ES2315350T3 - Composiciones para la introduccion de la neogenesis de islotes, que contienen unos ligandos para el receptor de gastrina/cck y ligandos para el receptor de efg. - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica que comprende una primera dosis del ligando para el receptor de gastrina/colecistoquinina (CCK), y una segunda dosis del ligando para el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGF), en la que la primera dosis es aproximadamente 10 veces y 100 veces superior en peso a la segunda dosis.

Description

Composiciones para la inducción de la neogénesis de islotes, que contienen unos ligandos para el receptor de gastrina/CCK y ligandos para el receptor de EGF.

Campo técnico

Las formas de realización de la presente invención se refieren a unas composiciones para un breve periodo de tratamiento sistémico de pacientes diabéticos con un ligando para el receptor de gastrina/colecistoquinina (CCK) y un ligando para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), dicho tratamiento inicia una neogénesis del islote pancreático al administrarse a los sujetos, y proporciona la remisión de la diabetes durante un periodo de tiempo prolongado después del cese del tratamiento.

Antecedentes

Aproximadamente 800.000 personas de la población de los Estados Unidos padecen diabetes insulino-dependiente (también conocida como juvenil o diabetes de tipo I) y cada año aparecen aproximadamente 30.000 nuevos casos. Además, un número de pacientes extremadamente grande y en rápido aumento en esta población presentan formas de diabetes de tipo II (también denominada de inicio adulto o no dependiente de la insulina), a un nivel de proporciones epidémicas, que provoca el agotamiento del páncreas y la insuficiencia de insulina. La diabetes de tipo I se trata generalmente con inyecciones de insulina en respuesta a los niveles de glucosa en sangre determinados mediante el autocontrol del paciente. Una diversidad de formas de insulina, por ejemplo, de acción lenta y rápida, y de sistemas y de dispositivos adecuados para la administración de la insulina mediante inyección, por ejemplo, una pluma de dosificación, son utilizados por la creciente población de diabéticos.

La glucosa en sangre anormalmente elevada (hiperglucemia) que caracteriza la diabetes, si no se trata, tiene como resultado una diversidad de estados patológicos, por ejemplo, úlceras vasculares periféricas que no se curan, daños en la retina que conducen a la ceguera e insuficiencia renal. La administración diaria de múltiples dosis de insulina por parte del paciente, en respuesta a los niveles de glucosa determinados mediante el autocontrol frecuente del paciente a diario, son necesarios durante toda su vida, con los gastos e inconvenientes asociados para el paciente y para el sistema de asistencia médica. Además, unas mayores consecuencias patológicas de diabetes se correlacionan con un control menos riguroso de los niveles de glucosa en la sangre, el control se consigue mediante la monitorización de los niveles de glucosa y la administración de insulina, y mediante restricciones en la dieta, de modo que sólo los pacientes que siguen estas indicaciones evitan unas consecuencias negativas.

Se ha tratado de encontrar terapias alternativas a la monitorización de la glucosa y la inyección de insulina para la diabetes, por ejemplo, terapias en las que el paciente diabético recibe un transplante de material pancreático. Estas posibilidades ofrecen la ventaja potencial de una respuesta psicológica normal, a saber, la rápida liberación de insulina en respuesta a un aumento de la concentración de glucosa en sangre. Los transplantes de material pancreático alogénico o xenógrafo, como los islotes porcinos encapsulados o células de los conductos de los islotes que se inducen para la diferenciación in vitro, continúan en fase experimental. El transplante de material pancreático humano continúa limitado por la grave insuficiencia de material disponible y por el rechazo inmunológico. El transplante de islotes de tejido de material pancreático alogénico o xenógrafo continúa limitado debido al rechazo inmunológico del transplante, o a la posible transmisión de un virus animal.

Los ratones transgénicos que expresan tanto la TGF\alpha como los genes recombinantes de la gastrina presentan un aumento de la masa del islote pancreático, cosa que no ocurre con los ratones que expresan alguno de los agentes por separado (patentes US 5.885.956, publicada el 23 de Marzo de 1999 y 6.288.301, publicada el 11 de Septiembre de 2001). Las composiciones y los procedimientos terapéuticos para controlar los niveles de glucosa en sangre y remediar la insuficiencia de insulina, particularmente las composiciones y los procedimientos que pueden producir una liberación rápida de la insulina en respuesta a unos niveles elevados de glucosa en sangre, y que son eficaces durante un periodo de tiempo prolongado, continúan siendo prioridades médicas importantes.

El documento WO 00/44400 se refiere a unos procedimientos y composiciones para el tratamiento de la diabetes mellitus mediante la administración de una composición que proporciona un ligando para el receptor de gastrina/CCK, como la gastrina, un ligando para el receptor del EGF, como el TGF\alpha, o una combinación de ambos en una cantidad suficiente para llevar a cabo la diferenciación de las células precursoras del islote pancreático en células maduras secretoras de insulina.

Sumario

La invención se basa en parte en el descubrimiento que la administración a un sujeto diabético de un ligando para el receptor de gastrina y un ligando para el receptor de EGF, según un protocolo corto de administración de las dosis, provoca la neogénesis del islote en el sujeto, y produce una respuesta que fue una sorprendente remisión prolongada de la patología diabética. El periodo de remisión se caracteriza por un descenso de los niveles de glucosa en sangre, y por un aumento de los niveles de insulina en la sangre. Actualmente, no existen curas disponibles comercialmente que impliquen la regeneración in vivo del islote en un paciente diabético.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que incluye una primera dosis de un ligando para el receptor de gastrina/colecistoquinina (CCK), y una segunda dosis de un ligando para el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGF). La primera y segunda dosis se encuentran en una proporción en la composición que es eficaz para inducir la neogénesis del islote en un sujeto que necesite la neogénesis del islote. La primera dosis es entre aproximadamente 10 veces y 100 veces mayor en peso que la segunda dosis. El ligando para el receptor de gastrina/CCK puede ser, por ejemplo, un derivado sintético de la gastrina. El ligando para el receptor de EGF puede ser un recombinante modificado de EGF. Por ejemplo, en una forma de realización, el ligando para el receptor de gastrina/CCK es un derivado sintético de la gastrina que presenta una leucina sustituida en posición 15, y el ligando para el receptor de EGF es un recombinante modificado del EGF que presenta una deleción de dos aminoácidos C terminal y que presenta un aminoácido neutro sustituido en la posición 51. El sujeto que necesita de neogénesis del islote puede ser un paciente con diabetes. La diabetes puede ser, por ejemplo, diabetes insulino-dependiente, por ejemplo, diabetes del adulto.

La primera dosis es entre aproximadamente 10 veces y aproximadamente 100 veces superior en peso que la segunda dosis. Específicamente, la primera dosis puede ser aproximadamente 0,1 microgramos a aproximadamente 1,0 microgramos por Kg de peso corporal del sujeto al día. Alternativamente, la primera dosis puede ser aproximadamente 1,0 microgramos a aproximadamente 10 microgramos por Kg de peso corporal del sujeto al día; la primera dosis puede ser aproximadamente 10 microgramos hasta aproximadamente 100 microgramos por Kg de peso corporal del sujeto al día; o la primera dosis puede ser aproximadamente 100 microgramos hasta aproximadamente 3,0 miligramos por Kg de peso corporal del sujeto al día. En algunas formas de realización, la dosis diaria (o un periodo de 24 horas) se divide entre varias administraciones al día.

