 y 4 similares
a Ig (5' AAGTGCAG
TATGCCCC GGAA), SEC DE ID Nº: 15. Se marcaron los oligonucleótidos en el extremo 5' en una reacción de 30 \mul que contenía 20 pmoles de oligonucleótido, 30 U de polinucleótido quinasa T4 (BRL), y 0,15 mCi de \gamma-(^{32}P)-ATP (NEN-DuPont, Boston, MA), en Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 10 mM, DTT 5 mM, espermidina-HCl 0,1 mM, y EDTA 0,1 mM. Tras incubación de la mezcla durante 30 min a 37ºC, los oligonucleótidos marcados se purificaron mediante cromatografía en columna. Las actividades específicas de las sondas de oligonucleótidos fueron de \sim10^{7} cpm/pmol. El ADNc amplificado mediante la PCR (10 \mul de la mezcla de reacción) se sometió a electroforesis a través de geles de agarosa al 1% en 1X TBE con 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio, y se fotografió en un transiluminador UV antes de transferirse a la nitrocelulosa. Se llevó a cabo la hibridación de los oligonucleótidos marcados en el extremo 5' en tampón que contenía, 6 x SSC, 10 x solución de Denhardts, SDS al 0,1% (p/v), fosfato de sodio 20 mM, y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón (Sigma). Finalmente, se lavaron los filtros en 1 x SSC a temperatura ambiente. La autoradiografía se realizó a temperatura ambiente durante 30 min.
TATGCCCC GGAA), SEC DE ID Nº: 15. Se marcaron los oligonucleótidos en el extremo 5' en una reacción de 30 \mul que contenía 20 pmoles de oligonucleótido, 30 U de polinucleótido quinasa T4 (BRL), y 0,15 mCi de \gamma-(^{32}P)-ATP (NEN-DuPont, Boston, MA), en Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 10 mM, DTT 5 mM, espermidina-HCl 0,1 mM, y EDTA 0,1 mM. Tras incubación de la mezcla durante 30 min a 37ºC, los oligonucleótidos marcados se purificaron mediante cromatografía en columna. Las actividades específicas de las sondas de oligonucleótidos fueron de \sim10^{7} cpm/pmol. El ADNc amplificado mediante la PCR (10 \mul de la mezcla de reacción) se sometió a electroforesis a través de geles de agarosa al 1% en 1X TBE con 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio, y se fotografió en un transiluminador UV antes de transferirse a la nitrocelulosa. Se llevó a cabo la hibridación de los oligonucleótidos marcados en el extremo 5' en tampón que contenía, 6 x SSC, 10 x solución de Denhardts, SDS al 0,1% (p/v), fosfato de sodio 20 mM, y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón (Sigma). Finalmente, se lavaron los filtros en 1 x SSC a temperatura ambiente. La autoradiografía se realizó a temperatura ambiente durante 30 min.
Se depositaron los siguientes hibridomas el 14
de Mayo de 1993, en la American Type Culture Collection (ATCC),
12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852.
(I) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dana-Farber Cancer Institute, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 44 Binney Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Boston
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachusetts
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02115
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (617) 632-3000
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (617) 632-4012
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE BLOQUEAN LA UNIÓN DEL LIGANDO CON EL RECEPTOR CD22 EN LAS CÉLULAS B MADURAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR : IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentin Release 1.0, Versión 1.25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD : US 08/066.309
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DEL ARCHIVO: 21-MAYO-1993
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.20
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA :lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LOCALIZACIÓN: 1.20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.20
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.24
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.24
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.22
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA; péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.20
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.21
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.24
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.24
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1.24
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAAGTTCTC CCCACAGTGG AGTC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAACTATT ACAACGTGCG CAGG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGTTCCTC TCCAATGACA CG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- SENTIDO CONTRARIO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGTGCAGTA TGCCCCGGAA
\hfill20
Claims (8)
1. Un anticuerpo monoclonal que:
- \quad
- se produce mediante una línea celular de hibridoma seleccionada entre el grupo constituido por HB22-7 (ATCC NºHB 11347), HB22-22 (ATCC NºHB 11348) y HB22-23 (ATCC NºHB 11349); o
- \quad
- se une al mismo determinante antigénico como un anticuerpo monoclonal producido mediante una línea celular de hibridoma seleccionada entre el grupo constituido por HB22-7 (ATCC NºHB 11347), HB22-22 (ATCC NºHB11348) y HB22-23 (ATCC NºHB 11349); o
- \quad
- es un fragmento o conjugado Fab, F(ab')_{2}, o Fv de un anticuerpo monoclonal producido mediante una línea celular de hibridoma seleccionada entre el grupo constituido por HB22-7 (ATCC NºHB 11347), HB22-22 (ATCC NºHB 11348) y HB22-23 (ATCC NºHB 11349).
2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
1, que es un anticuerpo humano.
3. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
1, que es un anticuerpo quimérico ratón-humano.
4. Una línea celular de hibridoma seleccionada
entre el grupo constituido por HB22-7 (ATCC NºHB
11347), HB22-22 (ATCC NºHB 11348) y
HB22-23 (ATCC NºHB 11349).
5. Una línea celular continua que produce un
anticuerpo monoclonal, en la que dicho anticuerpo monoclonal se une
al mismo determinante antigénico como un anticuerpo monoclonal
producido mediante una línea celular de hibridoma seleccionada
entre el grupo constituido por HB22-7 (ATCC NºHB
11347), HB22-22 (ATCC NºHB 11348) y
HB22-23 (ATCC NºHB 11349).
6. Una composición terapéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal de una
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
7. Un anticuerpo monoclonal de una cualquiera de
las reivindicaciones 1-3 para uso en el tratamiento
de un paciente para retardar o bloquear la función de adhesión de
CD22.
8. Uso de un anticuerpo monoclonal de una
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la
fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de
síndromes autoinmunes, que incluyen glomerulonefritis, síndrome de
Goodspature, vasculitis necrotizante, linfadenitis, periarteritis
nodosa, lupus sistémico eritematoso y artritis, púrpura
trombocitopénica, agranulocitosis, anemias hemolíticas autoinmunes,
reacciones inmunes contra los antígenos anteriores que incluyen los
grupos sanguíneos A-B-O fetales
durante el embarazo, miastenia grave, diabetes resistente a la
insulina, enfermedad de Graves, y respuestas alérgicas y tumores de
células B humanas.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/066,309 US5484892A (en) | 1993-05-21 | 1993-05-21 | Monoclonal antibodies that block ligand binding to the CD22 receptor in mature B cells |
| US66309 | 1993-05-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2316147T3 true ES2316147T3 (es) | 2009-04-01 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94919182T Expired - Lifetime ES2316147T3 (es) | 1993-05-21 | 1994-05-18 | Anticuerpos monoclonales que bloquean la union de ligando con el receptor cd22 en las celulas b maduras. |
Country Status (7)
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| EP (1) | EP0660721B1 (es) |
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| ES (1) | ES2316147T3 (es) |
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