En general, el sujeto es un mamífero. Por ejemplo, el mamífero es un roedor o un primate, por ejemplo, el sujeto es una persona.

En una forma de realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que incluye un derivado sintético de la gastrina y un recombinante modificado de EGF. La proporción del derivado de la gastrina y el recombinante modificado de EGF es de aproximadamente 60:1. Otra forma de realización es una composición farmacéutica que presenta un derivado sintético de la gastrina que presenta una leucina sustituida en posición 15, y un recombinante modificado del EGF que presenta una deleción de dos aminoácidos C terminal y que presenta un aminoácido neutro sustituido en la posición 51, en la que la proporción del derivado de la gastrina y el recombinante modificado de EGF es de aproximadamente 60:1. Otra forma de realización más puede ser una composición farmacéutica para la terapia de neogénesis del islote (I.N.T^{TM}), que presenta una dosis eficaz de por lo menos aproximadamente 1 \mug/Kg de peso corporal de un recombinante modificado del EGF y por lo menos aproximadamente 30 \mug/Kg de peso corporal de un derivado sintético de la gastrina. Otra forma de realización más es una composición farmacéutica para I.N.T.^{TM}, que presenta una dosis eficaz de por lo menos aproximadamente 1 \mug/Kg de peso corporal de un recombinante modificado del EGF que presenta una deleción de dos aminoácidos C terminal y que presenta un aminoácido neutro sustituido en la posición 51 y por lo menos aproximadamente 30\mug/Kg de peso corporal de un derivado sintético de la gastrina que presenta una leucina sustituida en la posición 15.

En otro aspecto, una forma de realización de la invención proporciona la utilización de dicha composición farmacéutica en un procedimiento para el tratamiento de un sujeto con diabetes, incluyendo: la administración durante un periodo de tiempo de tratamiento de una composición que presenta una primera dosis eficaz del ligando para el receptor de gastrina/CCK y una segunda dosis eficaz del ligando para el receptor de EGF, siendo la primera y la segunda dosis eficaces adecuadas para inducir la neogénesis del islote en un sujeto que necesite la neogénesis del islote, y que produce un periodo de remisión que es por lo menos aproximadamente cuatro veces superior que la duración del tratamiento. La composición puede ser eficaz en el aumento de la insulina en sangre y en la reducción de la glucosa en sangre durante el periodo de remisión. Por ejemplo, si el sujeto es un humano, la duración del tratamiento es inferior a aproximadamente 0,1 por ciento de la media de la esperanza de vida que es de aproximadamente 70-75 años, es decir, la duración del tratamiento es inferior a aproximadamente un mes. Alternativamente, la duración del tratamiento es inferior a aproximadamente 0,2 por ciento de la esperanza de vida media; o la duración del tratamiento es inferior a aproximadamente 0,3 por ciento de la media de esperanza de vida. Además, el periodo de remisión es por lo menos aproximadamente un 0,5 por ciento de la media de esperanza de vida; el periodo de remisión es por lo menos aproximadamente un uno por ciento de la media de esperanza de vida; o el periodo de remisión es por lo menos aproximadamente dos por ciento de la media de esperanza de vida. El procedimiento en varias formas de realización incluye la repetición de la administración de la composición en el momento que corresponde aproximadamente con el periodo de remisión.

Otra forma de realización más de la invención proporciona la utilización de dicha composición farmacéutica en un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que presenta diabetes insulino-dependiente incluyendo: la administración de una dosis de cada de un derivado sintético de la gastrina y un recombinante modificado del EGF durante un periodo de tratamiento que es inferior en duración a aproximadamente el uno por ciento de la esperanza de vida media de la especie del sujeto, provocando el tratamiento un aumento de la producción de insulina y un descenso de la glucosa en sangre; y la repetición de la administración de la composición en el momento que corresponde aproximadamente al final del periodo de remisión, de este modo, tratando al sujeto que presenta diabetes de insuficiencia de insulina.

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Otra forma de realización más de la invención proporciona la utilización de dicha composición farmacéutica en un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que presenta diabetes de insuficiencia de insulina, incluyendo: la administración de una dosis de cada de un derivado sintético de la gastrina que presenta una leucina sustituida en la posición 15 y un recombinante modificado del EGF que presenta una deleción de dos aminoácidos C terminal y que presenta un aminoácido neutro sustituido en la posición 51, durante un periodo de tratamiento que es inferior en duración a aproximadamente el uno por ciento de la media de la esperanza de vida de la especie del sujeto, provocando el tratamiento un aumento de la producción de insulina y un descenso de la glucosa en sangre; y la repetición de la administración de la composición en el momento que corresponde aproximadamente al final de la remisión, de este modo, tratando al sujeto que presenta diabetes de insuficiencia de insulina.

Otra forma de realización más de la invención proporciona la utilización de dicha composición farmacéutica en un procedimiento para el tratamiento de un paciente diabético con la necesidad de neogénesis del islote, incluyendo: la administración al paciente de una composición que presenta una primera dosis eficaz de un ligando para el receptor de la gastrina/CCK y una segunda dosis eficaz de un ligando para el receptor del EGF, administrándose la composición según protocolo de dosificación de corta duración; la monitorización de los niveles de glucosa en sangre en el paciente después de la administración de la composición; y la repetición de la administración de la composición al paciente cuando un aumento del nivel de glucosa en la sangre en la muestra indique que el paciente necesita más neogénesis del islote, de tal forma que se trata al paciente diabético con necesidad de neogénesis del islote. Por consiguiente, la administración de la composición causa un aumento de la insulina en sangre y una disminución de la glucosa en sangre. La duración del protocolo de dosificación es inferior a aproximadamente tres meses; por ejemplo, la duración del protocolo de dosificación es inferior a aproximadamente dos meses; por ejemplo, la duración del protocolo de dosificación es inferior a aproximadamente un mes. Además, la monitorización del nivel de glucosa en sangre es menos frecuente que aproximadamente una vez al día; por ejemplo, la monitorización del nivel de glucosa en la sangre es menos frecuente que aproximadamente una vez por semana. La monitorización del nivel de glucosa en la sangre se puede realizar con el autocontrol del propio paciente. La repetición de la administración de la composición puede ser menos frecuente que aproximadamente una vez cada seis meses. Alternativamente, la repetición de la administración de la composición puede ser menos frecuente que aproximadamente una vez por año; o la repetición de la administración de la composición puede ser menos frecuente que aproximadamente una vez cada dos años. La primera dosis eficaz de un ligando para el receptor de gastrina/CCK en la composición es por lo menos aproximadamente diez veces superior en peso que la segunda dosis eficaz del ligando para el receptor de EGF.

En otro aspecto de la invención, la invención proporciona la utilización de dicha composición farmacéutica en un procedimiento para el tratamiento de un paciente diabético que necesita neogénesis de un islote, que incluye: la administración al paciente de una composición que presenta un derivado sintético de gastrina y un EGF recombinante modificado, de modo que se inicia la neogénesis del islote y la glucosa en sangre se reduce sustancialmente, la composición que se administra según un protocolo de dosificación inferior a aproximadamente dos meses de duración; la monitorización del nivel de glucosa en sangre a unos intervalos de menos de aproximadamente una vez al día y la repetición de la administración de la composición al paciente menos frecuentemente que aproximadamente una vez cada seis meses.

En otro aspecto de la invención, la invención proporciona la utilización de dicha composición farmacéutica en un procedimiento para el tratamiento de un paciente diabético que necesita neogénesis de un islote, que incluye: la administración al paciente de una composición que presenta un derivado sintético de gastrina, el derivado de la gastrina que presenta una leucina en la posición 15, y el EGF recombinante modificado, el EGF recombinante modificado que presenta una deleción de dos aminoácidos en el C terminal y un aminoácido neutro en la posición 51, de modo que se inicia la neogénesis del islote y la glucosa en sangre se reduce sustancialmente, la composición que se administra según un protocolo de dosificación inferior a aproximadamente dos meses de duración; la monitorización del nivel de glucosa en sangre en una muestra de sangre extraída a intervalos de menos de aproximadamente una vez al día y la repetición de la administración de la composición al paciente menos frecuentemente de aproximadamente una vez cada seis meses.

En otro aspecto de la invención, la invención proporciona la utilización de dicha composición farmacéutica en un procedimiento de utilización que reduce la utilización de insulina en un paciente diabético deficiente en insulina, el procedimiento que incluye: la administración de una dosificación eficaz de una composición I.N.T^{TM}, para inducir la neogénesis del islote y que reduce el suministro de insulina al inducirse la neogénesis de un islote, que hace que de este modo se incremente la secreción de insulina y disminuya la glucosa en sangre. En una forma de realización relacionada, la composición presenta un ligando para el receptor de gastrina/EGF en una cantidad que es por lo menos aproximadamente 10 veces superior en peso que una cantidad de un ligando para el receptor de EGF en la composición. La administración de la composición se lleva a cabo según una pauta de dosificación inferior a aproximadamente seis meses de duración. Además, la reducción de suministro de la insulina se puede iniciar después del cese de la administración de la composición. Alternativamente, la reducción de la dosificación de la insulina exógena se puede iniciar durante la duración del protocolo de administración de la composición. De este modo, el suministro de insulina después de administrar la composición se reduce hasta menos de aproximadamente el 70% comparada con la utilización en el paciente diabético antes de la administración de la composición. Por ejemplo, el suministro de la insulina después de la administración de la composición se reduce hasta menos de aproximadamente el 50% comparado con la utilización en el paciente diabético antes de la administración de la composición, o el suministro de insulina después de la administración de la composición se reduce hasta menos de aproximadamente 10% comparado con la utilización en el paciente diabético antes de la administración de la composición, o el suministro de insulina después de la administración de la composición se reduce hasta menos de aproximadamente 1% comparado con la utilización en el paciente diabético antes de la administración de la composición.

Otro aspecto de la invención proporcionado es la utilización de dicha composición farmacéutica en un procedimiento de reducción de la utilización de insulina en un paciente insulino-dependiente, el procedimiento que incluye: la administración de una dosis eficaz de un ligando para el receptor de gastrina/CCK y una dosis eficaz de un ligando para el receptor de EGF en una proporción de por lo menos aproximadamente 10:1; y la reducción de suministro de insulina después del inicio de la reducción de la glucosa en sangre en el paciente.

Otra forma de realización de la invención en el documento presente proporciona la utilización de dicha composición farmacéutica en un procedimiento de incremento de la neogénesis de islotes en un paciente, que incluye la administración en un plazo de duración corto de un ligando para el receptor de gastrina/CCK, de modo que se incrementa la neogénesis de los islotes.

La composición farmacéutica se puede proporcionar en forma de un equipo que incluye un ligando para el receptor de gastrina/CCK y el ligando para el receptor de EGF. Por ejemplo, un ligando para el receptor de gastrina/CCK y el ligando para receptor de EGF se combinan en un contenedor único. El equipo puede contender un manual de instrucciones o un conjunto de instrucciones. Además, el ligando para el receptor de gastrina/CCK y el ligando para el receptor de EGF pueden estar presentes en unas unidades de dosificación. El equipo puede incluir además insulina.

Otras características y ventajas de la invención se pueden hacer evidentes a partir de la descripción siguiente de sus formas de realización preferidas y de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una gráfica que muestra una tolerancia mejorada a la glucosa de las ratas diabéticas STZ después del tratamiento mediante la terapia de neogénesis de los islotes (I.N.T^{TM}) con gastrina y TGF\alpha, en función del tiempo. Los grupos de ratas son controles no diabéticos (marcados como Nº control STZ n=4, en la figura), los ratones diabéticos STZ tratados con un vehículo solo (marcados Vehículo STZ n=12), ratas tratadas con dosis bajas de I.N.T^{TM} de 4 \mug de gastrina y TGF\alpha por kg de peso corporal (marcados STZ 4 TGF/gastrina n=6), y ratas tratadas con 40 \mug de gastrina y TGF\alpha por kg de peso corporal, una dosis 10 veces superior de I.N.T^{TM}
de gastrina y TGF\alpha por kg de peso corporal (marcados STZ 40 TGF/gastrina n=8). Los datos muestran que ambos grupos de ratas STZ tratadas con I.N.T^{TM} alcanzaron un nivel de glucosa en sangre inferior después de una estimulación que las ratas diabéticas en el grupo control no tratadas.

La Figura 2 es una gráfica que muestra una liberación de insulina incrementada en las ratas tratadas con I.N.T ^{TM} 15 y 30 minutos después de la estimulación con glucosa. El grupo de tres barras de la izquierda diseñados con barras vacías, barras punteadas y barras a rayas muestra los niveles de insulina en plasma (ng/ml) en cada una de las tres ratas diabéticas STZ en la Figura 1.Los niveles de insulina en el grupo de ratas no diabéticas a los 15 y 30 minutos después de la estimulación se muestran en el grupo de barras de la derecha a diferente escala. Los resultados muestran que las ratas diabéticas que recibieron el tratamiento con I.N.T^{TM} a unas dosis elevadas de I.N.T^{TM} de la Figura 1 producen unos niveles de insulina más de tres veces superiores a los de las ratas diabéticas no tratadas a los 15 y 30 minutos después de la estimulación, y las ratas que recibieron una dosis baja de I.N.T^{TM} de la Figura 1 produjeron insulina cuatro veces superior que las ratas diabéticas no tratadas a los 30 minutos.

La Figura 3 es un conjunto de gráficas que muestran unos niveles de glucosa en sangre para los grupos de ratas en la Figura 1, ensayadas en función del tiempo, en las muestras de sangre extraídas dos semanas después del tratamiento (panel izquierdo) y las ocho semanas después del tratamiento (panel derecho). Los resultados muestran que la glucosa en sangre en las ratas tratadas a dosis más baja I.N.T.^{TM} se mantiene más baja que en los controles no tratados después de una estimulación con glucosa durante por lo menos ocho semanas después del tratamiento.

La Figura 4 es una gráfica que muestra la concentración de glucosa en sangre en ayunas, en mM, en ratas no diabéticas (marcadas como control), ratas diabéticas no tratadas (marcadas como vehículo), las ratas que recibieron un tratamiento a una dosis baja de I.N.T^{TM} (marcados TGF/GAS 4) a las dos, cuatro y ocho semanas después del tratamiento. Los resultados muestran que las ratas tratadas con I.N.T^{TM} siguen siendo capaces de mantener unos niveles de glucosa en sangre en ayunas durante por lo menos ocho semanas después del tratamiento.

La Figura 5 es una gráfica que muestra una mejora sostenida en el crecimiento de las ratas diabéticas tratadas con I.N.T^{TM} durante por los menos ocho semanas después del tratamiento, comparada con las ratas control diabéticas no tratadas.

La Figura 6 es una gráfica que muestra los niveles de glucosa en sangre en ayunas de las ratas diabéticas (marcadas como control diabético), las ratas no diabéticas no tratadas (marcadas cono control no diabético) y las ratas que recibieron un tratamiento a una dosis baja de I.N.T^{TM} (marcadas TGF/GAS 4), en función del tiempo después del tratamiento (2,4, 8 y 16 semanas). Los resultados muestran que las ratas tratadas con I.N.T^{TM} mantienen un nivel de glucosa en sangre más bajo en ayunas durante por lo menos 16 semanas después del tratamiento, comparado con las ratas control diabéticas no tratadas.

La Figura 7A es una gráfica que muestra la concentración de péptido C de la insulina plasmática en ayunas y las concentraciones de glucosa en sangre en ayunas. La Figura 7B es una gráfica que muestra el contenido pancreático de insulina y la masa de células \beta determinadas morfométricamente. Las ratas diabéticas STZ insulino-dependientes (PC > 300 g) fueron tratados mediante infusión continua subcutánea durante dos semanas con un derivado sintético de gastrina humana, gastrina 17 (Leu 15), 270 \mug/kg al día, y con EGF1-51 gln51 recombinante humano, 227 \mug/kg al día, o con un vehículo control. Cada barra muestra la media \pm DS, para cada grupo de 6 animales. * indica p < 0,05 (Prueba de Student, no apareados).

La Figura 8 es un diagrama de dispersión que muestra los niveles de concentraciones de glucosa en sangre en ayunas de cada una de las ratas diabéticas insulino-dependientes STZ a los 4, 11 y 14 días después de finalizar el tratamiento con gastrina, 300 \mug/Kg y EGF, 100 \mug/Kg (grupo A) con 3.000 \mug/Kg de gastrina y 100 \mug/Kg de EGF (grupo C) o vehículo control (grupo V), inyectado subcutáneamente tres veces al día durante 28 días. El número de animales que muestran una remisión de la diabetes, la remisión se indica por presentar un nivel de glucosa en sangre de menos de 10 mM a los 14 días posteriores al tratamiento, se comparó entre los grupos mediante una prueba de Chi cuadrado con una significancia de p < 0,05. La gráfica muestra que a los 14 días después de 28 días de tratamiento con 3000 \mug/Kg y EGF 100 \mug/Kg (grupo C), un número significativo de animales ( 4 de 10) mostró una remisión completa de la diabetes comparada tanto con el grupo vehículo (en el que ninguno de los 10 animales mostró remisión) como con el grupo experimental que presenta una proporción diferente de 300 \mug/Kg y EGF 100 \mug/Kg (grupo A, en el que sólo un animal mostró una remisión completa). Una característica de esta respuesta es que la remisión se retrasó 11-14 días después de que se haya completado el tratamiento.

Descripción detallada de las formas de realización

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ligando para el receptor de gastrina/CCK" engloba los compuestos que estimulan el receptor de gastrina/CCK como los que cuando los receptores en el mismo tejido o en un tejido adyacente o en el mismo sujeto también son estimulados, se induce la neogénesis de las células de los islotes pancreáticos que producen insulina. Los ejemplos de dichos ligandos para los receptores de gastrina/CKK se proporcionan en la patente U.S nº 6.288.301 publicada el 11 de septiembre de 2001, e incluye varias formas de gastrina como gastrina 34 (gastrina grande), gastrina 17 (gastrina pequeña) y gastrina 8 (mini gastrina); varias formas de colecistoquinina como CCK 58, CCK 33, CCK 22, CCK 12 y CCK 8, y otros ligandos para los receptores de gastrina/CCK que demuestran la misma actividad sinérgica con los ligandos para los receptores de EGF, y los cuales pueden inducir la diferenciación de las células del páncreas maduro para formar las células de islotes que secretan insulina, cuando sinérgicamente con un ligando para el receptor de EGF.

Las formas pequeñas de gastrina tales como la gastrina 17 se preparan económicamente mediante la síntesis de péptidos, y los péptidos sintéricos están disponibles comercialmente. La gastrina humana sintética 17 y los derivados como la gastrina humana 17 que presenta una metionina sustituida por leucina en la posición 15 también están disponibles en Bachem AG, Bubendorf, Suiza, y en Researchplus.

Tal como se utiliza en el documento presente, la expresión "ligando para el receptor de EGF" engloba los compuestos que estimulan el receptor EGF como los que cuando los receptores de gastrina/CKK en el mismo tejido o en un tejido adyacente o en el mismo sujeto también son estimulados, se induce la neogénesis de las células de los islotes pancreáticos que producen insulina. Los ejemplos de dichos ligandos para el receptor EGF incluyen EGF de longitud total que es EGF1-53 y además incluye EGF-48, EGF1-49, EGF1-52 y fragmentos de sus análogos activos. Otros ejemplos de ligandos para el receptor EGF son formas TGFa que incluyen 1-48, 1-47, 1-51 y factores de crecimiento de amfiregulina y poxvirus así como cualquier ligando para los receptores de EGF que demuestra la misma actividad sinérgica con los ligandos para el receptor de gastrina/CKK. Estos incluyen los análogos activos, los fragmentos y modificaciones de los anteriores. Para obtener más información, ver, Carpenter y Wahl, Capítulo 4 en Peptide Growth Factors (Eds. Sporn and Roberts), Springer Verlag, 1990.

EGF presenta una actividad mitogénica, es decir, estimula el crecimiento de varias células y tejidos (Kames supra, Carpenter, g et al. J. Cell Physiol 88, 227-237, 1976; Gaslander, t. et al. Eur. Surg Res. 29, 142-149, 1997). También se ha encontrado que EGF presenta un efecto citoprotector, que estimula la migración de células hacia una herida in vivo, o hacia un orificio introducido en un cultivo de célula en monocapa, para promover la cicatrización de las heridas. Estas actividades biológicas son específicas de una familia de factores de crecimiento estructuralmente relacionados, que incluyen EGF, TGF\alpha, amfiregulina y el factor de crecimiento similar a EGF que se une a heparina (Kames, supra). Los miembros de esta familia de factores de crecimiento presentan unos aminoácidos idénticos en los 11 residuos de la secuencia de aminoácidos, seis de los cuales son residuos cistina que forman unos puentes disulfuro.

El grupo de compuestos que son ligandos para el receptor EGF incluyen asimismo "EGF modificado", los cuales son variantes de un tipo normal o salvaje de EGF. Se ha demostrado que las modificaciones afectan a una o más actividades biológicas como la velocidad de aclaramiento de EGF. El término incluye los péptidos que presentan la secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la de EGF humano, por ejemplo, con uno o algunos aminoácidos sustituidos en varias posiciones de los residuos.

Las formas de EGF recombinantes se han construido genéticamente para presentar unas alteraciones en la estructura y actividades, por ejemplo, se ha descrito un EGF que presenta una metionina en la posición 21 sustituida por un residuo leucina (patente US nº 4.760.023). El EGF recombinante humano (hEGF) que presenta 51 residuos, es decir, le faltan los dos residuos C-terminal en las posiciones 52 y 53 de hEGF, que presenta una sustitución del aminoácido neutro en la posición 51, mantienen la actividad de EGF y son más resistentes a la degradación por proteasas durante el procedimiento de producción microbiana, y después de la administración a un sujeto. Se han descrito una serie de moléculas de ácidos nucleicos que codifican para una familia de proteínas que presentan una similitud significativa con EGF y TGF\alpha (WO 00/29438).Se han descrito las muteínas de EGF (EGF mutado) que presentan una histidina en el residuo 16 sustituido por un aminoácido ácido o neutro (WO 93/03757), tales formas que mantienen la actividad a unos valores más bajos de pH. Los análogos y los fragmentos químicos de EGF y TGF\alpha mantienen la capacidad de unirse a varios miembros de la familia del receptor del factor EGF (patente US número 4.686.283). Varias modificaciones de EGF o TGF\alpha confieren unas propiedades ventajosas que afectan a la producción de una o más proteínas recombinantes, la estabilidad in vitro e in vivo, y la actividad in vivo. Un ligando para el receptor de EGF recombinante modificado preferido de las formas de realización del documento presente mantiene la actividad I.N.T^{TM} sustancialmente completa, y presenta una estabilidad in vivo e in vitro que es por lo menos aproximadamente tan elevada o más que la normal para el hEGF de tipo normal o salvaje.

Un aspecto principal de la invención es la utilización de una composición farmacéutica en un procedimiento para el tratamiento de la diabetes mellitus en un individuo que lo necesita mediante la administración al individuo de una composición que incluye un ligando para el receptor de gastrina/ CCK y un ligando para el receptor de EGF, cada uno en una cantidad suficiente y en proporción el uno con el otro de modo que la combinación de estos ligandos lleva a cabo la diferenciación de las células precursoras de los islotes pancreáticos en células maduras que secretan la insulina, un procedimiento conocido como la neogénesis de islotes. Las células que se diferencian son unas células precursoras latentes de los islotes que están presentes en el conducto pancreático del sujeto animal maduro. Ver patente US nº 5.885.956, presentada el 23 de marzo, 1999.

El término "maduro" tal como se utiliza en el documento presente se refiere exclusivamente a un animal posnatal, para distinguir al animal maduro del animal fetal. Maduro se refiere a un mamífero de edad cronológica por encima del 5% de la esperanza de vida media de las especies de mamíferos. Este término no está relacionado con una etapa del desarrollo del sujeto o a un periodo del inicio de la diabetes. En una forma de realización, los procedimientos y las composiciones del documento presente resultan útiles para el tratamiento de un paciente que padece diabetes mellitus de tipo I, es decir, una forma de diabetes caracterizada por la dependencia de la insulina que incluye una ausencia o deficiencia de insulina, y referida como diabetes "juvenil". Las composiciones y las utilizaciones en el presente documento también resultan útiles para el tratamiento de pacientes con una diabetes insulino-dependiente de tipo II, o de inicio adulto, por ejemplo, que producen una insulina insuficiente para mantener unos niveles de glucosa en sangre debido al agotamiento del páncreas.

Una forma de realización de una utilización de una composición en el documento presente comprende la administración, preferentemente por vía sistémica, de una composición que es cantidad regenerativa de la diferenciación de un ligando para el receptor de gastrina/CCK, por ejemplo, gastrina y un ligando para el receptor de EGF, por ejemplo, EGF o TGF\alpha a un individuo. La gastrina es sintética, por ejemplo, gastrina humana sintética, por ejemplo, gastrina 17 humana, por ejemplo, que presenta una leucina en el residuo 15. El ligando para el receptor de EGF es hEGF, por ejemplo, EGF producido de forma recombinante, por ejemplo, EGF recombinante modificado, por ejemplo, EGF producido por recombinación a partir de un gen sintético que presenta las modificaciones, como una deleción de los dos aminoácidos C-terminal en las posiciones 52 y 53, y que codifica para un EGF que presenta una longitud de 51 aminoácidos. La modificación adicional de EGF puede incluir una o más de varias sustituciones, como una sustitución de un aminoácido neutro en la posición 51 en lugar del residuo normal en la posición 51 de hEGF, que el aminoácido cargado ácido glutámico. Un aminoácido neutro como se define en el documento presente es uno que no está cargado a un pH fisiológico, y es preferentemente hidrofílico, como por sustitución de serina, alanina, y glutamina para el residuo que se encuentra normalmente en esta posición.

En otra forma de realización, la invención se refiere a la utilización de una composición en un procedimiento para llevar a cabo la diferenciación de las células precursoras de los islotes pancreáticos de un sujeto, por ejemplo, un mamífero, mediante la estimulación de dichas células con una combinación del ligando para el receptor de gastrina/CKK, por ejemplo, una gastrina como gastrina 17, gastrina 17 sintética que presenta una leucina en el residuo 15, y un ligando para el receptor de EGF, por ejemplo, un TGF\alpha, o un EGF recombinante modificado, según un protocolo de dosificación particular.

Como se utiliza en el documento presente, un protocolo de dosificación se refiere a un protocolo para la administración de la composición I.N.T.^{TM}, e incluye la cantidad de la composición suministrada por día, y la duración o periodo de tiempo durante el cual se administra la composición.

La mayoría de los pacientes insulino-dependientes requiere por lo menos una inyección de insulina diaria. Varias dosis al día de insulina son necesarias bajo unas circunstancias determinadas de enfermedad o dieta para el control de la diabetes, y la administración de insulina está indicada mediante los resultados de la monitorización frecuente de la glucosa, otra actividad que es necesaria para un paciente de diabetes para el control óptimo de la enfermedad, que se realiza por ejemplo tantas veces como cinco al día.

Por el contrario, las composiciones utilizadas en el documento presente se utilizan para un protocolo de dosificación de corta duración, por ejemplo, un periodo de dosificación de menos del 0,5 por ciento, o el 0,2 por ciento, o el 0,1 por ciento de la media de la esperanza de vida de un sujeto de una especie.

La administración durante un protocolo de dosificación corto de las composiciones del documento presente viene seguida por un periodo de eficacia extenso, incluso la remisión completa de los síntomas de la enfermedad. Los datos de la esperanza de vida utilizados en el documento presente incluyen: la esperanza de vida media de un roedor en cautividad de aproximadamente 2,5 años (30 meses); la esperanza de vida media de un primate que es un macaco como un mono cinomolgo (Macaca fascicularis) en cautividad de aproximadamente 30 años (360 meses); o la esperanza de vida media de un primate que es un chimpacé (Pan troglodytes) en cautividad de aproximadamente 45 años (540 meses); o la esperanza de vida media de un primate que es un humano de aproximadamente 70-75 años (840 - 900 meses). Se reconoce que la esperanza de vida media de una especie varía con unas condiciones que son culturales como la dieta y/o genética.

La duración de un protocolo de dosificación corto para un roedor como una rata se calcula en el presente documento como, por ejemplo, igual o inferior a aproximadamente 28 días, aproximadamente 18 días, o inferior a aproximadamente 9 días. La duración de un protocolo de dosificación para un primate, por ejemplo un mono cinomolgo, un chimpancé o un humano, es más larga que para un roedor, por ejemplo, el periodo de tratamiento es inferior a aproximadamente un año, inferior a aproximadamente tres meses, inferior a aproximadamente dos meses, o incluso inferior a aproximadamente un mes.

La duración de un protocolo de dosificación corto para un paciente humano representa incluso un porcentaje inferior al porcentaje de la esperanza de vida. Por ejemplo, una duración de cuatro semanas de tratamiento es 0,11% de una esperanza de vida de 70 años (3640 semanas); un tratamiento de dos semanas es 0,05% de la esperanza de vida. La eficacia del tratamiento se extiende a un periodo de 26 semanas (0,7%) o 52 semanas (1,4%) 0 104 semanas (2,86%).

Como resultado de la administración de las composiciones de I.N.T.^{TM} proporcionadas en el documento presente según un protocolo de dosificación de duración corta, se inicia el procedimiento de neogénesis de los islotes. Las células precursoras en el sujeto son inducidas para diferenciarse y las células que se diferencian después maduran en células de los islotes capaces de secretar insulina en respuesta a las fluctuaciones en los niveles de glucosa en sangre, es decir, el sujeto con diabetes entra en un periodo de remisión caracterizado por una respuesta normal a la estimulación de glucosa en sangre. Como resultado de esta administración, se inicia la remisión de la diabetes, por lo que la dosificación estándar de insulina administrada a un paciente diabético antes de la terapia se reduce, como se determina mediante el nivel de glucosa en sangre obtenido mediante la monitorización, por ejemplo, mediante el auto-control por el paciente, durante y después del tratamiento. La remisión de la diabetes debida a una terapia de neogénesis de islotes exitosa está indicada mediante un nivel de glucosa en sangre disminuido en ayunas, y mediante un nivel y una duración de la glucosa en sangre elevada disminuidos en respuesta a la estimulación dietética al consumo de azúcar. Al conseguir una neogénesis de islotes exitosa, la administración de insulina se reduce desde, por ejemplo, cinco inyecciones a dos inyecciones diarias; desde dos inyecciones a una inyección diaria, y desde una a ninguna, como se indica mediante los resultados obtenidos a partir de la monitorización de los niveles de glucosa en sangre. Un experto en farmacología, al tratar a un paciente diabético, está familiarizado con el ajuste de la dosis de insulina a unos niveles de glucosa en sangre después de un ayuno y en otras condiciones fisiológicas.

Las dosificaciones de las composiciones I.N.T.^{TM} que se van a administrar a un sujeto se ajustan para unas variaciones conocidas entre las especies en unos resultados estándar que engloban los criterios para la absorción, la distribución, la cinética de vida media en la circulación, el metabolismo, la secreción y la toxicología de los ligandos para el receptor de las formas de realización del documento presente, por ejemplo, para cada una de las especies de primates y roedores. En general, las dosificaciones se ajustan para ser aproximadamente 100 veces superiores para la administración a una especie de roedor que para una especie de primate. Por ejemplo, una dosis de una composición de I.N.T.^{TM} para una rata se ejemplifica mediante aproximadamente 3.000 \mug/día de un ligando para el receptor de gastrina/CCK y aproximadamente 100 \mug de un ligando para el receptor de EGF, administrado por ejemplo en tres inyecciones al día (para un total de aproximadamente 9.000 \mug de ligando para el receptor de gastrina/CCK y aproximadamente 300 \mug de un ligando para el receptor de EGF al día), en una base de Kg de peso corporal. Para un primate como un mono cinomolgo, un chimpacé, o un humano, la dosis comparable es, por ejemplo, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 \mug de un ligando para el receptor de EGF, o desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente
10 \mug de un ligando para el receptor de EGF por kg de peso corporal, y aproximadamente 30 hasta aproximadamente 90 \mug, o aproximadamente 90 hasta aproximadamente 300 \mug de ligando para el receptor de gastrina/CCK por kg de peso corporal, dichas dosis diarias se administran como un bolo total administrado una vez al día, o dividido en subdosis para ser administrado en dos o más administraciones al día.

Los modos de administración de los ligandos para el receptor incluyen pero no se limitan a las vías subcutánea, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intranasal y oral. Los compuestos se pueden administrar mediante una vía conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección de un bolo, mediante una bomba, por absorción a través de los revestimientos epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.). Los ligandos para los receptores en el presente documento se pueden administrar en combinación con uno o varios de otros agentes biológicamente activos. La administración es preferentemente sistémica.

La presente invención proporciona también unas composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable estéril. Dicho vehículo incluye pero no se limita a una solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y sus combinaciones. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

La composición, si se desea, puede contener también unas cantidades inferiores de agentes humectantes o emulsionantes, como Tween, o agentes que taponan el pH. La composición puede ser una solución líquida, una suspensión, una emulsión, un comprimido, una píldora, una capsula, una formulación de liberación sostenida o polvo. La composición se puede formular como un supositorio con unos aglutinantes tradicionales y los vehículos como triglicéridos. La formulación oral puede incluir unos vehículos estándar como unos reactivos farmacéuticos puros de manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, carbonato de magnesio, etc..

Son conocidos varios sistemas de administración y se pueden utilizar para administrar un agente terapéutico de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas y similares.

En una forma de realización preferida, la composición se formula según los procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa en humanos. Las composiciones para la administración intravenosa son generalmente soluciones en un tampón acuoso isotónico estéril. Si es necesario, la composición puede incluir unos componentes adicionales, por ejemplo, un agente solubilizante. Generalmente, los ingredientes se suministran o bien separadamente o bien pre-mezclados en las formas de dosificación. Además de la forma de solución, la composición se puede suministrar como un polvo seco liofilizado, o como un concentrado no acuoso, por ejemplo, en un contenedor sellado herméticamente como una ampolla o un sobre que indica la cantidad de agente activo. Si la composición se administra en infusión, se puede dispensar utilizando una botella de infusión que contiene agua de calidad farmacéutica estéril o solución salina. Si la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril o solución salina para inyección de modo que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración.

Las formas de realización del agente terapéutica de las composiciones de la invención se pueden formular como formas neutras o como sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres como los que derivan de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y los que se forman con unos grupos carboxilo libres como los que derivan de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc..

La cantidad de cada uno de los agentes terapéuticos de las composiciones del documento presente, y su cantidad relativa con respecto a cada uno que será eficaz en el tratamiento de una patología o trastorno particular dependerá de la naturaleza del trastorno o la patología, y que se pueden determinar mediante unas técnicas clínicas estándar. La dosis exacta que se emplea en una formulación depende también de la vía de administración, y la duración de la patología o el trastorno en un paciente determinado, y se puede decidir según el juicio del médico y de las circunstancias particulares de cada paciente. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados para la administración intravenosa y subcutánea son generalmente aproximadamente 0,1 microgramos o un microgramo, hasta aproximadamente un miligramo o tres miligramos, por kilogramo de peso corporal, por ejemplo, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 500 microgramos de cada compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los intervalos de dosificación adecuados para la administración intranasal son generalmente aproximadamente 0,01 pg por kg de peso corporal, hasta aproximadamente 1 mg por kg de peso corporal. Las dosis eficaces se pueden extrapolar desde unas curvas de dosis- respuesta derivadas de los sistemas de ensayo in vitro o de modelos animales. Una dosis diaria se administra en una dosis diaria como una dosis única o dividida en varias dosis fraccionales más pequeñas, que se administran varias veces durante el día.

Generalmente, los supositorios contienen el ingrediente activo en el intervalo desde aproximadamente 0,5% hasta aproximadamente 10% en peso; las formulaciones orales contienen preferentemente aproximadamente el 10% hasta aproximadamente 95% de ingrediente activo en peso.

Las formas de realización de la invención en el presente documento proporcionan también un paquete farmacéutico o un equipo que comprende uno o más contenedores llenos de uno o más ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención, por ejemplo, un contenedor que presenta una unidad de dosificación de un ligando para el receptor de gastrina/CCK o un ligando para el receptor de EGF o ambos. Asociado a dicho contenedor se puede encontrar un prospecto en la forma prescrita de una agencia gubernamental que regula la manufacturación, la utilización o venta de los productos farmacéuticos o biológicos, la cual refleja la aprobación por la agencia de manufacturación, el uso o la venta para la administración humana. En determinadas formas de realización, el paquete o equipo puede incluir uno o más contenedores que presentan insulina, que se administra durante el protocolo de dosificación antes de la inducción de la neogénesis de los islotes y la remisión de la diabetes.

Ejemplos Ejemplo 1 Eficacia prolongadas de las composiciones I.N.T.^{TM} y procedimientos en ratas diabéticas

La diabetes se indujo por inyección intravenosa con 50 mg/kg de estreptozotocina (STZ), la cual redujo el contenido de insulina pancreática en un 95%. Una semana más tarde, se administró a las ratas diabéticas STZ (de peso de 200-250 g) ya sea el vehículo sólo como un control (marcado como CON en la Figura 1), o se les administró una combinación de péptidos gastrina 17 humana (4 \mug/kg) y TGF\alpha humano (4 \mug/kg) (marcado con GAS/TGF) una vez al día, en inyecciones intraperitoneales durante 12 días. A las 1, 2, 4 y 8 semanas de tratamiento, se realizaron unas pruebas de tolerancia a glucosa intraperitoneal (IPGTT), para medir tanto los niveles de glucosa en sangre como los niveles de insulina plasmática, en respuesta a una cantidad de estimulación de glucosa.

Los datos muestran que el tratamiento con GAS/TGF estimula la neogénesis de las células \beta de los islotes, que se demuestra morfólogicamente por un aumento significativo en el número de pequeñas agrupaciones de células teñidas de insulina adyacentes a los ductos pancreáticos. Además, las ratas tratadas con GAS/TGF presentan unas concentraciones de insulina pancreática significativamente elevadas comparadas con las ratas CON. A todos los tiempos estudiados, IPGTT muestra que las ratas tratadas con GAS/TGF presentan unos niveles de glucosa en sangre significativamente inferiores que las ratas CON (ver Figura 1). Además, el incremento por la estimulación con glucosa en los niveles de insulina plasmática fue 2-3 veces superior en las ratas tratadas con GAS/TGF comparado con las ratas CON (Figura 2).

Sorprendentemente, se observó la eficacia prolongada del tratamiento, con una tolerancia prolongada a la glucosa en respuesta a la estimulación de glucosa en las ratas tratadas con GAS/TGF mantenida por lo menos a las 8 semanas después del cese del tratamiento (Figura 3). Además, 8 semanas después del cese del tratamiento, las ratas tratadas con GAS/TGF mostraron también unos niveles de glucosa en sangre en ayunas normales (6,4 \pm 1,2 mM) comparada con los niveles diabéticos (12,0 \pm 2,2 mM) observados en las ratas CON (ver Figura 4). El crecimiento de las ratas en los grupos tratados con I.N.T.^{TM} fue normal (ver Figura 5). La tolerancia mejorada a la glucosa correlacionada con una ganancia de peso corporal mejorada en el grupo GAS/TGF durante la 8 semana del periodo posterior al tratamiento.

Además, los datos adicionales indican que la eficacia del tratamiento con I.N.T.^{TM} siguió por lo menos 16 semanas después del cese del tratamiento (Figura 6).

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Ejemplo 2 Tratamiento por administración subcutánea de EGF y gastrina en las ratas diabéticas durante dos semanas dio como resultado un incremento en la masa de células \beta pancreáticas, el contenido de insulina y la secreción de insulina y redujo la glucosa en sangre en las ratas diabéticas

Las ratas diabéticas STZ se prepararon como se ha descrito anteriormente, utilizando ratas con un peso corporal superior a 300 g. Éstas fueron tratadas con EGF y gastrina mediante administración subcutánea (infusión subcutánea continua), como sigue. Las ratas fueron tratadas durante dos semanas con una gastrina 17 humana sintética (Leu 15), 270 \mug/kg al día y EGF 1-51 gin 51 humano, 227 \mug/kg al día, o con un control vehículo. Cada barra muestra la media \pm DS para 6 animales, y * indica p < 0,05 (prueba T de Student, no apareada). La insulina pancreática se determinó por inmunoensayo, y la masa de células \beta se determinó mediante el análisis de recuento morfométrico de las secciones histológicas del páncreas después de la tinción inmunohistoquímica con anticuerpos de insulina para teñir las células \beta. El anticuerpo es específico para el péptido C de la insulina.

Se observaron unos niveles de péptido C de la insulina plasmática aumentados (Figura 7 A, panel izquierdo) y unos niveles reducidos de glucosa en sangre en ayunas (Figura 7 A, panel derecho) para las ratas tratadas con EGF/gastrina, comparado con las ratas control que solo reciben vehículo.

Además, las ratas se examinaron para el contenido de insulina pancreática y el número de células \beta pancreáticas que secretan insulina (ver Figura 7, panel B). La Figura 7B muestra el contenido de insulina pancreática y el número de células \beta determinado morfológicamente, a partir de las ratas diabéticas STZ insulino-dependientes tratadas (marcadas como INT) y a partir del vehículo control (marcadas como Veh). Las ratas tratadas muestran aproximadamente tres veces más contenido de insulina y una masa de células \beta aproximadamente dos veces mayor que las ratas control.

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Ejemplo 3 Aumento de la proporción de gastrina en la combinación EGf/gastrina mejora la remisión de la diabetes

Las composiciones I.N.T.^{TM} y los procedimientos para el tratamiento se realizaron utilizando unos grupos de ratas STZ, que utilizan un protocolo de dosificación de 28 días de duración, y una composición que presenta gastrina a una proporción de peso 30 veces superior que EGF. Se administraron a las ratas 100 microgramos/inyección del ligando para el receptor EGF por Kg de peso, y 3 miligramos/inyección del ligando para el receptor de gastrina/CCK. Se administraron tres de dichas inyecciones cada día.

La Fig. 8 muestra el nivel de glucosa en sangre en ayunas después de 28 días de tratamiento de las ratas diabéticas con 3.000 \mug/kg de gastrina 17 Leu 15 sintética, administrada junto con EGF51 Gln51 recombinante modificado
(100 \mug/kg). Los resultados muestran que el tratamiento proporciona un número de ratas significativamente superior con remisión de la diabetes (como se ha definido mediante la glucosa en sangre en ayunas por debajo de 10 mM) (Grupo C) comparado con el grupo control no tratado (Grupo V). Por el contrario, el tratamiento con 300 \mug/kg de gastrina con la misma dosis de EGF (100 \mug/kg) no indujo la remisión en un número significativo de animales (Grupo A).

Sorprendentemente, a los 14 días de cese del tratamiento con la composición I.N.T.^{TM} que presenta una proporción en peso de gastrina/EGF de 30:1, se observó que los niveles de glucosa en sangre de un número significativo de los animales tratados decayeron a los niveles no diabéticos. El nivel 30:1 de gastrina fue importante para la respuesta ya que el grupo control de las ratas diabéticas tratadas con una proporción 3:1 que presenta una dosis 10 veces inferior de gastrina no mostró un número significativo de animales no diabéticos a los 14 días después del tratamiento.

Claims (19)

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   1. Composición farmacéutica que comprende una primera dosis del ligando para el receptor de gastrina/colecisto-
   quinina (CCK), y una segunda dosis del ligando para el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGF), en la que la primera dosis es aproximadamente 10 veces y 100 veces superior en peso a la segunda dosis.
2. 2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el ligando para el receptor de gastrina/CCK es gastrina 17 que presenta metionina sustituida por leucina en el aminoácido en posición 15 relativa a la secuencia de aminoácidos de la gastrina 17 de tipo salvaje.
3. 3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el ligando para el receptor de EGF es EGF 1- 53 recombinante humano que presenta una deleción de los dos aminoácidos C-terminales en los aminoácidos en las posiciones 52 y 53 y que presenta un aminoácido neutro sustituido en el aminoácido en posición 51 relativo a la secuencia de aminoácidos de EGF1-53 de tipo salvaje.
4. 4. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que el ligando para el receptor de EGF es EGF 1- 53 recombinante humano que presenta una deleción de los dos aminoácidos C-terminales de los aminoácidos en las posiciones 52 y 53 y que presenta un aminoácido neutro sustituido en el aminoácido en posición 51 relativo a la secuencia de aminoácidos de EGF1-53 de tipo salvaje.
5. 5. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, 2 ó 3 en la que el ligando para el receptor de gastrina/CCK y el ligando para el receptor de EGF están en un proporción de por lo menos aproximadamente 10:1.
6. 6. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el ligando para el receptor de gastrina/CCK y el ligando para el receptor de EGF están en una proporción de por lo menos aproximadamente 30:1.
7. 7. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el ligando para el receptor de gastrina/CCK y el ligando para el receptor de EGF están en una proporción de por lo menos aproximadamente 60:1.
8. 8. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en la que la primera dosis es de aproximadamente 1,0 microgramos hasta aproximadamente 10 microgramos por kg de peso corporal del sujeto al día.
9. 9. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en la que la primera dosis es de aproximadamente 10 microgramos hasta aproximadamente 100 microgramos por kg de peso corporal del sujeto al día.
10. 10. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4 para la administración subcutánea en la que el intervalo de dosificación del ligando del receptor de gastrina/CCK y el ligando para el receptor de EGF es 0,1 microgramos hasta un miligramo en kg de peso corporal del sujeto.
11. 11. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, en la que el aminoácido neutro es hidrofílico.
12. 12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que el aminoácido neutro es serina, alanina o glutamina.
13. 13. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el tratamiento de un sujeto, la composición que comprende una dosis de por lo menos aproximadamente 30 \mug/kg del peso corporal del sujeto de gastrina 17 que presenta metionina sustituida con leucina en el aminoácido en posición 15 relativo a la secuencia de aminoácido de la gastrina 17 de tipo salvaje y por lo menos a una dosis de aproximadamente 1 \mug/kg del peso corporal del sujeto del EGF1-53 recombinante humano que presenta una deleción de los dos aminoácidos C-terminales de los aminoácidos en las posiciones 52 y 53 y que presenta un aminoácido neutro sustituido en el aminoácido en posición 51 relativo a la secuencia de aminoácidos de EGF1-53 de tipo salvaje.
14. 14. Utilización de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la diabetes.
15. 15. Utilización de una composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la diabetes insuficiente en insulina en un sujeto para el tratamiento de aproximadamente el uno por ciento de la esperanza vida media del sujeto.
16. 16. Utilización de una composición farmacéutica según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la diabetes mediante un protocolo de tratamiento inferior a aproximadamente dos meses de duración y la repetición de la administración del medicamento menos frecuentemente que aproximadamente una vez cada seis meses.
17. 17. Utilización de una composición farmacéutica según la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la diabetes en un sujeto mediante un protocolo de tratamiento inferior a aproximadamente tres meses de duración, seguido de la administración del medicamento cuando un incremento de los niveles de glucosa en sangre indique que el sujeto necesita más neogénesis de los islotes.

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18. 18. Utilización según la reivindicación 16 ó 17, en la que la diabetes es diabetes es insulino-dependiente.
19. 19. Utilización según la reivindicación 16 ó 17, en la que la diabetes es diabetes del adulto.